DK164392B

DK164392B - Anvendelse af 3'-azido-3'-desoxythymidin til fremstilling af et laegemiddel til behandling af eller profylakse for en human retrovirusinfektion

Info

Publication number: DK164392B
Application number: DK118086A
Authority: DK
Inventors: Janet Litster Rideout; David Walter Barry; Sandra Nusinoff Lehrman; Clair Martha Heider St; Phillip Allen Furman; George Andrew Freeman
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1985-03-16
Filing date: 1986-03-14
Publication date: 1992-06-22
Also published as: DE3650130T2; DK118086A; ATE44464T1; FI85978B; HK164395A; CY1508A; DK164392C; ATE81978T1; MY102693A; DE3608606A1; AU572019B2; ATE113603T1; DE3650130T3; EP0196185A3; CS385191A3; AT390000B; MC1742A1; EP0196185B1; HK85789A; CA1238277A

Description

DK 164392 B

Retrovira danner en undergruppe af RNA-vira, som for at reproducere sig selv først må foretage en omvendt transkription af RNA i deres genom til DNA (transkrip-tion betyder konventionelt syntesen af RNA fra DNA). Når det virale genom er på DNA-form, vil det blive inkorpo-5 reret i værtscellegenomet og her kan det fuldstændig udnytte værtscellens transkription/translationsudstyr til replikation. Når det virale DNA én gang er inkorporeret, er det praktisk talt umuligt at skelne det fra værtens DNA, og det kan i denne tilstand eksistere lige så læn-10 ge, som cellen lever. Da det i denne form praktisk talt er fuldstændig modstandsdygtigt mod angreb, må man rette behandling mod et andet trin i dets livscyklus, og denne behandling må nødvendigvis fortsætte, indtil alle virusbærende celler er døde.

15 HTLV-I og HTLV-II er begge retrovira og man ved, at de forårsager leukæmi hos mennesker. Især er HTLV-I infektioner udbredte og er ansvarlige for mange dødsfald hvert år verden over.

Man har nu på reproducerbar måde isoleret en re-20 trovirus fra patienter med erhvervet immundefektsyndrom (AIDS). Denne virus er blevet grundigt karakteriseret, og dens internationalt accepterede navn er nu human immun defekt virus (HIV). Man har vist, at denne virus (som heri betegnes HIV) fortrinsvis inficerer og ødelæg-25 ger T-celler, der bærer OKT4 overflademarkøren og man accepterer den nu i al almindelighed som sygdomsfremkalderen for AIDS. Patienten mister mere og mere disse T-celler, hvorved immunsystemets balance forstyrres, og patientens evne til at bekæmpe andre infektioner reduce-30 res, hvorved han bliver modtagelig for opportunistiske infektioner, som ofte viser sig dødelige. Den sædvanlige dødsårsag hos AIDS ofre er de opportunistiske infektioner, såsom lungebetændelse eller viralt inducerede cancertyper, og er ikke et direkte resultat af HIV infek-35 tionen.

Man har fornyligt også udvundet HIV af andre vævstyper, deriblandt B-celler, der eksprimerer T4 mar-

DK 164392 B

2 køren, fra makrofager og væv i centralnervesystemet (CNS), der ikke er associeret med blod. Denne sidstnævnte infektion er opdaget hos patienter, der udviser klassiske AIDS symptomer, og er forbundet med fremad-5 skridende demyelinering, hvad der fører til udmarvning, og sådanne symptomer som encefalopati, fremadskridende dysartria, ataxi og manglende orientering.

Der findes i det mindste fire kliniske manifestationer af en HIV infektion. Ved den indledende bærer-10 tilstand er det eneste tegn på infektion tilstedeværelsen af anti-HIV-antistoffer i blodstrømmen. Man mener, at sådanne bærere kan overføre infektionen f.eks. ved blodtransfusion, seksuel omgængelse eller ved brugte kanyler. Bærertilstanden udvikler sig ofte ikke til anden 15 tilstand, der er karakteriseret ved vedvarende almen lymfadenopati (PGL). Man mener i øjeblikket, at ca.

20% af PGL patienter senere vil udvise den fremadskredne tilstand kendt som AIDS-relateret kompleks (ARC). Fysiske symptomer i forbindelse med ARC kan omfatte almin-20 delig utilpashed, forhøjet temperatur og kroniske infektioner. Sædvanligvis vil denne tilstand føre til den endelige dødelige AIDS tilstand, hvor patienten fuldstændig mister evnen til at bekæmpe infektioner.

Eksistensen af disse humane retrovira og andre er 25 først fornylig blevet opdaget, og da de sygdomme, de er forbundet med, er livstruende, er der et stærkt behov for at udvikle metoder til at bekæmpe disse vira.

Man har i øjeblikket foreslået forskellige medikamenter, der siges at kurere AIDS. Disse omfatter anti-30 monwolframat, suramin, ribavirin og isoprinosin, som enten er noget giftige eller ikke udviser synderlig antiretroviral aktivitet. Da HIV genomet inkorporeres i værtscelle-DNA efter infektionen og i praksis ikke kan angribes i denne tilstand, vil det eksistere så længe, 35 som værtcellen overlever, og i mellemtiden forårsage nye infektioner. Derfor vil en hvilken som helst behandling

DK 164392 B

3 for AIDS strække sig over en længere periode, muligvis for livstid, og kræve midler med en tolerabel giftighed.

Der findes rapporter, der beskriver afprøvning af forbindelser mod diverse retrovira, f.eks. Friend 5 leukæmivirus (FLV), en retrovirus hos mus. F.eks. fandt Krieg et al. (Exp. Cell Res., 116 (1978) 21-29), at 3'-azido-3'-desoxythymidin ved in vitro eksperimenter påvirkede frigivelsen af C-type partikler og forøgede dannelsen af A-type partikler af et FLV kompleks, og 10 Ostertag et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. (1974) 71, 4980-85) overfortolkede forsøg med det ovenfor nævnte FLV kompleks som antiviral aktivitet og foreslog på baggrund af dette og mangel på cellulær giftighed, at 3'-azido-3'-desoxythymidin "på fordelagtig vis kunne er-15 statte bromdesoxyuridin ved medicinsk behandling af sygdomme forårsaget af DNA vira". Imidlertid fastslog De Clerq et al. (Biochem. Pharm. (1980) 29, 1849-1851) seks år senere, at 3'-azido-3'-desoxythymidin ikke udviste nogen mærkbar aktivitet over for nogensomhelst vira ved 20 deres afprøvninger, omfattende vaccinia, HSV I og varicella zoster virus (VZV). Glinski et al. (J. Org. Chem.

(1973), 38, 4299-4305) beskriver visse derivater af 3'-azido-3'-desoxythymidin og deres evne til at blokere ex-oribonu cleaseaktiviteten hos pattedyr.

25 Vi har nu opdaget, at 3'-azido-3'-desoxythymidin har en overraskende kraftig aktivitet over for humane retrovira med en særlig høj aktivitet over for HIV, som demonstreret ved de nedennævnte eksperimenter. En sådan aktivitet gør forbindelsen nyttig ved behandling af 30 humane retrovirale infektioner.

Som følge heraf angår opfindelsen anvendelse af 3'-azido-3'-desoxythymidin til fremstilling af et lægemiddel til behandling af eller profylakse for en human retrovirusinfektion.

35 Forbindelsen 3'-azido-3'-desoxythymidin har føl gende formel:

DK 164392 B

.6"

5 H0 η I

£7

Aktiviteten af 3'-azido-3'-desoxythymidin over 10 for humane retrovira er blevet fastslået ved diverse in vitro assay systemer. P.eks. forhindrer man effektivt infektion af H9 human lymfoblastoidcellelinien med HIV ved koncentrationer af 3'-azido-3*-desoxythymidin, der er så lave som 0,013 pg/ml, op til 20 timer efter in-15 fektionen. HIV infektion af U937 humane lymfobla-stoidceller, PHA-stimulerede hvide blodceller og kultiverede periferale blodlymfocyter forhindres også ved tilsvarende lave koncentrationer. Derudover viste der sig ved 10 dages overbelastningseksperimenter, hvor man 20 benyttede op til 5000 HIV virioner pr. celle og klonede T4 tetanusspecifikke T-hjælper lymfocyter ingen nedgang i antal af celler behandlet med 3'-azido-3'desoxythymidin, hvorimod antallet af ubehandlede celler faldt med en faktor 5. Cytopatiske effekter blev også fuld-25 stændig blokeret ved den samme cellelinie, der var transformeret med HTLV I og overinficeret med HIV.

Andre studier, hvor man anvender renset HIV revers transkriptase har vist, at aktiviteten af dette enzym blokeres af triphosphatet af 3'-azido-3'-desoxy-30 thymidin ved en konkurrerende inhibitionsmekanisme.

Fase 1 kliniske prøver har også vist, at 3'-azido-3'-desoxythymidin er i stand til at overskride blod/hjernebarrieren i klinisk effektive mængder. Denne egenskab er usædvanlig og også værdifuld ved behandling 35 eller profylakse af CNS infektioner forårsaget af humane retrovira.

DK 164392 B

5

Evnen hos 3'-azido-3'-desoxythymidin til at modificere forløbet af en retrovirusinduceret lidelse er blevet demonstreret i en musemodel, hvori tilførsel af 3'-azido-3'-desoxythymidin forhindrede splenomegali 5 forårsaget af intravenøst tilført Rauscher museleukæmi-virus, hvad der hos mus er ækvivalent med HTLV i. I andre eksperimenter har man vist, at 3'-azido-3'-desoxythymidin forhindrer in vitro replikation af HTLV I ved koncentrationer, der er så lave som 0,8 yg/ml.

10 Eksperimenter har vist, at 3'-azido-3'-desoxythy midin in vivo omdannes til 5'-monophosphatet ved hjælp af cellulære enzymers virkning, Monophosphatet phospho-ryleres derefter af andre enzymer, så triphosphatet dannes via diphosphatet, og andre studier har demonstreret, 15 at det er triphosphatformen af 3'-azido-3'-desoxythymidin, som anses at være den effektive kædeafslutter i revers transkription af HIV, som det ses af dets virkning på myeloblastosisvirus hos fugle og Moloney leukæmivirus hos mus. Denne form inhiberer også Hiv revers tran-20 skription in vitro, idet den samtidig næsten ingen virkning har på human DNA-polymeraseaktivitet.

Eksempler på humane retrovirusinfektioner, som kan behandles eller forhindres med lægemidler fremstillet ved anvendelse ifølge opfindelsen, inkluderer infek-25 tioner med T-celle lymfotropiske retrovira (HTLV), især HTLV I, HTLV II, samt med HIV (tidligere bl.a. benævnt HTLV III). Kliniske tilstande, der kan behandles eller forhindres ifølge opfindelsen, inkluderer AIDS, AIDS-relateret kompleks og HTLV I positiv leukæmi og lymfoma.

30 Patienter, der kan behandles på denne måde omfatter også sådanne, der har antistoffer mod Hiv, HIV CNS infektioner, PGL og ARC.

3'-azido-3'-desoxythymidin (herefter betegnet den aktive ingrediens) kan indgives til mennesker ved be-35 handling eller profylakse for retrovirale infektioner på en hvilken som helst passende måde omfattende oral, rec-

DK 164392 B

6 tal, nasal, topisk (inkluderende buccal og sublingual), vaginal og parenteral (inkluderende subcutan, intramus-kulær, intravenøs og intradermal) indgivelse. Den foretrukne måde for indgivelsen vil afhænge af tilstanden og 5 alderen af modtageren, infektionens natur og den valgte aktive ingrediens.

I almindelighed vil et passende dosis være i området 3,0-120 mg/kg kropsvægt til en patient hver dag, foretrukken i området 6-90 mg/kg kropsvægt pr. dag og 10 mest foretrukket i området 15-60 mg/kg kropsvægt pr. dag. Det foretrækkes, at den ønskede dosis indgives som to, tre, fire, fem, seks eller flere underdoser med passende mellemrum i løbet af dagen. Disse underdoser kan indgives på enhedsdosisform, f.eks. med indhold af 15 5-1500 mg, foretrukken 10-1000 mg og mest foretrukken 20-700 mg aktiv ingrediens pr. enhedsdosis.

Eksperimenter med 31-azido-3'-desoxythymidin tyder på at en dosis skal indgives, så man opnår en maksimal plasmakoncentration af den aktive forbindelse på 20 ca. 1-75 μΜ, foretrukken 2-50 μΜ, mest foretrukken ca.

3-30 μΜ. Dette kan f.eks. opnås ved intravenøs injection af 0,1-5% opløsning af den aktive ingrediens, eventuelt i saltvand eller indgivelse oralt som en bolus, der indeholder 1-100 mg/kg af den aktive ingrediens. Man kan 25 opretholde det ønskede niveau i blodet ved hjælp af kontinuerlig infusion, hvorved der indgives ca. 0,01-5,0 mg/kg/time eller ved afbrudte infusioner, der indeholder ca. 0,4-5 mg/kg aktiv ingrediens.

Lægemidlerne fremstillet ved anvendelse ifølge 30 opfindelsen indeholder i det mindste én aktiv ingrediens, som defineret ovenfor, sammen med en eller flere acceptable bærere derfor og eventuelt andre terapeutiske midler. Alle bærere må være acceptable, idet de skal være forligelige med de andre ingredienser i præparatet og 35 ikke skadelige for patienten. Præparaterne omfatter sådanne, der er egnet til oral, rectal, nasal, topisk

DK 164392B

7 (inkluderende buccal og sublingual), vaginal eller parenteral (inkluderende subcutan), intramuskulær, intravenøs og intradermal indgivelse. Præparaterne foreligger bekvemt på enhedsdosisform og kan fremstilles ved en 5 hvilket som helst kendt farmaceutisk metode. Sådanne metoder inkluderer, at man forener den aktive ingrediens med bæreren, som består af en eller flere hjælpeingredienser. I almindelighed fremstiller man midlerne ved grundigt og regelmæssigt at forene den aktive ingrediens 10 med væskeformige bærere eller findelte faste bærere eller begge, og derefter, om nødvendigt, formgive produktet.

Omhandlede lægemidler, der er egnet til oral indgivelse, kan foreligge som enkelte enheder, såsom kap-15 sier, cachetter eller tabletter, der hver indeholder en forud bestemt mængde af den aktive ingrediens; som et pulver eller granulat; som en opløsning eller suspension i en vandig eller ikke vandig væske; eller som en olie- i-vand væskeformig emulsion eller en vand-i-olie væske-20 formig emulsion. Den aktive ingrediens kan også foreligge i en bolus, latværge eller pasta. Orale midler kan ydermere indeholde andre kendte midler såsom sødemidler, aromastoffer og fortykningsmidler.

En tablet kan fremstilles ved sammenpresning 25 eller formstøbning, evt. sammen med en eller flere hjælpeingredienser. Man kan fremstille pressede tabletter, idet man i en passende maskine sammenpresser den aktive ingrediens på fritflydende form, såsom et pulver eller et granulat, evt. blandet med et bindemiddel (f.eks.

30 povidon, gelatine eller hydroxypropylmethylcellulose), et smøremiddel, et inert fortyndingsmiddel, præserveringsmiddel, sprængmiddel (f.eks. natriumstivelsegly-collat), tværbundet povidon, tværbundet natriumcarboxy-methylcellulose, et overfladeaktivt eller et disper-35 gerende middel.

Man kan fremstille formstøbte tabletter ved i en passende maskine at formstøbe en blanding af forbin-

DK 164392 B

8 delsen på pulverform, fugtet med en inert væskeformig fortynder. Tabletterne kan eventuelt overtrækkes eller forsynes med en kærv og kan formuleres, så de medfører langsom eller kontrolleret frigivelse af deres indhold 5 af aktiv ingrediens, idet man f.eks. benytter hydroxy-propylmethylcellulose i varierende mængder til at opnå den ønskede form for frigivelse.

Præparater, der er egnet til topisk indgivelse i munden, omfatter pastiller, der indeholder den aktive 10 ingrediens sammen med en aromatisk bærer, sædvanligvis sucrose og akacia eller tragant; andre pastiller, der indeholder den aktive ingrediens sammen med en inert bærer, såsom gelatine og glycerin eller sucrose og akacia, og mundskyllemidler, der indeholder den aktive ingredi-15 ens i et passende væskeformig bærer.

Præparater til rektal indgivelse kan foreligge som stikpiller, hvor bæreren f.eks. indeholder cacaosmør eller et salicylat.

Præparater egnede til vaginal indgivelse, kan fo-20 religge som vagitorier, tamponer, cremer, geler, pastaer, skum eller spray, der foruden den aktive ingrediens indeholder bærere, der er kendt af fagmanden.

Præparater egnede til parenteral indgivelse inkluderer vandige og ikke vandige isotoniske sterile in-25 jektionsopløsninger, som kan indeholde antioxidanter, puffere, antibakterielle midler og opløste stoffer, som gør præparatet isotonisk med modtagerens blod; og vandige og ikke vandige sterile suspensioner, som kan indeholde suspensionsmidler og fortykningsmidler. Præpara-30 terne kan foreligge i enhedsdosis eller mangedosis lukkede beholdere, f.eks. ampuller og småglas, og kan opbevares frysetørrede (lyofiliserede), så man kun behøver at tilsætte steril væskeformig bærer, f.eks. vand til injektion, umiddelbart før de skal anvendes. Improvise-35 rede injektionsopløsninger og suspensioner kan fremstilles fra sterilt pulver, granulat eller tabletter som ovenfor beskrevet.

DK 164392 B

9

Foretrukne enhedsdosismidler er sådanne, der indeholder en daglig dosis eller enhed, en daglig underdosis som nævnt ovenfor eller en passende brøkdel deraf af den aktive ingrediens.

5 3'-Azido-3'-desoxythymidin kan også benyttes i terapi sammen med andre lægemidler såsom 9-[[2-hydroxy- 1-(hydroxymethyl) ethoxy]methyl]guanin, 9-(2-hydroxy- ethoxymethyl)guanin (acyclovir), 2-amino-9-(2-hydroxy-ethoxymethyl)purin, interferon, f.eks. a-interferon, 10 interleukin II og phosphonoformat (Foscarnet) eller sammen med andre immunmodulerende midler omfattende knoglemarv- eller lymfocyttransplantater, eller medikamenter, såsom levamisol eller thymosin, som tjener til at forøge antallet og/eller funktionen af lymfocytter.

15 Det må forstås, at lægemidlerne fremstillet ved anvendelse ifølge opfindelsen foruden de nævnte ingredienser også kan indeholde andre konventionelle midler, som man benytter ved fremstilling af farmaceutiske midler.

20 Forbindelsen med formlen I kan fremstilles på konventionel vis, f.eks. som beskrevet i følgende referencer eller ved analoge metoder: J.R. Horwitz et al., J. Org. Chem. 29, (juli 1964) 2076-78; M. Imazawa et al., J. Org. Chem, 43(15) (1978) 3044-3048; K.A. Watana- 25 be et al., J. Org. Chem., 45, 3274 (1980); og R.P. Glin-ski et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 915 (1970), såvel som ved fremgangsmåden beskrevet i nedennævnte Referenceeksempel.

De følgende eksempler er givet som illustrationer.

30 Betegnelsen "aktiv ingrediens" benyttet i eksemplerne angiver 31-azido-3'-desoxythymidin.

DK 164392 B

10

Eksempel 1

Tabletpræparater

De følgende præparater A og B blev fremstillet ved vådgranulering af ingredienserne med en opløsning 5 af povidon, hvorefter man tilsatte magnesiumstearat og komprimerede.

Præparat A

mg/tablet mg/tablet 10 (a) Aktiv ingrediens 250 250 (b) Lactose B.P. 210 26 (c) Povidon B.P. 15 9 (d) Natriumstivelsesglycolat 20 12 (e) Magnesiumstearat 5 3 15 500 300

Præparat B

mg/tablet mg/tablet 20 (a) Aktiv ingrediens 250 250 (b) Lactose 150 (c) Avicel(5)pH 101 60 26 (d) Povidon B.P. 15 9 (e) Natriumstivelsesglycolat 20 12 25 (f) Magnesiumstearat 5 3 500 300

DK 164392 B

11

Præparat C

mq/tablet

Aktiv ingrediens 100 5 Lactose 200

Stivelse 50

Povidon 5

Magnesiumstearat 4 359 10

De følgende præparater D og E blev fremstillet ved direkte sammenpresning af de sammenblandede ingredienser. Lactosen benyttet i formulering E var af direkte sammenpresningstype (Dairy Crest - Zeparox ®).

15

Præparat D

mq/tablet

Aktiv ingrediens 250 20 Prægelatiniseret stivelse nf 15 150 400

Præparat E

mq/tablet 25

Aktiv ingrediens 250

Lactose 150

Avicel ® 100 500 30

Præparat F (til kontrolleret afgivelse)

Man fremstillede præparatet ved vådgranulering af de nedennævnte ingredienser med en opløsning af povidon, hvorefter man tilsatte magnesiumstearat og presse-35 de.

DK 164392 B

12 mg/tablet (a) Aktiv ingrediens 500 (b) Hydroxypropylmethylcellulose 112 .5 (Methocel® K4M, bedste kvalitet) (c) Lactose B.P. 53 (d) Povidon B.P.C. 28 (e) Magnesiums tear at 7 700 10

Frigivelsen af aktiv ingrediens fandt sted over en periode på ca. 6-8 timer og var fuldstændig efter 12 timer.

15 Eksempel 2

Kapselpræparater

Præparat A

Man fremstillede et kapselpræparat, idet man 20 sammenblandede ingredienserne i præparat D i Eksempel 1, nævnt ovenfor, og fyldte dem i en todelt kapsel af hård gelatine. Præparat B (se nedenfor) blev fremstillet på samme måde.

25 Præparat B

mq/kapsel (a) Aktiv ingrediens 250 (b) Lactose B.P. 143 30 (c) Natriumstivelsesglycolat 25 (d) Magnesiumstearat 2 420 13

Præparat c mq/kapsel (a) Aktiv ingrediens 250 5 (b) Macrogol ® 4000 BP 350 600

Man fremstillede kapsler ved at smelte Macrogol ® 4000 BP, heri uddispergeredes den aktive ingrediens og 10 dette blev fyldt i en todelt kapsel af hård gelatine.

Præparat D

mq/kapsel 15 Aktiv ingrediens 250

Lecithin 100

Arachisolie 100 450 20 Man fremstillede kapsler ved at uddispergere den aktive ingrediens i lecithin og arachisolie, hvorefter man fyldte dispersionen i bløde elastiske gelatinekapsler. 1 2 3 4 5 6

Præparat E (kapsler til kontrolleret frigivelse) 2

Det følgende kapselpræparat til kontrolleret 3 afgivelse blev fremstillet, idet man benyttede en extru- 4 sionsmaskine til at sammenblande ingredienserne A, B og 5 C, hvorefter extrudatet blev omdannet til småkugler og 6 tørret. De tørrede kugler blev overtrukket med en membran til kontrollering af afgivelse (d) og fyldt i todelte kapsler af hård gelatine.

DK 164392 B

14 mg/kapsel (a) Aktiv ingrediens 250 (b) Mikrokrystallinsk cellulose 125 5 (c) Lactose BP 125 (d) Ethylcellulose 13 513

Eksempel 3 10

Præparater til injektion

Præparat A

Aktiv ingrediens 0,200 g 15 Saltsyreopløsning, 0,1M q.s. til pH 4,0 til 7,0

Natriumhydroxidopløsning, 0,1M q.s. til pH 4,0 til 7,0

Sterilt vand q.s. til 10 ml

Den aktive ingrediens blev opløst i hovedparten af 20 vandet (35-40°C) og pH reguleret til mellem 4,0 og 7,0 med saltsyre eller natriumhydroxid, som det nu passede.

Man fyldte op med vand og filtrerede gennem et sterilt mikroporefilter i en steril 10 ml beholder af ravfarvet glas, type 1, og lukkede og forseglede sterilt.

25

Præparat B

Aktiv ingrediens 0,125 g

Steril, pyrogenfri pH 7 phosphatpuffer, q.s.til 25 ml 30 15

Eksempel 4

Intramuskulær ini ektlon 5

Aktiv ingrediens 0,20 g

Benzylalkohol 0,10 g

Glycofurol 75 1,45 g

Vand til injektion g.s.til 3,00 ml 10

Den aktive ingrediens blev opløst i glycofurol. Man tilsatte benzylalkoholen og lod den opløses, hvorefter man med vand bragte rumfanget til 3 ml. Derefter filtrerede man blandingen gennem et sterilt mikropore-15 filter og forseglede den i sterile 3 ml beholdere af ravfarvet glas, type 1.

Eksempel 5 20 Ingredienser

Aktiv ingrediens 0,2500 g

Sorbitolopløsning 1,5000 g

Glycerol 2,0000 g 25 Natriumbenzoat 0,0050 g

Ferskenaroma 17.42.3169 0,0125 ml

Renset vand q.s. til 5,0000 ml

Den aktive ingrediens blev opløst i en blanding af 30 glycerol og det meste af det rensede vand. Derefter tilsatte man vandig opløsning af natriumbenzoat til opløsningen, hvorefter man tilsatte sorbitolopløsningen og endelig aromastoffet. Man tilpassede rumfanget med renset vand og sammenblandede godt.

35

DK 164392 B

16

Eksempel 6 Stikpiller 5 mq/stikpiller

Aktiv ingrediens (βΒμπι)1 250 Hårdt fedt, BP (Witepsol ® Hl 5-Dynamit NoBel) 1770 2020 10 1 Den aktive ingrediens blev benyttet som et pul ver, hvori i det mindste 90% af partiklerne havde en størrelse på mindre end eller lig med 63ym i diameter.

En femtedel af Witepsol ® H15 blev smeltet i en 15 dampopvarmet beholder ved højst 45°C. Den aktive ingrediens blev siet gennem en 200ym si og tilsat den smeltede basis under opblanding, idet man benyttede en silver-sonblander forsynet med et skærehoved, indtil en jævn dispersion var tilvejebragt. Idet temperaturen af blan-20 dingen blev holdt konstant på 45°C, blev resten af Witepsol ® Hl5 tilsat til suspensionen, og man omrørte til homogenitet. Hele suspensionen blev filtreret gennem et 250μπι filter af rustfrit stål og blev under stadig omrøring afkølet til 40°C. Ved en temperatur på 38-40°C 25 fyldte man 2,02 g af blandingen i passende plastforme. Stikpillerne henstod, til de var afkølet til stuetemperatur .

17

Eksempel 7 Vagitorier 5 mg/vaqitorie

Aktiv ingrediens 63ym 250

Vandfrit dextrose 380

Kartoffelstivelse 363

Magnesiumstearat 7 10 1000

De ovenstående ingredienser blev sammenblandet, og man fremstillede vagitorier ved sammenpresning af den resulterende blanding.

15

Referenceeksempel 31-Azido-31-desoxythymidin a) 2,3'Anhydrothymidin

Man opløste thymidin (85,4 g, 0,353 mol) i 500 ml 20 vandfri DMF og satte det til N-(2-chlor-l,l,2-tri-fluorethyl)diethylamin (100,3g, 0,529 mol) (fremstillet ifølge fremgangsmåden hos D.E. Ayer, J. Med. Chem. 6, 608 (1963)). Man ophedede denne opløsning til 70°C i 30 minutter og udhældte den derefter i 950 25 ml ethanol (EtOH) under kraftig omrøring. Produktet udfældedes fra denne opløsning og blev frafiltreret. Alkoholfiltratet blev isafkølet og derefter filtreret under tilvejebringelse af titelforbindelsen.

Smp. = 228-230°C.

30 b) 31-Azido-31-desoxythymidin 2,3'-Anhydrothymidin (25 g; 0,1115 mol) og NaN3 (29g; 0,446 mol) blev udsuspenderet i en blanding af 250 ml DMF og 38 ml vand. Man holdt reaktionsblandingen un-35 der tilbagesvaling i 5 timer og udhældte den derefter ill vand. Den vandige opløsning blev ekstraheret

DK 164392 B

18 med EtOAc( 3 x 700 ml). EtOAc ekstrakterne blev tørret over Na2S04, filtreret og EtOAc blev bortfordampet under vakuum under dannelse af en viskøs olie.

Denne olie blev udrørt med 200 ml vand under tilve-5 jebringelse af titelforbindelsen som et fast stof, som blev frafiltreret.

Smp. = 116-118°C.

10 Antiviral aktivitet

Retrovirus - induceret malignitet a) (i) Man indgav 3'-Azido-3'-desoxythymidin til BALB/c mus af hunkøn, der var inficeret med 1,5 x 104 Pfu af RVB3-stammen af Rauscher museleukæmivirus.

15 Behandlingen påbegyndtes fire timer efter infek tionen med doser på 80 mg/kg intraperitonealt hver ottende time eller 0,5 eller l, 0 mg/ml i drikkevand. En sådan behandling forhindrede infektion af miltceller og en følgende udvikling af 20 splenomegali og undertrykte også viraemi.

(ii) HTLV-I

TM-ll celler (T-celleklon, der kan inficeres med ' HTLV-I) blev dyrket sammen med bestrålede MJ-25 svulstceller, der producerede HTLV-I, som følger: 19 a) TM-11 celler alene; b) TM-11 celler og MJ-svulstceller; 5 c) TM-11 celler, MJ-svulstceller og 3'-azido-3'-des-oxythymidin (3yM); d) TM-11 celler, MJ-svulstceller og 3'-azido-3'-des-oxythymidin (9 μΜ); 10 e) TM-11 celler, MJ-svulstceller og 3'-azido-3'-des-oxythymidin (27μΜ).

På den 18. dag ekstraherede man total DNA fra 15 hver kultur og fordøjede med Bam Hl under dannelse af et fragment af HTLV-I genomet, uafhængig af en hvilken som helst nabosekvens fra værten, og med en standardmolekylvægt på 3,3 kD. Fordøjelsesproduktet blev derefter testet med radiomærket lambda MT-2, en standardsonde til 20 påvisning af Barn Hl fragmentet fra HTLV-I.

Man observerede ingen hybridisering under a), et tegn på, at der ikke var virus i det uinficerede kontrolforsøg. Man så et stærkt signal i b), den ubehandlede inficerede kontrol. Man så et svagt signal i c), 25 hvad der var et tegn på, at virussen ikke var helt udslettet, og ingen hybridisering i d) eller e), et tegn på fuldstændig udslettelse af virus.

Kulturerne blev også sondeprøvet med en sonde for T-celle receptor β-kæde, og man opnåede et stærkt signal 30 ved alle kulturer, et tegn på, at der til stadighed var TM-11 til stede under hele eksperimentet.

(b) HIV

(i) Revers transkriptaseaktivitet 35 3'-Azido-5'-triphosphat-3'-desoxythymidin blev afprøvet in vitro overfor HIV revers transkrip-

DK 164392 B

20 tase (HIV RT).

Man rensede HIV RT ud fra centrifugebundfald af ekstraheret HIV ved eluering gennem DEAE og phosphorcellulose på søjler. Enzymaktiviteten 5 var lineær i 60 minutter og stabil i det mindste i to måneder ved opbevaring i 60% glycerol og 1 mg BSA pr. ml. Idet man benyttede ^A-oDT^12-i8) som templat-primer, fandt man at HIV RT havde et pH optimum ved 7,1-7,3, et MnCl2 optimum ved 0,3 10 mM og et MgCl2 optimum ved 5 mM. Aktiviteten under tilstedeværelse af 5 mM MgCl2 var 10 gange højere end aktiviteten under tilstedeværelse af 0,3 mM MnCl2. Man fandt også maksimal enzymaktivitet i 80-140 mM KCl og 60-100 mM NaCl. Inkor-15 porering af [3h] dTTP var lineær i forhold til enzymkoncentrationen. Ved en prøve fandt man, at 3'-azido-5'-triphosphat-3'-desoxythymidin var en konkurrerende inhibitor for HIV RT, idet man fandt et Ki på 0,04 μΜ, når man benyttede 20 rA-odT(12-18) som templatprimer. Enzymet havde havde en Km værdi for dTTP på 2,81 μΜ, hvilket antyder, at 3'-azido-5'-triphosphat-31-desoxythymidin bindes tættere til enzymet end dTTP. yderligere eksperimenter med reverse transkrip-25 taser fra myeloblastosis virus hos fugle, Molo ney leukæmivirus fra mus og HIV viste, at 3'-azido-51-triphosphat-31-desoxythymidin var terminator for kædeforlængelse af DNA. 1 2 3 4 5 6

(ii) In vitro-aktavitet mod HIV

2 3'-Azido-3'-desoxythymidin blev afprøvet i en 3 række in vitro assay-systerner, hvor man fandt 4 aktivitet. Man målte effekten som medikament, 5 idet man foretog et assay for revers transkrip- 6 tase (RT) aktivitet på supernatanten fra infice rede, ikke-inficerede og præparatbehandlede 21 celler. 3'-Azido-3'-desoxythymidin blokerede effektivt infektionen af HIV i H9 og U937 humane lymfoblastoid cellelinier ved koncentrationer på 2,7-0,0013 pg/ml. Ligeledes forhindredes 5 infektion af normale ΡΗΆ stimulerede hvide blod celler, og kultiverede periferale blodlymfocyter ved koncentrationer af medikamemtet, der var så små som 0,13 pg/ml. Medikament additions- og subtraktionseksperimenter med H9-celler viste, at 10 3'-azido-3'-desoxythymidin var mest virksomt, når det fandtes under virusinfektionen af modtagelige celler, men bibeholdt dog det meste af sin antivirale aktivitet, selv om det blev tilsat så sent som 20 timer efter en HIV infek-15 tion. Det var også tydeligt, at virusreplika- tionen blev forhindret, når medikamentet kun var til stede i prøven i de 20 timer, hvor virus blev absorberet. Man så virkningen ved 0,13 og 0,013 pg/ml. 3'-Azido-3'-desoxythymidin udvi-20 ste ingen direkte anti-RT aktivitet over for ren sede HIV virioner. Ligeledes havde stoffet ingen eller kun lille effekt på produktion og frigivelse af virioner fra en kronisk inficeret H9 HIV cellelinie.

25

(iii) Forhindring af infektion med HIV

Man undersøgte evnen hos 3'-azido-3'-desoxhthy-midin til at blokere celleinfektion med Hiv som følger: 30 Klonede T4 positive tetanusspecifikke T hjælper lymfocyter blev inficeret med en sammenbragt portion HIV præparater (ved så kraftige doser som op til 5000 virioner/celle) og man kontrollerede celleoverlevelsen efter infektionen. Efter 10 35 dages kultivering så man ingen skadelig effekt på celler fra virus i inficerede T celler, behandlet

DK 164392 B

22 med 8,8 og 1,3 yg/ml 3'-azido-3'-desoxythymidin, medens antallet af ubehandlede inficerede celler faldt med en faktor 5. Man kontrollerede også celleoverlevelsen i en HTLV-I transformeret, 5 overinficeret HIV cellelinie, afledt fra de ovennævnte celler. 3'-azido-3'-desoxythymidin blokerede ved koncentrationer på 22,7, 0,27 og 0,13 yg/ml fuldstændigt cytopatiske effekter efter syv dage. Man så beskyttende virkninger ved 10 infektioner forårsaget både af cellefri virioner og virus associeret med celler. 3'-Azido-31-desoxythymidin ved en koncentration på 0,27 yg/ml forhindrede også effektiv cytopatisk effekt som følge af en fj ernerestående HIV prøve fra 15 Haiti.

Assay for giftighed 3'-Azido-3'-desoxythymidin blev indgivet både til 20 mus og rotter. LD50 værdien oversteg 750 mg/kg i begge tilfælde.

Claims

1. Anvendelse af S'-azido-S'-desoxythymidin til fremstilling af et lægemiddel til behandling af eller 5 profylakse for en human retrovirusinfektion.

2. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at lægemidlet er til behandling af eller profylakse for infektion med human T-celle lymfotropisk virus.

3. Anvendelse ifølge krav 2, kendeteg net ved, at den humane T-celle lymfotropiske virus er HTLV-I.

4- Anvendelse ifølge krav 2, kendeteg net ved, at den humane T-celle lymfotropiske virus er

15 HTLV-II.

5. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at lægemidlet er til behandling af eller profylakse for infektion med HIV.

6. Anvendelse ifølge krav 1, kendeteg- 20. e t ved, at lægemidlet er til behandling af eller profylakse for progressiv almen lymfadenopati.

7. Anvendelse ifølge krav l, kendetegnet ved, at lægemidlet er til behandling af eller profylakse for AIDS-relateret kompleks.

8. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at lægemidlet er til behandling af eller profylakse for AIDS.

9. Anvendelse ifølge krav 1, kendeteg net ved, at lægemidlet er til behandling af tilstan- 30 den som HIV-bærer.

10. Anvendelse ifølge krav 1, kendetegnet ved, at lægemidlet er til behandling af et menneske, der er bærer af anti-HIV-antistoffer.