JPH0125A - ｄｓＲＮＡと逆転写酵素インヒビターを含んで成るＨＩＶ感染治療のための医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ウィルス性疾患を制御するために又はその処
置においてウィルスの活性もしくはウィルスの発現を抑
制する他の薬剤との相乗的組合せにおけるｄｓＲＮＡの
使用に関する。また、さらにかかる治療において有用な
医薬の組成物が開示される。

〔発明の背景〕

二重鎖ＲＮＡ５（ｄｓＲＮＡｓ）　、例えばｐｏｌｙ　
Ｉ　・ｐｏｌｙｃは抗ウィルス活性、抗新生物活性及び
免疫調整活性を誘発する生物学的な応答調節剤として作
用し得る。これらの生物学的な応答に対する信頼できる
多面的効果の間には、インターフェロン（ＩＦＮ）及び
他の酵素並びに２．５−オリゴアデニル酸シンターゼ及
びリポソームに関連したプロティンキナーゼを含む一定
のＩＮＦ誘導酵素の誘導が存在する。これらの性状は、
ｄｓＲＮＡを、後天性免疫不全症症候群（ＡＩＤＳ）の
原因となるレトロウィルス、ヒト免疫不全ウィルス（Ｈ
ＩＶ）の治療ニ対する興味をそそる候補物としている。

事実、式％式％ ｄｓＲＮＡは、ヒトにおいて低い毒性を有し、試験管内
（側ｖｉｔｒｏ）及び生体内（２匡ｖ　ｉ　ｖｉ　ｏ）
のいずれにおいてもＨＩＶに対して活性があり、そして
さらに最近では大規模な＾ＩＤＳ関連コンプレックス（
ＡＲＣ）の制御された臨床上の試験に付されている。

最近、ＡＩＤＳ研究についてのアメリカの財団（ＡｍＦ
ＡＲ）は、ＡＲＣ及びＡＩＤＳの治療に対する使用につ
いて試験されている６０種以上の医薬を目録に載せてい
る。単剤療法に属するこの膨大な数の可能性のあるもの
が併用療法における可能な相乗作用を目的に組合わされ
た。他方、併用療法は、アジドチミジン（ＡＺＴ）及び
リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）の試験管内試験で示
されたように拮抗作用についての可能性を有する。これ
らの理由から、本発明者は原形のウィルス性病原体とし
て用いたＨＩＶによるＡＲＣ及びＡＩＤＳの治療におい
てミスマツチｄｓＲＮＡの最大限の潜在力を特徴付ける
ことを決心した。本発明者は、上記ウィルスに対する攻
撃の少なくとも５つの異る類別に共に含まれる他の薬剤
との併用の中で核となる医薬として、ミスマツチｄｓＲ
ＮＡを用いて試験管内で多数の医薬分析を行うことによ
り上記特徴付けを遂行した。これらの薬剤は、細胞分裂
促進剤（サイトカイン：　ｃｙｔｏｋｉｎｅ）のような
ｒｌＦＮ−アルファＡ。

ｒｒＦＮ−ベーター５ｅｒ１７及びｒｌＦＮ）’ｉ逆転
写インヒビターのようなアジドチミジン及びフォスフォ
ノホルメート（ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｆｏｒｍａｔｅ　（
ｆｏｓｃａｒｎｅｔ））　；適切なｍＲＮＡキャンピン
グを支配する機構の崩壊剤と推定されるようなりババリ
ン（ｒｉｂａｖａｒｉｎ）　；抗ＨＩＶ活性を有する脂
質結合性分子のようなアンフォテリシン（ａｍｐｈｏｔ
ｅｒｉｃｉｎ）　Ｂ　；そして糖タンパク質プロセッシ
ングのインヒビターのようなカスタノスペルミン（ｃａ
ｓｔａｎｏｓｐｅｒｍｉｎｅ）　（引用文献（１）参照
）が包含される。上記薬剤の１つ、アジドチミジンは、
より詳細には後述するようにミスマツチｄｓＲＮＡと試
験管内で相乗的に作用した。

本発明者は、これらの医薬の各々が薬剤別に最も効果的
な投与量でミスマツチｄｓＲＮＡと相乗作用を有する投
与量依存性の抗ＨＩＶ活性を有することを発見した。

〔発明の詳細な 説明は、ウィルス疾患の治療における広範囲の抗ウィル
ス化合物の１つと一緒に、ｄｓＲＮＡ　、とりわけミス
マツチｄｓＲＮＡの相乗作用的な併用剤の使用を包含す
る。該併用剤はウィルス活性を抑制するか、もしくはウ
ィルスの発現を抑制するか、又は両方の目的のために十
分な量で患者に投与される。ｄｓＲＮＡ及び他の抗ウイ
ルス活性化合物を含有する医薬組成物が開示され、そし
て該併用剤が示す相乗作用の結果を以下に述べる。

本明細書に提示されるデータは、一般にはウィルスの発
現の制御において、そして具体的にはレトロウィルスの
制御において、慢性的に衰弱するヒトの疾病と関連付け
られる典型的なヒトウィルスとしてのＨＩ　Ｖ　（ＡＩ
ＤＳウィルス）に役立つさまざまな他の薬剤との併用に
より相乗作用を示す薬剤としてのｄｓＲＮＡの役割を実
証している。本発明は、総体的又は部分的に、ウィルス
増殖／発病の共通の機構を有し、そしてそのために使用
される特別な併用剤に対して感応するＨＩＶ以外の怒受
性のウィルス感染のための治療法を包含する。

サイトカイン、逆転写酵素インヒビター、リソフィール
（ｌｙｓｏｐｈｉｌｑｓ）　インヒビター及び糖タンパ
ク質プロセッシング　インヒビター等の抗ウイルス性化
合物を包含する広範囲の本質的に異る化合物を用いて、
ウィル性活性／発現を抑制する場合の相乗作用が見られ
ることは予想外のことである。

ＡＩＤＳの効果的な治療は、地球を取り巻くほとんどす
べての国における医師の間で明らかに増大する関心事と
なってきた。ＡＲＣ及びＡＩＤＳの治療のためにアメリ
カ合衆国で最初に承認された、アジドチミジンは極端な
毒性を有する。この生体内毒性は、必要とする血液注入
量のアジドチミジンを投与される患者の約３０％に現わ
れた。本発明者の実験結果は、アジドチミジンのような
高い生体内毒性を有する医薬が、もしミスマツチｄｓＲ
ＮＡと併用されるならば相当に低く、より少ない毒性の
投与量で与えられ得ることを示唆する。併用療法は、単
に抗ウィルス活性のために必要とされる医薬の有効投与
量を減らすことができ、それによって医薬の毒性が減少
するだけでなく、またさらに多数の機構を通してウィル
スを攻撃する結果として明白な抗ウイルス性効果を増進
する０本明細書で述べられる相乗作用を伴うミスマツチ
ｄｓＲＮＡの多面的な活性は、ＡＲＣ及びＡＩＤＳに対
する最も効果的でそして最も低毒性の治療をもたらす併
用療法について、一般にｄｓＲＮＡが、そしてとりわけ
ミスマツチｄｓＲＮＡが効果的な核となる医薬であり得
ることを示唆する。より詳細については以下に明らかに
するようにｄｓＲＮＡ　、特にミスマツチｄｓＲＮＡと
の併用における、抗ウィルス剤の５つの相違する一般的
な類別を代表する、８つの相違する抗ウィルス剤につい
ての研究は、ｄｓＲＮＡ　。

特にミスマツチｄｓＲＮＡが一般に、そして具体的には
ＡＩＤＳ関連コンプレックス（ＡＲＣ）及びＡＩＤＳそ
のものを包含するＨＩＶ感染の治療において、抗ウィル
スの治療を補って相乗作用を示すことが実証された。単
独でそしてウィルス性症状を処理するための効果的な量
で投与した場合、重大な毒性を生じることが知られてい
る他の抗ウィルス剤との併用により投与したとき、これ
らのｄｓＲＮ＾は、その上さらに、上記治療法の必要と
される治療結果に悪影響を及ぼすことなく、上記併用剤
の構成薬剤の毒性の量を減少させることを臨床医に許容
する利益を有する。本発明の併用剤の相乗作用を実証す
るために、核となる医薬としてミスマツチ二重鎖ＲＮＡ
　（アンプリゲン）を伴う複数の医薬効果の分析が、他
の薬剤を確認するため、そしてミスマツチｄｓＲＮ＾を
通してヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）感染における効
果的治療の介在を増強する機構を確認するために実施さ
れた。

抗ウィルス活性は、ターゲットとしてＭＴ−２細胞を利
用し、そしてウィルス源としてＨ９細胞中で産生される
１（ＴＬＶ　−ＩＩＩ　ｌを利用するマイクロタイター
・インフエクション・アッセイ　（ｍｉｃｒｏｔｉｔｉ
ｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　）によって明ら
かにされた。試験された薬剤の範囲は、サイトカインと
してのｒＩＦＮ−アルファＡ、ｒｌＦＮ−ベーターＳｔ
！Ｒ１７、及びｒｌＦＮ　−ｙ　；逆転写のインヒビタ
ーとしてのアジドチミジン及びフォスフォノホルメート
（Ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）　；；適切なｍＲＮＡキャンピ
ングの仮定的な阻害剤としてのリバビリン（ｒｉｂａｖ
ｉｒｉｎ）　；脂質親和性剤としてのアンホテリシン；
そして糖タンパク質プロセッシング（グルコシダーゼＩ
）インヒビターのようなカスタノスペルミンを包含した
。個別に、各々の医薬が投与量依存性抗ＨＩ　Ｖ活性を
示し、そしてミスマツチｄｓＲＮＡと併用された場合に
相乗作用を示した。

ミスマツチｄｓＲＮ＾は、マイクロタイター・インフェ
クション・アッセイで抗ＨＩ　Ｖ活性について全ての３
つのＩＦＮｓと相乗的であったが、Ｈ９／ＨＴＬν１［
［ｓ細胞の培養物中でウィルス産生のＩＦＮにより誘導
される抑制をミスマツチｄｓＲＮＡは増大しなかった。

ｄｓＲＮＡｓの多面的な活性はＩＮＦのこれらの活性と
は異り、そしてＡＩＤＳの治療のための広範囲の抗ウイ
ルス性医薬との併用療法において相乗作用を示し得るこ
とを、これらの研究の結果が示唆する。

本発明の方法及び療法組成物は、本明細書に挙げられた
さまざまな類別の説明及び例示として、上記列挙した薬
剤を包含することが意図されている。いまだ発見されて
いないがｄｓＲＮＡｓとの併用の場合に相乗作用を有す
るさまざまな他の薬剤もまた、本発明の態様の中に包含
される。

“マツチ（ｍａｔｃｈｅｄ）　ｄｓＲＮＡｓ　”は、相
対鎖間の水素結合（塩基の積み重ね）がほぼ完全である
、即ち、中断が２９個の連続する塩基残基毎に１個未満
の塩基対であることを意味する。従って、“ミスマツチ
ｄｓＲＮＡ”の語は理解されるだろう。

上記ｄｓＲＮＡは、ウラシル塩基又はグアニジン塩基を
例えば、塩基として１：５−１：３０の割合で含有する
ポリイノシネート及びポリシチジレートの複合体であり
得る（ｐｏｌｙ　Ｉ　−ｐｏｌｙ　（Ｃａ−２９　Ｘ〉
Ｕ又はＧ））、該ｄｓＲＮＡは、Ｃ対Ｕの比が約１２−
１４対ｌ、好ましくは１３対ｌ、そしてｐｏｌｙ　［及
びｐｏｌｙｃ　、　Ｕの沈降係数が９未満で、かつお互
に２単位以内で；好ましくは約６．５−約７．５を示す
ｐｏｌｙ　Ｉ　−ｐｏｌｙｃ　、　Ｕであってもよい。

本発明の用途のために好ましいミスマツチｄｓＲＮＡは
、ｐｏｌｙ　（Ｃｎ　　、　Ｇ）（式中、ｎは４−２９
の整数値を表わす）から選ばれた共重合ヌクレオチドに
基づくものであり、そしてｒＩｎ　　−ｒ　Ｃｎを改変
してポリリボシチジレート（ｒＣｎ）鎖に沿って不対塩
基（ウラシル又はグアニン）を導入することにより調製
された、ポリリボイノシン酸及びポリボシチジル酸の複
合体のミスマツチ類似体（ｍｉｓｎ＋ａｔｃｈｅｄ　ａ
ｎａｌｏｇｓ）である。他方、該ｄｓＲＮＡはポリリボ
イノシン酸（ｒＩｎ）のリボシル骨格を改変する、例え
ば２′−〇−メチル　リボシル残基を含ませることによ
りｐｏｌｙ　（１）　　・ｐｏｌｙ　（Ｃ）ｄｓＲＮＡ
から誘導されてもよい。これらｒＩｎ　　・ｒＣｎのミ
スマツチ類似体は、Ｃａｒｔｅｒ及びＴｓ’。

の米国特許第４，１３０．６４１号及び同４　、０２４
　、２２２号に記載されている一般式ｒ　Ｉ　ｎ　　−
ｒ　（Ｃ１１−１４，Ｕ）、ｎ及びｒｒｎ　　−ｒ　（
Ｃ２９，Ｇ）ｎで示されるもののいずれかが好ましい。

ここに−船釣に記載されたｄｓＲＮＡｓが本発明の用途
に適している。

本発明において使用するためのミスマツチｄｓＲＮＡの
具体例は； ｐｏｌｙ　（１）　、　ｐｏｌｙ　（Ｃｏ、Ｕ）ｐｏｌ
ｙ　（Ｉ）　、　ｐｏｌｙ　（Ｃ７，Ｕ）ｐｏｌｙ　　
（１）　　、　　ｐｏｌｙ　　（ＣＩ：ｌ、　　Ｕ）ｐ
ｏｌｙ　　（１）、ｐｏｌｙ　　（Ｃ２Ｚ、　　Ｕ）ｐ
ｏｌｙ　　Ｎ）、ｐｏｌｙ　　（Ｃｚｏ、　　Ｇ）ｐｏ
ｌｙ　（１）　、　１）０１３１　（Ｃｇ＊、　Ｇ）及
びｐｏｌｙ　　（１）　　、　　ｐｏｌｙ　　（Ｃｐ　
）　２３　　Ｇ＞。

を包含する。

投与されるミスマツチｄｓＲＮＡの量は、注入部位から
遠位の箇所において投与直後の循環血液系中で０．１　
ｔｒｙ　／　ｍｌ　−１０００ｘ　／　ｍｌのｄｓＲＮ
Ａのピーク血中濃度に達するために十分であるのが好ま
しい。該ｄｓＲＮＡは、非経口的（静脈内、筋肉内もし
くは皮下）に、鼻腔内に、肛門内に、又は胃腸管のヌク
レアーゼに対して適当に保護された場合は経口的に投与
される。

リンフ才力インとしてインターフェロン（アルファ）が
用いられる場合は、患者の体液のミリリットル当たり０
．０１−１００．０００１ＲＵｆｆｉが供給される。

両薬剤（ｄｓＲＮ＾及び他の抗ウイルス性化合物）が投
与される場合、それらは混合物として投与されることも
できるし、個々に、しかし同時に又は続々と投与するこ
ともできる。ｄｓＲＮＡと一緒に用られる補足的な抗ウ
ィルス剤は用途を指示する生成物標示又は他の標示に調
和する量で投与され、ｄｓＲＮＡとの同時使用そして併
用の結果の相乗作用のために、しばしば少量で、たびた
び実質的に切り詰めて投与される。

“併用における（ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）”ｄ
ｓＲＮＡ及び他の抗ウィルス剤の投与は、両薬剤を治療
合剤として一緒に投与される提案や、そしてまた２つの
薬剤が別々に投与されるが、しかし同時に、例えば別々
の静脈血管を通して同一の個体に一緒に投与するような
手順をも包含する。さらに、“併用における”投与は、
薬剤の１つがまず投与された後にすぐさま２番目の投与
を続けるところの薬剤の１つの個別の投与を包含する。

プロトタイプの慢性／亜急性ヒトウィルス病原体のよう
なＨＩ　Ｖを利用してウィルス性疾患の治療における併
用療法について、ミスマツチｄｓＲＮ＾、アンプリゲン
を評価するために一群の試験管内研究が着手された。使
用した材料及び方法は以下に記載される。

ｖａｎ靴えび地」ノヒ入 ＨＩ　Ｖの感染により完全な細胞崩解を示す、１１ＴＬ
Ｖ−１で形質転換したＴ細胞系ＭＴ−２が、マイクロタ
イクー・アッセイ中の感染のためのターゲットとして用
いられた。ウィルスは低速度遠心、及びすべての細胞を
分離するために０．４５声濾過により、Ｆ１９／ＩＩＴ
ＬＶ　−Ｉ［Ｒ培養液から調製した。ウィルスの力価は
、ＭＴ−２細胞上での終点ｍｌ力価検定（ｅｎｄｐｏｉ
ｎｔ　ｍ１ｃｒｏｔｉｔｒａｔｉｏｎ）により得られた
５０％組織培養惑染感染与量値から決定された。

１６％加熱により不活化したウシ胎児血清及び５０返ゲ
ンタマイシン（ｇｅｎｔａ＋ｗｉｃｉｎ）　（Ｓｉｇｍ
ａ）　／　−を含有するＲＰＭＩ　−１６４０中ですべ
ての培養物は増殖されそして保存された。

坑捜コＪと左肩 ヒトｒｌＦＮ　−ａＡ　　（＞　１　０　”　　ＩＵ／
＋ｎ＋ｒ）　　、ｒ［ＦＮ　−ｙ（１，４Ｘ　１０＠Ｉ
ｌｌ／■）及びアジドチミジンは、１１ｏｆ　ｆｍａｎ
　−Ｌａ　−Ｒｏｃｈｅより得た。ヒトｒｌＦＮ−β５
ｅｒ１７（１，Ｏｘ　１０　”　ＩＵ／　ｍｇ）は、Ｔ
ｒｉｔｏｎ　Ｂｉｏｓｃｉｅ−ｎｃｅｓから得た。既に
開示しているように、ＩＦＮｓは水庖性口内炎ウィルス
で刺激したＷＩＳＨ細胞において測定し、そして細胞変
性効果についてアッセイされた（引用文献（２）を参照
）、対照標準は、世界保健機構（ヒトＩＦＮ−α、ＷＨ
ＯスタンダードＢ、６９／１９及びヒト　ＩＦＮ−β、
ＷＨＯｎｏ、　Ｇ−０２３−９０２−５２７）又はｔｈ
ｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａ
ｌｌｅｒｇｙａｎｄ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅ
ａｓｅ　（ヒト−ＩＦＮ−３’。

Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅ
ａｌｔｈ　ｎｏ、Ｇｇ２３−９０１−５３０）から得た
。アンフォテリシンＢ　　（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）はＧ
ＩＢＣＯから、カスタノスペルミンはＢｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒＭａｎｎｈｅｉｍから、リバビリン（ｒｉｂａｖｉ
ｒｉｎ）　（Ｖｉｒａｚｏｌｅ）はＶｉｒａｔｅｌ、　
Ｉｎｃ、＋から、３′−アジド−３′−デオキシチミジ
ン（Ａ　Ｚ　Ｔ　、　Ｒｅｔｒｏｖａｒ）研究グレード
（ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｇｒａｄｅ）は、Ｒｏｃｈｅ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから、そしてフォスフォノホル
メート（Ｆｏｓｃａｒｎｅｔ）はＡｓｔｒａ　Ａｌａｂ
　ＡＢからそれぞれ得た。ミスマツチｄｓＲＮＡ　（ア
ンブリゲン）は、塩緩衝剤中の凍結乾燥粉末として、Ｈ
ＥＭ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ、＋　（Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ）から供給された。

マイクロタイ　−・インフエクション・アッセイ引用文
献（２）と同様に、抗ＨＩＶ活性はマイクロタイター・
インフェクション・アッセイ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　
１ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｓｓｅｙ）で測定された。

手短かに言えば、各々の薬剤を単独で及びミスマツチｄ
ｓＲＮＡとの固定した割合での組み合わせにおいて、連
続的に２倍希釈し、９６個のウェルがついているマイク
ロタイター・プレート中で三度反復してアッセイされた
。細胞崩壊は、感染の終点としてポリーＬ−リジン付着
細胞によるバイタル染料Ｃ：−ユ）ラル　レッド（ｎｅ
ｕｔｒａｌ　ｒｅｄ））の取り込みによって測定された
。細胞はウィルスを加えて１時間、医薬希釈物の存在下
でインキュベートされた。アンフォテリシンＢの場合は
、ウィルスも細胞も共にチャレンジする前に医薬とブレ
インキュベートされた。該医薬の存在下で子孫ピリオン
（ｐｒｏｇｅｎｙ　ｖｉｒｉｏｎｓ）が産生される結果
、終点細胞崩壊が過剰に存在するため多重度０．１にて
細胞は感染された。防御バー、セントは、細胞対照及び
ウィルス対照間の吸収における相違に関連する試験ウェ
ル中での染料のＡ、４゜値がら次式を用いて導かれた： 併用剤効果は、次式を用いるＣｈｏｕ及びＴａ１ａｌａ
ｙの多重医薬分析法により計算された： 式中、ＣＩは組合せインデックス（ｃｏｎ＋ｂｉｎａｔ
ｉｏｎｉｎｄｅｘ）、（Ｄ、Ｌは単独でＸパーセント効
果を生ずるために要求される医薬１の投与量、そして（
Ｄ）ｌは（Ｄ）２との併用で同じＸパーセント効果を生
ずるために要求される医薬１の投与量をそれぞれ表わす
。同様に（Ｄｘ）ｚ及び（Ｄ　）　ｔの値は医薬２由来
のものである。α値は、投与量効果曲線のプロットから
次の５０％有効式を用いて決定される： ｆａ　　／　ｆｕ　　＝　　（Ｄ／Ｉ）＋　）　　”式
中、ｆ、は投与量りによって影響を受けるフラクション
であり、ｆｕは無影響フラクションであり、ＤＩｌｌは
５０％効果を奏するために要求される投与量であり、そ
してｍは投与量−効果曲線の勾配である。相互に排他的
な医薬（即ち、作用の類似する挙動を示す）については
、単独の医薬もそれらの合剤のいずれも５０％有効プロ
ットにおいて平行線を与える。相互に排除しあわない医
薬（即ち、作用の独立した挙動を示す）は、５０％有効
プロットにおいて平行線を与えるであろが、合剤におい
ては上向きにくぼんだ曲線を与えるだろう。もしこれら
の医薬が相互に排他的であれば、α＝０であり、そして
該医薬が相互に排除しあわないならば、α＝１である。

相互に非排他的医薬を測定して得られる値は、常に相互
に排他的な医薬よりもわずかに大きくなるだろう。１以
下のＣＩ値は相乗作用を示し、１以上のＣＩ値は拮抗作
用を示し、そしてｌに等しいＣＩ値は相加作用を示す。

゛　−−アッセイ 培養液中の逆転写酵素は、鋳型ブライマーとしてｐｏｌ
ｙ（Ａ）　・（ｄＴ）＋ｓ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、及び反応当たり２５μＣｉの〔メ
チル−２Ｈ）ｄＴＴＰ（８０，Ｉ　　Ｃｉ　　／ｍｅａ
ｌ、　　Ｎｅｗ　　Ｅｎｇｌａｎｄ　　Ｎｕｃｌｅａｒ
）を用いて、引用文献（３）に記載されたようにポリエ
チレングリコール沈澱物についてアッセイされた。

これらの研究の観察及び解析は、次の結果と結論を与え
た。

汎立王土入二皿性 ＨＩＶ感染由来の標的細胞を防御するための各医薬単独
及びミスマツチｄｓＲＮＡとの合剤における有効性は表
１に示される。ウィルス対照（エフェクター不存在）ウ
ェルにおける細胞崩壊直後のインキュベーション期間中
の初期に、リバビリンを除く各々の医薬のすべての濃度
において十分な防御が観察された。これらの医薬の低い
濃度におけるウィルス誘導性の細胞崩壊が１日遅れて生
じ、そして投与量依存関係が達成され得るようにこの時
期に再びアッセイが行われた。感染過程の初期でさえも
、リバビリンの任意の低い毒性濃度では十分な防御が全
熱達成できなかったにもかかわらず、またさらに上記の
時期においてリバビリンに対するアッセイが行われた。

各々の医薬の最大の有効（１０％以上）濃度は、単独で
用いられる場合よりもミスマツチｄｓＲＮＡとの併用に
おいてより大きな抗ＨＩＶ活性を示した。これらの研究
に利用された濃度では全ての医薬がＭＴ−２細胞に対し
て無毒性であった。

以下余白 表１ ＨＩＶ誘導ｔｙ旧剰セコ（］〒番こ対するミスマンチ龜
ＲＮＡ、ｌ！二の併用における各種抗つィルス剤蛇凶が
具（続き） ’Ｓ’　　　（Ｍｕｌｔｉ　　Ｉｅ　Ｄｒｕ　　Ｅｆｆ
ｅｃ工Ｌ５０％及び９５％防御値における、８種の他の
抗ＨＩＶ医薬との二元的併用でのミスマツチｄｓＲＮＡ
に対するＣＩ値は表２に与えられた。種々な程度の相乗
作用が観察された。最大級の相乗作用は、ＣＩ値が最低
（０，１以下）であったミスマツチｄｓＲＮＡ及びｒｌ
ＦＮ−αとの間である。一方、最小量の相乗作用は、Ｃ
Ｉ値が最も高（観察されそして５０％防御においてほと
んど相加作用（ＣＩ＝０、９０　（１、０８）　）を示
したアンフォテリシンＢとの併用について観察された。

ミスマツチｄｓＲＮＡと相乗作用を示す他の医薬（ＣＩ
値が１以下）は、ｒｌＦＮ−β、ｒＩＦＮ−ｙ、アジド
チミジン、リバビリン、フォスフォノホルメート、アン
フオテリシンＢ及びカスタノスペルミンであった。Ｃ１
値は、試験された各々の医薬について相互に非排他的な
ものに対する相互に排他的なものの想定に基づき計算さ
れたものではあるが、非常に小さな相違が観察された。

以下余白 表２ 中心となる医薬としてのミスマツチｄｓＲＮＡとの併用
剤効果に対するＣＩ値 ′″ＣＩ値は表１のデータから計算された。１以上の値
は拮抗作用を示し、１以下の値は相乗作用を示し、そし
て１は相加作用を示す。相互に排他であることを想定し
て計算されたＣＩ値が相互非排他的であることを想定し
て得られた値（カッコ内）と共に示した。

ユ土火久傅良生 Ｈ９／　ＨＴＬＶ−ｍ　ｍ培養におけるウィルスの産生
が１ＦＮ３％　ミスマツチｄｓＲＮＡ及びこれらの合剤
の存在下そして不存在下で実験された（表３）。ミスマ
ツチｄｓＲＮ＾単独（５０ｇ／＋ａｆ）はウィルスの産
生に対して非常に小さな効果を有する（６％減少）が、
一方ｒＩＦＮ　−ａ　Ａ　、　ｒｌＦＮ−β、及びｒｌ
ＦＮ−”／（５００１１１／ｄ）はそれぞれ５３％、５
６％、及び２０％ずつウィルスの産生を阻害した。ミス
マツチｄｓＲＮへ の存在は、上記ＩＦＮｓによって誘導されるウィルス産
生の抑制の中程度の減少をもたらし、そしてそこで該抑
制は、それぞれｒｌＦＮ−αＡについては５３％から４
７％に、ｒｌＦＮ−βについては５６％から５１％に、
そしてｒｌＦＮ−’／については２０％から１５％に減
少された。これらの濃度のミスマツチｄｓＲＮ＾及びｒ
ＩＦＮｓ単独又はそれらの組み合わせにおいては、細胞
分裂に対していかなる効果をも有さないことを他の研究
（記載してない）は示す。

以下余白 表３ ＨＩＶ産生のＩＦＮ−誘導阻害におけるミスマツチｄｓ
ＲＮＡの効果 １洗浄したＨ９／ＨＴＬＶ　−ＩＩＩ　ｌ細胞の等しい
濃Ｒを有する重複培養物を、エフェクターの存在下及び
不存在下で４８時間インキエベートした０条件化培養液
はその後収攬され、そして逆転写酵素活性についてアッ
セイされた０組換えＩＦＮ−Ｙ士ミスマフチｄｓＲＮＡ
は第２番目の実験で試験されたので別に対照を置いた。

ミスマツチｄｓＲＮＡ　＝５０Ｒ／　ｍｌ　。

ＩＦＮ、　＝　５００１０／１１１１゜ミスマツチｄｓ
ＲＮＡと５種類の抗ＨＩＶ医薬との間で本研究において
観察される相乗作用は、ＡＲＣ及びＡＩＤＳに対する併
用療法での中心となる医薬としてのミスマツチｄｓＲＮ
Ａが強力でかつ多面的な役割を有しうろことを示唆する
。ミスマツチｄｓＲＮＡを包含する二重鎖ＲＮＡ５は、
２，５−オリゴアデニル酸シンターゼ及びリポソームで
作用するプロティンキナーゼを包含する、抗ウイルス状
態の獲得に関与するｒ　Ｎ　Ｆ　Ｈｚ導性酵素を活性化
する。本発明者は２．５−オリゴアデニレートがレトロ
ウィルスの逆転写酵素を抑制することを観察した。そし
てこの発見は、複製のために逆転写を必要とするウィル
スに対する抗ウィルス活性についての特有な機構を、ミ
スマツチｄｓＲ％Ａによる２、５−オリゴアデニル酸シ
ンターゼの活性化が代表し得ることを示唆する。最も重
要なことには、ＩＦＮｓの多面的活性のすべてがミスマ
ツチｄｓＲＮＡにより分担されることを現わしてはいな
い。このことは、ミスマツチｄｓＲＮＡは、ＩＦＮが示
したように）（ＩＶ産生を抑制しないし、またＩＦＮ　
’　ｓのこの活性を相乗しなかった研究結果（表３参照
）と共に、ミスマツチｄｓＲＮ＾治療期間中にＩＦＮ治
療のフルーライク（ｆ　Ｉｕ　−１ｉｋｅ）な付帯的な
効果が現われない事実により例証される。これら後者の
結果は、抗ウイルス状態を獲得する上でミスマツチｄｓ
ＲＮＡ及びＩＦＮｓの間で観察される相乗作用と対照を
なしていて（表２参照）、さらにまた、これらの医薬が
抗ウィルス活性に対して別個の経路と共に共通の経路を
も有することを示唆している。

抗ＨＩＶ剤の別の種類、逆転写インヒビターもまた、ミ
スマツチｄｓＲＮＡと相乗作用を有することを本発明者
は見い出した。広範囲な２’、３’−ジデオキシヌクレ
オシド類似化合物類は、代謝されレトロウィルス逆転写
酵素に効能のあるインヒビターとなり得る。例えば、自
然に利用されるチミジン及び２′−デオキシシチジンの
類似体であるそれぞれ３′−アジド−３′デオキシチミ
ジン（ＡＺＴ）及び２’、３’−ジデオキシシチジン（
ＤＤｃ）と称される２つのジデオキシヌクレオシドをＲ
，Ｙａｒｃｈｏａｎ及びＳ、　Ｂｒｏｄｅｒは開示して
いる（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　　Ｆｅｂｒｕａｒｙ２６、１９
８７．　３旦、　５５７−５６４頁、参照）。

また、１日当たりの患者の体重キログラム当たり５−２
５０■量のＡＺＴを用いるＡＲＣ及びＡＩＤＳの治療も
開示されている（米国特許第４，７２４．２３２号参照
）。リン酸化ヌクレオシドが連鎖ターミネータ−として
働くことによりレトロウィルス類を抑制するとの証拠が
ある。例えば、逆転写酵素がＤＮＡの成長鎖に添加され
ている該ヌクレオシド類似化合物を誤って取り込み、そ
してさらに５′−３′フオスフオシ工ステル結合の形成
を妨害することにより早期ＤＮＡ連鎖停止をもたらす。

同様な効果がプリン類似化合物、例えば２’、３’−ジ
デオキシアデノシンにも見られるようである。

残念ながら、これら種々のピリミジン及びプリン類似化
合物は種々の正常な細胞酵素、例えば骨髄及び他の器官
に見い出されるＤＮＡポリメラーゼαをもまた抑制し得
る。即ち、正常細胞機能のかかる抑制は、種々の深刻な
毒性をもたらす。例えば、ＡＺＴの長期にわたる投与は
、５０％以上のケースに厳しい貧血及び白血球減少症を
惹起する。

従って、多くのＡＺＴ治療患者は定常的な輸血を要し、
そしてすでにＡＺＴ治療の前にレトロウィルス感染によ
り衰弱している患者は、骨！！ｉ損傷のために本当に死
ぬであろう。

本研究においてアジドチミジン及びホスカルネットであ
る２つのインヒビターが使用された。チミジン類似化合
物、アジドチミジンは細胞内でリン酸化されそして早期
連鎖停止を引き起こす新短ｔＪＷ　（ｎａｓｃｅｎｔ）
　Ｄ　Ｎ　Ａに取り込まれる。リン酸化アジドチミジン
は細胞のＤＮＡポリメラーゼによるよりも１００倍以上
も有効に逆転写酵素によって利用される。即ち表面上は
大きく外に向かって開かれた選択性を許している。逆転
写の他のインヒビター、フォスフォノホルメート　（Ｆ
ｏｓｃａｒｎｅｔ）は、インフルエンザウィルスＲＮＡ
ポリメラーゼ及びヘルペスウィルスＤＮＡポリメラーゼ
を選択的に抑制することに加えて、試験管内で強い抗Ｈ
ＩＶ活性を有する。これらの医薬の双方ともマイクロタ
イター・インフエクション・アッセイによりＨＩＶの選
択的抑制作用を示した。これらの観察したミスマツチｄ
ｓＲＮＡとの相乗作用は、またさらに逆転写の他のイン
ヒビターにおいてもかかる相乗作用が観察され得ること
を示唆する。一般にｄｓＲＮＡｓそして具体的にはアン
プリゲン（Ａｍｐｌ　ｉｇｅｎ）は、試験管内で明瞭な
ウィルス抑制活性のために要求されるＡＺＴの濃度を少
なくとも５倍まで実質的に減少し得る。その上、試験さ
れたＡＺＴのより高濃度において、２つの化合物間には
相乗的な関係が存在する。それゆえに、ＡＺＴに関連し
た毒性の低減に付随して生体内（旦ν１ｖｉｏ）でのＡ
ＺＴの減少した有効治療投与量をアンプリゲンは可能に
するであろう。

２つの医薬は作用のまったく相違する様式により機能す
るため、単独のそれぞれの医薬を併わせた毒性以上のい
かなる毒性も生体内でそれらは示さないだろう。実際に
、アンブリゲンがより密接に関連した分子、例えばイン
ターフェロンと併用された場合でさへ、臨床的に相乗的
な毒性のいかなる根拠をも本発明者は見い出せなかった
。その上、アンプリゲンの抗ウイルス特性のほかに、本
発明者の研究において、アンプリゲンが多様な免疫調節
活性を臨床的に示した（あるいは２’−５’オリゴＡ経
路のような同様の機構を通して両方とも仲介される）た
め、本発明者がここに試験管内試験で説明する効果を十
分越えて、ＨＩＶ惑染感染に対する明白でそして長期に
ねたり゛有益な効果をＡＺＴとアンプリゲンの併用がを
するであろう。

本発明者の発見の重要性そして特異性は、リババリン（
ｒｅｂａｖａｒｉｎｅ）と称される他の強力な抗ＡＩＤ
Ｓ剤、とＡＺＴとの組合せについての報告を考慮するな
らばいかなるより優れた例証も存在せず、そして該報告
は叶、　ＨｉｒｓｃｈのＨａｒｖａｒｄにおける研究室
から５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｍａｒｃｈ　１３＋　１９８７
中で明らかにされている（彼らは、治療の相乗作用を達
成するため−にＡＺＴにリババリンが加えられる場合の
深刻な拮抗作用を報告する）。すなわち、他の医薬が逆
転写酵素インヒビターに加えられる場合は、実際にそれ
らの治療の相乗作用を増大するよりもむしろその作用を
失う。

ｄｓＲＮＡ及び逆転写酵素インヒビターの相乗的な組み
合わせは、またさらにレトロウィルスの誘導する癌腫層
の治療にも有用である。

リバビリンは、５　’　−ｍＲＮＡプロセッシングを妨
げる抗ＨＩＶ医薬類を代表することができる。リバビリ
ンの抗ウィルス活性の機構は明らかでないが、この医薬
はｌｌｌＲＮＡキャップ構造の形成においてグアノシン
と競合し、そして／又はこれらの分子のメチル化機能を
妨害すると考えられている。機能的なＨＩＶ　ｍＲＮＡ
５の他のインヒビター、例えばアンチセンス（ａｎｔｉ
ｓｅｎｓｅ）　ＤＮＡ５もまたミスマツチｄｓＲＮＡと
上記抗ＨＩＶ機構の相乗作用を示し得た。

ステロールと相互に作用しそしてステロールと不可逆的
に結合するポリエンマクロライド抗菌抗生物質アンフォ
テリシンＢは、ＨＩＶを包含する種々のりピント−エン
ベロープ（１１ｐｉｄ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）ウィルス
に対して活性を有しおり、そしてこのようなユニークな
種類の薬剤はいまだ他には存在しない。アンフォテリシ
ンＢは生体内で厳しい毒性を示すにもかかわらず、この
医薬のメチルエステル体は、また抗ＨＩＶ活性を示し、
そして試験管内では低い細胞毒性を示す。従って、アン
フォテリシンＢメチルエステルがミスマツチｄｓＲＮＡ
との併用療法においては、親化合物よりさらに有益であ
ろう。

ミスマツチｄｓＲＮＡとの相乗作用について例示する最
後の医薬はカスタノスペルミン（ｃａｓ　ｔａｎｏｓｐ
ｅ−ｒｍｉｎｅ）であった。カスタノスペルミンは、糖
タンパク質プロセッシングを抑制する植物アルカロイド
であり、そして外層膜糖タンパク質としてのｇｐ　１２
０、及びトランスメンブラン塘タンパク質としてのｇｐ
　４１の、２つの密にグリコジル化したタパク質をＨＩ
Ｖのエンベロープが含有するため研究された。ｇｐ　１
２０とウィルスに対するレセプターのような作用するＴ
細胞の０ＫＴ４表面抗原との間の相互作用はＨＩＶの細
胞層性に部分的に頼っている。

グリコレース（ｇｌｙｃｏｌａｓｅｓ）及びレクチン（
ｌｅｃｔｉｎｓ）についての他の人達による最近の研究
は、タンパクグリコジル化反応がｇｐ　１２０−ＬＫＴ
４相互作用及びＨＩＶ惑染感染いて重要な役割を演する
ことを示した。糖タンパク質の成熟は、ハイ−マンノー
ス（ｈ　ｉｇｈ　−ｍａｎｎｏｓｅ）から複合型オリゴ
サツカライドへの変換で一般に得られる炭水化物成分の
プロセッシングのための一連の酵素に依存する。カスタ
ノスペルミンは、ハイ−マンノース型Ｎ−グリコジル化
タンパク質をもたらすグルコシダーゼを抑制する。カス
タノスペルミンの存在中で産生される子孫ピリオンによ
る感染条件下で、ＨＩＶの感染力は減衰された（表１参
照）、この減衰は、受容体のグリコジル化の状態におい
てカスタノスペルミンが有していたであろういかなる効
果とも独立しており、そして実際にＴＣＩＤ−５０７ン
セイにより決定される感染ウィルスの収率の減少に基づ
くものであり、ウィルスに関連した逆転写酵素活性によ
り測定されるような全体にわたるウィルス産生には効果
をもたない、上記抗ＨＩＶ活性がミスマツチｄｓＲＮＡ
と相乗的であるとの発見（表２）は、ＨＩＶレセプター
結合を妨げる薬剤とミスマツチｄｓＲＮＡが相乗作用を
有し得ることを示唆する。これらの薬剤は、中和抗体、
ペプチド、例えばペプチド“Ｔ”の封鎖、又は糖タンパ
ク賞プロセッシングの他のインヒビターをも包含するで
あろう。

玉里文献 （１）　Ｂｌｂｅｉｎ、＾、Ｄ、　（１９８７）　　’
Ｎ−結合性オリゴサッカライド鎖の生合成そしてプロセ
ッシングのインヒビター”、＾ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　　５６＋　４９７−５３４　。

（２）　Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ＋　Ｄ、Ｃ０＋　Ｒｏｂ
ｉｎｓｏｎ、　ｗＪ、ｌ　Ｊｒ、＋Ｓｃｈｕｆｆｍａｎ
、　ｓ、ｓ、及びＭｉｔｃｈｅｌｌ、　Ｗ、Ｍ、（１９
８７）“迅速及び高感度マイクロタイター・インフエク
ション・アッセイによるヒト免疫不全ウィルスに対する
抗ウィルス剤及び中和抗体の評価”。

Ｊ、Ｃ１１ｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（印刷中）（３）
　Ｐｏ１ｅｓｚ、　Ｂ、Ｊ、、　Ｒｕ５ｃｅｔｔｉ＋　
Ｆ、Ｗ、＋　Ｇａｚｄｅｒ＋Ａ、Ｆ、、　Ｂｕｎｎ、　
Ｐ、Ａ、、　Ｍｉｎｎａ、　Ｊ、Ｄ、及びＧａ１ｌｏ、
　Ｒ，Ｃ。

（１９８０）“皮膚Ｔ細胞リンパ腫を有する患者の新鮮
なリンパ球及び培養リンパ球由来のタイプＣレトロウィ
ルス粒子の測定及び単離”ｅ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　　７７、　７４１
５−７４１９゜以下会白

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗ウィルス剤及びｄｓＲＮＡの治療に必要な量を組
   み合わせとして投与し、そのように投与される組み合わ
   せの量がウィルス活性もしくはウィルス発現又はそれら
   の両方を抑制するために十分であることを特徴とするウ
   ィルスを有するヒトのウィルス疾患を治療する方法。 ２、上記ｄｓＲＮＡがミスマッチｄｓＲＮＡ、好ましく
   はｒＩｎ・ｒ（Ｃ＿１＿１＿−＿１＿４、Ｕ）ｎである
   ことを特徴とする請求項１記載の方法。 ３、上記ウィルス疾患がＨＩＶ感染又はＨＩＶのウィル
   ス増殖／発病の機構と全体的にもしくは部分的に共通で
   ある機構を有するＨＩＶ以外の感受性ウィルス感染であ
   ることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。 ４、上記抗ウィルス剤がサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎ
   ｅ）、逆転写酵素インヒビター、リポフィル（ｌｉｐｏ
   ｐｈｉｌｅ）又は糖タンパク質プロセッシングインヒビ
   ターであることを特徴とする請求項１、２又は３記載の
   方法。 ５、ウィルスを抑制する量のｄｓＲＮＡを、ウィルス活
   性又はそれらの両方に対する他のインヒビターとの組み
   合わせにおいて含んでなる、ウィルス感染の処置のため
   の療法組成物。 ６、上記組成物が、サイトカイン、逆転写インヒビター
   、リポフィル及び糖タンパク質プロセッシングインヒビ
   ターから選択される１の抗ウィルス剤のウィルスを抑制
   する量との組み合わせにおいて、ウィルスを抑制する量
   のｄｓＲＮＡを含んでなる、ＡＩＤＳ及びＡＩＤＳ関連
   コンプレックスを包含するＨＩＶ感染の処置のための療
   法組成物。 ７、上記抗ウィルス剤が、ｒＩＦＮ−α、ｒＩＮＦ−β
   、ｒＩＮＦ−ｙ、アジドチミジン、フォスフォノホルメ
   ート、リバビリン、アンフォテルシンＢ及びカスタノス
   ペルミンから選択される１のものである請求項５又は６
   記載の治療組成物。 ８、ｄｓＲＮＡ及び３′−アジド−３′−デオキシチミ
   ジン又はそれらの医薬として許容し得る塩を含んでなる
   ウィルス感染の処置のための療法組成物。 ９、上記ｄｓＲＮＡがミスマッチｄｓＲＮＡであり、そ
   して好ましくはｒＩｎ・ｒ（Ｃ＿２＿９、Ｇ）ｎである
   ことを特徴とする請求項５−８のいずれかに記載の療法
   組成物。 １０、上記ｄｓＲＮＡが結合切断の領域を含有しそして
   該ｄｓＲＮＡが有利な治療比率特性のｒＩｎ・に（Ｃ＿
   １＿１＿−＿１＿４、Ｕ）ｎ含有することを特徴とする
   請求項９記載の組成物。