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Die
vorliegende Erfindung betrifft therapeutische Kombinationen, die
(2R,cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-pyrimidin-2-on
(Lamivudin) und BMS-200475 (Entecavir), ein Cyclopentylguanosin-Analog,
umfassen. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische
Zusammensetzungen, die die Kombinationen enthalten, und ihre Verwendung
in der Behandlung von antiviralen Infektionen, wie HBV-Infektionen,
spezifisch HBV-Infektionen, die Infektionen mit HBV-Mutanten einschließen, die
eine Resistenz gegen Nukleosid- und/oder Nicht-Nukleosid-Inhibitoren
der Vervielfältigung
des Hepatitis B-Virus tragen.
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Hepatitis
B ist eine Viruserkrankung, die oral oder parenteral durch kontaminiertes
Material, wie Blut oder Blutprodukte, kontaminierte Nadeln, geschlechtlich
und vertikal von infizierten oder Trägermüttern auf ihre Nachkommen übertragen
wird. In denjenigen Gebieten der Erde, in denen die Krankheit häufig ist,
führt die vertikale Übertragung
in einem frühen
Alter zu einem hohen Anteil infizierter Individuen, die chronische
Träger von
Hepatitis B werden. Schätzungsweise
350 Millionen Menschen weltweit sind chronisch mit Hepatitis B infiziert,
und so viele wie 150 Millionen mögen
an Lebererkrankung in Abwesenheit eines Eingriffs sterben.
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Derzeit
ist der einzige etablierte Ansatz zur Behandlung von Hepatitis B
die wiederholte Injektion von Interferon, was mit unangenehmen Nebenwirkungen
verbunden sein kann und eine langandauernde Reaktion bei nur einem
Drittel oder weniger der behandelten Personen erzeugt. Interferon
ist ein Immunmodulator, der zur Steigerung der Fähigkeit des Immunsystems zur
Krankheitsbekämpfung
entwickelt wurde.
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Es
wurde berichtet, daß Lamivudin
in einer zweijährigen
Studie gegen HBV wirksam war, wodurch gezeigt wurde, daß die meisten
Patienten substantiell reduzierte Werte der viralen Vermehrung zeigten,
wobei 52 % nicht-nachweisbare Mengen von Virus bis zum Ende des
zweiten Jahres beibehielten. Lamivudin wurde zur Behandlung von
HBV in den Hauptmärkten
unter der Marke ZEFFIXTM, HEPTODINTM oder EPIVIR-HBVTM eingeführt.
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Die
Struktur von BMS-200475 ist wie in Formel (I) gezeigt:
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Es
wurde berichtet, das BMS-200475 Anti-HBV-Aktivität in vitro besitzt. "Metabolic Studies
on BMS-200475, a New Antiviral Compound with Activity Against Hepatitis
B Virus", G. Yasmanaka
et al., 36. Interscience Conference on Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 15.–18.
September 1996, New Orleans, Louisiana. Orales BMS-200475 hat sich
ebenfalls als wirksam gegen das Hepatitis B-Virus in Murmeltieren
erwiesen. Sicherheit und Pharmakokinetik von BMS-200475 wurden sowohl
in Einzeldosis- als auch 14-tägigen Mehrfachdosisstudien
untersucht. Zusammenfassung 01, D. DeHertogh et al., Second International
Conference on Therapies for Viral Hepatitis, Kona, Big Island, Hawaii,
15.–19.
Dezember 1997.
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Die
Verwendung von Kombinationen der Erfindung kann zu einer äquivalenten
antiviralen Wirkung bei reduzierter Toxizität oder einer Erhöhung der
Wirkstoffwirksamkeit führen,
weil ein Synergismus zwischen den Verbindungen auftritt. Niedrigere
Wirkstoff-Gesamtdosen werden ebenfalls möglicherweise die Häufigkeit
des Auftretens von arzneistoffresistenten Varianten von HBV reduzieren.
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Wir
haben jetzt gefunden, daß Lamivudin
unerwartete Vorteil aufweist, wenn es in Kombination mit BMS-200475
verwendet wird. Insbesondere zeigt die Kombination eine statistisch
signifikante synergistische Anti-HBV-Wirkung. Es ist ein Merkmal dieser Erfindung,
daß die
Verwendung dieser Wirkstoffkombination synergistische antivirale
Wirkungen, eine vollständigere
virale Unterdrückung
und eine virale Unterdrückung über längere Zeiträume bereitstellen
kann, das Auftreten von arzneistoffresistenten HBV-Mutanten einschränken und
eine bessere Behandlung von arzneistoffbezogenen Toxizitäten erlauben
kann. Die Verwendung dieser Wirkstoffkombination kann ebenfalls
zu einer Abnahme der Anzahl von z.B. pro Tag verabreichten Tabletten führen und
mag deshalb die Therapietreue des Patienten erhöhen.
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Wie
die Fachleute einsehen werden, erstrecken sich Verweise auf die
Behandlung hier auf die Prophylaxe sowie auf die Behandlung etablierter
Infektionen und Symptome.
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Pharamzeutisch
akzeptable Salze von Lamivudin und BMS-200475 schließen diejenigen
ein, die aus pharmazeutisch akzeptablen anorganischen und organischen
Säuren
stammen. Beispiele für
geeignete Säuren
schließen
Chlorwasserstoffsäure,
Bromwasserstoffsäure,
Schwefelsäure,
Salpetersäure,
Perchlorsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Salicylsäure, Bernsteinsäure, Toluol-p-sulfonsäure, Weinsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Methansulfonsäure, Ameisensäure, Benzoesäure, Malonsäure, Naphthalin-2-sulfonsäure und
Benzolsulfonsäure
ein. Andere Säuren,
wie Oxalsäure,
obwohl sie selbst nicht pharmazeutisch akzeptabel sind, können nützlich in
der Herstellung von Salzen sein, die nützlich als Zwischenstufen beim
Erhalt von Verbindungen der Erfindung und ihren pharmazeutisch akzeptablen
Säureadditionssalzen
sind.
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Aus
geeigneten Basen stammende Salze schließen Alkalimetall- (z.B. Natrium),
Erdalkalimetall- (z.B. Magnesium), Ammonium- und NR4 +-Salze (worin R C1-4-Alkyl
ist) ein.
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Bevorzugte
Ester von Lamivudin und BMS-200475 werden unabhängig aus der folgenden Gruppe ausgewählt: (1)
Carbonsäureester,
in denen die Nicht-Carbonyl-Einheit
des Carbonsäure-Anteils
der Estergruppierung aus gerad- oder
verzweigtkettigem Alkyl (z.B. Methyl, n-Propyl, t-Butyl oder n-Butyl),
Cycloalkyl, Alkoxyalkyl (z.B. Methoxymethyl), Aralkyl (z.B. Benzyl),
Aryloxyalkyl (z.B. Phenoxymethyl), Aryl (z.B. Phenyl, das gegebenenfalls
mit z.B. Halogen, C1-4-Alkyl oder C1-4-Alkoxy substituiert ist) oder Amino ausgewählt ist;
(2) Sulfonatester, wie Alkyl- oder Aralkylsulfonyl (z.B. Methansulfonyl);
(3) Aminosäureester
(z.B. L-Valyl oder L-Isoleucyl); und (4) Phosphonatester. In solchen
Estern enthält,
wenn nichts anderes angegeben ist, jede vorhandene Alkyl-Einheit
vorteilhaft 1 bis 18 Kohlenstoffatome, insbesondere 1 bis 6 Kohlenstoffatome,
ganz besonders 1 bis 4 Kohlenstoffatome. Jede in solchen Estern
vorhandene Cycloalkyl-Einheit
enthält
vorteilhaft 3 bis 6 Kohlenstoffatome. Jede in solchen Estern vorhandene
Aryl-Einheit umfaßt
vorteilhaft eine Phenyl-Gruppe. Jeder Verweis auf eine der obigen
Verbindungen schließt
ebenfalls einen Verweis auf ein physiologisch akzeptables Salz davon
ein.
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Besonders
bevorzugte Ester sind die Mono-, Di- und Triphosphatester von Lamivudin
und BMS-200475 (von denen beide gegebenenfalls geblockt sein können) oder
jede andere Verbindung, die bei Verabreichung an einen menschlichen
Patienten den Mono-, Di- oder Triphosphatester (direkt oder indirekt) bereitstellen
kann.
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So
stellt die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt eine Kombination
bereit, die (2R,cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-pyrimidin-2-on oder
ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon und BMS-200475 oder
ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon umfaßt. Kombinationen
wie oben beschrieben können
nachfolgend als erfindungsgemäße Kombinationen
bezeichnet werden.
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Wie
hier verwendet, schließt
ein "pharmazeutisch
akzeptables Derivat" jedes
(jeden) pharmazeutisch akzeptable(n) Salz, Ester oder Salz eines
solchen Esters von Lamivudin, BMS-200475 oder jeder anderen Verbindung
ein, die bei Verabreichung an den Empfänger eine solche Verbindung
oder einen antiviral aktiven Metaboliten oder Rest davon (direkt
oder indirekt) bereitstellen kann.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner erfindungsgemäße Kombinationen
zur Verwendung in der Therapie bereit, insbesondere in der Behandlung
einer HBV-Infektion, einschließlich
Infektionen, die gegen Nukleosid- und/oder
Nicht-Nukleosid-Inhibitoren für
die Vervielfältigung
des Hepatitis B-Virus resistent sind.
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Gemäß einem
anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Behandlung eines Säugetiers,
einschließlich
Mensch, bereit, das an einer HBV-Infektion leidet, umfassend die
Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer erfindungsgemäßen Kombination.
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Man
wird einsehen, daß die
Verbindungen der Kombination gleichzeitig, entweder in der gleichen
oder einer unterschiedlichen pharmazeutischen Zusammensetzung, oder
aufeinanderfolgend verabreicht werden können. Falls es eine aufeinanderfolgende
Verabreichung gibt, sollte die Verzögerung in der Verabreichung des
zweiten aktiven Bestandteils nicht derart sein, daß der Vorzug
einer synergistischen therapeutischen Wirkung der Kombination der
aktiven Bestandteile verlorengeht. Es wird ebenfalls selbstverständlich sein,
daß Lamivudin
und BMS-200475 oder die pharmazeutisch akzeptablen Derivate davon,
ob gleichzeitig oder aufeinanderfolgend angeboten, individuell oder
in jeder Kombination daraus verabreicht werden können. Lamivudin und BMS-200475
werden bevorzugt gleichzeitig oder aufeinanderfolgend in separaten
pharmazeutischen Formulierungen verabreicht, am meisten bevorzugt
gleichzeitig.
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Bevorzugt
wird die erfindungsgemäße Kombination
als eine einzelne kombinierte Formulierung verabreicht.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung von Lamivudin
in der Herstellung eines Medikaments zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden
Verabreichung mit BMS-200475 zur Behandlung von HBV-Infektionen bereit.
Man wird einsehen, daß Lamivudin
oder BMS-200475 in der Herstellung des obigen Medikaments verwendet
werden kann. Ebenfalls bereitgestellt wird die Verwendung von BMS-200475
in der Herstellung eines Medikaments zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden
Verabreichung mit Lamivudin zur Behandlung von HBV-Infektionen.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung ist eine erfindungsgemäße Kombination,
worin Lamivudin und BMS-200475 in einem synergistischen Verhältnis vorhanden
sind.
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Die
synergistischen Wirkungen der Kombination aus Lamivudin und BMS-200475
oder pharmazeutisch akzeptablen Derivaten davon werden über ein
Verhältnis
von z.B. 200:1 bis 2:1 (gewichtbezogen), bevorzugt 150.1 bis 10:1
(gewichtsbezogen), noch mehr bevorzugt 100.1 bis 10:1 (gewichtsbezogen)
beobachtet.
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Zweckmäßig wird
jede Verbindung in der Kombination in einer Menge eingesetzt werden,
bei der sie eine Anti-HBV-Aktivität aufweist, wenn sie allein
verwendet wird.
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Die
erforderliche Menge einer Kombination aus Lamivudin und BMS-200475,
um als ein Anti-HBV-Mittel wirksam zu sein, wird natürlich variieren
und liegt letztlich in der Verantwortung des praktischen Arztes.
Die zu berücksichtigenden
Faktoren schließen
den Verabreichungsweg und die Natur der Formulierung, das Körpergewicht,
das Alter und den allgemeinen Zustand des Tieres und die Natur und
Schwere der zu behandelnden Krankheit ein.
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Allgemein
wird für
Lamivudin eine geeignete tägliche
Dosis im Bereich von ca. 0,1 bis ca. 50 mg pro Kilogramm Körpergewicht
des Empfängers
pro Tag sein, bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 20 mg pro Kilogramm
Körpergewicht
pro Tag, am meisten bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 2 mg pro Kilogramm
Körpergewicht
pro Tag.
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Die
Verbindung wird zweckmäßig in einer
Menge von ca. 100 mg pro Tag verabreicht.
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Für BMS-200475
wird eine geeignete tägliche
Dosis im Bereich von ca. 0,02 bis ca. 1 mg pro Kilogramm Körpergewicht
des Empfängers
pro Tag sein, bevorzugt im Bereich von 0,02 bis 0,1 mg pro Kilogramm Körpergewicht
pro Tag, am meisten bevorzugt im Bereich von 0,01 bis 0,05 mg pro
Kilogramm Körpergewicht pro
Tag.
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Die
Verbindung wird zweckmäßig in einer
Menge von 1 bis 5 mg pro Tag verabreicht, z.B. 5 mg.
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Wenn
nichts anderes angegeben ist, werden alle Massen der aktiven Bestandteile
in bezug auf den Wirkstoff als solchen berechnet. Für den Fall
eines pharmazeutisch akzeptablen Derivats von Lamivudin und BMS-200475
oder eines Solvats davon würden
die Zahlen proportional erhöht
werden. Die gewünschte
Dosis wird bevorzugt als zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr Unterdosen
angeboten, die zu geeigneten Intervallen über den Tag verteilt verabreicht
werden. Diese Unterdosen können
in Einheitsarzneiformen verabreicht werden, die z.B. 1 bis 1500
mg, bevorzugt 5 bis 1000 mg und am meisten bevorzugt 5 bis 500 mg
des aktiven Bestandteils pro Einheitsarzneiform enthalten. Alternativ
kann die Dosis als kontinuierliche Infusion verabreicht werden,
falls der Zustand des Empfängers
dieses erfordert.
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Die
Komponenten der Kombination, die als aktive Bestandteile bezeichnet
werden können,
können
zur Therapie an ein Tier, z.B. ein Säugetier, einschließlich Mensch,
in einer herkömmlichen
Weise verabreicht werden.
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Obwohl
es möglich
ist, die aktiven Bestandteile der Kombination als Rohchemikalie
zu verabreichen, ist es bevorzugt, sie als pharmazeutische Zusammensetzung
anzubieten. Erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzungen umfassen eine erfindungsgemäße Kombination in Verbindung
mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern oder
Exzipienten und gegebenenfalls anderen Therapeutika. Der (die) Träger muß (müssen) akzeptabel
in dem Sinne sein, daß er
(sie) mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel
und nicht nachteilig für
den Empfänger
ist (sind). Wenn die individuellen Komponenten der Kombination getrennt
verabreicht werden, werden sie allgemein jeweils als pharmazeutische
Zusammensetzung angeboten. Die nachfolgenden Verweise auf Zusammensetzungen
bezeichnen, wenn nichts anderes angegeben ist, Zusammensetzungen,
die entweder die Kombination oder eine Komponente davon enthalten.
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Eine
Kombination aus Lamivudin und BMS-200475 oder von pharmazeutisch
akzeptablen Derivaten davon kann zweckmäßig als pharmazeutische Zusammensetzung
mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern dafür in einer
Einheitsarzneiform angeboten werden. Eine zweckmäßige Einheitsarzneiformulierung
enthält
die aktiven Bestandteile in Mengen von jeweils 1 mg bis 2 g, z.B.
2 mg bis 200 mg, wie 25 bis 150 mg Lamivudin, und 0,5 bis 20 mg,
wie 1 bis 10 mg BMS-200475.
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Pharmazeutische
Zusammensetzungen können
ebenfalls dem Patienten in "Patientenpackungen" verschrieben werden,
die den gesamten Behandlungsverlauf in einer einzelnen Packung enthalten,
gewöhnlich
in einer Durchdrückpackung.
Patientenpackungen besitzen einen Vorteil gegenüber herkömmlichen Verschreibungen, in
denen ein Pharmazeut einen Patientenvorrat eines Pharmazeutikums
aus einem Massevorrat unterteilt, indem der Patient immer Zugriff
zur Packungsbeilage hat, die in der Patientenpackung enthalten ist,
aber normalerweise in herkömmlichen
Verschreibungen fehlt. Es wurde gezeigt, daß der Einschluß einer Packungsbeilage
die Therapietreue des Patienten gegenüber den Anweisungen des Arztes
verbessert.
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Es
ist selbstverständlich,
daß die
Verabreichungen der erfindungsgemäßen Kombination mittels einer einzelnen
Patientenpackung oder mittels Patientenpackungen jeder Zusammensetzung
innerhalb einer Packungsbeilage, die den Patienten auf die richtige
Verwendung der Erfindung hinweist, ein wünschenswertes zusätzliches
Merkmal dieser Erfindung ist.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Patientenpackung bereitgestellt,
die wenigstens einen aktiven Bestandteil der erfindungsgemäßen Kombination
und eine Informationsbeilage umfaßt, die Anleitungen zur Verwendung
der erfindungsgemäßen Kombination
enthält.
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Gemäß einem
anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Doppelpackung bereit, die
in Verbindung zur getrennten Verabreichung Lamivudin und BMS-200475
oder pharmazeutisch akzeptable Derivate davon umfaßt.
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Zusammensetzungen
schließen
diejenigen ein, die zur oralen, rektalen, nasalen, topischen (einschließlich transdermalen,
bukkalen und sublingualen), vaginalen oder parenteralen (einschließlich subkutanen,
intramuskulären,
intravenösen
und intradermalen) Verabreichung geeignet sind. Die Zusammensetzungen
können
zweckmäßig in Einheitsarzneiform
angeboten werden und können
durch alle auf dem Gebiet der Pharmazie allgemein bekannten Verfahren
hergestellt werden. Solche Verfahren stellen ein weiteres Merkmal der
vorliegenden Erfindung dar und schließen den Schritt des Inverbindungbringens
der aktiven Bestandteile mit dem Träger ein, der einen oder mehrere
Nebenbestandteile darstellt. Allgemein werden die Formulierungen
durch gleichförmiges
und inniges Inverbindungbringen der aktiven Bestandteile mit flüssigen Trägern oder feinverteilten
festen Trägern
oder beiden und, falls erforderlich, anschließendes Formen des Produkts
hergestellt.
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Erfindungsgemäße Zusammensetzungen,
die zur oralen Verabreichung geeignet sind, können als diskrete Einheiten
angeboten werden, wie Kapseln, Kapletts, Kachets oder Tabletten,
die jeweils eine vorher festgelegte Menge der aktiven Bestandteile
enthalten; als Pulver oder Granalien; als Lösung oder Suspension in einer
wäßrigen oder
nicht-wäßrigen Flüssigkeit;
oder als flüssige Öl-in-Wasser-Emulsion
oder flüssige
Wasser-in-Öl-Emulsion.
Der aktive Bestandteil kann ebenfalls als Bolus, Elektuarium oder
Paste angeboten werden.
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Eine
Tablette kann durch Verpressen oder Formen hergestellt werden, gegebenenfalls
mit einem oder mehreren Nebenbestandteilen. Verpreßte Tabletten
können
durch Verpressen der aktiven Bestandteile in freifließender Form,
wie als Pulver oder Granalien, gegebenenfalls vermischt mit einem
Bindemittel (z.B. Povidon, Gelatine, Hydroxypropylmethylcellulose),
Schmiermittel, inerten Verdünnungsmittel,
Konservierungsmittel, Tablettensprengmittel (z.B. Natriumstärkeglykolat,
vernetztes Povidon, vernetzte Natriumcarboxymethylcellulose), oberflächenaktiven
oder Dispergiermittel, in einer geeigneten Maschine hergestellt
werden. Geformte Tabletten können
durch Formen einer Mischung aus der gepulverten und mit einem inerten
flüssigen
Verdünnungsmittel
angefeuchteten Verbindung in einer geeigneten Maschine hergestellt
werden. Die Tabletten können
gegebenenfalls überzogen
oder gekerbt werden und können
so formuliert werden, um eine langsame oder kontrollierte Freisetzung
der aktiven Bestandteile darin bereitzustellen, wobei z.B. Hydroxypropylmethylcellulose
in unterschiedlichen Anteilen verwendet wird, um das gewünschte Freisetzungsprofil
bereitzustellen. Tabletten können
gegebenenfalls mit einem enterischen Überzug versehen werden, um
die Freisetzung in anderen Teilen der Eingeweide als im Magen bereitzustellen.
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Bevorzugt
werden die erfindungsgemäßen Kombinationen
oral verabreicht.
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Zur
topischen Verabreichung im Mund geeignete Zusammensetzungen schließen Lutschtabletten
ein, die die aktiven Bestandteile in einer aromatisierten Basis
umfassen, gewöhnlich
Saccharose und Gummi arabicum oder Tragacanthharz; Pastillen, die
den aktiven Bestandteil in einer inerten Basis, wie Gelatine und
Glycerin, oder Saccharose und Gummi arabicum umfassen; und Mundspülungen,
die den aktiven Bestandteil in einem geeigneten flüssigen Träger umfassen.
Zusammensetzungen zur rektalen Verabreichung können als Suppositorium mit
einer geeigneten Basis angeboten werden, die z.B. Kakaobutter oder
ein Salicylat umfaßt.
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Die
topische Verabreichung kann ebenfalls mittels einer transdermalen
iontophoretischen Vorrichtung erfolgen.
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Zur
vaginalen Verabreichung geeignete Formulierungen können als
Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprühformulierungen
angeboten werden, die zusätzlich
zum aktiven Bestandteil solche Träger enthalten, wie sie auf
diesem Gebiet als angemessen bekannt sind.
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Zur
rektalen Verabreichung geeignete pharmazeutische Formulierungen,
in denen der Träger
ein Feststoff ist, werden am meisten bevorzugt als Einheitsdosissuppositorien
angeboten. Geeignete Träger
schließen Kakaobutter
und andere Stoffe ein, die gewöhnlich
auf diesem Gebiet verwendet werden. Die Suppositorien können zweckmäßig durch
Vermischen der aktiven Kombination mit dem (den) erweichten oder
geschmolzenen Träger(n)
gefolgt von Abkühlen
und Formgebung in Formen gebildet werden.
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Zur
parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen schließen wäßrige und
nicht-wäßrige isotonische
sterile Injektionslösungen
ein, die Antioxidantien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe
enthalten können,
die die Formulierung isotonisch zum Blut des beabsichtigten Empfängers machen;
und wäßrige und nicht-wäßrige sterile
Suspensionen, die Suspendiermittel und Verdickungsmittel einschließen können; und
Liposomen oder andere mikroteilchenförmige Systeme, die zur Ausrichtung
der Verbindung auf Blutkomponenten oder eines oder mehrere Organe
geschaffen sind. Die Formulierungen können in versiegelten Einheitsdosis-
oder Mehrfachdosis-Behältern
angeboten werden, z.B. Ampullen und Fläschchen, und können in
einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand gelagert werden,
der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers erfordert, z.B. Wasser
zur Injektion, unmittelbar vor der Verwendung. Unvorbereitete Injektionslösungen und
Suspensionen können
aus sterilen Pulvern, Granalien und Tabletten der zuvor beschriebenen
Art hergestellt werden.
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Bevorzugte
Einheitsarzneiformulierungen sind diejenigen, die eine tägliche Dosis
oder eine tägliche Unterdosis
der aktiven Bestandteile wie hier zuvor angegeben oder einen geeigneten
Bruchteil davon enthalten.
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Es
sollte selbstverständlich
sein, daß die
Formulierungen dieser Erfindung zusätzlich zu den oben besonders
genannten Bestandteilen andere Mittel einschließen können, die auf diesem Gebiet
in bezug auf den Typ der fraglichen Formulierung herkömmlich sind,
z.B. können
die zur oralen Verabreichung geeigneten solche weiteren Mittel wie
Süßungsmittel,
Verdicker und Aromatisierungsmittel einschließen.
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Die
Verbindungen der Kombination der vorliegenden Erfindung können in
herkömmlicher
Weise erhalten werden.
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Verfahren
zur Herstellung von Lamivudin werden in WO 91/17159 und WO 95/29174
beschrieben.
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Verfahren
zur Herstellung von BMS-200475 werden in EP Nr. 0 481 754 beschrieben.
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"Aktiver Bestandteil" bezeichnet Lamivudin
oder BMS-200475 oder ein Mehrfaches davon oder ein pharmazeutisch
akzeptables Derivat von jeder der zuvor genannten Verbindungen.
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Beispiel 1: Tablettenformulierung
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Die
folgenden Formulierungen A, B und C werden durch Naßgranulierung
der Bestandteile mit einer Lösung
von Povidon, gefolgt von Zugabe von Magnesiumstearat und Verpressung
hergestellt. Formulierung
A
| mg/Tablette |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 5 |
Lactose
B.P. | 105 |
Povidon
B.P. | 7 |
Natriumstärkeglykolat | 10 |
Magnesiumstearat | 3 |
| 230 |
Formulierung
B
| mg/Tablette |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 5 |
Lactose
B.P. | 75 |
Avicel
PH 101 | 30 |
Povidon
B.P. | 7 |
Natriumstärkeglykolat | 10 |
Magnesiumstearat | 3 |
| 230 |
Formulierung
C
| mg/Tablette |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 5 |
Lactose
B.P. | 100 |
Stärke | 25 |
Povidon
B.P. | 2 |
Magnesiumstearat | 2 |
| 234 |
-
Die
folgenden Formulierungen D und E werden durch Direktverpressung
der vermischten Bestandteile hergestellt. Die Lactose in Formulierung
E ist vom Direktverpressungstyp (Dairy Crest – "Zeparox"). Formulierung
D
| mg/Tablette |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 5 |
Vorgequollene
Stärke
NF15 | 75 |
| 180 |
Formulierung
E
| mg/Tablette |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 5 |
Lactose
B.P. | 70 |
Avicel | 50 |
| 225 |
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Formulierung
F (Formulierung mit kontrollierter Freisetzung) Die Formulierung
wird durch Naßgranulierung
der Bestandteile mit einer Lösung
von Povidon gefolgt von Zugabe von Magnesiumstearat und Verpressung
hergestellt.
| mg/Tablette |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 5 |
Hydroxypropylmethylcellulose | 28 |
(Methocel
K4M Premium) Lactose B.P. | 13 |
Povidon
B.P. | 7 |
Magnesiumstearat | 2 |
| 155 |
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Die
Wirkstofffreisetzung erfolgt über
einen Zeitraum von ca. 6-8
Stunden und ist nach 12 Stunden vollständig.
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Beispiel 1a: Tablettenformulierung
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Die
folgenden Formulierungen a, b und c werden durch Naßgranulierung
der Bestandteile mit einer Lösung
von Povidon, gefolgt von Zugabe von Magnesiumstearat und Verpressung
hergestellt. Formulierung
a
| mg/Tablette |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 1 |
Lactose
B.P. | 105 |
Povdidon
B.P. | 7 |
Natriumstärkeglykolat | 10 |
Magnesiumstearat | 3 |
| 226 |
Formulierung
b
| mg/Tablette |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 1 |
Lactose
B.P. | 75 |
Avicel
PH 101 | 30 |
Povidon
B.P. | 7 |
Natriumstärkeglykolat | 10 |
Magnesiumstearat | 3 |
| 226 |
Formulierung
c
| mg/Tablette |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 1 |
Lactose
B.P. | 100 |
Stärke | 25 |
Povidon | 2 |
Magnesiumstearat | 2 |
| 230 |
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Die
folgenden Formulierungen d und e werden durch Direktverpressung
der vermischten Bestandteile hergestellt. Die Lactose in Formulierung
e ist vom Direktverpressungstyp (Dairy Crest – "Zeparox"). Formulierung
d
| mg/Tablette |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 1 |
Vorgequollene
Stärke
NF15 | 75 |
| 176 |
Formulierung
e
| mg/Tablette |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 1 |
Lactose
B.P. | 70 |
Avicel | 50 |
| 221 |
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Beispiel 2: Kapselformulierungen
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Formulierung A
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Eine
Kapselformulierung wird durch Vermischen der Bestandteile der Formulierung
D im obigen Beispiel 1 und Einfüllen
in eine zweiteilige Hartgelatinekapsel hergestellt. Formulierung
B (unten) wird in einer ähnlichen
Weise hergestellt. Formulierung
B
| mg/Kapsel |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 5 |
Lactose
B.P. | 70 |
Natriumstärkeglykolat | 10 |
Magnesiumstearat | 1 |
| 186 |
Formulierung
C
| mg/Kapsel |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 5 |
Macrogel
4000 B.P. | 170 |
| 275 |
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Kapseln
der Formulierung C werden durch Schmelzen des Macrogel 4000 B.P.,
Dispergieren des aktiven Bestandteils in der Schmelze und Einfüllen der
Schmelze in eine zweiteilige Hartgelatinekapsel hergestellt. Formulierung
D
| mg/Kapsel |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 5 |
Lecithin | 50 |
Erdnußöl | 50 |
| 205 |
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Kapseln
der Formulierung D werden durch Dispergieren des aktiven Bestandteils
im Lecithin und Erdnußöl und Einfüllen der
Dispersion in weiche elastische Gelatinekapseln hergestellt.
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Formulierung E (Kapsel
mit kontrollierter Freisetzung)
-
Die
folgende Kapselformulierung mit kontrollierter Freisetzung wird
durch Extrudieren der Bestandteile a, b und c unter Verwendung eines
Extruders gefolgt von Sphäronisierung
des Extrudats und Trocknen hergestellt. Die getrockneten Pellets
werden dann mit einer die Freisetzung kontrollierenden Membran (d) überzogen
und in eine zweiteilige Hartgelatinekapsel eingefüllt.
| mg/Kapsel |
(a)
Aktiver Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 5 |
(b)
Mikrokristalline Cellulose | 60 |
(c)
Lactose B.P. | 60 |
(d)
Ethylcellulose | 6 |
| 231 |
Beispiel
3: Injizierbare Formulierung Formulierung
A
| mg |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 5 |
Salzsäure-Lösung 0,1
M oder Natriumhydroxid-Lösung
0,1 M, in genügender
Menge auf pH | 4,0
bis 7,0 |
Steriles
Wasser in genügender
Menge auf | 10
ml |
-
Der
aktive Bestandteil wird im Großteil
des Wassers (35–40°C) gelöst und der
pH mit der Salzsäure oder
dem Natriumhydroxid nach Bedarf auf 4,0 bis 7,0 eingestellt. Die
Charge wird dann mit dem Wasser zum Volumen aufgefüllt und
durch einen sterilen Mikroporenfilter in ein steriles 10 ml-Braunglasfläschchen
(Typ 1) filtriert und mit sterilen Verschlüssen und Übersiegeln versiegelt. Formulierung
B
Aktiver
Bestandteil A | 100
mg |
Aktiver
Bestandteil B | 5
mg |
Steriler,
pyrogenfreier Phosphatpuffer pH 7, in genügender Menge auf | 25
ml |
Beispiel
4: Intramuskuläre
Injektion
Aktiver
Bestandteil A | 100
mg |
Aktiver
Bestandteil B | 5
mg |
Benzylalkohol | 0,067
g |
Glycofurol
75 | 0,94
g |
Wasser
zur Injektion in genügender
Menge auf | 3,00
ml |
-
Der
aktive Bestandteil wird im Glycofurol gelöst. Der Benzylalkohol wird
dann hinzugegeben und gelöst
und Wasser auf 3 ml hinzugegeben. Die Mischung wird dann durch einen
sterilen Mikroporenfilter filtriert und in sterilen 3 ml-Braunglasfläschchen
(Typ 1) versiegelt. Beispiel
5: Sirup
Aktiver
Bestandteil A | 100
mg |
Aktiver
Bestandteil B | 5
mg |
Sorbitlösung | 0,6
mg |
Glycerin | 0,85
g |
Natriumbenzoat | 0,0025
g |
Geschmacksstoff,
Pfirsich 17.42.3169 | 0,0125
ml |
Gereinigtes
Wasser in genügender
Menge auf | 5,00
ml |
-
Der
aktive Bestandteil wird in einer Mischung aus dem Glycerin und dem
Großteil
des gereinigten Wassers gelöst.
Eine wäßrige Lösung des
Natriumbenzoats wird dann zur Lösung
gegeben, gefolgt von Zugabe der Sorbitlösung und schließlich des
Geschmacksstoffs. Das Volumen wird mit gereinigtem Wasser aufgefüllt und
gut vermischt. Beispiel
6: Suppositorium
| mg/Kapsel
Suppositorium |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 5 |
Hartfett,
B.P. (Witepsol H15 – Dynamit
Nobel) | 1770 |
| 1875 |
-
1/5
des Witepsol H15 wird in einem Tiegel mit Dampfmantel bei maximal
45°C geschmolzen.
Der aktive Bestandteil wird durch ein 200 μm-Sieb gesiebt und zur geschmolzenen
Basis unter Vermischen unter Verwendung eines mit einem Schneidkopf
ausgerüsteten
Silverson gegeben, bis eine glatte Dispersion erhalten wird. Unter
Halten der Mischung auf 45°C
wird das verbleibende Witepsol H15 zur Suspension gegeben und gerührt, um
eine homogene Mischung sicherzustellen. Die gesamte Suspension wird
durch ein 250 μm-Sieb aus
rostfreiem Stahl passiert und unter kontinuierlichem Rühren auf
40°C abkühlen gelassen.
Bei einer Temperatur von 38 bis 40°C werden 2,02 g der Mischung
in geeignete 2 ml-Plastikformen gefüllt. Man läßt die Suppositorien auf Raumtemperatur
abkühlen. Beispiel
7: Pessare
| mg/Pessar |
Aktiver
Bestandteil A | 100 |
Aktiver
Bestandteil B | 5 |
Wasserfreie
Dextrose | 160 |
Kartoffelstärke | 150 |
Magnesiumstearat | 3 |
| 418 |
-
Die
obigen Bestandteile werden direkt vermischt und Pessare durch Direktverpressung
der resultierenden Mischung hergestellt.
-
Biologische Daten
-
Beispiel 8
-
Die
humane Hepatoblastom-Zellinie (Hep-G2-2.2.15), die konstitutiv infektiöses HBV
erzeugt, wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit einer
Dichte von 5 × 103 Zellen pro Vertiefung übergeimpft. Diese Zellen wurden
dann mit einer Kombination aus Lamivudin (3TC) und BMS-200475 auf
Platten in dreifacher Ausführung
behandelt. Kulturmedium, das die Wirkstoffe enthielt, wurde jeden
zweiten Tag für
9 Tage erneuert, wobei die Überstände aufgefangen
und auf den HBV-Gehalt analysiert wurden.
-
Die
Lamivudin/BMS-200475-Kombination wurde dreimal in dreifacher Ausführung in
einer Matrixweise getestet. Die 3 Experimente verwendeten einen
Lamivudin-Bereich von 100 nM bis 0,046 nM (3-fache Verdünnungen
in Spalten). BMS-200475 wurde seriell zur Bildung einer Konzentrationsreihe
von 5,0 bis 0,0002 nM verdünnt
(3,16-fache Verdünnungen
in Zeilen). Beide Wirkstoffe wurden in einer getrennten Mikrotiterplatte
mit 96 Vertiefungen verdünnt
und anschließend
auf Platten überführt, die
die Zell-Monoschichten enthielten. Die Zellen wurden in 150 μl RPMI 1640
gezüchtet,
das mit 2 mM L-Glutamin und 10 % fötalem Rinderserum ergänzt war.
Vor der Übertragung
des Wirkstoffs wurden 120 μl
Medium aus den Zellen entfernt, wobei 30 μl auf den Monoschichten verblieben,
um ein Trocknen zu verhindern. 90 μl frisches Medium ohne Wirkstoff
wurden hinzugegeben, gefolgt von Zugabe von 30 μl von 5X-Wirkstoffverdünnungen.
Lamivudin und BMS-200475 wurden jeweils auf ihren entsprechenden
Platten individuell mit den gleichen Konzentrationen getestet. Die Daten
wurden auf Werte normiert, die mit nicht- wirkstoffbehandelten Zellen erhalten
wurden, und als Prozent der Kontrolle zur Analyse ausgedrückt.
-
Das
zur Detektion von HBV verwendete Verfahren wurde zuvor beschrieben
(R.W. Jansen, L.C. Johnson, D.R. Averett, "High-Capacity in vitro assessment of
anti-hepatitis B virus compound selectivity by a virion-specific
polymerase chain reaction assay".
Antimicrob. Agents Chem. 1993; 37 (3): 441–447). Kurz gesagt wurde die
HBV-Detektion durch "Einfangen" von Virus aus Überständen auf
Anti-HBsAg-beschichteten Platten, Waschen, Denaturieren zur Freisetzung
von HBV-DNA, Durchführen
von PCR mit biotinylierten Primern, Streptavidin-Einfangen der biotinylierten
PCR-Produkten mit
gleichzeitiger Sondenhybridisierung, Addition von Substrat und Auslesen
optischer Dichten der kolorimetrischen Reaktion durchgeführt. Verdünnungen
eines standardisierten HBV-haltigen Überstandes wurden auf jeder
Platte eingeschlossen, und HBV-DNA-Konzentrationen der Testvertiefungen
wurden aus dieser HBV-Standardkurve berechnet. Der nützliche
Detektionsbereich beträgt
wenigstens 0,045 bis 45 fg von HBV-DNA, wobei 30 Kopien des Genoms
zuverlässig
detektiert werden können.
Die Proben wurden in Verbindung mit sowohl positiven (0,448 fg/μl Plasmid-DNA)
und negativen Kontrollen (RPMI-Medium, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin und
10 % fötalem
Kälberserum)
getestet.
-
Der
durchschnittliche IC50-Wert und der Standardfehler
der IC50-Werte für die Platten in dreifacher
Ausführung
wurden unter Verwendung einer nicht-linearen SAS-Regression berechnet,
um die Daten an die Hill-Gleichung für jede Konzentrations-Reaktions-Kurve
anzupassen. Wenn nur eine einzelne Bestimmung eines IC50-Wertes
für eine
besondere Dosiskombination durchgeführt werden konnte, wurde der
Durchschnitt der Standardfehler aus benachbarten Konzentrationen
verwendet, um den Standardfehler abzuschätzen. Fraktionelle inhibitorische
Konzentrationen (FIC50) wurden für
jede Kombination berechnet und unter Verwendung der Isobologramm-Darstellung
aufgetragen (M.C. Berenbaum (1985), The Expected Effect of a Combination
of Agents: the General Solution, J. Theor. Biol. 114, 413–431). Zur
Bewertung der statistischen Signifikanz von Synergismus oder Antagonismus
wurde ein ungepaarter t-Test verwendet, um jede Summe von gepaarten
FIC50-Werten mit dem theoretischen Wert von 1 zu vergleichen. P-Werte
von weniger als 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet.
In einigen Fällen
konnten nicht alle untersuchten Konzentrationen die Berechnung eines
IC50-Wertes stützen, da die Reaktion zu einem
größeren Ausmaß als 50
% der Kontrolle für alle
Dosen inhibiert wurde.
-
1, 2 und 3 stellen
graphisch die Isobologrammdaten für die Experimente 1, 2 bzw.
3 dar.
-
4 kombiniert
Daten aus allen drei Experimenten in einem einzelnen Isobologramm.
-
Wechselwirkungen
mit Durchschnittsabweichungen, die sich –0,5 annähern, würden als stark betrachtet,
während
eine beobachtete Abweichung von –0,2 als schwach bis mäßig betrachtet
würde.
Das Ausmaß der
statistischen Signifikanz zeigt, daß die Wirkung real und reproduzierbar
ist. Obwohl Ergebnisse aus Experiment 1 nur einen additiven Effekt
anzeigten, zeigten die Experimente 2 und 3 jeweils eine schwache,
aber statistisch signifikante synergistische Inhibierung der HBV-Vermehrung
für die
Kombination aus Lamivudin und BMS-200475 an. Wenn Daten für alle drei
Experimente kombiniert wurden, um eine kompilierte Datenbank zu erzeugen,
wurde ein schwacher, aber statistisch signifikanter Synergismus
beobachtet.
-
Beispiel 9
-
Die
Ki-Werte für die aktiven Formen von BMS
200475, BMS 200475-Triphosphat
(BMS 200475-tp) und Lamivudin, Lamivudin-Triphosphat (Lamivudin-tp)
wurden gegen die HBV-Polymerasen vom Wildtyp und die YMDD-Variante in einem
In-vitro-Assay bestimmt, der aus HBV-Kernpartikeln bestand, die
aus transient transfizierten oder transduzierten HepG2-Zellen isoliert
wurden. HepG2-Zellen wurden transient mit Plasmid transfiziert,
das das HBV-Genom enthielt, das die Wildtyp-Sequenz besaß oder die
folgenden Aminosäureveränderungen
im reversen Transkriptase-Gen enthielt: M552I, M552V, L528M, L528MM552V,
L528MM552I (M.I. Allen, M. Deslauriers, C.W. Andrews, G.A. Tipples,
K.A. Walters, D.L.J. Tyrrell, N. Brown. (Lamivudine Clinical Investigation
Group) und L.D. Condreay, Identification and characterization of
mutations in hepatitis B virus resistant to Lamivudine, HEPATOLOGY
1998; 27:1670–1677).
Transiente Transduktionen wurden unter Verwendung von Baculovirus
durchgeführt,
das die gleichen Konstrukte enthielt (J.P. Condreay, S.M. Witherspoon, W.C.
Clay, T.A. Kost (1999) Transient and stable gene expression in mammalian
cells transduced with a recombinant baculovirus vector. PNAS, 96,
127–132).
Der Kernpolymerase-Assay war eine Modifikation eines zuvor angegebenen
Protokolls (M.G. Davis, J.E. Wilson, N.A. VanDraanen, W.H. Miller,
G.A. Freeman, S.M. Daluge, F.L. Boyd, A.E. Aulabaugh, G.R. Painter,
L.R. Bonne (1996) DNA polymerase activity of hepatitis B virus particles:
differential inhibition by L-enantiomers of nucleotide analogs.
Antiviral Res. 30, 133–145). HBV-Kernpartikel wurden
in der folgenden Weise isoliert. Kurz gesagt wurden die Zellen 5
Tage nach der Transfektion oder Transduktion geerntet und pelletisiert.
Das Zellpellet wurde in einer hypotonischen Lösung resuspendiert und die
Zellen mit NP-40 bei einer Endkonzentration von 0,5 % lysiert. Die
Kerne wurden pelletisiert, und der Zellüberstand wurde mit RNase und
DNase verdaut. Das behandelte Lysat wurde durch einen Saccharose-Stufengradienten
pelletisiert. Das resultierende Pellet, das HBV-Kerne enthielt,
wurde durch Ultraschallbehandlung in einem Puffer resuspendiert,
der 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 50 mM KCl und 5 mM MgCl2 enthielt.
Dieses Material wurde bei –80°C bis zur
Verwendung in Polymerase-Assays gelagert. Antikörper-Einfang-ASSay-Platten
wurden unter Verwendung des folgenden Protokolls hergestellt: Costar
#3632 (Corning, Corning, NY) wurden sequenziell beschichtet mit
1) Neutravidin (Pierce, Rockford, IL) in 50 mM Natriumcarbonatpuffer
(Sigma- St. Louis, MO), pH 9,6, 0,10 mg/ml, 0,15 ml pro Vertiefung
für 2 Stunden
bei Raumtemperatur, dann mit 3 × 0,25
ml/Vertiefung mit Waschpuffer gewaschen, WP (150 mM NaCl, 100 mM
Natriumphosphat, pH 7,2, 0,02 % Tween-20 (Pierce, Rockford, IL),
0,02 % Natriumazid, 0,01 % Rinderserumalbumin (Sigma, St. Louis,
MO)); 2) biotinyliertem Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Pierce, Rockford,
IL), verdünnt
auf 0,0015 mg/mlg in WP mit 0,15 ml pro Vertiefung für 1 Stunde
bei Raumtemperatur, dann gewaschen 3 × 0,25 ml/Vertiefung mit WP;
und 3) Kaninchen-anti-HBV-Kern-Antigen-Antikörper (Zymed, San Francisco,
CA), verdünnt
1:300 in WP mit 0,15 ml pro Vertiefung für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
Die Platten wurden 2 × 0,25 ml/Vertiefung
mit WP gewaschen und WP mit 0,25 ml pro Vertiefung am Ende der Spülung hinzugegeben.
Die Platten wurden in einer angefeuchteten Kammer bei 4°C gelagert.
Der Kern-Polymerase-Assay
war eine Modifikation eines zuvor angegebenen Protokolls (M.G. Davis,
J.E. Wilson, N.A. VanDraanen, W.H. Miller, G.A. Freeman, S.M. Daluge,
F.L. Boyd, A.E. Aulabaugh, G.R. Painter, L.R. Boone (1996), DNA
polymerase activity of hepatitis B virus particles: differential
inhibition by L-enantiomers of nucleotide analogs. Antiviral Res.
30, 133–145).
Kernpartikelzubereitungen wurden auf Eis aufgetaut und durch Ultraschallbehandlung
vor jedem Assay resuspendiert. Kernpartikel-Assays enthielten folgendes:
Kernpartikel (gewöhnlich
107 bis 108/10 μl Reaktion) in 230 mM KCl, 33
mM Tris-HCl, pH 7,4, 8 mM MgCl2, 0,2 % NP-40,
5 mM DTT, 7 Einheiten/ml Pyruvatkinasepuffer (Sigma St. Louis, MO),
2 mM Phosphoenolpyruvatpuffer (Sigma, St. Louis, MO), 25 mM unmarkierte
dNTPs (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 33P-markiertes
dNTP (NENTM Life Science Products, Boston,
MA, 2000 Ci/mmol) mit 0 bis 4 μM.
Assays von 10 μl
wurden bei 37°C für 45 bis
90 Minuten in einer Polypropylen-Platte mit 96 Vertiefungen inkubiert
(USA Scientific, Ocala, FL), dann mit 90 μl des folgenden Puffers angehalten:
50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2,
0,05 % Tween-20, 2 mM Natriumpyrophosphat, 0,02 % Natriumazid. Der
gesamte angehaltene 100 μl-Assay
wurde in einer Antikörper-Einfangplatte
mit 96 Vertiefungen überführt und
bei Raumtemperatur unter Schütteln
für 2 Stunden
inkubiert. Nach dem Antikörper-Einfangen
wurden die Vertiefungen 5-mal mit dem folgenden Puffer gewaschen:
150 mM NaCl, 100 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 0,05 % Tween-20, 2
mM Natriumpyrophosphat, 0,02 % Natriumazid. Überschüssiger Puffer wurde durch Klopfen
der Platten auf Saugpapier entfernt. 170 μl von Wallac Optiphase "Supermix" (Wallac Inc., Gaithersburg,
MD) wurden zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten wurden an einem Wallac
1450 Microbeta Plus Flüssigszintillationszähler (Wallac
Inc., Gaithersburg, MD) gezählt.
Inhibierungsassays waren im wesentlichen die gleichen wie die Kernpolymerase-Assays,
außer
daß die
Konzentration von alpha-33P-dGTP bei Km für
Wildtyp-Polymerase war, wenn BMS 200475-Triphosphat untersucht wurde. Die Konzentration
von BMS 200475-tp reichte von 0,01 bis 350 μM. Der IC50-Wert
ist die inhibitorische Konzentration der Verbindung, bei der die
Polymeraseaktivität
50 % ist. [S] ist die Konzentration des konkurrierenden Substrats
(für BMS
200475-tp ist es 33P-markiertes dGTP). Erzeugte Konzentrations-Reaktions-Kurven
wurden an die Hill-Gleichung y=(Vmax·xn)/(Kn+xn) unter Verwendung
einer nicht-linearen Regression angepaßt, um den IC50-Wert
von BMS 200475-tp abzuschätzen.
Ki-Werte
wurden unter Verwendung der folgenden Formel berechnet:
Ki=IC50/(1+[S]/Km)· Km für
dGTP für
jede Polymerase ist wie folgt: Wildtyp, 0,07 μM; LMMV, 0,16 μM; MI, 0,35 μM; LMMI,
0,18 μM;
LM, 0,11 μM;
und MV, 0,29 μM.
Berechnungen wurden unter Verwendung des RoboSage Add-in für Microsoft
EXCEL durchgeführt.
Der Ki-Wert für
Lamivudin-tp wurde im wesentlichen in der gleichen Weise bestimmt,
außer
daß der
markierte Konkurrent alpha-33P-dCTP war
und seine Konzentration auf den Km-Wert
für dCTP
für jede
untersuchte Polymerase eingestellt wurde. Lamivudin-Triphosphat wurde
in einem Bereich von 0,005 bis 2600 μM untersucht.
-
Tabelle
1. Lamivudin-tp und BMS 200475-tp: K
i und
Faltungsveränderung
in K
i
-
BMS
200475 und Lamivudin wurden ebenfalls in einem Assay auf Zellbasis
gegen Wildtyp und ausgewählte
YMDD-Varianten untersucht. Vier Zellinien wurden verwendet: eine
war die 2.2.15-Linie, die Wiltyp-HBV-Virus erzeugt, und die drei
anderen Zellinien, die Wildtyp-, LMMI- oder LMMV-Virus erzeugen, wurden in diesem Labor
entwickelt. Die Labor-Zellinien wurden durch stabiles Transformieren
von HepG2-Zellen mit DNA geschaffen, die die viralen Genome mit
entweder Wildtyp- oder Varianten-Polymerase enthielt. Der zur Bestimmung
der Verbindungswirkungen auf die HBV-Erzeugung verwendete Assay
wurde an anderer Stelle beschrieben (R.W. Jansen, L.C. Johnson,
D.R. Averett, High-Capacity in vitro assessment of anti-hepatitis
B virus compound selectivity by a virion-specific polymerase chain
reaction assay. Antimicrob. Agents Chemother. 1993, 37:441–447). Lamivudin
wurde bei Konzentrationen von 0,00032 bis 200 μM und BMS 200475 bei Konzentrationen
von 0,000032 bis 2 μM
getestet.
-
Tabelle
2. Assay auf Zellbasis: Lamivudin und BMS 200475
-
Diskussion
-
Im
Kernpartikel-Polymerase-Assay zeigt BMS 200475-tp eine gewisse Reduktion
der Aktivität
gegen jede der YMDD-Varianten mit der Ausnahme der einzelnen LM-Variante.
Jedoch ist die Faltungsänderung
der Aktivität
nicht so groß wie
die mit Lamivudin-tp beobachtete. Die Ergebnisse sind ähnlich,
wenn Lamivudin und BMS 200475 im Assay auf Zellbasis verwendet und
gegen Wildtyp und zwei der YMDD-Varianten getestet werden. Weil
der EC50-Wert von BMS 200475 im unteren Pikomol-Bereich ist, führt selbst
die fast 700-fache Zunahme der Konzentration, die zum Erreichen
des EC50-Wertes für
die LMMI-Variante
erforderlich ist, zu einer Endkonzentration der Verbindung von 22
nM.