JP2690493B2 - ウイルス感染に対するマーカー - Google Patents
ウイルス感染に対するマーカーInfo
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- hiv
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、動物の細胞抽出物におけるヒト免疫不全ウ
イルス又は実質的に類似した臨床症状を惹起するその他
のウイルスの存在を測定する方法及びそれらに関連する
発明に関する。
イルス又は実質的に類似した臨床症状を惹起するその他
のウイルスの存在を測定する方法及びそれらに関連する
発明に関する。
AIDSの一般的な背景 エイズ（AIDS:後天性免疫不全症候群）は、20世紀の
主な公衆衛生上の脅威を代表する。その生物学的多様
性、個体から個体へと蔓延する微妙な方法、そしてその
現実の存在の早期の検出さえも不可能とする“潜伏（la
tent）”期間のために、AIDSは先例のない程の疫学的窮
地に急速に追い込まれていった。事実、診断の可能性を
高めるためにすでに開発された考えうる方策をもってし
ても、個体群のすべての区域内でこの問題をしっかりと
制御するために必要な要件はいまだ満たされていない
〔例えば、National Institutes of Health（Bethesda,
Maryland）において1985年７月31日に開催された、Cent
er for Drugs and Biologics,FDA,National Institutes
of Health,及びCenter for Disease Controlにより後
援されたタイトル“HTLV−III抗体試験における経験、
最新のスクリーニング、実験室と疫学の相関”の会報、
そしてまたBudiansky,S.,Nature,316,96頁（1985）参
照〕。
主な公衆衛生上の脅威を代表する。その生物学的多様
性、個体から個体へと蔓延する微妙な方法、そしてその
現実の存在の早期の検出さえも不可能とする“潜伏（la
tent）”期間のために、AIDSは先例のない程の疫学的窮
地に急速に追い込まれていった。事実、診断の可能性を
高めるためにすでに開発された考えうる方策をもってし
ても、個体群のすべての区域内でこの問題をしっかりと
制御するために必要な要件はいまだ満たされていない
〔例えば、National Institutes of Health（Bethesda,
Maryland）において1985年７月31日に開催された、Cent
er for Drugs and Biologics,FDA,National Institutes
of Health,及びCenter for Disease Controlにより後
援されたタイトル“HTLV−III抗体試験における経験、
最新のスクリーニング、実験室と疫学の相関”の会報、
そしてまたBudiansky,S.,Nature,316,96頁（1985）参
照〕。
ヒト免疫不全ウイルス（HIV）についての数種の異な
る名称が存在する;LAVはパスツール研究所（Paris,Fran
ce）において分離されたAIDSウイルスに対する名称であ
り、そしてHTLV−IIIは米国国立衛生研究所（Bethesda,
Maryland,U.S.A）において分離された該ウイルスに対す
る名称である。本明細書においては、しばしば一般的な
名称、又はHTLV−IIIもしくはLAVもしくはHIVと称する
が、これらの間を区別することを意図するものではな
い。なお、本明細書における“HIV"の語は、いまだ分離
されていようと分離されてなかろうと、AIDSの発生に関
与し得るいかなるその他のウイルスをも包含する。単数
形のHIVは、それらのゲノムの内容物にかかわらずHIVタ
イプのいかなるものも包含する。同様に、AIDS症状は、
HIV（上記に定義したところの）、ARC又はAIDS関連コン
プレックス、リンパ腺症症候群（LAS）、そして実質的
に類似する臨床症状を引き起こす他のウイルスにより惹
起される症状を包含することを一般に意味する。
る名称が存在する;LAVはパスツール研究所（Paris,Fran
ce）において分離されたAIDSウイルスに対する名称であ
り、そしてHTLV−IIIは米国国立衛生研究所（Bethesda,
Maryland,U.S.A）において分離された該ウイルスに対す
る名称である。本明細書においては、しばしば一般的な
名称、又はHTLV−IIIもしくはLAVもしくはHIVと称する
が、これらの間を区別することを意図するものではな
い。なお、本明細書における“HIV"の語は、いまだ分離
されていようと分離されてなかろうと、AIDSの発生に関
与し得るいかなるその他のウイルスをも包含する。単数
形のHIVは、それらのゲノムの内容物にかかわらずHIVタ
イプのいかなるものも包含する。同様に、AIDS症状は、
HIV（上記に定義したところの）、ARC又はAIDS関連コン
プレックス、リンパ腺症症候群（LAS）、そして実質的
に類似する臨床症状を引き起こす他のウイルスにより惹
起される症状を包含することを一般に意味する。
AIDSはヒト免疫不全ウイルス（HIV）の感染により発
病し免疫系の進行性劣化を伴う。この病気の初期に、主
にヘルパーＴ及びインデューサ−細胞からなるＴ細胞の
サブセットであるいわゆるT4抗原を発現するＴ（胸腺由
来）細胞の喪失を通して、細胞性免疫が低下してくる。
T4細胞の欠落は、NK（ナチュラルキラー細胞）、LAK
（リンホカインにより活性化されたキラー細胞）及び細
胞溶解性Ｔ細胞の欠損を含む細胞性免疫のいくらかの欠
損をもたらしうる。また、AIDSにおいてはＢ細胞（骨髄
由来）の欠損を存在する。
病し免疫系の進行性劣化を伴う。この病気の初期に、主
にヘルパーＴ及びインデューサ−細胞からなるＴ細胞の
サブセットであるいわゆるT4抗原を発現するＴ（胸腺由
来）細胞の喪失を通して、細胞性免疫が低下してくる。
T4細胞の欠落は、NK（ナチュラルキラー細胞）、LAK
（リンホカインにより活性化されたキラー細胞）及び細
胞溶解性Ｔ細胞の欠損を含む細胞性免疫のいくらかの欠
損をもたらしうる。また、AIDSにおいてはＢ細胞（骨髄
由来）の欠損を存在する。
AIDSは、１相から他の相への遷移速度が可変的であり
うるが、進行性の病気のようである。これらの相は分類
がされている。HIVによって感染した無症状の個体が存
在する（血清陽性）、これはすなわち上記ウイルスに対
する循環する抗体の存在によって判定された（M.G.Sarn
gadharen等、Science,224,506頁,1984）。もし彼らが他
のいかなるマーカーも持たないなら、ウォルターリード
（Walter Read）分類によれば、彼らはWR1期患者である
（R.R.Redfield等、New England Journal of medicine,
314,131頁、1986）。また、これらの個体のいくらかはA
RCの症状を全く発現しないにもかかわらず、彼らはプレ
（pre）ARC（ARC＝AIDS関連コンプレックス）と呼ばれ
てきた。これらの患者のいく人かは、リンパ腺症に発展
するだろうし（WR2）そしてT4細胞の欠損を示す（WR
3）。次に、抗原刺激増殖及び抗原刺激性γ−インター
フェロン産生を行うためのリンパ球の能力が低下し、そ
してさらに、これらのWR4患者は遅延性皮膚過感作を失
い始める。WR5患者はアネルギー性（anergic）である。
彼らは、帯状疱疹（Herpes Zoster）感染、口腔粘膜カ
ンジダ症（鵞口瘡）、又は長期にわたる発熱、寝汗、疲
労、下痢及び／もしくは体重減少を伴うARC症状を呈す
る。またさらに、この段階のARCは一般に進行性免疫崩
壊により特徴づけられる。最後に、WR6個体は、“本格
的”なAIDSを構成する日和見感染に冒され、12ケ月以内
に患者の50％は死に至る（H.W.Murray等、New England
Journal of Medicine,310,883頁、1984）。
うるが、進行性の病気のようである。これらの相は分類
がされている。HIVによって感染した無症状の個体が存
在する（血清陽性）、これはすなわち上記ウイルスに対
する循環する抗体の存在によって判定された（M.G.Sarn
gadharen等、Science,224,506頁,1984）。もし彼らが他
のいかなるマーカーも持たないなら、ウォルターリード
（Walter Read）分類によれば、彼らはWR1期患者である
（R.R.Redfield等、New England Journal of medicine,
314,131頁、1986）。また、これらの個体のいくらかはA
RCの症状を全く発現しないにもかかわらず、彼らはプレ
（pre）ARC（ARC＝AIDS関連コンプレックス）と呼ばれ
てきた。これらの患者のいく人かは、リンパ腺症に発展
するだろうし（WR2）そしてT4細胞の欠損を示す（WR
3）。次に、抗原刺激増殖及び抗原刺激性γ−インター
フェロン産生を行うためのリンパ球の能力が低下し、そ
してさらに、これらのWR4患者は遅延性皮膚過感作を失
い始める。WR5患者はアネルギー性（anergic）である。
彼らは、帯状疱疹（Herpes Zoster）感染、口腔粘膜カ
ンジダ症（鵞口瘡）、又は長期にわたる発熱、寝汗、疲
労、下痢及び／もしくは体重減少を伴うARC症状を呈す
る。またさらに、この段階のARCは一般に進行性免疫崩
壊により特徴づけられる。最後に、WR6個体は、“本格
的”なAIDSを構成する日和見感染に冒され、12ケ月以内
に患者の50％は死に至る（H.W.Murray等、New England
Journal of Medicine,310,883頁、1984）。
天然の２′−５′Ａ抗ウイルス性防御経路のHIVに向
けられたインヒビターが記載される。これらの知見は、
さまざまなウイルス疾病（例えば、ヘルペス、レトロウ
イルス感染等）及び／又はその上に潜在的な癌の症状に
ついての新診断法及び／又は治療様式に対して適切であ
る。
けられたインヒビターが記載される。これらの知見は、
さまざまなウイルス疾病（例えば、ヘルペス、レトロウ
イルス感染等）及び／又はその上に潜在的な癌の症状に
ついての新診断法及び／又は治療様式に対して適切であ
る。
インターフェロンにより誘導される２−5A（２′−
５′−オリゴアデニレート）シンテターゼ/RNase L系
は、ウイルス感染に対する宿主防御機構の一部である。
上記系のいくつかの要素は、（ｉ）dsRNA依存性２−5A
シンテターゼ、（ii）内因性（endogenous）２−5A、及
び（iii）２−5A依存性エンドリボヌクレアーゼ（RNase
L）を包含する。２−5Aシンテターゼ/RNase L経路のこ
れらの要素のいずれかの脱落は、抗ウイルス効果の完全
又は部分的な消失をもたらすであろう。
５′−オリゴアデニレート）シンテターゼ/RNase L系
は、ウイルス感染に対する宿主防御機構の一部である。
上記系のいくつかの要素は、（ｉ）dsRNA依存性２−5A
シンテターゼ、（ii）内因性（endogenous）２−5A、及
び（iii）２−5A依存性エンドリボヌクレアーゼ（RNase
L）を包含する。２−5Aシンテターゼ/RNase L経路のこ
れらの要素のいずれかの脱落は、抗ウイルス効果の完全
又は部分的な消失をもたらすであろう。
いくらかのウイルス感染を有するヒト又はインターフ
ェロン治療を受けているヒトの血清及び末梢血単核細胞
（PBMC）中に高いレベルの２−5Aシンテターゼが見い出
されている。それゆえに、PBMCにおける２−5Aシンテタ
ーゼの誘導は、限定的ではあるが潜在的な診断的価値を
有しているようだ。その上、PBMC中の高い２−5Aシンテ
ターゼレベルは、いくらかのウイルス疾患の進行した病
気の状態を示したが、対照的に、他のウイルス感染の効
果的なインターフェロン治療の徴候でもある。インター
フェロンはAIDS患者の血清中に見い出されているが、そ
れにもかかわらずARCからAIDSに進行した個体につい
て、２−5Aシンテターゼの持続的な増加が観察された。
これらの極端な実験室／臨床の矛盾は、もし上記２−5A
シンテターゼ/RNase L系の他の要素、例えば細胞間２−
5A又はRNase Lが機能しないことが見い出されれば説明
できるであろう。この可能性を探究するためには、本発
明者が本明細書で詳細に説明するように、生体内（in vi
vo）で合成された２−5A及びRNase L活性を特徴づける
ことが要求されるであろう。
ェロン治療を受けているヒトの血清及び末梢血単核細胞
（PBMC）中に高いレベルの２−5Aシンテターゼが見い出
されている。それゆえに、PBMCにおける２−5Aシンテタ
ーゼの誘導は、限定的ではあるが潜在的な診断的価値を
有しているようだ。その上、PBMC中の高い２−5Aシンテ
ターゼレベルは、いくらかのウイルス疾患の進行した病
気の状態を示したが、対照的に、他のウイルス感染の効
果的なインターフェロン治療の徴候でもある。インター
フェロンはAIDS患者の血清中に見い出されているが、そ
れにもかかわらずARCからAIDSに進行した個体につい
て、２−5Aシンテターゼの持続的な増加が観察された。
これらの極端な実験室／臨床の矛盾は、もし上記２−5A
シンテターゼ/RNase L系の他の要素、例えば細胞間２−
5A又はRNase Lが機能しないことが見い出されれば説明
できるであろう。この可能性を探究するためには、本発
明者が本明細書で詳細に説明するように、生体内（in vi
vo）で合成された２−5A及びRNase L活性を特徴づける
ことが要求されるであろう。
本発明の説明 ヒト免疫不全ウイルスで感染した細胞により放出され
るか又は放出されるように原因付けられたインヒビター
物質が発見された。このインヒビターは、RNase L酵素
に物理的に付着し、２′−５′オリゴアデニレート/RNa
se L経路の最終生産物は、全免疫系を機能不全に至らし
め、そしてHIVが非抑制的に増殖することを許容してい
ると思われる。RNase Lの不存在又はRNase Lの不活性に
より、あるいは２′−５′A/RNase L経路中の生化学的
媒介物のインヒビター、すなわちHIV又は実質的に類似
する臨床状態を生じさせる関連ウイルスの存在を検出す
るためのマーカーとして役立つインヒビター、の存在に
より、直接的又は間接的に、これらのインヒビターを同
定する技術が開示される。
るか又は放出されるように原因付けられたインヒビター
物質が発見された。このインヒビターは、RNase L酵素
に物理的に付着し、２′−５′オリゴアデニレート/RNa
se L経路の最終生産物は、全免疫系を機能不全に至らし
め、そしてHIVが非抑制的に増殖することを許容してい
ると思われる。RNase Lの不存在又はRNase Lの不活性に
より、あるいは２′−５′A/RNase L経路中の生化学的
媒介物のインヒビター、すなわちHIV又は実質的に類似
する臨床状態を生じさせる関連ウイルスの存在を検出す
るためのマーカーとして役立つインヒビター、の存在に
より、直接的又は間接的に、これらのインヒビターを同
定する技術が開示される。
患者における、特に、それらの末梢血中に又は血液、
血液画分、移植器官の細胞及び細胞抽出物を包含する組
織中にHIVに対する抗体を有する患者における、十分に
発達したAIDSの進行に関するこのマーカーの前兆的な重
要性が検討される。RNase Lの活性化法及び／又はRNase
Lインヒビターを除去し又は不活化する方法が記載され
る。AIDS及び関連のウイルスを処置するための治療法、
並びにRNase Lを活性化しそして／又はRNase Lインヒビ
ターもしくはインヒビターに向けられたウイルスを除去
しもしくは不活性化することにより前記のようなウイル
スの発達をモニターする医療的方法は本発明の一部であ
る。RNase Lの特異的インヒビター又は２′−５′A/RNa
se L経路中の生化学的媒介物のウイルスに向けられたイ
ンヒビターを抗原として用いて、生体内（in vivo）及
び試験管内（in vitro）双方でこれらのウイルスに対
する抗体を調製する方法は本発明に包含される。上記２
−5Aシンテターゼ/RNase L抗ウイルス経路の構成要素
は、リンパ腺症（LAS）、AIDS関連コンプレックス（AR
C）及び後天性免疫不全症症候群（AIDS）を有するヒト
由来の末梢血単核細胞（PBMC）の抽出物中で測定され
た。２−5Aシンテターゼのレベルは、AIDSを有するヒト
において非常に上昇しており、そしてARC又はLASを有す
る個体において基底のレベルにあることが示された。し
かし、２−5Aシンテターゼの多様性と無関係に、高い濃
度の内因性２−5A（35nM以下）がLAS,ARC及びAIDSを有
するヒトで検出された。抽出された２−5Aは、結合アッ
セイ、コア−セルロース（core−cellulose）アッセイ
及びリボゾームのRNA分解アッセイにより測定したとこ
ろ確かに機能的であった。機能的な内因性２−5Aの濃度
が増強したにもかかわらず、LAS,ARC及びAIDSを有する
ヒトのいずれにおいてもいかなる活性化RNase L示すこ
とができなかった。しかしながら、たとえ内因性２−5A
の濃度が5nM以下であったとしても、RNase Lは全ての健
康な個体のPBMC中で活性化された。実験を組みあわせる
ことにより、LAS,ARC及びAIDSを有するヒト５人中５人
においてRNaseインヒビターが存在する証拠が提供され
た。このインヒビターは転移され、そしてL929細胞抽出
物中のrRNAの２−5Aで誘導されたRNase L特異的分解を
妨げることができる。RNaseのこのようなインヒビター
の１つはTCA及びエタノールにより沈澱する。RNase L活
性の抑制はRNase A又はプロテアーゼ処理により消失さ
れた。本発明者の研究は、LAS,ARC及びAIDSを有するヒ
トのPBMC中で、内因性dsRNAは２−5Aシンテターゼの活
性を促進し、そしてそれは内因性２−5Aの濃度を増強す
る結果をもたらすことを示唆する。RNaseを活性化する
機能的２−5Aの能力は、LAS,ARC及びAIDSを有するヒト
のPBMC中のRNase LのHIVにより誘導されるインヒビター
により抑制される。
血液画分、移植器官の細胞及び細胞抽出物を包含する組
織中にHIVに対する抗体を有する患者における、十分に
発達したAIDSの進行に関するこのマーカーの前兆的な重
要性が検討される。RNase Lの活性化法及び／又はRNase
Lインヒビターを除去し又は不活化する方法が記載され
る。AIDS及び関連のウイルスを処置するための治療法、
並びにRNase Lを活性化しそして／又はRNase Lインヒビ
ターもしくはインヒビターに向けられたウイルスを除去
しもしくは不活性化することにより前記のようなウイル
スの発達をモニターする医療的方法は本発明の一部であ
る。RNase Lの特異的インヒビター又は２′−５′A/RNa
se L経路中の生化学的媒介物のウイルスに向けられたイ
ンヒビターを抗原として用いて、生体内（in vivo）及
び試験管内（in vitro）双方でこれらのウイルスに対
する抗体を調製する方法は本発明に包含される。上記２
−5Aシンテターゼ/RNase L抗ウイルス経路の構成要素
は、リンパ腺症（LAS）、AIDS関連コンプレックス（AR
C）及び後天性免疫不全症症候群（AIDS）を有するヒト
由来の末梢血単核細胞（PBMC）の抽出物中で測定され
た。２−5Aシンテターゼのレベルは、AIDSを有するヒト
において非常に上昇しており、そしてARC又はLASを有す
る個体において基底のレベルにあることが示された。し
かし、２−5Aシンテターゼの多様性と無関係に、高い濃
度の内因性２−5A（35nM以下）がLAS,ARC及びAIDSを有
するヒトで検出された。抽出された２−5Aは、結合アッ
セイ、コア−セルロース（core−cellulose）アッセイ
及びリボゾームのRNA分解アッセイにより測定したとこ
ろ確かに機能的であった。機能的な内因性２−5Aの濃度
が増強したにもかかわらず、LAS,ARC及びAIDSを有する
ヒトのいずれにおいてもいかなる活性化RNase L示すこ
とができなかった。しかしながら、たとえ内因性２−5A
の濃度が5nM以下であったとしても、RNase Lは全ての健
康な個体のPBMC中で活性化された。実験を組みあわせる
ことにより、LAS,ARC及びAIDSを有するヒト５人中５人
においてRNaseインヒビターが存在する証拠が提供され
た。このインヒビターは転移され、そしてL929細胞抽出
物中のrRNAの２−5Aで誘導されたRNase L特異的分解を
妨げることができる。RNaseのこのようなインヒビター
の１つはTCA及びエタノールにより沈澱する。RNase L活
性の抑制はRNase A又はプロテアーゼ処理により消失さ
れた。本発明者の研究は、LAS,ARC及びAIDSを有するヒ
トのPBMC中で、内因性dsRNAは２−5Aシンテターゼの活
性を促進し、そしてそれは内因性２−5Aの濃度を増強す
る結果をもたらすことを示唆する。RNaseを活性化する
機能的２−5Aの能力は、LAS,ARC及びAIDSを有するヒト
のPBMC中のRNase LのHIVにより誘導されるインヒビター
により抑制される。
ここに本発明者は、特異的且つ高感度のアッセイを用
いることによるPBMC抽出物中の２−5Aの濃度及びRNase
Lの機能の測定に注目し、そしてLAS,ARC及びAIDSを有す
るヒトからのPBMC中の２−5Aシンテターゼ/RNase抗ウイ
ルス系の欠損が、RNase Lインヒビターの存在に基づく
ものであって非機能的２−5Aの合成に基づくものではな
いことを証明する。ここに提示したデータは、ウイルス
感染細胞中で生じている外見上では逆説的な相互作用が
今や合理的に、理路整然と生化学的な術語で説明し得る
ことを強調する。
いることによるPBMC抽出物中の２−5Aの濃度及びRNase
Lの機能の測定に注目し、そしてLAS,ARC及びAIDSを有す
るヒトからのPBMC中の２−5Aシンテターゼ/RNase抗ウイ
ルス系の欠損が、RNase Lインヒビターの存在に基づく
ものであって非機能的２−5Aの合成に基づくものではな
いことを証明する。ここに提示したデータは、ウイルス
感染細胞中で生じている外見上では逆説的な相互作用が
今や合理的に、理路整然と生化学的な術語で説明し得る
ことを強調する。
図面の詳細の説明 アクリル系のビーズに結合したRNase A（1mg）又はカ
ルボキシメチルセルロースに結合したプロテアーゼ（1m
g）（Sigma Chemical社）を、NP40細胞溶解緩衝液（1
6）（10μ）に30℃で２時間浸した。次に最終容量が1
5μになるようにPBMC抽出物（100μg/アッセイ）を混
合し、さらに30℃で２時間インキュベートした。二度目
のインキュベーションの間中、試験管をゆっくりと指で
数回撹拌した。対照サンプルは、いずれの酵素を加えな
いでインキュベートした。固定化された酵素を遠心（1
0,000×g,5分，室温）により沈澱させた。５μの上澄
分画をL929細胞抽出物（150μg,タンパク／アッセイ）
に加え、そしてrRNA分解アッセイを使用してRNase L特
異活性を測定した。
ルボキシメチルセルロースに結合したプロテアーゼ（1m
g）（Sigma Chemical社）を、NP40細胞溶解緩衝液（1
6）（10μ）に30℃で２時間浸した。次に最終容量が1
5μになるようにPBMC抽出物（100μg/アッセイ）を混
合し、さらに30℃で２時間インキュベートした。二度目
のインキュベーションの間中、試験管をゆっくりと指で
数回撹拌した。対照サンプルは、いずれの酵素を加えな
いでインキュベートした。固定化された酵素を遠心（1
0,000×g,5分，室温）により沈澱させた。５μの上澄
分画をL929細胞抽出物（150μg,タンパク／アッセイ）
に加え、そしてrRNA分解アッセイを使用してRNase L特
異活性を測定した。
さらにPBMC抽出物から単離された内因性２−5Aは、rR
NA分解アッセイにより特徴づけた。PBMCから単離した２
−5AについてのRNase Lにより生成される開裂パターン
は、真正の２−5Aを用いて得られたパターンよりL929細
胞抽出物中では著しく相違した（第１図、レーン3,5,7
及び９をレーン10と比較）。例えば、PBMCから単離され
た内因性２−5AはL929細胞からのRNase Lを活性化して2
8S及び18S rRNAを開裂せしめ、３個の特徴的な開裂生成
物を形成せしめる（第１図、レーン10）。観察された開
裂パターンの相違に対する説明は、PBMCで産生した内因
性２−5Aは真正２−5Aから異るということであろう。
NA分解アッセイにより特徴づけた。PBMCから単離した２
−5AについてのRNase Lにより生成される開裂パターン
は、真正の２−5Aを用いて得られたパターンよりL929細
胞抽出物中では著しく相違した（第１図、レーン3,5,7
及び９をレーン10と比較）。例えば、PBMCから単離され
た内因性２−5AはL929細胞からのRNase Lを活性化して2
8S及び18S rRNAを開裂せしめ、３個の特徴的な開裂生成
物を形成せしめる（第１図、レーン10）。観察された開
裂パターンの相違に対する説明は、PBMCで産生した内因
性２−5Aは真正２−5Aから異るということであろう。
２−5Aに対する現在知られている標的酵素であるフリ
ーのRNase L（２−5Aで活性化されていない）のレベル
を概算するために放射線結合アッセイが用いられた。本
発明者の発見と同等な追加の標的酵素を用いることもで
きる。LAS,ARC及びAIDSを有するヒトのPBMC抽出物は、
正常者のそれよりも５−７倍低いレベルのフリーのRNas
e Lを有する（第１表，第４カラム）。しかしながら、R
Nase Lへの結合についてP3A4〔32P〕PCPと内因性２−5A
とが競合するようなサンプルにおいては、上記放射線結
合アッセイの適用には限界がある。従って、放射線結合
アッセイで得られた結果はRNase Lのレベルを正確に反
映するものでない。それゆえに、２−5Aで活性化された
RNase Lのレベルの決定は必須であった。この目的を達
成するために、本発明者は、末梢血の1mlほどの少量か
ら単離されたPBMCの抽出物中の活性化RNase Lの測定を
許容する下記に記載する新規かつ高感度な技術を用い
た。なお、この技術はrRNAに対する２−5A活性化RNase
Lの開裂の特異性に基礎を置いた。
ーのRNase L（２−5Aで活性化されていない）のレベル
を概算するために放射線結合アッセイが用いられた。本
発明者の発見と同等な追加の標的酵素を用いることもで
きる。LAS,ARC及びAIDSを有するヒトのPBMC抽出物は、
正常者のそれよりも５−７倍低いレベルのフリーのRNas
e Lを有する（第１表，第４カラム）。しかしながら、R
Nase Lへの結合についてP3A4〔32P〕PCPと内因性２−5A
とが競合するようなサンプルにおいては、上記放射線結
合アッセイの適用には限界がある。従って、放射線結合
アッセイで得られた結果はRNase Lのレベルを正確に反
映するものでない。それゆえに、２−5Aで活性化された
RNase Lのレベルの決定は必須であった。この目的を達
成するために、本発明者は、末梢血の1mlほどの少量か
ら単離されたPBMCの抽出物中の活性化RNase Lの測定を
許容する下記に記載する新規かつ高感度な技術を用い
た。なお、この技術はrRNAに対する２−5A活性化RNase
Lの開裂の特異性に基礎を置いた。
PBMC中のrRNAは検出限界より低いから、rRNA原として
HL929細胞（L929細胞系のRNase L欠損サブクローン）を
代用した。HL929細胞は、ブタペスト条約の規定の下
に、アメリカンタイプカルチャーコレクション（The Am
erican Type Culture Collection in Rockville,Maryla
nd,USA）に受託番号第号で寄託された。このアッセイを
使用して、本発明者は、機能的２−5Aの高い細胞内蓄積
を示すところの、LAS,ARC及びAIDSを有するヒト由来のP
BMC抽出物中ではRNase Lが活性をもたないことを証明す
ることができる（第２図、２−６レーン）。実験された
すべての健康な個体由来のPBMC抽出物は、たとえ２−5A
が＜5nMで存在したとしても、特徴的開裂生成物を生じ
るRNase L活性の存在を示した（第２図、７レーン）。
HL929細胞（L929細胞系のRNase L欠損サブクローン）を
代用した。HL929細胞は、ブタペスト条約の規定の下
に、アメリカンタイプカルチャーコレクション（The Am
erican Type Culture Collection in Rockville,Maryla
nd,USA）に受託番号第号で寄託された。このアッセイを
使用して、本発明者は、機能的２−5Aの高い細胞内蓄積
を示すところの、LAS,ARC及びAIDSを有するヒト由来のP
BMC抽出物中ではRNase Lが活性をもたないことを証明す
ることができる（第２図、２−６レーン）。実験された
すべての健康な個体由来のPBMC抽出物は、たとえ２−5A
が＜5nMで存在したとしても、特徴的開裂生成物を生じ
るRNase L活性の存在を示した（第２図、７レーン）。
LAS,ARC及びAIDSが感染した患者由来のPBMC抽出物中
に生物学的に活性な２−5Aが存在したとの本発明者の観
察は、何故RNase Lが不活性であったかについて疑問を
生じさせた。上記RNase L活性の不存在が（第２図、２
−６レーンで明らかにされたごとく）、非機能的なRNas
e Lのせいであるか、又はRNase L活性のインヒビターの
せいであるかを決定するために、混合実験を以下のよう
に行った。機能的なRNase Lを含有するL929細胞抽出物
を、LAS,ARC及びAIDSを有するヒト由来のPBMC抽出物と
混ぜ、そして同時インキュベート（co−incubate）し
た。RNase L−特徴的開裂生成物のいかなる形成物も検
出されなかった（第１図、3,5及び７レーン）。
に生物学的に活性な２−5Aが存在したとの本発明者の観
察は、何故RNase Lが不活性であったかについて疑問を
生じさせた。上記RNase L活性の不存在が（第２図、２
−６レーンで明らかにされたごとく）、非機能的なRNas
e Lのせいであるか、又はRNase L活性のインヒビターの
せいであるかを決定するために、混合実験を以下のよう
に行った。機能的なRNase Lを含有するL929細胞抽出物
を、LAS,ARC及びAIDSを有するヒト由来のPBMC抽出物と
混ぜ、そして同時インキュベート（co−incubate）し
た。RNase L−特徴的開裂生成物のいかなる形成物も検
出されなかった（第１図、3,5及び７レーン）。
RNase Lの活性化の原因である内因性２−5A（第１
図、3,5及び７レーン）が、これらのサンプルが調製さ
れた細胞抽出物（第１図、2,4及び６レーン）に比較し
少なくとも４倍希釈を代表することを強調することが重
要である。これらのデータは、LAS,ARC及びAIDSを有す
るヒトのPBMC中にTCA−不溶RNase Lインヒビターの存在
を示す。かかるインヒビターは健康人には見い出されな
かった。なぜなら、健康人のPBMC抽出物は、L929細胞抽
出物との同時インキュベーションに続きRNase L−特徴
的開裂生成物が生じたからである（第１図、８レー
ン）。同様に、また健康人に由来するPBMCのTCA−可溶
分画も特徴的開裂生成物を生じる（第１図、９レー
ン）。機能的２−5Aの存在、及び推測されるRNase Lイ
ンヒビターがTCA及びエタノール沈澱性であるという事
実は、上記RNase LのインヒビターはHSV−１及びレトロ
ウイルス感染細胞の培養物中で最近同定されたように２
−5A類似体ではないことを示唆する。
図、3,5及び７レーン）が、これらのサンプルが調製さ
れた細胞抽出物（第１図、2,4及び６レーン）に比較し
少なくとも４倍希釈を代表することを強調することが重
要である。これらのデータは、LAS,ARC及びAIDSを有す
るヒトのPBMC中にTCA−不溶RNase Lインヒビターの存在
を示す。かかるインヒビターは健康人には見い出されな
かった。なぜなら、健康人のPBMC抽出物は、L929細胞抽
出物との同時インキュベーションに続きRNase L−特徴
的開裂生成物が生じたからである（第１図、８レー
ン）。同様に、また健康人に由来するPBMCのTCA−可溶
分画も特徴的開裂生成物を生じる（第１図、９レー
ン）。機能的２−5Aの存在、及び推測されるRNase Lイ
ンヒビターがTCA及びエタノール沈澱性であるという事
実は、上記RNase LのインヒビターはHSV−１及びレトロ
ウイルス感染細胞の培養物中で最近同定されたように２
−5A類似体ではないことを示唆する。
固相上に不溶化した分解酵素を用いる本発明者の実験
は、LAS,ARC及びAIDSを有するヒト由来のPBMC抽出物中
に見い出されるRNase Lのインヒビターの性質について
重要な新しい洞察を提供した。固定化プロテアーゼ又は
RNaseと共にAIDSを有するヒト由来のPBMC抽出物をプレ
インキュベート（preincubate）し、そして引き続きL92
9細胞抽出物とコ・インキュベートした場合は、特徴的
な生成物の出現物により明らかにしたように（第３図、
１及び２レーンと３レーンとの比較）、RNase L活性は
回復した。
は、LAS,ARC及びAIDSを有するヒト由来のPBMC抽出物中
に見い出されるRNase Lのインヒビターの性質について
重要な新しい洞察を提供した。固定化プロテアーゼ又は
RNaseと共にAIDSを有するヒト由来のPBMC抽出物をプレ
インキュベート（preincubate）し、そして引き続きL92
9細胞抽出物とコ・インキュベートした場合は、特徴的
な生成物の出現物により明らかにしたように（第３図、
１及び２レーンと３レーンとの比較）、RNase L活性は
回復した。
LAS,ARC及びAIDSを有するヒト由来のPBMCにおける２
−5Aシンテターゼ/RNase L抗ウイルス系の欠損は、RNas
e Lのインヒビターに帰することができるが、しかし機
能的２−5Aの欠失に帰することにできないことを、本発
明者の研究は証明している。RNase Lインヒビターは、L
AS,ARC及びAIDSを有するヒトから単離されたPBMC抽出物
中に存在し、そしてこのことは該インヒビターが典型的
なレトロウイルス性疾病の進行の全ての段階において存
在でき、そしてまた種々の他の亜急性／慢性、ウイルス
性／病原体感染にも関連することを示している。ここで
実験されたLAS,ARC及びAIDSを有するヒト由来の全てのP
BMCがHIV RNA（分子ハイブリダイゼーションにより検出
されるような）及びHIV感染センター（infections cent
ers）を有するという本発明者の今までの報告を考慮す
ればRNase Lインヒビターがウイルスにより誘導される
可能性が高い。
−5Aシンテターゼ/RNase L抗ウイルス系の欠損は、RNas
e Lのインヒビターに帰することができるが、しかし機
能的２−5Aの欠失に帰することにできないことを、本発
明者の研究は証明している。RNase Lインヒビターは、L
AS,ARC及びAIDSを有するヒトから単離されたPBMC抽出物
中に存在し、そしてこのことは該インヒビターが典型的
なレトロウイルス性疾病の進行の全ての段階において存
在でき、そしてまた種々の他の亜急性／慢性、ウイルス
性／病原体感染にも関連することを示している。ここで
実験されたLAS,ARC及びAIDSを有するヒト由来の全てのP
BMCがHIV RNA（分子ハイブリダイゼーションにより検出
されるような）及びHIV感染センター（infections cent
ers）を有するという本発明者の今までの報告を考慮す
ればRNase Lインヒビターがウイルスにより誘導される
可能性が高い。
ここに発明した発見が示唆するところによれば、ウイ
ルスの複製が２−5Aシンテターゼ/RNase L系を変化せし
め、自然の抗ウイルス状態が十分に発揮されずそして／
又は維持されなくなる。HIV及び／又は他の共存するレ
トロウイルスによりコードされたタンパク又はRNAはRNa
se Lの活性を抑制できるようである。
ルスの複製が２−5Aシンテターゼ/RNase L系を変化せし
め、自然の抗ウイルス状態が十分に発揮されずそして／
又は維持されなくなる。HIV及び／又は他の共存するレ
トロウイルスによりコードされたタンパク又はRNAはRNa
se Lの活性を抑制できるようである。
末梢血単核細胞（PBMC）はファイコール−ヒパキュ
（Ficoll−Hypaque）上で単離された;L929及びHL929（L
929のRNase L失損サブクローン）細胞は単層倍地中に保
存された；そしてL929及びLH929由来の細胞質抽出物は
グリセロール緩衝液中で調製されそしてPBMC抽出物はNP
40細胞溶解緩衝液中で調製された（全て公知の手法に従
う）。上記抽出物のタンパク濃度は１−15μg/μの範
囲とした。
（Ficoll−Hypaque）上で単離された;L929及びHL929（L
929のRNase L失損サブクローン）細胞は単層倍地中に保
存された；そしてL929及びLH929由来の細胞質抽出物は
グリセロール緩衝液中で調製されそしてPBMC抽出物はNP
40細胞溶解緩衝液中で調製された（全て公知の手法に従
う）。上記抽出物のタンパク濃度は１−15μg/μの範
囲とした。
２−5Aシンテターゼの活性はポリ（rI）−ポリ（rC）
−アガロースを用いて単離されたPBMC抽出物（50μｇタ
ンパク／アッセイ）中で検出した。２−5Aは、フロン／
トリ−ｎ−オクチルアミン中和後PBMC抽出物のTCA−可
溶性分画から単離した。TCAにより抽出された２−5A
は、その後凍結乾燥されそして水に再溶解して５μｇタ
ンパク／μと同等となるよう全てのサンプルは水のあ
る量で標準化した。PBMC抽出物中に存在する２−5Aの濃
度は、RNase Lの原料としてL929細胞抽出物を用いる放
射線結合アッセイで測定された。18,900dpmのp3A
4〔32P〕pCp（比活性3000Ci/mmol,Amersham）がアッセ
イ当り添加され、２−5Aの添加をしないときはRNase L
に9,400dpmが結合された。５μの単離した２−5Aサン
プルが添加されたアッセイにおいて約９−14％のp3A4〔
32P〕pCpが置換された。PBMC中の２−5A濃度は、真正な
２−5Aを用いる測定曲線との比較により決定され、そし
て25μg/μの細胞質タンパク濃度が計算の基礎とされ
た。また、PBMCから単離された２−5Aの濃度は、RNase
Lの原料としてL929細胞抽出物を用いるコアー−セルロ
ース（core−cellulose）アッセイで測定された。この
アッセイにおける２−5AによるRNaseの活性化は、ポリ
（Ｕ）〔32P〕pCpの酸性可溶化断片への転換が基礎とさ
れた。全ポリ（Ｕ）〔32P〕pCp（15,000dpm）の約５−2
0％が上記単離２−5Aサンプル2.5μの存在中で開裂さ
れた。濃度は上述のような真正な２−5Aの有する測定曲
線から決定された。無変化RNase Lレベルは、RBMC抽出
物（50μｇタンパク／アッセイ）に20,000dpmのp3A4〔
32P〕pCpを添加した後に放射線バインディングアッセイ
で測定された。得られた結果は次のとおりであった： LAS,ARC及びAIDSを有するヒトから得られたPBMCの抽
出物中のインターフェロンにより誘導される酵素、すな
わち２−5Aシンテターゼを試験管内（in vitro）で測
定しそして表１に示したような健康人由来の抽出物中の
ものと比較した。AIDS（＋３及び＋５）を有するヒトに
おける２−5Aシンテターゼレベルは正常者で観察された
もの（表１、カラム１）よりも16及び20倍高かった。こ
れに対して、LAS（＋１）、ARC（＋２）及びカポジ（Ka
posi′ｓ）肉腫を伴うAIDSを有する患者における２−5A
シンテターゼレベルは、1.3−５倍高められているにす
ぎず、他のものにより行われた基線観察の結果を支持し
た。
−アガロースを用いて単離されたPBMC抽出物（50μｇタ
ンパク／アッセイ）中で検出した。２−5Aは、フロン／
トリ−ｎ−オクチルアミン中和後PBMC抽出物のTCA−可
溶性分画から単離した。TCAにより抽出された２−5A
は、その後凍結乾燥されそして水に再溶解して５μｇタ
ンパク／μと同等となるよう全てのサンプルは水のあ
る量で標準化した。PBMC抽出物中に存在する２−5Aの濃
度は、RNase Lの原料としてL929細胞抽出物を用いる放
射線結合アッセイで測定された。18,900dpmのp3A
4〔32P〕pCp（比活性3000Ci/mmol,Amersham）がアッセ
イ当り添加され、２−5Aの添加をしないときはRNase L
に9,400dpmが結合された。５μの単離した２−5Aサン
プルが添加されたアッセイにおいて約９−14％のp3A4〔
32P〕pCpが置換された。PBMC中の２−5A濃度は、真正な
２−5Aを用いる測定曲線との比較により決定され、そし
て25μg/μの細胞質タンパク濃度が計算の基礎とされ
た。また、PBMCから単離された２−5Aの濃度は、RNase
Lの原料としてL929細胞抽出物を用いるコアー−セルロ
ース（core−cellulose）アッセイで測定された。この
アッセイにおける２−5AによるRNaseの活性化は、ポリ
（Ｕ）〔32P〕pCpの酸性可溶化断片への転換が基礎とさ
れた。全ポリ（Ｕ）〔32P〕pCp（15,000dpm）の約５−2
0％が上記単離２−5Aサンプル2.5μの存在中で開裂さ
れた。濃度は上述のような真正な２−5Aの有する測定曲
線から決定された。無変化RNase Lレベルは、RBMC抽出
物（50μｇタンパク／アッセイ）に20,000dpmのp3A4〔
32P〕pCpを添加した後に放射線バインディングアッセイ
で測定された。得られた結果は次のとおりであった： LAS,ARC及びAIDSを有するヒトから得られたPBMCの抽
出物中のインターフェロンにより誘導される酵素、すな
わち２−5Aシンテターゼを試験管内（in vitro）で測
定しそして表１に示したような健康人由来の抽出物中の
ものと比較した。AIDS（＋３及び＋５）を有するヒトに
おける２−5Aシンテターゼレベルは正常者で観察された
もの（表１、カラム１）よりも16及び20倍高かった。こ
れに対して、LAS（＋１）、ARC（＋２）及びカポジ（Ka
posi′ｓ）肉腫を伴うAIDSを有する患者における２−5A
シンテターゼレベルは、1.3−５倍高められているにす
ぎず、他のものにより行われた基線観察の結果を支持し
た。
２−5Aシンテターゼのこの試験管内測定が生体内の機
能的酵素を示すものであるかを決定するために、２−5A
を上記PBMCから抽出された。PBMC抽出物のTCA−可溶性
分画由来の２−5Aの生物学的活性は、放射線結合アッセ
イ及びコアー・セルロースアッセイにより広範囲にわた
って特徴づけられた。２−5Aの濃度は上記２つのアッセ
イ手法により決定された場合（表１、カラム２及び３）
同程度であった。方法Ａ及び方法Ｂ（表１、カラム２及
び３）によって得られた結果の間の一致は、ヒトPBMC抽
出物から単離された２−5Aが真正の２−5Aと同じ程度で
L929細胞由来のRNase Lに対して結合できそして該RNase
Lを活性化できることを明らかにしている。
能的酵素を示すものであるかを決定するために、２−5A
を上記PBMCから抽出された。PBMC抽出物のTCA−可溶性
分画由来の２−5Aの生物学的活性は、放射線結合アッセ
イ及びコアー・セルロースアッセイにより広範囲にわた
って特徴づけられた。２−5Aの濃度は上記２つのアッセ
イ手法により決定された場合（表１、カラム２及び３）
同程度であった。方法Ａ及び方法Ｂ（表１、カラム２及
び３）によって得られた結果の間の一致は、ヒトPBMC抽
出物から単離された２−5Aが真正の２−5Aと同じ程度で
L929細胞由来のRNase Lに対して結合できそして該RNase
Lを活性化できることを明らかにしている。
LAS,ARC及びAIDSにおける２−5Aシンテターゼレベル
と内因性２−5Aのレベルとの間の量的な相関性の見かけ
上の不在（表１、カラム２及び３とカラム１を比較）
は、今や初めて次のように説明し得る。試験管内アッセ
イにおける２−5Aシンテターゼの決定は、ポリ（rI）−
ポリ（rC）−アガロースにより部分的な精製に基礎づけ
られている；従って、このアッセイではフリー２−5Aシ
ンテターゼのみが測定されそしてdsRDAにより生体内で
活性化された２−5Aシンテターゼは測定されない。しか
し、内因性２−5Aシンテターゼの直接測定に上記２−5A
変性酵素を加えた（即ち、２′−ホスホジェステラーゼ
及びホスファターゼ）。それゆえに、LAS,ARC及びAIDS
を有するヒトのPBMC中の２−5Aの蓄積は２−5A変性酵素
の低い活性を示す。またさらに、PBMC中の２−5Aの存在
は、正常な被験者においてもAIDS患者においても従来観
察されなかった内因性dsRNAが存在することを示してい
る。
と内因性２−5Aのレベルとの間の量的な相関性の見かけ
上の不在（表１、カラム２及び３とカラム１を比較）
は、今や初めて次のように説明し得る。試験管内アッセ
イにおける２−5Aシンテターゼの決定は、ポリ（rI）−
ポリ（rC）−アガロースにより部分的な精製に基礎づけ
られている；従って、このアッセイではフリー２−5Aシ
ンテターゼのみが測定されそしてdsRDAにより生体内で
活性化された２−5Aシンテターゼは測定されない。しか
し、内因性２−5Aシンテターゼの直接測定に上記２−5A
変性酵素を加えた（即ち、２′−ホスホジェステラーゼ
及びホスファターゼ）。それゆえに、LAS,ARC及びAIDS
を有するヒトのPBMC中の２−5Aの蓄積は２−5A変性酵素
の低い活性を示す。またさらに、PBMC中の２−5Aの存在
は、正常な被験者においてもAIDS患者においても従来観
察されなかった内因性dsRNAが存在することを示してい
る。
ミスマッチ二重鎖（mismatched double−stranded）R
NAは高分子RNAの公知の成品であり（米国特許第4,024,2
22号及び同第4,130,641号）、そしてその中で二重鎖ら
せんの不安定性が塩基の対合を妨げる。ミスマッチdsRN
Aは、本来インターフェロンの誘導に関連性のない機構
を示すところの、そのインターフェロン誘導特性につい
て周知である〔例えば、ヨーロッパ特許出願（E.P.A）
第83305426、５号（1983年８月15日出願、発明の名称：
腫瘍細胞上のdsRNAsの抗増殖作用”）。
NAは高分子RNAの公知の成品であり（米国特許第4,024,2
22号及び同第4,130,641号）、そしてその中で二重鎖ら
せんの不安定性が塩基の対合を妨げる。ミスマッチdsRN
Aは、本来インターフェロンの誘導に関連性のない機構
を示すところの、そのインターフェロン誘導特性につい
て周知である〔例えば、ヨーロッパ特許出願（E.P.A）
第83305426、５号（1983年８月15日出願、発明の名称：
腫瘍細胞上のdsRNAsの抗増殖作用”）。
ミスマッチ二重鎖RNAの典型的な治療の態様は、ポリ
リボイノシン酸及びポリリボシチジル酸／ウリジル酸の
複合により調製された合成dsRNA、例えばrIn・ｒ（Cx′
Ｕ又はＧ）ｎ（但し、Ｘは４−29の値を有する）、より
具体的にはrIn・ｒ（C12U）ｎ〔本明細書ではAMPLIGEN
（HEM Research,Inc.,Rockville,Maryland,USAの米国
登録商標）〕である。アンプリゲン（AMPLIGEN）と同様
に作用する多くのミスマッチdsRNAポリマーが研究され
てきた。他の形態の天然及び／又は合成dsRNAに対する
ミスマッチdsRNAの医療的な主たる利点は、動物及びヒ
トにおけるそれらの低い毒性である。例えば、Lampson
等は種々のインターフェロン関連効果を誘因し得るdsRN
Aの初期の複合体を開示した（米国特許第3,666,646
号）。しかし、かかる化合物の毒性は、癌又は関連の疾
病の治療におけるすべての臨床的な使用を排除した。
リボイノシン酸及びポリリボシチジル酸／ウリジル酸の
複合により調製された合成dsRNA、例えばrIn・ｒ（Cx′
Ｕ又はＧ）ｎ（但し、Ｘは４−29の値を有する）、より
具体的にはrIn・ｒ（C12U）ｎ〔本明細書ではAMPLIGEN
（HEM Research,Inc.,Rockville,Maryland,USAの米国
登録商標）〕である。アンプリゲン（AMPLIGEN）と同様
に作用する多くのミスマッチdsRNAポリマーが研究され
てきた。他の形態の天然及び／又は合成dsRNAに対する
ミスマッチdsRNAの医療的な主たる利点は、動物及びヒ
トにおけるそれらの低い毒性である。例えば、Lampson
等は種々のインターフェロン関連効果を誘因し得るdsRN
Aの初期の複合体を開示した（米国特許第3,666,646
号）。しかし、かかる化合物の毒性は、癌又は関連の疾
病の治療におけるすべての臨床的な使用を排除した。
ミスマッチdsRNA、例えばアンプリゲンは、一定のヒ
ト腫瘍、特に腎臓癌に対し治療効果を有することが今や
知られている。最近は完全に“インターフェロン誘発
剤”のように考えられているが本件の発明者がその発明
者であるとE.P.A83305426、５に十分に記載されたよう
に、dsRNAsはインターフェロンそのものに完全に耐性が
あるある種のヒト腫瘍について活性を有する。
ト腫瘍、特に腎臓癌に対し治療効果を有することが今や
知られている。最近は完全に“インターフェロン誘発
剤”のように考えられているが本件の発明者がその発明
者であるとE.P.A83305426、５に十分に記載されたよう
に、dsRNAsはインターフェロンそのものに完全に耐性が
あるある種のヒト腫瘍について活性を有する。
他の特許出願（E.P.A.86306582、7,出願日:1986年８
月26日、名称「二重鎖RNAsによるウイルス関連事象の調
整」）において、本発明者は原型dsRNAとしてアンプリ
ゲンを使用してdsRNAsによるヒト細胞培養中のAIDSウイ
ルスの抑制を記載している“マッチ（matched）dsRNA"
は相対鎖間の水素結合（塩基の積重ね）がほぼ完全であ
る。即ち、中断が29個の連続する塩基残基毎に１個未満
の塩基対であることを意味する。従って、“ミスマッチ
dsRNA"の語は理解されるだろう。
月26日、名称「二重鎖RNAsによるウイルス関連事象の調
整」）において、本発明者は原型dsRNAとしてアンプリ
ゲンを使用してdsRNAsによるヒト細胞培養中のAIDSウイ
ルスの抑制を記載している“マッチ（matched）dsRNA"
は相対鎖間の水素結合（塩基の積重ね）がほぼ完全であ
る。即ち、中断が29個の連続する塩基残基毎に１個未満
の塩基対であることを意味する。従って、“ミスマッチ
dsRNA"の語は理解されるだろう。
上記dsRNAは、ウラシル塩基又はグアノシン塩基を例
えば塩基として、1:5−1:30の割合で含有するポリイノ
シネート及びポリシチジレートの複合体であり得る〔po
ly I.poly（C4−29X＞Ｕ又はＧ）〕。
えば塩基として、1:5−1:30の割合で含有するポリイノ
シネート及びポリシチジレートの複合体であり得る〔po
ly I.poly（C4−29X＞Ｕ又はＧ）〕。
該dsRNAの一般式は、 rIn・（C12U）ｎ であってもよい。dsRNAの他に適当な例は以下に説明す
る。
る。
本発明の用途に好ましいミスマッチdsRNAは、一般式:
poly（Cn,U）及びpoly（Cn,g）（式中、ｎは４−29の整
数値を表わす。）で示されるものから選ばれた共重合ヌ
クレオチドに基づくものであり、そしてポリリボシチジ
レート（rCn）鎖に沿って不対塩基（unpaired base）
（ウラシル又はグアニン）を導入するためのrIn・rCnを
改変することにより調製されたポリリボイノシン酸及び
ポリリボシチジル酸の複合体のミスマッチ類以体（mism
ated analogs）である。他方、該dsRNAはポリリボイノ
シン酸（rIn）のリボシル骨格を改変する、例えば２′
−ｏ−メチルリボシル残基を含ませる、ことによりpoly
（Ｉ）・poly（Ｃ）dsRNAから誘導されてもよい。これ
らrIn・rCnのミスマッチ類以体は、Carter及びTs′ｏの
米国特許第4,130,641号及び4,024,222号に記載されてい
る一般式rIn・ｒ（C12,U）ｎで示されるものが好まし
く、そしてこの記載を引用することによって本明細書の
内容に含める。本明細書に一般的に記載されたdsRNA′
ｓは本発明の用途に適している。
poly（Cn,U）及びpoly（Cn,g）（式中、ｎは４−29の整
数値を表わす。）で示されるものから選ばれた共重合ヌ
クレオチドに基づくものであり、そしてポリリボシチジ
レート（rCn）鎖に沿って不対塩基（unpaired base）
（ウラシル又はグアニン）を導入するためのrIn・rCnを
改変することにより調製されたポリリボイノシン酸及び
ポリリボシチジル酸の複合体のミスマッチ類以体（mism
ated analogs）である。他方、該dsRNAはポリリボイノ
シン酸（rIn）のリボシル骨格を改変する、例えば２′
−ｏ−メチルリボシル残基を含ませる、ことによりpoly
（Ｉ）・poly（Ｃ）dsRNAから誘導されてもよい。これ
らrIn・rCnのミスマッチ類以体は、Carter及びTs′ｏの
米国特許第4,130,641号及び4,024,222号に記載されてい
る一般式rIn・ｒ（C12,U）ｎで示されるものが好まし
く、そしてこの記載を引用することによって本明細書の
内容に含める。本明細書に一般的に記載されたdsRNA′
ｓは本発明の用途に適している。
本発明中で使用するためのミスマッチdsRNAの具体例
は： poly（Ｉ）.poly（C4′Ｕ） poly（Ｉ）.poly（C7′Ｕ） poly（Ｉ）.poly（C13′Ｕ） poly（Ｉ）.poly（C22′Ｕ） poly（Ｉ）.poly（C20′Ｇ） poly（Ｉ）.poly（C29′Ｇ）及び poly（Ｉ）.poly（CP）23G＞Ｐ を包含する。また、本発明により期待される医薬組成物
は、適当な医薬賦形剤中で非経口的投与のために適合さ
せた組成物を包含する。すなわち、例えば、非経口溶
液、非経口懸濁液及び非経口分散液が、溶媒／希釈剤と
して無菌の又は発熱物質を除去した水、またさらに任意
に生理学的に許容できる塩を用いて、公知の医薬製剤技
術に従い調製され得る。
は： poly（Ｉ）.poly（C4′Ｕ） poly（Ｉ）.poly（C7′Ｕ） poly（Ｉ）.poly（C13′Ｕ） poly（Ｉ）.poly（C22′Ｕ） poly（Ｉ）.poly（C20′Ｇ） poly（Ｉ）.poly（C29′Ｇ）及び poly（Ｉ）.poly（CP）23G＞Ｐ を包含する。また、本発明により期待される医薬組成物
は、適当な医薬賦形剤中で非経口的投与のために適合さ
せた組成物を包含する。すなわち、例えば、非経口溶
液、非経口懸濁液及び非経口分散液が、溶媒／希釈剤と
して無菌の又は発熱物質を除去した水、またさらに任意
に生理学的に許容できる塩を用いて、公知の医薬製剤技
術に従い調製され得る。
投与されるミスマッチdsRNAの量は、注入部位から遠
位の箇所において投与直後の循環血液系の体液当たりの
該dsRNAが0.01μg/mlの血中濃度ピークを達成するため
に十分であるのが好ましい。
位の箇所において投与直後の循環血液系の体液当たりの
該dsRNAが0.01μg/mlの血中濃度ピークを達成するため
に十分であるのが好ましい。
他方、有効量は患者に注入する直前に血液生成物に添
加されてもよい。かかる場合において、施術者は、dsRN
Aの必要量との平衡のために用いられる体液容量と患者
の体液容量との合計である彼又は彼女の体液容量と、受
容者の体重とを関連ずける体液容量標準表を単に引用す
ればよい。60−70kgの患者は約５−６リットルの体液を
持っているだろう。
加されてもよい。かかる場合において、施術者は、dsRN
Aの必要量との平衡のために用いられる体液容量と患者
の体液容量との合計である彼又は彼女の体液容量と、受
容者の体重とを関連ずける体液容量標準表を単に引用す
ればよい。60−70kgの患者は約５−６リットルの体液を
持っているだろう。
第１図は、リボソームRNA分解アッセイにより測定したL
AS,ARC又はAIDSを有するヒトのPBMC抽出物から抽出され
た２−5AによるRNase Lの活性化を示すポリアクリルア
ミドゲル電気泳動プレートの写真である。 第２図は、リボソームRNA分解アッセイにより測定され
たところのPBMC抽出物におけるRNase Lレベルの活性化
を示すゲル電気泳動プレートの写真である。 第３図は、PBMCにおけるリボソームRNA分解活性の回復
を示したゲル電気泳動プレートの写真である。 そして、第４図は、２′−５′オリゴアデニレート/RNa
se L経路を図示したフローチャートである。
AS,ARC又はAIDSを有するヒトのPBMC抽出物から抽出され
た２−5AによるRNase Lの活性化を示すポリアクリルア
ミドゲル電気泳動プレートの写真である。 第２図は、リボソームRNA分解アッセイにより測定され
たところのPBMC抽出物におけるRNase Lレベルの活性化
を示すゲル電気泳動プレートの写真である。 第３図は、PBMCにおけるリボソームRNA分解活性の回復
を示したゲル電気泳動プレートの写真である。 そして、第４図は、２′−５′オリゴアデニレート/RNa
se L経路を図示したフローチャートである。
Claims (5)
- 【請求項１】動物中の細胞抽出物中のRNase Lインヒビ
ター、HIVの存在を示すマーカー又はHIVにより指令され
る遺伝情報の存在を決定することを含んでなる、ヒト免
疫不全ウィルス又は実質的に同様な臨床症状を惹起する
その他のウィルスの存在を測定するための方法。 - 【請求項２】ヒトの生物学的な流体又は細胞中のRNase
Lインヒビターの存在を検出することを含んでなる請求
項１記載のヒトの生物学的な流体又は細胞中の潜在性ヒ
ト免疫不全ウィルス又の存在を測定するための方法。 - 【請求項３】生物学的な流体が血液又は血液分画である
請求項２記載の方法。 - 【請求項４】動物の組織の抽出物を試験し、そして請求
項１のRNase Lインヒビターの少なくとも１つの存在又
は不存在を決定することを含んでなり、ここで前記存在
はHIVウィルスの投影された存在をポジティブに示すも
のである、動物中のHIVの投影された頻度を決定するた
めの診断試験方法。 - 【請求項５】HIV又は同様な生化学的及び／又は臨床症
状を惹起するウィルスからの回復の進行をモニターする
方法であって、患者の細胞の抽出物中のRNase Lインヒ
ビターの少なくとも１つが存在するか又は存在しないか
を決定することを含んでなる方法。
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|---|---|
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| AU (2) | AU1256488A (ja) |
| CA (1) | CA1337277C (ja) |
| DK (1) | DK112988A (ja) |
| FI (1) | FI880960A (ja) |
| HU (1) | HU205460B (ja) |
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| PH (1) | PH25365A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| FR2725214A1 (fr) * | 1994-09-30 | 1996-04-05 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveaux composes utilisables pour la preparation d'agents anti-infectieux |
| US5985565A (en) * | 1996-10-09 | 1999-11-16 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Chronic fatigue syndrome diagnosis |
| US6506559B1 (en) | 1997-12-23 | 2003-01-14 | Carnegie Institute Of Washington | Genetic inhibition by double-stranded RNA |
| AUPP249298A0 (en) | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
| KR20010042069A (ko) | 1998-03-20 | 2001-05-25 | 베니텍 오스트레일리아 리미티드 | 유전자 발현 조절방법 |
| AU776150B2 (en) | 1999-01-28 | 2004-08-26 | Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. | Composition and method for (in vivo) and (in vitro) attenuation of gene expression using double stranded RNA |
| US6207366B1 (en) | 1999-04-14 | 2001-03-27 | Temple University- Of The Commonwealth System Of Higher Education | Chronic fatigue syndrome diagnosis |
| US6423885B1 (en) | 1999-08-13 | 2002-07-23 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) | Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells |
| EP1229134A3 (en) | 2001-01-31 | 2004-01-28 | Nucleonics, Inc | Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell |
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| DE3380200D1 (en) * | 1982-09-16 | 1989-08-24 | William Alvin Carter | Anti-proliferative action of dsnras on tumor cells |
| CA1326450C (en) * | 1985-08-26 | 1994-01-25 | William A. Carter | Modulation of aids virus-related events by double stranded rnas (dsrnas) |
-
1988
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- 1988-02-29 IL IL85577A patent/IL85577A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-02-29 CA CA000560051A patent/CA1337277C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-03-02 EP EP88301820A patent/EP0325018A3/en not_active Withdrawn
- 1988-03-02 NO NO88880935A patent/NO880935L/no unknown
- 1988-03-02 PT PT86880A patent/PT86880B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-03-02 JP JP63047657A patent/JP2690493B2/ja not_active Expired - Fee Related
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- 1988-03-02 DK DK112988A patent/DK112988A/da not_active Application Discontinuation
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- 1988-03-03 OA OA59295A patent/OA08815A/xx unknown
- 1988-03-03 KR KR1019880002189A patent/KR890010562A/ko not_active Application Discontinuation
- 1988-03-03 SU SU884355467A patent/SU1687035A3/ru active
- 1988-10-26 RU SU884356721A patent/RU1836101C/ru active
-
1992
- 1992-05-12 AU AU16187/92A patent/AU660973B2/en not_active Ceased
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| PH25365A (en) | 1991-05-13 |
| NO880935L (no) | 1989-06-26 |
| AU1618792A (en) | 1992-09-10 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |