DE60012961T2 - Kombinationen von lamivudin und entecavir für behandlung der hepatitis b virus infektion - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft therapeutische Kombinationen, die (2R,cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-pyrimidin-2-on (Lamivudin) und BMS-200475 (Entecavir), ein Cyclopentylguanosin-Analog, umfassen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Kombinationen enthalten, und ihre Verwendung in der Behandlung von antiviralen Infektionen, wie HBV-Infektionen, spezifisch HBV-Infektionen, die Infektionen mit HBV-Mutanten einschließen, die eine Resistenz gegen Nukleosid- und/oder Nicht-Nukleosid-Inhibitoren der Vervielfältigung des Hepatitis B-Virus tragen.
  • Hepatitis B ist eine Viruserkrankung, die oral oder parenteral durch kontaminiertes Material, wie Blut oder Blutprodukte, kontaminierte Nadeln, geschlechtlich und vertikal von infizierten oder Trägermüttern auf ihre Nachkommen übertragen wird. In denjenigen Gebieten der Erde, in denen die Krankheit häufig ist, führt die vertikale Übertragung in einem frühen Alter zu einem hohen Anteil infizierter Individuen, die chronische Träger von Hepatitis B werden. Schätzungsweise 350 Millionen Menschen weltweit sind chronisch mit Hepatitis B infiziert, und so viele wie 150 Millionen mögen an Lebererkrankung in Abwesenheit eines Eingriffs sterben.
  • Derzeit ist der einzige etablierte Ansatz zur Behandlung von Hepatitis B die wiederholte Injektion von Interferon, was mit unangenehmen Nebenwirkungen verbunden sein kann und eine langandauernde Reaktion bei nur einem Drittel oder weniger der behandelten Personen erzeugt. Interferon ist ein Immunmodulator, der zur Steigerung der Fähigkeit des Immunsystems zur Krankheitsbekämpfung entwickelt wurde.
  • Es wurde berichtet, daß Lamivudin in einer zweijährigen Studie gegen HBV wirksam war, wodurch gezeigt wurde, daß die meisten Patienten substantiell reduzierte Werte der viralen Vermehrung zeigten, wobei 52 % nicht-nachweisbare Mengen von Virus bis zum Ende des zweiten Jahres beibehielten. Lamivudin wurde zur Behandlung von HBV in den Hauptmärkten unter der Marke ZEFFIXTM, HEPTODINTM oder EPIVIR-HBVTM eingeführt.
  • Die Struktur von BMS-200475 ist wie in Formel (I) gezeigt:
  • Figure 00020001
  • Es wurde berichtet, das BMS-200475 Anti-HBV-Aktivität in vitro besitzt. "Metabolic Studies on BMS-200475, a New Antiviral Compound with Activity Against Hepatitis B Virus", G. Yasmanaka et al., 36. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 15.–18. September 1996, New Orleans, Louisiana. Orales BMS-200475 hat sich ebenfalls als wirksam gegen das Hepatitis B-Virus in Murmeltieren erwiesen. Sicherheit und Pharmakokinetik von BMS-200475 wurden sowohl in Einzeldosis- als auch 14-tägigen Mehrfachdosisstudien untersucht. Zusammenfassung 01, D. DeHertogh et al., Second International Conference on Therapies for Viral Hepatitis, Kona, Big Island, Hawaii, 15.–19. Dezember 1997.
  • Die Verwendung von Kombinationen der Erfindung kann zu einer äquivalenten antiviralen Wirkung bei reduzierter Toxizität oder einer Erhöhung der Wirkstoffwirksamkeit führen, weil ein Synergismus zwischen den Verbindungen auftritt. Niedrigere Wirkstoff-Gesamtdosen werden ebenfalls möglicherweise die Häufigkeit des Auftretens von arzneistoffresistenten Varianten von HBV reduzieren.
  • Wir haben jetzt gefunden, daß Lamivudin unerwartete Vorteil aufweist, wenn es in Kombination mit BMS-200475 verwendet wird. Insbesondere zeigt die Kombination eine statistisch signifikante synergistische Anti-HBV-Wirkung. Es ist ein Merkmal dieser Erfindung, daß die Verwendung dieser Wirkstoffkombination synergistische antivirale Wirkungen, eine vollständigere virale Unterdrückung und eine virale Unterdrückung über längere Zeiträume bereitstellen kann, das Auftreten von arzneistoffresistenten HBV-Mutanten einschränken und eine bessere Behandlung von arzneistoffbezogenen Toxizitäten erlauben kann. Die Verwendung dieser Wirkstoffkombination kann ebenfalls zu einer Abnahme der Anzahl von z.B. pro Tag verabreichten Tabletten führen und mag deshalb die Therapietreue des Patienten erhöhen.
  • Wie die Fachleute einsehen werden, erstrecken sich Verweise auf die Behandlung hier auf die Prophylaxe sowie auf die Behandlung etablierter Infektionen und Symptome.
  • Pharamzeutisch akzeptable Salze von Lamivudin und BMS-200475 schließen diejenigen ein, die aus pharmazeutisch akzeptablen anorganischen und organischen Säuren stammen. Beispiele für geeignete Säuren schließen Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Perchlorsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Salicylsäure, Bernsteinsäure, Toluol-p-sulfonsäure, Weinsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Methansulfonsäure, Ameisensäure, Benzoesäure, Malonsäure, Naphthalin-2-sulfonsäure und Benzolsulfonsäure ein. Andere Säuren, wie Oxalsäure, obwohl sie selbst nicht pharmazeutisch akzeptabel sind, können nützlich in der Herstellung von Salzen sein, die nützlich als Zwischenstufen beim Erhalt von Verbindungen der Erfindung und ihren pharmazeutisch akzeptablen Säureadditionssalzen sind.
  • Aus geeigneten Basen stammende Salze schließen Alkalimetall- (z.B. Natrium), Erdalkalimetall- (z.B. Magnesium), Ammonium- und NR4 +-Salze (worin R C1-4-Alkyl ist) ein.
  • Bevorzugte Ester von Lamivudin und BMS-200475 werden unabhängig aus der folgenden Gruppe ausgewählt: (1) Carbonsäureester, in denen die Nicht-Carbonyl-Einheit des Carbonsäure-Anteils der Estergruppierung aus gerad- oder verzweigtkettigem Alkyl (z.B. Methyl, n-Propyl, t-Butyl oder n-Butyl), Cycloalkyl, Alkoxyalkyl (z.B. Methoxymethyl), Aralkyl (z.B. Benzyl), Aryloxyalkyl (z.B. Phenoxymethyl), Aryl (z.B. Phenyl, das gegebenenfalls mit z.B. Halogen, C1-4-Alkyl oder C1-4-Alkoxy substituiert ist) oder Amino ausgewählt ist; (2) Sulfonatester, wie Alkyl- oder Aralkylsulfonyl (z.B. Methansulfonyl); (3) Aminosäureester (z.B. L-Valyl oder L-Isoleucyl); und (4) Phosphonatester. In solchen Estern enthält, wenn nichts anderes angegeben ist, jede vorhandene Alkyl-Einheit vorteilhaft 1 bis 18 Kohlenstoffatome, insbesondere 1 bis 6 Kohlenstoffatome, ganz besonders 1 bis 4 Kohlenstoffatome. Jede in solchen Estern vorhandene Cycloalkyl-Einheit enthält vorteilhaft 3 bis 6 Kohlenstoffatome. Jede in solchen Estern vorhandene Aryl-Einheit umfaßt vorteilhaft eine Phenyl-Gruppe. Jeder Verweis auf eine der obigen Verbindungen schließt ebenfalls einen Verweis auf ein physiologisch akzeptables Salz davon ein.
  • Besonders bevorzugte Ester sind die Mono-, Di- und Triphosphatester von Lamivudin und BMS-200475 (von denen beide gegebenenfalls geblockt sein können) oder jede andere Verbindung, die bei Verabreichung an einen menschlichen Patienten den Mono-, Di- oder Triphosphatester (direkt oder indirekt) bereitstellen kann.
  • So stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt eine Kombination bereit, die (2R,cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-pyrimidin-2-on oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon und BMS-200475 oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon umfaßt. Kombinationen wie oben beschrieben können nachfolgend als erfindungsgemäße Kombinationen bezeichnet werden.
  • Wie hier verwendet, schließt ein "pharmazeutisch akzeptables Derivat" jedes (jeden) pharmazeutisch akzeptable(n) Salz, Ester oder Salz eines solchen Esters von Lamivudin, BMS-200475 oder jeder anderen Verbindung ein, die bei Verabreichung an den Empfänger eine solche Verbindung oder einen antiviral aktiven Metaboliten oder Rest davon (direkt oder indirekt) bereitstellen kann.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner erfindungsgemäße Kombinationen zur Verwendung in der Therapie bereit, insbesondere in der Behandlung einer HBV-Infektion, einschließlich Infektionen, die gegen Nukleosid- und/oder Nicht-Nukleosid-Inhibitoren für die Vervielfältigung des Hepatitis B-Virus resistent sind.
  • Gemäß einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Säugetiers, einschließlich Mensch, bereit, das an einer HBV-Infektion leidet, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Kombination.
  • Man wird einsehen, daß die Verbindungen der Kombination gleichzeitig, entweder in der gleichen oder einer unterschiedlichen pharmazeutischen Zusammensetzung, oder aufeinanderfolgend verabreicht werden können. Falls es eine aufeinanderfolgende Verabreichung gibt, sollte die Verzögerung in der Verabreichung des zweiten aktiven Bestandteils nicht derart sein, daß der Vorzug einer synergistischen therapeutischen Wirkung der Kombination der aktiven Bestandteile verlorengeht. Es wird ebenfalls selbstverständlich sein, daß Lamivudin und BMS-200475 oder die pharmazeutisch akzeptablen Derivate davon, ob gleichzeitig oder aufeinanderfolgend angeboten, individuell oder in jeder Kombination daraus verabreicht werden können. Lamivudin und BMS-200475 werden bevorzugt gleichzeitig oder aufeinanderfolgend in separaten pharmazeutischen Formulierungen verabreicht, am meisten bevorzugt gleichzeitig.
  • Bevorzugt wird die erfindungsgemäße Kombination als eine einzelne kombinierte Formulierung verabreicht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung von Lamivudin in der Herstellung eines Medikaments zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Verabreichung mit BMS-200475 zur Behandlung von HBV-Infektionen bereit. Man wird einsehen, daß Lamivudin oder BMS-200475 in der Herstellung des obigen Medikaments verwendet werden kann. Ebenfalls bereitgestellt wird die Verwendung von BMS-200475 in der Herstellung eines Medikaments zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Verabreichung mit Lamivudin zur Behandlung von HBV-Infektionen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine erfindungsgemäße Kombination, worin Lamivudin und BMS-200475 in einem synergistischen Verhältnis vorhanden sind.
  • Die synergistischen Wirkungen der Kombination aus Lamivudin und BMS-200475 oder pharmazeutisch akzeptablen Derivaten davon werden über ein Verhältnis von z.B. 200:1 bis 2:1 (gewichtbezogen), bevorzugt 150.1 bis 10:1 (gewichtsbezogen), noch mehr bevorzugt 100.1 bis 10:1 (gewichtsbezogen) beobachtet.
  • Zweckmäßig wird jede Verbindung in der Kombination in einer Menge eingesetzt werden, bei der sie eine Anti-HBV-Aktivität aufweist, wenn sie allein verwendet wird.
  • Die erforderliche Menge einer Kombination aus Lamivudin und BMS-200475, um als ein Anti-HBV-Mittel wirksam zu sein, wird natürlich variieren und liegt letztlich in der Verantwortung des praktischen Arztes. Die zu berücksichtigenden Faktoren schließen den Verabreichungsweg und die Natur der Formulierung, das Körpergewicht, das Alter und den allgemeinen Zustand des Tieres und die Natur und Schwere der zu behandelnden Krankheit ein.
  • Allgemein wird für Lamivudin eine geeignete tägliche Dosis im Bereich von ca. 0,1 bis ca. 50 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Empfängers pro Tag sein, bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 20 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag, am meisten bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 2 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag.
  • Die Verbindung wird zweckmäßig in einer Menge von ca. 100 mg pro Tag verabreicht.
  • Für BMS-200475 wird eine geeignete tägliche Dosis im Bereich von ca. 0,02 bis ca. 1 mg pro Kilogramm Körpergewicht des Empfängers pro Tag sein, bevorzugt im Bereich von 0,02 bis 0,1 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag, am meisten bevorzugt im Bereich von 0,01 bis 0,05 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag.
  • Die Verbindung wird zweckmäßig in einer Menge von 1 bis 5 mg pro Tag verabreicht, z.B. 5 mg.
  • Wenn nichts anderes angegeben ist, werden alle Massen der aktiven Bestandteile in bezug auf den Wirkstoff als solchen berechnet. Für den Fall eines pharmazeutisch akzeptablen Derivats von Lamivudin und BMS-200475 oder eines Solvats davon würden die Zahlen proportional erhöht werden. Die gewünschte Dosis wird bevorzugt als zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr Unterdosen angeboten, die zu geeigneten Intervallen über den Tag verteilt verabreicht werden. Diese Unterdosen können in Einheitsarzneiformen verabreicht werden, die z.B. 1 bis 1500 mg, bevorzugt 5 bis 1000 mg und am meisten bevorzugt 5 bis 500 mg des aktiven Bestandteils pro Einheitsarzneiform enthalten. Alternativ kann die Dosis als kontinuierliche Infusion verabreicht werden, falls der Zustand des Empfängers dieses erfordert.
  • Die Komponenten der Kombination, die als aktive Bestandteile bezeichnet werden können, können zur Therapie an ein Tier, z.B. ein Säugetier, einschließlich Mensch, in einer herkömmlichen Weise verabreicht werden.
  • Obwohl es möglich ist, die aktiven Bestandteile der Kombination als Rohchemikalie zu verabreichen, ist es bevorzugt, sie als pharmazeutische Zusammensetzung anzubieten. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen eine erfindungsgemäße Kombination in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern oder Exzipienten und gegebenenfalls anderen Therapeutika. Der (die) Träger muß (müssen) akzeptabel in dem Sinne sein, daß er (sie) mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und nicht nachteilig für den Empfänger ist (sind). Wenn die individuellen Komponenten der Kombination getrennt verabreicht werden, werden sie allgemein jeweils als pharmazeutische Zusammensetzung angeboten. Die nachfolgenden Verweise auf Zusammensetzungen bezeichnen, wenn nichts anderes angegeben ist, Zusammensetzungen, die entweder die Kombination oder eine Komponente davon enthalten.
  • Eine Kombination aus Lamivudin und BMS-200475 oder von pharmazeutisch akzeptablen Derivaten davon kann zweckmäßig als pharmazeutische Zusammensetzung mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern dafür in einer Einheitsarzneiform angeboten werden. Eine zweckmäßige Einheitsarzneiformulierung enthält die aktiven Bestandteile in Mengen von jeweils 1 mg bis 2 g, z.B. 2 mg bis 200 mg, wie 25 bis 150 mg Lamivudin, und 0,5 bis 20 mg, wie 1 bis 10 mg BMS-200475.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen können ebenfalls dem Patienten in "Patientenpackungen" verschrieben werden, die den gesamten Behandlungsverlauf in einer einzelnen Packung enthalten, gewöhnlich in einer Durchdrückpackung. Patientenpackungen besitzen einen Vorteil gegenüber herkömmlichen Verschreibungen, in denen ein Pharmazeut einen Patientenvorrat eines Pharmazeutikums aus einem Massevorrat unterteilt, indem der Patient immer Zugriff zur Packungsbeilage hat, die in der Patientenpackung enthalten ist, aber normalerweise in herkömmlichen Verschreibungen fehlt. Es wurde gezeigt, daß der Einschluß einer Packungsbeilage die Therapietreue des Patienten gegenüber den Anweisungen des Arztes verbessert.
  • Es ist selbstverständlich, daß die Verabreichungen der erfindungsgemäßen Kombination mittels einer einzelnen Patientenpackung oder mittels Patientenpackungen jeder Zusammensetzung innerhalb einer Packungsbeilage, die den Patienten auf die richtige Verwendung der Erfindung hinweist, ein wünschenswertes zusätzliches Merkmal dieser Erfindung ist.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Patientenpackung bereitgestellt, die wenigstens einen aktiven Bestandteil der erfindungsgemäßen Kombination und eine Informationsbeilage umfaßt, die Anleitungen zur Verwendung der erfindungsgemäßen Kombination enthält.
  • Gemäß einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Doppelpackung bereit, die in Verbindung zur getrennten Verabreichung Lamivudin und BMS-200475 oder pharmazeutisch akzeptable Derivate davon umfaßt.
  • Zusammensetzungen schließen diejenigen ein, die zur oralen, rektalen, nasalen, topischen (einschließlich transdermalen, bukkalen und sublingualen), vaginalen oder parenteralen (einschließlich subkutanen, intramuskulären, intravenösen und intradermalen) Verabreichung geeignet sind. Die Zusammensetzungen können zweckmäßig in Einheitsarzneiform angeboten werden und können durch alle auf dem Gebiet der Pharmazie allgemein bekannten Verfahren hergestellt werden. Solche Verfahren stellen ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung dar und schließen den Schritt des Inverbindungbringens der aktiven Bestandteile mit dem Träger ein, der einen oder mehrere Nebenbestandteile darstellt. Allgemein werden die Formulierungen durch gleichförmiges und inniges Inverbindungbringen der aktiven Bestandteile mit flüssigen Trägern oder feinverteilten festen Trägern oder beiden und, falls erforderlich, anschließendes Formen des Produkts hergestellt.
  • Erfindungsgemäße Zusammensetzungen, die zur oralen Verabreichung geeignet sind, können als diskrete Einheiten angeboten werden, wie Kapseln, Kapletts, Kachets oder Tabletten, die jeweils eine vorher festgelegte Menge der aktiven Bestandteile enthalten; als Pulver oder Granalien; als Lösung oder Suspension in einer wäßrigen oder nicht-wäßrigen Flüssigkeit; oder als flüssige Öl-in-Wasser-Emulsion oder flüssige Wasser-in-Öl-Emulsion. Der aktive Bestandteil kann ebenfalls als Bolus, Elektuarium oder Paste angeboten werden.
  • Eine Tablette kann durch Verpressen oder Formen hergestellt werden, gegebenenfalls mit einem oder mehreren Nebenbestandteilen. Verpreßte Tabletten können durch Verpressen der aktiven Bestandteile in freifließender Form, wie als Pulver oder Granalien, gegebenenfalls vermischt mit einem Bindemittel (z.B. Povidon, Gelatine, Hydroxypropylmethylcellulose), Schmiermittel, inerten Verdünnungsmittel, Konservierungsmittel, Tablettensprengmittel (z.B. Natriumstärkeglykolat, vernetztes Povidon, vernetzte Natriumcarboxymethylcellulose), oberflächenaktiven oder Dispergiermittel, in einer geeigneten Maschine hergestellt werden. Geformte Tabletten können durch Formen einer Mischung aus der gepulverten und mit einem inerten flüssigen Verdünnungsmittel angefeuchteten Verbindung in einer geeigneten Maschine hergestellt werden. Die Tabletten können gegebenenfalls überzogen oder gekerbt werden und können so formuliert werden, um eine langsame oder kontrollierte Freisetzung der aktiven Bestandteile darin bereitzustellen, wobei z.B. Hydroxypropylmethylcellulose in unterschiedlichen Anteilen verwendet wird, um das gewünschte Freisetzungsprofil bereitzustellen. Tabletten können gegebenenfalls mit einem enterischen Überzug versehen werden, um die Freisetzung in anderen Teilen der Eingeweide als im Magen bereitzustellen.
  • Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Kombinationen oral verabreicht.
  • Zur topischen Verabreichung im Mund geeignete Zusammensetzungen schließen Lutschtabletten ein, die die aktiven Bestandteile in einer aromatisierten Basis umfassen, gewöhnlich Saccharose und Gummi arabicum oder Tragacanthharz; Pastillen, die den aktiven Bestandteil in einer inerten Basis, wie Gelatine und Glycerin, oder Saccharose und Gummi arabicum umfassen; und Mundspülungen, die den aktiven Bestandteil in einem geeigneten flüssigen Träger umfassen. Zusammensetzungen zur rektalen Verabreichung können als Suppositorium mit einer geeigneten Basis angeboten werden, die z.B. Kakaobutter oder ein Salicylat umfaßt.
  • Die topische Verabreichung kann ebenfalls mittels einer transdermalen iontophoretischen Vorrichtung erfolgen.
  • Zur vaginalen Verabreichung geeignete Formulierungen können als Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprühformulierungen angeboten werden, die zusätzlich zum aktiven Bestandteil solche Träger enthalten, wie sie auf diesem Gebiet als angemessen bekannt sind.
  • Zur rektalen Verabreichung geeignete pharmazeutische Formulierungen, in denen der Träger ein Feststoff ist, werden am meisten bevorzugt als Einheitsdosissuppositorien angeboten. Geeignete Träger schließen Kakaobutter und andere Stoffe ein, die gewöhnlich auf diesem Gebiet verwendet werden. Die Suppositorien können zweckmäßig durch Vermischen der aktiven Kombination mit dem (den) erweichten oder geschmolzenen Träger(n) gefolgt von Abkühlen und Formgebung in Formen gebildet werden.
  • Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen schließen wäßrige und nicht-wäßrige isotonische sterile Injektionslösungen ein, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung isotonisch zum Blut des beabsichtigten Empfängers machen; und wäßrige und nicht-wäßrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel und Verdickungsmittel einschließen können; und Liposomen oder andere mikroteilchenförmige Systeme, die zur Ausrichtung der Verbindung auf Blutkomponenten oder eines oder mehrere Organe geschaffen sind. Die Formulierungen können in versiegelten Einheitsdosis- oder Mehrfachdosis-Behältern angeboten werden, z.B. Ampullen und Fläschchen, und können in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers erfordert, z.B. Wasser zur Injektion, unmittelbar vor der Verwendung. Unvorbereitete Injektionslösungen und Suspensionen können aus sterilen Pulvern, Granalien und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
  • Bevorzugte Einheitsarzneiformulierungen sind diejenigen, die eine tägliche Dosis oder eine tägliche Unterdosis der aktiven Bestandteile wie hier zuvor angegeben oder einen geeigneten Bruchteil davon enthalten.
  • Es sollte selbstverständlich sein, daß die Formulierungen dieser Erfindung zusätzlich zu den oben besonders genannten Bestandteilen andere Mittel einschließen können, die auf diesem Gebiet in bezug auf den Typ der fraglichen Formulierung herkömmlich sind, z.B. können die zur oralen Verabreichung geeigneten solche weiteren Mittel wie Süßungsmittel, Verdicker und Aromatisierungsmittel einschließen.
  • Die Verbindungen der Kombination der vorliegenden Erfindung können in herkömmlicher Weise erhalten werden.
  • Verfahren zur Herstellung von Lamivudin werden in WO 91/17159 und WO 95/29174 beschrieben.
  • Verfahren zur Herstellung von BMS-200475 werden in EP Nr. 0 481 754 beschrieben.
  • "Aktiver Bestandteil" bezeichnet Lamivudin oder BMS-200475 oder ein Mehrfaches davon oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat von jeder der zuvor genannten Verbindungen.
  • Beispiel 1: Tablettenformulierung
  • Die folgenden Formulierungen A, B und C werden durch Naßgranulierung der Bestandteile mit einer Lösung von Povidon, gefolgt von Zugabe von Magnesiumstearat und Verpressung hergestellt. Formulierung A
    mg/Tablette
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 5
    Lactose B.P. 105
    Povidon B.P. 7
    Natriumstärkeglykolat 10
    Magnesiumstearat 3
    230
    Formulierung B
    mg/Tablette
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 5
    Lactose B.P. 75
    Avicel PH 101 30
    Povidon B.P. 7
    Natriumstärkeglykolat 10
    Magnesiumstearat 3
    230
    Formulierung C
    mg/Tablette
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 5
    Lactose B.P. 100
    Stärke 25
    Povidon B.P. 2
    Magnesiumstearat 2
    234
  • Die folgenden Formulierungen D und E werden durch Direktverpressung der vermischten Bestandteile hergestellt. Die Lactose in Formulierung E ist vom Direktverpressungstyp (Dairy Crest – "Zeparox"). Formulierung D
    mg/Tablette
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 5
    Vorgequollene Stärke NF15 75
    180
    Formulierung E
    mg/Tablette
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 5
    Lactose B.P. 70
    Avicel 50
    225
  • Formulierung F (Formulierung mit kontrollierter Freisetzung) Die Formulierung wird durch Naßgranulierung der Bestandteile mit einer Lösung von Povidon gefolgt von Zugabe von Magnesiumstearat und Verpressung hergestellt.
    mg/Tablette
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 5
    Hydroxypropylmethylcellulose 28
    (Methocel K4M Premium) Lactose B.P. 13
    Povidon B.P. 7
    Magnesiumstearat 2
    155
  • Die Wirkstofffreisetzung erfolgt über einen Zeitraum von ca. 6-8 Stunden und ist nach 12 Stunden vollständig.
  • Beispiel 1a: Tablettenformulierung
  • Die folgenden Formulierungen a, b und c werden durch Naßgranulierung der Bestandteile mit einer Lösung von Povidon, gefolgt von Zugabe von Magnesiumstearat und Verpressung hergestellt. Formulierung a
    mg/Tablette
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 1
    Lactose B.P. 105
    Povdidon B.P. 7
    Natriumstärkeglykolat 10
    Magnesiumstearat 3
    226
    Formulierung b
    mg/Tablette
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 1
    Lactose B.P. 75
    Avicel PH 101 30
    Povidon B.P. 7
    Natriumstärkeglykolat 10
    Magnesiumstearat 3
    226
    Formulierung c
    mg/Tablette
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 1
    Lactose B.P. 100
    Stärke 25
    Povidon 2
    Magnesiumstearat 2
    230
  • Die folgenden Formulierungen d und e werden durch Direktverpressung der vermischten Bestandteile hergestellt. Die Lactose in Formulierung e ist vom Direktverpressungstyp (Dairy Crest – "Zeparox"). Formulierung d
    mg/Tablette
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 1
    Vorgequollene Stärke NF15 75
    176
    Formulierung e
    mg/Tablette
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 1
    Lactose B.P. 70
    Avicel 50
    221
  • Beispiel 2: Kapselformulierungen
  • Formulierung A
  • Eine Kapselformulierung wird durch Vermischen der Bestandteile der Formulierung D im obigen Beispiel 1 und Einfüllen in eine zweiteilige Hartgelatinekapsel hergestellt. Formulierung B (unten) wird in einer ähnlichen Weise hergestellt. Formulierung B
    mg/Kapsel
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 5
    Lactose B.P. 70
    Natriumstärkeglykolat 10
    Magnesiumstearat 1
    186
    Formulierung C
    mg/Kapsel
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 5
    Macrogel 4000 B.P. 170
    275
  • Kapseln der Formulierung C werden durch Schmelzen des Macrogel 4000 B.P., Dispergieren des aktiven Bestandteils in der Schmelze und Einfüllen der Schmelze in eine zweiteilige Hartgelatinekapsel hergestellt. Formulierung D
    mg/Kapsel
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 5
    Lecithin 50
    Erdnußöl 50
    205
  • Kapseln der Formulierung D werden durch Dispergieren des aktiven Bestandteils im Lecithin und Erdnußöl und Einfüllen der Dispersion in weiche elastische Gelatinekapseln hergestellt.
  • Formulierung E (Kapsel mit kontrollierter Freisetzung)
  • Die folgende Kapselformulierung mit kontrollierter Freisetzung wird durch Extrudieren der Bestandteile a, b und c unter Verwendung eines Extruders gefolgt von Sphäronisierung des Extrudats und Trocknen hergestellt. Die getrockneten Pellets werden dann mit einer die Freisetzung kontrollierenden Membran (d) überzogen und in eine zweiteilige Hartgelatinekapsel eingefüllt.
    mg/Kapsel
    (a) Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 5
    (b) Mikrokristalline Cellulose 60
    (c) Lactose B.P. 60
    (d) Ethylcellulose 6
    231
    Beispiel 3: Injizierbare Formulierung Formulierung A
    mg
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 5
    Salzsäure-Lösung 0,1 M oder Natriumhydroxid-Lösung 0,1 M, in genügender Menge auf pH 4,0 bis 7,0
    Steriles Wasser in genügender Menge auf 10 ml
  • Der aktive Bestandteil wird im Großteil des Wassers (35–40°C) gelöst und der pH mit der Salzsäure oder dem Natriumhydroxid nach Bedarf auf 4,0 bis 7,0 eingestellt. Die Charge wird dann mit dem Wasser zum Volumen aufgefüllt und durch einen sterilen Mikroporenfilter in ein steriles 10 ml-Braunglasfläschchen (Typ 1) filtriert und mit sterilen Verschlüssen und Übersiegeln versiegelt. Formulierung B
    Aktiver Bestandteil A 100 mg
    Aktiver Bestandteil B 5 mg
    Steriler, pyrogenfreier Phosphatpuffer pH 7, in genügender Menge auf 25 ml
    Beispiel 4: Intramuskuläre Injektion
    Aktiver Bestandteil A 100 mg
    Aktiver Bestandteil B 5 mg
    Benzylalkohol 0,067 g
    Glycofurol 75 0,94 g
    Wasser zur Injektion in genügender Menge auf 3,00 ml
  • Der aktive Bestandteil wird im Glycofurol gelöst. Der Benzylalkohol wird dann hinzugegeben und gelöst und Wasser auf 3 ml hinzugegeben. Die Mischung wird dann durch einen sterilen Mikroporenfilter filtriert und in sterilen 3 ml-Braunglasfläschchen (Typ 1) versiegelt. Beispiel 5: Sirup
    Aktiver Bestandteil A 100 mg
    Aktiver Bestandteil B 5 mg
    Sorbitlösung 0,6 mg
    Glycerin 0,85 g
    Natriumbenzoat 0,0025 g
    Geschmacksstoff, Pfirsich 17.42.3169 0,0125 ml
    Gereinigtes Wasser in genügender Menge auf 5,00 ml
  • Der aktive Bestandteil wird in einer Mischung aus dem Glycerin und dem Großteil des gereinigten Wassers gelöst. Eine wäßrige Lösung des Natriumbenzoats wird dann zur Lösung gegeben, gefolgt von Zugabe der Sorbitlösung und schließlich des Geschmacksstoffs. Das Volumen wird mit gereinigtem Wasser aufgefüllt und gut vermischt. Beispiel 6: Suppositorium
    mg/Kapsel Suppositorium
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 5
    Hartfett, B.P. (Witepsol H15 – Dynamit Nobel) 1770
    1875
  • 1/5 des Witepsol H15 wird in einem Tiegel mit Dampfmantel bei maximal 45°C geschmolzen. Der aktive Bestandteil wird durch ein 200 μm-Sieb gesiebt und zur geschmolzenen Basis unter Vermischen unter Verwendung eines mit einem Schneidkopf ausgerüsteten Silverson gegeben, bis eine glatte Dispersion erhalten wird. Unter Halten der Mischung auf 45°C wird das verbleibende Witepsol H15 zur Suspension gegeben und gerührt, um eine homogene Mischung sicherzustellen. Die gesamte Suspension wird durch ein 250 μm-Sieb aus rostfreiem Stahl passiert und unter kontinuierlichem Rühren auf 40°C abkühlen gelassen. Bei einer Temperatur von 38 bis 40°C werden 2,02 g der Mischung in geeignete 2 ml-Plastikformen gefüllt. Man läßt die Suppositorien auf Raumtemperatur abkühlen. Beispiel 7: Pessare
    mg/Pessar
    Aktiver Bestandteil A 100
    Aktiver Bestandteil B 5
    Wasserfreie Dextrose 160
    Kartoffelstärke 150
    Magnesiumstearat 3
    418
  • Die obigen Bestandteile werden direkt vermischt und Pessare durch Direktverpressung der resultierenden Mischung hergestellt.
  • Biologische Daten
  • Beispiel 8
  • Die humane Hepatoblastom-Zellinie (Hep-G2-2.2.15), die konstitutiv infektiöses HBV erzeugt, wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 5 × 103 Zellen pro Vertiefung übergeimpft. Diese Zellen wurden dann mit einer Kombination aus Lamivudin (3TC) und BMS-200475 auf Platten in dreifacher Ausführung behandelt. Kulturmedium, das die Wirkstoffe enthielt, wurde jeden zweiten Tag für 9 Tage erneuert, wobei die Überstände aufgefangen und auf den HBV-Gehalt analysiert wurden.
  • Die Lamivudin/BMS-200475-Kombination wurde dreimal in dreifacher Ausführung in einer Matrixweise getestet. Die 3 Experimente verwendeten einen Lamivudin-Bereich von 100 nM bis 0,046 nM (3-fache Verdünnungen in Spalten). BMS-200475 wurde seriell zur Bildung einer Konzentrationsreihe von 5,0 bis 0,0002 nM verdünnt (3,16-fache Verdünnungen in Zeilen). Beide Wirkstoffe wurden in einer getrennten Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen verdünnt und anschließend auf Platten überführt, die die Zell-Monoschichten enthielten. Die Zellen wurden in 150 μl RPMI 1640 gezüchtet, das mit 2 mM L-Glutamin und 10 % fötalem Rinderserum ergänzt war. Vor der Übertragung des Wirkstoffs wurden 120 μl Medium aus den Zellen entfernt, wobei 30 μl auf den Monoschichten verblieben, um ein Trocknen zu verhindern. 90 μl frisches Medium ohne Wirkstoff wurden hinzugegeben, gefolgt von Zugabe von 30 μl von 5X-Wirkstoffverdünnungen. Lamivudin und BMS-200475 wurden jeweils auf ihren entsprechenden Platten individuell mit den gleichen Konzentrationen getestet. Die Daten wurden auf Werte normiert, die mit nicht- wirkstoffbehandelten Zellen erhalten wurden, und als Prozent der Kontrolle zur Analyse ausgedrückt.
  • Das zur Detektion von HBV verwendete Verfahren wurde zuvor beschrieben (R.W. Jansen, L.C. Johnson, D.R. Averett, "High-Capacity in vitro assessment of anti-hepatitis B virus compound selectivity by a virion-specific polymerase chain reaction assay". Antimicrob. Agents Chem. 1993; 37 (3): 441–447). Kurz gesagt wurde die HBV-Detektion durch "Einfangen" von Virus aus Überständen auf Anti-HBsAg-beschichteten Platten, Waschen, Denaturieren zur Freisetzung von HBV-DNA, Durchführen von PCR mit biotinylierten Primern, Streptavidin-Einfangen der biotinylierten PCR-Produkten mit gleichzeitiger Sondenhybridisierung, Addition von Substrat und Auslesen optischer Dichten der kolorimetrischen Reaktion durchgeführt. Verdünnungen eines standardisierten HBV-haltigen Überstandes wurden auf jeder Platte eingeschlossen, und HBV-DNA-Konzentrationen der Testvertiefungen wurden aus dieser HBV-Standardkurve berechnet. Der nützliche Detektionsbereich beträgt wenigstens 0,045 bis 45 fg von HBV-DNA, wobei 30 Kopien des Genoms zuverlässig detektiert werden können. Die Proben wurden in Verbindung mit sowohl positiven (0,448 fg/μl Plasmid-DNA) und negativen Kontrollen (RPMI-Medium, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin und 10 % fötalem Kälberserum) getestet.
  • Der durchschnittliche IC50-Wert und der Standardfehler der IC50-Werte für die Platten in dreifacher Ausführung wurden unter Verwendung einer nicht-linearen SAS-Regression berechnet, um die Daten an die Hill-Gleichung für jede Konzentrations-Reaktions-Kurve anzupassen. Wenn nur eine einzelne Bestimmung eines IC50-Wertes für eine besondere Dosiskombination durchgeführt werden konnte, wurde der Durchschnitt der Standardfehler aus benachbarten Konzentrationen verwendet, um den Standardfehler abzuschätzen. Fraktionelle inhibitorische Konzentrationen (FIC50) wurden für jede Kombination berechnet und unter Verwendung der Isobologramm-Darstellung aufgetragen (M.C. Berenbaum (1985), The Expected Effect of a Combination of Agents: the General Solution, J. Theor. Biol. 114, 413–431). Zur Bewertung der statistischen Signifikanz von Synergismus oder Antagonismus wurde ein ungepaarter t-Test verwendet, um jede Summe von gepaarten FIC50-Werten mit dem theoretischen Wert von 1 zu vergleichen. P-Werte von weniger als 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet. In einigen Fällen konnten nicht alle untersuchten Konzentrationen die Berechnung eines IC50-Wertes stützen, da die Reaktion zu einem größeren Ausmaß als 50 % der Kontrolle für alle Dosen inhibiert wurde.
  • 1, 2 und 3 stellen graphisch die Isobologrammdaten für die Experimente 1, 2 bzw. 3 dar.
  • 4 kombiniert Daten aus allen drei Experimenten in einem einzelnen Isobologramm.
  • Wechselwirkungen mit Durchschnittsabweichungen, die sich –0,5 annähern, würden als stark betrachtet, während eine beobachtete Abweichung von –0,2 als schwach bis mäßig betrachtet würde. Das Ausmaß der statistischen Signifikanz zeigt, daß die Wirkung real und reproduzierbar ist. Obwohl Ergebnisse aus Experiment 1 nur einen additiven Effekt anzeigten, zeigten die Experimente 2 und 3 jeweils eine schwache, aber statistisch signifikante synergistische Inhibierung der HBV-Vermehrung für die Kombination aus Lamivudin und BMS-200475 an. Wenn Daten für alle drei Experimente kombiniert wurden, um eine kompilierte Datenbank zu erzeugen, wurde ein schwacher, aber statistisch signifikanter Synergismus beobachtet.
  • Beispiel 9
  • Die Ki-Werte für die aktiven Formen von BMS 200475, BMS 200475-Triphosphat (BMS 200475-tp) und Lamivudin, Lamivudin-Triphosphat (Lamivudin-tp) wurden gegen die HBV-Polymerasen vom Wildtyp und die YMDD-Variante in einem In-vitro-Assay bestimmt, der aus HBV-Kernpartikeln bestand, die aus transient transfizierten oder transduzierten HepG2-Zellen isoliert wurden. HepG2-Zellen wurden transient mit Plasmid transfiziert, das das HBV-Genom enthielt, das die Wildtyp-Sequenz besaß oder die folgenden Aminosäureveränderungen im reversen Transkriptase-Gen enthielt: M552I, M552V, L528M, L528MM552V, L528MM552I (M.I. Allen, M. Deslauriers, C.W. Andrews, G.A. Tipples, K.A. Walters, D.L.J. Tyrrell, N. Brown. (Lamivudine Clinical Investigation Group) und L.D. Condreay, Identification and characterization of mutations in hepatitis B virus resistant to Lamivudine, HEPATOLOGY 1998; 27:1670–1677). Transiente Transduktionen wurden unter Verwendung von Baculovirus durchgeführt, das die gleichen Konstrukte enthielt (J.P. Condreay, S.M. Witherspoon, W.C. Clay, T.A. Kost (1999) Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. PNAS, 96, 127–132). Der Kernpolymerase-Assay war eine Modifikation eines zuvor angegebenen Protokolls (M.G. Davis, J.E. Wilson, N.A. VanDraanen, W.H. Miller, G.A. Freeman, S.M. Daluge, F.L. Boyd, A.E. Aulabaugh, G.R. Painter, L.R. Bonne (1996) DNA polymerase activity of hepatitis B virus particles: differential inhibition by L-enantiomers of nucleotide analogs. Antiviral Res. 30, 133–145). HBV-Kernpartikel wurden in der folgenden Weise isoliert. Kurz gesagt wurden die Zellen 5 Tage nach der Transfektion oder Transduktion geerntet und pelletisiert. Das Zellpellet wurde in einer hypotonischen Lösung resuspendiert und die Zellen mit NP-40 bei einer Endkonzentration von 0,5 % lysiert. Die Kerne wurden pelletisiert, und der Zellüberstand wurde mit RNase und DNase verdaut. Das behandelte Lysat wurde durch einen Saccharose-Stufengradienten pelletisiert. Das resultierende Pellet, das HBV-Kerne enthielt, wurde durch Ultraschallbehandlung in einem Puffer resuspendiert, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 50 mM KCl und 5 mM MgCl2 enthielt. Dieses Material wurde bei –80°C bis zur Verwendung in Polymerase-Assays gelagert. Antikörper-Einfang-ASSay-Platten wurden unter Verwendung des folgenden Protokolls hergestellt: Costar #3632 (Corning, Corning, NY) wurden sequenziell beschichtet mit 1) Neutravidin (Pierce, Rockford, IL) in 50 mM Natriumcarbonatpuffer (Sigma- St. Louis, MO), pH 9,6, 0,10 mg/ml, 0,15 ml pro Vertiefung für 2 Stunden bei Raumtemperatur, dann mit 3 × 0,25 ml/Vertiefung mit Waschpuffer gewaschen, WP (150 mM NaCl, 100 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 0,02 % Tween-20 (Pierce, Rockford, IL), 0,02 % Natriumazid, 0,01 % Rinderserumalbumin (Sigma, St. Louis, MO)); 2) biotinyliertem Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Pierce, Rockford, IL), verdünnt auf 0,0015 mg/mlg in WP mit 0,15 ml pro Vertiefung für 1 Stunde bei Raumtemperatur, dann gewaschen 3 × 0,25 ml/Vertiefung mit WP; und 3) Kaninchen-anti-HBV-Kern-Antigen-Antikörper (Zymed, San Francisco, CA), verdünnt 1:300 in WP mit 0,15 ml pro Vertiefung für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Platten wurden 2 × 0,25 ml/Vertiefung mit WP gewaschen und WP mit 0,25 ml pro Vertiefung am Ende der Spülung hinzugegeben. Die Platten wurden in einer angefeuchteten Kammer bei 4°C gelagert. Der Kern-Polymerase-Assay war eine Modifikation eines zuvor angegebenen Protokolls (M.G. Davis, J.E. Wilson, N.A. VanDraanen, W.H. Miller, G.A. Freeman, S.M. Daluge, F.L. Boyd, A.E. Aulabaugh, G.R. Painter, L.R. Boone (1996), DNA polymerase activity of hepatitis B virus particles: differential inhibition by L-enantiomers of nucleotide analogs. Antiviral Res. 30, 133–145). Kernpartikelzubereitungen wurden auf Eis aufgetaut und durch Ultraschallbehandlung vor jedem Assay resuspendiert. Kernpartikel-Assays enthielten folgendes: Kernpartikel (gewöhnlich 107 bis 108/10 μl Reaktion) in 230 mM KCl, 33 mM Tris-HCl, pH 7,4, 8 mM MgCl2, 0,2 % NP-40, 5 mM DTT, 7 Einheiten/ml Pyruvatkinasepuffer (Sigma St. Louis, MO), 2 mM Phosphoenolpyruvatpuffer (Sigma, St. Louis, MO), 25 mM unmarkierte dNTPs (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 33P-markiertes dNTP (NENTM Life Science Products, Boston, MA, 2000 Ci/mmol) mit 0 bis 4 μM. Assays von 10 μl wurden bei 37°C für 45 bis 90 Minuten in einer Polypropylen-Platte mit 96 Vertiefungen inkubiert (USA Scientific, Ocala, FL), dann mit 90 μl des folgenden Puffers angehalten: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 0,05 % Tween-20, 2 mM Natriumpyrophosphat, 0,02 % Natriumazid. Der gesamte angehaltene 100 μl-Assay wurde in einer Antikörper-Einfangplatte mit 96 Vertiefungen überführt und bei Raumtemperatur unter Schütteln für 2 Stunden inkubiert. Nach dem Antikörper-Einfangen wurden die Vertiefungen 5-mal mit dem folgenden Puffer gewaschen: 150 mM NaCl, 100 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 0,05 % Tween-20, 2 mM Natriumpyrophosphat, 0,02 % Natriumazid. Überschüssiger Puffer wurde durch Klopfen der Platten auf Saugpapier entfernt. 170 μl von Wallac Optiphase "Supermix" (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten wurden an einem Wallac 1450 Microbeta Plus Flüssigszintillationszähler (Wallac Inc., Gaithersburg, MD) gezählt. Inhibierungsassays waren im wesentlichen die gleichen wie die Kernpolymerase-Assays, außer daß die Konzentration von alpha-33P-dGTP bei Km für Wildtyp-Polymerase war, wenn BMS 200475-Triphosphat untersucht wurde. Die Konzentration von BMS 200475-tp reichte von 0,01 bis 350 μM. Der IC50-Wert ist die inhibitorische Konzentration der Verbindung, bei der die Polymeraseaktivität 50 % ist. [S] ist die Konzentration des konkurrierenden Substrats (für BMS 200475-tp ist es 33P-markiertes dGTP). Erzeugte Konzentrations-Reaktions-Kurven wurden an die Hill-Gleichung y=(Vmax·xn)/(Kn+xn) unter Verwendung einer nicht-linearen Regression angepaßt, um den IC50-Wert von BMS 200475-tp abzuschätzen. Ki-Werte wurden unter Verwendung der folgenden Formel berechnet:
    Ki=IC50/(1+[S]/Km)· Km für dGTP für jede Polymerase ist wie folgt: Wildtyp, 0,07 μM; LMMV, 0,16 μM; MI, 0,35 μM; LMMI, 0,18 μM; LM, 0,11 μM; und MV, 0,29 μM. Berechnungen wurden unter Verwendung des RoboSage Add-in für Microsoft EXCEL durchgeführt. Der Ki-Wert für Lamivudin-tp wurde im wesentlichen in der gleichen Weise bestimmt, außer daß der markierte Konkurrent alpha-33P-dCTP war und seine Konzentration auf den Km-Wert für dCTP für jede untersuchte Polymerase eingestellt wurde. Lamivudin-Triphosphat wurde in einem Bereich von 0,005 bis 2600 μM untersucht.
  • Tabelle 1. Lamivudin-tp und BMS 200475-tp: Ki und Faltungsveränderung in Ki
    Figure 00210001
  • BMS 200475 und Lamivudin wurden ebenfalls in einem Assay auf Zellbasis gegen Wildtyp und ausgewählte YMDD-Varianten untersucht. Vier Zellinien wurden verwendet: eine war die 2.2.15-Linie, die Wiltyp-HBV-Virus erzeugt, und die drei anderen Zellinien, die Wildtyp-, LMMI- oder LMMV-Virus erzeugen, wurden in diesem Labor entwickelt. Die Labor-Zellinien wurden durch stabiles Transformieren von HepG2-Zellen mit DNA geschaffen, die die viralen Genome mit entweder Wildtyp- oder Varianten-Polymerase enthielt. Der zur Bestimmung der Verbindungswirkungen auf die HBV-Erzeugung verwendete Assay wurde an anderer Stelle beschrieben (R.W. Jansen, L.C. Johnson, D.R. Averett, High-Capacity in vitro assessment of anti-hepatitis B virus compound selectivity by a virion-specific polymerase chain reaction assay. Antimicrob. Agents Chemother. 1993, 37:441–447). Lamivudin wurde bei Konzentrationen von 0,00032 bis 200 μM und BMS 200475 bei Konzentrationen von 0,000032 bis 2 μM getestet.
  • Tabelle 2. Assay auf Zellbasis: Lamivudin und BMS 200475
    Figure 00210002
  • Diskussion
  • Im Kernpartikel-Polymerase-Assay zeigt BMS 200475-tp eine gewisse Reduktion der Aktivität gegen jede der YMDD-Varianten mit der Ausnahme der einzelnen LM-Variante. Jedoch ist die Faltungsänderung der Aktivität nicht so groß wie die mit Lamivudin-tp beobachtete. Die Ergebnisse sind ähnlich, wenn Lamivudin und BMS 200475 im Assay auf Zellbasis verwendet und gegen Wildtyp und zwei der YMDD-Varianten getestet werden. Weil der EC50-Wert von BMS 200475 im unteren Pikomol-Bereich ist, führt selbst die fast 700-fache Zunahme der Konzentration, die zum Erreichen des EC50-Wertes für die LMMI-Variante erforderlich ist, zu einer Endkonzentration der Verbindung von 22 nM.

Claims (15)

  1. Eine Kombination, die (2R,cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-pyrimidin-2-on oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon und Entecavir oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon umfaßt, worin (2R,cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-pyrimidin-2-on und Entecavir im Gewichtsbereich von 200.1 bis 1:1 vorhanden sind.
  2. Kombination gemäß Anspruch 1, worin das Verhältnis im Gewichtsbereich von 150:1 bis 10:1 der aktiven Bestandteile ist.
  3. Kombination gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung in der Medizin.
  4. Pharmazeutische Formulierung, die eine Kombination gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 in Verbindung mit einem odermehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern dafür umfaßt.
  5. Formulierung gemäß Anspruch 4 in Einheitsarzneiform.
  6. Formulierung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 5, die zur oralen Verabreichung geeignet ist.
  7. Formulierung gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, die 25 bis 150 mg (2R,cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-pyrimidin-2-on und 0,5 bis 20 mg Entecavir umfaßt.
  8. Formulierung gemäß Anspruch 7, die 100 mg (2R,cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-pyrimidin-2-on und 1 bis 5 mg Entecavir umfaßt.
  9. Verwendung von (2R,cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-pyrimidin-2-on in der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung entweder gleichzeitig oder aufeinanderfolgend mit Entecavir zur Behandlung einer Hepatitis B-Virusinfektion.
  10. Verwendung von Entecavir in der Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung entweder gleichzeitig oder aufeinanderfolgend mit (2R,cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2-on zur Behandlung einer HBV-Infektion.
  11. Verwendung einer Kombination, die (2R,cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-pyrimidin-2-on oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon und Entecavir oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon umfaßt, zur Behandlung einer HBV-Infektion.
  12. Verwendung einer Kombination gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2 zur Behandlung einer HBV-Infektion.
  13. Verwendung einer Kombination, die (2R,cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-pyrimidin-2-on oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon und Entecavir oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon umfaßt, zur Behandlung einer HBV-Infektion, die resistent gegen Nukleosid- und/oder Nicht-Nukleosid-Inhibitor ist.
  14. Verwendung einer Kombination gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2 zur Behandlung einer HBV-Infektion, die resistent gegen Nukleosid- und/oder Nicht-Nukleosid-Inhibitor der Vervielfältigung des Hepatitis B-Virus ist.
  15. Patientenpackung, die die Kombination gemäß Anspruch 1 und eine Packungsbeilage umfaßt, die Anweisungen zur Verwendung beider aktiver Bestandteile zusammen in Kombination enthält.
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