PT82199B

PT82199B - Processo para a preparacao de nucleosidos antivirais e de composicoes farmaceuticas que os contem

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Publication number: PT82199B
Application number: PT82199A
Authority: PT
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1985-03-16
Filing date: 1986-03-14
Publication date: 1990-11-07
Also published as: AU572019B2; CA1238277A; EP0196185B1; AP11A; DE3650130D1; DE3650130T2; EP0291633A1; FI861069A0; EP0196185A2; NZ215486A; SG62889G; DE3650130T3; EP0196185A3; HK85789A; DE196185T1; PH24388A; DK118086A; AU5475886A; ATA68386A; ATE81978T1

Description

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.Reino Unido em 16 de Março de 1985, 9 de Maio de 1985, 27 de Setembro de 1985 e em 12 de Fevereiro de 1986, sob os n²s. 8506869,8511774,8523881 e 8603450, respectivamente e nos Estados Unidos da América em 17 de Setembro de 1985, sob o n⁹ 776,899

INPI. MOD. 113 RF 16732

..eméria descritiva referente b patente de invençSo de THE WEliCC^E FOUNDATION 11. I•_5D, britânica, industrial e comercial,com sede em 183-193 Euston Road, london N.W.l, Inglaterra, para «FHÇCESEO j?ARã A ?EE1ABAQAO DE NUC1EÕSK-OS WEUIS E DE C(OCSIÇCES M^ACSUTICAS QUm OS CONgfíiJ¹ memória descritiva

A presente invençSo refere-se ao processo de preparaçSo de 3*-8Ζίάο-3*-ά.βοχϋ1πιίάίη8, dos seus derivados farmaceuticamente aceitáveis e b sua utilização no tratamento ou profilaxia de infecçtfes retro virais humanas.

Os retrovirais formam um sub-grupo de vírus de RNA que, para se reproduzirem devem primeiro «contra-transcrever¹¹ o ARN dos seus genomas em ADK (a «transcrição* descreve convencionalmente a síntese de ABN a partir de ADN). Uma vez na forma de ADN o genoma virai é incorporado no genoma da célula hospedeira, permitindo tirar vantagem total do mecanismo transcrição/translacçSo das células hospedeiras a fim de se reproduzirem. Uma vez incorporado, o ÀDN virai é virtualmente indistinguível do ADN hospedeiro e, desta forma, o virus pode persistir tanto tempo quanto a vida da célula. Como, nesta forma, é virtualmente invulmerâvel ao ataque, qualquer tratamento deve ser dirigido para outro estado do ciclo da vida e terá, necessáriamente, de ser continuado, até que todas as células portadores de virus tenham morrido.

• - ¹ Ϊ11

V1.TH-I e V1TH-1I são ambos retrovirus e são conhecidos como agentes causadores de leucemia no homem. As infecçffes do VLTH-I são propagadas especialmente eu larga escala e são responsáveis por muitas mortes, a nível mundial, todos os anos.

Rresentemente, tem-se isolado reprodutivelmente um tipo de retrovirus a partir de doentes possuidores de SIDa. Durante a caracterização pormenorizada não houve, até agora, nenhum acordo na atribuição dum nome ao virus, pelo que foi correntemente conhecido quer por virus linfotrópico de T-células humanas III (V1TH III), retrovirus associado do SIDA(RVA) ou virus associdado de linfadenoma (VAL). Considerou-se que o nome a atribuir internacionalmente seria virus de imuno-deficiência adquirida (VID*). Este virus (referido como VIDA) tem sido descrito para infectar e destruir T-células que produzem os indicadores de superfície OKT^ e Ó agora geralmente aceite como agente etiológico do SIDA. 0 doente perde progressivamente este conjunto de 2-células, perturbando o balanço glx bal do sistema imunizado, reduzindo a sua capacidade para combater infecçães, predispondo-se, ele próprio, para as infecçães eventuais que a maior parte das vezes são fatais, ^ssim, 9 causa vulgar da morte das vitimas do SIDA é por infeeção eventual, tal como pneumonia ou cancros induzidos viralmente e não como um resultado directo de infecçSes do VIDA.

Recentemente, o VIDA tem também sido recuperado a partir de outros tipos de tecido aue incluem B-células 4 expressando o indicador T , macrofagos e tecido associado não - sanguíneo no sistema nervoso central (SNC), Descobriu-se esta última infeeção em doentes apresentando sintomas clássicos do SIDA e está associada a uma progressiva desmielinação, conduzindo ao enfraquecimento e a sintomas como encefalia, ataxia, desorientação e disartria.

Há, pelo menos, quatro manifestações clínicas da infecção do VID*·.··. No estado transportador inicial, a Única indicação de infecção é a presença de anticorpos de anti-VIDA na corrente sanguínea, acredita-se que tais transportadores são capazes de transmitir a infecção, por exemplo, atrás de uma transfusão de sangue, relações sexuais ou agulhas de se·· ringas usadas. 0 estado transportador pode muitas vezes não progredir para um segundo estágio, caracterizado por linfoma persistente generalizado (12G·). Estima-se vulgarmente que cerca de 2o$ de doentes 1PG progridem para um estado mais avançado conhecido como “complexo relacionado com (CRa). Os sintomas físicos relacionados com CR* incluem indisposição geral, aumento de temperatura e infecções crónicas. Este estado progride normalmente para o estado final, estado do 3Γ2«· fatal, quando o doente perde totalmente a capacidade para combater a infecção.

Reconheceu-se apenas recente..ente a existência oestes e outros retrovirus humanos e, como as doenças com as quais estão relacionadas são de natureza perigosa, existe uma necessidade urgente de desenvolver métodos de combate pa ra esses virus.

Propõem-se, agora, várias drogas como cura para o Sito, Elas incluem tungstato de antimÓnio, suramina, ribavirina e isoprinosina, que possuem tanto de tóxico como de actividade anti-retroviral. Como o genoma do VIDÁ é incorporado no aDN da célula hospedeira depois da infecção e é virtualmente invulnerável ao ataque neste estado, persistirá tanto tempo quanto sobrevive a célula hospedeira, originando entretanto nova infecção. assim, qualquer tratamento do SIPA deverá ser por um período extenso, possivelmente a vida inteira, necessitando de substâncias com uma toxicidade aceitável.

Têm-se descrito, em relatórios, testes de vários retrovirus, por exemplo, Eriend leukae-’ um retrovirus murino. Para esse fim hrieg

116 (1978) 21-29) descobriu em esperiêncompostos contra mia Virus (M), et al. (Exp. Cell Res., i

cias in vitro que a 3*-azido-3*-deoxitimidina tinha actividade contra o FhV e Cstertag et al, (Froc. Nat. .4caã. Sei. (1974) 4980-85) demonstrou, com base na actividade antiviral relacionada com E1V e uma carência de toxicidade celular, que a 3*-azi<k -3*-deoxÍtimidina **devia substituir favoravelmente a bromodeoxluridina no tratamento médio de doenças provocadas pelos virus do ΑΓΝ”. Forêm, De Clerq et al. (Biochem* Pharm. (1980) 2g. 1849-1851) estabeleceu, seis anos depois, que a 3*-azido-3’-deoxitimídina não tinha actividade apreciável contra quaisquer virus utilizados nos seus testes, incluindo vaccinia, HSVI e varicella zoster virus (V2V), ^wGlinski et al, (j. Crg. Chem. (1973), 38, 4299-4305) descreve alguns derivados da 3*-azide-3*-deoxitiniidina (infra) e a sue capacidade para bloquear a actividade da exo-ribonuclease nos mamíferos**.

Descobriu-se agora que a 3*-azido-3*-deoxitimidina tem surpresndenteuente uma grande actividade contra retrovirus humanos, com uma grande actividade, particularmente, contra o VHA, como é demonstrado pelos dados experi mentais referidos a seguir, lai actividade tornar 0 composto útil na terapia de infecçdes retrovirais humanas.

Assim, num primeirc aspecto da presente invenção, proporcionou-se um composto de fórmula (I);

(3*-azido-3*-deoxitimidina) ou um derivado formaceuticamente aceitêvel, para uso no tratamento ou profilaxia de infecçêes re- 4 1 irovirais humanas.

Os compostos de fórmula (l) e os seus deri vados farmaceuticamente aceitáveis são depois considerados co mo compostos que fazem parte da invenção.

Tem-se estabelecido em vários sistemas de ensaio in vitro a actividade da 3*-aziâo->*-deoxitimidina. 2or exemplo, a infecção do tipo de célula linfoblastoide humana pelo VIDA é evitada efectivamente por concentrações baixas como 0,013 mcg/ml eté 2o horas após a infecção. â infecção pelo VIL* de células linfoblastoides humanas U937, células de sangus branco estimuladas com PHft· e linfócitos sanguíneos periféricos cultivados é também evitada por concentrações baixas semelhantes. Adicionalmente, dez dias de ensaios utilizando até 5000 viriões de VIDA· por célula e clonagem tétano específico, linfécitos auxiliares-T, não apresentaram redução em células tratadas com 3’-3Ζίάβ-3*-άβοχϋ1πιίάίη3 enquanto células não tratadas tinh»m diminuído 5 vezes. Os efeitos citopáticos foram também bloqueados no mesmo tipo de células transformada por VLTH-I e super-infectada com VIDA.

Outros estudos utilizando contra-tra scri-ptase mostraram que a actividade desta enzima é bloaueada pelo trifosfato de 3^,-azido-3*-deoxitimidina através de um mecanismo de inibição competitivo,

Os ensaios clínleus da fase I mostraram também que a 3*-azido-3*-deoxitiraidin é capaz de atravessar a barreira sangue/cérebro em quantidades clinicamente efectivas. Esta propriedade é não sé rara, mas também valiosa para o tratamento e profilaxia de jnf^cções do SYG causadas por retrovirus humanos.

capacidade da 3^,-azido-3^l-deoxitimidina para modificar a malignidade induzida pelos retrovirus foi demonstrada num modelo ãe rato que a administração da 3*-azido-3*-deoxitimidina evitar a doença do aumento do baço caueada

À

pelo Vírus leukaemia _A. urine Rauscher administrado intravenosamente, o murino equivalente de V1TH-I. Noutras experiências,» V-azido-3*-deoxitimiãin? foi aplicada para inibir a reproduçfo in vítro de VLTH-I para concentrações baixas como 0,8 mcg/ml.

Assim, proporcionou-se, num outro aspecto preferido da invenção, a utilização de um composto de acordo com a invenção na preparação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de infecções de retrovirus humanos.

i.< presente invenção também proporciona um método para o tratamento ou profilaxia do SIDA num ser humano que consiste na administração de uma Quantidade efectiva de um composto de acordo com a invenção.

a presente invenção também inclui um método para o tratamento ou profilaxia de infecçBes originadas por retrovirus num ser humano, que consiste na administração de uma quantidade efectiva antiviral de um composto de acordo com a invenção.

A presente invençêo também proporciona um composto para utilização no tratamento ou profilaxia do SIDA ou de infecçSo de um vírus como se identificou acima.

Exemplos de infecçêes de retrovirus huma nos que podem ser tratadas ou evitados em concordância com a presente invenção incluem retrovirus linfotrÓpicos de T-célular (ou células-T) (V1TH), espe^almen-e V1TH-1, VLTH-II e 71D.·. (V1TH-I1I). Estados clínicos aue podem ser tratados ou evita dos em concordância com a invenção incluem 811«*, complexo rela cionado com SIDA e leukaeniia positivo de VxTH-1 e linfoma. Doen tes susceptlveis de tratamento são também os que possuem anti corpos para o VIDA, infecções SNC VIDA, PGL e CBA.

Por ^ttderivado f armaceuticamente aceitável* entende-se qualquer sal farmaceuticamente aceitável, éster, ou βάί

sal de tal éster, ou qualquer outro composto que por administrado a um ser humano, é capaz de fornecer (directa ou indirect?-mente) ^^azido-y^õeoxitimiãina ou um metabÓlito anti-retrovirelmente activo ou um seu resíduo, Num exemplo de um composto n5o éster é o derivado em que os átomos 5*-0- e 2-0- estíío ligados por um átomo de oxigénio para formar um grupo aninro. Os ésteres preferidos do composto de fórmula I incluem ésteres de ácidos carboxílicos nos ouais a metade n?o carbonil do agrupamento éster é seleccionada a partir de uma cadeia linear ou ramificada alquii, alcoxialquil (por exemplo fenil opcionalmente substituído por halogéneo, alquil ou alcoxi C1-.4); ésteres de sulfonato, como por exemplo axquil- ou aralauilsulfonil (por exemplo metano-sulfonil); e ésteres de mono, di ou tri-fosfato. Con referência aos ésteres descritos acima, a menos que de outro modo se especifique, quaisquer metades alnulL presentes em tais ésteres contêm vantajosamente 1 a 18 átomos particularmente 1 a 4 átomos de carbono, Qualquer metade aril presente em tais ésteres compreende vantajosamente um grupo fenilo. Qualquer referência a um dos compostos descritos acima inclui também uma referência a um seu sal formaccuticamente ?ceitável.

As experiências têm mostrado que a 5*-a2ido-3*-deoxitimidina se converte, in vivo, por acçSo de enzimas celulares em 5*-monofosfato. 0 monofosfato é entSo fosforado de novo por outras enzimas para formar o tri-fosfato via di-fosfato, e outros estudos demonstraram que é a forma de tri-fosfato da rP-azido-^-deoxitiaidina que se aceita ser a cadeia terminal efectiva na eonira-tr?nscriç?o de VXP/t, como evidenciou pelo seu efeito no viros mieloblastose das aves e no virus leukaemia murino ^oloney. ista forma também inibe a contra-transcriptase do 7IDn in vitro embora tendo um efeito insignificante na actividade dapolinerase do humano.

Exemplos ae sais farmaceuticamente aceitáveis do composto de fórmula (l) e dos seus derivados £ar..aceuticamente aceitáveis incluem sais de base, por exemplo derivados de uma base apropriada, tal como sais de metal alcalino (exjsóõio), metal alcalino-terroso (ex·magnésio) líX^ (em que X é alquii O·^) · amónio e n presente invenção proporcione também novos derivados farmaceutioaniente aceitáveis do composto de fórmula (l), excerto os seguintes derivados 5*, nomeadamente monofosfato, monofosfato dissódico, 2-cianoetil-monofosfato, trifosfato, p-tolueno-sulfonato, acetato, tri-fenilmetil e me t a noisulfo na to ou quando 5*0 é libado a um outro nucleÓtido ou derivado nucleÓsido.

Exemplos específicos de derivados fariacetticamente aceitáveis do composto de fórmula (l) que podem ser usados sm concordância com a presente invenção incluem 0 sal monossódico e os seguintes ésteres 5’· monofosfato; monofosfa to di-sódico; di-fosfato; tri-fosfato; acetato; 3-metil-butirg to; 0 tonoato; palmitato; 3-clorobenzoato; benzoato; 4 metilbenzoato; hidrogeno-suceinato; pivalato; e mesilato.

a 5*-azido-3*-deoxitimidina, ou um seu derivado farmaoeuticemente aceitável (? seguir referido como 0 ingrediente activo), pode ser administrado e seres humanos para a profilaxia ou tratamento de infecçães retrovirais através de qualquer via apropriada, incluindo as vias oral, rec-tal, nasal, Tópica (bucal e sublingual), vaginal e parenteral (subcu tânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica), a vis preferida varia com estado e idade do doente, a natureza da infec ção e o ingrediente activo escolhido.

Em geral a úose apropriada estará n? gama de 3,0 a 120 mg/i.g de peso de corpo do áoeite/dia, preferivelmente na gama de 6 a 9C mg/ííg ue peso do corpo/die e m^is preferivelmente na ga^a 15 0 60 mg /kg de peso do corpo/dia. 4 dose desejada é preferivelmente spresentada em duas, três, quatro, cinco, seis ou mais sub-doses administradas em intervalos apropriados ao longo do dia, kstae sub-doses podem ser adminis tradas sob a forma de dosagem unitária por exemplo, contendo 10 a 1500 mg, preferivelmente 2c a 100 mg e melhor aind« 50 a 700 mg de ingrediente activo / formo de dosagem unitária.

As experiências com a 3*-azido-3’-àeoxitimidina sugerem que uma dose deverá ser administrada para atir gir as concentrações do composto activo do máximo de plasma de cerca de la 75preferivelmente de 2 a 50e ainda melhor de 3 a 30yU^. Isto pode ser atingido, por exemplo, por injecçlo intravenosa de uma solução G,1 a 5% de ingrediente activo, opcjo nalmente em soro fisiológico ou por administração oral de uma pílula grande contendo eerca de 1 ;? 100 mg/kg do ingrediente activo. ?odem-se manter níveis de sangue desejáveis por infu são contínua para proporcionar cerca de C,01 a 5,0 mg/kg/hor» ou por infusão intermitentes contendo cerca de 0,4 a 15 mg/Jqs; do ingrediente activo.

‘Embora seja possível administrar o ingrediente activo isolada mente, é p:?eferível apresentálo sob ? forma de formulação farmacêutica, ús formulações da nresente invenção compreendem pelo menos um ingrediente activo, como acima definido, juntamente com um ot. mais veículos aceitáveis e opcio nalmente outros agentes terapêuticos. Cada veículo deve ser aceitável no sentido õe ser compatível com os outros ingredien tes da formulação e não prejudicial para o doente, às formulações incluem as apropriadas para administração oral, rectal, nasal, tópica (bucal e sublingual), vaginal ou parentersl (subcutânea, intramuscular, intravenosa e intraãérmica. As formulações podem ser apresentadas convenientemente sob a forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por métodos bem conhecidos no domínio farmacêutico. íais métodos incluem o passo de associar o ingrediente activo com o veiculo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. Bm geral, as formulações podem ser preparadas associando uniformemente e intimamente o ingrediente activo com veículos líquidos ou veículos só liões fina mente divididos ou com ambos, e depois moldando o produto se necessário.

ãs formulações da presente invenção, apropriadas para administração oral, poãem ser apresentadas sob a forma de unidades discretas tais como capsulas, pílulas ou com

- 9 primidos, contendo cada uma quantidade pré-determinada do ingro diente activoj sob a forma de pó ou grânulos; sob a forma de solução ou suspensão em. líquido aquoso ou nSo aquoso; ou sob a forma de emulsão líquida de 61eo-em-água ou de água-em-óleo. 0 ingrediente activo pode também ser apresentado como uma pílula grande, electuáíiõ ou pasta. As formulaçCes orais podem incluir outros agentes convencionais da técnica,tais como agentes adoçantes, aromatizantes e espessantes.

Um comprimido pode ser feito por compressão ou por moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredien tes acessórios. Comprimidos prensados podem ser preparados poo> compressão numa máquina própria do ingrediente activo sob a forma de fluxo livre tal como um pé ou grânulos, opcionalmente misturados com um ligante (por exemplo povidona, gelatina, hidroxi-propilmetil celulose), lubrificante, diluente inerte, preservativo, desintegraste (por exemplo amido glicolato de sé dio, povidona de ligação cruzada carboximetil celulose de sódjn de ligação cruzada), agente de superfície activa ou dispersante. Os comprimidos moldados podam ser preparados por moldagem, numa máquina própria, de uma mistura do composto em pé com um diluente liquido inerte. Os comprimidos podem opcionalmente ser revestidos ou marcados e podem ser formulados de forma a fornecer desprendimento baixo ou controlado do ingrediente ac±. vo, utilizando, por exemplo, hidroxi-propil-metilcelulose, em várias proporçâes, para proporcionar o desejado perfil de libee taçâo»

FormulaçCes apropriadas para a administração tópica bucal incluem pastilhas possuindo o ingrediente activo num8 base aromatizada, geralmente sucrose e acácia ou tragacanta; pastilhas possuindo o ingrediente activo numa base inerte tal como gelatina e glicerina, ou sucrose e acácia; e elixir para a boca possuindo o ingrediente activo num veículo líquido apropriado.

- 1G -

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às formulações para administração rectal podem ser apresentadas sob a forma de supositório com uma base apropriada, compreendendo, por exemplo, manteiga de cacau ou um salicilato»

Ãs formulações apropriadas para adminis tração vaginal pcdem-se apresentar sob a forma úe supositórios vagina, tampões, cremes, geles, pastas, espumas ou n& pulverizada contendo em adição ao ingrediente activo veículos apropri? doe conhecidos da técnica.

Formulações apropriadas para administração parenteral incluem soluções para injecção esterilizadas isotÔnicas, aquosas ou não aquosos, oue contém anti-oxidantes, tampões, bactericidas e solutos que tornara a formulação isotônica com o sangue do respectivo doente; e suspensões esterili zadas aquosas ou não aauosas que podem incluir agentes de sus· pensão e de espessamento. ,is formulações podem-se apresentar sob a forma de dose unitária ou multi-dose em recipientes selados, por exemplo ampolas e frascos pequenos e poõem-ser guaa dadas no estaco liofilizado necessitando somente da adição de um celculo líquido esterilizado, por exemplo, âgua para injecçtJes, imediatamente antes da sua utilização, rodem-se preparar soluções para injecção extemporâneas e suspensões a parti3^Fde pôs esterilizados, grânulos e comprimidos da espécie pre viamente descrita.

Formulações preferenciais de dosagem unitéri* são as que contém uma dose ou uma unidade diárias, uma sub-dose diária, como se descreveu atrás, ou uma fracção apropriada <le um ingrediente activo.

Os ingredientes administrados também podam ser usados em terapia, em conjunção com outros medicamer tos, tais como 9-(2-hidroxi-etoxi-metil)guanina (acidovir), 2-am.ino-9-(2-hi

- 11 droxi-etoxi-metiljpurina, interferSo, por exemplo <-interfer>o interleiquina 11, e fosfono formato (Roscarnet) ou em conjunção com outra terapia de modulação imune incluindo medula de ossos ou transplantes de J4nfócitos ou medicamentos, tais como levamisol, ou timosina, que servem para aumentar o número de linfócitos e/ou funçSo.

leve-se entender que, em adição aos ingredientes mencionados particularmente atrás, a invenção pode incluir outros agentes convencionais da técnica da formulação* composto de fórmula (X) e os derivados farmaceuticamente aceitáveis podem ser preparados de forma convencional, por exemplo como se descreve nas referências seguintes, ou por métodos análogos; J.R. Horwitz et al.. ú, Crg. Chem. £9, (Julho 1964) 2&76 - 78; m.Imazawa et al») J.Crg.Ohem, 43 (15)(1978) 3044 - 3048; .n .>7a tanabe et al». ΰ .Org.Chem,,

45. 3^74 (198 0); e R^l^Glinski et al.. J.Ohem. Soc» Ohem* Commun., 915 (1970), bem corno pelos processos descritos nos Exemplos * « presente invenção inclui também um processo de preparaçSo de um composto de fórmula (1) e dos seus derivados, farmaceuticamente aceitáveis, que consiste em:

(â) reagir um composto de fórmula;

- 12 C-J, —* , S>

. < '

í..

(em que representa um gru 0 precursor do grupo 3*-azido) ou um seu derivado (por exemplo um óster ou sal), com um agente ou sob condições tais que converta 0 referido grupo precursor no desejado grupo azido;

(Β)

(em que R representa um grupo precursor do grupo hidroxij ou dum grupo de derivado farmaceuticamente aceitável) com um agente ou sob condições tais que converta o referido grupo precursor no correspondente grupo desejado> ou (Ο

(ιν)

CkU um seu equivalente funcional, com um composto que faz introduzir o anel desejado de ribofuvanosilo na posiçõo 1 do composto de fórmula (IV); ou (D) reagir um composto de fórmula

(em que R hidroxi ou R como defiiido anteriormente), com um agente, sob condições, de firma a converter o referido composto num composto de acordo com a invenção;

e, depois disso ou siGiultaneemente, efectuar uma ou mais das seguintes conversões opcionaisj- (i) quando se forma a 3 *-azido-3’-dcoxitimic.ina converter-se o referido composto num seu derivado farmaceuticamente aceitável, (ii) quando se forma um derivado farmaceuticaaente aceitável da 3*-azido-3’-deoxitimidina, converter-se o referido derivado no composto de fórmula (1) ou num seu derivado diferente.

iio processo descrito c.e acordo com a invenção, pretende-se que os compostos preevisores de fórmula (II) e (III), bem como os agentes e as condições atrás mencionados, sejam seleccionados apartir dos que são conhecidos na técnica da química dos nucleÔsidos sintéticos, Exemplos de tais processos de conversSo s3o descritos a seguir para orientaç3o e entendeu-se que podem ser modificados de forma convencional dependendo do composto desejado de fóimula (1)< Sm particular, onde se descreveu uma conversSo que podia resultar numa reacçõo nSo desejada de grupos instáveis, tais grupos podem ser protegidos de forma convencional, com remoçSo subsequen te dos grupos protectores depois de realizada a conversSo# ás14 -

- B±m._t no processo (λ), o grupo ... no composto de fórmula (li) pods representar, por exemplo, um halogéneo (ex:cloro), hidroxi ou organosulfoniloxi (ex; trifluoro-aetil-sulfoniloxi, metano-sulfoniloxi ou p-toluenosuifoniloxi).

x-ara a preparação de um composto de fórmula(l) no qual o grupo m é um grupo halugéneo (ex:cloro) na configuração threo (na qual o 5*-hiúroxi $ protegido vantajosamente, por exemplo com um grupo ti i iilo) pode-se tratar um composto de fórmula (11), por exemplo, com szeto de lítio ou de sódio. 0 material de partida o 3-Àologénio-threo (por ex; cloro) pode ser obtido, por exemplo, pox reacçSo do correspondente composto 3’-eritro-hidroxi ccm, por exemplo, trifenil-fosfina e tetracloreto de carbono, ou alternativamente por tratamento com haleto de organo-sulfonilo (ex: cloreto de trifluoro-metano-sulfonilo) para formar o correspondente composto 3^eritio-organo-sulfoniloxi que é então halogcnado. 0 composto 3'-threo-hidroxi de fórmula (II) pode ser tratado, por exemplo com trifenil-ío afina, tetrabrometo de carbono e azeto de lítio para formar o composto 3*-eritro aziuo. rode-se efectuar então subsequentemente a remoção de qualquer grupo protector.

iíelativamente ao processo (h), K pode representar um grupo hidroxi protegido por exemplo um éster combinado do tipo referido atrás relativ<»mentp à fórmula(l) particularmente acetoxi, ou um grupo éter tal como um grupo trialquil-sililoxi, por exemplo t-br.til-diietil-sililoxi ou um grupo aralcoxi por exemplo trifenil-metori. Tais grupos podem ser convertidos, por exemplo, por hidrÓZ.ise no grupo hidroxi desejado ou, por trans-esterificação num grupo éster alternativo de 3*-azido-3^,-deoxitimidiua .

Reiativamentâ ao processo (C), isto pode ser efectuado, por exemplo, po»* sratamento da pirimidina de fírmula (IV) ou dum sal ou dum seu derxvado protegido com . um composto de fórmula

- 15 ο

(em que A representa u acetoxi ou benziloxi o opcionalmente um grupo p-tolueno-sulfoniloxi) grupos protectores.

. grupo removível, por exemplo, um grupo . halo(ex:gripo cloro? e 3 representa hidroxi protegido (por exemplo, um grupo e subsequente ente a remoção de quaisquer

Belativamente ao processo 1, H pode representar um grupo precursor como se descreveu atrás para R na fórmula (111). a 3*-azido-3*-d eoxitiaiiciina po,.e, então, ser obtida, por exemplo, por reaeçSo com um azeto de metal alcalino, por exemplo azeto de lltio, vantajosamente num solvente apropriado tal como íè]? húmido seguida de hidrólise ácida ou bÔsica vantajosamente sob condições suaves.

a 3*-aziáo-?‘-ueoxitimidine pode ser convertida num fosfato farmaceuticarnente aceitável ou noutro éster por reacçSo com um agente de fosforilaçâo, por ex: .9001, ou um agente de esterificaçâo apropriado, por exemplo um haletc ou anidrido ácidos, respectivamente. 0 composco de fórmula (l) incluindo os seus ésteres pode ser convertido m sais farmaceu ticamente aceitáveis de forma convencional, por exemplo por tra tamento com uma base apropriada. Um éster ou sal de 3*-azido-3’-deoxitimidina pode ser convertido no compostc cie origem, por exemplo por hidrólise.

Os Exemplos seguintes servem apenas par« ilustraçSo e nSo para limitar, de algum n*Gdc_; o âmbito da invenção. 0 termo ingrediente activo* usado nus Exemplos significa um composto de fórmula (I) ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável.

â

Maaaczz..

lauiiw

Exemplo li FormulaçCos àe comprimidos ~ ί¹:·'

4<s formulações cus comprimidos λ e 3 foram preperadas por granulação húmida dos ingredientes com uma solução de povidona, seguida da adição de sstearato de magnésii) e de compressão»

Formulação * (a) ingrediente activo (b) Lactose Β»1» (c) LOvidona B.j?» (d) Amido-glicolato de sõcio (e) Estearato ãe magnésio

Formulação B (a) Ingrediente actívo (b) juaotose (c) âvicei FH 101 (d) xovidona x;.-r» (e) «mido-G-licolato de sódio (f) Estearato de magnésio

Formulação 0

Ingrediente activo

Lactose

Ãmido

Boviôona

Estearato de magnésio

mg/vOmjizimido	mg/compriuido
	250
2 lo	£-b
15	α
2Q	12
5
5CC	300
mg/comprimid o	mg/compr imid o
250	250
150	-
60	26
15	9
f.	12
5	3
500	300
mg/comprimid o
100
?00
50

359 as formulações a seguir lei, foram preparadas por compressão directa dos ingredientes misturados.

- 17 1

mg/câpsula

250

Ή

Ingrediente activo

«Mão NE 15 pré-gelatinizado	150 400
	m^/câpsula
Ingrediente activo	250
lactose	150
* vicei	100
	500
Formulação F (Formulação de Libertação Controlada)
n formulação foi preparada por granulação húmida dos ingredientes (a seguir) coia unia solução de povidona stguida pela adição de estearato de magnésio e compressão. mg/comprimido (a) Ingrediente activo 500
(b) Hidroxi-propil-uetil-celulose (a.etocel íiAu ^remium)	112
(c) Lactose 3.1.	53
(d) xOVidona	2s
(e) Estearato de magnésio	700
a libertação te um período de cerca de 6-8 horas	da droga teve lugar durane terminau apús 12 horas.
Exemplo 2> Formulaçães
Formulação «
ireparou-se uma formulação de cápsula misturando os ingredientes da Formulação D no Exemplo I atrás

descrito e introduzindo a misture numa cápsula de gelatina durí de duas partes* â formulação B (infra) foi preparada de manei ra semelhante*

Formulac3o B mg/cápsula (a) Ingrediente activo250 (b) Lactose B,P*143 (c) *mido glicolato ãe sMio25 (d) Estearato de magnésio 2_

420

Formulac3o 0 mg/edpsula (a) Ingrediente activo2-50 (b) Lacrogol 4003 &?35C

600 «s cápsulas foram preparadas fundindo o Macrogol 4000 BP» dispersando o ingrediente activo na fusáo e introduzindo a solução numa cápsula ãe gelatina dura de duas

partes*
FormulacSo L	mg/câpsula
Ingrediente activo	250
Lecitina	100
fllec araquldico	100 450
	«s cápsulas foram preparadas d:

do o ingrediente activo na lecitina e áleo aracuídico e introduzindo a dispersSo em cápsulas de gelatina elástica flexível*

FormulaçSo E (Cápsula <3e Libertaç9o Controlada)

Lrepj?cu-se a seguinte formulação de cápsula úe libertaçSc contro..a ia por extrusão dos ingredientes a, b e c usando um extrimor, seguida de transformação em esfePBWL

ras do extrudato e secagem, hs esferas secas foram então revestidas com uma membrana de libertação controlada (d) e intro duzidas numa cápsula de gelatina dura de duas partes.

(a)

Ingrediente activo (b)

Celulose microcristalina

125 (c) lactose &

125

Etil-celulose

Exemolo 3s Formulação In.iectável

Formulação á

Ingrediente activo

Solução ue ácido clorídrico C,lu q.s.to pH

Solução de hidróxido de sódio c,!*

q.s.to pii

4.6 ,c a 7,0 a 7.6 água esterilizada

q.s.to ml água a 35% - 46°C e p com o ácioo clorídrico

C ingrediente activo pií ajustado para o intervalo 4,6 e 7,0 ou o hiãrôxião de sócio apropriados, a quantidade formada foi então concluida em volume com a 5gua e filtrada através de um filtro microporoso esterilizado para dentro de um frasco de vidro e ambar (tipo 1) ε selado com oclusões e selos esterilizados.

foi dissolvido em

Formulação B

Ingrediente activo

Tampão de fosfato de p*i«7 esterilizado livre de pirogéneo, quanto baste.

0,125 g ml

Exemplo 4i ln,i ecção intramuscular

2C Ingrediente activo

Álcool benzllico

Glicofurol 75

Água para injecção (quanto baste)

1,45 g .00 ml ingrediente activo foi dissolvido no glicofurol. Adicionou-se e dissolveu-se álcool benzllico e por fim água até 3 ml. a mistura foi então filtrada através de um filtro microporoso esterilizado e selada em frascos este rilizados de 3 ml de vidro e ambar ( tipo 1)

Exemplo 5; Ingredientes

Ingrediente activo

Solução de sorbitol

Glicerol

Benzoato ce sódio

Aroma, xêssego 17.42.316y

Água purificada quanto baste

0.2500	O
1.5tCv	o
2.0000	g
0.0050	3
0.0125	ml
5.0000	ml

ingrediente activo foi dissolvido numa mistura de glicerol e ns maior parte da êgua purificada, adicionou-se então uma solução aquosa de béiizoato de sódio seguindo-se a adição de uma solução úe sorbitol e finalmente o aroma, o volume foi refeito com água purificada e tudo bem misturado.

Supositórios

Ingrediente activo (63^im) í

Gordura sólida, tá (..itepsol nl5-lynamit Nobel) mg/suaositório

250

1770

2020

- 21 Η

ingrediente activo foi usado sob a forma de pá em que pelo menos 90/i das partículas eram de 63 /rm de diâmetro ou menos.

Um quinto do dtepsol H15 foi fundido numa vasilha com vapor a uma temperatura máxima de 45°G, 0 ingrediente activo foi peneirado através de uma peneira de 2oO ^im e adicionado b base fundida com agitação utilizando uma tira de prata com uma'extremidade cortante, até atingir uma dispersão fluente, ^antendo a mistura a 4>°0, adicionou-se a restante rfitepsol hl5 b suspensão e agitou-se para assegurar uma mistura homogénea, rassou-se a suspensão através de uma rede de Aço inoxidável de 250 .um e arrefeceu-se até 4C°G, com agitação contínua. Introduziram*se 2,C2 g da misturá b temperatura entra 5b°0 e 40°u em moldes plásticos apropriadcs.^zCs supositórios foram então arrefecidos até b temperatura ambiente.

Exemplo 7i xessãrips (eugosirérios vaginais) ln_orecitate activo 63 extrose a nitra to

Amino de batata

Estearato de magnésio mg/pessârio

250

W ,. -v V

loco misturam-se 0·? ingredientes anteriores directamente e pregara .j-ae os pessarios gor compressão directs da mistura resultante.

Exemplo 8í 3*-aziúo~3*-ueoxi— 5 ^>-G-oct8noil—ti miôina

Adicionou-se cloreto re octanoilo (1,2 equivalentes) a uma solução de 3^,-azido-3^l-Geoxiti.._iidína em pinaiaa a 0%. Leixou-se a reacção aquecer até b temperatura ambiente, guando a coluna cromato_ôrâfica (UgClj^eOEj ²Usl,

- 22 « em gel de sílica) indicou o fim da reacção, a solução foi vazada em água geleca e a fase aquosa decantado. C óleo resultante foi cromato^rafado e... gel fe sílica e elutriado com ChClx;- eOli. v composto pretendido foi obtido sob a forma de ✓

um óleo por evaporação do solvente a partir de fracções apropriadas,

Ciih·, calculada C-54.95 H-6.92 _i-17.8G encontrado C-54.32 9-6.96 i'-17.6b

£4.0-3.8(^,141,4^), £ 2 »3-2.Hm,4h,2e (lEg)! of octanoil))

6(;2,13H,5* octanoil

Exemplo 9í 5*-acetil-3*-aziáo-3Ó-deoxitimidina «dicionou-se cxoreto ue acetilo (2,1 equivalentes; a uma solução ue S^aziúo-^*-decxitimidina (2C g em piriúina (% ml) b temperatura ambiente, agitou-se 3 rcacção dursnte duas horás e conservou-se entre C°C a 5°C durante 2l horas. Vazou-se em água gelada a'it-anto e deoantou-^e a fase aquosa. 0 produto oleoso foi dissolvido em água e extrH do co.,i água (9 vezes), ácido clorídrico 0,511, água (2 vezes) e depois seco sobre sulfato de magnésio. Ã solução foi filtra da e evaporaua in vácuo e o óleo residual foi dissolviõc em clorofórmio, aplicado a uma colune de gel de sílica e submetido a uma cromatografia * flash” utilizando metanol a 2/ em clorofórmio, As fracções com o produto foram evaporadas e 0 óleo foi crornatografado outra vez, utilizando acetato de etilo hexano (6j4 v/v). As fracções foram outra vez evaporadas in vácuo obtendo-se um sólido branco.

p.f. S6-98^oC

Calculada 0-46.60 xi-4.89 ίϊ-22,65

Encontrada 0-46.67 H-4.94 1-22.59

- 23 Exemplo 10

Os sejuintes compostos foram preparados de acordo com os processos dos Exemplos 8 ou 9 a partir do haleto ou anidrido de ácido, ‘-azido-5 ‘-O-benzoil-3 ‘-deoxitimidina

Calculada

Encontrado •Ό.Ρ

C-53.68

0-53,81

54-59°C

H-4.77 N-18.41

1.-4.7^ 1-18.46 *-azido-3‘-deoxi-5 ^f-0-piraloiltimidina valcuxa.o

Xíncua cr aã©

P.f.

0-51.2? 0-51.07 _{r n}. o.

9p—Ico O i>6.€’ 1.-19,93 £-6.05 11-19.83

3*-azido-3*-deoxi-5*-G“

-(3 -metilbutiril)tiiiaina

Calculado

Encontrado

0-50.24 th-6.13 N-19.53

G-50.27 H-6.11 δ-19.49 $ 7 .Ao(d ,lx. ,v £—1 ,^ΐχζ,6ix) , / 6 ,15( t,lix, 1‘íx) , í4.55-4.15(m,3n,3^fXÍ e 5*0Ea), / 3,8-4,15(m,11,4‘n), í2 .4-1,78(^,3..,2 ‘li e 5 ‘metano} ,/l,cC(ú/<.,v 5 £-1.2..2,^..,^}, 4õ.9(d,6E.â =6,41.2, úutil e... 5‘butiril)

3‘azido-3 *-deoxi-5‘-0-palmitoiltimidina

Calculado 0-61.67 H-8.57 n-13.85

Encontrado 0-61.85 K-8.59 -13.75 ^ΪΛδία,ΙχΜ^ ₆=1.0mZ,í.jJ , /O,l?(t,lE_tl*x.) , /4» 2—4 ,ob(u,3i*, 3 *n e ^‘óíig),/4.0—3.8(m,lu,4‘ti) /2 .35—2 ,ll(m,4u,2 *ti e (úiig)l paliuitcily ,/1 .fc =1.0x12,56x15) /1,35—0.6 (m,29x1,5‘pãlãi,itoil\Ox>>)^56..5) *-azido-3 ‘-deoxi-5-0-toluiltiuiaxna

Calculado

Encontrado

0-56.10;

0-55.88;

-íxr·»

NnR tonado eia DnSO-d^

ΝηΗι íl.95-7.^9 (m,5H; bH,oíi,6H), Í6.16 (t,lH,l’H), ^4.6-4.4 (m,5B,3K,5'2),/4.2-4.0 (a,12,4'B),/2,39 (e.JH.flOH,),

J 1.65 (s,3H,5OHj)

5»-0-hidrogeno-succinato de 3’-azido-3^l-deoxitimidina Calculada 0-44.98} H-4.83; N-17.95

Encontrado 0-44.90} H-4.77} N-17.85

KnR tonado em XbiSO-cL·

NtR: Λ 7.+6 (β,1Η,6Η),/6.13 (η,ΙΗ,ΙΉ) ,/4.48-4.40 (ο,1Η,3'Η) /4.34-4.20 Ga,22,5'2),/3.99-3.94 Ga,12,4'2),/1,78 (e,3H,5OHj)

3’-azido-3’-deoxl-5^,-mesiltimidina

Calculado

0-38.25} Η-4.37}

Encontrado

0-38.15} Η-4.38;

N-20.28!

S-9.2 8

N-20.19!

S-9.30

253°C (dec.)

NíuR tomado em DLSO-dg

NàiRí j7.49(d,lH,J_6>5=

1.0

Hz, 6H),<Í6.15 (t,lH,J_{lt 2}»’⁶·^{6 Hz}» 1Ή), 4.54-4^41 (m,3H} 3*H,5*H),J4.14-4.0^ (m,lH,4*H),

3.24 (s,3H,5*-mesil 0^),/1.79 (d, 3H,J₅ g-1.0 Hz, 5CH₅)

3‘-8zido-5’-0-(3-clorobenzoil)-3’-deoxitimidina Calculado 0-50,31; H-3.97} N-17.26;

01-8.74

Encontrado 0-50.16; H-4.03; N-17.13;

01-8.66

NmR tomado em BanSO-dg

NúiRj /11.37 (β,1Η,3-ΝΗ),ί 7.98-7.43 (m,5H;5*-fenil,6H)»Zô.17 (dd,lH); Jjj₍2a^,a^·^· 2b*^e^·^ 2·*&)»//.68-4.^-8 (m,3H;3’H,5’H),/4.14-4.11 (m.lH,4‘H) ,/2.48-2 .41 (m^H, 2»H), /1.64 (d,3H,J_{5 6}«1.2 Hz, 5CHj)

- 25 _

ΜΕ

Exemplo 11; 2,5-C'-âniàro-3 ^azião-deoxitimiáina â 3‘-azido-3‘-deoxdtimidina (3,0 g, 11,2 nuol) foi mesilada em piridina seca (2 ml) por adiçSo de cloreto de metano-sulfonilo (2,7 ml) a uma soluçSo do material de partida, â reacçSo prosseguiu b temperatura de 5°C durante uma hora e depois vazada em água gelada, 0 precipitado foi se parado por filtração e fez-se reagir o produto (3‘-azido-5‘-me siltimidina) com carbonato de potássio (0,78 g, 5,6 m^ol) em DIF (75 ml). Os reagentes foram aquecidos num banho de Óleo a 80°C durante seis horas, e depois vazadas em água gelada. 0 produto foi extraído a partir da água com acetato de etilo. Hemoveu-se o solvente in vácuo e o Óleo resultante foi submetido a cromatografia “flash” em gel de sílica por eluiçSo com CHOl^í >eOH (9;1 v/v). 0 composto pretendido foi obtido sob a forma de um sólido depois de evaporaçSo do solvente a partir das fracçtJes apropriadas, p,f, » 184 - 1$6°C

Exemplo 12; 3‘-azido-3*-deoxitimidina

·) 2.3‘-anidrotimidina

Dissolveu-s.) a timidina (85,4g ; 0,353 mol) em 500 ul de DiF seco e adicionou-sn b h-(2-cloro-l,l,2-trifluoroetil)dietilamina (100,3 g; 0,529'mol) (preparada de acordo com o método de D.EJiyer, Chem. 6, 608 (1963)).

Esta solução foi aquecida a 70°c durante 30 minutos e depois vazada em 950 ml de etanol (EtOH) com agitação vigorosa. 0 produto precipitou desta soluçSo foi filtrado e o EtOH sobrenadaste foi refrigerado e depois filtrado para se obter o composto, p.f. - 228 - 230°C.

b) 3 *-azido-3‘-deoxitimidina

Su$penáeu-se numa mistura de 250 ml de

DaF e 38 ml de água a 2_>3‘-0-anidrotimidina (25 g; 0,1115 mol) e NaN^ (29g, 0,446 mol). A mistura da reacçPo foi submetida

a refluxo durante cinco horas pelo que foi vazada, a seguir num litro de água, a solução aquosa foi extraída com EtOAc (5x700 ml) e os extcactos de EtOÁc foram secos sobre NagSO^, filtrados e o EtOAc removido in vacuo para conduzir a um Óleo viscoso. Este Óleo foi agitado com 2qo ml de água fornecendo o composto desejado como um sólido que foi separado por filtra ção. p.f. » 116 - 118°0

Exemplo 15s sal monossódico de 3^azjdo-õ^deoxitimidina

Dissolveu-se aproximadamente 1 g de 3*-azido-3*-deoxitimidina em 50 ml de água destilada. 0 pH foi ajustado para 12 com MaOH IN. Aproximadamente metade da solução foi liofilizada, O composto desejado foi obtido sob a for· ma de pó liofilizado·

Análises calculado por Cl_OH₁₂N₅NaO₄ 6/10 N₂0

Calculado C-40.03; H-4.43; N-23.34; Na-7.66

Encontrado 0-39.88; £-4,34; N-23.23; Na-7.90

Dissolveu-se 3*-azido-3^,-deoxitimiãina (0,5 g, 1,87 mol) em 5 ml de trietil-Josfato e arrefeceu-se a mistura atê -5°C. Ádicionou-se oxicloreto de fósforo para se agitar rapidamente a solução que foi depois mantida a -10°C durante 22 horas. Repoveu-se uma porção que foi adicionada a hidróxido de amónio concentrado. A análise dests amostra em coluna cromatografica (IDC) (celulose, n-BrOHíHgO, 7s3 v/v) mostrou não haver material de partida e mostrou uma mancha fluorescente Única com mais baixa mobilidade do que o nucleóMdo. A mistura de reacção foi vazada em 2o ml de água gelada, depois colocada num banho de gelo e o pH da solução ajustado para 7,5 por adição de NaOH 2lí. Extraiu-se esta mistura uma vez com clorofórmio e outra vez com éter. A camadc aquosa foi novamente ajustada para um pfí de 7,5 e concentrada in vacuo

para remover o solvente orgânico residual. 0 material foi armazenado 8 -1O°C e purificado como segue.

carvão desactivado foi preparado por lavagem do carvão de coconote (50-200 de malha, 100 g) com 500 ml de HC1 IN, 3 1 de âgua, 35 ml de de tolueno 93$ em etanol a 95$, 600 ml de de etanol a 95$ e por fim com bastante égua. Adicionou-se o carvão desactivado (12 ml.de carvão seco) a uma solução de monofosfato (0,7² g, 1,8 mmol, 30 ml), a parte sobrenadante foi decantada e o carvão foi lavado com 150 ml de água. 0 nucleófilo foi elutriado a partir do carvão por lavagem com 120 ml de hidróxido de amónio 1,.5 λ. em metanol a 50$. Esta solução foi filtrada at-cavÓs de um filtro de 0,22 micron, concentrada in vácuo até 10 ml, filtrada através de uma membrana de OE-25 amicon Oentriflo e liofilizada para fornecer ο 3¹-8Zido-3^,-deoxitimiãina-5^,-monofosfato de di-amónio como um sólido. Éste composto foi definido como sendo um 5*-monofosfato de nuclósido pela capacidade da 5‘-núcleotidase degradâ-lo para o nucleósido.

Exemplo 15: 3*-azido-5^t-trifosfato-3*-áeoxitimidina -5 *-difosfato-3 ‘-deoxitimidina (a) oirpfosfato de bi8(tri-n-butilfmónio)

3*-azjdcPreparou-se uma coluna de resina de piridina Dow 50 (resina permutadora de iões ^rtlowex^H-Dow Chemical laboratories) vazando 40 ml de resina numa coluna de 25 cm de diâmetro e lavou-se com água até não elutriar mais cor. 0 Pirofosfato deca-hidratado (1,12 g, 2,51 foi dissolvido em 30 ml de água e aplicado ã coluna, a coluna foi elutriada com égua e colheu-se uma fracção de 125 ml do eluente que continha material absorvente de liV. Reduziu-se 0 volume para 10 ml in vacuo e adicionou-se tri-n-butilamina (1,2 ml). Reduzindo novamente 0 volume in vácuo 0 resíduo foi seco 4 vezes por co-evapo .‘ação com piridina, 0 produto foi armazenado num congelador (-5°C).

- 28 1

(b) ^{A £orulSl} hidrogeno da 3^>-azido-5*-monofosfato -3*-deoxitimidina

A forma hidrogeno do monofcsfato foi preparada passando o sal de amónio obtido no Exemplo 14 (0,1 g, 0,283 mol) dissolvido em 6 ml de água, através de uma coluna de 1,5 ml (10 eg.) de DGW 50 H*.

(c) Derivado do fosforomorfolidato da 3*-azido-3^t-deoxitimidina

Dissolveu-se 0,283 mmol da forma hidrogeno do monoíosf8to obtido no passo b) em 9 ml de água. Adiei» nou-se morfolina (99 ul, 1,13 mmol, 4 eq.) e a solução foi aqm eido sob refluxo, adicioncu-se durante 3 horas dxciclo-hexil carbodiimida (0,234 g, 1,13 m^ol, 4 eq.) dissolvida em t-butanol (5 ml) e a reacçSo foi novamente submetida a refluxo duran te a noite, λ reacção foi arrefecida até b temperatura ambien te, filtrada e os solventes removidos in vácuo. Adicionou-se etanol e evaporou-se in vacuo quatro vezes. 0 resíduo foi dissolvido em metanol e o fosforomorfolidato precipitado por adição de éter. 0 precipitado foi triturado com éter quatro vezes e seco num evaporador rotativo, obtendo-se o composto pretendido.

(d) *-BZido-3 ^deoxitimidina-S^-trifosfato

Secou-se o derivado fosforomorfolidato obtido no passo c) por remoção, in vácuo. 4 vezes da piridina, 0 bis (n-Bu)^N pirofosfato obtido no passo a) foi também seco por remoção da piridina in vácuo, Lissolveu-se o fosforomorfolidato em piridina, 5 ml, e adicionou-se ao recipiente que continha o reagente pirofosfato. a reacção continuou durante a noite à temperatura ambiente e a piridina foi removida in vácuo. Adicionou-se água ao resíduo e removeu-se in vácuo trê3 vezes. 0 resíduo foi congelado e depois descongelado e dissolvido <)m 50 ml de água. A solução foi aplicada a uma coluna — 29 — (1x10 cm) de DEaE Saphadex À-2? que ê equilibrada com 50mm de bicarbonato de amónio. Os fosfatos foram elutriados com um gradiente linear de 300 ml de bicarbonato de amónio de 50-800aw e as íracçOes contendo nucleotido de di-fcsfato foram reunidas como foram as que continham o nucleótido de trifosfato. ab fracçóes reunidas de difosfato e tri-fosfato foram secas in vácuo redissolvidas em égua, novamente secas e liofilizadas.

Exemolo 16; Sintese Enzjmática da 3'-azida-5'-trifosfato^ *-deoxitimidina

5'-trifosfato foi sintetizado a partir do 5‘-difosfato utilizando piruvato de quinase e nucleósido difosfato quinase. *» mistura de reacção continha; 6mm de 3'~azido TDi, 12 mm de trifosfato de adenosina, 40mm de mgCl₂, 40 mu de potássio um tampão (pH 6,8) do Ócido piperazina-Ε,ϊΡ-bis(2-etano-sulfónico), 30 mm de fosfoenol-piruvato, 40 XU/ml nucleÓsido difosfato quinase e 100 XV/ml de piruvato quinase num volume final de 5 ml. A mistura da reacção foi incubada a 37°C durante 5 dias e aplicou-se a uma coluna (2,5x10 cm) de DEAE Sephadex A-25 que foi equilibrada com bicarbonato de amónio. Os nucleÓtidos foram elutriados com um gradiente de 100-1000 mã de bicarbonato de amónio. As fracçães contendo o tri fosfato forem reunidas e evaporadas b secura in vácuo. 0 composto foi também purificado utilizando uma coluna HPLC (whatman, Inc», kagnum 9 SftX) elutriada com um gradiente de 10-100 nua de fosfato de potássio, pfí«3,5. 0 composto resultante foi ainda purificado utilizando uma coluna EBAE Sephadex á-25 como referido atrÔs. As fracçães contendo o ã^azido-õ^deoxitimidina-5'-trifosfato de tetra-amónio foram reunidas, secas in redissolvidas em Ógua e liofilizadas para dar o composto desejado.

Exemplo 17; actividade antiviral (») U) Retrovirus - malignidade induzida — 30 -

â 3^l-azido-3*-deoxitimidina foi administrada a ratos fêmeas BáXB/c infectados coai 1,5 x 10⁴Bfu do tipo RVB3 do Virus Leukaemia rnurino Rauscher. 0 tratamento foi ini ciclo 4 horas depois da infecção em doses de 80 mg/kg via intraperitonal de 8 em 8 horas ou 0,5 ou 1,0 mg/mi oralmente com água. Verificou-se que tal tratamento evitou a infecção das células do baço e subsequente desenvolvimento da doença do aumento do baço e suprimiu também a viraemia.

(ii) ngH - I hs células suaceptíveis b infecção do VXTH células de tumor-aj produtoras de

2m-ll (clones das células-S

1) feram co-cultivedas com VXíífí - 1 radiant-s como se segue:

a)

b)

c)

d)

e)

Somente células - 11$

Células - 11 e células de tumor--.. J

Células Tm-11, midina (3^oM)í

Células Tk-11, dina (9yu &);

Células TX-11, células de tumor-wj e células de tumor--. J e células de tumor-âJ e

3*-azido-3’-deoxiti3’-azido-3‘-deoxitimi· *-azido-3 *-deoxitimidina (27^)

Dezoito dias depois, o AM total foi extraído de cada cultura e preparado com Bam Hl para produzir um fregmento do genona de ViTH -1, inàepenâente de qualquer sequência do flanco hospedeira e tendo um peso molecular padrão de 3>3 aD. A reacção foi então testada com radio-etiqueta lambda mf-2, um método padrão para reconhecer o fragmento Bam Hl de ViTH-I.

Não foi observada nenhuma hibridização para a) indicando uma deficiência de virus no controle não infeemado. Roi visto um sinal forte para b), o controle infectado não tratado. Observou-se um sinal fraco em c) indicando

exterminação incompleta do virus e em d) ou e) não foi notada nenhuma hibridização o que indica exterminação completa do vi rus.

Cada cultura foi também testada coa uma sonda prra a cadeia fi do receptor de célula-T, com um sinal forte produzido por todas as culturas, o que mostra a presença contínua de Ik-11 durante a ocorrência da experiência.

(b) VIU* (i) actividade da contra-transcriptase « 3’-azida-5 *-trifosfato-3 ♦-c.eoxitimidina foi testada invitro contra a transcriptase do VXu* (VUM RI).

VIDa RT foi purificado a partir do Vllk» extraído e reduzido a pequenos grânulos por elutriação stravés de colunas de fosfocelulose e DBAE. á actividade da enzima era linear durante 6C minutos e estável durante pelo menos 2 meses quando armazenada em glicerol a 6O5& e 1 mg de como albumina de soro bovino por ml. Utilizando ^rÀ~^oât(j_2_i8) 0 suporte-primário, 0 VIDfc tinha um pH óptimo de 7,0 a 7,3 uma concentração éptima de mnGlg de 0,3 mm e uma concentração óptima de wgClg de 5nm, A actividade na presença de 5 mm de MxgCl, era JG vezes maior do que a actividade na presença de 0,3 mu de wnC^. A actividade máxima Ca enzima foi também verificada para uma concentração de 80 a 140 mm. de L.C1 e 60 para 100 m*u de NaCl. A incorporação de ^â m era linear relativamente 4 concentração da enzima. Quando testada verificou-se que a 3^l-azido-5*-trifosfato-3*~deoxitimidina era uma inifeidor competitivo do Vilm RT, obtendo-se um Ai de 0,04^ quando se usa rA-odT^g^g^ como 0 suporte-primário. á enzima tinha um Am de dTTP de 2,81 yk, sugerindo que a 3^,-azido-5^t-trifosfato-3*-deoxitimidina se liga mais fortemente a enzima do que 0 dTTP. Além disso, experiências com 0 R®¹® do virus do mieloblastose das aves, virus leukaemia murino moloney e VIIM,

mostrarem que a 3»-₈ziao-5*-trifosf8to-3’-âeoxititiiâina é uma extremidade da elongação da cadeia de λ TU.

(ii) Actividade «nri-VIIA in vitr-

Testou-se que k 3*-azido-3’-deoxitimidi’· na e verificou-se possuir actividade numa série de sistemas de ensaio in vitro. mediram-se os efeitos das drogas por ensaio da actividade da contra-transcriptase (K2) nas células sobrena·· dantes a partir das células infectadas, não infectadas e tratadas com drogas, a 3’-azic.o-3‘-ô.eoxiti!iiidina bloqueou efecti·· vamente a infecção pelo VIB» das linhas de células linfoblastoides humanas H9 e 0937 nas concentraçd-.s compreendidas entre 2,7 e 0,0013 meg/ml. Ao mes^o modo a infecção das rélulas de sangue brancas estimuladas Piíí» normal e inibiram-se linfócitos de eangue periféricos cultivados para concentrações de droga de 0,013 meg/ml. Experiências de adição e subtracção de droga em células H9 reveraram que a 3^,-azido-3^,-deoxitimidina foi mais efectiva quando presente ná mesma altura que a infecção de virus das células susceptiveis, mas ainda mantiveram a maioií parte da sua actividade antiviral mesmo quando adicionada 2o horas depois da infecção do VIDà inicial, â inibição da reprodução virai era também evidente quando a droga esteve presente no m-Ίο apenas durante o período ^f'e 20 horas da absorção do virus. Verificaram-se efeitos para concentrações de 0,13 e C,01D meg/ml. A 3‘-azido-3 ’-deoxitimidina não apresentou actividadv directa anti-Ii2 contra os viriães do VILA purificados. Do mesmo modo, a droga teve um pequeno ou nenhum efeito na produção e libertação de viriões a partir das linhas ãe células do VIDA H9 infectadas cronicamente, (iii) Prevenção de infecoães pelo VlLa λ capacidade da 3*-azido-3*-deoxitimidina para bloquear a infecção de células pelo V1AÁ foi determinada como se segue,

Infectaram-se linfécitos auxiliares-2 específicos de tétano positivos de clonagem com uma série de V11M isolados j/para doses de /até 5OOÚ viriões/célula? e contrelou-se a sobrevivência da cédula depois da infecção. Depois de 10 dias de cultura não foram vistoc efeitos citopéticoí! virsis am células-ϊ «ratadas com 8,ô e 1,3 mcg/ml de jP-azido-3*-deoxitinidina enquanto que nas células infectadas não tratadas foram diminuídas 5 vezes, m sobrevivência das células foi também avaliada em derivados de linha de células súperinfectadas de Vllâ transformadas por VmTH-1 a partir das células descritas atrás. a 3*-aFido-3*-deoxitimidina para concentrações de 2,7_f ¢,27 e 0,13 mcg/rnl bloqueou totalmente os efeitos citopéc-icos em 7 dias, viram-se efeitos protectores em infecções induzidas por viriões li/res de células e virus associadon a células, λ 3^,-azido-3*-deoxitimidina para uma concentração de u,27 mcg/ml também evitou, efectivamente a indução de efeitos citopáticos por um haitiano menos relacionado e isolado de VIDh.

Exemulo 18; Ensaio da toxicidade âdministrou-se a 3*-azião-3*-deoxitimidina a ratos e a ratazanas. 0 valor so de 750 mg/kg em ambes as espécies.

Claims

Erocesso para a preparação de um derivado farmaceuticamente aceitável de 3*-azido-3*-deoxitimidina qu« ao ser administrado a um ser humano é capaz de fornecer (directa ou indirectamente) 3^,-azido-3’-deoxitimidina, ou um metabélito sctivo anti-retroviral, diferente dos seguintes 5•-derivados, nomeadamente derivados de monofosfato, monofosfato dissódico, monofosfato de
2-cimnoetilo, trifosfato p-tolueno-^ulfona to, acetato, metano-sulfonato, trifenilmetil eonde o :*c de
3*- 34 -

-azido-3’-deoxitimidina se liga a um outro nucleÓtido ou derivado nucleósido, caracterizado pors (a) fazer-se reagir um composto de fórmulas (II) (em que u. representa um grupo precursor do grupo 3*-azido) ou um seu derivado (por exemplo um éster ou sal), com um agente ou sob condiçCes tais que converte o referido grupo precursor no desejado grupo azido; ou fazer-se reagir um composto de fórmula (III) (em que R representa um grupo precursor do grupo hidroxi, ou dum grupo de derivado farmaceuticamente aceitável) com um agente ou sob condiçBes tais que converta o referido grupo precursor no correspondente grupo desejado; ou

- 35 (C) fazer-se reagir um composto de fórmula rffi»L

H (IV) ou um seu equivalente funcional, com um composto que faz introduzir o anel desejado de ribofuranosilo na posição 1 do composto de fórmula (l^); ou (D) fazer-se reagir um compostj de íurmula (V) (em que é hicroxi ou R como definido anteriormente), com um agente, sob condiçães, du forma a converter o referido composto em 3^t-azido-3^,-iecxitimidina ou num seu derivado farmacêuticãmente aceitável;

e (i) Quando se forma a 3*-azido-3*-deoxitimidina, converter-se o referido composto num seu ccrivaãc farmaceuticamente aceitável, ou (ii) Quando se forma um derivado farmaceuticamente aceitável j da 3*-azido-3 Weoxitlmidina, converter-se o referido derivado simultaneamente ou depois disso, em 3*-aziáo-3*-deoxitimidina ou num seu derivado diferente.

— 26- —

Processo para a preparação de um der vado de 3’-azido~3‘-deoxitimlãina farmacêuticamante aceitável de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter um sal farmaceuticamente aceitável, um éster ou um sal do éster de 3¹-azido-3*-deoxitimidina.

Processo para a preparação dum deriva· do de 3*-a«ido-3’-deoxitimidina farmaceuticamente aceitável de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se obter um composto do grupo de 5*-difosfato, 3^,-(3-metil-butirato), 5’** -octanoato, 5’-palmitado, 5’-(3-cloro-benzoato), 5’-benzoato, 5’-euccinato de hidrogénio, e ésteres de 5’-pivalato.

w
4* —

Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se incorporar a 3»-azida-3*-deoxiiimidina, como ingrediente activo, ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável com um veículo farmaceutloamente aceitável para esse fim, cuando preparado de acordo com as reivindlcaçães anterioras.

Processo de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por o veículo não ser água.

- 6* Processo de acordo com as reivindica*çSes 4 ou
5 caracterizado por os ingredientes serem esiereliza·· dos.

Processo de acordo com a reivindicaçSo
6 caracterizado por se outer uma composiçõo farmacêutica adequa da à administração per injeoçSo,

- a& Processo u? acordo com a reivindicação 7csracterizado por a referida composição poder ser armazenada nu recipiente selado.

-gs -

ProcesrO de acordo com quaisquer das reivindicações 6 e 7 caracterizado per o veiculo farmacêuticamente acextâvel ser âgua esterilizsda,

-ICê - i re cesse de acordo com as reivindicações 4 ou 5 caracterizado por s^c obter uma composição adaptável à administraçSo oral.

-lie -

Processo u acordo com as reivindicaçOeu 4,5 ou 10 caracterizado por se obter uma composição sob a forma de um comprimido ou cápsula.

... *1 O;’ ·“· Ju·**⁸

Processo de acordo com as reivindicações 4,5 ou 6 caracterizado por se obter uma composição adaptável > libertaçSo controlada do ingrediente activo depois da administração oral.

Processo de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por se incorporar adicionalmente um agente aromatizante.

-14* - processo de acordo com quaisquer das reivindicações de 4 a 13 caracterizado por o ingrediente activo estar presente sob a forma unitária ou múltipla.

-15* -

Processo de aoordo com a reivinúicação 14 caracterizado por o ingrediente activo se incorporar numa quantidade entre 5 e 1500 mg.

-16í - processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado por o ingrediente activo se incorporar numa quantidade entre 10 e 1009 ng.

-17* -

Processo de asordo com a reivindicação 14 caracterizado por o ingrediente activo se incorporar numa quantidade entre 2c e 7cG mg.

-18& - processe de acordo com quaisquer das reivindicações 4 a 17 caracterizado por o ingrediente activo ser 3*-azido-3*-deoxitimidina.

- 19½ processo de acordo com as reivindicaçãoí j 4a 18 caracterizado por compreender as seguintes fases:

grupo I*-3Ziõo/ sal), com um preparaçSo de 3’-8Zido-3’-deoxitimidina farmaceuticamente aceitável, fazendo: (i) reagir um composto de fórmula (em que - representa um ^ru^o ^recurocr ou um derivado (por exemplo iu éster ou agente ou sob conuições tais ãe forma a rido grupo precursor ncuesejado grupo asido, ou (ii) reagir um comi os to de fórmula

ÚC converter o refe- (11X) (em que E representa um _arupo precursor do ou dum grupo de derivado farmacêuticamente um agente ou sob condiçCes tais de forma a ferido grupo precursor no correspondente grupo desejado; ou grupo hidroxi aceitável) com converter o re-40 -

-s ou um seu equivalente funcional, com uai composto que fez introduzir o anel desejado de úibofuranosil na posição 1 do composto de fórmula (1V)j ou (iv) reagir um composto de fórmula (em que E*³ Ó hidroxi ou R como '.'.-.'.tinido anteriormente), com um agente, sob conâiçtJe» tais, de forma a converter c referido composto em SP-azidc-^-deaxitf.iicina ou num seu derivado farmaceuticemente acentévelj e depois disso, ou simultan^vente com isso, efectuar uma ou mais das seguintes conversSes opciousisí (i) quando se forma 3*-azião-5*-dcoxitimid.ina converter o referido composto num'seu derivado farmaceuticamente aceitável, (ii) quando se forma um derivado farmaceuticamente aceitável de ^-azido-^-deoxitimiàina converter o referido derivado simultâneamente ou depois disso em ^-azido-V-aeoxiti midina ou num seu derivado diferente; e

- 41 (b) misturar ο produto resultante do processo (A) com o referido veiculo farmacetiLticamente aceitável.

a requerer;e declara que os primeiros pedidos desta patente fo\am deposivados na Jrã-Bretanha em 16 de março de 1985, 9 de ^aio de 1985, 27 de Setembro de 1985 e em 12 de Fevereiro de 1986, os ;2s. 8506869, 8511774, 8525881 e 8603450, respectivamentí e nos /stacos t-niéos da América em 17 de Setembro de 1985, sob o número de série 776,899.