JP2023086856A - 免疫賦活活性を有するオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途 - Google Patents
免疫賦活活性を有するオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途 Download PDFInfo
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Abstract
Description
約20塩基対)、一本鎖の合成DNA断片であって、Toll様受容体9(TLR9)の強力なアゴニ
ストであり、樹状細胞(DCs)及びB細胞を活性化して、I型インターフェロン(IFNs)
及び炎症性サイトカインを産生させ(非特許文献1、2)、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)反応を含む、Th1型の液性及び細胞性免疫反応のアジュバントとして作用する(非特許文
献3、4)。そこで、CpG ODNは、感染症、癌、喘息及び花粉症に対して可能性のある免
疫療法剤とみなされてきた(非特許文献2、5)。
)骨格及びホスホロチオエート(PS)ポリGテイルと共に1つの回文構造のCpGモチーフを
含み、形質細胞様DCs(pDCs)を活性化して大量のIFN-αを産生させるが、pDC成熟化やB
細胞活性化を誘導できない(非特許文献7、8)。他の3つの型のODNは、PS骨格からな
る。K型(B型とも呼ばれる)CpG ODNは、典型的には、非回文構造の、複数のCpGモチーフを含有し、B細胞を強力に活性化してIL-6を産生させ、pDCsを活性化して成熟化させるが
、ほとんどIFN-αを産生しない(非特許文献8、9)。近年、開発されたC型及びP型のCpG ODNはそれぞれ1つ及び2つの回文構造CpG配列を含有しており、双方ともK型の様にB細
胞を活性化させ、D型の様にpDCsを活性化させることができるが、P型CpG ODNと比較して
、C型CpG ODNは、IFN-α産生をより弱く誘導する(非特許文献10-12)。特許文献1に、多数の優れたK型 CpG ODNが記載されている。
ン塩基対、及びシス回文構造部位とトランス回文構造部位との間のワトソン-クリック塩基対、という高次構造をそれぞれ形成することが示されており、これらはpDCsによる強力なIFN-α産生に必要である(非特許文献12-14)。このような高次構造は初期エンドソームへの局在化やTLR9を介する情報伝達に必要であるようだが、これらは産物の多型性及び沈殿の影響を受け、その結果その臨床応用を妨げている(非特許文献15)。従って、K型及びC型CpG ODNのみが、ヒト用の免疫療法剤及びワクチンアジュバントとして一般
的に利用可能である(非特許文献16及び17)。K型CpG ODNは、ヒト臨床試験において、感染症及び癌を標的とするワクチンの免疫原性を高めるが(非特許文献6、16)、最適なアジュバント効果のためには、抗原とK型CpG ODNとの間の化学的及び物理的連結が必要である。これらの結果は、4つの型(K、D、P、及びC)のCpG ODNには長所及び短所が
あることを示しており、アグリゲーションすることなく、B細胞及びpDCsの両方を活性化
する「オール・イン・ワン」CpG ODNの開発が期待されている。
0年に亘り認可されている医薬である(非特許文献18)。同様に、シイタケ由来の可溶性β-1,3-グルカンであるレンチナン(LNT)は、1985年に承認された医薬であり、手術不能および再発胃癌患者に対しフルオロピリミジン系薬剤との併用で使用されている(非特許文献19、20)。β-1,3-グルカンは、ポリデオキシアデニル酸(dA)と三
重螺旋構造の複合体を形成することが示されている(非特許文献21)。
溶性複合体の遺伝子キャリアとしての使用が開示されている。これらの文献には、該複合体を形成することにより、遺伝子のアンチセンス作用及び核酸分解酵素(ヌクレアーゼ)への耐性作用が高められることが記載されている。
剤)として用いることにより、CpG配列を含み、リン酸ジエステル結合をホスホロチオエ
ート結合又はホスホロジチオエート結合に置換した免疫刺激性オリゴヌクレオチドの作用が高められることが開示されている。
側鎖を有するβ-1,3-グルカンとからなることを特徴とする免疫刺激性複合体が記載さ
れている。
ポリ(dA)を連結させたマウス及びヒト化したCpG ODNが、サイトカイン産生を増強し、インフルエンザワクチンアジュバントやTh2細胞関連疾患の予防または治療剤として作用す
ることを示した(非特許文献22、23、特許文献7)。K型及びD型のそれぞれのCpGの5’末端にポリ(dA)を付加し、SPGと複合体を形成すると、それぞれK型及びD型の特性を
維持しつつ、その活性が増強された。しかしながら、より効果的で、費用効率が高い、前臨床及び臨床開発へ向けて、CpG-SPG複合体の高収率を達成することが困難であった。近
年、CpG ODNにホスホロチオエート結合を有するポリ(dA)を連結すると、複合体形成がほとんど100%にまで上昇することが示された(非特許文献24)。しかしながら、最適なヒト化CpG配列を同定し、4つの型のCpG ODNの「オール・イン・ワン」活性を得るための因子を最適化するための綿密な試験はなされていない。
疫賦活剤を提供することである。
型CpG ODN及びレンチナン(LNT)を含む新規の複合体K3-LNTの作製にも成功した。K3-SPG, K3-LNTはD型CpG ODN配列を有していないにも係わらず、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性(例えば、B細胞(好ましくは、ヒトB細胞)を活性化してIL-6を産生させる活性)と、D
型CpG ODNに特有の免疫賦活活性(例えば、形質細胞様樹状細胞を活性化してIFN-αを産
生させる活性)とを併せ持っていた。更に、K3-LNT、及びK3-SPGは強力なワクチンアジュバント活性を有しており、抗原とともに免疫接種すると、該抗原特異的な液性免疫及び細胞性免疫の両方を誘導し、実際、RSVウイルス又はインフルエンザウイルスに対し非常に
強い感染防御効果を示した。これらの知見に基づいて更に検討を進め、本発明を完成した。
[1]ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に配置されている、オリゴデオキシヌクレオチド。
[2]ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、10ヌクレオチド以上の長さであり、且つ式:
、N5及びN6はいかなるヌクレオチドであってもよい)
で表されるヌクレオチド配列を含む、[1]に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
[3]ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなる、[1]又は[2]に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
[4]オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合で置換されている、[1]~[3]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
[5]オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されている、[4]に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
[6]ポリデオキシアデニル酸の長さが、20~60ヌクレオチド長である、[1]~[5]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
[7][1]~[6]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1, 3-グルカンを含有する複合体。
[8]β-1, 3-グルカンがレンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、又はラミナランである[7]に記載の複合体。
[9]β-1, 3-グルカンがレンチナン、シゾフィラン又はスクレログルカンである[8]に記載の複合体。
[10]下記(i)に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、及び(ii)に記載のβ-1, 3
-グルカンからなる複合体。
(i)配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に20~60ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されているオリゴデオキシヌクレオチド
(ii)レンチナン又はシゾフィラン
[11]三重螺旋構造状のものである、[7]~[10]のいずれかに記載の複合体。
[12]B細胞を活性化してIL-6を産生させる活性、及び樹状細胞を活性化してIFN-αを
産生させる活性を有する、[7]~[11]のいずれかに記載の複合体。
[13][1]~[6]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは[7]~[12]のいずれかに記載の複合体を含む、医薬組成物。
[14]ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための、[13]に記載の医薬組成物。
[15]ウイルス感染症の予防又は治療のための、[14]に記載の医薬組成物。
[16]ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である[15]に記載の医薬組成物。
[17][7]~[12]のいずれかに記載の複合体を含む、I型及び/又はII型インタ
ーフェロン産生誘導剤。
[18][1]~[6]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは[7]~[12]のいずれかに記載の複合体を含む、免疫賦活剤。
[19]ワクチンアジュバントである、[18]の免疫賦活剤。
[20][1]~[6]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは[7]~[12]のいずれかに記載の複合体を含む、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療剤。
[21]ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である[20]に記載の予防又は治療剤。
[22]医薬組成物の製造のための、[1]~[6]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは[7]~[12]のいずれかに記載の複合体の使用。
[23]医薬組成物が、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための医薬組成物である、[22]に記載の使用。
[24]ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、[23]に記載の使用。
[25][1]~[6]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは[7]
~[12]のいずれかに記載の複合体の薬理的有効量を温血動物に投与することを含む、当該温血動物における疾患の治療もしくは予防のための方法。
[26]疾患が、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症である、[25]に記載の方法。
[27]ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、[26]に記載の方法。
[28]温血動物がヒトである、[25]~[27]のいずれかに記載の方法。
[29][1]~[6]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは[7]~[12]のいずれかに記載の複合体の薬理的有効量を温血動物に投与することを含む、当該温血動物における防御免疫反応を誘導する方法。
[30]ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の治療又は予防において使用するための、[1]~[6]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは[7]~[12]のいずれかに記載の複合体。
[31]ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、[30]に記載のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体。
[32](a)[1]~[6]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは[
7]~[12]のいずれかに記載の複合体、及び
(b) 抗原
を含む、医薬組成物。
[33]該抗原に対する免疫反応を誘導するための、[32]に記載の組成物。
[34]抗原が病原体由来の抗原である、[33]に記載の組成物。
[35]病原体の感染症の予防又は治療用である、[34]に記載の組成物。
[36]病原体がウイルスである、[35]に記載の組成物。
[37]ウイルスがRSウイルス又はインフルエンザウイルスである、[36]に記載の組成物。
型CpG ODNに特有の免疫賦活活性とを併せ持つ。更に、本発明の複合体は強力なワクチン
アジュバント活性を有しており、本発明の複合体を抗原とともに免疫接種すると、該抗原特異的な液性免疫及び細胞性免疫の両方を刺激し、非常に強い感染防御効果を示す。従って、本発明の複合体は、免疫賦活剤やワクチンアジュバントとして有用である。
本発明は、K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸(dA)を含む、オリゴデオキシヌクレオチド(以下、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドと称する。)を提供するものである。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドにはリン酸ジエステル結合が修飾(例えば、一部又は全てのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合により置換)されているものを含む。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは薬学的に許容可能な塩を含む。
なお、本明細書においてオリゴデオキシヌクレオチドとODNは同義である。また、「ヒ
ト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)」と、「ヒト化K型CpGオリゴデオキ
シヌクレオチド(CpG ODN)残基」とは末尾の用語「残基」の有無に関わらず同義であり、
交換可能に用いられる。更に、ポリデオキシアデニル酸とポリデオキシアデノシン酸(残基)は同義である。用語「残基」は、より大きな分子量の化合物の部分構造を意味するが、本明細書中、「ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)」が、独立した
分子を意味するか、より大きな分子量の化合物の部分構造を意味するかは、当業者であれば、文脈から容易に理解可能である。「ポリデオキシアデニル酸」等、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれる他の部分構造に関する用語についても、同様である。
を含有する一本鎖DNAであり、TLR9のアゴニストである。CpG ODNには、骨格配列及び免疫賦活特性がそれぞれ異なる、K型(B型とも呼ばれる)、D型(A型とも呼ばれる)、C型及
びP型の4つの型がある(Advanced drug delivery reviews 61, 195-204 (2009))。本発
明のオリゴデオキシヌクレオチドは、これらのうちK型CpG ODNを含む。
型CpG ODNに特有の免疫賦活活性(例えば、ヒトB細胞を活性化してIL-6を産生させる活性)を有する。
で表されるヌクレオチド配列を含む。
クレオチドであっても良い。
む非回文構造を含有する。更に好適に用いられるK型CpG ODNは1つまたは複数のCpGモチ
ーフを含む非回文構造からなる。
する。また、多くのケースにおいて、一つのヒト化K型CpG ODN中にこの4塩基のCpGモチ
ーフが2又は3個含まれる。従って、好ましい態様において、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれるK型CpG ODNは、少なくとも1個、より好ましくは2以上、更に好ましくは2又は3個、TCGA又はTCGTからなる4塩基のCpGモチーフを含む。該K型CpG ODNが
2又は3個の4塩基のCpGモチーフを有する場合、これらの4塩基のCpGモチーフは同一であっても異なっていてもよい。ただし、ヒトTLR9に対するアゴニスト活性を有する限り、特に限定されない。
クレオチド長)である。K型CpG ODNの長さは、更に好ましくは30ヌクレオチド長以下(例えば、10-25ヌクレオチド長)である。K型CpG ODNの長さは、最も好ましくは、12-25ヌクレオチド長である。
ン、又はシゾフィラン)鎖とともに三重螺旋構造を形成するのに十分な長さであれば特に限定されるものではないが、安定な三重螺旋構造を形成する観点からは、通常20ヌクレオチド長以上、好ましくは40ヌクレオチド長以上、より好ましくは60ヌクレオチド長以上である。ポリdAは、長ければ長いほどβ-1,3-グルカンと安定な三重螺旋構造を形成する
ので、理論的には上限はないが、長すぎると、オリゴデオキシヌクレオチドの合成時の長さにバラつきが生じる原因となるので、通常、100ヌクレオチド長以下、好ましくは80以
下である。一方、前記安定な三重螺旋構造の形成に加え、単位量のβ-1,3-グルカンあ
たりに結合する本発明のオリゴデオキシヌクレオチド量を増大させ、且つオリゴデオキシヌクレオチドの合成時の長さのばらつきの回避、複合化効率の観点からは、ポリdAの長さは、好ましくは、20~60ヌクレオチド長(具体的には、20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59又は60ヌクレオチド長 )、より好
ましくは、30~50ヌクレオチド長(30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50ヌクレオチド長)、最も好ましくは、30~45ヌクレオチド長(30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45ヌクレオチド長)である。特に、30ヌクレオチド長以上の場合、良好な複合化効率を示す。本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ポリdAを含むことにより、2本のシゾフィラン鎖とと
もに三重螺旋構造を形成する活性を有する。なお、ポリデオキシアデニル酸を「ポリ(dA)」又は「poly(dA)」と表記することもある。
ることを特徴とする。この配置により、本発明の複合体(詳細は下に述べる)が、K型CpG
ODNに特有の免疫賦活活性に加えて、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性を有することとなる。
せる活性、及び樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性)を有する限り、特に限定
されないが、通常1~10ヌクレオチド長、好ましくは1~5ヌクレオチド長、より好ましくは1~3ヌクレオチド長である。最も好ましくは、K型CpG ODNとポリdAとが、直接共有結合により連結される。
せる活性)を有する限り、特に限定されないが、通常1~10ヌクレオチド長、好ましくは1~5ヌクレオチド長、より好ましくは1~3ヌクレオチド長である。
及び/又は3’末端の付加的なヌクレオチド配列を含まない。即ち、本発明のオリゴデオ
キシヌクレオチドは、好ましくは、K型CpG ODN、ポリdA及び任意的なスペーサー配列からなり、更に好ましくは、K型CpG ODN及びポリdAからなる。
体的には、例えば、配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチド)及びポリdAからなり、K型CpG ODNが該オリゴデオキシヌクレオチドの5’末端に、ポリdAが3’末端に、それぞれ位置する。具体的には、配列番号1で表されるヌクレオ
チド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’末端に20~60ヌクレオチド長(より
好ましくは、30~50ヌクレオチド長(30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50ヌクレオチド長)、最も好ましくは、30~45ヌクレオチド長(30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45ヌクレオチド長))のポリdAが結合したオリゴデオキシヌクレオチドであり、例えば、配列番号2、又は9~12で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドである。
くは35~100ヌクレオチド長、より好ましくは40~80ヌクレオチド長(具体的には、40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 又は80ヌクレオチド長)、より好ましくは、50~70ヌクレオチド長(具体的には、50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 , 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70ヌクレオ
チド長)、最も好ましくは、50~65ヌクレオチド長(具体的には、50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65ヌクレオチド長)である。
換される)である。即ち、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合の一部又は全てが、ホスホロチオエート結合により置換されている。
チオエート結合、または、ホスホロジチオエート結合による修飾を含み、より好ましくは、該K型CpG ODNのリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合に置換される。また、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、好ましくは、ポリdAにおいて、ホスホロチオエート結合、または、ホスホロジチオエート結合を含み、より好ましくは、該ポリdAのリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合に置換される。更に好ましくは、本発明のヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含むオリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てが、ホスホロチオエート結合に置換される。最も好ましくは、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、ヒト化K
型CpGオリゴデオキシヌクレオチド(例、配列番号1)の3’末端に20~60ヌクレオチド長(より好ましくは、30~50ヌクレオチド長(30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50ヌクレオチド長)、最も好ましくは、30~45ヌクレオチド長(30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45ヌクレオチド長))のポリdAが結合したオリゴデオキシヌクレオチドであって、当該オリゴデオキシヌクレオチドに含まれる全てのリン酸ジエステル結合が、ホスホロチオエート結合に置換されている。ホスホロチオエート結合により、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドにおいて、分解に対する抵抗性のみならず、免疫賦活活性(例えば、B細胞を活性
化させてIL-6を産生させる活性)の増強、及びCpG-β-1,3-グルカン複合体の高収率が期
待されるからである。なお、本明細書におけるホスホロチオエート結合はホスホロチオエート骨格と、リン酸ジエステル結合はリン酸骨格と同義である。
しくは、ヒトB細胞)を活性化してIL-6を産生させる活性)を有するので、免疫賦活剤等
として有用である。更に、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは、2本のβ-1,3-グルカン(好ましくは、レンチナン、シゾフィラン、又はスクレログルカン)とともに三重螺旋構造を形成する性質を有するので、下記の本発明の複合体の調製に有用である。
本発明は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1,3-グルカンを含有す
る複合体(以下、本発明の複合体と称する。)を提供するものである。
を形成することにより、D型CpG ODNの配列を要することなく、D型CpG ODNに特有の免疫賦活活性(例えば、形質細胞様樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性)を獲得する。即ち、本発明の複合体は、K型CpG ODNに特有の免疫賦活活性(例えば、B細胞(好まし
くは、ヒトB細胞)を活性化してIL-6を産生させる活性)と、D型CpG ODNに特有の免疫賦
活活性(例えば、形質細胞様樹状細胞(好ましくはヒト形質細胞様樹状細胞)を活性化してIFN-αを産生させる活性)の両方を有する。
ログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、ラミナラン等を挙げることが出来る。β-1,3-グルカンは、好ましくは、レンチナン、シゾフィランまたはスクレログルカ
ンのように、1,6-グルコピラノシド分枝を多く含有する(側鎖率33~40%)β-1,3-グルカンであり、より好ましくはレンチナン、又はシゾフィランであり、最も好ま
しくはレンチナンである。
は(C6H10O5)n、分子量は約30~70万である。水、メタノール、エタノール(95)、又はアセトンにはほとんど溶けないが、極性有機溶媒であるDMSOや水酸化ナトリウム水溶液に溶解する。
レンチナンは活性化マクロファージ、キラーT細胞、ナチュラルキラー細胞及び抗体依
存性マクロファージ仲介性細胞障害作用(ADMC)活性の増強作用を有する(Hamuro, J., et
al.:Immunology, 39, 551-559, 1980、Hamuro, J., et al.:Int. J. Immunopharmacol., 2, 171, 1980、 Herlyn, D., et al.:Gann, 76, 37-42, 1985)。動物実験において
は同系腫瘍及び自家腫瘍に対して化学療法剤との併用投与により腫瘍増殖抑制作用ならびに延命効果が認められている。また、レンチナンの単独投与によっても腫瘍増殖抑制作用ならびに延命効果が認められている。臨床試験においては手術不能又は再発胃癌患者に対して、テガフール経口投与との併用により生存期間の延長が認められ(医薬品インタビューフォーム「レンチナン静注用1mg「味の素」」)、本邦で承認されている。レンチナン
の単独投与による効果は現在のところ確認されていない。
-グルコシル側鎖からなる(Tabata, K., Ito, W., Kojima, T., Kawabata, S. and Misaki A.,「Carbohydr. Res.」, 1981, 89, 1, p.121-135)。SPGは婦人科癌に対する免疫増強法の筋肉内注射製剤臨床薬として20年以上の使用実績があり(清水, 陳, 荷見, 増淵,「Biotherapy」, 1990, 4, p.1390長谷川,「Oncology and Chemotherapy」, 1992, 8, p
.225)、生体内での安全性が確認されている(Theresa, M. McIntire and David, A. Brant,「J. Am. Chem. Soc.」, 1998, 120, p.6909)。
上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド中のポリデオキシアデニル酸の鎖である。なお、当該複合体は一部に、三重螺旋構造を形成していない部分を含んでいても良い。
は、オリゴデオキシヌクレオチド中のポリデオキシアデニル酸の鎖長、及びβ-1,3-グ
ルカンの長さ等に応じて、変化しうる。例えば、β-1,3-グルカン鎖と、ポリデオキシ
アデニル酸の鎖の長さが同等の場合には、2本のβ-1,3-グルカン鎖と、1本の本発明
のオリゴデオキシヌクレオチドが会合し、三重螺旋構造を形成し得る。一般的には、β-1,3-グルカン鎖に対して、ポリデオキシアデニル酸の鎖長は短いので、2本のβ-1,3-グルカン鎖に対して、複数の本発明のオリゴデオキシヌクレオチドがポリデオキシアデニル酸を介して会合し、三重螺旋構造を形成し得る(図1参照)。
フィラン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、ラミナラン)を含有する複合体であり、好ましくは、ヒト化K型CpG ODN及びβ-1,3-グルカン(例、レン
チナン、シゾフィラン、スクレログルカン)からなる複合体である。より好ましくは、配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に20
~60ヌクレオチド長(具体的には、20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59又は60ヌクレオチド長)のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及びβ-1,3-グルカン(例、レンチナン、シゾフィラン)からな
る複合体(例、K3-dA20~60-LNT、K3-dA20~60-SPG)であり、更に好ましくは、配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に30~50ヌ
クレオチド長(具体的には、30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50ヌクレオチド長)のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及びβ-1,3-グルカン(例、レンチナン、シゾフィラン)からなる複合体
(例、K3-dA30~50-LNT、K3-dA30~50-SPG)であり、最も好ましくは、配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に30~45ヌクレオチ
ド長(具体的には、30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45ヌクレオチド長)のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合に置換されたオリゴデオキシヌクレオチド、及びβ-1,3-グ
ルカン(例、レンチナン、シゾフィラン)からなる複合体(K3-dA30~45-LNT、K3-dA30~45-SPG)である。
に記載された条件と同様に行うことができる。すなわち、本来は、天然で三重螺旋構造として存在するβ-1,3-グルカンを非プロトン性有機極性溶媒(ジメチルスルホキシド(DMSO),アセトニトリル,アセトン等)またはアルカリ水溶液(水酸化ナトリウム、水酸
化カリウム、アンモニア、水酸化カルシウム等)に溶解して一本鎖に解く。このようにし
て得られた一本鎖のβ-1,3-グルカンの溶液と本発明のオリゴデオキシヌクレオチドの
溶液(水溶液、中性付近のpHの緩衝水溶液、又は酸性の緩衝水溶液、好ましくは、水溶液又は中性付近のpHの緩衝水溶液)とを混合し、必要に応じて再度pHを中性付近に調整後、適当時間保持する、例えば、5℃で一夜保持する。その結果、2本のβ-1,3-グルカン鎖と該オリゴデオキシヌクレオチド中のポリdA鎖が三重螺旋構造を形成することにより、本発明の複合体が形成される。生成した複合体に対して、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製、限外濾過、透析等を行うことにより、複合体未形成のオリゴデオキシヌクレオチドを除くことができる。また、生成した複合体に対して、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製を行うことにより、複合体未形成のβ-1,3-グルカンを除くことができ
る。上記の方法により、複合体を適宜精製することができる。
長さ等を考慮して適宜設定することができるが、通常モル比(SPG/ODN)が0.02~2.0、好ましくは0.1~0.5である。更なる態様において、モル比(β-1,3-グルカン(LNT等)/ODN)が例えば0.005~1.0、好ましくは0.020~0.25である。
5~2N、好ましくは0.1~1.5Nのアルカリ水溶液(例えば、0.25N水酸化ナトリウム水溶液)に溶解させ、1℃~40℃で10時間~4日間放置し(例えば、室温で一晩放置する)、一本鎖のLNT水溶液(例えば、50mg/mlのLNT水溶液)を調製する。前記LNT水溶液と別途調製したCpG水溶液(例えば、100μMの CpG水溶液)をモル比(LNT/ODN)0.005~1.0で混合し、続いて、前記LNT水溶液に酸性の緩衝水溶液(例えば、NaH2PO4)を加えて中和し、1~40℃で6時間~4日間(例えば、4℃で一晩)維持することで複合化を完了させる。なお、前記複合化のためにLNT水溶液を最後に加え混合しても良い。複合体の形成は、例
えば、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、CpG ODNの高分子量側へのシフトを240~280nm(例えば、260nm)における吸収をモニタリングすることによって確認することができる。
より形成する粒子の径と同等であり、通常平均粒子径が10-100 nm、好ましくは20-50 nm
である。該粒子径は、複合体を水に溶解し、Malvern Instruments Zeta Sizerを用いて80℃の条件で動的光散乱法により計測することができる。
含む複合体(K3-LNT)及びK型CpG ODN(例えば、配列番号2)とSPGを含む複合体(K3-SPG)は、炎症応答誘導能(pan-IFN-a、IL-6等)、ウイルス接種個体における血清中抗原特
異的IgG抗体価(Total IgG, IgG2c等)の増強作用、ウイルス接種個体における抗原特異
的サイトカイン産生能(IFN-γ,IL2等)、ウイルスに対する感染防御効果を有する。K3-LNTについてはウイルス接種個体においてTh2型サイトカイン(IL-13等)の産生増強能も有する。従って、新規ワクチンアジュバント候補として有用である。
本発明は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は上記本発明の複合体を含む、医薬組成物を提供するものである。本発明の医薬組成物は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は上記本発明の複合体を常套手段に従って製剤化することにより得ることができる。本発明の医薬組成物は、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体と薬理学的に許容され得る担体を含む。また、本医薬組成物は抗原を更に含んでいても良い。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。
重量%程度である。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及び複合体は、優れた免疫賦活活性を有するので、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、複合体及び医薬組成物は、免疫賦活剤として用いることができる。本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、複合体又は医薬組成物を哺乳動物(ヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類等)に投与することにより、該哺乳動物における免疫反応を惹起することができる。特に、本発明の複合体は、D型CpG ODNの活性特性を有し、末梢血単核球を刺激して、I型インターフェロン(Pan-IFN-α、IFN-α2等)及
びII型インターフェロン(IFN-γ)の両方を大量に産生させるので、I型インターフェロ
ン産生誘導剤、II型インターフェロン産生誘導剤、I型及びII型インターフェロン産生誘
導剤として有用である。I型及びII型インターフェロンの両方の産生を誘導することから
、本発明の複合体及びこれを含有する医薬組成物は、I型及びII型インターフェロンのい
ずれか一方又は両方が有効な疾患の予防又は治療に有用である。I型インターフェロンが
有効な疾患としては、ウイルス感染症(例えば、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、RSウイルス、インフルエンザウイルス等)、癌等を挙げるこ
とが出来る。II型インターフェロンが有効な疾患としては、アレルギー疾患、細胞内寄生性の原虫(リーシュマニア等)や細菌(リステリア、結核菌等)等の感染症等を挙げることが出来る。RSウイルスやインフルエンザウイルスを含む急性ウイルス感染症に対しては、I型インターフェロン及びII型インターフェロン共に、ウイルス排除に関する免疫応答
を高めるので、本発明の複合体及びこれを含有する医薬組成物は、急性ウイルス感染症に対する有効性が期待できる。
、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、複合体、及び医薬組成物、特に本発明の複合体及びこれを含有する医薬組成物は、ワクチンアジュバントとして有用である。
本明細書において、アジュバントとは免疫応答を促す補助剤のことであり、抗原とともに生体に投与されたとき、その抗原に対する免疫応答を非特異的に増強させる物質を意味する。
認識し得る限り、特に限定されるものではなく、抗原となるあらゆる物質(タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖質、ならびに前記物質の修飾体(例えば、一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換、及び/又は付加等(以下、変異等)を導入した修飾体など)を用いることができる。抗原としては、原虫、真菌、細菌、ウイルスなどの病原体由来の抗原、癌、または特定の疾患に関係する抗原も用いられ得る。
ポリペプチドのアミノ酸配列が、病原体Xのゲノムにコードされたタンパク質のアミノ酸
配列中に存在することを意味する。
)、B型肝炎ウイルス(HBV)、エボラウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、ポリオウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、黄熱ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ハンタウイルス、デングウイルス、ノロウイルス、ロタウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、ジステンパーウイルス、成人T細胞白血病ウイルス(HTLV-1)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス等が挙げられる。細胞内感染性バクテリアとしては、マイコプラズマ等が挙げられる。細胞内感染性原虫としては、マラリア原虫、住血吸虫等が挙げられる。細胞内感染性病原体は好ましくはウイルス(具体的には、RSウイルス、又はインフルエンザウイルス等)である。
様において、ウイルスとして、I型インターフェロン及びII型インターフェロンの両方が
有効な急性ウイルス感染症を引き起こすウイルス(例、RSウイルス、インフルエンザウイルス)が選択される。
、病原体や癌細胞の表面抗原と内部抗原のいずれを用いることも可能であり、表面抗原と内部抗原とを混合して用いることも、また望ましい。
、当該抗原に対する免疫反応を誘導するための組成物は、上記本発明の医薬組成物に準じて調製することができる。
動物及び試薬
Tlr9欠損マウス及びDectin-1欠損マウスの作成については、以前に記載した(Koyama, S., et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010); Saijo, S., et al., Nature immunology 8, 39-46 (2007))。C57BL/6Jマウスは、日本クレアから購入した。
全ての動物実験は、医薬基盤研究所及び大阪大学動物施設の機関ガイドラインに従って実
施した。以下のCpG ODNsは、(株)ジーンデザインで合成された(下線はホスホロチオエート結合を示す)。
番号11)、K3-dA25(配列番号10)及び、K3-dA20(配列番号9)の合成(表2)について記載する。
に置換されていることを示す。)
持時間を示す(カラム:Waters, X-Bridge C18 2.5μm, 4.6 x 75 mm、A溶液:100 mM ヘ
キサフルオロイソプロパノール、8 mM トリエチルアミン、B溶液:メタノール、B%:5%→30%(20 min, linear gradient);60℃;1 ml/min;260 nm)。
びカードランは、SIGMAから購入した。Zymosan-DepletedはInvivogenから購入した。クロドロネートリポソームはFormuMaxから購入した。インフルエンザスプリットプロダクトワクチン、ホルマリン不活化全ウイルス(WIV)、及び精製インフルエンザウイルス(H1N1
)は、以前に記載したように調製した(Koyama, S., et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010))。
7.22 mgのK3-dA40を水(3.7mL)に溶解した。SPG(三井製糖) 15 mgを0.25 N NaOH (1 mL)に溶解した。1 mLの330 mM NaH2PO4をDNA溶液に加え、次にSPG溶液をDNA/NaH2PO4溶液
に加え、4℃にて一晩維持することにより複合体化を完了した。モル比(MSPG/MDNA)は、0.27に固定した。複合体の形成は、マイクロチップ電気泳動装置(SHIMADZU:MultiNA)
によって確認した。
レンチナン(LNT:味の素株式会社、ロット番号:2D8X1)を50mg/mlとなるように、0.25N NaOHに溶解し、室温で一晩放置した。各種CpG ODN(表2,3)は100mMとなるように
、注射用水に溶解した。LNT水溶液と各種CpG水溶液(K3-dA20(配列番号9)、K3-dA25(配列番号10)、K3-dA30(配列番号11)、K3-dA35(配列番号12)、K3-dA40(配列
番号2))を表4に示す比率で混合し、続いて、添加したLNTと同体積の330 mM NaH2PO4
を加え、4℃にて一晩維持することにより複合体化を完了した。複合体の形成は、サイズ
排除クロマトグラフィーを用い、CpG ODNの高分子量側へのシフトを、260nmにおける吸収をモニタリングすることによって確認した(System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GF7M-HQ (Shodex) 2本連結、Flow rate:0.8mL/min、Buffer: 10mM EDTA PBS, pH7.4、Temperature:40℃)。
PBMCsは、3人の健康な成人男性ボランティア(30~40 歳)から得た。ヒトPBMCsを用
いる全ての試験は、医薬基盤研究所の施設内治験審査委員会により認可された。Ficollを用いてPBMCsを調製後、1 x 107 個/mlの濃度で播いた。PBMCsを、コンプリートRPMI(10%
FCS、ペニシリン、及びストレプトマイシンが添加されたRPMI 1640)中で維持した。PBMCsを、K3 (0.24、0.74、2.2、6.6、20 μg/mL) 、K3-dA40、K3-SPG (K3-dA40の複合体)、dA40-K3、SPG-K3(dA40-K3の複合体)、D35、CpG21798、CpG21889、CpG2395、又はM362で24時間刺激した。上清をpan-IFN-α (Mabtech)、IL-6 (R&D)、及びMilliplex (Millipore)用のELISAに付した。
染色する前に、試料をホルムバール-カーボンコートグリップ上に滴下した。陰性染色のため、2% 酢酸ウラニウム(pH 4.0)の液滴をグリップ上に載せ、風乾させた。グリップ
を電子顕微鏡(Hitachi H-7650)上で40,000倍の拡大率にて観察した。
水溶液中の平均ナノ粒子サイズを、80℃にて、Malvern Instruments Zeta Sizer上で動的光散乱法を用いて測定した。
6週齢C57BL/6Jマウス、Tlr9欠損マウス、及びDectin-1欠損マウスから、マウス脾臓を
採取した。脾細胞を懸濁後、ACK溶解緩衝液で赤血球(RBCs)を溶解し、細胞をコンプリー
トRPMI中で維持した。細胞を1 x 107cells/mLの濃度で播いた。マウス骨髄由来細胞を、
ヒトFlt3L (Peprotech) (100 ng/mL)と共に7日間培養することにより、骨髄由来DCsを
作成した。細胞を1 x 107cells/mLの濃度で播いた。マウスM-CSF (Peprotech) (20 ng/mL)と共に7日間培養することによりBMDMsを作成した。これらの細胞は、コンプリートRPMI中で維持した。
BMDMsを5 x 107 cells/mLで播き、Alexa 488-K3 (1 μM) 及びAlexa 647-K3-SPG (1 μM)、又はAlexa 488-D35 (1 μM) 及びAlexa 647-K3-SPG (1 μM)により3時間刺激した。細胞をHoechst33258で30分染色することにより核を可視化し、次に細胞を固定し、蛍光顕微鏡を用いて解析した。
6週齢のC57BL/6Jマウス、Tlr9欠損マウス、及びDectin-1欠損マウスの尾の付け根に、
OVA (0.1、1、10、又は100 μg);
OVA (0.37、1.1、3.3、又は10 μg)及びK3(538 pmol);
OVA (0.37、1.1、3.3、又は10 μg)及びK3-dA40 (538 pmol);又は
OVA (0.37、1.1、3.3、又は10 μg)及びK3-SPG (538 pmol)
を、0日目及び10日目に投与した。他の試験においては、6週齢のC57BL/6Jマウスの尾の付け根に、
スプリットワクチン(0.1 μg)単独;
スプリットワクチン及びK3 (538 pmol);又は
スプリットワクチン及びK3-SPG (538 pmol)
を、0日目及び10日目に投与した。17日目に採血し、抗原特異的血清抗体力価をELISAにより測定した(図10、15a、16、25、28a、29、43a)。17日目にマウス脾臓を採取し、脾細
胞を上述の方法で調製した。細胞を
OVA257-264 (OVA257):SIINFEKL (10 μg/mL);
OVA323-339 (OVA323):ISQAVHAAHAEINEAGR (10 μg/mL);
全OVAタンパク質 (OVA) (10 μg/mL);
NP260-283 (NP260):ARSALILRGSVAHKSCLPACVYGP (10 μg/mL);又は
スプリットワクチン (10 μg/mL)
により24又は48時間再刺激した。上清を、マウスIFN-γのためのELISAに付した(図11、15b、17、26、28b、30、43b)。テトラマーアッセイのため、脾細胞をH-2Kb OVAテトラマ
ー (MBL)、抗CD8α (KT15)、抗TCRβ(H57-597)、抗CD62L (MEL-14)、及び抗CD44 (IM7)抗体、並びに7-AADで染色した。OVAテトラマー+ CD44+CD8α+ TCRβ+細胞数をFACSにより測定した(図12、15c、27、28c、31)。
6週齢のC57BL/6Jマウスの尾の付け根に、
OVA (100 μg);
OVA及びK3 (3.3 μg);
OVA及びK3-dA40 (3.3 μg);又は
OVA及びK3-SPG (3.3 μg)
を、0日目に投与した。免疫接種後7日目に、ナイーブC57BL/6J脾細胞を、異なる濃度のCFSE(5又は0.5 μM)により、10分間、37℃にて標識した。染色した高濃度の細胞をOVA257
(10 μg/mL)で90分間、37℃にてパルスした。培地で2回洗浄後、標識した細胞を混合し
、静脈内投与により免疫したマウスへ移入した。移入から24時間後、脾細胞を採取し、CFSEで標識した細胞の割合をFACSにて測定した。
C57BL/6Jマウスを、
OVA257 (10 μg);
OVA257及びK3 (10 μg);
OVA257及びK3-dA40 (10 μg);又は
OVA257及びK3-SPG (10 μg)
で免疫した。免疫から7日後に、脾細胞を調製し、H-2Kb OVAテトラマー、抗CD8α、抗TCRβ、抗CD62L、及び抗CD44抗体で染色した。OVAテトラマー+ CD44+ CD8α+ TCRβ+細胞数をFACSにより解析した(図14左)。調製した脾細胞をインビトロにてOVA257 (10 μg/mL)及びGolgi Plugにより4時間、再刺激した。細胞を抗IFN-γ、抗CD8α、及び抗CD3e抗体
で染色し、IFN-γ+ CD8α+ CD3e+細胞数をFACSにて測定した(図14右)。
HEK293を、Lipofectamine 2000を用いて、空、Dectin-1、又はDectin-2発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション後48時間で、細胞を、FITC-SPG (0.5 μM)、Alexa 488-labeled K3-dA40 (0.5 μM)、又はAlexa 488-labeled K3-SPG (0.5 μM)
で、37℃にて、60分間処理した。処理後、細胞を集め、SPG又はCpG ODN陽性細胞をFACSにより解析した。
C57BL/6Jマウス、Tlr9欠損マウス、又はDectin-1欠損マウスからの脾細胞及びFL-DCsをK3-SPG (0.014、0.03、0.04、0.08、0.12、0.25、0.37、0.74、1.1、2.2、3.3、6.7、10
、又は20 μg/mL)、ザイモザン (3.7、11.1、33.3、又は100 μg/mL)、カードラン、Zymosan-Depleted、又は SPGで24時間刺激した。他の試験においては、C57BL/6Jマウス又はDectin-1欠損マウスからの脾細胞を、D35 (1 μM)の存在下又は非存在下で、Zymosan-Depleted (100、33.3、又は11.1 μg/mL)又はSPG (100、33.3、又は11.1 μg/mL)で、24時間刺激した。上清をIFN-α(PBL)、IL-6 (R&D)、IL-12 p40 (R&D)、IL-12 p70 (R&D)、及びBioplex (BIO-RAD)のためのELISAに付した。
C57BL/6Jマウスの付け根に、
DQ-OVA (10 μg);
Alexa 488-K3-SPG (10 μg);
Alexa 647-K3-SPG (10 μg);又は
DQ-OVA及びAlexa647-K3-SPG (10 μg)
を投与した。iLNsを採取後、クリオスタットを用いて凍結切片を調製した。凍結切片を4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、抗Siglec-1 (MOMA-1)、抗MARCO(ED31)、抗CD3e (145-2C11)、又は抗CD11c (N418)抗体とインキュベートした。画像化の結果をImageJによ
り解析した。
C57BL/6Jマウス、Tlr9欠損マウス、又はDectin-1欠損マウスの尾の付け根に、DQ-OVA (10 μg)、Alexa 488-K3 (10 μg)、又はAlexa 488-K3-SPG (10 μg)を投与した。iLN採取の30分前に、マウスの尾の付け根にPE-抗MARCO抗体、又はPE-抗Siglec-1抗体を投与した
。抗原及びアジュバントの投与後1時間に、iLNsを採取し、二光子顕微鏡(Olympus)による画像解析に付した。ピアソン相関を、Volocity共局在解析を用いて計算した。
C57BL/6Jマウスの尾の付け根に、
Alexa 647-K3 (538 pmol)、
Alexa 647-K3-SPG (538 pmol)、
Alexa 488-OVA (10 μg)、
Alexa 488-OVA及びK3 (10 μg)、
Alexa 488-OVA及びK3-SPG (10 μg),
DQ-OVA (10 μg)、
DQ-OVA及びAlexa 647-K3 (538 pmol)、又は
DQ-OVA及びAlexa 647-K3-SPG (538 pmol)
を投与した。投与の24時間後に、iLNsを採取した。単一細胞懸濁液を調製するため、iLNsをコラゲナーゼD (1 mg/mL)及びDNase I (0.1 mg/mL)と37℃にて30分間インキュベートした。調製した細胞を抗B220 (RA3-6B2)、抗CD8α (56-6.7)、及び抗CD11c抗体とインキュ
ベートし、異なるDC集団を分離した。OVA及びCpG ODNsの細胞内取込みをFACSにより解析
した。
免疫接種の5日又は2日前のいずれかに、6週齢のC57BL/6Jマウスの尾の付け根に、クロ
ドロネートリポソームを投与した。0日目に、OVA及びK3-SPGにより、マウスを尾根部にて免疫した。8日目に血液及び脾臓を採取し、血清抗体力価及びT細胞反応をELISAにより測
定した。
C57BL/6Jマウス又はTlr9欠損マウスの尾の付け根に、K3 (10 μg)又はK3-SPG (10 μg)を投与した。投与から24時間後に、iLNsを上述の方法で調製した。細胞を抗CD11c、抗mPDCA-1 (JF05-1C2.4.1)、抗CD8α、及び抗CD40 (3/23) 抗体とインキュベートし、FACSにて解析した。
6週齢のC57BL/6Jマウスに、
スプリットワクチン(0.1 μg);
スプリットワクチン及びK3-SPG (10 μg);又は
WIV(0.2 μg)
を、0日目及び14日目に投与した。免疫接種から2週間後に、血清抗体力価をELISAにより
測定し(図39)、マウスに2.3 x 103 pfu (10 LD50)のインフルエンザウイルス A/PR/8/34を鼻腔内へ接種した。接種後20日間に亘り、マウスの体重及び死亡率をモニターした(
図40)。
カニクイザルの皮下へ、
インフルエンザスプリットワクチン(5 μg)及びK3 (5 nmol);又は
スプリットワクチン及びK3-SPG (5 nmol)
を、0日目及び14日目に投与した。血液試料を、-2、2、4、6、8及び110週目に採取し、血清抗体力価をELISAにより測定した。
群間の統計学的有意性(P < 0.05)は、Student’s t-test又はMann-Whitney U testを用いて決定した。
1)K3-SPGの竿状ナノサイズ粒子は、K型及びD型CpG ODNの2つの特性を獲得する。
図1に示すように、CpG ODNとSPGとの間のよりよい複合体化効率には、変性-復元手順
を通して、5’末端又は3’末端においてポリdA40のPS骨格の追加的配列を要する(Shimada, N., et al., Bioconjugate chemistry 18, 1280-1286 (2007); Minari, J., et al., Bioconjugate chemistry 22, 9-15 (2011))。ヒト化CpG ODNによる複合体形成の最適
化の過程で、本発明者らは、CpG ODNの5’末端及び3’末端の免疫賦活性への影響を調
べた。複合体化効率は同等であるにもかかわらず、SPGと複合体化した5’-K3-dA40-3’は、ヒト末梢血単核球(PBMCs)を活性化し、多量のIFN-αを産生させたが、5’-dA40-K3-3’では、そうではなかった(図2、図3)。K3、K3-dA40及びdA40-K3は、ヒトPBMCsを活性化
してIL-6のような他のサイトカインを産生させることができるが、IFN-αは産生させることが出来なかった(図2、図3)。これらの結果は、新規のTLR9アゴニストとしては、3’-CpGよりも、5’-CpGの方がより望ましいことを示す。
ODNと比較した。K3-SPGで刺激されたPBMCsは大量のIFN-α及びIFN-γを産生したが、D35(図6)、P型及びC型 CpG ODN(図7)により誘導されるそれよりも、かなり低い濃度での刺激においてIFN-αを産生した。これらのIFNsはD型特異的なサイトカインであることが知られているので(Krug, A., et al., European journal of immunology 31, 2154-2163 (2001); Verthelyi, D. et al., Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001); Gursel, M. et al., Journal of leukocyte biology 71, 813-820 (2002))、これらの結果は、K3-SPGが、K型の特性を損なうことなく、D型CpG ODNの特性を獲得したことを示唆する。K型及びD型CpG ODNの二重機能を理解するため、本発明者らは、骨髄由来マクロファージにおけるK3-SPGの細胞内局在を解析した。K3-SPGは、C型CpG ODNのように(Guiducci, C.,
et al., The Journal of experimental medicine 203, 1999-2008 (2006))、K型CpG ODNを含有するエンドソームのみならず、D型CpG ODNを含有するエンドソームとも共局在したことから(図8、図9)、K3-SPGが、K型及びD型CpG ODNにより、エンドソーム媒介自然免疫
シグナル系を伝達した可能性が示唆された。これらの結果は、K3-SPGが、ナノサイズ化した、高次で、且つ完全に可溶化した粒子を形成し、この「オール・イン・ワン」K3-SPGが、他の型のCpG ODN及び従来知られているCpG-SPG複合体よりも強力な活性を示し、これらとは異なる特性を示すことが強く示唆された。
越したワクチンアジュバントである。
本発明者らは、マウス免疫化モデルにおける、K3、K3-dA40、及びK3-SPGのアジュバン
ト効果を比較した。野生型マウスを、OVA単独で、或いは各K3由来アジュバントと共にOVAで免疫すると、K3-SPGが、K3により誘導されるものよりも、有意に高い液性免疫反応(図10)、及びより強力なT細胞反応(図11)を誘導した。注目すべきは、K3-SPGによって、より
多数のOVA特異的CD8T細胞が誘導されることが、テトラマーアッセイにより明らかになっ
た(図12)。共有結合を何らすることなく共投与したタンパク質抗原に対するきわめて強力なインビボCTL活性も認められた(図13)。このK3-SPGによる強力なCTL誘導は、ペプチドワクチン接種によっても再現され(図14)、用量依存的であった(図15)。K3-SPGの抗原節約活性は極めて強く、同等の抗体及びCD4T細胞反応は100倍量のOVA抗原を用いることに
より達成された(図16、17)。これらの結果は、K3-SPGが、K3単独よりも、卓越したアジュバントであることを明確に示す。
Dectin-1は、ザイモザンのようなβグルカンの受容体であることが示されているので(Herre, J., et al., Blood 104, 4038-4045 (2004))、SPG及びK3-SPGの細胞取込、及び
それに引き続くSPG及びK3-SPGによる活性化におけるDectin-1の役割について調べた。フ
ローサイトメトリーを用いて、Dectin-1を発現するHEK293細胞において、ODNの存在に係
わらず、インビトロにおけるSPG又はK3-SPGの取り込みが上昇したが、Dectin-2やコント
ロールベクターでは上昇しないことを見出した(図18、19)。最近、可溶型のβ-グルカンはDectin-1シグナリングを活性化しないことが報告された(Goodridge, H.S., et al., Nature 472, 471-475 (2011))。更に、Dectin-1シグナリングは、サイトカインシグナル
抑制因子1(SOCS1)誘導を介して、TLR9媒介サイトカイン産生を抑制する(Eberle, M.E. & Dalpke, A.H., Journal of immunology 188, 5644-5654 (2012))。そこで、SPGのアゴニスト活性を調べた。脾臓細胞をZymosan-Depletedで刺激すると、用量依存的及びDectin-1依存的なTNF-α及び他のサイトカインの産生が認められたが(図20)、SPG刺激では認め
られなかった(図21)。ザイモザンおよびカードランによるサイトカイン産生は、Dectin-1非依存的であった。Zymosan-Depletedは、CpG ODNにより誘導されたIFN-αを阻害したが
、この阻害はDectin-1欠損により軽減された(図22)。対照的に、SPGはCpG ODNにより誘導されたIFN-αを阻害しなかった(図23)。これらの結果は、SPGはDectin-1のリガンドであ
るがアゴニストではないこと;従ってSPGはTLR9媒介IFN-α産生を妨げないことを示す。
K3-SPGは、CpG ODNとβ-グルカンの複合体であるので、TLR9(Hemmi, H., et al., Nature 408, 740-745 (2000))及びDectin-1(Saijo, S., et al., Nature immunology 8, 39-46 (2007))の役割を、受容体ノックアウトマウスを用いて調べた。Tlr9欠損マウス及びDectin-1欠損マウスからの脾細胞及びFlt3リガンド誘導骨髄由来DCs (FL-DCs)をK3-SPGで刺激すると、サイトカイン産生は完全にTLR9依存的であったが、Dectin-1については、そうではなかった(図24)。インビトロの結果と一致して、K3-SPG及びOVAによるTlr9欠損
マウスの免疫の結果、液性反応及びT細胞反応が減弱した(図25-27)。OVA 及び10μgのK3-SPG でマウスを免疫すると、Dectin-1欠損マウスは、野生型マウスと同等の免疫反応を示
した(図28)。Dectin-1欠損マウスをOVA及び1μgのK3-SPGで免疫すると、抗体産生及びT細胞からのサイトカイン産生については有意な変化は認められないが(図29、図30)、テトラマーアッセイにおいて減弱したCD8 T細胞反応を示した(図31)。これらの結果は、K3-SPG
のアジュバント効果はTLR9シグナリングに依存することを示唆する。SPG及びK3-SPGはDectin-1シグナリングを刺激しないが、K3-SPGの効果は、インビボにおいて、なお部分的にDectin-1に依存する。
K3-SPGは、単純な抗原混合物の免疫接種を通じて、インビボにおいて強力なアジュバント効果をもたらすので、抗原及びK3-SPGの両方を捕捉する細胞が、アジュバント効果の媒介において重要な役割を果たすと仮定した。蛍光標識OVA及びK3-SPGのインビボ分布を調
べるため、蛍光顕微鏡及び二光子顕微鏡を用いた。尾の付け根に注入後1時間以内に、抗原及びアジュバントは流入領域リンパ節(iLNs)に到達した(図32、33、35)。24時間後、いくらかのK3-SPGがCD3e+ T細胞領域に移動し、DQ-OVAと共局在した。K3-SPG及びDQ-OVA
の両方を含有する、iLNのT細胞領域におけるこれらの細胞は、CD11c+DCsであった。
。このことから、LN表面上に分布することが知られている2つの型のマクロファージである、Siglec-1 (CD169又はMOMA-1とも呼ばれる)+マクロファージ(嚢下洞マクロファージ
としても知られる)及びMARCO+ マクロファージ(Martinez-Pomares, L. & Gordon, S., Trends in immunology 33, 66-70 (2012))に焦点をあてることにした。通常の蛍光顕微
鏡を用いた組織学的解析では、全iLN表面を適切に見ることが出来なかった;更に、これ
らのマクロファージはフローサイトメトリー解析により単離することが困難であった(Aoshi, T., et al., European journal of immunology 39, 417-425 (2009); Gray, E.E. &
Cyster, J.G., Journal of innate immunity 4, 424-436 (2012))。そこで、二光子顕
微鏡イメージング解析を用いて抗原及びK3-SPGの分布をエクソビボで明らかにした。抗MARCO抗体及び抗Siglec-1抗体の投与後、特異的マクロファージが可視化された。投与後1
時間にてiLN表面を二光子顕微鏡でモニターすると、OVA及びK3-SPGがMARCO+マクロファージと共局在していたが、Siglec-1+マクロファージとはしていなかった(図33、35)。以前
の報告において、免疫複合体及び不活化インフルエンザウイルスがSiglec-1+マクロファ
ージにより捕捉され、液性免疫反応を誘導することが示唆されている(Gonzalez, S.F., et al., Nature immunology 11, 427-434 (2010); Suzuki, K. et al., The Journal of experimental medicine 206, 1485-1493 (2009))。Volocityの共局在解析による確認の
結果、分布パターンはMARCO+マクロファージのそれと完全に一致しており、Siglec-1+マ
クロファージとは共局在しなかった(図34、36)。対照的に、K3は、K3-SPGと比較すると、MARCO+領域とSiglec-1+領域の間に拡散的に分布していた(図35、36)。また、Tlr9欠損マ
ウス及びDectin-1欠損マウスの両方とも、K3-SPGと同等の局在を示した。K3-SPGのアジュバント効果に対するこれらのマクロファージの貢献を調べるため、尾の付け根にクロドロネートリポソームを注入した後のマクロファージ及びDCsの異なる回復カイネティクスを
試験した。注入後、2日目までにマクロファージは完全に枯渇した。これらの細胞は、少なくとも1週間では回復しなかったが、DCsは、以前報告されているように(Aoshi, T., et al., Immunity 29, 476-486 (2008))、5日目までにほとんど回復した。マクロファ
ージ及びDCsの両方を枯渇させたところ、免疫反応は有意に抑制された(図37; Clo -d2)
。マクロファージのみを枯渇させ、DCsを枯渇させなかった場合、免疫反応は、非処置マウスと同等であった(図37; Clo-d5)。このことは、注入後LNsにおいて、OVA及びK3-SPGの両方ともMARCO+マクロファージにより主に捕捉され、そのマクロファージが適応免疫反応を誘導したことを示唆する。言い換えると、K3-SPGのアジュバント効果はDC集団に大きく依存した。
本発明者らの知見は、ナノ微粒子K3-SPGの大部分は、注入後にiLNsにおけるMARCO+マクロファージにより取り込まれるが、アジュバント効果はDCsによりコントロールされるこ
とを示唆する。そこで、iLNsにおけるDC集団による抗原及びアジュバントの取込に焦点をあてた。投与後24時間において、DC集団による抗原及びアジュバントの取込をフローサイトメトリーにより解析した。3つのDCサブセット(pDCs、CD8α+ DCs、CD8α- DCs)におけるCpG陽性の頻度はK3-SPG注入後に、K3のときよりも有意に増加した。対照的に、OVA陽性DCの頻度は、K3注入後とK3-SPG注入後とで同等であった。抗原及びアジュバントの両方とも陽性のDCsに焦点をあてると、K3-SPGにおいてK3よりもかなりの増加が認められた。注入後24時間において、iLNs におけるpDCs及びCD8α陽性DCsの双方とも、K3-SPGに
より強力に活性化されたが、K3によってはされず、これは全体的にTLR9に依存した(図38)。これらの結果から、pDCs及びCD8α+ DCsが、成熟化のための非微粒子K3ではなく、優先的にナノ微粒子K3-SPGを捕捉し、アジュバント効果を発揮することが示された。
K3-SPGのアジュバント効果を、マウス及び非ヒト霊長類において、より臨床的に関連するインフルエンザワクチン接種モデルを用いて調べた。マウスをエーテル処理ヘムアグルチニン抗原濃縮ビリオン不含スプリットワクチン(SV)及び表示したアジュバントで免疫接種し、抗体反応及びT細胞反応を比較すると、K3-SPGは、K3よりも優れたアジュバント
効果を示した(図43)。より重要なことに、SVとK3-SPGによる免疫接種により、ビルトインアジュバントとしてウイルスRNAを含有する(Koyama, S., et al., Science translational medicine 2, 25ra24 (2010))、全(ビリオン)不活化ワクチン(WIV)(0.2 μg/マウス)を用いたワクチン接種と比較しても、100倍大きな抗体反応が生じた(図39)。SV
(0.1 μg/マウス)及びK3-SPGで免疫接種したマウスは、WIVで免疫化したマウスよりも体重の減少が少なかった(図40)。驚くべきことに、WIVワクチン接種マウスでは僅か10%
のみ生存をもたらす用量において、K3-SPGは、致死的なPR8ウイルス負荷に対して100
%防御をもたらした(図40)。これらの結果は、マウスモデルにおいて、K3-SPGがタンパク質又はタンパク質ベースのワクチンの強力なアジュバントとして機能するとの考えを強力に支持した。この知見を、カニクイザルを用いた非ヒト霊長類モデルに拡張することとした。0日目及び14日目に、各群3匹のカニクイザルをK3又はK3-SPGと共にSVで免疫接種した。血清抗体力価を8週間に亘ってモニターした。SV及びK3-SPGにより、免疫接種の2週間後に有意に高い抗体力価が誘導され、この力価は少なくとも更に6週間に亘って高いままであった(図41)。免疫接種から2年(110週)後において、K3-SPG群は、K3群よりも
高い抗体力価を示した(図42及び43)。まとめると、これらの結果から、K3-SPGが非ヒト霊長類モデルにおいても卓越したワクチンアジュバントであることが示唆された。
ヒトPBMCs(Lonza社、Cat# CC-2702、Lot# 0000396517)を用いて、K3(K3-dA30, K3-dA35, K3-dA40)単独、K3-LNT複合体(K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT)及びK3-SPG複合体(K3-dA40-LNT)のpan-IFN-a(hIFNa)とIL-6(hIL-6)の産生誘導能を評価し
た。
結果を図44に示す。低用量の刺激において、pan-IFN-aとIL-6産生は、K3とSPGとの複合体であるK3-SPG、およびK3とLNTとの複合体であるK3-LNTにおいて、K3単独に比べて高
いことが認められた。また、dA tail長(dA30, dA35, dA40)が異なるK3-LNTによって誘
導される炎症性サイトカイン産生能は、ほぼ同等である可能性が示唆された。更に、K3-SPGとK3-LNTの炎症性サイトカイン産生能を比較すると、K3-SPGに比べて、K3-LNTによるpan-IFN-a産生誘導能が高い可能性が示唆された。一方、IL-6産生量においては、K3-SPGとK3-LNTは同等であることが認められた。
、血清中RSV F抗原特異的IgG抗体価
7週齢のC57BL/6マウスの尾根部に、一匹あたりRSV F抗原0.5 μgと各種アジュバント(K3単独(K3-dA30, K3-dA35, K3-dA40)、K3-LNT複合体(K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT)及びK3-SPG複合体(K3-dA40-SPG)、リン酸アラム)10 μgを2週間隔で2回免
疫した。最終免疫から1週後に末梢血の回収と血清の調製を行い、評価試料とした。血清
中のRSV Fワクチン抗原に結合する抗体価は、ELISA法を用いて測定した。図45に示されるとおり、RSV F抗原特異的なTotal IgG誘導は、RSV F抗原単独接種群(F)に比べて、アジュバント添加によって増強されており、K3単独(F+K3-dA30, F+K3-dA35, F+K3-dA40)
、K3-LNT(F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT)及びK3-SPG複合体(F+K3-dA40-SPG)とリン酸アラム(F+Alum)のアジュバント効果は同等である可能性が示唆された。Th2型アジュバントであるリン酸アラム(F+Alum)を接種したマウス群では、IgG1サブク
ラス誘導能がRSV F抗原単独接種群に比べて高いことが認められた。一方、IgG2cサブクラス抗体において、K3単独(F+K3-dA30, F+K3-dA35, F+K3-dA40)、K3-LNT(F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT)、K3-SPG(F+K3-dA40-SPG)を接種した免疫群では、
リン酸アラム(F+Alum)に比べて高い結果が示されており、K3-LNT複合体はK3-SPGと同様のTh1型アジュバントである可能性が示唆された。
る、RSV F抗原特異的サイトカイン産生能
7週齢のC57BL/6マウスの尾根部に、一匹あたりRSV F抗原0.5 μgと各種アジュバント(K3単独(K3-dA30, K3-dA35, K3-dA40)、K3-LNT(K3-dA30-LNT, K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT)及びK3-SPG複合体(K3-dA40-SPG)、リン酸アラム)10 μgを2週間隔で2回免疫した
。最終免疫から1週後に脾臓を回収し、脾臓細胞を調製した。96 well培養プレートに播種した脾臓細胞を、RSV F抗原のMHC class I拘束性エピトープペプチド、MHC class II拘束性エピトープペプチド、ワクチン抗原タンパク質それぞれで刺激し、24時間もしくは48時間、培養した。RSV F抗原特異的サイトカイン産生能は、培養上清を試料とし、サイトカ
インELISA法を用いて評価した。本検討では、Th1型サイトカインであるIFN-g、活性化T細胞から産生されるIL-2、Th2型サイトカインであるIL-13の3種のサイトカインについて評
価した。
その結果、図46に示されるとおり、RSV F抗原特異的なIFN-g産生誘導とIL-2産生誘導の増強効果は、K3-LNT(F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT)とK3-SPG(F+K3-dA40-SPG)で同等である可能性が示唆された。Th2型アジュバントであるリン酸アラム
アジュバント接種群(F+Alum)では、IFN-g産生はいずれの刺激においても検出限界以下
であった。一方、IL-13産生増強効果は、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群で高く認められ、Th1型アジュバントであるK3-SPG接種群では低い結果となった。興味深い
ことに、K3-LNT接種群(F+K3-dA30-LNT, F+K3-dA 35-LNT, F+K3-dA 40-LNT)においては
、同じTh1型アジュバントであるK3-SPG接種群(F+K3-dA40-SPG)に比べ、高いIL-13産生
増強効果を示した。このことから、K3-LNT複合体は、K3-SPGが有する高いTh1応答増強効
果に加え、Th2応答増強能も有することが示唆された。
ける、RSV感染防御効果
6~7週齢のコットンラットの尾根部に、一匹あたりRSV F抗原1 μgと各種アジュバント(K3-LNT(K3-dA35-LNT, K3-dA40-LNT)及びK3-SPG複合体(K3-dA40-SPG)、リン酸アラ
ム)10 μgを2週間隔で2回免疫した。最終免疫から2週後に、RSV血清型A(Long株)をコッ
トンラットに経鼻接種を用いて攻撃感染させ、その3日後に肺内ウイルス量を計測した。Synagis(palivizumab)投与群は、Synagis 2.5 mg /kgを攻撃感染一日前に筋肉内投与し
、上記と同様に感染防御能の評価を行った。中和抗体価は、攻撃感染直前に麻酔下でラット頚静脈から採血し、得られた血清を用いて検討を行った。
図47の左に肺内ウイルス量の結果を、右に中和抗体価の結果を示す。肺内ウイルス量の結果から、PBS-投与群では約105pfu/lungのウイルス量が認められるのに対し、リン酸
アラム添加RSV Fワクチンを投与した群(F+Alum)では、平均値で約100倍もの低いウイルス量に抑えられていた。一方、K3-SPG添加ワクチン投与群(F+K3-dA40-SPG)においても
、感染防御誘導能が認められた。最も良好な感染防御効果を示したのは、K3-LNT添加ワクチン群(F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT)であり、リン酸アラムやK3-SPGに比べて、高い感染防御能に寄与する新規ワクチンアジュバント候補である可能性が示唆された。
中和抗体誘導能においては、リン酸アラム添加ワクチン投与群(F+Alum)において、シナジスと同等の血中中和活性が認められた。一方、K3-SPG添加ワクチン投与群(F+K3-dA40-SPG)においては、4匹中3匹で中和抗体がほとんど誘導されていないことから、K3-SPG
が寄与する感染防御効果は中和抗体非依存的な機作によるものと考察された。また、K3-LNT投与群(F+K3-dA35-LNT, F+K3-dA40-LNT)においては、K3-SPGに比べて、高い中和抗体が認められていることから、K3-LNTアジュバントはK3-SPGと異なる特性、例えばTh2応答
増強能、を有している可能性が示唆された。
型CpG ODNに特有の免疫賦活活性とを併せ持つ。更に、K3-SPG及びK3-LNTは強力なワクチ
ンアジュバント活性を有しており、K3-SPG又はK3-LNTを抗原とともに免疫接種すると、該抗原特異的な液性免疫及び細胞性免疫の両方を刺激する。従って、本発明の複合体は、免疫賦活剤やワクチンアジュバントとして医薬分野において有用である。
Claims (37)
- ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に配置されている、オリゴデオキシヌクレオチド。
- ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなる、請求項1又は2に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されている、請求項1~3のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されている、請求項4のオリゴデオキシヌクレオチド。
- ポリデオキシアデニル酸の長さが、20~60ヌクレオチド長である、請求項1~5のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- 請求項1~6のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ-1, 3-グルカンを含有する複合体。
- β-1, 3-グルカンが、レンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、又はラミナランである、請求項7に記載の複合体。
- β-1, 3-グルカンがレンチナン、シゾフィラン、又はスクレログルカンである、請求項8に記載の複合体。
- 下記(i)に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、及び(ii)に記載のβ-1, 3-グル
カンからなる複合体。
(i)配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に20~60ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合で置換されているオリゴデオキシヌクレオチド
(ii)レンチナン又はシゾフィラン - 三重螺旋構造状のものである、請求項7~10のいずれかに記載の複合体。
- B細胞を活性化してIL-6を産生させる活性、及び樹状細胞を活性化してIFN-αを産生さ
せる活性を有する、請求項7~11のいずれかに記載の複合体。 - 請求項1~6のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項7~12のいずれかに記載の複合体を含む、医薬組成物。
- ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための、請求項13に記載の医薬組成物。
- ウイルス感染症の予防又は治療のための、請求項14に記載の医薬組成物。
- ウイルス感染症がRSウイルス、又はインフルエンザウイルス感染症である、請求項15に記載の医薬組成物。
- 請求項7~12のいずれかに記載の複合体を含む、I型及び/又はII型インターフェロ
ン産生誘導剤。 - 請求項1~6のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項7~12のいずれかに記載の複合体を含む、免疫賦活剤。
- ワクチンアジュバントである、請求項18の免疫賦活剤。
- [1]~[6]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項7~12のいずれかに記載の複合体を含む、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療剤。
- ウイルス感染症がRSウイルス、又はインフルエンザウイルス感染症である請求項20に記載の予防又は治療剤。
- 医薬組成物の製造のための、請求項1~6のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項7~12のいずれかに記載の複合体の使用。
- 医薬組成物が、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための医薬組成物である、請求項22に記載の使用。
- ウイルス感染症がRSウイルス、又はインフルエンザウイルス感染症である、請求項23に記載の使用。
- 請求項1~6のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項7~12のいずれかに記載の複合体の薬理的有効量を温血動物に投与することを含む、当該温血動物における疾患の治療もしくは予防のための方法。
- 疾患が、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症である、請求項25に記載の方法。
- ウイルス感染症が、RSウイルス、又はインフルエンザウイルス感染症である、請求項26に記載の方法。
- 温血動物が、ヒトである、請求項25~27のいずれかに記載の方法。
- 請求項1~6のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項7~12のいずれかに記載の複合体の薬理的有効量を温血動物に投与することを含む、当該温血動物における防御免疫反応を誘導する方法。
- ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の治療又は予防において使用するための、請求項1~6のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項7~12のいずれかに記載の複合体。
- ウイルス感染症が、RSウイルス、又はインフルエンザウイルス感染症である、請求項30に記載のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体。
- (a)請求項1~6のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項7~1
2のいずれかに記載の複合体、及び
(b) 抗原
を含む、医薬組成物。 - 該抗原に対する免疫反応を誘導するための、請求項32に記載の組成物。
- 抗原が病原体由来の抗原である、請求項33に記載の組成物。
- 病原体の感染症の予防又は治療用である、請求項34に記載の組成物。
- 病原体がウイルスである、請求項35に記載の組成物。
- ウイルスが、RSウイルス又はインフルエンザウイルスである、請求項36に記載の組成物。
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