RU1836101C - Способ вы влени вируса человеческого иммунодефицита у животного и человека - Google Patents

Abstract

Использование: вирусологи . Сущ- нос-ть изобретени : описаны направл емые HIV ингибиторы природной 2 -5 А противовирусной защитной системы, диагностические методики и вспомогательные средства дл  лечени  вирусных нарушений. Выделены и идентифицированы индуцируемые HIV ингибиторы РНазы L больных с синдромом заболевани  лимфатических узлов, родственным СПИДу комплексом и синдромом приобретенного иммунодефицита . У таких пациентов функциональные 2-5А не способны активировать РНазу L в моно дерных клетках периферийной крови, эндогенна  дзРНК, эндогенна  дзРНК, в особенности неспаренна  дзРНК, активирует 2-5А-синтетазу, что приводит к увеличению концентрации эндогенных 2-5А.4 ил. 1 табл.

Description

I СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита ) представл ет собой одну из основных угроз здоровью людей в двадцатом сто, 1етии, Вследствие его изменчивой биологи- чес ой природы, коварных способов распространени  от индивидума к индивидуму, скрытого периода развити  болезни, что делает затруднительным само ее обнаружение, СП /1Д, несомненно, состоит в р ду эпидемиолог 1ческих проблем, требующих беспрецеден- тних усилий. В самом деле, даже при значительных затратах, вложенных на увеличение надежности диагностики СПИДа, созданные к насто щему времени методики все ещо в недостаточной степени отвечает необходимым требовани м четкого контрол  этой проблемы дл  любой группы населени .

Существуют различные обозначени  вируса иммунодефицита человека (HiV), вирус СПИДа, выделенный в Пастеровском Институте (Париж, Франци ) обозначают как LAV в то врем  как вирус, выделенный в Национальном Институте здоровь  (Бефез- да шт.Мэриленд, США), обозначают как HTLV-III. В насто щем тексте вирус HIV частот будет называтьс  в его общем значении или же будет обозначатьс  как HTLV-III, LAV или HIV, но без намерени  провести различи  между ними. Более того, термин HIV в насто щем описании включает вс кие любые другие вирусы, которые могут быть св заны со СПИДом, вне зависимости от того выделены ли они или еще нет. Имеетс  в виду, что HIV в единственном числе

00

со

О

OJ

включает любой тип HIV, независимо от его геномного содержани . Аналогично, характерные дл  СПИДа симптомы в общем виде будут называтьс , как включающие симптомы , вызываемые HIV (согласно вышеприведенному определению), симптомы РСК (родственный СПИДу комплекс), симптомы синдрома заболевани  лимфатических узлов (СЗЛ) и симптомы, вызываемые другими вирусами, с по существу аналогичной клинической картиной.

СПИД следует за прогрессирующими нарушени ми иммунной системы, вызванные инфекцией вирусом иммунодефицита человека (HIV). На ранних стади х болезни ответственные за иммунность клетки станов тс  дефектными вследствие потери Т-кле- ток (происход щих из тимуса клеток), экспрессирующих так называемой Т4-анти- ген, т.е. той части Т-клеток, котора  в основ- ном состоит из фага-помощника и индуктора. Дефицит Т4 в клетках может привести к определенным видам дефицита в передающейс  с помощью клеток иммунности , втом числе: дефицита ЕУ (естественных клеток-убийц) АЛУ (активированных лимфо- кином клеток-убийц) и цитолитичных Т-клеток .

СПИД, видимо,  вл етс  прогрессирующей болезнью, хот  врем  перехода из одной фазы в другую может мен тьс . Дл  фаз развити  СПИДа существует классификаци . Существуют асимптоматические индивидумы, зараженные HIV (серопо- ложительные), о чем суд т по циркул ции антител к вирусу. Если у них отсутствуют другие маркеры, их относ т к больным на BPI-стадии согласно классификации Вальтера Рида Их также называют предРСК/РСК - родственный СПИДу комплекс , хот  некоторые такие больные могут так никогда и не показать характерных дл  РСК симптомов. У некоторых таких больных может развитьс  болезнь лимфатических узлов (ВР2) и по витьс  дефицит Т4-клеток (ВРЗ). Затем происходит снижение способности лимфоцитов претерпевать стимулируемую антигеном пролиферацию и стимулируемой антигеном способности образовывать гамма-интерферон, и пациенты на такой ВР4-стадии начинают тер ть замедленную кожную гиперчувствительность. Больные на ВР5-стадии обычно станов тс  в лыми. Они подвержены заражению опо сывающим лишаем, афтозному стоматиту (молочнице) или имеютсимптомы РСК, которые включают: продолжительные ознобы, потение по ночам, слабость, понос и/или потерю веса. Этот период РСК обычно также характеризуетс  прогрессирующим снижением иммунности, Наконец, больные на ВРб-стадии подвержены любым инфекци м , т.е. речь идет о СПИДе в полном расцвете , когда 50% больных умирает в

течение 12 мес цев.

Описан направл емый HIV ингибитор- (ы) естественного 2 -5 А противовирусного защитного процесса. Сделанные открыти  относ тс  к новым диагностическим и/или

лечебным способам, направленным на разнообразные вирусные нарушени  (напр.: лишаи, инфекции ретровирусами и т.д.) и/или потенциально также на раковые заболевани ,

Индуцируема  интерфероном система

2-5А(2 -5 -алигоаденил ты)синтетаза-РНа- за L  вл етс  частью защитного механизма организма против вирусных инфекций. Отдельные элементы такой системы включают:

(|) зависимую от дзРНК 2-5А-синтетазу, (II) эндогенные 2-5А и (III) зависимую от 2-5А эндорибонуклеазу (РНазу L). Дефект в любом из перечисленных элементов системы 2-5А-синтетаза-РНаза L неизбежно приведет к полному или частичному упразднению противовирусного действи  системы.

В сыворотке или моно дерных клетках периферийной крови (МКПК) людей с некоторыми вирусными инфекци ми или подвергавшихс  лечению интерфероном обнаружена повышенни  концентраци  2- 5А-синтетазы. Индуцирование 2-5А-синте- тазы в МКПК, таким образом, видимо, может иметь потенциальное, хот  и ограниченное

значение дл  диагностики. Более того, повышенна  концентраци  2-5А-синтетазы в МКПК указывает на запущенное состо ние болезни при некоторых вирусных нарушени х , но и напротив  вл етс  признаком

эффективного лечени  интерфероном других вирусных инфекций. Интерферон был найден в сыворотке больных СПИДом, и тем не менее, устойчивое повышение уровн  2- 5А-синтетазы показано дл  больных на стадни перехода от РСК к СПИДу. Такие громадные лабораторно-клинические несоответстви  могут быть объ снены, если считать нефункцинальными другие элементы системы 2-5А-сйнтетаза-РНаза L Дл  того,

чтобы исследовать такую возможность, необходима характеристика синтетазы 2-5А in vivo и действи  РНазы L, о чем подробно говоритс  ниже.

Фиг.1 представл ет собой фотографию

результатов электрофореза на пластинке с полиакриламидным гелем, показывающими активацию РНазы L по действи м 2-5А, экстрагированных МКПК людей, страдающих СЗЛ, РСК и СПИДом, что, установлено в

испытании на расщепление рибосомной РНК.

Фиг.2 представл ет собой фотографию результатов электрофореза на пластинке с

олиакриламидным гелем, показывающих |активацию уровн  РНазы L в экстрактах VIКПК, что установлено в испытании по расцеплению рибосомной РНК.

Фиг.З представл ет собой фотографию результатов электрофореза на пластинке с юлиакриламидным гелем, показывающих юсстановление активности по расщеплению рибосомной РНК и МКПК.

Фиг.4  вл етс  диаграммой, иллюстрирующей систему 2 -5 -олигаденил т-РНа- la L

Открыто ингибирующее вещество, выдел ющеес  или понуждаемое к выделе- нию, клетками, инфицированными вирусами иммунодефицита человека. Этот И нгибитор, видимо, физически св зан с фер- |фентом РНазой L - конечным продуктом в системе 2 -5 -олигоаденил т-РНазы L и приводит к выходу из стро  всей иммунной системы, что позвол ет вирусам бесконт- рольно мультиплицироватьс . Описаны ме- Т1эдики идентификации таких ингибиторов л|1бо непосредственно, либо косвенно по отсутствию РНазы неактивности РНазы L, либо по присутствию промежуточных биохимических веществ в системе 2-5- Р Чаза L, при этом ингибитор(ы) служит мар- MipOM дл  обнаружени  присутстви  HIV или родственных вирусов, дающих по существу аналогичную клиническую картину.

Также обсуждаетс  прогнозирующее значение такого маркера с точки зрени  ргзвити  СПИДа в полном расцвете у боль- них, в частности, больных, имеющих антитепа к HIV в периферийной крови и ткан х, втом числе, крови, фракци х крови, клетках трансплантированных органов и клеточных экстрактах, Описаны способы активации РНазы L или дезактивации ингибирующего РНазу L вещества. Частью насто щего изобретени   вл ютс  лечебные методы борьбы со СПИДом и родственными вирусами и ко нтрол  развити  таких вирусов путем ак- тинации РНазы L и/или удалени  или дезак- типации ингибирующего.РНазу L вещества (веществ), или направленного на ингибито

ры

вируса. В насто щее изобретение включеНы способы получени  антител к указанным вирусам как in vivo так и in vitro с использованием в качестве антигена спе- 55 циничного ингибитора РНазы L или направл 

мых

вирусом

биС химических

промежуточных системе 2 -5А -РНаза L.

ингибиторов веществ в

5

0

5

0 5 0

5

0

5

0

5

В экстрактах моно дерных клеток периферийной крови (МКПК) людей с синдромом заболевани , лимфатических узлов (СЗЛ), родственным СПИДу комплексом (РСК) и синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) замерены компоненты системы 2-5А-синтетаза-РНаза L. Как показано, уровень 2-5А-синтетазы в высшей степени завышен у больных СПИДом и находитс  на базальном уровне у больных РСКом или СЗЛом. Однако вне зависимости от колебаний колнцентраций 2-5А-синтетазы (2-5А) высокие эндогенные концентрации 2-5А(до 35 нм) обнаружены у больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. Экстракты 2-5А на деле оказались функциональными, о чем свидетельствуют испытани  на св зывание, расщепление рибосомной РНК и испытание с  дро-целлюлозой. Несмотр  на повышенные концентрации эндогенной функциональной 2-5А, ни дл  одного из больных СЗЛом, РСКом или СПИДом не могла быть показана активированна  РНаза L. Однако у всех здоровых людей РНаза LB МКПК была активирована, даже несмотр  на то, что концентрации эндогенной 2-5А составл ли менее 5 нМ. Опыты со смешиванием свидетельствуют о присутствии ингибитора РНазы L у п ти больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. Такой ингибитор может переноситьс  и может преп тствовать индуцируемому 2-5А специфичному дл  РНазы L разрушению рРН К в экстрактах клеток 1929. Один из таких ингибиторов РНазы L осаждаетс  трихлоруксусной кислотой ) и этанолом. Ингибирование действи  РНазы L снимаетс  обработкой РНазой А или про- теазой. Мои исследовани  предполагают, что в МКПК больных СЗЛом, РСКом или СПИДом эндогенна  дзРНК активирует 2- 5А-синтетазу, что приводит к увеличению концентрации эндогенных 2-5А. Способности функциональных 2-5А активировать РНазу L преп тствует индуцируемой HIV ингибитор РНазы L в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом.

Хочу отметить здесь, что определение концентрации 2-5А и функционировани  РНазы L в экстрактах МКПК использованием специфических и чувствительных определений показывает то, что дефект противовирусной системы 2-5А-синтетаза- РНаза L в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом заключаетс  в присутствии ингибитора РНазы L но не в синтезе нефункциональных 2-5А. Приводимые здесь данные подчеркивают, что кажущиес  парадоксальными взаимодействи  происход щие в инфицированной вирусом клетке могут быть

теперь объ снены рациональными согласованными биохимическими пон ти ми,

Св занную с акриловыми шариками (1 мг) РНазу А или св занную с карбоксиме- тилцеллюлозой (1 мг) (Sigma Chemical Co, вымачивают в NP40 лизисном буфере (16) (10 мкл) 2 ч при 30°С, после чего смешивают с экстрактом МКПК (100 мкг на испытание) до окончательного объема 15 мкл и дополнительно инкубируют 2 ч при 30°С. Во врем  повторного инкубировани  содержимое пробирок осторожно несколько раз перемешивают . Контрольные образцы инкубируют без вс кого добавлени  фермента. Иммобилизованные ферменты таблетируют центрифугированием (10000 х 0,5 мин, комнатна  температура). П ть микролитров центрифугированных фракций добавл ют к экстрактам клеток L929 (150 мкг белка на испытание) и провод т испытани  по расщеплению рРНК дл  определени  специфичной дл  РНазы L активности.

Выделенные из экстрактов МКПК эндогенные 2-5А далее характеризуют проведением испытаний по расщеплению рРНК, Образованные при расщеплении РНазой L продукты с выделенными из МКПК2-5А значительно отличаютс  в экстрактах клеток 1929 от продуктов, полученных с аутентичными 2-5А (фиг.1, сравнить полосы 3, 5, 7 и 9 с полосой 10). Например, эндогенные 2- 5А, выделенные из МКПК, активирует РНазу L из клеток L929 с расщеплением 28S и 18S рРНК и образованием трех специфических продуктов расщеплени  (фиг.1, полоса 10). Объ снение наблюдаемых различий в продуктах расщеплени  может заключатьс  в том, что эндогенные 2-5А, синтезируемые в МКПК, отличаютс  от аутентичных 2-5А.

Дл  вы влени  уровн  свободной (не- 2-5А-активированной) РНазы L,  вл ющейс , как в насто щее врем  установлено, целевым ферментом дл  2-5А, использовано испытание с радисв зыванием.Могут быть также использованы и другие целевые ферменты, которые равно уместны в моем открытии. В экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом уровень свободной РНазы L в 5-7 раз выше, чем у здоровых людей (табл.1, столбец 4). Однако испытание на радиосв зывание имеет ограниченное значение дл  образцов, в которых эндогенные 2-5А контактируют с (РзА4/32Р/рСр за св зывание с РНазой L. Соответственно, результаты испытаний по радиосв зыванию точно не отражают уровень РНазы L. Таким образом, существенно определение уровн  2-А-активированной РНазы L. Дл  достижени  этого мною использован новый чувствительный метод,

описанный ниже, позвол ющий определ ть активированную РНазу L в экстрактах МКПК, выделенных всего лишь из одного миллилитра периферийной крови, и этот метод основан на специфичности расщеплени  2-5А-активированной РНазы на рРНК. Вследствие того, что рРН К присутствует в МКПК ниже уровн  детектировани , экстракты клеток HL929 (субклон штамма кле0 ток L929 с дефицитом РНазы L) используют в качестве источника рРНК, Клетки HL929 депозитированы в Американской Коллекции типовых культур (Роквиль, шт. Мэриленд, США) под регистрационным но5 мером согласно Будапештскому Соглашению . Использованием этого испытани  мне удалось показать, что РНаза L неактивна в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом (фиг.2, полосы 2-6), где имеет мес0 то высокое внутриклеточное аккумулирование функциональных 2-5А. Экстракты МКПК от всех здоровых людей, подвергшихс  испытанию, показали присутствие активной РНазы L дающей специфичные

5 продукты расщеплени  (фиг.2, полоса 7), несмотр  на то, что 2-5А присутствует в концентрации 5 нМ (таблица, столбец 2),

Мои наблюдени  того, что в экстрактах МКПК, инфицированных СЗЛом, РСКом и

0 СПИДом больных, присутствуют биологически активные 2-5А, подн ли вопрос - почему же неактивна РНаза L. Дл  определени  того, что  вл етс  ли отсутствие активности РНазы Цчто очевидно из фиг.2, полосы 2-6)

5 следствием нефункциональности РНазы L или следствием присутстви  ингибитора активности РНазы L проведены следующие опыты со смешиванием. Экстракты клеток L929, содержащие фукциональную РНазу,

0 смешивают и совместно инкубируют с экстрактами МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. Специфичных продуктов расщеплени  дл  РНазы L не обнаруживаетс  (фиг.1, полосы 3, 5 и 7).

5Важно подчеркнуть, что эндогенные 25А , ответственные за активацию РНазы L (фиг.1, полосы 3, 5 и 7), дают по меньшей мере четырехкратное разбавление относительно клеточных экстрактов, из которых

0 эти образцы происход т (фиг,1, полосы 2, 4 и 6). Эти данные указывают на присутствие нерастворимого в ТХК ингибитора (ингибиторов ) РНазы L в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. Такой ингибитор не об5 наружен у здоровых людей, поскольку их экстракты МКПК генерируют специфичные дл  РНазы L продукты расщеплени  после совместного инкубировани  с экстрактами клеток L929 (фиг.1, полоса 9). Присутствие функциональных 2-5А и тот факт, что предполагаемый ингибитор РНазы L осаждаетс  ТСК и этанолом, наводит на мысль о том, что ингибитор РНазы L не  вл етс  аналогом 5А, как недавно идентифицировалось в сточных культурах, инфицированных HJSV-I и ретровирусом.

Мои опыты с использованием разруша- ю|щих ферментов, иммобилизованных на ;ердых носител х, дают совершенно новое представление о природе ингибитора (инги- 1торов) РНазы L, найденных в экстрактах КПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом. :ли экстракты МКПК больных СПИДом едварительно инкубируют с иммобилизо- нной протеазой или РНазой А и затем вместно инкубируют с экстрактами кле- к L929, активность РНазы L восстанавли- втс , о чем свидетельствует по вление специфичных продуктов расщеплени  (фиг.З, сравнить полосы 1 и 2 с полосой 3).

Мои насто щие исследовани  показывают , что дефект в противовирусной систе- мф2-5А-синтетаза-РНаза LB МКПК больных , РСКом и СПИДом может быть отне- сен за счет ингибитора РНазы L, а не за счет отсутстви  функциональных 2-5А. Ингиби- трр РНазы L присутствует в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом, чтр указывает на возможность существовани  ингибитора на всех стади х развити  ти пичных ретровирусных заболеваний и что этот ингибитор также имеет отношение к различным субострым (хроническим вирус- нь м) патогенным инфекци м. С учетом моего предыдущего сообщени  о том, что во возх случа х МКПК больных СЗЛом, РСКом ил i СПИДом, подвергшихс  испытанию, соде эжит РНК НIV(определено молекул рной ридизацией) и центры инфицировани 

ГИ1

HI ни

гифитор РНазы L индуцируетс  вирусом. Открыти , о которых сообщаетс  здесь,

У) определено совместным культивирова- :м лимфоцитов), вполне веро тно, что инпр

здполагает, что репликаци  вируса модифидирует систему 2-5А-синтетаза-РНаза L та):им образом, что естественное противовирусное состо ние не может быть в полной мере экспрессировано или отрегулировано. Впэлне веро тно, что белок-(и) и РНК-(ы), закодированный HIV или другим сосущест- вующим с ним ретровирусом, может ингиби- РОЕОТЬ активацию РНазы L.

Пример. Моно дерные клетки периферийной крови(МКПК) выдел ют на Ficoll- Hypague, клетки L929 и HL929 (субклон 1929 с дефицитом РНазы L) получают в культуре с монослоем, цитоплазматические экстракты клеток L929 и HL929 получают в глицери- НОЕОМ буфере, экстракты МКПК получают в NP40 лизионом буфере, все это согласно

известным методикам. Концентраци  белка в экстрактах в интервале 1-15 мкг/мкл.

Активность 2-5А-синтетазы определ ют в выделенных экстрактах МКПК (50 мкг на испытание) использованием поли (1) -по- ли(С)-агарозы. 2-5А выдел ют из растворимых в ТХК фракций экстрактов МКПК после нейтрализации фреоном-три-н-октилами- ном. Экстрагированные ТХК 2-5А затем ли- офилизуют и вновь раствор ют в воде таким образом, что все образцы стандартизованы в объеме воды до эквивалента в 5 мкг белка на мкл. Концентрации 2-5А, присутствующих в экстрактах МКПК, измер ют в испытании на радиосв зывание с экстрактами клеток L929 в качестве источника РНазы L. Из 18900 dpm рзА4/32р/рСр (удельна  активность 3000 Ci/ммоль). Amersham добавленных на одно испытание, 9400 dpm св зываютс  с РНазой в отсутствие 2-5А. Примерно 9-14% рзАд/32 Р/рСр замещаетс  в испытани х, в которых добавл ют 5 мкл выделенных образцов 2-5А. Концентрацию 2-5А в МКПК определ ют сравнением с калибровочной кривой дл  аутентичных 2-5А. и это определение основано на подсчете концентрации цитоплазмического белка в 25 мкг/мл. Концентрацию 2-5А, выделенных из МКПК, также измер ют в испытании с  дро-целлюлозой с клетками L929 в качестве источника РНазы L. Активаци  РНазы L в таком испытании основано на превращении поли /V/ р/рСр в растворимые в кислоте фрагменты. Примерно 5-20% всего количества поли /V/ p/pCp(1500dpm) расщепл етс  в присутствии 2,5 мкл выделенных образцов 2-5А. Концентрации определ ют по калибровочным кривым дл  аутентичных 2-5А (см. выше). Уровень свободной РНазы L измер ют испытании на радиосв зывание после добавлени  20000 dpm РзА4/32 Р/рСр к экстрактам МКПК (50 мкг белка на испытание). Полученные результаты приведены в таблице.

Активность индуцированного интерфероном фермента (2-5А-синтетазы) в экстрактах МКПК. полученных от больных СЗЛом, РСКом, и СПИДом, измер ют in vitro и сравнивают с активностью экстрактов от здоровых людей, как показано в вышеприведенной таблице. Концентраци  2-5А-синтетазы у больных СПИДом (3 и 5) были в 16 и 20 раз выше чем у нормальных пациентов (таблица,столбец 1). И напротив, концентраци  2-5А-синтетазы у больных СЗЛом ( 1), РСКом ( 2) и СПИДом с саркомой Капози (СК)(4) выше всего лишь в 1.3-5 раз, что подтверждает сделанные другими основные наблюдени .

Дл  определени  того,  вл ютс  ли такие измерени  in vitro 2-5А-синтетазы указанием на функциональность фермента in vivo из МКПК экстрагируют 2-5А. Биологическую активность 2-5А из растворимых в ТХК фракций экстрактов МКГЖ усиленно характеризуют в испытани х на радиосв зывание и испытани х с  дроцеллюлозой. Концентрации 2-5А аналогичны при испытании двум  методами (таблица, столбцы 2 и 3). Сходимость результатов, полученных методами А и В (таблица, столбцы 2 и 3), указывает на то, что 2-5А, выделенные из экстрактов МКПК человека, могут св зыватьс  и активировать РНазу L из клеток L929 в той же степени, что и аутентичные 2-5А.

Видимое отсутствие количественной коррел ции между уровн ми 2-5А-синтета- зы и эндогенными 2-5А при СЗЛ, РСК и СПИД (таблица, сравнить столбец 1 со столбцами 2 и 3) может быть впервые объ снено следующим образом. Определение 2-5А- синтетазы в испытани х in vitro основано на частичной очистке через поли (rl) -поли (гС)- агарозу, соответственно, в таком испытании измер ют только свободную 2-5А-синтета- зу, а не 2-5А-синтетазу, активированную in. vivo с помощью дзРНК. Однако, непосредственно измер ют эндогенную 2-5А-синте- тазу плюс деградируемые 2-5А-ферменты (напр.2 - фосфодиэстераза и фосфатазы). Таким образом, аккумулирование 2-5А в МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом указывает на низкую активность деградиру- емых 2-5А-ферментов. Присутствие 2-5А в МКПК также указывает на то, что существует эндогенна  дзРНК, до сего времени не обнаруживаема  как у здоровых людей, так и у больных. СПИДом.

Неспаренна  двунитева  РНК  вл етс  известной формой макромолекул рной РНК, в которой дестабилизаци  двойной спирали преп тствует спариванию оснований . Неспаренна  дзРНК хорошо известна за ее способность индуцировать интерферон , что указывает на механизм, несв занный сам по себе с индуцированием интерферона.

Типичное лечебное воплощение неспаренной двунитевой РНК  вл етс  синтетическа  дзРНК, образованна  комплексом полирибоинизиновой и полирибоцитидило- вой) урациловой кислоты, такой как rln г(Сх, V или G)n где х принимает значени  от 4 до 29, напр., rln (Ci2 V/n далее называема  АМПЛИГЕН Исследованы многие полимерные неспаренные дзРНК, ведущие себ  аналогично Амплигену. Ключевое лечебное преимущество неспаренной

дзРНК перед другими формами природных и/или синтетических дзРНК заключаетс  в их пониженной токсичности по отношению к человеку и животным. Например, Lampson

и др. описывают первичные комплексы дзРНК, способные запускать в действие различные, св занные с интерфероном эффекты , однако токсичность подобных соединений исключает их использование дл 

0 лечени  рака или родственных нарушений. Неспаренна  дзРНК, как теперь известно , обладает лечебной активностью против определенных опухолей человека, в частности , против рака почки. Хот  в насто щее

5 врем  существует представление о дзРНК как о чисто индукторе интерферона, тем не менее дзРНК активны по отношению к определенным опухол м человека, которые вполне устойчивы к интерферону, что в пол0 ной мере отражено в за вке на Европейский патент № 83305426.5, автором которой  вл етс  создатель насто щего изобретени .

В.другой за вке на патент, котора  подана 26 августа 1986 под заглавием Модул 5 ции св занных с вирусом случаев с помощью двунитевых дзРНК изобретатель описывает ингибирование вируса СПИДа в культуре клеток человека использованием Амплигена в качестве протипной дзРНК.

0 Под неспаренными дзРНК имеютс  в виду такие дзРНК, в которых водородные св зи (укладка оснований) между противосто щими нит ми остаютс  сравнительно интактными, т.е. прерываютс  менее, чем

5 одной парой оснований на каждые 29 последовательных остатков оснований. Термин неспаренна  дзРНК следует понимать соответственно .

ДзРНК может представл ть собой ком0 плекс полиинозината и полицитидилата с определенным отношением урациловых оснований или гуанидиновых оснований, напр., от 1 в 5 до 1 в 30 таких оснований (поли I. поли(СА-29 х V или G).

5 ДзРНК могут отвечать общей формуле rln./CiaV/n. Другие приемлемые примеры дзРН К обсуждаютс  ниже.

Неспаренные дзРНК, рекомендуемые дл  использовани  в насто щем изобрете0 нии, основаны на сополинуклеотидах, выбранных среди пол  (Cn,V) и поли(Сп, G), где п означает цифровой показатель со значением от 4 до 29, и  вл ющиес  неспаренными аналогами комплексов

5 полирибоинозиновой и полирибоцити- диловой кислот, образованных модифицированием rln, rCn с введением неспаренных оснований (урацила или гуани- дина) вдоль нити полирибоцидилата (rCn). Или же дзРНК может происходить из по/1и (1), поли(С) дзРНК модифицированием ри- Еозильного скелета полирибоинозиновой кислоты (rln), напр., включением 2 -0-ме- тилрибозильных остатков. Такие неспарен- t-ые аналоги rln.rCn, из которых предпочтительны те, которые отвечают общей формуле rln. (Ci2, V), описаны Carter и Ts o в патентах США № 4130641 и 4024222, описани  которых даютс  здесь в качестве ссылок. Описанные в указанных патентах дзРНК, как правило, приемлемы дл  использовани  согласно насто щему изобретению .

Сцепифичные примеры неспаренных дзРНК дл  применени  в изобретении включают:

поли(1). поли(С4,У)

поли(1). поли(С7,У)

поли(1), поли(С13,У)

поли(1). поли(С22,/)

поли(1), поли(С20,С)

ПОЛИ(1), ПОЛИ(С29,6) И

поли(1). поли(Ср/23 G р.

Фармацевтические композиции в соот- в тствии с насто щим изобретением вклю- чгиот композиции, предназначенные дл  парентерального введени  в приемлемом фармацевтическом носителе. Так могут быть приготовлены парентеральные растворы , суспензии и дисперсии так, как это требуетс  согласно известным фармаколо- г ческим методам в стерильной или несо- доржащей пирогенов воде в качестве растворител /разбавител , возможно так- жо с физиологически приемлемыми сол ми.

0

5

0

5

0

5

Количество вводимой неспаренной дзРНК предпочтительно достаточно дл  достижени  пиковой концентрации в крови от 0,01 микрограмма на миллилитр концентрации дзРНК во всей жидкости организма до 1000 микрограмм на миллилитр в систематической системе кровообращени  сразу же после введени  в точке, удаленной огместа вливани .

Или же эффективное количество может быть добавлено к кров ному продукту непосредственно перед инъекцией реципиенту . В таких случа х врач может просто сослатьс  на стандартную таблицу дл  объемов жидкости в организме, в которой привод тс  соотношени  между весом реципиента и его или ее объемом жидкости, в сумме должно быть объем жидкости организма пациента плюс объем жидкости, приводимой в равновесие с необходимым количеством дзРНК. Пациент весом шесть- дес т-семдес т килограмм имеет в организме жидкость объемом примерно п ть-шесть литров.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ вы влени  вируса человеческого иммунодефицита у животного и человека, включающий отбор крови с последующей ее обработкой, анализом и вынесением суждени , отличающийс  тем, что обработку крови провод т на наличие 2-5А- синтетазы и при ее обнаружении суд т о наличии вируса человеческого иммунодефицита .

   Активность 2-5А-синтетазы, концентраци  эндогенных 2-5А, уровень свободной РНазы L присутствие ингибитора РНазы L в экстрактах МКПК больных СЗЛом, РСКом и СПИДом

   a стандартное отклонение 9%

   определено в испытании по радиосв зывании /дублировано/

   6 определено в испытании с  дро-целлюлозой /дублировано/, стандартное отклонение 1 % г определено в испытании по радиосв зыванию /дублировано/, стандартное отклонение 1 % А определено в испытании по расщеплению рРНК.см. также фиг.1 е в среднем дл  7 контрольных образцов /дублировано/ ЖНО-не определ лось

   28 С18СПродолжение таблицы

   НОРМА & 9 10

   cpue.f

   JC3/7 РСК спид KQHtnpo/ib

   8

   28С18СФиг .г

   (.3

   IrnaduzA

   I

   HHwlepn Стимумт Шиметиды

   Стадий В

   Фцг.1+

   Стади  В

   tmadt/  С

   Катализ

   РНазаЬ

   i