DE60006495T2

DE60006495T2 - Pharmazeutische kombination von antiviralen wirkstoffen

Info

Publication number: DE60006495T2
Application number: DE60006495T
Authority: DE
Inventors: Robert Rando; Zhengxian Gu
Original assignee: Shire BioChem Inc
Current assignee: Shire Canada Inc
Priority date: 1999-03-01
Filing date: 2000-03-01
Publication date: 2004-04-15
Anticipated expiration: 2020-03-02
Also published as: DE60006495D1; JP2002538171A; AU771196B2; US6511983B1; EP1159005B1; WO2000051641A1; US20030045534A1; EP1159005A1; AU2899000A; ATE253938T1; ES2208281T3; US6887879B2; CA2363982A1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft pharmazeutische Kombinationen, die als antivirale Mittel geeignet sind. Im Besonderen betreffen die Kombinationen der Erfindung Dioxolannukleoside mit mindestens einem weiteren therapeutischen Mittel, ausgewählt aus Nukleosidanaloga oder NNRTIs.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
In den Vereinigten Staaten treten pro Jahr mehr als 12 Millionen neue Fälle sexuell übertragener Krankheiten (STDs) auf. Unter den 10 wichtigsten Krankheiten in den Vereinigten Staaten, von denen berichtet werden kann, sind fünf STDs, einschließlich Chlamydia, Gonorrhoe, Syphilis, das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) und Hepatits B-Virus (HBV)-Infektion, unter welchen AIDS- und HBV-Infektion nicht heilbar sind.
Im Falle von AIDS sagt die Weltgesundheitsorganisation voraus, dass im Jahr 2000 weltweit 40 Millionen Menschen mit dem Human-Immunschwächevirus (HIV), dem Virus, das (AIDS) bewirkt, infiziert sein werden. Hepatits-Infektionen betreffen fünfmal mehr Menschen als HIV. Von der Weltgesundheitsorganisation ist berichtet worden, dass derzeit 2000 Millionen lebende Menschen mit dem HBV-Virus infiziert sind, von welchen 350 Millionen chronisch infiziert sind und daher die Gefahr besteht, dass sie an einer Leberkrankheit sterben.
Wenngleich die Sterblichkeitsraten von AIDS aufgrund neuer Therapien sinken, bleibt AIDS die zweite Haupttodesursache Erwachsener im Alter zwischen 29 und 40 Jahren. Die Standardversorgung ist derzeit Kombinations-Anti-HIV- Therapie für Menschen mit HIV. Es gibt derzeit elf Anti-HIV-Arzneimittel, die auf Rezept erhältlich sind. Diese Anti-HIV-Mittel fallen in drei Kategorien: Nukleosidanaloga, welche Zidovudine, Didanosine, Zalcitabine, Stavudine und Lamivudine umfassen; Proteaseinhibitoren, welche Indinavir, Nelfinavir, Squinavir und Ritonavir umfassen und Nicht-nucleosidische reverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI), welche Nevirapine, Delavirdine und Efavirenz umfassen. Verglichen mit HIV gibt es derzeit nur zwei lizensierte Therapien für chronische Hepatits B-Virusinfektion, welche Interferon und Lamivudine sind. Andere Arzneimittel sind derzeit in klinischen Studien, einschließlich Lamivudine, Famciclovir, Lobucavir und Adefovir. Jedoch viele Studien haben gezeigt, dass die meisten Patienten nach Abschluss der Therapie einen Rückfall erleiden und Resistenz gegenüber den Arzneimitteln entwickeln.
Die Entwicklung von Resistenz ist in jüngerer Zeit ein Hauptproblem bei der Behandlung von HIV- und HBV-Infektionen geworden. Resistenz tritt üblicherweise auf, wenn die verwendeten Arzneimittel nicht potent genug sind, um Virusreplikation vollständig zu stoppen. Wenn das Virus trotz der Gegenwart von Arzneimitteln reproduzieren kann, hat es die Möglichkeit Veränderungen in seiner Struktur vorzunehmen, die als Mutationen bezeichnet werden, bis es eine findet, die es ihm erlaubt trotz der Arzneimittel zu reproduzieren. Wenn einmal eine Mutation auftritt, wächst es dann unkontrolliert und ist dann bald der dominante Stamm des Virus in dem Individuum. Das Arzneimittel wird zunehmend schwächer gegen den neuen Stamm. Zunehmend wird auch Kreuzresistenz an Bedeutung gewinnen. Kreuzresistenz tritt auf, wenn Mutationen, die Resistenz gegenüber einem Arzneimittel bewirken, auch Resistenz gegenüber einem anderen bewirken. Mehrere Untersuchungen haben bewiesen, dass das Kombinieren von zwei Arzneimitteln die Entwicklung von Resistenz gegenüber einem oder beiden Arzneimitteln, verglichen mit dem Fall, dass nur ein Arzneimittel alleine verwendet wird, verzögert. Andere Studien legen nahe, dass Kombinationen aus drei Arzneimitteln diesen Vorteil sogar noch erhöhen. Als ein Ergebnis nehmen viele Menschen an, dass der beste Weg zum Verhindern oder zumindest verzögern von Resistenz die Verwendung von Multiarzneimittelkombinationstherapien ist. Jedoch mit der Zunahme der Anzahl von Arzneimitteln steigt das Risiko oder steigen Arzneimittelwechselwirkungen und Toxizität an.
(–)-β-D-2,6-Diaminopurindioxolan (DAPD) und (–)-β-D-1,3-Dioxolanguanin (DXG) sind als hochwirksam beschrieben worden gegen HIV-1 in verschiedenen Zellsystemen, dass sie minimale Kreuzresistenz mit Lamivudine und geringe Zelltoxizität aufweisen (Kim et al., J. Med. Chem., 1993, 36, 30–37) oder Siddiqui et al., Bioorg. Med. Chem., Lett. 3; 1543–1546). Kombinationen von DAPD und DXG mit anderen therapeutischen Mitteln, die potente therapeutische Wirksamkeit gegen HIV und HBV zeigen, würden bedeutend bei der Entwicklung einer neuen Kombinationstherapie gegen HIV und HBV helfen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liefert eine neue pharmazeutische Kombination, die geeignet ist zur Behandlung von viralen Infektionen, umfassend mindestens ein (–)-β-D-2,6-Diaminopurin-1,3-dioxolan (β-D-DAPD) und (–)-β-D-1,3-dioxolanguanin (β-D-DXG) und mindestens ein weiteres therapeutisches Mittel, ausgewählt aus Zidovudine, Lamivudine, Nevirapine und Kombinationen davon.
Die pharmazeutischen Kombinationen der vorliegenden Erfindung sind geeignet für eine Therapie, insbesondere als antivirale Mittel.
In einer anderen Hinsicht wird eine pharmazeutische Formulierung bereitgestellt, umfassend die beanspruchte Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsmittel.
In einer weiteren Hinsicht ist die Erfindung die Verwendung der beanspruchten Kombination zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung viraler Infektionen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die Dosis-Wirkung-Kurve der HIV-1-Replikation-Inhibierung. MT-2-Zellen wurden mit HIV-1IIIB mit einem MOI von 0,005 infiziert. Die infizierten Zellen wurden in der Gegenwart verschiedener Konzentrationen antiviraler Verbindung kultiviert, wie in dieser Figur gezeigt. Virale Suszeptibilität gegenüber den Verbindungen wurde durch Messung der HIV-1 RT-Aktivität in den Kulturüberständen untersucht, wie in den Methoden beschrieben. Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichungen für mindestens fünf verschiedene Versuche angegeben, wobei jeder zweifach durchgeführt wurde.
2 zeigt den Vergleich der Kettenterminationswirkung von DXG-TP mit anderen Dideoxynukleotidtriphosphaten und NNRTI auf reverse Transkription. Die Banden an dem oberen Ende des Gels waren Volllängen-cDNA-Produkte in diesem Assay. Die ausgefüllten Pfeile zeigen Beispiele von Kettenterminationsbanden, die durch jeden der Dideoxynukleotidinhibitoren erzeugt werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die pharmazeutische Kombination der vorliegenden Erfindung umfasst eine Verbindung der Formel (1a) und (1b):
X ist ausgewählt aus H, und mindestens ein weiteres therapeutisches Mittel, ausgewählt aus Lamivudine, Zidovudine, Nevirapine und Kombinationen davon.
Der Fachmann in der Technik wird erkennen, dass die Verbindungen der Formel (1a) und (1b) mindestens zwei chirale Zentren enthalten, welche durch ein Sternchen (*) in der allgemeinen Formel (1a) markiert sind. Die Verbindungen der Formel (1a) liegen daher in der Form von zwei verschiedenen optischen Isomeren vor (d.h. (+)- oder (–)-Enantiomere oder β-L und β-D). Alle derartigen Enantiomere und Gemische davon, einschließlich racemischer Gemische sind im Bereich der Erfindung enthalten. Das einzelne optische Isomere oder Enantiomer kann durch ein in der Technik allgemein bekanntes Verfahren erhalten werden, wie etwa durch chirale HPLC, enzymatische Aufspaltung und chirale Hilfsmittel.
Die pharmazeutische Kombination der vorliegenden Erfindung umfasst eine der folgenden Verbindungen: Verbindung A (–)-β-D-2,6-Diaminopurin-1,3-dioxolan (DAPD)
Verbindung B (–)-β-D-1,3-Dioxolanguanin (DXG)
und mindestens ein weiteres therapeutisches Mittel, ausgewählt aus Zidovudine, Lamivudine, Nevirapine und Kombinationen davon.
In einer Ausführungsform werden die Verbindungen der Formel (1a) und (1b), die in der pharmazeutischen Kombination der vorliegenden Erfindung vorliegen, in der Form eines einzelnen Enantiomers bereitgestellt, zumindest 95%, bevorzugter mindestens 97% und am bevorzugtesten mindestens 99% frei von dem entsprechenden Enantiomer.
In einer Ausführungsform sind die Verbindungen der Formel (1a) und/oder (1b), die in der pharmazeutischen Kombination der vorliegenden Erfindung vorliegen, in der Form des (+)-Enantiomers zu mindestens 95% frei von dem entsprechenden (–)-Enantiomer.
In einer Ausführungsform sind die Verbindungen der Formel (1a) und/oder (1b), die in der pharmazeutischen Kombination der vorliegenden Erfindung vorliegen, in der Form des (+)-Enantiomers zu mindestens 97% frei von dem entsprechenden (–)-Enantiomer.
In einer Ausführungsform sind die Verbindungen der Formel (1a) und/oder (1b), die in der pharmazeutischen Kombination der vorliegenden Erfindung vorliegen, in der Form des (+)-Enantiomers zu mindestens 99% frei von dem entsprechenden (–)-Enantiomer.
In einer weiteren Ausführungsform sind die Verbindungen der Formel (1a) und/oder (1b), die in der pharmazeutischen Kombination der vorliegenden Erfindung vorliegen, in der Form des (–)-Enantiomers mindestens 95% frei von dem entsprechenden (+)-Enantiomer.
In einer Ausführungsform sind die Verbindungen der Formel (1a) und/oder (1b), die in der pharmazeutischen Kombination der vorliegenden Erfindung vorliegen, in der Form des (–)-Enantiomers mindestens 97% frei von dem entsprechenden (+)-Enantiomer.
In einer Ausführungsform sind die Verbindungen der Formel (1a) und/oder (1b), die in der pharmazeutischen Kombination der vorliegenden Erfindung vorliegen, in der Form des (–)-Enantiomers mindestens 99% frei von dem entsprechenden (+)-Enantiomer.
In einer Ausführungsform ist die pharmazeutische Kombination der vorliegenden Erfindung eine synergistische Kombination therapeutischer Mittel, umfassend Verbindung A oder Verbindung B und mindestens ein zusätzliches therapeutisches Mittel, ausgewählt aus Zidovudine, Lamivudine und Nevirapine.
Es werden auch pharmazeutisch verträgliche Salze der Verbindungen der Formel (1a) und/oder (1b), die in der pharmazeutischen Kombination der vorliegenden Erfindung vorliegen, bereitgestellt. Der Ausdruck pharmazeutisch verträgliche Salze von Verbindungen der allgemeinen Formel (1a) und (1b) bedeutet diejenigen, welche von pharmazeutisch verträglichen anorganischen und organischen Säuren und Basen erhalten werden. Beispiele geeigneter Säuren umfassen Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Salpeter-, Perchlor-, Fumar-, Malein-, Phosphor-, Glycol-, Milch-, Salicyl-, Succin-, Toluol-p-sulfon-, Wein-, Essig-, Zitronen-, Methansulfon-, Ameisen-, Benzoe-, Malon-, Naphthalin-2-sulfon- und Benzolsulfonsäuren. Andere Säuren, wie etwa Oxalsäure, können, wenngleich sie an sich nicht pharmazeutisch verträglich sind, als Zwischenprodukte zum Erhalt der Verbindungen der vorliegenden Erfindung und ihrer pharmazeutisch verträglichen Säurezugabesalze geeignet sein.
Salze, die von geeigneten Basen stammen, umfassen Alkalimetall- (z.B. Natrium), Erdalkalimetall- (z.B. Magnesium), Ammonium- und NR₄ ⁺- (worin R C_1–4-Alkyl ist) Salze.
Hier nachfolgende Bezugnahmen auf die pharmazeutische Kombination gemäß der Erfindung umfassen Verbindungen der allgemeinen Formel (1a) und/oder (1b) und ihre pharmazeutisch verträglichen Salze.
Es wird zu erkennen sein, dass die Menge pharmazeutische Kombination gemäß der Erfindung, die erforderlich ist zur Verwendung bei der Behandlung nicht nur mit der speziellen ausgewählten Verbindung variiert, sondern auch mit der Verabreichungsroute, der Natur und dem Zustand, für welche die Behandlung erforderlich ist und dem Alter und dem Zustand des Patienten und sie wird letztendlich im Bereich der Entscheidung des behandelnden Arztes oder Veterinärmediziners sein. Im Allgemeinen jedoch wird eine geeignete Dosis im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 750 mg/kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 500 mg/kg/Tag, am bevorzugtesten im Bereich von 1 bis 300 mg/kg/Tag sein.
Die gewünschte Dosis kann herkömmlicherweise in einer Einzeldosis verabreicht werden oder als eine geteilte Dosis in geeigneten Intervallen, z.B. als zwei, drei, vier oder mehr Dosen pro Tag, verabreicht werden.
Die Verbindungen der Formel (1a) und (1b), die in der pharmazeutischen Kombination der vorliegenden Erfindung vorliegen, sind synergistisch mit den zusätzlichen therapeutischen Mitteln in der Kombination und/oder Beseitigen die cytotoxischen Wirkungen der anderen Komponenten.
Die pharmazeutische Kombination gemäß der vorliegenden Erfindung wird üblicherweise in Einheitsdosisform verabreicht; z.B. enthaltend 10 bis 1500 mg, üblicherweise 20 bis 1000 mg, am häufigsten 50 bis 300 mg aktiven Bestandteil pro Einheitsdosisform.
Idealerweise sollte der aktive Bestandteil verabreicht werden, um Plasmaspitzenkonzentrationen der aktiven von etwa 1 bis etwa 75 μM, vorzugsweise etwa 2 bis 50 μM, am bevorzugtesten etwa 3 bis etwa 30 μM zu erreichen. Dies kann z.B. erreicht werden durch die intravenöse Injektion einer 0,1 bis 5%-igen Lösung des aktiven Bestandteils, optional in Kochsalzlösung oder durch orale Verabreichung als ein Bolus, enthaltend etwa 1 bis etwa 500 mg des aktiven Bestandteils. Wünschenswerte Blutgehalte können aufrechterhalten werden durch eine kontinuierliche Infusion, um etwa 0,01 bis etwa 5,0 mg/kg/Stunde bereitzustellen, oder durch intermittierende Infusion, enthaltend 0,4 bis etwa 15 mg/kg des aktiven Bestandteils.
Die Kombinationen, auf welche oben Bezug genommen wird, können herkömmlicherweise zur Verwendung bereitgestellt werden in der Form einer pharmazeutischen Formulierung und derartige pharmazeutische Formulierungen, die eine oben definierte Kombination zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen, umfassen daher einen weiteren Aspekt der Erfindung.
Die einzelnen Komponenten derartiger Kombinationen können entweder schrittweise oder gleichzeitig in getrennten oder kombinierten pharmazeutischen Formulierungen verabreicht werden.
Wenn die Verbindung (1a) oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon in Kombination mit einem therapeutischen Mittel verwendet werden, das aktiv gegen das gleichen Virus ist, kann die Dosis jeder Verbindung entweder die gleiche sein oder verschieden sein von derjenigen, wenn die Verbindung alleine verwendet wird. Geeignete Dosen werden durch den Fachmann in der Technik leicht erkannt werden.
Die vorteilhaften Wirkungen der Kombination der Verbindungen der Formel (1a) und/oder (1b) und der zusätzlichen therapeutischen Mittel werden über ein weites Verhältnis realisiert. Zum Beispiel 1 : 250 bis 250 : 1.
In einer Ausführungsform ist das Verhältnis der Verbindungen in Formel (1a) und/oder (1b) zu den zusätzlichen therapeutischen Mitteln in der vorliegenden Erfindung zwischen 1 : 50 und 50 : 1.
In einer Ausführungsform ist das Verhältnis der Verbindungen in Formel (1a) und/oder (1b) zu den zusätzlichen therapeutischen Mitteln in unserer Erfindung zwischen 1 : 20 bis 20 : 1.
In einer weiteren Ausführungsform kann man von 1 : 1 bis 1 : 15 Verbindungen der Erfindung: zweites therapeutisches Mittel verwenden. In einer weiteren Ausführungsform kann man von 1 : 1 bis 1 : 10 Verbindungen der Erfindung: zweites therapeutisches Mittel verwenden. In einer weiteren Ausführungsform kann man von 1 : 1 bis 1 : 5 Verbindungen der Erfindung: zweites therapeutisches Mittel verwenden. In einer weiteren Ausführungsform kann man von 1 : 1 bis 1 : 3 Verbindungen der Erfindung: zweites therapeutisches Mittel verwenden. Wenn ein weiteres therapeutisches Mittel zugegeben wird, werden die Verhältnisse entsprechend eingestellt werden.
Obwohl es möglich ist, dass zur Verwendung bei der Therapie eine Verbindung der Erfindung als die unvermischte Chemikalie verabreicht wird, ist es bevorzugt, den aktiven Bestandteil als eine pharmazeutische Formulierung zu verabreichen. Die Erfindung liefert daher weiterhin eine pharmazeutische Formulierung, umfassend eine Verbindung der Formel (1a) und/oder (1b) oder ein pharmazeutisch verträgliches Derivat davon zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern hierfür und gegebenenfalls andere therapeutische und/oder prophylaktische Bestandteile. Der (die) Träger muss (müssen) in dem Sinne „verträglich" sein, dass sie kompatibel mit den anderen Bestandteilen der Formulierung sind und nicht nachteilig für den Rezipienten davon sind.
Pharmazeutische Formulierungen umfassen diejenigen, die geeignet sind zur oralen, rektalen, nasalen, topischen (einschließlich bukkal und sublingual), transdermalen, vaginalen oder parenteral (einschließlich intramuskulär, subkutan und intravenös) Verabreichung, oder in einer Form, die geeignet ist zur Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation. Die Formulierungen können, wenn es geeignet ist, üblicherweise in diskreten Dosiseinheiten verabreicht werden und können durch eines der in der Technik der Pharmazie allgemein bekannten Verfahren hergestellt werden. Alle Verfahren umfassen den Schritt, dass die aktive Verbindung mit flüssigen Trägern oder fein zerteilten festen Trägern oder beiden in Verbindung gebracht wird und dann, falls erforderlich, Formen des Produkts in die gewünschte Formulierung.
Eine pharmazeutische Formulierung, die zur oralen Verabreichung geeignet ist, kann herkömmlicherweise als diskrete Einheiten verabreicht werden, wie etwa als Arzneikapseln, Kapseln oder Tabletten, wobei jede eine vorbestimmte Menge des aktiven Bestandteils enthält; als ein Pulver oder Granalien, als eine Lösung, eine Suspension oder als eine Emulsion. Der aktive Bestandteil kann auch verabreicht werden als ein Bolus, Electuarium oder eine Paste. Tabletten und Kapseln zur oralen Verabreichung können herkömmliche Hilfsmittel enthalten, wie etwa Bindemittel, Füllmittel, Schmiermittel, Desintegrationsmittel oder Benetzungsmittel. Die Tabletten können entsprechend in der Technik allgemein bekannter Verfahren beschichtet werden. Flüssige Oralpräparationen können z.B. in der Form von wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen oder Elixieren sein oder können als ein Trockenprodukt zur Zubereitung mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor der Anwendung verabreicht werden. Derartige flüssige Präparationen können herkömmliche Additive enthalten, wie etwa Suspendiermittel, Emulgiermittel, nichtwässrige Vehikel (welche Speiseöle enthalten können) oder Konservierungsmittel.
Die pharmazeutische Kombination gemäß der Erfindung kann auch für parenterale Verabreichung (z.B. Injektion, z.B. Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion) formuliert werden und kann in Einheitsdosisform in Ampullen, vorgefüllten Spritzen, Kleinvolumeninfusions- oder in Multidosisbehältnissen mit einem zugegebenen Konservierungsmittel bereitgestellt werden. Die Zusammensetzungen können in solchen Formen sein, wie etwa Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln bzw. Trägern und können Formulierungsmittel enthalten, wie etwa Suspendier-, Stabilisierungs- und/oder Dispergiermittel. Alternativ kann der aktive Bestandteil in Pulvertorm sein, erhalten durch aseptische Isolierung von sterilem Feststoff oder durch Lyophilisierung aus Lösung, zur Zubereitung mit einem geeigneten Träger, wie etwa sterilem, pyrogenfreiem Wasser, vor Anwendung.
Zur topischen Verabreichung in die Epidermis kann die pharmazeutische Kombination gemäß der Erfindung als Salben, Cremes oder Lotionen oder als transdermales Pflaster formuliert werden. Derartige transdermale Pflaster können Penetrationsverstärkungsmittel enthalten, wie etwa Linalool, Carvacrol, Thymol, Citral, Menthol und t-Anethol. Salben und Cremes können z.B. mit einer wässrigen oder öligen Basis unter der Zugabe von geeigneten Verdickungs- und/oder Geliermitteln formuliert werden. Lotionen können mit einer wässrigen oder öligen Basis formuliert werden und werden im Allgemeinen eines oder mehrere Emulgiermittel, Stabilisierungsmittel, Dispergiermittel, Suspendiermittel, Verdickungsmittel oder Färbemittel enthalten.
Formulierungen, die zur topischen Verabreichung im Mund geeignet sind, umfassen Pastillen, umfassend aktive Bestandteile in einer aromatisierten Basis, üblicherweise Sucrose und Akazie oder Tragant; Pastillen, die den aktiven Bestandteil in einer inerten Basis, wie etwa Gelatine und Glycerin oder Sucrose und Akazie, umfassen; und Mundwässer, umfassend den aktiven Bestandteil in einem geeigneten flüssigen Träger.
Pharmazeutische Formulierungen, die geeignet zur rektalen Verabreichung sind, worin der Träger ein Feststoff ist, werden am bevorzugtesten als Einheitsdosissuppositorien bereitgestellt. Derartige Träger umfassen Kakaobutter und andere Materialien, die üblicherweise in der Technik verwendet werden und die Suppositorien können herkömmlicherweise gebildet werden durch Mischen der aktiven Verbindungen mit dem (den) weichgemachten oder geschmolzenen Träger(n), gefolgt durch ein Abkühlen und Formen in Formen.
Formulierungen, die zur vaginalen Verabreichung geeignet sind, können bereitgestellt werden als Pessarien, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprays, die zusätzlich zu dem aktiven Bestandteil solche Träger enthalten, die in der Technik als geeignet bekannt sind.
Für intranasalse Verabreichung kann die pharmazeutische Kombination gemäß der Erfindung als ein Flüssigspray oder dispergierbares Pulver oder in der Form von Tropfen verwendet werden. Tropfen können mit einer wässrigen oder nichtwässrigen Basis formuliert werden, ebenfalls umfassend ein weiteres Dispergiermittel, Solubilisiermittel oder Suspendiermittel. Flüssigsprays werden üblicherweise aus Druckverpackungen zugeführt.
Zur Verabreichung durch Inhalation wird die pharmazeutische Kombination gemäß der Erfindung üblicherweise aus einem Insufflator, Vernebler oder einem Druckbehältnis oder einem anderen geeigneten Mittel zum Zuführen eines Aerosolsprays zugeführt. Druckverpackungen können ein geeignetes Treibmittel umfassen, wie etwa Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas. Im Falle eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosismenge durch Vorsehen eines Ventils zum Zuführen einer abgemessenen Menge bestimmt werden.
Alternativ kann zur Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation die pharmazeutische Kombination gemäß der Erfindung die Form einer Trockenpulverzusammensetzung annehmen, z.B. ein Pulvergemisch der Verbindung und einer geeigneten Pulverbasis, wie etwa Lactose oder Stärke. Die Pulverzusammensetzung kann in Dosisform bereitgestellt werden. z.B. in Form von Kapseln oder Patronen oder z.B. Gelatine- oder Blisterverpackungen, aus welchen das Pulver verabreicht werden kann mit der Hilfe eines Inhalators oder Insufflators.
Wenn es gewünscht ist, können die oben beschriebenen Formulierungen, die angepasst sind, um eine Langzeitfreisetzung des aktven Bestandteils zu ergeben, verwendet werden.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen und sollen nicht als begrenzend für den Bereich betrachtet werden.
Die Verbindungen
Die Verbindung DXG, DAPD, DXG 5'-Triphosphat (DXG-TP), (+)-Enantiomer von -D-1'-3'-Dioxolanguanosin und Lamivudine wurden synthetisiert bei BioChem Pharma., wie früher beschrieben (Belleau et al., 1989, Design and activity of a novel class of nucleoside analogs effective against HIV-1. Internatl. Conference on AIDS, Montreal (Quebec), Canada, 4. bis 9. Juni; Siddiqui et al., 1993, Bioorg. Med. Chem. Lett. 3: 1543–1546). Alle Dioxolanylnukleoside waren enantiomerenrein.
Zellen und Viren
Mononukleare Zellen aus humanem Nabelblut (CBMCs) und mononukleare Zellen aus periphärem Blut (PBMCs) wurden von HIV-1-negativen und Hepatits B-Virus-negativen Donoren (Department of Obstetrics, Jewish General Hospital, Montreal) erhalten und wurden unter Verwendung der Ficoll-Hypaque (Pharmacia) Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Die CBMCs wurden dann unter Stimulierung mit 0,1% (V/V) (5 mg/ml) Phytohemagglutinin (PHA; Boehringer Mannheim, Montreal, Canada) in RPMI-1640-Medium (Gibco BRL Laboratories, Mississauga, Canada), enthaltend 10% fötales Kälberserum (Flow Laboratories, Toronto, Canada), 2 mM Glutamin, 100 U Penicillin, 100 mg Streptomycin und 15 U Interleukin 2 (IL-2, Boehringer Mannheim) pro ml, bei 37 °C und 5% CO₂ für 3 bis 4 Tage kultiviert bevor sie für Antivirenassays (Rooke et al., 1990, Virol. 176: 205–215) verwendet wurden.
T-Zelllinien, d.h. MT-2, MT-4, H9 und Jurkat, und eine Monocytenzelllinie, d.h. U937, wurden jeweils von NIH AIDS Research and Reference Reagents (MD) oder der ATCC erhalten. Die Zellen wurden für antivitale und Cytotoxizitätsstudien verwendet und als Suspensionskulturen in RPMI-1640-Medium gehalten, enthaltend 10% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin, 100 U Penicillin und 100 mg Streptomycin pro ml. Andere Tumorzelllinien, einschließlich Molt-4, HT-1080, DU145 und HepG2, erhalten von der ATCC, und eine normale Zelllinie (humane Hautfibroblasten, HSF), erhalten von Dr. M. Chrevette (McGill University, Montreal, Canada) wurden ebenfalls für Cytotoxizitätsassays verwendet und in RPMI-1640-Medium kultiviert.
Der HIV-1_IIIB-Laborstamm und die HXB2-D-Rekombinante von HIV-1 wurden freundlicherweise von R. C. Gallo (Institute of Human Virology, Baltimore, MD) zur Verfügung gestellt. Rekombinante mutierte HIV-1-Varianten wurden durch stellengerichtete Mutagenese hergestellt, wie früher beschrieben (Gu et al., 1992, J. Virol. 66: 12–19 und Gu et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother. 38: 275–281). Die rekombinanten Viren wurden erzeugt durch Transfektion proviraler DNA in MT-4-Zellen mit Lipofectamin, unter Verwendung des gemäß Hersteller empfohlenen Protokolls (Gibco BRL, Montreal, Canada). Klinische HIV-1-Isolate wurden erhalten durch cokultivieren von periphären Blutlymphozyten aus HIV-1-infizierten Individuen mit den CBMCs und dann propagiert auf CBMCs in der Abwesenheit von Arzneimitteln, wie von Salomon et al. beschrieben (1994, J. Clin. Microbiol. 32: 2000–2002). Virenvorrat wurde hergestellt aus durch Zentrifugation geklärten Kulturüberständen und aufbewahrt bei –70°C. Die Viren wurden durch limitierte Verdünnung mit einer 4-fach Reihenverdünnung titriert.
Antivirale Assays
Anti-HIV-1-Aktivitäten von DXG und seinem Pro-Arzneimittel DAPD wurden beurteilt durch Verwenden verschiedener HIV-1-Varianten und Typen von Zellen. Die meisten Versuche wurden mit einem Laborstamm-HIV-1_IIIB durchgeführt. Eine Anzahl rekombinanten Arzneimittelresistenzvarianten und wenig passagierte klinische Isolate aus Individuen, die eine Langzeit-anti-HIV- Therapie erhielten, wurden ebenfalls verwendet, um die Wirkungen dieser beiden Verbindungen zu beurteilen. Die Verfahren, die verwendet werden, um die antiviralre Wirkung der Verbindungen zu beurteilen, sind früher beschrieben worden (Gu et al., 1992, J. Virol. 66: 12–19 und Gu et al., 1994, Antimicrob. Agents Chemother. 38: 275–281, Rando et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 1754–1760, Salomon et al., 1994, J. Clin. Microbiol. 32: 2000–2002). Die Zellen wurden mit Virus unter Verwendung der angegebenen Infektionsmultiplizität (MOI) für 2 bis 3 Stunden inkubiert. Die MOI, die für jeden Versuch verwendet wurde, war abhängig von der Zelllinie und dem verwendeten Virusstamm und war im Allgemeinen im Bereich von 0,005 bis 0,5. Zum Beispiel wurde in Versuchen, die unter Verwendung der etablierten Zelllinie MT-2 durchgeführt wurden, HIV-1_IIIB mit einer MOI von 0,005 verwendet, um Zellen zu infizieren. Das ungebundene Virus wurde dann durch Waschen der Zellen entfernt, gefolgt von einem Platieren der Zellen auf einer Platte mit 96 Vertiefungen. Die infizierten Zellen wurden in der Gegenwart einer Reihe von Konzentrationen der Testverbindung für 5 bis 7 Tage kultiviert. Die Anti-HIV-1-Wirksamkeit wurde bestimmt durch Testen auf HIV-1-RT-Aktivität in den Zellkulturüberständen. Alle Assays wurden doppelt durchgeführt und mindestens zwei unabhängige Versuche wurden durchgeführt. Anti-HIV-1-Wirksamkeit von DXG und DAPD wurde verglichen mit den zugelassenen Anti-HIV-Arzneimitteln AZT- und/oder Lamivudine-Kontrollen in jedem einzelnen Experiment. Die Suszeptibilitäten der HIV-1-Varianten gegenüber antiretroviralen Mitteln sind als der Mittelwert der EC₅₀-Bestimmungen angegeben.
Kombinationswirkungen zwischen DXG und zugelassenen Anti-HIV-1-Mitteln wurden in CBMCs unter Verwendung von HIV-1_IIIB beurteilt. Die Kombinationen der Inhibitoren wurden in einem Schachbrettmuster-Kreuz durchgeführt. Die antiviralen Wirkungen wurden durch Testen der RT-Aktivität in den Kulturüberständen am Tag 7 beobachtet. Die Daten wurden gemäß dem von Chou und Talalay (Chou und Talalay, 1984, Adv. Enzyme Regul. 22: 27–55) analysiert. Die Kombinationsindizes (Cls) von DXG mit anderen Anti-HIV-1- Mitteln wurden unter Verwendung des CalcuSyn-Programms (Biosoft, Cambridge, UK) berechnet. Theoretisch zeigt ein Cl von 1 eine Additivwirkung; Cls von > 1 und < 1 stehen für Antagonismus bzw. Synergismus zwischen den kombinierten Arzneimitteln.
Cytotoxizitätsanalyse
Die zelluläre Toxizität der BCH-Verbindungen wurde auf verschiedenen Zellen unter Verwendung der [³H]-Thymidinaufnahme beurteilt. Die verschiedenen Zellen, einschließlich Molt-4, HT1080, DU-145, HepG 2 und HSF, wurden bei einer Konzentration von 1 bis 2 × 10³ Zellen pro Vertiefung (Platten mit 96 Vertiefungen) platiert. Jedoch wurden PHA-stimulierte PBMCs bei einer Konzentration von 4 × 10⁴ kultiviert. Nach einer Inkubationsdauer von 24 h wurden 10-fach reihenverdünnte Verbindungen (10^–4 M bis 10^–10 M) zu dem Kulturmedium gegeben und die Zellen wurden weiter für 72 h inkubiert. [³H]-Thymidin wurde während der letzten 18 h Inkubationsdauer zugegeben. Nach Inkubation mit dem [³H]-Thymidin wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen, mit Trypsin behandelt, falls die Zellen anhaftend waren, und dann in Wasser resuspendiert (hypotones lysieren von Zellen). Der zelluläre Extrakt wurde direkt einem Tomtec Harvester 96 zugeführt. Unter Verwendung dieses Instruments wird die extrahierte DNA auf Filtern adsorbiert, gewaschen und das eingebaute [³H]-Thymidin wird dann gezählt. Die 50% Cytotoxizitätskonzentration (CC₅₀) wurde bestimmt durch Vergleichen der Radioaktivitätszählungen pro Minute der Proben in der Gegenwart der Verbindungen gegen die Kontrolle.
Die zelluläre Toxizität der Verbindungen wurde ebenfalls getestet durch WST-1-Färben durch Beurteilen der Proliferation von MT-2, H9, Jurkat, U937 und CBMCs. Die etablierten Zelllinien wurden in RPMI-Medium auf Platten mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung inkubiert, während CBMCs in einer Konzentration von 0,5 × 10⁶/Vertiefung platiert wurden. Eine 10-fach reihenverdünnte (10^–4 – 10^–7 M) Verbindung wurde am Tag Null zugegeben.
Am Tag 4 wurden die Zellen passagiert durch Austauschen von halbem Medium, das geeignet verdünnte Verbindung enthielt. Die Zellaktivitäten wurden am Tag 7 unter Verwendung des WST-1-Reagenz (Boehringer Mannheim) unter Befolgung des vom Zulieferer bereitgestellten Protokolls beurteilt.
Reverese Transkriptase-Enzymassays
Die Wildtyp (wt)-Version von rekombinanter HIV-1-RT wurde mit einem Histidintag in einem E.coli-Protein-Expressionssystem exprimiert. Die Enzyme wurden bis auf 95% Homogenität gereinigt, wie von Gu et al. (1994, J. Biol. Chem. 269: 28118–28122 und 1995, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 92: 2760–2764) beschrieben.
RT-Inhibierungsassay
Die Inhibierung von HIV-1-RT-RNA-abhängiger DNA-Polymeraseaktivität von DXG-TP wurde beurteilt unter StationärszustandsEnzym-Kinetiken unter Verwendung homopolymerer RNA-Template/DNA-Primer (T/P) und einem heteropolymeren RNA-Templat/DNA-Primer. Das heteropolymere RNA-Templat enthält die HIV-1-Primerbindesequenz, U5 und R-Regionen (bezeichnet als HIV-PBS). Die HIV-PBS-RNA wurde in vitro von einer Plasmid-DNA, wie früher beschrieben (Gu et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 28118–28122), transkribiert. Der Oligodeoxynukleotidprimer (dPR) ist ein 18-mer (5'-GTCCCTGTTCGGGCGCCA-3'), welcher komplementär zur HIV-1-Primerbindungssequenz ist. Der Komplex aus HIV-PBS und dPR T/P wurde hergestellt durch Mischen eines 1 : 2-Verhältnisses in 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,8), enthaltend 60 mM KCl, Erhitzen auf 95°C für 2 min. und dann langsam abkühlen auf Raumtemperatur (Gu et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 28118–28122). Die reverese Transkriptionsreaktion enthielt Endkonzentrationen von 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,8, 60 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 0,1 U/ml homopolymeres T/P und 5 μM [³H]dNTP-Substrat oder 25 nM HIV-PBS/dPR und 5 μM von jeweils dTTP, dCTP, dGTP und [–³²P]dATP in 100 ml. Die Reaktionen wurden für 30 Minuten bei 37°C in der Gegenwart oder Abwesenheit von Dideoxynukleosidtriphosphatinhibitoren inkubiert, wie von Gu et al., (1994, J. Biol. Chem. 269: 28118–28122) beschrieben.
Inhibierung von dNTP-Einbau/Kettenterminierung
Die Wirkung von DXG-TP auf RT-Aktivität wurde ebenfalls beurteilt unter Verwendung des Kettenterminierungs/dNTP-Einbau-Assays, worin Inhibierung von nascierender DNA-Synthese (Kettenterminierung) beobachtet wurde, basierend auf cDNA-Synthese, wie früher beschrieben (Arts et al., 1993; J. Biol. Hem. 269: 14672–14680 und Gu et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 2760–2764). HIV-PBS-RNA-Templat und dPR-DNA-Primer wurden in diesem System verwendet. Die RT-Reaktionen wurden durchgeführt in 20 ml Volumina, enthaltend 50 mM Tris (pH-Wert 7,8), 75 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 100 μM dNTPs. Das HIV-PBS-RNA-Templat (50 nM) und [–³²P]-ATP-markierter Oligodeoxynukleotidprimer (125 nM) wurden in die Reaktion aufgenommen. Das Gemisch wurde zuerst bei 85°C für 2 Minuten denaturiert, dann auf 55°C für 8 min gekühlt und schließlich auf 37°C gekühlt, zu welcher Zeit rekombinantes HIV-RT zugegeben wurde (42,5 nM). Man ließ die Reaktionen bei 37°C für 60 min in der Gegenwart oder Abwesenheit von Inhibitoren fortschreiten. Die transkribierten DNA-Produkte wurden auf einem 5% denaturierenden Polyacrylamidgel getrennt und unter Aussetzung unter einem Röntgenfilm sichtbar gemacht.
Bestimmung des HIV-RT-Genotyps
Zur Bestimmung des RT-Genotyps der klinischen HIV-1 Isolate wurde provirale DNA von jedem Isolat von infizierten CD4⁺-T-Zellen oder CBMCs wie früher beschrieben (Gu et al., 1992) extrahiert. Die kompletten RT-codierenden Regionen wurden durch PCR amplifiziert, unter Verwendung eines Primerpaares, bestehend aus dem oberstromigen Primer RT01 (5'-GTAGAATTCTGTTGACTCAGATTGG-3') und des unterstromigen Primers RT02 (5'-GATAAGCTTGGGCCTTATCTATTCCAT-3'), wie früher beschrieben (Gu et al., 1992, J. Virol. 66: 12–19). Das amplifzierte Fragment hatte 1,7 kb und enthielt die komplette RT-codierende Sequenz. Die PCR-amplifizierten Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese getrennt und durch einen Qiaquick Gel Extraktionskit (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada) gereinigt. Das gereinigte PCR-Produkt wurden direkt sequenziert unter Verwendung von Primer-RTS (5'-CCAAAAGTTAAACAATGGC-3'), welche lokalisiert ist am 5'-Teil der RT-codierenden Region (Nukleotid 2603–2621 der NXB2-D-Koordinaten). Die Nukleinsäuresequenz von RT wurde sequenziert und mit den veröffentlichten Sequenzen der Wildtyp-HIV 1-Stämme verglichen.
Beispiel 1 (kein Teil der Erfindung)
Anti-HIV-1-Wirksamkeit von Dioxolanylanaloga in verschiedenen Zellen
Da anabole Wirksamkeit von Nukleosidanaloga, d.h. Phosphorylierung und Pro-Arzneimittelkonversion, durch die korrespondierenden zellulären Enzyme vermittelt wird, deren Aktivitäten vom Typ der Zellen abhängt, beurteilten wir die Anti-HIV-1-Wirksamkeit der Dioxolanylverbindungen, DXG und DAPD, in humanen CBMCs und einer Vielzahl humaner T- und Monocytenzelllinien. Alle Daten in diesen Assays wurden unter Verwendung von HIV-1_IIIB erhalten. Zugelassene Anti-HIV-Mittel, AZT und Lamivudine, wurden in jedem der Versuche als Kontrollen verwendet. Tabelle 1 fasst die Daten der antiviralen Wirksamkeit der Verbindungen zusammen, während 1 eine Dosis-Wirkung-Kurve für die Inhibierung von HIV-1 in MT-2-Zellen zeigt. Im Allgemein hatten die Dioxolanylverbindungen die gleiche Wirksamkeit in CBMCs und in T-Zelllinien. Zum Beispiel waren die EC₅₀ 0,046 μM und 0,085 μM für DXG, getestet in CBMCs bzw. MT-2-Zellen. EC₅₀ für DAPD waren üblicherweise um das 5- bis 20-fache höher als diejenigen für DXG in verschiedenen Zellen, z.B. 0,97 μM und 0,54 μM EC₅₀ für dieses Pro-Arzneimittel in CBMCs bzw. in MT-2-Zellen. Zusätzlich waren bei Vergleich mit der Anti-HIV-1-Wirksamkeit der zugelassenen Arzneimittel DXG im Allgemeinen äquivalent mit der Wirksamkeit von Lamivudine in den verschiedenen Zellen, jedoch ungefähr 5 bis 10 mal geringer als von AZT (Tabelle 1).
Wir verglichen auch die antivirale Wirksamkeit zwischen (–)- und (+)-Enantiomeren von β-D-1',3'-Dioxolanguanosin. Unsere Ergebnisse zeigten, dass das (+)-Enantiomer mit 0,7 μM EC₅₀ eine geringere antivirale Aktivität hatte als sein (–)-Enantiomer-Partner, der in MT-2-Zellen getestet wurde.
Beispiel 2 (kein Teil der Erfindung)
Suszeptibilität von rekombinanten Arzneimittel-resistenten HIV-1-Varianten gegenüber DXG und DAPD
Rekombinante HIV-1-Varianten, die Arzneimittelresistenzmutation(en) tragen, wurden verwendet, um den Kreuzresistenzphenotyp von DXG und DAPD in CBMCs und MT-2-Zellen zu testen. Tabelle 2 fasst den Hintergrund der Varianten und ihrer Empfindlichkeiten gegenüber den Dioxolanylpurinverbindungen als auch den zugelassenen NRTIs in CBMCs zusammen. Diese Mutanten bestehen aus denjenigen, die als die üblichsten RT-Inhibitor-Resistenz-HIV-Varianten angesehen werden, die entweder durch in vitro-Selektion oder von Patienten, die einer anti-retroviralen Therapie mit NRTIs, wie etwa AZT, Lamivudine, 2',3'-Dideoxyinosin (ddI) und ddC, unterzogen werden, erzeugt werden. Alle Rekombinanten stammen von HXB2-D. Die Daten in Tabelle 2 zeigten an, dass die Varianten von HIV-1, die ddI-, ddC- oder Lamivudine-Resistenzmutationen, d.h. 65K-, 74V- und 184V-Substitutionen in dem RT-Gen aufweisen, minimal (2 bis 5-fach) erniedrigte Empfindlichkeit gegenüber DXG und DAPD aufwiesen, bezogen auf das wt HXB2-D. Zusätzlich hatte die Variante, die Mutationen 41L und 215Y, kombiniert mit 184V, aufweist, die einen hohen Resistenzgrad gegenüber Lamivudine, jedoch revertierte Empfindlichkeit gegenüber AZT aufweist, ungefähr 2-fach erniedrigte Empfindlichkeit gegenüber DXG, was ähnlich der 184V einzelmutierten Rekombinante war.
Im Gegensatz hierzu blieb AZT-resistentes Virus, d.h. die Rekombinante, die 41L-, 70R-, 215Y- und 219Q-Mehrfachsubstitutionen in dem RT aufweist, vollständig empfindlich gegenüber DXG und DAPD, beide in CBMCs (Tabelle 2), dies wurde ebenfalls in MT-2-Zellen beobachtet. Zusätzlich zeigten antivirale Assays auch, dass diese Dioxolanylnukleosideanaloga sensitiv gegenüber NNRTI-resistenten und Proteaseinhibitor-resistenten Varianten waren (Tabelle 2).
Beispiel 3 (kein Teil der Erfindung)
Suszeptibilität von HIV-1 klinischen Isolaten gegenüber DXG und DAPD
Die Population von HIV-1 in infiziertem Individuum ist eine Quasi-Spezies und die Empfindlichkeit dieser verschiedenen Viren, die in klinischen Isolaten gegenüber antiviraler Chemotherapie gefunden wird, kann sehr variabel sein. Zusätzlich können HIV-1-Isolate, die von Patienten erhalten werden, welche eine antiretrovirale Langzeittherapie erhalten, sich verschieden von klonierten Viren verhalten, die genetisch entwickelte Mutationen in dem RT-Gen aufweisen. Aus diesen Gründen wurden klinische Isolate von HIV-1 von antiviralen, nicht behandelten und Arzneimittel-behandelten Patienten in PHA-stimulierten CBMCs untersucht auf ihre Empfindlichkeit gegenüber DXG und DAPD, begleitet von zugelassenen antiviralen Mitteln. Der Genotyp der klinischen HIV-1-Isolate wurde wie oben beschrieben bestimmt.
Tabelle 3 zeigt die Zusammenfassung der derzeitigen Therapiehistorie von Patienten, von welchen die HIV-1-Isolate erhalten wurden, den RT-Genotyp der Isolate und ihre Empfindlichkeit gegenüber den angegebenen Anti-HIV-Mitteln. Vier Isolate, d.h. Nr. 3887, 4246, 4877 und 4526 waren empfindlich gegenüber AZT und/oder Lamivudine oder wiesen marginal abgesenkte Empfindlichkeit gegenüber einem dieser beiden Arzneimittel auf, bezogen auf EC₅₀, erhalten mit rekombinanten Varianten (Tabelle 2). Diese Isolate wurden von HIV-1-infizierten Individuen erhalten, die entweder keine Anti-HIV-Therapie erhalten hatten oder behandelt waren mit den RT-Inhibitoren. Die Isolate 3387 trugen 184V-Substitution, gemischt mit wt 184M, und das Isolat 4877 hatte eine 41L-Mutation in den RTs. Wie in Tabelle 3 gezeigt, sind die EC₅₀, die erhalten wurden unter Verwendung dieser vier Isolate, sowohl für DXG und Pro-Arzneimittel DAPD vergleichbar mit denjenigen, die erhalten werden mit wt-Stämmen, d.h. HIV-1_IIIB und HXB2-D, beurteilt in CPMCs (siehe Tabellen 1 und 2).
Die Isolate 3350 und 4205 von Patienten, die eine Lamivudine-Therapie erhalten hatten, trugen eine 184V-Mutation in ihren RTs und waren hochgradig resistent gegenüber Lamivudine, blieben jedoch empfindlich gegenüber AZT. Konsistent mit den erhaltenen Ergebnissen unter Verwendung der rekombinanten Varianten (Tabelle 2) hatten diese 184V-mutierten Isolate eine ungefähr 5-fach erniedrigte Suszeptibilität gegenüber DXG und DAPD im Vergleich mit den Lamivudine- und AZT-empfindlichen Isolaten (Tabelle 3).
Das Isolat 4242 jedoch, welches von einem Patienten erhalten wurde, der mit AZT behandelt war und AZT-Resistenzmutationen trug, d.h. 41/L/70R/215Y in RT, hatte verringerte Empfindlichkeit gegenüber AZT, wie erwartet, blieb jedoch empfindlich gegenüber DXG, DAPD als auch Lamivudine. Der Assay verwendete einen NNRTI-resistenten Stamm 4924, isoliert aus einem Individuum, das AZT- und Navirapine-Kombinationstherapie erhielt, welches 41L/103N-Mutationen in dem RT aufwies und > 10 μM EC₅₀ für Nevirapine hatte, empfindlich war gegenüber Dioxolannukleosidanaloga (Tabelle 3). Zusätzlich wurde auch beobachtet, dass die Dioxolanverbindungen vollständig sensitiv gegenüber Proteaseinhibitor-Resistenzisolat 4833 sind, welches erhalten wurde aus einem Individuum, das eine 48 Wochen-Saquinavir-Therapie erfuhr und hatte etwa 20-fach verringerte Empfindlichkeit gegenüber diesem Proteaseinhibitor, verglichen mit Basislinienisolat 4526 (Tabelle 3).
Beispiel 4.
Kombinationswirkungen von DXG mit zugelassenen Anti-HIV-1-Mitteln
DXG, die aktive Form seiner Pro-Arzneimittel, wurde beurteilt über Kombinationen mit den zugelassenen Anti-HIV-1-Mitteln, d.h. NRTIs (AZT und Lamivudine) und NNRTI (Nevirapine), um HIV-1-Replikation in CBMCs gegenüber dem Laborstamm HIV-1_IIIB zu inhibieren. Die Kombinationsindizes (Cls) von DXG, kombiniert mit zugelassenen Anti-HIV-1-Mitteln sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Die Cls wurden bei verschiedenen wirksamen Konzentrationsgehalten berechnet, d.h. EC₅₀, EC₇₅, EC₉₀ und EC₉₅, in verschiedenen molaren Verhältnissen der kombinierten Arzneimittel. Die meisten der Cls waren zwischen 0,4 bis 0,8 im Falle von DXG, kombiniert mit entweder Lamivudine oder Nevirapine, was nahelegt, dass DXG einen moderaten Synergismus mit diesen beiden Anti-HIV-1-Mitteln hatte. Jedoch hatten diese Verbindungen einen größeren Synergismus mit den Thymidinanalogen AZT mit Cls zwischen 0,3 bis 0,8 bei EC₅₀ und weniger als 0,3 bei höheren EC-Gehalten, was einen starken Synergismus anzeigt.
Beispiel 5. (Kein Teil der Erfindung)
Zelluläre Toxizität
DXG und DAPD wurden zusammen mit Lamivudine und AZT bezüglich ihrer Wirkung auf Zellproliferation unter Verwendung von sowohl [³H]-Thymidinaufnahme als auch Zellproliferation (WST-1)-Assays getestet. Humane PBMC und eine Anzahl etablierter solider und leukämischer Krebszelllinien (Molt-4, HT-1080, DU-145, HepG2) und eine normale Zelllinie (humane Hautfibroblasten, HSF) wurden in der [³H]-Thymidinaufnahmestudie verwendet. Die Ergebnisse dieser Studien zeigten, dass DXG und DAPD nicht toxisch waren für die Zellproliferation bis zu einer Konzentration von 500 μM in dem [³H]-Thymidineinbauversuch (Tabelle 5). In den gleichen Versuchen waren CC₅₀ für AZT und ddC weniger als 10 μM in den getesteten Zellen. Zusätzlich hatte DXG keine Toxizität auf humane CBMC und mehrere Zelllinien, d.h. MT-2, H9, Jurkat und U937, bis zu 100 μM, der höchsten getesteten Konzentration in dem WST-1-Zelllebensfähigkeitsassay, verglichen mit den 74 μM und 29 μM CC₅₀ für sowohl AZT bzw. ddC. Daher waren DXG und DAPD weniger cytotoxisch als AZT und ddC in diesen Assaysystemen.
Beispiel 6. (Kein Teil der Erfindung)
Inhibierung von HIV-1-RT-Polymeraseaktivität durch DXG-Triphosphat
Das DXT-TP würde am wahrscheinlichsten die antiviral aktive Form für das Diaminopurindioxolan DAPD in vivo sein. Die inhibierende Wirkung von DXG-TP auf HIV-1 RT-Aktivität wurde beurteilt unter Verwendung verschiedener homopolymeres Templat/Primer (T/P) und einem heteropolymeres T/P, d.h. HIV-PBS/dPR. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigten, dass DXG-TP ein potenter HIV-1-RT-Inhibitor mit 0,01 μM IC₅₀ war, erhalten unter Verwendung von wt HIV-1-RT, wenn komplementäres Poly(rC).oligo(dG) T/P und dGTP-Substrat in den enzymatischen Reaktionen verwendet wurden (Tabelle 6). Dieser Wert hat ungefähr die gleiche inhibierende Wirksamkeit wie das parentale Dideoxyguanosintriphosphat (ddGTP). Ähnlich wurde beobachtet, dass DXG-TP und ddGTP die gleiche Inhibierung von RT aufwiesen wenn das Poly(rC).oligo(dG) durch heteropolymeres Templat/Primer HIV-PBS/dPR (Tabelle 6) ersetzt wurde. Zusätzlich wurde beobachtet, dass die RT-Inhibierung von DXG-TP mit natürlichem Substrat kompetitierte, d.h. um so höher die Konzentration von DGTP, umso geringer ist die inhibierende Wirkung von DXG-TP. Jedoch, wie erwartet, zeigte DXG-TP keine Inhibierung von HIV-1-RT-Aktivität bis zu 10 μM, wenn das nichtkomplementäre T/P Poly(rA).oligo(dT) zusammen mit dTTP als das Substrat verwendet wurde (Tabelle 6).
Der Kettenverlängerungs/Terminierungs-Assay liefert ein Verfahren zum direkten Sichtbarmachen der Produkte des Einbaus von Dideoxynukleotidmonophosphaten in nascierende DNA durch Beobachten der Reaktionsprodukte unter Verwendung von Polyacrylamidgelelektrophorese. Der Versuch wurde durchgeführt unter Verwendung von wt HIV-1-RT und HIV-PBS-Heterpolymertemplat und [³²P]ATP-markiertem dPR-Primer in der Gegenwart verschiedener Konzentrationen RT-Inhibitor. Die Konzentrationen der Inhibitoren, die verwendet wurden, waren 0, 0,7, 2,2, 6,6, 20 und 60 μM für DXG-TP, ddGTP und AZT-TP; 0, 1, 3, 10, 33 und 100 μM für 3TC-TP; 0, 0,005, 0,02, 0,08, 0,32 und 1,5 μM für NNRTI Nevirapine. 2 zeigt Ergebnisse eines Kettenverlängerungs/Terminations-Assays, worin DXG-TP, das als HIV-1-RT-Inhibitor verwendet wurde, im Vergleich mit anderen NRTI-Triphosphaten, d.h. ddGTP, AZT-TP und Lamivudine-TP, und einem NNRTI-Nevirapine. Die Banden am oberen Ende des Gels waren Volllängen-DNA-Produkte der RT-Reaktion. In den Bahnen, deren Reaktionen ohne RT-Inhibitoren waren, sind die verbleibenden Banden, die kürzer sind als die Volllängenprodukte, Pausierungsprodukte aufgrund der Tatsache, dass HIV-1-RT ein prozessives Enzym ist. Die zusätzlichen Banden (angegeben durch Pfeile als Beispiele), welche lediglich in den Bahnen in der Gegenwart von Dideoxynukleotidtriphosphatinhibitoren beobachtet werden, sind Kettenterminationsprodukte. DXG-TP bewirkte zusammen mit anderen getesteten Nukleotiden, d.h. ddGTP, AZT-TP und Lamivudine-TP, zunehmende Kettenterminierung, jedoch abnehmende Volllängenprodukte mit zunehmender Inhibitorkonzentration. Zum Vergleich wurde NNRTI Nevirapine auch in dem Assay verwendet. In diesem Falle zeigte Nevirapine auch die Abnahme des Volllängen-DNA-Produkts, jedoch wurden hier keine zusätzlichen Kettenterminationsbanden erzeugt, wie erwartet. Diese Ergebnisse zeigen den verschiedenen Inhibierungsmechanismus der RT zwischen NRTIs und NNRTIs.
Darüber hinaus war das Muster der Kettenterminationsbanden, erzeugt durch Einbau von DXG-MP in Verlängerungs-DNA-Stränge, exakt das gleiche wie das Muster seines parentalen Dideoxyguanidins (ddGMP), jedoch verschieden von Thymidin- und Cytidin-Analoga, d.h. AZT-MP und Lamivudine-MP-Einbau (siehe 2). Im Allgemeinen war die inhibierende Wirkung von DXG-TP auf RT-Aktivität in diesem zellfreien Assay, bestimmt durch die Intensität der Kettenterminierung und Volllängenbanden, die erzeugt wurden, die gleiche wie bei ddGTP und AZT-TP bei gleichen Konzentrationen, jedoch größer als bei Lamivudine-TP.

Claims

Pharmazeutische Kombination, geeignet zur Behandlung viraler Infektionen, umfassend mindestens eines aus (–)-β-D-2,6-Diaminopurin-1,3-dioxolan (β-D-DAPD) und (–)-β-D-1,3-Dioxolanguanin (β-D-DXG) und mindestens ein weiteres therapeutisches Mittel, ausgewählt aus Zidovudine, Lamivudine, Nevirapine und Kombinationen davon.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 1, worin β-D-Dioxolan mindestens zu 97% frei von dem entsprechenden (+)-Enantiomer ist.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 2, worin mindestens ein weiteres therapeutisches Mittel ausgewählt ist aus Zidovudine, Lamivudine, Nevirapine und Kombinationen davon.
Pharmazeutische Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung in der medizinischen Therapie.
Pharmazeutische Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung bei der Behandlung von HIV-Infektion.
Pharmazeutische Formulierung, umfassend eine pharmazeutische Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsmittel.
Pharmazeutische Formulierung, umfassend eine pharmazeutische Kombination nach Anspruch 4 mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsmittel.
Pharmazeutische Formulierung, umfassend eine pharmazeutische Kombination nach Anspruch 5 mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsmittel.
Pharmazeutische Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem synergistischen Verhältnis vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 4, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem synergistischen Verhältnis vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruchs, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem synergistischen Verhältnis vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 7, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem synergistischen Verhältnis vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 8, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem synergistischen Verhältnis vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 250 bis 250 : 1 vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 50 bis 50 : 1 vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 20 bis 20 : 1 vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 4, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 250 bis 250 : 1 vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 4, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 50 bis 50 : 1 vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 4, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 20 bis 20 : 1 vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 5, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 250 bis 250 : 1 vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 5, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 50 bis 50 : 1 vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 5, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 20 bis 20 : 1 vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 7, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 250 bis 250 : 1 vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 7, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 50 bis 50 : 1 vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 7, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 20 bis 20 : 1 vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 8, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 250 bis 250 : 1 vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 8, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 50 bis 50 : 1 vorliegen.
Pharmazeutische Kombination nach Anspruch 4, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 20 bis 20 : 1 vorliegen.
Verwendung mindestens eines aus (–)-β-D-2,6-Diaminopurin-1,3-dioxolan (β-D-DAPD) und (–)-β-D-1,3-Dioxolanguanin (β-D-DXG) und mindestens eines weiteren therapeutischen Mittels, ausgewählt aus Zidovudine, Lamivudine, Nevirapine und Kombinationen davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung viraler Infektionen.
Verwendung nach Anspruch 29, worin das β-Dioxolan zu mindestens 97% frei von dem entsprechenden (+)-Enantiomer ist.
Verwendung nach Anspruch 30, worin mindestens ein weiteres therapeutisches Mittel ausgewählt ist aus Zidovudine, Lamivudine, Nevirapine und Kombinationen davon.
Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 31, worin die virale Infektion eine HIV-Infektion ist.
Verwendung nach Anspruch 29 bis 31 worin die Verbindungen und die anderen therapeutischen Mittel aufeinanderfolgend benutzt werden.
Verwendung nach Anspruch 32, worin die Verbindungen und die anderen therapeutischen Mittel aufeinanderfolgend benutzt werden.
Verwendung nach Anspruch 29 bis 31, worin die Verbindungen und die anderen therapeutischen Mittel gleichzeitig benutzt werden.
Verwendung nach Anspruch 32, worin die Verbindungen und die anderen therapeutischen Mittel gleichzeitig benutzt werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 31, worin die Verbindungen und die anderen therapeutischen Mittel in einem synergistischen Verhältnis vorliegen.
Verwendung nach Anspruch 32, worin die Verbindungen und die anderen therapeutischen Mittel in einem synergistischen Verhältnis vorliegen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 31, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 250 bis 250 : 1 vorliegen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 31, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 50 bis 50 : 1 vorliegen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 29 bis 31, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 20 bis 20 : 1 vorliegen.
Verwendung nach Anspruch 32, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 250 bis 250 : 1 vorliegen.
Verwendung nach Anspruch 32, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 50 bis 50 : 1 vorliegen.
Verwendung nach Anspruch 32, worin die antiviral wirksamen Verbindungen und die therapeutischen Mittel in einem Verhältnis zwischen 1 : 20 bis 20 : 1 vorliegen.
Verwendung einer pharmazeutischen Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 28 zur Herstellung eines Medikaments.