CN1032190C - 减少药物副效应的单片脂质体的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种用于减少药物副效应的、结合有对正常细胞物异性抗体的、能输送到所述正常细胞的单片脂质体的制备方法。该方法是制备含有解毒剂的单片脂质体，所述解毒剂针对能损害所述正常细胞的药物，然后将单克隆抗体结合到所述脂质体上，所述单克隆抗体为针对所述正常细胞的非补体固定的单克隆抗体。

Description

减少药物副效应的单片脂质体的制备方法

本发明系属化学疗法领域，更具体地说，它涉及减少化学治疗剂副效应的方法。

假如副效应并不妨碍较大剂量的使用，那么药物将变得更有效。副效应的引起并不是完全集中于需作治疗的生物体细胞或微生物的作用，副效应的引起特别是由于药物对某些生物体细胞的错误处置所致，因该生物体细胞不是该药物的针对性的目标。举例来说，假如希望处置其他目标的药物对胃肠细胞仍然有毒性，那么就能产生恶心、呕吐和腹泻，以及胃肠出血。假如药物对造血细胞有毒性，则能产生贫血症、对感染的易感性(由于白细胞数不足)和出血。假如药物对皮肤细胞有毒性，则能产生脱发和皮疹。

癌难以从人体根除掉的理由是那些作用剂它既杀灭了癌细胞同时也杀灭了那些如肠、造血骨髓和皮肤的正常分裂细胞。假如正常细胞能受到保护而避免抗癌剂的细胞毒素的作用，那么就能安全地使用较高量的抗癌剂。因为高剂量能杀灭较高百分比的癌细胞，这样才有可能杀灭因目前使用低剂量而能存活的那些少量的癌细胞。

病毒难于从人体根除的理由是由于那些作用剂它既杀灭了病毒同时也杀灭了正常的分裂细胞。假如正常细胞能受保护而避免抗病毒剂的细胞毒素的作用，那么人们能使用充分足够剂量的这种药剂来根除威胁生命的病毒。举例来说，叠氮胸苷已被发现在治疗后天获得性免疫缺陷综合症即爱滋病(AIDS)中能延长生命。根据“技术背景”(Backgrounder)(癌症交流通讯处，国家癌症研究院出版)1986年9月19日记载，“AZT为胸苷的衍生物，为DNA(基因)正常组分之一，这基因是宿主细胞和病毒制取复制所需的化学药品所需要的。当AZT进入被HTLV-III(引起爱滋病的病毒)感染的细胞时，该药物浸没带有假DNA结构单元的细胞，所以病毒不能自身复制。一旦这种情况发生，病毒感染和复制就被止住，由此保护了目标细胞”。遗憾的是，注射入血流内的叠氮基胸苷也可达及骨髓的造血细胞。在那里，叠氮基胸苷止住了再生血细胞的复制。其结果是造成贫血症和减少了白血细胞数目。NCI Backgrounder(刚才引用的出版物)中叙述说“在大剂量情况下，有可能使药物对骨髓的抑制将成为一有限的因素”。假如我们保护这些骨髓细胞使不受AZT的损害作用，我们就能使用高剂量的AZT，并导致根除爱滋病毒的较大的机会。

其他抗微生物的药物具有剧烈的副效应以致限制了它们的应用。庆大霉素和有关药物如托普霉素和氨基羟丁基卡那霉素A，近于青霉素，在对虚弱病人(如后期外科的、年长的、危及免疫的)的脓毒症的治疗方面为最重要的抗生素。然而，这些药物也能损害肾脏细胞以及前庭的和听觉的感觉细胞，并且不能经常用合适的剂量和较长充分的时间。保护好肾脏、前庭和听觉的感觉细胞使不受这些抗生素的有害的作用，便能延长这些药物的使用，以导致拯救更多的生命。

本人已发明了一种新颖的方法，能集中药物效应，并减少药物的副效应，它是通过保护生物体细胞，它不意味着受所述药物影响而避免所述药物的不希望有的效应。更具体地说，本人的方法是当使用该药物时，给需要保护的生物体细胞优先地输入该药物的解毒剂，所述的作为目标的输入，其完成的方法是将与所述生物体细胞具有亲和性的抗体与解毒剂，或载体，或载有解毒剂脂质体相结合使用。以另一方式来描述，当第一个化学药品为第二个化学药品的解毒剂时，本发明就是利用该第一化学药品且与抗体相结合使用，该抗体来自下述各类别，包括有对骨髓细胞具有亲和性的抗体，与胃肠细胞具有亲和性的抗体，对口咽细胞具有亲和性的抗体，对呼吸系统细胞具有亲和性的抗体，对基础角蛋白细胞具有亲和性的抗体；此时该第二种药物被用来治疗生物有机体中的另一个目标。

关于“药物”(“drug”)这个术语，本人意指化学治疗剂，如《治疗学药理基础》(The Pharmacologic Basis of Therapeutics)(编著者：A.G.Gilman，L.S.Goodman A.Gilman；纽约MacMillan出版公司1980年出版或稍后的版本)。对本发明来说，术语“药物”(“drug”)包括离子辐射，当它被用于治疗疾病时，因为辐射高能粒子起到药物的作用。

对于术语“解毒剂”(“antidole”)，本人意指对具体特定药物的细胞效应起反作用的化学物质。举例来说，亚叶酸为抗癌药物氨甲蝶呤的解毒剂，胸苷为抗癌药物5-氟尿嘧啶(5-FU)和5-氟脱氧尿苷(FUdR)的解毒剂，并为爱滋病(AIDS)药物AZT的解毒剂，尿苷为阿扎利宾(azaribine)的解毒剂，以及脱氧胞苷为胞嘧啶阿糖酐的解毒剂。亚叶酸为长春花碱和长春新碱的弱解毒剂。但谷氨酸和天冬氨酸为长春花碱的解毒剂。

关于确定何种化学药品可用作任何给定药物的解毒剂，这里有某些逻辑规定：

1)假如药物是通过天然代谢物的非官能类似物起作用的(例如，AZT或5-FU)，这种药物的解毒剂为天然(官能的)代谢物，对该代谢物来说，该药物就是类似物(对AZT或5-FU，胸苷而言)。

2)假如药物通过可逆地阻断酶的作用，而此酶为制造特定代谢物所非常必需的(例如，该酶二氢叶酸还原酶在制造胸苷中受氨甲蝶呤的阻断)，这种药物的解毒剂为特定的代谢物，它的制造可受该药物的阻断(例如，在氨甲蝶呤的例子中，按刚才描述的逻辑，胸苷也为一种解毒剂)。

3)假如在细胞中发现对给定药性的天然抗药性有发展增大，人们能够得知细胞是如何变得有抗药性的，并且同时能找到一种解毒剂。举例来说，通过增加酶的合成，一旦药物进入细胞，酶就能帮助降解该药物，这样细胞就能对药物的作用往往会变得更有抗药性。所述的酶就是该药物的解毒剂。作为此规则的推论，即在细胞内环境中它能降解药物并能以其他方式起无损害作用的一种酶可以为一种解毒剂。有些细胞能抵抗博莱霉素的作用由于细胞内具有较高浓度的博莱霉素水解酶。对胞嘧啶阿糖酐的抗药性也归因于胞苷脱氨酶，对重要的氨基糖苷抗生素的抗药性则归因于乙酰基转移酶和氨基糖苷失活酶。在肝中可大量发现的黄嘌呤氧化酶能解毒6-巯基嘌呤和咪唑硫嘌呤。这些酶，当送入到需要保护的细胞的细胞质中时，就成为它们所解毒的药物的解毒剂。

4)将离子化辐射作为药物的情况，人们能在“辐射保护器”如WR-2721和WR-1065(Walter Reed Army Institute of Research，Washington，D，C.)中所熟知的化学药品中找到此种解毒剂。

5)本人仍在探索的新途径是将外来的过量的、药物可与其结合的目标结构物送入到细胞的细胞质中(将二氨二氯络铂送入至脱氧核糖核酸中)，插入法(将阿霉素、道诺霉素用脱氧核糖核酸插入)或直接改变法(以DNA和如鸟嘌呤组分的烷基化物)。在此例子中，DNA断片(如鸟嘌呤基的富集DNA断片，经人工合成的)可作为解毒剂。一旦进入细胞质，DNA断片能与进入的细胞毒素的药物分子反应，使它们对细胞的“真实”官能DNA无害。

6)有些药物通过细胞由产生的游离基而起作用(例如阿霉素)。在这种情况下，游离基清除剂如α-生育酚(维生素E)和辅酶Q可用作解毒剂。阿霉素的使用由于它的心脏毒素而受到限制，心脏毒素似乎特别是由于产生游离基而引起的。前面所述的清除剂能用作心肌细胞的解毒剂。

当寻找解毒剂时，可使用已知的经验证据或进行在体内或在试管内的试验。举例来说，人们能确定一种物质是否能合格地作为本发明目的的“解毒剂”，其方法如下：将试验的“解毒剂”加入到需保护的生物体细胞的组织培养液中，然后将为其试验解毒剂的药物加入至组织培养液中。人们可评价该试验“解毒剂”在组织培养液中的细胞上对药物作用所具有的效果，以便确定该试验“解毒剂”的可接受性。对有些解毒剂来说，如蛋白质和酶，人们需提供试验解毒剂的方法装置在培养的生物体细胞内取得。例如，将酶放入至脂质体内(下面将作讨论)和当脂质体膜和细胞融合时使酶进入细胞质中。

有多种方法，人们可“优先地将(解毒剂)输送入需保护的生物体细胞中”。人们可将解毒剂与对需保护的生物体细胞具有亲和性的抗体共价结合。现有技术继续按方法论谋求发展，但是本人参考Hurwitz，E.，Ccancer Res，35；1175-，1975的文献资料，他描述了一种成功的键合方法，通过待结合的药物的高碘酸盐氧化作用，并将经氧化的药物与抗体发生反应，接着通过氢硼化物还原试剂。特别有用的技术是由细胞基因公司(Cytogen Corporation)所开发的，(Princeton，New Jersey，USA-Rodwell，J，D，et al.Proc.Nat.Acad.Sci.83；2632-2636，1986)，它利用在抗体重链的一定部位发现的低聚糖。将低聚糖进行化学或酶氧化为醛类，产生基团，它与含有此种官能基团的化合物反应，如胺类、肼类、酰肼类和氨基硫脲类。此种特定部位的改变能产生比较均一的抗体结合，它具有未受损害的抗原结合的特点。这些“衔接物”结合也是“有条件地稳定的”，即该衔接物释放对应于所谓“第二信号”的药物。连接抗体的药物依附于目标细胞和第二信号，如蛋白水解酶，破坏该结合，释放出药物进入围绕于目标细胞周围的细胞外的空间。除酶之外(如补体、血纤维蛋白溶酶、和弹性蛋白酶)，衔接物也能被制成例如对pH变化发生敏感，或放射性同位素。例如使用“第二信号”不是经常必需的，因为细胞将会摄取依附于其外膜的内部药物。

在细胞基因公司(Cytogen Corporation)工作之前，一般地说，将药物直接结合在抗体上而不引起药物或抗体的官能损失，这是感到有些困难的。因此，发现许多较好的情况是，首先将药物与一载体结合，接着该载体依次又与抗体相结合。在此法中，有可能将药物的更多分子与抗体结合而不引起抗体官能的损失。成功的例子是M.Garnett，M.J.Embleton E.J acobs和R.W.Baldwin(Int.J.of Cancer：661-670，1983)的实例，他采用清蛋白作为载体。Reisfeld和他的小组近来又采用共轭缀合技术，利用一种酸敏感的衔接物，顺式鸟头酸酐(Proc.Nat.Acad.Sci.85：1189-1193，1988)另一个虽较少有希望但颇感兴趣的技术是利用多谷氨酸作为中间载体，如由O.F.Rowland(Nature255：487-，1975)所描述的那样。

在较理想的具体方案中，并且特别当使用酶为解毒剂时，该解毒剂被“结合”到抗体上的方法是，首先将它们放在脂质体内。然后抗体共作结合于脂质体的壁上，并以这样的方式，即保存抗体的能力来认识和在目标细胞表面上与抗原相连接在一起的方式。该技术将在下面加以叙述。

脂质体为小球体，是当磷脂在含水区域使其溶胀而形成。在脂质或脂质体的含水相内，脂质或水溶性物质内，可各自分别捕集之。脂质体的一些物理性质可随意变更：大小(半径)能被调节，从单片脂质体的约12毫微米到多片型式的达几个微米，并且通过加入带电荷的酚衍生物可施加有正的或负的表面电荷(Gregoriadis，G.，Methods in Enzymology 44：698-，1976)。对截留物质渗透性的控制和稳定性的控制，通过将甾醇或其他脂类加入到脂质体结构中的方法也是可行的(Gregoriadis，G.，刚才引用的参考资料)。

这些脂质体能在本国制造，以一目标细胞，通过附着抗体的方法(Barbet，J.，Machy，P.，δL.Leserman，J.Supramolecular Structure and Cellular Biochemistry 16：243-258，1981(cellular Recognition，p，237-252)；Leserman，L.，Barbet，J.，δF.Kourlisky，Nature 288：602-604.1980；Machy，P.，Pierres，M.，Barbet，J.，δL.Leserman.J.，Immunology 129：2098-2102.1982；Machy，P.，δL.Leserman，EMBO J.3(9)：1971-1977.1984；Konno H.et al.Cancer Res.47：4471-4477.1987)。

最好，该脂质体应为单片的，直径约为350-600埃，并且可为中性或带正电荷的。在制造适用的脂质体的技术中，许多方法是已知的(Juliano，R.L.，Stamp，D.，Biochem.Biophys，Res.Comm.63(3)：651-658，1975；还有Ann，New York Acad，Sci.308：411-432，1978，还有Canad.J.Ppysio.Pharmacy57(5)：535-539，1979，和Biochem.Pharmacol.27：21-27，1978；Kimelberg，H.K.，Cancer Res.36：2949-2957，1976；前面引用过的Barbet，J.，Machy，P.，δL.Leserman的著作； Gregoriadis，G.Nature 265：407-411，1977；Gregoriadis，G.，New England J.Med.295(3)：704-710，1976和295(14)：765-770，1976)。大量的情报信息可在研究文献中得到，其中描述了如何变更脂质体的大小、电荷和含量(Gregoriadis，G.，Leathwood，P.D.，δRyman，B.E.，Fed.Europ.Biochem.Soc.Letters 14：95-99，1971；Gregoriadis，G.，Fef.Europ.Biochem.Soc.Trans.2：117-119，1974 ；Gregoriadis，G.δRyman，B.E.，Europ.J.Biochem.24：485-491，1972；Magce，E.E.，Miller，O.V.，Nature 235：339-340.1972；Kobayashi，T.，Gann66：719-720，1975；GregoriadisG.Biochem.Soc.Trans.2：117，1974 ；GregoriadisG.Fed.Europ Bioch.Soc.Letters 36(3)：292-1973；Gregoriadis，G.δE.D.Necrunjun Biochem Biophys，Res，Comm.65：537-544，1975)。

为将脂质体输入至目标细胞的适用的抗体，可通过标准免疫的方法来制造，该方法包括由G.Gregoriadis(Biochem.Biophysic.Res.Comm.65：537—544，1975)所描述的内容。然而，单克隆抗体的制造方法是最好的方法，它可提供大量的提纯的抗体(Kohler，G.δC.Milstein，Nature 256：495—497，1975；Barbet.J.，Machy，P.，δL.Leserman，上面所引用的)。最好，本发明所用的抗体应为非补体固定的。现在有许多适用的在商业上可得到的抗体(例如，MRXOXI小鼠的抗鼠白细胞普通抗原；OKT—10小鼠抗人类骨髓细胞)。对骨髓茎的细胞和血微粒和血小板的前体细胞来说，人们可用抗体来与对小鼠骨髓细胞的T200糖蛋白有活性的那些抗体作比较。对于胃肠细胞来说，较好的是使用IGGI单克隆抗体来对付结肠和小肠小囊和茎细胞的侧基膜。其他需要保护的消化系统的的细胞包括有口咽、食管和胃的细胞。对皮肤细胞来说，最好是使用单克隆IGGI(免疫球蛋白)抗体来对待基础角蛋白细胞(和头发滤泡小囊角蛋白细胞)。虽然有些正常的分裂细胞的分裂减少了并且可不需保护，但当使用抗有丝分裂的、细胞毒素的(细胞溶解的)药物时，在一定用药条件下这种细胞可需要保护，如在延长用药时间或超高剂量用药的条件下。前句中所指的细胞包括呼吸上皮细胞、泌尿上皮细胞、和肝细胞。有些药具有特殊的器官毒性(氨基羟丁基卡那霉素A抗生素对于肾细胞和耳细胞；阿霉素对于心肌细胞的毒性)，并且在此种情况下，可使用对受作用器官具有亲和性的抗体。

输入需保护细胞的解毒剂的剂量必须适当以提供所述的保护。举例来说，在使用亚叶酸时，必须输入至少为1摩尔的亚叶酸到被保护的细胞内(对每一摩尔进入所述细胞中的氨甲蝶呤而言)。将脂质体直接注射到动脉内，输液给需保护的细胞，可能会带来好处(例如，腹腔和上肠系膜动脉，输液给胃肠细胞)。在细胞毒素(细胞溶解)药物加入到同一介质之前，解毒剂应被加入到活性循环物体的流体(血液)中，浸泡需保护的细胞，以便使解毒剂及时到达其目标细胞中。虽然解毒剂如亚叶酸已被发现能减弱氨甲蝶呤的毒性效应，甚至当随着给药氨甲喋呤3小时后，若再给药解毒剂，其减弱作用是很快的。在本发明的例子中，最好在投药细胞毒素(细胞溶解)药物2—12小时之前，就投药解毒剂，因为解毒剂供送至需保护的细胞中要化费时间，又因引导抗体的供送是比较慢的。当然，人们可以通过增加抗体—结合—解毒剂的药量加速供药，但是考虑到的经济问题就限制了该方法。

人们可以预先制造好所需的解毒剂—载体—抗体配位化合体(包括在结合至抗体的脂质体之内的解毒剂)、例如，已被发现对另一种药物来说为解毒剂的任何药物，它能与抗体配位化合而进入骨髓茎细胞，与抗体配位化合进入结肠细胞，与抗体配位化合进入基础角蛋白细胞等等。各种类型的配位化合物可被置于低温贮存架上供以后之用。

以下为如何实施本发明的例子，提出这些例子仅是为了说明，不应认为是本发明的范围就限于这些例子或甚至这些例子必需提出最好的操作模式。

实施例1含有亚叶酸(钠盐)单片脂质体，其制造方法如下：用卵磷脂酰胆碱(卵磷脂)、胆甾醇和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、3-(2-吡啶二硫)丙酸酯，其摩尔比为64∶35∶1，并且对此脂质体使其与白血细胞的骨髓前体具有亲和性的抗体相结合，它可采用适合的Barbet的方法(J.Supramol，Structure & Cell Biochem.前面已引用过)，使用异源双功能交叉衔接剂。在治疗癌症投药氨甲蝶呤之前数小时，可将这些脂质体进行静脉注射。氨甲蝶呤的骨髓毒性可大大降低。特别有益的是同时使用；1)结合对胃肠、食管和口咽细胞具有亲和性的抗体的脂质体，2)结合对皮肤细胞具有亲和性的抗体的脂质体，3)结合对骨髓干细胞具有亲和性的抗体的脂质体，所有的脂质体含有亚叶酸或胸苷。于是氨甲蝶呤就能方便地以通常能承受的2—3倍的剂量安全地投药。在含有胸苷、5-FU和氨甲蝶呤在一起的情况下的脂质体也可被使用。当使用胸苷时，药物5—氟尿嘧啶苷也可使用。

实施例2

制取含有胸苷的单片脂质体、并且以对骨髓干细胞具有亲和性的抗体结合至脂质体上，如同实施例1。在治疗爱滋病给药叠氮胸苷之前数小时将这些脂质体进行静脉注射，AZT的骨髓毒性可大大降低，AZT可以超过普通剂量的150％来使用。

实施例3

如实施例1，不同的是该脂质体加入了胞苷脱氨酶而不是亚叶酸，并且该药物为胞嘧啶阿糖酐而不是氨甲蝶呤。

实施例4

如实施例1，不同的是脂质体加入了博莱霉素水解酶而不是亚叶酸，药物为博莱霉素而不是氨甲蝶呤。

实施例5

如实施例1，不同的是脂质体加入了尿苷而不是亚叶酸，并且该药物为阿扎利宾(azaribine)而不是氨甲蝶呤。

实施例6

如实施例1，不同的是脂质体加入了脱氧胞苷而不是亚叶酸，并且该药物为胞嘧啶阿糖酐而不是氨甲蝶呤。

实施例7

代替如上例中所用的脂质体，用抗体结合解毒剂，抗体使用酸敏感的衔接物，顺乌头酸酐。其他方法如同实施例1、2、5和6。

其他实施例包括取代上述药物和它们的解毒剂，而采用在本说明书中提到的其他药物一解毒剂对。

另一例子，本发明也能被用于在生物有机体中建立疾病模型，使细胞毒素(细胞溶解)药物杀灭某些生物体细胞，或使其病变，从而保护了其他生物体细胞，而该生物体细胞能受细胞毒素剂的影响。举例来说，人们可用5—FU或FUdR来破坏结肠粘膜细胞来模拟结肠炎，并且通过使用已描述的方法优先地供送胸苷或尿苷给细胞，从而保护了小肠、胃、食管、口咽、骨髓和基础角蛋白细胞使不受5一FU或FUdR的细胞毒素(细胞溶解)的作用。

Claims (5)

1.一种用于减少化学治疗剂副效应的、结合有对正常细胞特异性抗体的、能输送到所述正常细胞的单片脂质体的制备方法，该方法的特征在于：制备含有解毒剂的单片脂质体，所述解毒剂针对能损害所述正常细胞的药物，然后将单克隆抗体结合到所述脂质体上，所述单克隆抗体为针对所述正常细胞的非补体固定的单克隆抗体。

2.按权利要求1所述的方法，其中所述结合为“衔接物”结合。

3.按权利要求1或2所述的方法，其中正常细胞选自胃肠道细胞、骨髓细胞和呼吸道上皮细胞。

4.按权利要求1所述的方法，其中所述抗体选自对骨髓细胞T200糖蛋白有亲和性的抗体、抗肠小囊和干细胞侧基膜的IGGI抗体及抗基底和毛囊角质化细胞的IGGI抗体。

5.按权利要求1所述的方法，其中所述单片脂质体的直径为350—600。