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BEREICH DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Endung betrifft neue
Purinnukleosidanaloga, die als antivirale Mittel geeignet sind.
Im Besonderen betrifft die Erfindung Purinnukleoside, die verbesserte
Pharmakokinetikeigenschaften zeigen.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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In den Vereinigten Staaten treten
jedes Jahr mehr als 12 Millionen neuer Fälle sexuell übertragener Krankheiten
(STD) auf. Unter den 10 bedeutendsten Krankheiten, die in den Vereinigten
Staaten anzugeben sind, sind fünf
STD einschließlich
Chlamydia, Gonorrhoe, Syphilis, das Erworbene Immunschwäche Syndrom (AIDS)-
und Hepatitis B-Virus(HBV)-Infektion, unter welchen AIDS- und HBV-Infektion
nicht heilbar sind.
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Im Falle von AIDS sagt die Weltgesundheitsorganisation
voraus, dass im Jahr 2000 40 Millionen Menschen weltweit mit dem
Human-Immunschwächevirus
(HIV), dem Virus, das (AIDS) verursacht, infiziert sein werden.
Hepatitis-Infektionen
betreffen fünfmal
mehr Personen als im Falle von HIV. Von der Weltgesundheitsorganisation
ist berichtet worden, dass 2000 Millionen heute lebende Menschen
mit dem HBV-Virus infiziert sind, von welchen 350 Millionen chronisch
infiziert sind, und daher Gefahr laufen an einer Leberkrankheit
zu sterben.
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Wenngleich die Sterblichkeitsraten
von AIDS aufgrund neuer Therapien fallen, bleibt AIDS die zweitwichtigste
Todesursache bei Erwachsenen im Alter zwischen 29 und 40. Eine kombinierte
Anti-HIV-Therapie ist derzeit Pflegestandard für Menschen, die mit HIV infiziert
sind. Es gibt derzeit 11 Anti-HIV-Arzneimittel, die auf Verordnung
erhältlich
sind. Diese Anti-HIV-Arzneimittel fallen in drei Kategorien: Nukleosidanaloga,
die Zidovudine, Didanosine, Zalcitabine, Stavudine oder Lamivudine
umfassen; Proteaseinhibitoren, die Indinavir, Nelfinavir, Saquinavir
und Ritonavir umfassen, und Nicht-nukleosidische reverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI),
die Nevirapine, Delavirdine und Efavirenz umfassen. Verglichen mit
HIV gibt es derzeit nur wenige genehmigte Therapiemöglichkeiten
für chronische
Hepatitis B-Virusinfektion, welche Interferon und Lamivudine sind.
Andere Arzneimittel sind derzeit in klinischen Versuchen, einschließlich Famciclovir,
Lobucavir und Adefovir. Jedoch zeigten viele Studien, dass die meisten
Patienten nach Abschluss der Therapie einen Rückfall erleiden und eine Resistenz
gegenüber
den Arzneimitteln entwickeln.
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Die Entwicklung von Resistenz ist
in jüngerer
Zeit ein Hauptproblem bei der Behandlung von HIV- und HBV-Infektionen
geworden. Resistenz tritt üblicherweise
auf, wenn die verwendeten Arzneimittel kein ausreichendes Potenzial
aufweisen, um Virusreplikation vollständig zu stoppen. Wenn das Virus
an sich in der Gegenwart von Arzneimitteln reproduzieren kann, hat
es die Möglichkeit,
Veränderungen
in seiner Struktur vorzunehmen, die als Mutationen bezeichnet werden,
bis es eine findet, die es ihm erlaubt, trotz der Arzneimittel zu
reproduzieren. Wenn eine Mutationen auftritt, wächst es dann ohne nachgewiesen
zu werden und ist bald der dominante Stamm des Virus in dem Individuum.
Das Arzneimittel wird zunehmend schwächer gegen den neuen Stamm.
Zunehmend wird auch die Kreuzresistenz an Bedeutung gewinnen. Kreuzresistenz
tritt auf, wenn Mutationen, die Resistenz gegenüber einem Arzneimittel bewirken,
ebenfalls Resistenz gegenüber
einem anderen bewirken. Mehrere Studien bewiesen, dass das Kombinieren
von zwei Arzneimitteln die Entwicklung einer Resistenz gegenüber einem
oder beiden Arzneimitteln verzögert,
verglichen damit, wenn jedes Arzneimittel alleine verwendet wird.
Andere Studien legen nahe, dass Kombinationen aus drei Arzneimitteln
diesen Vorteil sogar noch weiter verbessern. Als ein Ergebnis nehmen
viele Leute an, dass die beste Art zum Verhindern oder zumindest
zum Verzögern
von Resistenz die Verwendung von Multi-Arzneimittelkombinationstherapien
ist. Jedoch steigt mit der Zunahme der Anzahl von Arzneimitteln
auch das Risiko oder die Arzneimittelwechselwirkungen und Toxizität.
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Ein Weg zum Erhöhen der Wirksamkeit eines Arzneimittels
ist die Verbesserung seiner pharmakokinetischen Eigenschaften, die
zu seiner therapeutischen Wirksamkeit beitrrgen. Die Wissenschaft
der Pharmakokinetik ist die Untersuchung der Faktoren, die die Menge
chemischer Mittel an ihren Stellen biologischer Wirkung zu verschiedenen
Zeiten nach der Verarbreichung eines Mittels oder Arzneimittelmittels
an biologische Systeme bestimmen. Die Pharmakokinetiken umfassen
die Untersuchung der Arzneimittelabsorption und Verteilung („Biotranslokation"), die Untersuchung
der chemischen Veränderungen,
die ein Arzneimittel im Körper eingehen
kann („Biotransformation") und die Untersuchung
der Mittel, durch welche Arzneimittel im Körper gespeichert und aus ihm
eliminiert bzw. ausgeschieden werden. Bei chronischer Arzneimitteltherapie
ist die Bioverfügbarkeit
der wichtigere Faktor, da er das Ausmaß betrifft, zu welchem ein
Arzneimittel absorbiert wird und den Blutstrom erreicht oder auf
andere Art für
den Behandlungsort im Körper
verfügbar
ist. Die Bioverfügbarkeit
ist direkt verknüpft
mit der Fähigkeit
des Arzneimittels zum Lösen
in biologischen Fluiden.
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Es ist berichtet worden, dass (-)-β-D-2,6-Diaminopurindioxolan(DAPD)
und (-)β-D-1,3-Dioxolanguanin (DXG)
eine hohe Effizienz bzw. Wirksamkeit gegen HIV-1 in verschiedenen
Zellsystemen, minimale Kreuzresistenz mit Lamivudine und geringe
Toxizität
aufweisen. Jedoch haben diese Verbindungen schlechte pharmakokinetische
Eigenschaften, die verbessert werden könnten. Es wäre daher zweckmäßig mit
Verbindungen versorgt zu sein, die verbesserte Pharmakokinetiken
aufweisen zur Verwendung bei der Behandlung von Patienten, die mit
HIV und HBV infiziert sind.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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In einer Hinsicht liefert die vorliegende
Erfindung neue Purin-cis-Nukleosid-Verbindungen der Formel (I)
und pharmzeutisch verträgliche Salze
davon, worin
n 1 oder 2 ist,
R
4 ausgewählt ist
aus H, COOH, CONH
2, OH, SH, NH
2,
NO
2, C
1-6-Alkyl,
C
2-6-Alkenyl,
C
2-6-Alkinyl, Halogen, COR
a,
worin R
a ein C
2-6-Alkyl,
C
2-6-Alkenyl, C
2-6-Alkinyl ist, oder
COOR
b, worin R
b ein
C
1-6-Alkyl, C
2-6-Alkenyl
oder C
2-6-Alkinyl ist;
R
3 H
oder C
1-6-Alkyl, C
2-6-Alkenyl,
C
2-6-Alkinyl ist;
X ausgewählt ist
aus H, Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat, Carbonyl, das substituiert
ist mit einem C
1-6-Alkyl, C
2-6-Alkenyl,
C
2-6-Alkinyl, C
1-10-Aryl
oder
worin jedes Rc unabhängig ausgewählt ist
aus H, C
1-6-Alkyl, C
2-6-Alkenyl,
C
2-6-Alkinyl
oder einer Hydroxyschutzgruppe; und worin
das Nukleosid in
der Form des (–)-Enantiomers,
des (+)-Enantiomers und Gemischen davon, einschließlich racemische
Gemische, vorliegt.
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Die Verbindungen der vorliegenden
Erfindung sind geeignet bei der Therapie, insbesondere als antivirale
Mittel.
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In einer anderen Hinsicht wird ein
Verfahren bereitgestellt zur Behandlung viraler Infektionen in einem Lebewesen,
das eine solche Behandlung erfordert, umfassend das Verabreichen
einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung oder Zusammensetzung
der Erfindung an das Lebewesen.
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In einer anderen Hinsicht wird eine
pharmazeutische Formulierung bereitgestellt, umfassend die Verbindung
der Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger
oder Hilfsstoff.
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Ein noch weiterer Aspekt ist die
Bereitstellung eines Verfahrens zum Behandeln viraler Infektionen
in einem Lebewesen, das eine derartige Behandlung erfordert, umfassend
das Verabreichen an das Lebewesen einer Kombination, umfassend mindestens
eine Verbindung gemäß Formel
I und mindestens ein weiteres therapeutisches Mittel, ausgewählt aus
Nukleosidanaloga; Nicht-nukleosidischereverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI)
oder Protease-Inhibitoren.
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In einer noch weiteren Hinsicht wird
eine pharmazeutische Formulierung bereitgestellt, umfassend mindestens
eine Verbindung gemäß Formel
I, mindestens ein weiteres therapeutisches Mittel, ausgewählt aus Nukleosidanaloga;
Nicht-nukleosidische reverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI);
oder Proteaseinhibitoren und einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
oder Hilfsstoff.
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In einer anderen Hinsicht ist die
Erfindung die Verwendung einer Verbindung gemäß Formel I zur Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung viraler Infektionen.
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DETALLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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In einer Ausführungsform umfassen Verbindungen
der vorliegenden Erfindung, diejenigen, worin die folgenden Ausführungsformen
entweder unabhängig
oder in Kombination vorliegen.
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In einer Ausführungsform ist X H.
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Alternativ ist X
worin jedes Rc unabhängig ausgewählt ist
aus H, C
1-6-Alkyl, C
2-6-Alkenyl,
C
2-6-Alkinyl
oder einer Hydroxyschutzgruppe, ausgewählt aus S-Acylthioethylester,
Acyloxymethylester oder Alkylmethylcarbonat. In einer weiteren Ausführungsform
ist X
worin jedes Rc unabhängig eine
Hydroxyschutzgruppe ist, ausgewählt
aus Acetyl-2-thioethylester, Pivaloyloxymethylester oder Isopropyloxycarbonyloxymethylester.
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In einer Ausführungsform ist n 1.
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In einer weiteren Ausführungsform
ist R3 H oder Methyl. In einer weiteren
Ausführungsform
ist R3 H.
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In einer weiteren Ausführungsform
ist R4 ausgewählt aus H, COOH, CONH2, C1-6-Alkyl, C2-6-Alkenyl, C2-6-Alkinyl oder COORb,
worin Rb ein C1-6-Alkyl,
C2-6-Alkenyl oder C2-6-Alkinyl
ist.
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In einer weiteren Ausführungsform
ist R4 H, COOH oder C1-6-Alkyl.
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In einer weiteren Ausführungsform
ist R4 H, COOH, Methyl oder Ethyl. In einer
weiteren Ausführungsform
ist R4 Methyl oder Ethyl.
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In einer alternativen Ausführungsform
ist R4 COOH. In einer weiteren Ausführungsform
ist R4 H.
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In einer weiteren Ausführungsform
ist R3 H oder Methyl und R4 ist
H. In einer weiteren Ausführungsform
sind R4 und R3 H.
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In einer Ausführungsform werden die Verbindungen
der vorliegenden Erfindung durch Formel (Ia):
und pharmazeutisch verträgliche Salze
davon dargestellt, worin jedes n, X, R
3 und
R
4 wie oben definiert ist.
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Dem Fachmann in der Technik wird
bewusst sein, dass die Verbindungen der Formel (I) und (Ia) mindestens
zwei chirale Zentren enthalten, welche durch ein Sternchen (*) in
der allgemeinen Formel (I) und (Ia) markiert sind. Die Verbindungen
der Formel (I) und (Ia) existieren so in der Form zweier verschiedener
optischer Isomere (d. h. (+)- oder (–)-Enantiomere oder β-L und β-D). Alle derartigen
Enantiomere und Gemische davon, einschließlich racemische Gemische,
sind im Bereich der Erfindung enthalten. Das einzelne optische Isomer
oder Enantiomer kann durch in der Technik allgemein bekannte Verfahren
erhalten werden, wie etwa chirale HPLC, enzymatische AufTrennung
und chirale Hilfsmittel, oder kann stereoselektiv synthetisiert
werden.
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Entsprechend der vorliegenden Erfindung
werden Verbindungen mit verbesserten Pharmakokinetikeigenschaften
bereitgestellt.
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Gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden Verbindungen mit verbesserter
Bioverfügbarkeit
bereitgestellt.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum
Behandeln einer viralen Infektion in einem Lebewesen, das eine solche
Behandlung erfordert, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch
wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch
verträglichen
Salzes davon an das Lebewesen.
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Gemäß einer anderen Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zum
Behandeln einer retroviralen Infektion in einem Lebewesen, das eine
solche Behandlung benötigt,
umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer
Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch verträglichen
Salzes davon an das Lebewesen.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Behandeln eines
Lebewesens bereitgestellt, das durch das HIV-Virus infiziert ist, umfassend das Verabreichen
an das Lebewesen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung
der Formel (I) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Behandeln eines
Lebewesens bereitgestellt, das durch das HBV-Virus infiziert ist, umfassend das Verabreichen
an das Lebewesen einer therapeutisch wirksamen Menge einer Verbindung
der Formel (I) oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon.
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Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung
umfassen:
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Verbindung
A cis-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
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Verbindung
B cis-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclobutylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
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Verbindung
C cis-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-[1-carbonsäurecyclopropylamino]-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
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In einer weiteren Ausführungsform
umfassen Verbindungen der Erfindung:
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Verbindung
A(-) (-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylaminopurin-9'-yl)-1,3-dioxolan
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Verbindung
B(-) (-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclobutylaminopurin-9'-yl)-1,3-dioxolan
-
Verbindung
C(-) (-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-[1-carbonsäurecyclopropylamino]-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
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In einer Ausführungsform ist die Verbindung
der vorliegenden Erfindung in der Form des (+)-Enantiomers mindestens
zu 95% frei von dem entsprechenden (–)-Enantiomer.
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In einer Ausführungsform ist die Verbindung
der vorliegenden Erfindung in der Form des (+)-Enantiomers mindestens
zu 97% frei von dem entsprechenden (–)-Enantiomer.
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In einer Ausführungsform ist die Verbindung
der vorliegenden Erfindung in der Form des (+)-Enantiomers mindestens
zu 99% frei von dem entsprechenden (–)-Enantiomer.
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In einer Ausführungsform ist die Verbindung
der vorliegenden Erfindung in der Form des (–)-Enantiomers mindestens zu
95% frei von dem entsprechenden (+)-Enantiomer.
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In einer Ausführungsform ist die Verbindung
der vorliegenden Erfindung in der Form des (–)-Enantiomers mindestens zu
97% frei von dem entsprechenden (+)-Enantiomer.
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In einer Ausführungsform ist die Verbindung
der vorliegenden Erfindung in der Form des (–)-Enantiomers mindestens zu
99% frei von dem entsprechenden (+)-Enantiomer.
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In einer Ausführungsform ist die Verbindung
der vorliegenden Erfindung Verbindung A.
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In einer Ausführungsform ist die Verbindung
der vorliegenden Erfindung Verbindung A(-).
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Es werden auch pharmazeutisch verträgliche Salze
der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Der Ausdruck pharmazeutisch
verträgliche
Salze von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und (Ia) bedeutet diejenigen,
die aus pharmazeutisch verträglichen
anorganischen und organischen Säuren
und Basen erhalten werden. Beispiele geeigneter Säuren umfassen
Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Salpeter-, Perchlor-,
Fumar-, Malein-, Phosphor-, Glykol-, Milch-, Salicyl-, Succin-,
Toluol-p-sulfon-, Wein-, Essig-, Zitronen-, Methansulfon-, Ameisen-,
Benzoe-, Malon-, Naphthalin-2-sulfon- und Benzolsulfonsäuren. Andere
Säuren,
wie etwa Oxalsäure,
können,
wenngleich sie an sich pharmazeutisch nicht verträglich sind,
als Zwischenprodukte zum Erhalten der Verbindungen der vorliegenden
Erfindung und ihrer pharmazeutisch verträglichen Säurezugabesalze geeignet sein.
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Salze, die von geeigneten Basen abstammen,
umfassen Alkalimetall-, (z. B. Natrium), Erdalkalimetall- (z. B.
Magnesium), Ammonium- und NR4
+-
(worin R C1-4-Alkyl ist), Salze.
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Hier nachfolgende Bezugnahmen auf
eine Verbindung gemäß der vorliegenden
Erfindung umfassen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und (Ia)
und ihre pharmazeutisch verträglichen
Salze.
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Wenn es nicht anders definiert ist,
haben alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die
hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung, wie sie üblicherweise
vom Fachmann in der Technik, die diese Erfindung betrifft, verstanden
werden. Zusätzlich
sind die Materialien, Verfahren und Beispiele nur veranschaulichend
und sollen nicht als begrenzend ausgelegt werden.
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Wie in dieser Anmeldung verwendet,
bedeutet der Ausdruck „Alkyl" eine unsubstituierte
oder substituierte (durch ein Halogen, Nitro, CONH2,
COOH, O-C1-6-Alkyl, O-C2-6-Alkenyl,
O-C2-6-Alkinyl, Hydroxyl, Amino oder COOQ,
worin Q C1-6-Alkyl; C2-6-Alkenyl;
C2-6-Alkinyl ist) geradkettige, verzweigtkettige
oder cyclische Kohlenwasserstoffkomponente (z. B. Isopropyl, Ethyl,
Fluorhexyl oder Cyclopropyl). Der Ausdruck Alkyl soll auch Alkyle
umfassen, worin ein oder mehrere Wasserstoffatome durch ein Halogen
ersetzt sind, bevorzugter ist das Halogen Fluor (z. B. CF3- oder CF3CH2.-).
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Die Ausdrücke „Alkenyl" oder „Alkinyl" bedeuten ein Alkyl, das mindestens
eine ungesättigte
Gruppe enthält
(z. B. Allyl).
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Der Ausdruck „Hydroxyschutzgruppe" ist im Bereich der
organischen Chemie allgemein bekannt. Derartige Schutzgruppen können in
T. Greene, Protective Groups In Organic Synthesis, (John Wiley & Sons, 1981) gefunden
werden. Beispiele von Hydroxyschutzgruppen umfassen, ohne darauf
begrenzt zu sein, Acetyl-2-thioethylester, Pivaloyloxymethylester
und Isopropyloxycarbonyloxymethylester.
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Wenn ein Schwefelatom vorliegt, kann
das Schwefelatom in verschiedenen Oxidationszuständen, S, SO oder SO2 vorliegen. Alle derartigen Oxidationszustände sind
im Bereich der vorliegenden Erfindung.
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Halogen bedeutet hier Fluor, Chlor,
Brom und Jod, z. B. Fluor.
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Es versteht sich, dass die Menge
einer Verbindung der Erfindung, die erforderlich ist zur Verwendung bei
einer Behandlung nicht nur mit der speziellen ausgewählten Verbindung
variieren wird, sondern auch mit dem Verabreichungsweg, der Art
des Zustands, für
welchen eine Behandlung erforderlich ist und dem Alter und dem Zustand
des Patienten und sie wird letztendlich im Ermessensbereich des
zuständigen
Arztes oder Tierarztes liegen. Im Allgemeinen liegt jedoch eine
geeignete Dosis im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 750 mg/kg Körpergewicht
pro Tag, vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 60 mg/kg/Tag, am bevorzugtesten
im Bereich von 1 bis 20 mg/kg/Tag.
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Die gewünschte Dosis kann praktischerweise
in einer Einzeldosis oder in geteilten Dosen zu geeigneten Intervallen
verabreicht werden, z. B. als zwei, drei, vier oder mehr Dosen pro
Tag.
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Die Verbindung wird üblicherweise
in Einheitsdosisform verabreicht; z. B. sind 10 bis 1500 mg, geeigneterweise
20 bis 1000 mg, am geeignetsten 50 bis 700 mg wirksamer Bestandteil
pro Einheitsdosisform enthalten.
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Idealerweise sollte der wirksame
Bestandteil verabreicht werden, um Maximalplasmakonzentrationen der
wirksamen Verbindung von etwa 1 bis etwa 75 μM, vorzugsweise etwa 2 bis 50 μM, am bevorzugtesten etwa
3 bis etwa 30 μM,
zu erreichen. Dies kann z. B. erreicht werden durch die intravenöse Injektion
einer 0,1- bis 5-%-igen Lösung
des wirksamen Bestandteils, optional in Kochsalzlösung, oder
durch orale Verabreichung als ein Bolus, der etwa 1 bis etwa 500
mg des wirksamen Bestandteils enthält. Wünschenswerte Blutgehalte können durch
eine kontinuierliche Infusion, um etwa 0,01 bis etwa 5,0 mg/kg/Stunde
vorzusehen, oder durch periodische Infusionen, die etwa 0,4 bis
etwa 15 mg/kg des wirksamen Bestandteils erhalten, erhalten werden.
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Wenngleich es möglich ist, dass zur therapeutischen
Verwendung eine Verbindung der Erfindung als die Rohchemikalie verabreicht
werden kann, ist es bevorzugt, den wirksamen Bestandteil als eine
pharmazeutische Formulierung zu verabreichen. Die Erfindung liefert
daher weiterhin eine pharmazeutische Formulierung, umfassend eine
Verbindung der Formel (I) oder (Ia) oder ein pharmazeutisch verträgliches
Salz davon zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen
Träger
hierfür
und optional anderen therapeutischen und/oder prophylaktischen Bestandteilen.
Der/die Träger
muss/müssen
in dem Sinne „verträglich" sein, dass er/sie
kompartibel mit den anderen Bestandteilen der Formulierung ist/sind
und nicht schädlich
für den
Rezipienten ist/sind.
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Pharmazeutische Formulierungen umfassen
diejenigen, die zur oralen, rektalen, nasalen, topischen (einschließlich bukkal
und sublingual), transdermalen, vaginalen oder parenteralen (einschließlich intramuskulär, subkutan
und intravenös)
Verabreichung geeignet sind oder in einer Form sind, die geeignet
zur Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation ist. Die Formulierungen
können,
wenn es geeignet ist, üblicherweise in
diskreten Dosiseinheiten vorliegen und können durch eines der allgemein
in der pharmazeutischen Technik bekannten Verfahren hergestellt
werden. Alle Verfahren umfassen den Schritt, dass die wirksame Verbindung mit
flüssigen
Trägern
oder feinzerteilten festen Trägern
oder beiden in Verbindung gebracht wird, und dann, falls erforderlich,
Formen des Produkts in die gewünschte
Formulierung.
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Eine pharmazeutische Formulierung,
die für
orale Verabreichung geeignet ist, kann herkömmlicherweise als diskrete
Einheiten vorliegen, wie etwa als Kapseln, Arzneikapseln oder Tabletten,
welche jeweils eine vorbestimmte Menge des wirksamen Bestandteils
enthalten; als ein Pulver oder als Granalien; als eine Lösung, eine
Suspension oder als eine Emulsion. Der wirksame Bestandteil kann
auch als ein Bolus, Electuarium oder eine Paste vorliegen. Tabletten
und Kapseln zur oralen Verabreichung können übliche Hilfsstoffe enthalten,
wie etwa Bindemittel, Füllstoffe,
Schmierstoffe, Desintegrationsmittel bzw. Auflösemittel oder Benetzungsmittel.
Die Tabletten können
entsprechend allgemein in der Technik bekannter Verfahren beschichtet
werden. Flüssige
Oralpräparationen
können
in der Form von z. B. wässrigen
oder öligen
Suspensionen, Lösungen, Emulsionen,
Sirup oder Elixieren sein, oder können als ein trockenes Produkt
zum Konstituieren mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel
vor der Anwendung vorliegen. Derartige flüssige Präparationen können herkömmliche
Additive, wie etwa Suspensionsmittel, Emulgiermittel, nichtwässrige Vehikel
(welche Speiseöle
enthalten können)
oder Konservierungsmittel, enthalten.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch
für parenterale
Verabreichung formuliert werden (z. B. durch Injektion, z. B. Bolusinjektion
oder kontinuierliche Infusion) und können in Dosisform in Ampullen, vorgefüllten Spritzen,
kleinvolumigen Infusionen oder in Mehrfachdosisbehältnissen
mit einem zugegebenen Konserverierungsmittel vorliegen. Die Zusammensetzungen
können
in solchen Formen sein, wie etwa Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder
wässrigen
Vehikeln, und können
Formulierungsmittel enthalten, wie etwa Suspendier-, Stabilisierungs-
und/oder Dispergiermittel. Alternativ kann der wirksame Bestandteil
in Pulverform sein, erhalten durch aseptische Isolierung von sterilem
Feststoff oder durch Lyophilisierung aus Lösung, zum Konstituieren mit
einem geeigneten Vehikel, z. B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser,
vor Anwendung.
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Zur topischen Verabreichung in die
Epidermis können
die Verbindungen der Erfindung als Salben, Cremes oder Lotionen
oder als ein transdermales Pflaster formuliert sein. Derartige transdermale
Pflaster können
Penetrationsverstärkungsmittel,
wie etwa Linalool, Carvacol, Thymol, Citral, Menthol und t-Anethol,
enthalten. Salben und Cremes können
z. B. formuliert werden mit einem wässrigen oder öligen Grundmaterial
unter der Zugabe geeigneter Verdickungs- und/oder Geliermittel.
Lotionen können
mit einem wässrigen
oder öligen
Grundmaterial formuliert werden und werden im Allgemeinen ein oder
mehrere Emulgiermittel, Stabilisierungsmittel, Dispergiermittel,
Suspendiermittel, Verdickungsmittel oder Färbemittel enthalten.
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Formulierungen, die zur topischen
Verabreichung in den Mund geeignet sind, umfassen Pastillen, die den
aktiven Bestandteil in einem aromatisierten Grundmaterial, üblicherweise
Sucrose und Akazie oder Tragant, umfassen; Pastillen, umfassend
den wirksamen Bestandteil in einem inerten Grundmaterial, wie etwa Gelatine
und Glycerin oder Sucrose und Akazie; und Mundwässer, die den wirksamen Bestandteil
in einem geeigneten flüssigen
Träger
umfassen.
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Pharmazeutische Formulierungen, die
zur rektalen Verabreichung geeignet sind, worin der Träger ein Feststoff
ist, liegen am bevorzugtesten als Einheitsdosissuppositorien vor.
Geeignete Träger
umfassen Kakaobutter und andere Materialien, die üblicherweise
in der Technik verwendet werden und die Suppositorien können herkömmlich durch
Mischen der wirksamen Verbindung mit dem/den weichgemachten oder
geschmolzenen Träger/Trägern, gefolgt
durch Abkühlen
und Formen in Formen gebildet werden.
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Formulierungen, die zur vaginalen
Verabreichung geeignet sind, können
als Pessarien, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder
Sprays vorliegen, die zusätzlich
zum wirksamen Bestandteil solche Träger enthalten, wie diejenigen,
von welchen in der Technik bekannt ist, dass sie geeignet sind.
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Zur intranasalen Verabreichung können die
Verbindungen der Erfindung als ein flüssiger Spray oder dispergierbares
Pulver oder in der Form von Tropfen vorliegen. Tropfen können mit
einem wässrigen
oder nichtwässrigen
Grundmaterial formuliert werden, welches auch ein oder mehrere Dispergiermittel,
Solubilisiermittel oder Suspendiermittel enthält. Flüssige Sprays werden geeigneterweise
aus Druckbehältern
zugeführt.
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Zur Verabreichung durch Inhalation
werden die erfindungsgemäßen Verbindungen
herkömmlicherweise
aus einem Einblasegerät
bzw. Inhaliergerät,
Vernebelungsgerät
oder einem unter Druck stehenden Behälter oder durch andere herkömmliche
Mittel zum Zuführen
eines Aerosolsprays zugeführt.
Unter Druck stehende Behälter
können
ein geeignetes Treibmittel umfassen, wie etwa Dichlordifluormethan,
Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein
anderes geeignetes Gas. Im Falle eines unter Druck stehenden Aerosols
kann die Dosiseinheit durch Vorsehen eines Ventils zum Zuführen einer
abgemessenen Menge bestimmt werden.
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Alternativ können zur Verabreichung durch
Inhalation oder Insufflation die erfindungsgemäßen Verbindungen in der Form
einer Trockenpulverzusammensetzung sein, z. B. ein Pulvergemisch
der Verbindung und eines geeigneten pulverförmigen Grundmaterials, wie
etwa Lactose oder Stärke.
Die Pulverzusammensetzung kann in Einheitsdosisform vorliegen, z.
B. in Kapseln oder Patronen oder z. B. in Gelatine oder Blisterpackungen,
aus welchen das Pulver mit der Hilfe eines Inhalators oder Insufflators
verabreicht werden kann.
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Wenn es gewünscht ist, können die
oben beschriebenen Formulierungen, welche ausgelegt sind, um eine
verzögerte
Freisetzung des wirksamen Bestandteils zu ergeben, verwendet werden.
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Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch
in Verbindung mit anderen antiviralen Mitteln verwendet werden.
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In einer Ausführungsform umfassen Kombinationen
der vorliegenden Erfindung, diejenigen, worin die folgenden Ausführungsformen
vorliegen, entweder unabhängig
oder in Kombination.
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In einer Ausführungsform können die
Verbindungen der Erfindung zusammen mit mindestens einem anderen
antiviralen Mittel verwendet werden, das ausgewählt wird aus Nukleosidanaloga,
NNRTI oder Proteaseinhibitoren.
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In einer Ausführungsform ist das Nukleosidanaloge
ein 1,3-Oxathiolananaloges.
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In einer weiteren Ausführungsform
ist das 1,3-Oxathiolananaloge Lamivudine, Coviracil oder 2-Hydroxymethyl-4-(cytosin-1'-yl)-1,3-Oxathiolan.
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In einer weiteren Ausführungsform
ist das 1,3-Oxathiolananaloge 2-Hydroxymethyl-4-(cytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan.
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In einer weiteren Ausführungsform
ist das 1,3-Oxathiolananloge 2R-Hydroxymethyl-4R-(cytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan.
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In einer weiteren Ausführungsform
ist das 1,3-Oxathiolan-Analoge 2S-Hydroxymethyl-4S-(cytosin-1'-yl)-1,3-oxathiolan.
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In einer Ausführungsform können die
Verbindungen der Erfindung zusammen mit mindestens einem anderen
antiviralen Mittel verwendet werden, ausgewählt aus Zidovudine, Didanosine,
Zalcitabine, Stavudine, Lamivudine, Nevirapine, Delavirdine, Efavirenz,
Indinavir, Nelfinavir, Saquinavir oder Ritonavir.
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In einer Ausführungsform können die
Verbindungen der Erfindung zusammen mit mindestens einem anderen
antiviralen Mittel verwendet werden, ausgewählt aus Nevirapine, Efavirenz,
Zidovudine, Stavudine oder Lamivudine.
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In einer Ausführungsform können die
Verbindungen der Erfindung zusammen mit mindestens einem anderen
antiviralen Mittel, ausgewählt
aus Efavirenz, Zidovudine, Stavudine oder Lamivudine, verwendet
werden.
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In einer Ausführungsform können die
Verbindungen der Erfindung zusammen mit mindestens einem anderen
antiviralen Mittel, ausgewählt
aus Efavirenz, Zidovudine oder Lamivudine verwendet werden.
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In einer Ausführungsform werden die Verbindungen
der Erfindung zusammen mit Efavirenz, Zidovudine oder Lamivudine
verwendet. In einer Ausführungsform
können
die Verbindungen der Erfindung zusammen mit mindestens einem anderen
antiviralen Mittel verwendet werden, ausgewählt aus Nevirapine, Zidovudine,
Stavudine oder Lamivudine.
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In einer Ausführungsform werden die Verbindungen
der Erfindung zusammen mit Nevirapine, Zidovudine, Stavudine und
Lamivudine verwendet.
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In einer Ausführungsform können die
Verbindungen der Erfindung zusammen mit mindestens einem anderen
antiviralen Mittel verwendet werden, ausgewählt aus Zidovudine, Stavudine
oder Lamivudine.
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In einer Ausführungsform werden die Verbindungen
der Erfindung zusammen mit Zidovudine, Stavudine oder Lamivudine
verwendet.
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In einer Ausführungsform können die
Verbindungen der Erfindung zusammen mit Zidovudine verwendet werden.
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In einer Ausführungsform können die
Verbindungen der Erfindung zusammen mit Stavudine verwendet werden.
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In einer Ausführungsform können die
Verbindungen der Erfindung mit Lamivudine verwendet werden.
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In einer Ausführungsform können die
Verbindungen der Erfindung zusammen mit Nevirapine verwendet werden.
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In einer Ausführungsform können die
Verbindungen der Erfindung zusammen mit Efavirenz verwendet werden.
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Die Kombinationen, auf welche oben
Bezug genommen wird, können
herkömmlicherweise
zur Verwendung in der Form einer pharmazeutischen Formulierung vorliegen
und derartige pharmazeutische Formulierungen, die eine oben definierte
Kombination zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger umfassen,
stellen daher einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
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Die einzelnen Komponenten derartiger
Kombinationen können
entweder aufeinanderfolgend oder gleichzeitig in getrennten oder
kombinierten pharmazeutischen Formulierungen verabreicht werden.
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Wenn die Verbindung (I) und (Ia)
oder pharmazeutisch verträgliche
Salze davon in Kombination mit einem zweiten therapeutisch wirksamen
Mittel gegen den gleichen Virus verwendet werden, kann die Dosis jeder
Verbindung entweder die gleiche sein oder kann von derjenigen abweichen,
die eingesetzt wird, wenn die Verbindung alleine verwendet wird.
Geeignete Dosen werden durch den Fachmann in der Technik leicht
zu beurteilen sein.
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Das Verhältnis zwischen den Verbindungen
der vorliegenden Erfindung und dem zweiten therapeutischen Mittel
wird durch den Fachmann in der Technik leicht zu bestimmen sein.
Zum Beispiel kann man von 1 : 1 bis etwa 1 : 50 Verbindungen der
Erfindung : zweites therapeutisches Mittel verwenden. In einer weiteren Ausführungsform
kann man von 1 : 1 bis etwa 1 : 30 Verbindungen der Erfindung :
zweites therapeutisches Mittel verwenden. In einer weiteren Ausführungsform
kann man von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 20 Verbindungen der Erfindung
: zweites therapeutisches Mittel verwenden. In einer weiteren Ausführungsform
kann man von 1 : 1 bis etwa 1 : 15 Verbindungen der Erfindung :
zweites therapeutisches Mittel verwenden. In einer weiteren Ausführungsform
kann man von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 10 Verbindungen der Erfindung
: zweites therapeutisches Mittel verwenden. In einer weiteren Ausführungsform
kann man von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 5 Verbindungen der Erfindung
: zweites therapeutisches Mittel verwenden. In einer weiteren Ausführungsform
kann man von 1 : 1 bis etwa 1 : 3 Verbindungen der Erfindung : zweites
therapeutisches Mittel verwenden. Wenn ein weiteres therapeutisches
Mittel zugegeben wird, werden die Verhältnisse dementsprechend eingestellt.
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Die Verbindungen der vorliegenden
Erfindung können
wie folgt hergestellt werden.
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Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt,
um verschiedene Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung zu veranschaulichen und sollen nicht
als begrenzend für
den Bereich ausgelegt werden.
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Die Zielverbindung kann gemäß dem obigen
Schema hergestellt werden:
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Schritt a: 2-Benzoyloxy-acetaldehyd
1 wird umgesetzt mit Methyl (R-(+)-2,2-Dimethyl-1,3-dioxolan-4-carboxylat 2
in der Gegenwart von para-Toluolsulfonsäure (pTSA)
unter Transketalisierung, um 2-Benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-carboxymethylester
3 als ein Gemisch von cis- und trans-Isomeren in einem Verhältnis von
3 : 1 unter Bevorzugung des cis-Isomers herzustellen.
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Schritt b: Der Carbonsäuremethylester
3 wurde selektiv unter Verwendung von Lithiumhydroxid hydrolysiert,
um die entsprechenden Säurederivate
4a und 4b zu ergeben. Das Gemisch wurde durch Blitzchromatographie
getrennt und jedes Isomer wurde weiter unabhängig verwendet.
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Schritt c: Die Carbonsäurefunktion
von 4a wurde dann in eine Acetoxyaustrittsgruppe durch Behandlung
mit Bleitetraacetat übergeführt.
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Schritt d: Das (2R)-2-Benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-acetoxy
4a wurde mit silyliertem 2-Amino-6-chlorpurin unter Verwendung von
Trimethylsilyltrifluormethylsulfonat (TMSTf) als Aktivator gekoppelt,
um ein Gemisch von cis- und trans-Isomeren der Nukleosidanaloga
6a und 6b in einem Verhältnis
von 1,2 : 1, unter Bevorzugung des cis-Isomers, zu ergeben. Das
Gemisch wurde durch Blitzchromatographie aufgetrennt und jedes Isomer
wurde unabhängig
weiter verwendet.
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Schritt e: Das (-)-(2R, 4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-chlorpurin-9'-yl)-1,3-dioxolan 6a wurde mit
Cyclopropylamin in Ethanol behandelt, um das entsprechende (-)-(2R,
4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylaminopurin-9'-yl)-1,3-dioxolan
7 in guter Ausbeute zu ergeben.
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Schritt f: Die Entfernung der Benzoylschutzgruppe
wurde durch Behandlung mit () -(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylaminopurin-9'-yl)-1,3-dioxolan 7 mit methanolischem
Ammoniak erreicht, um das gewünschte
Produkt (-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylaminopurin-9'-yl)-1,3-dioxolan A in guter
Ausbeute zu ergeben.
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Beispiel
1.
Methyl-2-(R,S)-benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-(R)-carboxylat
-
Zu einer Lösung von Methyl-2,3-O-isopropyliden-D-glycerat
(Fluka: Katalognr. 59449), (9,76 g, 60,9 mmol, 1 Äq.) und
Benzoyloxyacetaldehyd (10 g, 60,9 mmol, 1 Äq.) in Toluol (20 ml) wurde
bei 80°C
p-Toluolsulfonsäure
(460 mg, 2,4 mmol, 4 Mol-%) zugegeben. Der Reaktionskolben wurde
unter Vakuum für
eine Stunde gehalten und es wurde ein Destillat (80 bis 85°C) während dieser
Zeitdauer gesammelt. Der Rückstand
wurde dann auf RT gekühlt
und durch Säulenchromatographie
auf Silikagel unter Verwendung von Hexan/Ethylacetat als Eluent
gereinigt, um 13,2 g (81%) der Zielverbindung als ein Gemisch von
cis- und traps-Isomeren in einem Verhältnis von 3 : 1 zu erhalten.
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Cis-Isomer:
1N-NMR
(CDCl3): δ(ppm):
3,75 (s, 3H, CH
3);
4,15 (dd, 1H, C5-CH, 4,30 (dd, 1H, C5-CH); 4,5 (m, 2H, CH
2-O-CO-C6H5); 4,7 (m, 1H,
C4-CH);
5,4 (t, 1H, C2-CH);
7,45–8,1
(m, 5H, Ar-CH).
-
Trans-Isomer:
1H-NMR
(CDCl3): δ(ppm):
3,8 (s, 3H, CH
3);
4,1 (dd, 1H, C5-CH); 4,35 (dd, 1H, C5-CH); 4,45 (m, 2H, CH
2-O-CO-C6H5); 4,75 (m, 1H,
C4-CH);
5,5 (t, 1H, C2-CH);
7,45–8,1
(m, 5H, Ar-CH).
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BEISPIEL
2
(2R, 4R)-2-Benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-carbonsäure.
(2S,
4R)-2-Benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-carbonsäure.
-
Zu einer Lösung von Methyl-2-(R,S)-benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-(R)-carboxylat (411 g,
1,54 mmol, 1 Äq.,
2 : 1-Gemisch von cis- und traps-Isomeren) in einem 1 : 1-Gemisch
aus THF und Wasser wurde Lithiumhydroxid (64,8 g, 1,54 mol, 1 Äq.) portionsweise über eine
Dauer von 30 min. zugegeben, wobei die Reaktionsgefäßtemperatur
unter 30°C
gehalten wurde. Nach 90 min. wurde THF im Vakuum entfernt und die wässrige Lösung wurde
auf einen pH-Wert von 2,5-3,2
durch tropfenweise Zugabe von 30%-iger (Gew/Gew) Schwefelsäure angesäuert. Die
resultierende Lösung
wurde mit Dichlormethan (4 × 400
ml) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat
getrocknet und konzentriert, um 380 g dunkles Öl zu ergeben. Die Isomere wurden
durch Säulenchromatographie
auf Silikagel unter Verwendung von 2%-iger Essigsäure in Dichlormethan
getrennt, um 220 g des cis-Isomers (56,5%) und 116 g des traps-Isomers
(30%) zu erzeugen. Jedes der Isomere wurde unabhängig für den nächsten Schritt verwendet.
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Cis-Isomer:
(2R, 4R)-2-Benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-carbonsäure.
1H-NMR (CDCl3): δ (ppm): 4,2
(t, 1H, C5-H);
4,4 (m, 1H); 4,5 (m, 1H); 4,7 (m, 2H); 5,4 (t, 1H, C2-CH); 7,45–8,1 (m, 5H, Ar-CH); 7,2–8,0 (bs, 1H, COOH).
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Trans-Isomer:
(2S, 4R)-2-Benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-carbonsäure.
1H-NMR (CDCl3): δ(ppm): 4,15
(dd, 1H, C5-H);
4,4 (t, 1H, C5-H);
4,45 (m, 2H, CH
2-OCOC6H5); 4,8 (dd, 1H, C4-CH);
5,6 (t, 1H, C2-CH);
7,45–8,1
(m, 5H, Ar-CH); 8,3–8,8 (bs,
1H, COOH).
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BEISPIEL
3
(2R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(R,S)-acetoxy-1,3-dioxolan
-
Zu einer Lösung von (2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-1,3-dioxolan-4-carbonsäure (130
g, 0,515 mol, 1 Äq.)
und Pyridin (60 ml, 0,741 mol, 1,44 Äq) in Acetonitril wurde bei
4°C Bleitetraacetat
(Reinheit (Assay) 95%, 300 g, 0,678 mol, 1,25 Äq.) über eine Dauer von 20 min gegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde unter Rühren für 18 Stunden bei RT gehalten.
Die anorganischen Bestandteile wurden durch Filtration entfernt,
das Filtrat wurde auf eine gesättigte
Lösung
von Natriumbicarbonat (2 l) gegeben, gefolgt von der Zugabe von
festem Natriumbicarbonat (pH-Wert = 7–8). Die organische Phase wurde
abgetrennt und die wässrige
Phase wurde mit Ethylacetat (3 × 400
ml) extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde konzentriert
und durch Säulenchromatographie
auf Silikagel unter Verwendung von Hexanen/Ethylacetat als Eluent
gereinigt, um 93,5 g (68%) der Zielverbindung als ein Gemisch von
cis- und trans-Isomeren in einem Verhältnis von 2 : 1 zu erhalten.
Das Gemisch wurde für
den nächsten
Schritt verwendet.
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Cis/trans-Isomere:
1H-NMR
(CDCl3): δ(ppm):
2,0, 2,15 (s, 3H, CH
3); 4,05–4,45
(m, 4H, CH); 5,45, 5,55 (t,
1H, C2-CH);
6,4, 6,45 (dd, 1H, C4-CH); 7,45–8,1 (m, 5H, Ar-CH).
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BEISPIEL
4.
(2R,4R)- und (2R,4S)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-chlorpurin-9'-yl)-1,3-dioxolan.
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2-Amino-6-chlorpurin (4,15 g, 1,3 Äq.) in 50
ml Hexamethyldisilazan (HMDS), enthaltend 100 mg Ammoniumsulfat,
wurde unter Rückfluss
für 3 h
erhitzt, wonach die klare Lösung
bis zur Trockene im Vakuum eingedampft wurde. Der Rückstand
wurde in 100 ml wasserfreiem 1,2-Dichlorethan gelöst. (2R)-2-Benzoyloxymethyl-4-acetoxy-1,3-dioxolan
(5 g) wurde durch zweimaliges Coverdampfen mit Benzol (2 × 30 ml)
getrocknet und in 100 ml wasserfreiem 1,2-Dichlorethan gelöst. Die Lösung wurde das Reaktionsgefäß übergeführt, das silylierte
2-Amino-6-chlorpurin-Lösung
enthielt. Das Gemisch wurde in einem auf 60°C vorgeheizten Ölbad für 15 Minuten
angeordnet, gefolgt von der Zugabe von Trimethylsilyltriflat (TMS-Tf,
3,8 ml, 1,1 Äq.).
Das Gemisch wurde unter Rückfluss
unter Stickstoff für
3 h erhitzt und die Lösung
wurde braun. TLC (Hex : EtOAc 7 : 3 für Zucker und Hex : EtOAc 1
: 4 für
Produkt) zeigte eine abgeschlossene Reaktion mit dem Verschwinden
von Zucker und dem Vorliegen von zwei gut getrennten Flecken für cis- und
trans-Produkt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur gekühlt, in
eine gesättigte
Natriumbicarbonatlösung
(100 ml) gegossen und für
10 Minuten gerührt.
Die organische Schicht wurde gesammelt und die wässrige Schicht wurde zweimal
mit Methylenchlorid (2 × 50
ml) extrahiert. Die vereinigte organische Lösung wurde mit Wasser, Salzlösung gewaschen
und über
MgSO4 auf herkömmliche Art getrocknet und
Lösungsmittel
wurde bis zur Trockene verdampft, um einen Schaum (7 g) zu ergeben.
H-NMR des Rohprodukts zeigte eine saubere Reaktion mit cis- und trans-Produkten
in einem Verhältnis
von 1,2 : 1 unter Bevorzugung des cis-Isomers. Das Rohprodukt wurde auf
Silikagel unter Verwendung eines Gradienten von Hexan : Ethylacetat
7 : 3, 1 : 1 und 2 : 3 als Eluent gereinigt, um 2,5 g trans-Isomer
(weniger polar, α-Anomer)
als ein Schaum, welcher in EtOH kristallisiert wurde, und 3 g cis-Isomer
(polarer, β-Anomer)
als ein Schaum, welcher in EtOH kristallisiert wurde, und 0,3 g
Gemisch aus cis und trans, wobei cis im Überschuss war als ein Schaum
für eine
Gesamtausbeute von 82% zu erhalten.
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Trans-Isomer:
(+)-(2R,4S)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-chlor-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
Rf:
0,40 (Hexan-EtOAc 3 : 7)
[αD] +21,16° (c
0,293 in CH2Cl2)
1H-NMR (CDCl3): δ(ppm): 4,45–4,55 (m,
4H; C5-H2, C2-CH2-OBz), 5,16
(b, 2H, NH2), 5,83 (t, 1H, C2-H,
J = 3,8 Hz), 6,39 (dd, 1H, C4-H), 7,45 (t,
2H, aromatisch), 7,62 (t, 1H, aromatisch), 7,92 (s, 1 H, C8'-8),
8,10 (d, 2H, aromatisch).
U. V.: (CH3OH) λmax:
312 nm
-
Cis-Isomer:
(-)-(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-chlor-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
Rf:
0,26 (Hexan-EtOAc 3 : 7)
[αD] –87,7° (c 0,2565
in CH2Cl2)
1H-NMR (CDCl3): δ(ppm): 4,25–4,33 dd,
1H, C5-H), 4,60–4,64
(m, 3H; C5-H und C2-CH2-OBz), 5,17 (b, 2H, NH2),
5,42 (t, 1H, C2-H, J = 3,5 Hz), 6,33 (dd,
1H, C4-H), 7,45 (t, 2H, aromatisch), 7,62
(t, 1H, aromatisch), 7,95 (d, 2H, aromatisch), 8,05 (s, 1H, C8'-8).
U.
V.: (CH3OH) λmax:
312 nm.
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BEISPIEL
5.
(-)-(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
-
Zu einer Lösung von (-)-(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-chlor-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan (600 mg) in Ethanol
(30 ml) wurde Cyclopropylamin (2 ml, = 18 Äq.) gegeben. Das Gemisch wurde
vorsichtig unter Rückfluss
(80–85°C) für 18 h erhitzt
und auf Raumtemperatur gekühlt.
Lösungsmittel
wurde zur Trockene im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in 100 ml Methylenchlorid
gelöst,
mit gesättigter
NaHCO3-Lösung,
Wasser, Salzlösung
gewaschen und über
MgSO4 getrocknet. Lösungsmittel wurde im Vakuum
entfernt und der Rückstand
wurde auf Silikagel unter Verwendung von EtOAc : MeOH als Eluent
gereinigt, um das gewünschte
Produkt als einen Schaum in 80% Ausbeute (506 mg) zu ergeben.
Rf:
0,26 (CH2Cl2 : McOH
95 : 5)
[αD] –67,7° (c 0,2565
in CH2Cl2)
1N-NMR (CDCl3): δ(ppm): 0,64–0,68 (m,
2H, CH2 von Cyclopropyl), 0,91–0,96 (m,
2H, CH2 von Cyclopropyl), 3,06 (b, 1H, CH
von Cyclopropyl), 4,27–4,30
(dd, 1H, C5-H), 4,54–4,57 (dd, 1H; C5-H)
4,60 (t, 2H, C2-CH2-OBz), 5,37
(b, 2H, NH2), 5,42 (t, 1 H, C2-H),
J = 3,5 Hz), 6,28 (b, 1H, NH), 6,35 (dd, 1H, C4-H),
7,45 (t, 2H, aromatisch), 7,58 (t, 1H, aromatisch), 7,77 (s, 1H,
C8'-8),
8,01 (d, 2H, aromatisch).
U. V.: (CH3OH)λmax:
283 und 260 nm.
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BEISPIEL
6.
(-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan (Verbindung
A)
-
Eine Lösung von (-)-(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclopropylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
(480 mg) in 30 ml gesättigtem
methanolischem Ammoniak wurde bei Raumtemperatur für 18 h gerührt. Das
Gemisch wurde bis zur Trockene im Vakuum eingedampft. Der Rückstand
wurde in 20 ml Wasser gelöst, zweimal
mit 10 ml Methylenchlorid gewaschen und lyophilisiert, um 283 mg
weißen
Feststoff in 80% Ausbeute zu ergeben.
Rf: 0,26 (CH2Cl2 : MeOH 9 : 1)
[αD] –35,9° (c 0,334
in MeOH)
1H-NMR (DMSOd-6): δ(ppm): 0,55
(m, 2H, CH2 von Cyclopropyl), 0,95 (m, 2H,
CH2 von Cyclopropyl), 3,15 (b, 1H, CH von
Cyclopropyl), 3,80 (m, 2H, CH2OH), 4,30
(dd, 1H, C5-H), 4,55 (dd, 1H; C5-H),
5,08 (t, 1H, C2-H), 5,17 (b, H, OH), 6,15
(b, 2H, NH2), 6,52 (dd, 1H, C4-H),
7,72 (b, 1H, NH), 8,12 (s, 1H, C8'-8).
U.
V.: (CH3OH) λmax:
283 und 260 nm.
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BEISPIEL
7.
(-)-(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclobutylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
-
Zu einer Lösung von (-)-(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-chlor-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan (250 mg) in Ethanol
(25 ml) wurde Cyclobutylamin (0,17 ml, = 3 Äq.) gegeben. Das Gemisch wurde
vorsichtig unter Rückfluss
(80–85°C) für 18 h erhitzt
und auf Raumtemperatur gekühlt.
Lösungsmittel
wurde bis zur Trockene im Vakuum verdampft. Der Rückstand
wurde in 100 ml Methylenchlorid gelöst, mit gesättigter NaHCO3-Lösung, Wasser,
Salzlösung
gewaschen und über
MgSO4 getrocknet. Lösungsmittel wurde im Vakuum
entfernt und der Rückstand
wurde auf Silikagel unter Verwendung von EtOAc : MeOH 95 : 5 als
Eluent gereinigt, um das gewünschte
Produkt als ein Schaum mit 84% Ausbeute (230 mg) zu ergeben.
Rf:
0,31 (CH2Cl2 : McOH
95 : 5)
[αD] –62,5° (c 0,4925
in CH2Cl2)
1H-NMR (CDCl3): δ(ppm): 1,74–1,78 (m,
2H, CH2 von Cyclobutyl), 1,95–2,00 (m,
2H, CH2 von Cyclobutyl), 2,43–2,45 (m,
2H, CH2 von Cyclobutyl), 4,27–4,30 (dd,
1H, C5-H), 4,54–4,57 (dd, 1H, C5-H),
4,59 (t, 2H, C2-CH2-OBz),
4,75 (b, 1H, CH von Cyclobutyl), 5,37 (b, 2H, NH2),
5,41 (t, 1H, C2-H, J = 3,6 Hz), 6,00 (b,
1H, NH), 6,35 (dd, 1H, C4-H), 7,45 (t, 2H,
aromatisch), 7,58 (t, 1H, aromatisch), 7,75 (s, 1H, C8'-8), 8,01 (d,
2H, aromatisch).
U. V.: CH3OH λmax:
283 und 263 nm.
-
Beispiel
8.
(-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'amino-6'-cyclobutylamino-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan (Verbindung
B)
-
Eine Lösung von (-)-(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-cyclobutylaminopurin-9'-yl)-1,3-dioxolan
(214 mg) in 20 ml gesättigtem
methanolischem Ammoniak wurde bei Raumtemperatur für 18 h gerührt. Das
Gemisch wurde bis zur Trockene im Vakuum eingedampft. Der Rückstand
wurde in 20 ml Wasser gelöst, zweimal
mit 10 ml Ether gewaschen und bis zur Trockene unter Coverdampfung
mit Ethanol eingedampft, um 154 mg reines Produkt als ein Schaum
in 96% Ausbeute zu erhalten.
Rf: 0,52 (CH2Cl2 : MeOH 9 : 1)
[αD] –29,04° (c 0,396
in MeOH)
1N-NMR (DMSOd-6): δ(ppm): 1,61
(m, 2H, CH2 von Cyclobutyl), 2,06 (m, 2H,
CH2 von Cyclobutyl), 2,18 (m, 2H, CH2 von Cyclobutyl), 3,58 (m, 2H, CH2OH), 4,17 (dd, 1H, C5-H),
4,40 (dd, 1H, C5-H), 4,90 (b, 1H, CH von
Cyclobutyl), 5,01 (t, 1H, C2-H), 5,42 (b,
H, OH), 5,87 (b, 2H, NH2), 6,19 (dd, 1H,
C4-H), 7,62 (b, 1H, NH), 7,85 (s, 1H. C8'-8).
U.
V.: (CH3OH) λmax:
283 und 260 nm.
-
BEISPIEL
9.
(-)-(2R,4R)-2-Hydroxymethyl-4-(2'-amino-6'-{1-carbonsäurecyclopropylamino}-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan
(Verbindung C)
-
Zu einer Lösung von (-)-(2R,4R)-2-Benzoyloxymethyl-4-(2'-amino-6'-chlor-purin-9'-yl)-1,3-dioxolan (210 mg) in Ethanol
(30 ml) wurde 1-Amino-2-cyclopropancarbonsäure (113
mg = 2 Äq.)
und Triethylamin (0,2 ml, 2,5 Äq.)
gegeben. Das Gemisch wurde vorsichtig unter Rückfluss (80 bis 85°C) für 72 h erhitzt
und auf Raumtemperatur gekühlt.
Lösungsmittel
wurde bis zur Trockene im Vakuum verdampft. Der Rückstand
wurde in methanolischem Ammoniak (20 ml) gelöst und über Nacht gerührt. Lösungsmittel
wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde auf Silikagel
unter Verwendung eines Gradienten von CH2Cl2 : MeOH 95 : 5 bis 9 : 1 gereinigt, um Nebenprodukt
zu entfernen und letztendlich wurde das gewünschte Produkt mit CH2Cl2 : MeOH 4 : 1,
enthaltend 0,5 Essigsäure,
eluiert. Es ergaben sich 80 mg reines Produkt (42,5% Ausbeute).
Rf:
0,34 (CH2Cl2 : MeOH
4 : 1, enthaltend 0,5% AcOH)
1H-NMR
(DMSOd6): δ(ppm): 1,05 (b, 2H, CH2 von Cyclopropyl), 1,45 (b, 2H, CH2 von Cyclopropyl), 3,58 (b, 2H, CH2-OH), 4,17 (dd, 1H, C5-H),
4,41 (dd, 1H; C5-H), 5,12 (t, 1H, C2-H), 5,15 (b, 1H, OH), 5,82 (b, 1H, NH),
6,19 (dd, 1H, C4-H), 7,71 (b, H, NH), 7,86
(s, 1 H, C8'-8).
U.
V.: (CH3OH) λmax 283
und 264 nm.
-
BEISPIEL 10.
-
ANTI-HIV-WIRKSAMKEIT
-
ANTIVIRUS ASSAYS. Die Anti-HIV-1-Wirkung
der Verbindung A(-) wurde unter Verwendung von HIV-1IIIB in
mehreren Zelltypen untersucht, wie früher beschrieben (Gu et al.,
1992, 1994, 1999; Rando et al., 1995; Salomon et al., 1994). Kurz
gesagt, wurden Zellen mit Virus mit einer Infektionsmultiplizität (MOI)
von 0,005 für
T-Zellen-Assays und einem MOI von 0,5 für Monozytenzellen-Assays für 3 h inkubiert.
Ungebundener Virus wurde dann durch Waschen der Zellen entfernt,
gefolgt von einem Aussäen
der Zellen in eine Platte mit 96 Vertiefungen. Die infizierten Zellen
wurden in der Gegenwart mehrerer Konzentrationen der Testverbindung für 5 bis
7 Tage gezüchtet.
Die Anti-HIV-1-Wirksamkeit
wurde durch Testen der HIV-1 RT Aktivität oder des p24-Gehalts in den
Zellkulturüberständen bestimmt.
Alle Assays wurden zweifach durchgeführt. Zidovudine und/oder Lamivudine
wurden als Kontrollen in jedem Versuch verwendet.
-
Vergleich der Verbindung A(-) mit
anerkannten Anti-HIV-Mitteln. Die Verbindung A(-) wies 0,083 μm EC50 gegen HIV-1IIIB in
MT-2-Zellen auf, was dem gleichen Grad Anti-HIV-1-Aktivität entspricht
wie Lamivudine, Stavudine, Zalcitabine und Abacavir, jedoch weniger
Aktivität
als Zidovudine (Tabelle 1).
-
Tabelle
1. Vergleich der Anti-HIV- Aktivität der Verbindung A(-) mit anerkannten
antiretroviralen Mitteln (bestimmt durch RT-Aktivität)
-
Aktivität der Verbindung A(-) gegen
HIV-1 in verschiedenen Zellen. Anti-HIV-1- Aktivität der Verbindung A(-) wurde
in verschiedenen Zelltypen getestet, einschließlich humanen periphären Monozytenzellen (PBMC),
T-Zell- (MT-2 und MT-4) und Monozytenzell-(U937)-Linien. Die Verbindung
A(-) hatte submikromolare EC50 gegen HIV-1IIIB in verschiedenen getesteten Zelltypen
(Tabelle 2).
-
Tabelle
2. Anti-HIV-1-Wirksamkeit der Verbindung A(-) in verschiedenen Zelltypen
(bestimmt durch RT-Aktivität).
-
-
Darüber hinaus wurde die antiretrovirale
Aktivität
der Verbindung A(-) ebenfalls unter Verwendung verschiedener Typen
von HIV-1-Stämmen
beurteilt. Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigten, dass Verbindung
A(-) wirksam gegen Nicht-Syncytium-induzierende
(HIV-1-9881)-, dual-tropische (HIV-1macBAL) und monocytropische (HIV-1WRM8488)-Stämme waren.
-
Tabelle
3. Anti-HIV- Aktivität
der Verbindung A(-) gegen verschiedene Typen von HIV-Stämmen (bestimmt durch
p24)
-
Beispiel 11.
-
TOXIZITÄTSBEURTEILUNG
-
Die Zelltoxizität der Verbindungen wurde an
verschiedenen Zellen unter Verwendung der [3H]-Thyimdin-Aufnahme
beurteilt. Verschiedene Zellen, einschließlich Molt-4, HT1080, DU-145,
HepG-2 und HSF wurden in einer Konzentration von 1–2 × 103 Zellen pro Vertiefung (Platten mit 96 Vertiefungen)
plattiert. Nach 24 h Inkubationsdauer wurden 10-fach-Verdünnungsreihen
der Verbindungen (10–4 M bis 10–10 M)
zu dem Kulturmedium gegeben und die Zellen wurden weiter für 72 h inkubiert.
[3H]-Thymidin wurde während der letzten 18 h Inkubationsdauer
zugegeben. Nach Inkubation mit dem [3H]-Thymidin
wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen, mit Trypsin behandelt
wenn die Zellen klebrig waren und dann in Wasser resuspendiert (hypotonisches
Lysieren von Zellen). Der Zellextrakt wurde direkt in einen Tomtec
Harvester 96 übergeführt. Unter Verwendung
dieses Geräts
wird die extrahierte DNA auf Filter adsorbiert, gewaschen und das
eingebaute [3H]-Thymidin wird dann gezählt. Die
50%-Cytotoxizitätskonzentration
(CC50) wurde durch Vergleich der Radioaktivitätszählungen
pro Minute der Proben in der Gegenwart der Verbindungen gegenüber der
Kontrolle bestimmt.
-
Die Zelltoxizität der Verbindungen wurde auch
mit WST-1-Färben
durch Beurteilen der Proliferation von MT-2, H9, Jurkat, U937 und
CBMCs bestimmt. Die etablierten Zelllinien wurden in RPMI-Medium
in Platten mit 96 Vertiefungen bei einer Dichte von 5 × 104 Zellen/Vertiefung gezüchtet, während CBMCs in einer Konzentration
von 0,05 × 106/Vertiefung plattiert wurden. Eine 10-fach-Reihenverdünnung der
Verbindung (10–4–10–7 M)
wurde am Tag Null zugegeben. Am Tag 4 wurden die Zellen passagiert
durch Austauschen des Halbmediums, das geeignet verdünnte Verbindung
enthielt. Die Zellaktivitäten
wurden am Tag 7 unter Verwendung des WST-1-Reagenz (Boehringer Mannheim)
unter Befolgung des vom Hersteller bereitgestellten Protokolls beurteilt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben.
-
-
Beispiel 12
-
VORBEREITENDE PHARMAKOKINETISCHE
UNTERSUCHUNGEN
-
Die Bioverfügbarkeit der Verbindungen wurde
in männlichen
erwachsenen Ratten beurteilt, die eine Dosis intravenös über die
Schwanzvene (5 mg/kg) und oral (20 mg/kg) zugeführt bekamen. Die Plasmaproben wurden
2, 5, 15, 30, 60, 90, 120 und 240 Minuten nach intravenösem Zudosieren
und 5, 15, 30, 60, 90, 120, 240 und 360 Minuten nach oralem Zudosieren
gesammelt.
-
Experimentelle Verfahren
-
Plasmaherstellung
-
Blutproben (1 ml) wurden aus den
Rattenschwänzen
in einem EDTAenthaltenden (3 ml) Vakuumbehältnis (Vacutainer) sowohl für iv- als
auch po-Verabreichungen
gesammelt. Plasmaproben wurden durch Zentrifugieren bei 2000 × g für 15 Minuten
bei 4°C
hergestellt.
-
HPLC-Analyse
-
Analytische Bedingungen:
-
- HPLC-System: Zwei Waters 616 Pumpensysteme und zwei Alliance
2690 Systeme mit PDA 996,
- Säule:
Phenomenex Luna C18 (2), 5 μm,
250·4,6
mm,
- Gradient: 0–35%
Lösungsmittel
A in 20 Minuten. Lösungsmittel
A enthält
Acetonitril mit 0,01% TFA und Lösungsmittel
B enthält
Millipore Wasser (0,25 μm
Filter) mit 0,01% TFA,
- Flussrate: 1,0 ml/min, UV: 200 bis 350 nm.
-
Festphasenextraktion:
-
Plasmaproben (verdünnt auf
1 ml mit Wasser) wurden auf das Abselut Nexus Sorbens (Nr. 1210–3100) aufgebracht
und unter geringem Vakuum (ungefähr
5 Zoll Hg oder 16,93 kPa) durchgezogen. Ein Milliliter entionisiertes
Wasser wurde zu dem Sorbens zugegeben und unter Vakuum durchgezogen.
Die Extraktionssäule
wurde für
1 Minute unter Verwendung eines Hochvakuums (> 10 mmHg oder 33,86 kPa) getrocknet. Ein
Milliliter Methanol wurde zu der Abselut Nexus Säule gegeben und der Eluent
wurde mit 1 bis 2 ml/min gesammelt. Der Eluent wurde bis zur Trockene
unter Verwendung eines Speed Vac eingedampft und die Proben wurden
in 120 μl
H2O rekonstituiert; 100 μl wurden zur Injektion verwendet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben.
-
Tabelle
5. PK und orale Bioverfügbarkeit
(BA)
-
BEISPIEL 14
-
ARZNEIMITTELRESISTENZPROFILE
DER VERBINDUNG A(-)
-
Rekombinante HIV-1-Varianten wurden
hergestellt durch Einbringen der angegebenen Mutationen in HXB2-D
durch ortsspezifische Mutagenese, wie beschrieben (Gu et al. 1992,
1994). Die Virusausgangsmaterialien (virus stocks) wurden durch
Transfizieren von MT-4-Zellen mit infektiösen viralen DNA-Konstrukten hergestellt.
Antivirale Aktivität
der Verbindung A(-) wurde wie in Beispiel 10 beschrieben, bestimmt.
Die Verbindung A(-) zeigte leicht erniedrigte Aktivität gegen
HIV-1-Varianten, die K65R- und/oder M184V-Mutation in der reversen
Transkriptase aufweisen, blieben jedoch wirksam gegenüber anderen
Varianten, die resistent gegenüber
Zidovudine, Nicht-nukleosidische Inhibitoren und Proteaseinhibitoren
waren (Tabelle 6).
-
Tabelle
6. Wirksamkeit der Verbindung A(-) gegenüber rekombinanten Arzneimittel-resistenten
HIV-1-Varianten (bestimmt durch RT-Aktivität)
-
BEISPIEL 15
-
WIRKSAMKEIT DER VERBINDUNG
A(-) GEGEN KLINISCHE HIV-1-ISOLATE.
-
Klinische Stämme wurden aus PBMCs von HIV-1
infizierten Individuen durch Co-Kultur
mit PBMCs aus normalen Donoren isoliert. Um den RT-Genotyp der klinischen
HIV-1-Isolate zu bestimmen, wurde die provirale DNA aus infizierten
CD4* T-Zellen oder PBMCs extrahiert und die kompletten RT-codierenden
Regionen wurden durch PCR, wie früher berichtet (Gu et al., 1992)
amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und dann direkt unter
Verwendung von Primer RTS (5'-CCAAAAGTTAAACAATGGC-3') sequenziert, welcher
am 5'-Teil der RT-codierenden Region
lokalisiert ist (Nukleotid 2603–2621
von HXB2-D-Koordinaten).
Antivirale Aktivität
wurde wie in Beispiel 10 beschrieben, beurteilt.
-
Tabelle
7. Aktivität
der Verbindung A(-) gegen klinische HIV-1-Isolate (bestimmt durch
RT-Aktivität).
-
Tabelle
B. Aktivität
der Verbindung A(-) gegen Arzneimittel-resistente klinische Isolate
in PBMCs (bestimmt durch p24)
-
BEISPIEL 16.
-
ARZNEIMITTELKOMBINATIONSWIRKUNGEN
-
Kombinationswirkungen der Vebindung
A(-) mit Anti-HIV-1-Mitteln wurden in MT-2 oder PBMCs unter Verwendung von HIV-1IIIB beurteilt. Die Kombinationen wurden
durchgeführt
unter Verwendung eines Damebrett-Kreuzmusters von Arzneimittelkonzentrationen.
Die antiviralen Wirkungen wurden bestimmt durch Beobachten der RT-Aktivität in den
Kulturüberständen. Die
Daten wurden gemäß dem von
Chou und Talalay (Chou und Talalay, 1984) und Prichard (Prichard
et al., 1993) beschriebenen Verfahren analysiert. Die Kombinationsindizies
(CI) der Verbindung A(-)M mit anderen Anti-HIV-1-Mitteln wurden
unter Verwendung einer CalcuSyn-Software (Biosoft, Cambridge, UK)
berechnet. Theoretisch zeigt ein CI-Wert von 1 eine Additivwirkung,
ein CI-Wert von > 1
zeigt Antagonismus und ein CI-Wert von < 1 zeigt Synergismus. AcSynergy II
Software wurde verwendet, um Synergie- oder Antagonist-Ausmaße für die Arzneimittelkombination
zu berechnen.
-
Tabelle
9. Kombinationswirkung von Verbindung A(-) und Zidovudine in MT-2-Zellen
-
Tabelle
10. Kombinationswirkung von Verbindung A(-) und AZT (Zidovudine)
in PBMCs
-
Tabelle
11. Kombinationswirkung von Verbindung A(-) und (Lamivudine) in
MT-2-Zellen
-
Tabelle
12. Kombinationswirkung von Verbindung A(-) und Stavudine (d4T)
in MT-2-Zellen
-
Tabelle
13. Kombinationswirkung von Verbindung A(-) und Nevirapine in MT-2-Zellen
-
BEISPIEL 17.
-
ZYTOTOXIZITÄTSANALYSE
-
Zelltoxizität wurde durch [3H]Thymidinaufnahme
(de Muys et al., 1999) und WST-1-Färben beurteilt. In
den [3H]Thymidinaufnahmeversuchen wurden
Molt-4, HT1080, DU-145, HepG2 und HSF in einer Konzentration von
1–2 × 103 Zellen pro Vertiefung (Platte mit 96 Vertiefungen)
plattiert. PHA-stimulierte PBMCs wurden in einer Konzentration von
4 × 104 Zellen pro Vertiefung gezüchtet. Nachfolgend
auf eine 24 h Vorinkubationsperiode wurden Testverbindungen (10–4 M
bis 10–10 M)
zugegeben und die Zellen wurden für zusätzliche 72 h inkubiert. [3H]Thymidin wurde während der letzten 18 h Inkubationsperiode
zugegeben. Die Zellen wurden dann einmal mit PBS gewaschen, mit
Trypsin behandelt, falls die Zellen anhaftend waren, und in Wasser
resuspendiert (hypotonisches Lysieren von Zellen). Der Zellextrakt
wurde direkt in einen Tomtec Harvester 96 gegeben. Die 50%-Zytotoxizitätskonzentration
(CC50) wurde durch Vergleichen der Radioaktivitätszählungen pro
Minute, die von Arzneimittelgetesteten Proben erhalten wurden, mit
denjenigen, die von den Kontroll(unbehandelten) Zellen erhalten
wurden, bestimmt.
-
In den WST-1-Färbeversuchen wurden Zelllinien
in RPMI-Mediumplatten mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 5 × 104 Zellen/Vertiefung gezüchtet bzw. kultiviert. CBMs
wurden in einer Konzentration von 0,5 × 106/Vertiefung
platiert. Verbindungen (10–4–10–7 M)
wurden am Tag null zugegeben. Zelllebensfähigkeit wurde am Tag 7 unter
Verwendung des WST-1-Reagenz (Boehringer Mannheim) unter Befolgung
des vom Hersteller bereitgestellten Protokolls beurteilt.
-
Die Verbindung A(-) hatte viel weniger
Zytotoxizität
als Zidovudine und Zalcitabine in den verschiedenen Zelltypen, die
sowohl durch [3H]Thymidineinbau als auch
WST-1-Färben
beurteilt wurden (Tabelle 14).
-
Tabelle
14. Zytotoxizität
der Verbindung A(-)
-
BEISPIEL 18.
-
MITOCHONDRIEN-DNA-TOXIZITÄTS-ASSAY
-
Mitochondrien-DNA(mtDNA)-Toxizität der Verbindung
A(-) wurde in HepG2-Zellen
getestet. Die Zellen wurden für
28 Tage unter der Verbindungsbehandlung gezüchtet. Die Zellen wurden einmal
pro Woche passagiert. Jedoch das Zellkulturmedium, das die richtige
Konzentration der Verbindung enthielt, wurde zweimal pro Woche gewechselt.
Zalcitabine wurde als eine Kontrolle verwendet. Die Toxizität wurde
durch Messen des Gehaltsverhältnisses
von mtDNA und Kern-DNA (28s rDNA) durch einen Southern Hybridisierungsassay
(de Muys et al., 1999) bestimmt. Die Verbindung A(-) zeigte keine
signifikante mtDNA-Toxizität bis zur
höchsten getesteten
Konzentration von 100 μm
(1).
-
BEISPIEL 19.
-
PHARMAKOKINETISCHE
UNTERSUCHUNG DER VERBINDUNGEN DER ERFINDUNG
-
Verbindung A(-), DAPD und DXG wurden
als eine Einzeldosis verabreicht, entweder intravenös durch die
Drosselvene mit 10 mg/kg oder oral mit 20, 125, 500, 1000 oder 2000
mg/kg. Alle Ratten wurden für
12 Stunden vor der po-Dosierungsbehandlung
nüchtern
gehalten. Das sowohl für
iv- als auch po-Verabreichungen
verwendete Vehikel war 0,1% Carboxymethylcellulose und 0,1 % Tween[Marke]
80 in destilliertem Wasser, angesäuert auf einen pH-Wert von
3,15 mit 1 N HCl. Blutproben wurden den Ratten zu den in unten angegebenem
Schema für
alle oralen Dosen entnommen. Für
insgesamt 10 Ratten für
jede Verabreichung wurden sieben Zeitpunkte für die intravenöse Dosierung
durch die Drosselvene (2, 5, 15, 30, 60, 120 und 240 min) und für die orale
Dosierung (5-360
min) mit 20 mg/kg verwendet, während
zwei zusätzliche
Zeitpunkte bei 480 und 1440 Minuten für die oralen Dosen von 125
bis 2000 mg/kg verwendet wurden. Für jeden Zeitpunkt lagen 4 Ergebnisse
vor, ausgenommen für
den Zeitpunkt von 1440 Minuten als Blutproben durch die Drosselvene von
allen Raten vor dem Opfern entnommen wurden.
-
-
Experimentelle Verfahren
-
Plasmaherstellung
-
Blutproben (1 ml) wurden aus den
Rattenschwänzen
in einem Vakuumbehälter
mit EDTA (3 ml) gesammelt, sowohl für iv- als auch po-Verabreichungen.
Plasmaproben wurden durch Zentrifugieren bei 2000 × g für 15 Minuten
bei 4°C
hergestellt.
-
HPLC-Analyse
-
Analytische Bedingungen:
-
- HPLC-System: Zwei Waters 616 Pumpensysteme und zwei Alliance
2690 Systeme mit PDA 996,
- Säule:
Phenomenex Luna C18 (2), 5 μm,
250·4,6
mm,
- Gradient: 0–35%
Lösungsmittel
A in 20 Minuten. Lösungsmittel
A enthält
Acetonitril mit 0,01% TFA und Lösungsmittel
B enthält
Millipore Wasser (0,25 μm
Filter) mit 0,01% TFA,
- Flussrate: 1,0 ml/min, UV: 200 bis 350 nm.
-
Festphasenextraktion:
-
Plasmaproben (verdünnt auf
1 ml mit Wasser) wurden auf das Abselut Nexus Sorbens (Nr. 1210–3100) aufgebracht
und unter geringem Vakuum (ungefähr
5 Zoll Hg) durchgezogen. Ein Milliliter entionisiertes Wasser wurde
zu dem Sorbens zugegeben und unter Vakuum durchgezogen. Die Extraktionssäule wurde
für 1 Minute
unter Verwendung eines Hochvakuums (> 10 Zoll Hg oder 33,86 kPa) getrocknet.
Ein Milliliter Methanol wurde zu der Abselut Nexus Säule gegeben
und der Eluent wurde mit 1 bis 2 ml/min gesammelt. Der Eluent wurde
bis zur Trockene unter Verwendung eines Speed Vac eingedampft und
die Proben wurden in 120 μl
H2O rekonstituiert; 100 μl wurden zur Injektion verwendet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 und 16 angegeben.
-
Tabelle
15: PK-Parameter für
Verbindung A(-) nachfolgend auf iv- (10 mg/kg) oder po- (20 mg/kg)
Verbreichung in Ratten
-
Tabelle
16 PharmaKokinetische Parameter von DAPD & DXG in männlichen und weiblichen Ratten
nach iv- oder po-Verabreichung von DAPD
-
Unten sind die vollständigen Literaturstellen,
die in der Anmeldung zitiert werden, aufgeführt:
- 1
De Muys, J. -M., H. Gourdeau, N. Nguyen-Ba, D. T. Taylor, P. S.
Ahmed, T. Mansour, C. Locas, N. Richard, M. A. Wainberg und R. F.
Rando. 1999. Antihuman immunodeficiency virus type 1 activity, intracellular
metabolism, and pharmacokinetic evaluation of 2'-deoxy-3'-oxa-4'-thiocytidine. Antimicrob. Agents Chemother. 43:
1835–1844.
- 2 Gu, Z., Q. Gao, M. A. Parniak, and M. A. Wainberg. 1992. Novel
mutation in the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase
gene that encodes cross-resistance to 2',3'-dideoxyinosine
and 2',3'-dideoxycytidine.
J. Virol. 66: 12–19.
- 3 Gu, Z., Q. Gao, H. Fang, N. Salomon, M. A. Parniak, E. Goldberg,
J. Cameron, and M. A. Wainberg. 1994a. Identification of a mutation
at codon 65 in the IKKK motif of reverse transcriptase that encode
human immunodeficiency virus resistance to 2',3'-dideoxycytidine
and 2',3'-dideoxy-3'-thiacytidine. Antimicrob. Agents Chemother.
38: 275–281.
- 4 Gu, Z., M. A. Wainberg, N. Nguyen-Ba, L. L'Heureux, J. -M. De Muys, T. L. Bowlin,
and R. F. Rando. 1999. Mechanism of action and in vitro activity
of 1',3'-dioxolanylpurine
nucleoside analogues against sensitive and drugresistant human immunodeficiency
virus type 1 variants. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 43:
2376–2382.
- 5 Chou, T. C., and p Talalay. 1984. Quantitative analysis of
dose effect relationships : the combined effects of multiple drugs
or enzyme inhibitors. Adv. Enzyme Regul. 22: 27–55.
- 6 Prichard, M. N., L. E. Prichard, and C. Shipman, Jr. 1993.
Strategic design and three-dimentional analysis of antiviral drug
combinations. Antimicrob. Agents Chenmother. 37: 540–545.
- 7 Rando, R., J. Ojwang, A. Elbaggari, G. R. Reyes, R. Tinder,
M. S. McGrath, and M. E. Hogan. 1995. Suppression of human immunodeficiency
virus type 1 activity in vivo by oligonucleotide which form intramolecular
tetrads. J. Biol. Chem. 270: 1754–1760.
- 8 Salomon, H., A. Belmonte, K. Nguyen, Z. Gu, M. Gelfand and
M. A. Wainberg. 1994. Comparison of cord blood and peripheral blood
mononuclear cells as targets for viral isolation and drug sensitivity
studies involving human immunodeficiency virus type 1. J. Clin.
Microbiol. 32: 2000-2002.