PT86880B - Processo para a determinacao da presenca de virus da imunodeficiencia humana (hiv)mediante a utilizacao de um inibidor de rnase l - Google Patents
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Description
Existem várias designações diferentes para o vírus da imunodeficiência humana (HIV); LAV é a designação para o vírus do SIDA isolado no Instituto Pasteur, Paris, França e HTLV-III é a designação para o vírus isolado no National Institute of Health, Bethesda, Maryland, E.U.A.. Na presente memória descritiva o vírus será frequentemente referido genéricamente ou designado por HTLV-III ou LAV ou HIV sem intenção de se diferenciar entre eles. Além disso o termo HIV·1 na presente especificação inclui todos e quaiqquer outros vírus que se poderão associar como causadores do SIDA, quer já isolados ou não. HIV no singular quer dizer que inclui qualquer dos tipos ae HIV sem se ter em conte os seus conteúdos genómicos. De forma similar os sintomas do SIDA serão referidos genéricamente incluindo sietomas causados pelo HIV (como definido acima), os ARC ou complexos relacionados com o SIDA, o síndroma de linfadenopatia (LAS) e outros vírus causadores de condições substancialmente similares clinicamente.
O SIDA segue a deterioração pregressiva do sistema imunitário causado pela iníecção com o virus de imunodificiência humana, HIV. Nos primeiros momentos da doença a imunidade mediada por intermédio celular fica danificada pela perda de células T (derivado de timo), as quais expressam o chamado antigénio T4, um subconjunto de células T consistindo principalmente em adjuvante T e células indutoras. A deficiência em células T4 pode conduzir a várias deficiências na imunidade mediada por intermédio celular, incluindo deficiências em células destruidoras naturais (natural Killer cell = NK), em células destruidoras activadas por linfoquina (lymphokine activated killer cell = LAK) e e® células T citolíticas. Existem também insuficiências ae células E (derivadas de medida õe óssea) no SIDA.
SIDA parece ser uma doença progressiva, apesar do ritmo de transição de uma fase para outra poder der variável. Estas fases foram classificadas. Existem indivíduos assintomáticos infectados pelo HIV (seropositivos), como demonstra a presença de anticorpos em circulação contra o vírus (M.G. Sarngadharan et al., Science, volume 224, p. 506, 1984). Se não têm mais
quaisquer sintomas, estes pacientes são designados como pacientes no estádio WR1 pela classificação Walter Reed (R.R. Redfield et al., New England Journal of Medicine, volume 314, p. 131. 1986). Este estádio também foi denominado por pré-ARC (ARC « complexo relacionado com SIDA) apesar ae alguns destes inoivíduos poderem nunca vir a desenvolver sintomatologia ARC. Alguns destes pacientes podem desenvélver linfadenopatia (WR2) e apresentam uma deficiência de células T4 (WR3). Em seguida, a capacidade dos linfócitos para suportar uma proliferação estimulada por antigenes e a produção de interferão gama estimulada por antigenes diminuem e estes pacientes WR4 começam a perder hipersensibilidade cutânea retardada. Os pacientes WR5 são usualmente anergéticos. Estes pacientes apresentam infecções de hcrpcs Zoster, candidíase oral (aftas) ou sintomas de ARC, os quais incluem febres prolongadas, suores nocturnos, fadiga, diarreia e/ou perda de peso. Este ^erívOv de AéC é normalmente também caracterizado por decadência progressiva da imunidade. Finalmente, os indivíduos WR6 experimentam infecções oportunistas que constituem o SIDA •‘maduro·’ em que 50% dos pacientes morrem em 12 meses (H.W. Murray et al., .,õv« England Journal of Medicine, volume 310, p. 883, 1984).
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
São descritos inibiuore(s) dirigidos para HIV da via de defesa antiviral 2‘-5· natural. O resultado destas investigações é pertinente para um novo diagnóstico e/ou modalidade de tratamento para uma variedade de aíecções (p. ex. herpes, infecções por retrovírus, etc) e/ou de condições potencialmente cancerosas* f
O sistema sintetase de 2-5A (2‘-5*-oligoadilenatos) /RNase L· induzido por interferão L é uma parte do mecanismo de defesa do hospedeiro contra infecções virais. Alguns elementos desse sistema incluem (i) a sintetase de 2-5A dependente de ARNdc;, (ii) 2-5A endogéneo e (iii) uma endoribonuclease dependente de 2-5A (RNase L). Uma deficiência em qualquer òestes elementos das vias da sintetase 2-5A/RNase L resultará na abolição completa ou parcial do efeito antiviral.
Foram encontrados níveis elevados de sintese 2-5A em soro e em células mononucleares de sangue periíeral (PBMC) de humanos com algumas infecções virais ou humanos submetendo-se a terapia de interferões. A indução de sintetase 2-5A em PMBC, assim parecia possuir um valor de diagnóstico potencial, apesar de limitado. Além disso, os altos níveis de sintetase 2-5A em
PBMC indicam um estado avançado da doença em alguns dos desarranjos virais mas em contraste são um sinal de terapia de ínterferões efectiva em outras infecções virais. Foram encontrados in-
outros elementos explicadasoutros elementossistema sintetase de 2-SA/RNase L, como 2-5A intracelular ou RNase L, fossem consideradas não funcionais. Para se explorar esta possibiliaaae requerer-se-ia a caracterização do 2-5A sintetizado in vivo e da acção RNase L, como relato pormenorização em seguida.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A presente invenção é se^uidamente descrita ccm referência aos desenhos junto, nos quais:
A FIGURA 1 é uma fotografia de uma placa de electroforese com gel de poliacrilamida mostrando a activação de RNase L por 2-5A extraído de extractos de humanos PbhC coai LAC, ARC ou SIDA como determinado por ensaio de cisão de ARN ribossomal;
A FIGURA 2 é uma fotografia de uma placa de electroforese de gel mostrando a activação do nível de RNase L em extractos de PBMC como determinado pelo ensaio de cisão de ARN ribossomal;
A FIGURA 3 é uma fotografia de uma placa de electroforese de gel, que mostra a restauação da actividade de cisão de ARN ribossomal em PBMC; e
A FIGURA 4 é um mapa de corrente ilustrando o caminho da oligadenilato/RNase L 2'-5‘.
ι
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Foi descoberta uma substância inibidora, liberta feita libertar por células infectadas por vírus da imunodeficiência humana. Este inibidor parece ligar-se à enzima RNase Lt pre vocando o produto da via 2’-5’-oligoadenilato/RNase L o funcionamento deficiente de todo o sistema imunitário e permitândo ao HIV multiplicar-se incontrolavelmente. Descrevem-se técnicas para identificar estes inibidores, directa ou indirectamente, pela falta de RNase L ou pela inactividade da RNase L ou pela presença de inibidores de intermediários bioquímicos na via 2»-5'A/RNase L, servindo o iaibidor(es) corno aarcaãor para detcctar a presença de HIV ou de vírus relacionados apresentando condições clínicas substancialmente similares.
Ê também discutido o significado como prognóstico deste marcador com respeito ao desenvolvimento ua SIDA madura em pacientes, particularraente naqueles que possuem anticorpos a um HIV no sangue periférico e em tecidos incluindo sangue, em fracções de sangue, em células de orgSos transplantados e em extractos de células. São descritos procedimentos para activar a RNase L e/ou para remover ou inactivar a substância inibidora da RNase L. Fazem parte da presente invenção processos para a preparação de agentes terapêuticos para tratamento da SIDA e vírus relacionados e para controlar o progresso de tais vírus pela activaçâo de RNase D e/ou pela remoção ou inactivação da(s) substância(s) inibidoras de RNase L ou vírus dirigidos para inibidores. Estão incluidcs na presente invenção cs procedimentos para preparação de anticorpos para estes vírus quer in vivo quer in vitro utilizando como antigénio um inibidor específico de RNase L ou inibidores de intermediários bioquímicos na via 2*-5*A/RNase L dirigidos contra vírus.
Os constituintes da via antiviral sintetase de 2-5A/ RNase L foram medidos em extractos de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de humanos com linfadenopatia (DAS), complexo relacionado com SIDA (ARC) e sindroma de imunodeficiência adquirida (SIDA). 0 nível de sintetase de 2-5A demonstrou ser altamente elevado em humanos com SIDA e a um nível basal em
indivíduos com ARC ou LAS. De qualquer modo, independeutemente das variações na sintetase de 2-5A (2-5A), foram detectadas altas concentrações de 2-5A {acima de 35 nM) em humanos co» LAS, ARC e SIDA. Verificou-se que o 2-5A extraído era realmente funcional por análises de ligação, de celulose nuclear e de cisão de ARN ribossomal. Apesar das concentrações elevadas de 2-5A funcional endógeno, não foi possível detectar qualquer RNase I» activado era qualquer dos humanos com LAS, ARC, SIDA. No entanto a RNase foi activaãa em PohC em todos os indivíduos saudáveis, mesmo apesar de as concentrações de 2-5Ά endógeno seres. inferiores a 5 nM. Diversas experiências demonstraram a evidência da presença de um inibidor de RNase L em todos os indivíduos escolhidos de entre ura grupo uc cinco com LAS, ARC e SIDA. Este inibidor é transferido e pode prevenir a degradação de ARNr específica em relação a RNase L induzida por 2-5A extractos de células L929. É possível precipitar um inioidor ae RNase como o aescrito pelo TCA e pelo etanol. A inibição da acção de RNase L foi eliminada por RNase A ou por tratamento com uma protease. Os meus estudos sugerem que em PBMC de humanos com LAS, ARC e SIDA, um ARNdc endógeno activa a sintetase de 2-5A, o que tem como resultado numa concentração de 2-5A endógeno. A capacidade do 2-5A funcional para activar RNase L é evitada por um inibidor de RNase L induzido por HIV em PBMC de humanos com DAS, ARC e SIDA.
Eu anoto aqui as medições ae concentrações de 2-5A e da função de RNase L em extractos de PEMC pela utilização de ensaios específicos e sensíveis e demonstro que uma defeciência no sistema antiviral de sintetase de 2-5A/RNase em PBMC de humanos com LAS, ARC e SIDA resulta na presença de um inibidor de Rííase L mas não na síntese de 2-5A não funcional. Os dados aqui relatados salientam que as interaeções aparentemente paradoxais que ocorrem na célula infectada pelo vírus poaem agora ser explicadas em termos bioquímicos racionais e coerentes.
DESCRIÇÃO DETALHADA DOS DESENHOS
Mergulhou-se num tampão de lise NP40 (16) (10 uL) RNase A ligada a partículas acrílicas (1 m£) ou protease ligada, a carboximetil-celulose (1 mg) (Sigma Chemical Co.) durante 2 horas
a 30°C, e em seguida mistura-se com extracto de PBMC (100 pg por análise), obtendo-se um volume final de 15 pl, e uma incubou-se durante mais 2 horas a 30°C. Durante a segunda incubação, os tubos foram várias vezes agitados à mão com suavidade. Incubaram-se amostras de comparação sem auição cie qualquer enzima, ás enzimas foram sedimentados por centrifugação (10 000 x ç, 5 min. temperatura ambiente). Adicionaram-se 5 microlitros de fracções de sobrenadante a extractos de células L929 (150 pg de proteína/ ensaio) e usaram-se análises de cisão de ARNr para medir a actividade específica da RNase L.
Ο 2-5A endógeno isolado dos extractos de PBMC foi caracterizado adicionalmente pelas análises de cisão de ARNr» Os padrões de cisão provocada por da RNase L com 2-5A isolado a partir de PBMC eram significativamente diferentes em extractos de células L929 dos obtidos com 2-5A autêntico (FIG. 1, comparar pistas 3, 5, 7 e 9 com pista 10). Por exemplo ο 2-5A endógeno isolado de Plí-iC activa a RNase L de células ^ara cindir ARNr
28S e 181, formando três produtos de cisão específicos (Fig. 1, pista 10). Estas diferenças nos padrões de cisão observados podem ser explicados pelo facto de ο 2-5A endógeno sintetizado em PBMC diferir do autentico 2-5A.
Têm-se usado análises de ligação a radioisótopos para estimar o nível de RNase L livre (não activada por 2-5A), uma enzima visada presentemente conhecida para 2-5A. Podem também ser usadas outras enzimas visadas adicionais, as quais são igualmente relevantes para a minha invenção. Extractos de PBMC de humanos com LAS, ARC e SIDA possuem níveis de RNase L livre 5 a 7 vezes mais baixos que os de indivíduos normais (Quadro 1, coluna 4). NO entanto, o ensaio de ligação a radioisÓtopos tem uma aplicação limitada em amostras em que ο 2-5A endógeno compete com PgA^Í P)pCp para ligação com RNase L. Consequentemente os resultados obtidos em ensaios de ligação a radicisótopcs não reflectem os níveis de Rnase L com precisão. Por isso, foi essencial a determinação do nível de Rnase L activada por 2-5A. Para se obter este objectivo eu usei uma técnica nova e sensível descrita seguidamente, que permite a medição de RNase L activada em extractos de PBMC isolados de quantidades tão reduzidas como
um mililitro de sangue periférico, uma técnica baseada na especificidade da cisão de RNase L activada por 2-5A em ARNr.
Porque rARN em PBMC está abaixo do nível de detecção, substituiram-se as células usadas como fonte de ARNr por células HL929 {um subclone deficiente em RNase L da linha de células L929). As células HL929 estão depositadas no American Type Culture Collection em Rpckville, Maryland, USA sob o número de aces-> so » de acordo com os termos do tratado de Budapeste.
Utilizando esta experiência posso demonstrar que a RNase L não está activa em extractos de PobC ue huiuanos com LAO, AilC e oXDA {Fig. 2, pistas 2-6) onde existe uma alta acumulação intracelular de 2-5A funcional. Extractos de PBMC de todos os indàvíduos saudáveis testados mostraram a presenção de RNase L activa que produziu produtos de cisão específicos (1¾. 2, pista 7) aiesmo apesar de estar presente 2-5A a <5 nM (Quadro 1 coluna 2),
Λ minha observação de que 2-5A biologicamente activo estava presente em extractos de PBMC de pacientes infectados com LAS, ARC e SIDA levantou a questão de porque é que a RNase estava inactiva. Para determinar se a falta de actividade de RNase L (como evidenciado na Fig. 2, pistas 2-6) se deveu a RNase L não funcional ou era devida a um inibidor da actividade de RNase L, foram realizadas experiências de mistura como se segue. Foram misturados extractos de células L929 contendo RNase L· funcional e co-incubaram-se estes extractos com extractos de PBMC de humanos com LAS, ARC e SIDA. Não foi detectável qualquer formação de produtos de cisão específicos de RNase L (Fig. 1, pistas 3, 5 e 7).
É importante sublinhar que ο 2-5A endógeno responsável pela activação de RNase L (Fig. 1, pistas 3, 5 e 7) representa pelo menos uma diluição quadrupla relativamente aos extractos de células dos quais estas amostras eram derivadas (Fig. 1, pistas 2, 4 e 6). Estes dados indicam a presença de inibidor(es) de RNase L insolúvel em TCA no PBMC de humanos com LAS, ARC e SIDA. Um inibidor deste género não se encontra em humanos saudáveis porque os seus extractos de PBMC geram produtos de cisão específicos para RNase L a seguir a co-incuoação com extractos de células L929 (Fig. 1, pista 8). Similarmente, a fracção so- 8 -
lúvel TCA de PBMC de humanos saudáveis geram também produtos dc cisão específicos (Fig. 1, pista 9). A presença de 2-5A funcional e o facto de o presumível inibidor de RNase L ser precipitável por TCA e por etanol sugere que o inibidor de RNase L não é um análogo de 2-õA, como tem vinao a ser recentemente identificado em HSV-1 e células infectadas por retrovírus em cultura»
As minhas experiências utilizando enzimas de degradação imobilizadas em suportes sólidos têm proporcionado uma visão nova importante dentro da natureza do(s) inibidor(es) de RNase L encontrado(s) em extractos oe rlí.C te humanos com Lha, LnC c SIDA. Quando extractos de PBMC de humanos com SIDA foram pré-incubados com protease ou com RNase A imobilizadas e subsequentemente foram co-incubaaos com extractos ae células L92b, xoi restaurada a activação de RNase L, como evidenciado pela presença de produtos de cisão específices (Fig. 3, comparar pistas 1 e 2 com a pista 3).
O meu estudo presente demonstra que o defeito no sistema antiviral de sintetase 2-5A/RNase L em PBMC de humanos com LAS, ARC e SIDA pode ser atribuído a um inibidor de RNase L e não à falta de 2-5A funcional. 0 inibidor de RNase L está presente em extractos de PbhC isolados de humanos com LAS, ARC e SIDA, o que indica que o inibidor pode existir em todos os estádios do desenvolvimento de doenças provocadas por retrovírus típicos e é também relevante para uma variedade de outras infecções sub-agudas/crónicas virais/patogénicas. Tendo-se em consideração o meu relatório anterior, segundo o qual todos os PBMC de humanos com LAS, ARC e SIDA testados aqui têm ARN de HIV (conforme determinado por hidridação molecular) e centros de infecção HIV (conforme medido por co-cultura de limfócitos), é provável que o inibidor e RNase L seja induzido por vírus.
Os inventos aqui relatados sugerem que a replicação de vírus modifica o sistema de sintetase 2-5A/RNase L de maneira que o estado antiviral natural não ^ode ser completamente espresso e/ou mantido. É provável que proteína(s) ou ARN5s) codificados por HIV e/ou por outros retrovírus co-existentes podem inibir a activação de RNase L.
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Exemplo
As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas em Ficoll-Hypaque; as células L929 e HL929 (um subclone deficiente RNase L de LS2S) forair isantidas em cultura de monocamada; e os extractos citoplasmáticos de células L929 e LH929 foram preparados em tampão de glicerol e os extractos de PBMC em tampão de lise NP40, sempre de acordo com procedimentos conhecidos. As concentrações de proteínas dos extractos variaram entre 1 a 15 pg/pL·.
A actividade da sintetase 2-5A foi determinada em extractos de PBMC (50 pg de proteína/ensaio) utilizando poli(rl)-poli(rC)-agarose. Ο 2-5Δ foi isolado da fracção solúvel cm TCA de extractos de PBMC a seguir a neutralização por freon/tri-n-octilamina. O 2-5A extraído por TCA foi então liofilizado e redissolvido em água, de maneira gue todas as amostras foram nor malizadas num volume de água equivalente a 5 ug de proteínas/uL.
As concentrações de 2-5A presente em extractos de PBMC foram medidas em ensaios de ligação a radioisótopos com extractos de cê32 lulas como fonte de RNase L. Dos 1Ê 900 dpm de P)pCp (actividade específica de 3 000 Ci/mmol, Amersham) adicionados por ensaio, 9 400 dpm foram ligados a RNase L na ausência de 2-5A adicionado. Aproximadamente 9 a 14> ae 32P)yCp foram substituídos nas experiências em que se adicionou 5 pL das amostras 2-5A isolados. A concentração de 2-5A em PBMC foi determinada por comparação com cuevas de calibração de 2-5A autêntico e foi baseado num cálculo de concentração de proteína citoplasmática de 25 pg/pL. Foi também medida a concentração de 2-5A isolado de PBMC em ensaios de celulose de núcleo com extractos de células L929 como fonte de RNase L·. A activação de RNase L por 2-5A neste ensaio basea-se na conversão de poli(D) (s2P)pCp em fragmentos solúveis em ácido. Aproximadamente 5 a 20% do total de poli(U) (s2P)pCp (15 000 dpm) foi cindido na presença de 2,5 pl das amostras de 2-5A isoladas. As concentrações foram determinadas a partir de curvas de calibração com 2-5A autêntico, como descrito acima. O nível de RNase L livre foi medido em ensaios de ligação a radioisótopos após a adição de 20 uôo dpm de P.jA4(s2P)pCp a extractos de PBMC (50 pg de proteína/ensaio). Os resultados obtidos foram os seguintes:
interferão em extractos de PBMC obtidos de humanos com LAS, ARC e SIDA foi medida com ensaios in vitro e comparada com o de extractos de indivíduos sãos como se mostra no Quadro 1 acima apresentado, Os níveis ue sintetase de 2—5a e«í iiumanvs cofe «SIDA (#3 e #5) eram de 16 a 20 vezes mais elevados do que os observados em pacientes normais (Quadro 1, coluna 1). Em contraste, os níveis de sintetase de 2-5A em pacientes com LAS (#1), ARC (#2) e SIDA com o sarcoma de Kaposi (SK) (#4) eram só 1,3 a 5 vezes mais elevados, em concordância com observações feita por outros que não revelavam qualquer elevação.
Para determinar se esta medição in vitro de sintetase de 2-5A era uma inaicação aa ocorrência oe enzima funcionai in vivo, extraiu-se 2-5Zi de As actividadcs biológicas de 2-5A da fracção solúvel em TCA dos extractos do PBMC foram caracterizadas completamente por análises de ligação a radioisótopos e de celulose de núcleo, as concentrações uC 2-oA fora;.. similares às determinadas pelos dois procedimentos de análise (Quadro 1, colunas 2 e 3). O acordo entre resultados obtidos pelos métodos A e B (yuadro 1, colunas 2 e 3) aemonstra que ο 2-5 A isolado de extractos de .2 MC humano pode ligar-se e activar RNase L de células L929 com a mesma intensidade que 2-5A autentico.
A falta aparente de correlação quantidativa entre os níveis de sintetase de 2-5A e do 2-5A endógeno em LAS, ARC e SIDA (Quadro 1, comparar coluna 1 com coluna 2 e 3) pode auora ser explicada, pela primeira vez, como se segue, A determinação de sintetase 2-5A por ensaios in vitro basea-se na purificação parcial via poli(rl)-poli(rC)-agarose; conseguentemente esta análise média só a sintetase de 2-5A livre e não a sintetase de 2-5A que se encontra activada in vivo-gelo ARNdc. No entanto, medição directa de sintetase 2-5A endógena mais as enzimas 2-5A de- | gradativas (i.e., 2'-fotífoàiesterase e fosfatase). Por conseguinte, a acumulação de 2-5A em PBMC de humanos com LAS, ARC e SIDA indica uma baixa actividade das enzimas õegradativas. A presença de 2-5A em PjsMC também indica gue existe um Aittídc endógeno até aqui não detectado nem cm indíviduos normais nen em pacientes com SIDA.
ARN de cadeia dupla desemparelhado é uma forma conhecida de ARN macromulecular (ver patente norte americana nQ, 4 024 222 e patente norte americana n° 4 130 041) em que a deses tabilização da hélice dupla evita a formação de pares de base. O ARNdc desemparelhaao é nem conhecido pelas suas propriedades indutoras de interferão, o que indica um mecanismo não relacionado com a indução de interferão per se (p. ex., pedido de Patente Europeia 83305426.5 apresentado em 15 de Agosto 1983 intitulado Antiproleferative action uf qsrnAs on iumor Celis).
como r
Uma concretização ui^>ic« gê axú» uú ccu»eiu parelhado é o ARNdc sintético formado por complexos liriboinosínico e de ácido yoliribocitidílico/uridílico, por exemplo rln r(Cx,u ou em que x possue o valor de 4 a 2y, p. ex., rln.r (C^UÍn a^ui referido como àúPLiviN , uma marca registada por HEM Researcn, Inc., cie Rockville, Maryland, EUA. Têm sido estudados muitos polímeros de ARNdc desemparelhado que se comportam de modo similar ao ampligen. A vantagem terapêuti de ácido poca chave de ARNdc*s imperfeitos sobre outras formas de ARN*s naturais e/ou sintéticos reside na sua toxicidade reduzida em animais e homens. Por exemplo Lampson et al. na patente Norte Americana nfi 3 666 646 tinha descrito anteriormente complexos de ARNdc que são capazes de desencadear vários efeitos relacionados com interferões, mas a toxicidade de tais compostos impossibilitara qualquer utilidade no tratamento do cancro ou afecções rela cionadas.
Sabe-se presentemente que o ARNdc desemparelhado, p.ex.
Ampligen, possui actividade terapêutica contra alguns tumores humanos, particularmente o cancro do rim. Apesar de correntemente os ARNdc’s serem encarados como puramente indutores ce interferão, são activos em certos tumores humanos que são completamente resistentes a interferões, como vastamente descrito no pedido de Patente Europeia ca ^ual o requerente da presente aplicação é um inventor.
Noutro pedido de patente (ver pedido de Patente Europeia 86306582.7, apresentado era 26 de Agosto de 1986 intitulado Modulation oí Vxrus-Relateo Avente by Double-strandeo o inventor descreve a inibição do vírus da SIDA em cultura de cé13 -
lulas humanas por ARNdc*s utilizando Ampligen como ura iUVNác protótipo.
Por “ARNdc emparelhado” entendem-se aquelas em que ligações de hidrogénio (empilhamento de bases) entre as cadeias opostas estão relativamente intactas, isto é, estão interrompidas em média menos do que um par de bases em cada 29 resíduos de bases consecutivos. O termo ARNdc desemparelhado deve ser entendido de acordo com esta definição.
ARNdc pode ser um complexo de poliinosinato e um policitidilato contendo uma proporção de bases de uracilo ou de bases de guanidina, p» ex. , de 1 em 5 a 1 em «b oestas rases (poli I. poli (C4-29 x U ou G).
ARNdc pode ser da fórmula geral Rln.íC^^UÍn. Outros exemplos apropriados de ARNdc são discutidos a seguir.
Os ARNdc desemparelhados preferidos para uso na presente invenção são baseados em co-polxnucleótiaos selecionados a partir de poli (Cn,U) e poli (Cn,G), nos quais n um número inteiro com um valor de 4 a 29 e são análogos desemparelhados de complexos de ácido poliriooinosínico e poliribocitidílico, formados pela motificação de rln.rCn a fim cie incorporar bases não correspondentes (uracilo ou guanina) ao longo da cadeia de poliribocitidilato (rCn). Alternativamente, o ARNdc pode ser derivado de ARNdc poli (1). poli (c) através de modificação àa espinha dorgal do ribosilo de ácido poliriboinosínico (rln) p. ex., por inclusão de resíduos de 2’-0-metil-ribosilo. Estes análogos desemparelhados de rln.rCn, dos quais os preferidos são da fór mula geral rln.ríc^^
são descritos por Cárter c na patente Norte-Americana 4 130 641 e 4 024 222, cujas descobertas são aqui incorporadas por referência, Os ARNdc's descritos nes tas referuncias são geraimente apropriaoos para uso de acordo com a presente invenção.
Exemplos específicos de ARNdc desemparelhaão para uso na presente invenção incluem: Poli (I). poli (C4,U) poli (1). poli (νίγ,Ο) poli (I). poli (2. . ,ϋ)
As composições farmacêuticas contempladas pela presente invenção incluem as adaptadas para administração parenteral num veículo farmaceuticamente aceitável. Assim, oor exemplo, soluções parenterais, suspensões e dispersões podem ser preparadas como requerido de acordo com técnicas farmacêuticas conheci das com água estéril ou livre de pirogénio como solvente/diluente, opcionalmente taausém com sais xârmaccuticameiite aceitáveis.
A ^uantidaãe Αε deoemparelhadc administrada é preferencialmente suficiente para alcançar uma concentração máxima no sangue de a partir de 0,01 microgramas por mililitro do nível de ARNác atravé» -úu fluído uo corpo até luóú microgramas por mililitro na circulação sistémica do sangue imediataisente a seguir num ponto distanciado do sítio de perfusão.
Em alternativa, pode ser adicionada uma concentração efectiva pode ser adicionaaa ao produto do sangue imediatamente antes da injecção no receptor. Nesses casos o operador pode sim plesmente referir-se a um quadro normalizado de volumes de fluídos do corpo que interrelacionam o peso do receptor com o volume de fluídos do corpo, o vjual é o total ao volume de fluído do corpo do paciente e o volume de fluido do corpo disponível para equilibrar com a quantidade necessária de ARNdc. Um paciente de sessenta a setenta quilogramas de peso terá um volume de flui do de corpo de aproximadamente cinco a seis litros.
Claims (1)
- REIVINDICAÇÕES- lã Processo para determinação da presença do vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou de outro vírus que causa condições clínicas substaiicxalíuéiite siiaxlares caracterizaao ^or coa- 15 preender marcador por HIV, para a presença de HIV ou informação genética dirigida num extracto celular dum animal.Processo de acordo com a reivindicação 1, para a determinação num fluído biológico humano ou em células humanas da presença de vírus da imunoòeiiciênaia humana ocultos caracterizado por compreender uma fase de Netecção da presença d® um inibidor de RNase L no fluído biológico humano ou nas células humanas.- 30 Processo ue acurou com a reiviudcaçao z, caracterizado por o fluído biológico ser sangue ou uma fracção de sangue.- 42 Processo de diagnóstico para a determinação da incidência presumível de HIV num animal caracterizado por compreender uma fase de exame dum extracto de tecidos co animal e ue determinação da presença ou da ausência de pelo menos um inibidor de RNase 1» de acordo com a reivindicação 1, constituindo a respectiva presença uma indicação positiva da presumível presença de vírus HIV.- 5| Processo para a monitorização de progresso de recuperação de HIV ou dum vírus que cause condições bioquímicas e/ou clínicas similares caracterizado por compreender as fases de; |Ϊ (1) determinação da presença cu ue. ausência de pelo menos um inibidor de RNase L num extracto de células do paciente e, no caso de se detectar um inibidor de RNase L, (2) administração de uma quantidade de ARw de ou^la caceia (AkNqc) suficiente para reduzir a quantidade de inibidor (ou de inibidores) de RNase- L de- 16 condições induzidas por HIV ou por outros vírus que causem condições bioquímicas e/ou clínicas similares e {3) continuação fa administração de ARSdc até que os sintomas clínicos do paciente I se estabilizem e melhorem. 1 íProcesso de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 5 caracterizado por ARNdc ser um ARNdc desemparalhado.- 7â -Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o ARNdc ser um complexo dum poli-inosinato com um poli-citidilado contendo desde 1 a 5 até 1 em 30 bases uracilo ou guanidina (x).
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