FI85978C - Foerfarande foer framstaellning av ett terapeutiskt anvaendbart salt eller ester av 3'-azido-3'deoxitymidin. - Google Patents

Description

1 85978

Menetelmä 3'-atsido-3'-deoksitymidiinin terapeuttisesti käyttökelpoisen suolan tai esterin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää 3'-atsido-3'-deok-5 sitymidiinin terapeuttisesti käyttökelpoisen ja farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan tai esterin valmistamiseksi, joka on muu kuin jokin seuraavista 5'-johdannaisista: mo-nofosfaatti, dinatriummonofosfaatti, 2-syaanietyylimono-fosfaatti, trifosfaatti, p-tolueenisulfonaatti, asetaatti 10 tai metaanisulfonaatti. Uudet yhdisteet ovat käyttökelpoisia ihmisen retrovirusinfektioiden hoidossa tai ehkäisyssä.

Retrovirukset muodostavat RNA-virusten alaryhmän, joiden virusten täytyy replikoituakseen ensin "käänteis-15 kopioida" genominsa RNA DNA:ksi ("kopioinnilla" tarkoitetaan tavallisesti RNA:n syntetisoimista DNA:sta). Kun vi-rusgenomi on muuttunut DNA:n muotoon, se siirtyy osaksi isäntäsolun genomia, mikä antaa sille mahdollisuuden käyttää täysin hyväkseen isäntäsolun kopiointi/luentakoneistoa 20 replikoitumistarkoituksiin. Tultuaan sisällytetyksi virus-DNA on itse asiassa erottamaton osa isännän DNA:ta, ja virus voi tässä tilassa säilyä hengissä koko solun elinajan. Koska virus on tässä muodossa käytännöllisesti katsoen haavoittumaton, täytyy mahdollinen hoito suunnata sen 25 elämänkierron toiseen vaiheeseen, ja sitä pitää väistämättömästi jatkaa, kunnes kaikki virusta kantavat solut ovat kuolleet.

HTLV-I ja HTLV-II ovat molemmat retroviruksia, ja niiden tiedetään aiheuttavan leukemiaa ihmisessä. HTLV-I-30 infektiot ovat erityisen laajalle levinneitä ja aiheuttavat vuosittain monia kuolemantapauksia kaikkialla maailmassa.

Eräs retroviruslaji on eristetty toistuvasti AIDS-potilaista. Vaikka tämä virus on pitkälle karakterisoitu, 35 ei sille vielä ole olemassa sovittua nimeä, ja sitä kutsu- 2 85978 taan tällä hetkellä ihmisen T-solulymfotrooppinen virus III:ksi (HTLV III), AIDS:iin liittyväksi retrovirukseksi (ARV) tai imusolmuketautiin liittyväksi virukseksi (LAV). Odotetaan, että kansainvälisesti hyväksytyksi tuleva nimi 5 on hankittu immuniteetin puutostila-virus (aquired immune deficiency virus, AIDV). Tämän viruksen (tästedes käytetään nimitystä AIDV) on osoitettu infektoivan ja tuhoavan ensisijassa OKT4-pintamarkkerin sisältäviä T-soluja, ja sitä pidetään tällä hetkellä yleisesti AIDS:n etiologisena 10 aiheuttajana. Potilas menettää enenevässä määrin tämän ryhmän T-soluja, mikä sekoittaa immuunijärjestelmän koko-naistasapainon, heikentää potilaan kykyä torjua muita infektioita ja herkistää hänet infektioille, jotka usein osoittautuvat tappaviksi. Siten AIDS-potilaiden tavallinen 15 kuolinsyy on toissijainen infektio, kuten keuhkokuume tai viruksen aiheuttama syöpä, eikä kuolema ole suora seuraus AIDV-infektiosta.

Viime aikoina AlDV:tä on saatu talteen muista kudostyypeistä, T4-markkerin sisältävät B-solut, makrofagit 20 ja keskushermostokudos, joka ei ole yhteydessä vereen, mukaan luettuina. Viimeksi mainittu infektio on havaittu potilaissa, joilla on klassiset AIDS-oireet, ja siihen liittyy etenevä myeliinikato, joka johtaa riutumiseen ja sellaisiin oireisiin kuin aivotauti, etenevä dysartria, atak-25 siä ja epätietoisuus ajasta ja paikasta.

On olemassa ainakin neljä AIDV-infektion kliinistä ilmenemismuotoa. Alkuvaiheessa ("kantajavaiheessa") ainoa osoitus infektiosta on anti-AIDV-vasta-aineiden esiintyminen veressä. Uskotaan, että tällaiset "kantajat" pystyvät 30 levittämään infektiota, esimerkiksi verensiirtojen, seksuaalisen kanssakäymisen tai käytettyjen injektioneulojen kautta. Kantajavaihe ei ehkä usein milloinkaan etene seu-raavaan vaiheeseen, jolle on luonteenomaista pysyvä yleis-imusolmuketauti (PGL). Tällä hetkellä arvioidaan, että 35 noin 20 %:lla PGL-potilaista tauti etenee pidemmällä ole- I: 3 85978 vaan vaiheeseen, joka tunnetaan nimellä ARC "AIDS related complex". ARCrhen liittyviä fysikaalisia oireita voivat olla yleinen huonovointisuus, lämmönnousu ja krooniset infektiot. Tämä tila etenee tavallisesti lopulliseen, hen-5 genvaaralliseen AIDS-tilaan, kun potilas menettää täydellisesti kykynsä torjua infektioita.

Näiden ja muiden ihmisen retrovirusten olemassaolo on havaittu vasta vähän aikaa sitten, ja koska niihin liittyvät sairaudet ovat luonteeltaan hengenvaarallisia, 10 on olemassa kiireellinen tarve kehittää uusia tapoja näiden virusten torjumiseksi.

On ehdotettu monia lääkkeitä AIDS:in "parantajiksi". Näihin kuuluvat antimonivolframaatti, suramiini, ribaviriini ja isoprinosiini, jotka ovat joko jossain mää-15 rin myrkyllisiä tai joilla ei ole merkittävää retrovirusten vastaista vaikutusta. Koska AIDV-genomista infektion jälkeen tulee osa isäntäsolun DNA:ta, se säilyy hengissä niin kauan kuin isäntäsolu elää, ja aiheuttaa tänä aikana uuden infektion. Siten mahdollisen AIDS-hoidon tulee olla 20 pitkäaikainen, mahdollisesti elinikäinen, mikä vaatii aineita, joiden myrkyllisyys on hyväksyttävissä rajoissa.

Kirjallisuudessa on kuvattu yhdisteiden testaamista eri retroviruksia, esimerkiksi Friend-leukemiavirusta (FLV), hiiren retrovirusta, vastaan. Esimerkiksi Krieg et 25 ai. (Exp.Cell Res. 116 (1978) 21-29) ovat havainneet 3'-atsido-3'-deoksitymidiinin vaikuttavan FLV: n vastaisesti in vitro-kokeissa, ja Ostertag et ai. (Proc. Nat. Acad. Sei. 71 (1974) 4980-85) ovat todenneet, että FLC:n vastaisen vaikutuksen ja solumyrkyllisyyden puuttumisen 30 perusteella 3'-atsido-3'-deoksitymidiini "voisi suotuisalla tavalla korvata bromideoksiuridiinin DNA-virusten aiheuttamien sairauksien hoidossa". De Clerq et ai. (Bio-chem. Pharm. 29 (1980) 1849-1851) totesivat kuitenkin 6 vuotta myöhemmin, ettei 3'-atsido-3'-deoksitymidiinillä 35 ollut merkittävää vaikutusta mitään heidän kokeissaan käy- 4 85978 tettyä virusta, vaccinia, HSVI ja varicella zoster-virus (VZV) mukaan luettuina, vastaan. Glinski et ai. (J. Org. Chem. (1973), 38, 4299-4305) tuovat esiin tiettyjä 3'-at-sido-3'-deoksitymidiinijohdannaisia (intra) ja niiden ky-5 vyn estää nisäkkäiden eksoribonukleaasiaktiivisuutta.

Olemme nyt havainneet, että 3'-atsido-3'-deoksity-midiinillä on yllättävän voimakas vaikutus ihmisen retro-viruksia vastaan ja erityisen voimakas vaikutus AlDV:ta vastaan, kuten jäljempänä kuvattavat koetulokset osoitta-10 vat. Tällainen vaikutus tekee yhdisteestä käyttökelpoisen ihmisen retrovirusinfektioiden hoitoon.

3'-atsido-3'-deoksitymidiinillä on kaava I

o HN CH3 •u H0 V/ 20 nj ’- ‘ 3 3'-atsido-3'-deoksitymidiinin ihmisen retrovirus-ten vastainen vaikutus on todettu erilaisissa in vitro-koejärjestelmissä. Esimerkiksi ihmisen lymfoblastoidiso-25 lulinjan H9 infektoitumisen AIDV:lla estävät niin pienet 3’-atsido-3'-deoksitymidiinipitoisuudet kuin 0,013 pg/ml vielä 20 tunnin kuluttua infektioinnista. Ihmisen lymfo-blastoidisolujen U937, PHA-stimuloitujen valkosolujen ja viljeltyjen ääreisveren lymfosyyttien AIVD-infektio estyy 30 myös samanlaisilla pienillä pitoisuuksilla. Lisäksi 10 vrk kestävissä altistuskokeissa, joissa käytettiin jopa 5000 AIDV-virionia solua kohden ja kloonattuja tetanusspesifi-siä T-auttajasoluja (T4), ei esiintynyt 3'-atsido-3'-deoksitymidiinillä käsiteltyjen solujen vähenemistä, kun taas 35 käsittelemättömien solujen lukumäärä oli laskenut viides- 5 85978 osan. Sytopaattiset vaikutukset estyivät myös täysin samassa solulinjassa, joka oli transformoitu HTLV-I:llä ja superinfektoitu AIDV:lla.

Toiset kokeet, joissa käytettiin puhdistettua AIDV-5 käänteistranskriptaasia, osoittivat, että 3'-atsido-3'-deoksitymidiinitrifosfaatti estää tämän entsyymin vaikutuksen kompetitiivisella inhibitiomekanismilla.

Ensimmäisen vaiheen kliiniset kokeet ovat myös osoittaneet, että 3'-atsido-3'-deoksitymidiini pystyy lä-10 päisemään veri-aivoesteen kliinisesti vaikuttavina määrinä. Tämä ominaisuus on sekä epätavallinen että arvokas ihmisen retrovirusten aiheuttamien keskushermostoinfektioi-den hoidon ja ehkäisyn kannalta.

3’-atsido-3'-deoksitymidiinin kyky muuttaa retro-15 viruksen indusoiman pahanlaatuisen taudin kulkua on osoitettu hiirimallilla, jossa 3'-atsido-3'-deoksitymidiinin antaminen esti pernan suurenemisen, jonka aiheuttaa Rauscher-hiiren leukemiavirus, HTLV-I:n vastine hiiressä, laskimonsisäisesti annettuna. Lisäkokeissa 3'-atsido-3'-20 deoksitymidiinin on osoitettu estävän HTLV-I:n replikoitu- mista in vitro jopa niin pieninä pitoisuuksina kuin 0,8 pg/ml.

3 *-atsido-3'-deoksitymidiiniä voidaan siis käyttää ihmisen retrovirusinfektioiden hoitoon käytettävän lääk-25 keen valmistukseen.

Keksintö koskee siten menetelmää 3'-atsido-3'-deoksitymidiinin terapeuttisesti käyttökelpoisen ja farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan tai esterin valmistamiseksi, joka on muu kuin jokin seuraavista 5'-johdannaisista: mo-30 nofosfaatti, dinatriummonofosfaatti, 2-syaanietyylimono- fosfaatti, trifosfaatti, p-tolueenisulfonaatti, asetaatti tai metaanisulfonaatti. Uudet yhdisteet ovat käyttökelpoisia AIDS:n tai edellä määritellyn virusinfektion hoitoon tai ehkäisyyn.

35 Esimerkkejä ihmisen retrovirusinfektioista, joita voidaan hoitaa tai ehkäistä tämän keksinnön mukaisesti 6 85978 ovat T-solulymfotrooppisten retrovirusten (HTLVriden), erityisesti HTLV-I:n, HTLV-II:n ja AIDV:n (HTLV-II:n) aiheuttamat infektiot. Kliinisiä tiloja, joita voidaan hoitaa tai estää tämän keksinnön mukaisesti ovat AIDS, ARC ja 5 HTLV-I-positiivinen leukemia ja lymfooma. Hoidettaviksi soveltuvia potilaita ovat myös ne, joilla on AIDV-vasta-aineita, AIDV-keskushermostoinfektioita, PGL ja ARC.

Ilmauksella "farmaseuttisesti hyväksyttävä suola tai esteri" tarkoitetaan mitä tahansa farmaseuttisesti 10 hyväksyttävää suolaa, esteriä tai tällaisen esterin suolaa, joka annettuna ihmiselle pystyy antamaan käytettäväksi (suorasti tai epäsuorasti) 3'-atsido-3'-deoksitymidii-niä tai sen retrovirusten vastaisesti vaikuttavaa metabo-liittia tai ryhmää.

15 Edullisia kaavan I mukaisen yhdisteen estereitä ovat karboksyylihappoesterit, joissa esteriryhmittymän ei-karbonyyliryhmä on suoraketjuinen tai haaroittunut alkyy-li, alkoksialkyyli (esimerkiksi metoksimetyyli), aralkyyli (esimerkiksi bentsyyli), aryloksialkyyli (esimerkiksi fe-20 noksimetyyli ), aryyli (esimerkiksi halogeenilla, C1.4-alkyy-lillä tai C1.4-alkoksyylillä mahdollisesti substituoitu fe-nyyli), sulfonaattiesterit, kuten alkyyli- tai aralkyyli-sulfonyyli (esimerkiksi metaanisulfonyyli), ja mono-, di-tai trifosfaattiesterit. Mitä edellä kuvattuihin esterei-25 hin tulee, sisältävät tällaisissa estereissä mahdollisesti olevat alkyyliryhmät edullisesti 1-13 hiiliatomia, erityisesti 1-4 hiiliatomia, ellei toisin mainita. Tällaisten esterien mahdollisesti sisältämä aryyliryhmä on edullisesti fenyyliryhmä. Kaikki viittaukset mihin tahansa edellä 30 mainittuihin yhdisteisiin ovat samalla myös viittauksia niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviin suoloihin.

Kokeet ovat osoittaneet, että 3’-atsido-3'-deoksi-tymidiini muuttuu in vivo soluentsyymien vaikutuksesta 5'-monofosfaatiksi. Muut entsyymit saavat aikaan monofosfaa-35 tin fosforyloitumisen edelleen trifosfaatiksi difosfaatin

II

7 85978 kautta, ja muut tutkimukset ovat osoittaneet, että juuri 3'-atsido-3'-deoksitymidiinin trifosfaattimuoto on uskottavasti tehokas ketjunpäättäjä AIDVrn käänteiskopioinnis-sa, kuten sen vaikutus linnun myeloblastoosivirukseen ja 5 hiiren Moloney-leukemiavirukseen osoittaa. Tämä muoto estää AIDV:n käänteiskopioinnin in vitro vaikuttaen samalla mitättömän vähän ihmisen DNA-polymeraasiaktiivisuuteen.

Esimerkkejä kaavan I mukaisen yhdisteen farmaseuttisesti hyväksyttävistä suoloista ovat emässuolat, esi-10 merkiksi vastaavasta emäksestä saadut suolat, kuten alka-limetalli- (esimerkiksi natrium-), maa-alkalimetalli-(esimerkiksi magnesium-), ammonium- ja NX\-suolat (jossa X on C^-alkyyli ).

Erityisesimerkkejä kaavan I mukaisen yhdisteen far-15 maseuttisesti hyväksyttävistä estereistä ovat seuraavat 5'-esterit: difosfaatti, 3-metyylibutyraatti, oktanoaatti, palmitaatti, 3-klooribentsoaatti, bentsoaatti, vetysuk-kinaatti ja pivalaatti.

3'-atsido-3'-deoksitymidiiniä tai sen farmaseutti-20 sesti hyväksyttävää suolaa tai esteriä (joista tästedes käytetään ilmausta aktiivinen aineosa) voidaan antaa ihmiselle retrovirusinfektioiden ehkäisemiseksi tai hoitamiseksi millä tahansa soveltuvalla tavalla oraalinen, rek-taalinen, nasaalinen, paikallinen (poskeen ja kielen alle 25 tapahtuva antaminen mukaan luettuina), emättimeen tapahtuva ja parenteraalinen (ihonalainen, lihaksensisäinen, las-kimonsisäinen ja ihonsisäinen antaminen mukaan luettuina) antotapa mukaan luettuina. On selvää, että edullinen antotapa vaihtelee potilaan tilan ja iän, infektion luon-30 teen ja valitun aktiivisen aineosan mukaan.

Sopiva annos on yleensä 3,0-120 mg/painokilo vuorokaudessa, edullisesti 6-90 mg/painokilo vuorokaudessa ja edullisimmin 15-60 mg/painokilo vuorokaudessa. Haluttu annos on edullisesti kahtena, kolmena, neljänä, viitenä, 35 kuutena tai useampana osa-annoksena, jotka annetaan so- 8 85978 pivin välein vuorokauden aikana. Nämä osa-annokset voidaan antaa yksikköannosmuotoina, jotka sisältävät esimerkiksi 10-1500 mg, edullisesti 20-1000 mg ja edullisimmin 50-700 mg aktiivista aineosaa yhtä yksikköannosmuotoa koh-5 den.

3'-atso-3'-deoksitymidiinillä tehdyt kokeet viit-taavat siihen, että tulisi antaa sellainen annos, jolla saavutetaan aktiivisen yhdisteen huippupitoisuus plasmassa noin 1-75 pmol/l, edullisesti noin 2-50 pmol/l ja edulli-10 simmin noin 3-30 pmol/l. Tähän voidaan päästä esimerkiksi antamalla laskimonsisäisenä ruiskeena aktiivisen aineosan 0,1-5 %:ista liuosta, mahdollisesti fysiologisessa suolaliuoksessa, tai suun kautta kerta-annos, joka sisältää noin 1-100 mg/kg aktiivista aineosaa. Toivottavat pitoi-15 suudet veressä voidaan pitää yllä jatkuvalla tiputuksella, joka antaa aktiivista aineosaa noin 0,01-5,0 mg/painokilo tunnissa, tai ajoittaisilla tiputuksilla, jotka sisältävät aktiivista aineosaa noin 0,4-15 mg/painokilo.

Vaikka on mahdollista antaa aktiivista aineosaa 20 sellaisenaan, on edullista antaa se farmaseuttisena valmisteena. Valmisteet sisältävät vähintään yhtä edellä määriteltyä aktiivista aineosaa yhdessä yhden tai useamman sille soveltuvan hyväksyttävän kantaja-aineen ja mahdollisesti muiden terapeuttisten aineiden kanssa. Kunkin kanta-25 ja-aineen tulee olla "hyväksyttävä" siinä mielessä, että sen on oltava yhteensopiva valmisteen muiden aineosien kanssa ja haitaton potilaalle. Valmisteisiin kuuluvat oraaliseen, rektaaliseen, nasaaliseen, paikalliseen (poskeen ja kielen alle tapahtuvat mukaan luettuina), emätti-30 meen tapahtuvaan tai parenteraaliseen (ihonalainen, lihaksensisäinen, laskimonsisäinen ja ihonsisäinen mukaan luettuina) antotapaan soveltuvat valmisteet. Valmisteet ovat mielellään yksikköannosmuodossa, ja ne voidaan valmistaa millä tahansa farmasian alalla hyvin tunnetulla menetel-35 mällä. Tällaisiin menetelmiin sisältyy vaihe, jossa aktii- 9 85978 vinen aineosa saatetaan kosketukseen kantaja-aineen kanssa, joka sisältää yhtä tai useampaa apuainetta. Valmisteet valmistetaan yleensä sekoittamalla aktiivinen aineosa tasaisesti ja perinpohjin nestemäisen kantaja-aineen tai 5 hienojakoisen kiinteän kantaja-aineen tai molempien kanssa ja muotoilemalla sitten tuote tarpeen vaatiessa.

Suun kautta annettaviksi soveltuvat valmisteet voivat olla erillisinä yksikköinä, kuten kapseleina, pulveri-pakkauksina tai tabletteina, joista kukin sisältää ennalta 10 määrätyn määrän aktiivista aineosaa, jauheena tai rakeina, liuoksena tai suspensiona vesipohjaisessa tai vedettömässä nesteessä, tai nestemäisenä öljy/vesi- tai vesi/öljy-emul-siona. Aktiivinen aineosa voi olla myös suurena tablettina, lääkepuurona tai tahnana. Suun kautta annettavat for-15 mulat voivat sisältää lisäksi muita alalla tavanomaisia aineita, kuten makeutus-, maku- ja sakeutusaineita.

Tabletti voidaan valmistaa puristamalla tai valamalla, mahdollisesti yhtä tai useampaa apuainetta käyttäen. Puristetut tabletit voidaan valmistaa puristamalla 20 sopivassa koneessa vapaasti virtaavassa muodossa, kuten jauheena tai rakeina, olevaa aktiivista aineosaa, mahdollisesti sekoitettuna sideaineeseen (esimerkiksi povidoni, gelatiini, hydroksipropyylimetyyliselluloosa), liukastus-aineeseen, inerttiin laimennusaineeseen, säilöntäainee-25 seen, hajoamista edistävään aineeseen (esimerkiksi nat-riumtärkkelysglykollaatti, silloitettu povidoni, silloitettu natriumkarboksimetyyliselluloosa), pinta-aktiivi-seen aineeseen tai dispergointiaineeseen. Valetut tabletit voidaan valmistaa valamalla soveltuvassa koneessa 30 inertillä nestemäisellä laimennusaineella kostutettua jau-heseosta. Tabletit voidaan mahdollisesti päällystää tai varustaa halkaisu-urilla, ja ne voidaan formuloida siten, että saadaan aikaan hidas tai säädetty aktiivisen aineosan vapautuminen, käyttämällä esimerkiksi hydroksipropyylime-35 tyyliselluloosaa vaihtelevina määrinä halutun vapautumis-käyrän aikaansaamiseksi.

10 85 97 8

Valmisteita, jotka soveltuvat suuhun tapahtuvaan paikalliseen antamiseen, ovat makeiset, jotka sisältävät aktiivista aineosaa maustetussa perusaineessa, tavallisesti sakkaroosissa ja arabikumissa tai traganttikumissa; 5 pastillit, jotka sisältävät aktiivista aineosaa inertissä pohjassa, kuten gelatiinissa ja glyseriinissä tai sakkaroosissa ja arabikumissa, ja suuvedet, jotka sisältävät aktiivista aineosaa soveltuvassa nestekantajassa.

Rektaaliseen antotapaan tarkoitetut valmisteet voi-10 vat olla peräpuikkoina yhdessä soveltuvan, esimerkiksi kaakaovoita tai salisylaattia sisältävän, perusaineen kanssa.

Emättimeen annettaviksi soveltuvat valmisteet voivat olla pessareina, tamponeina, voiteina, hyytelöinä, 15 tahnoina, vaahtoina tai suihkevalmisteina, jotka sisältävät aktiivisen aineosan lisäksi alalla soveltuviksi tunnettuja kantoaineita.

Parenteraaliseen antotapaan soveltuvia valmisteita ovat vesipohjaiset ja vedettömät, isotoniset, steriilit 20 ruiskeliuokset, jotka voivat sisältää hapettumisenestoai- neita, puskureita, bakteriostaatteja ja liuenneita aineosia, jotka tekevät valmisteesta isotonisen vastaanottajan veren kanssa, ja vesipohjaiset ja vedettömät suspensiot, jotka voivat sisältää suspendointi- ja sakeutusaineita. 25 Nämä valmisteet voivat olla pakattuina suljettuihin yksik-köannos- tai moniannossäiliöihin, esimerkiksi ampulleihin ja pulloihin, ja ne voidaan säilyttää kylmäkuivatussa muodossa, johon tarvitsee lisätä vain steriili nestemäinen kantoaine, esimerkiksi injektioihin soveltuva vesi, juuri 30 ennen käyttöä. Ruiskeliuoksia ja -suspensioita voidaan valmistaa tarpeen vaatiessa edellä kuvatun kaltaisista steriileistä jauheista, rakeista ja tableteista.

Edullisia yksikköannosvalmisteita ovat sellaiset, jotka sisältävät edellä määritellyn päivittäisannoksen tai 35 yksikköannososan päivittäisannoksesta tai sopivan osan niistä aktiivista aineosaa.

il 85978

Annettavia aineosia voidaan käyttää hoitoon myös yhdessä muiden lääkkeiden, kuten 9-[[2-hydroksi-l-(hydr-oksimetyyli)etoksi]metyyli]guaniinin, 9-(2-hydroksietok-simetyyli )guaniinin (asykloviirin), 2-amino-9-( 2-hydroksi-5 etoksimetyyli)puriinin, interferonin, esimerkiksi a-in-terferonin, interleukiini II:n ja fosfonoformaatin (Foscarnet) kanssa, tai yhdessä muun immuniteettia parantavan hoidon, luuydin- tai lymfosyyttisiirrot tai esimerkiksi levamisoli- tai tymosiinilääkitys, joka lisää lymfo-10 syyttien määrää ja/tai toimintaa, mukaan luettuina, kanssa kun se on tarpeellista.

On selvää, että edellä erityisesti mainittujen aineosien lisäksi valmisteet voivat sisältää formulointi-alalla tavanomaisia muita aineita.

15 Kaavan I mukainen yhdiste ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävät johdokset voidaan valmistaa tavanomaisella tavalla, esimerkiksi seuraavissa viitteissä kuvatuilla tai niiden kanssa analogisilla menetelmillä: J.R. Horwitz et ai., J. Org. Chem. 29 (1964) 2076-78; M. Imazawa et ai., 20 J. Org. Chem. 43 (15) (1978) 3044-3048; K.A. Watanabe et ai., J. Org. Chem. 45 (1980) 3274; ja R.P. Glinski et ai., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 915 (1970), samoin kuin esimerkeissä kuvatuin menetelmin.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle 3'-atsido-3'-25 deoksitymidiinin terapeuttisesti käyttökelpoisen suolan tai esterin valmistamiseksi on tunnusomaista, että (A) annetaan yhdisteen, jolla on kaava (II), 0

II

/ CH_ 30 hn 3 -'···’; 35 H0 v° J 00

M

i2 8 5 978 jossa M on halogeeni, hydroksi tai organosulfonyyli-oksiradikaali, tai sen johdannaisen, kuten esterin tai suolan reagoida litium- tai natriumatsidin kanssa ryhmän muuttamiseksi halutuksi atsidoryhmäksi, tai (B) hydroly-5 soidaan yhdiste, jolla kaava (III), o

hn y J

10 "L—°—— (III) jossa R on esteri-, eetteri- tai aralkoksiryhmä, mainitun ryhmän muuttamiseksi halutuksi hydroksiryhmäksi; ja kun 3'-atsido-3'-deoksitymidiini on saatu, muutetaan se 20 farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi tai esteriksi.

Edellä kuvatun keksinnön mukaisen menetelmän yhteydessä on huomattava, että kaavojen (II) ja (III) mukaiset esiasteyhdisteet samoin kuin aineet ja olosuhteet ovat synteettisen nukleosidikemian alalla tunnettuja. Esimerk-25 kejä tällaisista muuttamismenettelyistä kuvataan jäljempänä ohjeellisesti, ja on ymmärrettävä, että niitä voidaan muuntaa tavanomaisesti halutusta lopputuotteesta riippuen. Erityisesti silloin, kun kuvataan konversiota, joka muutoin voisi johtaa epätoivottavaan pysymättömien ryhmien 30 reagoimiseen, voidaan tällaiset ryhmät suojata tavanomaisesti, jolloin suojausryhmät poistetaan myöhemmin muutta-misreaktion mentyä loppuun. Siten menetelmässä (A) ryhmä M voi kaavan (II) mukaisessa yhdisteessä olla esimerkiksi halogeeni (esimerkiksi kloori), hydroksyyli tai organosul-35 fonyloksiryhmä, esimerkiksi trifluorimetyylisulfonylok- si-, metaanisulfonyloksi- tai p-tolueenisulfonyoksiryhmä.

i3 85978

Kaavan (I) mukaisen yhdisteen valmistamiseksi voidaan kaavan (II) mukaisen yhdisteen, jossa M on treokonfi-guraatiossa oleva halogeeni (esimerkiksi kloori) (jolloin 5'-hydroksyyliryhmä on edullisesti suojattuna esimerkiksi 5 trityyliryhmällä), käsitellä esimerkiksi litium- tai nat-riumatsidilla. 3'-treohalogeenin (esimerkiksi kloorin) sisältävä lähtöaine voidaan valmistaa esimerkiksi antamalla vastaavan 3'-erytro-hydroksyyliyhdisteen reagoida esimerkiksi trifenyylifosfiinin ja hiilitetrakloridin kanssa 10 tai vaihtoehtoisesti käsittelemällä organosulfonyylihalo-genidilla (esimerkiksi trifluorimetaanisulfonyylikloridil-la), jolloin muodostuu vastaava 3'-erytro-organosulfonyy-lioksiyhdiste, joka halogenoidaan sitten. Vaihtoehtoisesti voidaan kaavan (II) mukainen 3'-treo-hydroksyyliyhdiste 15 käsitellä esimerkiksi trifenyylifosfiinilla, hiilitetra- bromidilla ja litiumatsidilla, jolloin muodostuu vastaava 3'-erytro-atsidoyhdiste. Sen jälkeen voidaan tehdä mahdollisen suojausryhmän poisto, esimerkiksi edellä kuvatulla tavalla.

20 Mitä menetelmään (B) tulee, R voi olla suojattu hydroksyyliryhmä, esimerkiksi esteriryhmä, joka on edellä kaavan (I) yhteydessä kuvattua tyyppiä, erityisesti aset-oksiryhmä, tai eetteriryhmä, kuten trialkyylisilyylioksi-ryhmä, esimerkiksi t-butyylidimetyylisilyylioksiryhmä, tai 25 aralkoksyyliryhmä, esimerkiksi trifenyylimetoksiryhmä.

Tällaiset ryhmät voidaan muuttaa esimerkiksi hydrolysoimalla halutuksi hydroksyyliryhmäksi tai vaihtoesteröin-nillä 3'-atsido-3'-deoksitymidiinin vaihtoehtoiseksi ester iryhmäksi.

30 3'-atsido-3'-deoksitymidiini voidaan muuttaa farma seuttisesti hyväksyttäväksi fosfaatti- tai muuksi esteriksi antamalla sen reagoida fosforylointiaineen, esimerkiksi P0Cl3:n, tai vastaavasti esteröintiaineen, esimerkiksi happohalogenidin tai -anhydridin kanssa. Kaavan (I) 35 mukainen yhdiste sen esterit mukaan luettuina voidaan 14 85978 muuttaa farmaseuttisesti hyväksyttäviksi suoloikseen tavanomaisesti, esimerkiksi käsittelemällä sopivalla emäksellä.

Virusten vastainen vaikutus 5 a) (i) Retroviruksen indusoima pahanlaatuinen sairaus 3’-atsido-3’-deoksitymidiiniä annettiin BALB/c-naarashiirille, jotka oli infektoitu Rauscher Murine Leukaemia Virus-kannalla RVB3 (1,5 x 104 pesäkettä muodostavaa 10 yksikköä). Hoito aloitettiin 4 tunnin kuluttua infektoin-nista annoksilla 80 mg/kg vatsakalvonsisäisesti 8 tunnin välein tai 1,0 g/ml suun kautta juomavedessä. Tämän hoidon havaittiin estävän pernasolujen injektoituminen ja sitä seuraava pernan suurentuminen ja myös vähentävän virusve-15 risyyttä.

(ii) HTLV-I

TM-ll-soluja (HTLV-I-infektiolle herkkä T-solukloo-ni) viljeltiin yhdessä säteilytettyjen HTLV-I:tä tuottavien MJ-kasvainsolujen kanssa seuraavasti: 20 a) Pelkkiä TM-ll-soluja b) TM-ll-soluja ja MJ-kasvainsoluja c) TM-ll-soluja, MJ-kasvainsoluja ja 3'-atsido-3'-deoksitymidiiniä (3 pmol/l) d) TM-ll-soluja, MJ-kasvainsoluja ja 3'-atsido-3'-deoksi- 25 tymidiiniä (9 pmol/l) e) TM-ll-soluja, MJ-kasvainsoluja ja 3'-atsido-3'-deoksitymidiiniä (27 pmol/l).

18. päivänä uutettiin kustakin viljelmästä koko-nais-DNA ja pilkottiin se BamHI:llä, jolloin saatiin HTLV-30 I-genomifragmentti, joka oli vapaa mahdollisista isännästä peräisin olevista reunajaksoista ja jolla oli vakiomole-kyylipaino 3,3 kD. Pilkottu tuote tutkittiin sitten radio-nuklidileimatulla lambda-MT-2:11a, joka on HTLV-I:n BamHI-fragmentin tunnistava standardikoetin.

35 Kohdan a) näytteessä ei havaittu hybridisoitumista, mikä osoittaa, ettei infektoimaton vertailunäyte sisällä is 85378 virusta. Kohdan b) näyte, käsittelemätön, infektoitu ver-tailunäyte antoi voimakkaan signaalin. Kohdan c) näytteellä havaittiin heikko signaali, mikä osoittaa viruksen epätäydellisen häviämisen, ja kohtien d) ja e) mukaisissa 5 näytteissä ei tapahtunut ollenkaan hybridisoitumista, mikä osoittaa viruksen täydellisen poissaolon.

Kukin viljelmä tutkittiin myös T-solujen reseptorin β-ketjun tunnistavalla koettimella, jolloin kaikissa viljelmissä muodostui voimakas signaali, mikä osoittaa sen, 10 että TM-ll:ä oli läsnä kokeen kuluessa koko ajan.

b) AIDV

(i) Käänteiskopiointiaktiivisuus 3'-atsido-5'-trifosfaatti-3'-deoksitymidiini tutkittiin in vitro AIDV-transkriptaasia (AIDV RT) vastaan. 15 AIDV R puhdistettiin pelletoidusta ja uutetusta AIDV:sta eluoimalla DEAE- ja fosfoselluloosapylväiden läpi. Entsyymiaktiivisuus oli lineaarinen 60 min:n ajan ja stabiili vähintään 2 kk säilytettäessä 60 %:isessa glyserolissa, joka sisälsi 1 mg naudan seerumialbuminia/ml. Käytettäessä 20 rA-odT(12.18):a templaattialukkeena AIDV RT:n pH-optimi oli 7,0-7,3, MnCl2-optimi 0,3 mmol/1 ja MgCl2-optimi 5 mmol/1. Aktiivisuus MgCl2:n ollessa läsnä pitoisuutena 5 mmol/1 oli 10 kertaa suurempi kuin aktiivisuus MnCl2:n ollessa läsnä pitoisuutena 0,3 mmol/1. Suurin entsyymiaktiivisuus 25 havaittiin myös 80-140 mM KCl-liuoksessa ja 60-100 mM NaCl-liuoksessa. [3H]dTTP:n liittyminen oli lineaarisesti riippuvainen entsyymipitoisuudesta. Testien mukaan 3'atsi-do-5'-trifosfaatti-3'-deoksitymidiinin havaittiin olevan AIDV R:n kompetitiivinen inhibiittori; Ki oli 0,04 pmol/l 30 käytettäessä rA-odT(12.1B):a templaattialukkeena. Entsyymin Km dTTP:n suhteen oli 1,7-2,6 pmol/l mikä viittaa siihen, että 3'-atsido-5'-trifosfaatti-3-deoksitymidiini sitoutuu entsyymiin tiukemmin kuin dTTP. Kokeet, jotka tehtiin linnun myeloblastoosiviruksella Moloney-hiiren leukemiavi-35 ruksella, osoittivat, että 3'-atsido-5'-trifosfaatti-3'-deoksitymidiini on DNA-ketjun pidentymisen pysäyttäjä.

ie 85978 (ii) AIDV:n vastainen vaikutus in vitro 3'-atsido-3'-deoksitymidiiniä testattiin, ja sen todettiin olevan aktiivinen joukossa in vitro-koejärjes-telyjä. Lääkkeen vaikutukset mitattiin tutkimalla kään-5 teistranskriptaasiaktiivisuus (RT-aktiivisuus) injektoi tujen, infektoimattomien ja lääkkeellä käsiteltyjen solujen supernatanteista. 3'-atsido-3'-deoksitymidiini esti tehokkaasti ihmisen lymfoblastoidisolulinjojen H9 ja U937 AIDV-infektoinnin pitoisuuksina 2,7-0,0013 pg/ml. Samoin 10 normaalien PHA-stimuloitujen valkosolujen ja viljeltyjen ääreisveren lymfosyyttien infektoituminen estyi niin pienillä pitoisuuksilla kuin 0,013 pg/ml. H9-soluilla tehdyt lääkkeen lisäys- ja poisjättökokeet osoittivat, että 3'-atsido-3'-deoksitymidiini oli tehokkaimmillaan ollessaan 15 läsnä herkkien solujen virusinfektoinnin tapahtumahet kellä, mutta suurin osa sen virusten vastaisesta aktiivisuudesta havaittiin lisättäessä se niin myöhään kuin 20 tunnin kuluttua infektoinnista. Virusten replikoitumisen estyminen oli havaittavissa myös silloin kun lääkettä oli 20 alustassa vain viruksen absorboitumisajan, 20 tuntia. Vaikutukset havaittiin pitoisuuksilla 0,13 ja 0,013 pg/ml. 3'-atsido-3'-deoksitymidiinillä ei ollut suoraa anti-RT-vaikutusta puhdistettuja AIDV-virioneja vastaan. Lääkkeen vaikutus oli samoin mitätön tai pieni virionien tuotantoon 25 ja vapautumiseen kroonisesti infektoituneesta H9 AIDV-so-lulinjasta.

(iii) AIDV-infektion esto 3'-atsido-3'-deoksitymidiinin kyky estää solujen infektoituminen AIDVrlla määritettiin seuraavasti.

30 Kloonatut T4-positiiviset tetanusspesifiset T-aut- tajalymfosyytit infektoitiin eristetyllä AIDVrlla (annokset jopa 5000 virionia/solu), ja seurattiin solujen hengissä säilymistä infektoinnin jälkeen. 10 vrk viljelyn jälkeen ei havaittu minkäänlaisia viruksen aiheuttamia 35 sytopaattisia vaikutuksia infektoiduissa T-soluissa, jotka i7 8 5 978 oli käsitelty 3'-atsido-3'-deoksitymidiinipitoisuuksilla 8,8 ja 1,3 pg/ml, kun taas käsittelemättömien infektoi-tujen solujen määrä oli pudonnut viidesosaan. Solujen hengissä pysyminen tutkittiin myös edellä kuvatuista soluista 5 saadusta HTLV-I:llä transformoidusta, AIDV:lla superinfek-toidusta solulinjasta. 3'-atsido-3'-deoksitymidiini esti pitoisuuksina 2,7, 0,27 ja 0,13 pg/ml täydellisesti syto-paattiset vaikutukset 7 vrk:n ajan. Entsyymin km d 11 P:lle oli 2,81 μΜ, joka tuo mieleen sen että 3'-atsido-10 5'-trifosfaatti-3'-deoksitymidiini sitoo entsyymin tiukem min kuin d 11 P. Avian myeloblastosis viruksen, Moloney murine leukemia viruksen ja AIDV:n RTrllä tehdyt lisäkokeet osoittivat, että 3'-atsido-5'-trifosfaatti-3T-deoksitymidiini on DNA-ketjun pidennyksessä terminaattori.

15 Myrkyllisyystutkimus 3’-atsido-3'-deoksitymidiiniä annettiin sekä hiirille että rotille. LD50-arvo oli yli 750 mg/kg kummallakin lajilla.

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu vain keksintöä 20 valaiseviksi, eikä niiden tarkoituksena ole rajoittaa sen piiriä millään tavalla. Termillä "aktiivinen aineosa" tarkoitetaan esimerkeissä käytettynä kaavan (I) mukaista yhdistettä tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää johdosta.

Esimerkki 1 25 Tablettivalmisteet

Seuraavat valmisteet A ja B valmistettiin märkära-keistamalla aineosat povidoniliuoksen läsnä ollessa, mitä seurasi magnesiumstearaatin lisääminen ja puristus.

Valmiste A_mg/tabletti mg/tabletti 30 (a) Aktiivista aineosaa 250 250 (b) Laktoosia (B.P.) 210 26 (c) Povidone PVP:tä 15 9 (d) Natriumtärkkelysglykollaattia 20 12 (e) Magnesiumstearaattia 5_3 .1--. 35 500 300

: I

i w 85978

Valmiste B_mg/tabletti_mg/tabletti (a) Aktiivista aineosaa 250 250 (b) Laktoosia 150 (c) Avicel PH 101 :ä 60 26 5 (d) Povidone BPC:tä 15 9 (e) Natriumtärkkelysglykollaattia 20 12 (f) Magnesiumstearaattia 5_3 500 300

Valmiste C_mg/tabletti 10 Aktiivista aineosaa 100

Laktoosia 200 Tärkkelystä 50

Polyvinyylipyrrolidonia 5

Magnesiumstearaattia 4 15 359

Seuraavat valmisteet D ja F tehtiin puristamalla sekoitetut aineosat suoraan toisiinsa. Valmisteessa E käytetty laktoosi oli suoraan puristettavissa olevaa tyyppiä (Dairy Crest - "Zeparox") 20 Valmiste D_mg/tabletti

Aktiivista ainesosaa 250

Esigelatoitua tärkkelystä NF15 _150_ 400

Valmiste F_mg/tabletti 25 Aktiivista ainesosaa 250

Laktoosi 150

Avicel 100 500

Valmiste F tehtiin märkäpuristamalla (alla olevat) 30 ainekset poridoniliuoksen kanssa, minkä jälkeen lisättiin magnesiumstearaattia ja tuote puristettiin.

Valmiste F (säädetysti vapauttava formula) mg/tabl.

(a) Aktiivista ainesosaa 500 (b) Hydroksipropyylimetyyliselluloosaa 35 (Methocel K4M Premium) 112 ie 85978 (c) Laktoosia (B.P.) 53 (d) Povidone (PC]:tä 28 (e) Magnesiumstearaattia 7 700 5 Lääkettä vapautui noin 6-8 tunnin aikana ja lääkkeen va-vapautuminen oli tapahtunut täydellisesti 12 tunnin jälkeen.

Esimerkki 2 Kapselivalmisteet 10 Valmiste A

Kapselivalmiste valmistettiin sekoittamalla esimerkin 1 valmisteen (D) mukaiset aineosat keskenään ja pakkaamalla seos kaksiosaisiin kovagelatiinikapseleihin. Valmiste B (intra) tehtiin samalla tavalla.

15 Valmiste B_mg/kapseli (a) Aktiivista aineosaa 250 (b) Laktoosia (BP) 143 (c) Natriumtärkkelysglykolaattia 25 (d) Magnesiumstearaattia 2 20 420

Valmiste C_mg/kapseli (a) Aktiivista aineosaa 250 (b) Macrogol 4000 BP 350 600 25 Kapselit valmistettiin sulattamalla Macrogol 4000 BP:tä, dispergoimalla aktiivinen ainesosa sulatteeseen ja täyttämällä kaksiosainen kovagelatiinikapseli sulatteella.

Valmiste D_mg/kapseli

Aktiivista ainesosaa 250 30 Lesitiiniä 100

Maapähkinäöljyä 100 450

Kapselit valmistettiin dispergoimalla aktiivinen ainesosa lesitiiniin ja maapähkinäöljyyn ja täyttämällä pehmeä, ' . 35 elastinen gelatiinikapseli dispersiolla.

20 8 5 978

Valmiste E (säädellysti vapauttava kapseli)

Seuraava säädellystä vapauttava kapselivalmiste tehtiin pursottamalla ainekset a, b ja c suulakepuristimen avulla, rakeistamalla puriste ja kuivaamalla tuote. Kuivatut pel-5 letit päällystettiin vapautumista säätelevällä membraanil-la (d) ja niillä täytettiin kaksiosainen kovagelatiinikap-seli.

mg/kapsell (a) Aktiivista aineosaa 250 10 (b) Mikrokiteinen selluloosa 125 (c) Laktoosi BP 125 (d) Etyyliselluloosa _13 513

Esimerkki 3 15 Ruiskuvalmisteet

Valmiste A

Aktiivista aineosaa 0,200 g

Suolahappoliuosta (0,1M) tarpeen mukaan pH:n säätämiseksi alueelle 4,0-7,0 20 Natriumhydroksidiliuosta (0,1M) tarpeen mukaan pH:n säätämiseksi alueelle 4,0-7,0

Steriiliä vettä täytetään 10 ml:ksi

Aktiivinen aineosa liuotettiin käyttäen suurin osa vedestä (35-40 °C) ja pH säädettiin arvoon 4,0-7,0 suolahapon ja 25 natriumhydroksidin avulla. Panos täydennettiin vedellä ja suodatettiin steriilin mikrohuokossuotimen läpi 10 ml keltaisesta lasista (amberglass) valmistettuun ampulliin (tyyppi 1) ja suljettiin steriilillä sulkimella ja sinetöitiin.

30 Valmiste B

Aktiivista aineosaa 0,125 g

Steriiliä, pyrogeeni-vapaata pH 7 fosfaatti-puskuria tarpeen mukaan 25 ml:ksi : 35 21 85978

Esimerkki 4

Lihaksensisäiset ruiskeet

Aktiivista aineosaa 0,20 g

Bentsyylialkoholia 0,10 g 5 Glykofurolia 75 1,45 g

Vettä, ruisketta varten täytetään 3,00 ml:ksi

Aktiivinen aineosa liuotettiin glykofuroliin. Bentsyyli-alkoholi lisättiin ja liuotettiin ja vettä lisättiin 3 mlrksi. Senjälkeen seos suodatettiin läpi steriilin mikro-10 huokossuotimen ja suljettiin 3 ml:n keltalasiampulliin (tyyppi 1).

Esimerkki 5

Aineosat

Aktiivista aineosaa 0,2500 g 15 Sorbitoliliuosta 1,5000 g

Glyserolia 2,000 g

Natriumbentsoaattia 0,0050 g

Hajustetta, persikka 17.42.3169 0,0125 ml

Puhdistettua vettä täytetään 5,000 ml:ksi 20 Aktiivinen aineosa liuotettiin seokseen, jossa oli glyserolia ja suurin osa puhdistetusta vedestä. Sitten liuokseen lisättiin natriumbentsoaatin vesiliuos, sen jälkeen sorbitoliliuos ja lopuksi hajuste. Lopputilavuus täytettiin puhdistetulla vedellä ja seosta sekoitettiin hyvin. 25 Esimerkki 6

Peräpuikot mg/peräpuikko

Aktiivista aineosaa (63 pm)* 250

Kova rasva, BP (Witepsol H15-Dynamit NoBel) 1770 30 2020 * Aktiivinen aine käytettiin jauheena, jolloin osasten läpimitta oli ainakin 90-prosenttisesti 63 pm tai vähemmän.

Viidesosa Witepsoli H15:ta sulatettiin höyryvaippa-. 35 astiassa, korkeintaan 45 °C:n lämpötilassa. Aktiivinen ai- 22 8 5 3 7 8 neosa seulottiin läpi 200 pm:n seulan ja se lisättiin sulaneeseen seokseen ja sekoitettiin käyttäen lovitetulla päällä varustettua silversonia, sekoitusta jatkettiin kunnes saatiin pehmeä dispersio. Seosta pidettiin 45 °C:n läm-5 pötilassa ja loppuosa Witepsor H15:sta lisättiin suspensioon ja sitä sekoitettiin homogeenisen seoksen saamiseksi. Koko suspensio vietiin ruostumattomasta teräksestä valmistetun 250 pm:n seulan läpi ja seoksen annettiin jäähtyä 40 °C:een samalla sekoittaen. Sopivat muovimuotit 10 täytettiin 2,02 g:11a seosta 38 °C-40 °C:en lämpötilassa. Peräpuikkojen annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan.

Esimerkki 7

Pessaarit mg/pessaari

Aktiivista ainesosaa 63 pm 250 15 Dekstroosianhydraatti 380

Perunatärkkelys 363

Magnesiumstearaatti 7 1000

Yllä mainitut aktiiviset aineosat sekoitettiin suoraan ja 20 pessaarit valmistettiin puristamalla suoraan saatua seosta.

Esimerkki 8 3'-atsido-3'-deoksi-5'-O-oktanoyylitymidiini

Liuokseen, joka sisälsi 3'-atsido-3'-deoksitymi-25 diiniä pyridiinissä (0 °C), lisättiin oktanoyylikloridia (1,2 ekvivalenttia). Reaktioseoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan. Kun TLC (CHCl3:MeOH, 20:1, silikageeli) osoitti reaktion menneen loppuun, liuos kaadettiin jääve-teen. Vesifaasi kaadettiin pois. Saatu öljy puhdistettiin 30 kromatografisesti silikageelillä käyttäen eluenttina CHCl3:n ja MeOH:n seosta. Otsikon mukainen yhdiste saatiin öljymäisenä tuotteena haihduttamalla liuotin asianmukaisista fraktioista.

Alkuaineanalyysi: 35 Laskettu: C 54,95, H 6,92, N 17,80 Mitattu: C 54,82, H 6,96, N 17,66 23 85978 NMR: £ 7,46(d, 1H, J5 6 = 1 Hz, 6H), <b 6,13( t, 1H, 1Ή), i 4,5-4,2 (m, 3H, 3Ή ja 5'CH2), ζ 4,0-3,8(m, 1H, 4Ή), 6 2,3-2,1 (m, 4H, 2Ή ja oktanoyylin (CH2)1), 1,81 (d, 3H, J5 6 = 1,0 Hz, 5CH3), $ 1,5-0,6(m, 13H, 5’ okta- 5 noyyli (CH2) 5CH3).

Esimerkki 9 (viite-esimerkki) 5'-asetyyli-3'-atsido-3'-deoksitymidiini Liuokseen, joka sisälsi 20 g 3’-atsido-3’-deoksi-tymidiiniä pyridiinissä (50 ml) huoneen lämpötilassa, li-10 sättiin 2,1 ekvivalenttia asetyylikloridia. Reaktioseosta sekoitettiin 2 tuntia ja pidettiin 0-5°C:ssa 20 tuntia. Seos kaadettiin jääveteen sekoittaen. Vesikerros dekan-toitiin pois. öljymäinen tuote liuotettiin veteen ja uutettiin vedellä (5 kertaa), 0,5N suolahapolla, vedellä 15 (2 kertaa) ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla. Liuos suo datettiin ja haihdutettiin alipaineessa. Öljymäinen jäännös liuotettiin kloroformiin, laitettiin silikageelipyl-vääseen ja puhdistettiin nopeasti kromatografisesti käyttäen eluenttina kloroformia, joka sisälsi 2 % metanolia. 20 Tuotetta sisältävät fraktiot haihdutettiin, ja öljy käsiteltiin uudelleen kromatografisesti eluenttina etyyliasetaatin ja heksaanin seos (tilavuussuhde 6:4). Tuotetta sisältävät fraktiot haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin valkea kiinteä aine. Sp. 96-98 °C.

25 Alkuaineanalyysi:

Laskettu: C 46,60, H 4,89, N 22,65 Mitattu: C 46,67, H 4,94, N 22,59 Esimerkki 10

Seuraavat yhdisteet valmistettiin esimerkin 8 tai 30 9 mukaisella menetelmällä asianmukaisesta happohalogeni- dista tai -anhydridistä.

3'-atsido-5'-O-bentsoyyli-3'-deoksitymidiini Laskettu: C 53,68, H 4,77, N 18,41 Mitattu: C53,81, H 4,72, N 18,46 35 Sp. 54-59 °C.

24 8 5 978 3'-atsido-3'-deoksi-5'-O-pivaloyylitymidiini Laskettu: C 51,27, H 6,03, N 19,93

Mitattu: C 51,07, H 6,05, N 19,83

Sp. 99-100 °C

5 3 ' -atsido-3'-deoksi-5'-0-(3-metyylibutyryyli)tymidiini

Laskettu: C 50,24, H 6,13, N 19,53

Mitattu: C 50,27, H 6,11, N 19,49 NMR: i 7,46(d, 1H, J56 = 1,2 Hz, 6H), £ 6,13(t, 1H, l'H), 6 4,55-4,15(m, 3H, 3Ή ja 5’CH2), % 3,8-4,15(m, 1H, 4Ή), 10 6 2,4-1,78(m, 3H, 2Ή ja 5'-metiini), £ l,80(d, 3H, J5 6= 1,2 Hz, 5CH3), £ 0,9(d, 6H, J = 6,4 Hz, 5’-butyryylimetyy-lit) 3'-atsido-3'-deoksi-5'-O-palmitoyylitymidiini Laskettu: C 61,67, H 8,57, N 13,85 15 Mitattu: C 61,85, H 8,59, N 13,75 NMR: £ 7,45(d, 1H, J5 6 = 1,0 Hz, 6H), £ 6,12 (t, 1H, l'H), i 4,5-4,05( m, 3H, 3Ή ja 5'CH2), £ 4,0-3,8(m, 1H, 4Ή), % 2,35-2,ll(m, 4H, 2Ή ja palmitoyylin (CH2)1), b 1,8(d, 3H, J5 6 = 1,0 Hz, 5CH3, £ 1,35-0,6(m, 29H, 5’- 20 palmitoyyli-(CH2)13CH3).

3'-atsido-3'-deoksi-5'-O-tolyylitymidiini Laskettu: C 56,10, H 4,97, N 18,17

Mitattu: C 55,88, H 5,00, N 18,09

Sp. 73 °C

.·. 25 NMR (DMSO-d6): 8 7,95-7,29 (m, 5H, bH, cH, 6H), £ 6,16 (t, 1H, l’H), 4,6-4,4 (m, 3H, 3Ή, 5Ή), S 4,2-4,0 (m, 1H, 4'H), S 2,39 (s, 3H, dCH3), & 1,63 (s, 3H, 5CH3) 3'-atsido-3'-deoksitymidiini-5'-O-vetysukkinaatti Laskettu: C 44,98, H 4,83, N 17,96 30 Mitattu: C 44,90, H 4,77, N 17,85 NMR (DMS0-d6): 5 7 ’46 (s/ lH/ 6H), $ 6,13 (m, 1H, l'H), 8 4,48-4,40 (τη, 1H, 3Ή), 8 4,34-4,20 (m, 2H, 5Ή), .‘I ζ 3,99-3,94 (m, 1H, 4Ή), ζ 1,78 (s, 3H, 5CH3).

3'-atsido-3'-deoksi-5'-metyylitymidiini 35 Laskettu: C 38,25, H 4,37, N 20,28, S 9,28 Mitattu: C 38,15, H 4,38, N 20,19, S 9,30, sp. 253 °C(haj).

25 85 978 NMR (DMS0-d6): £ 7,49 (d, 1H, J65 = 1,0 Hz, 6H), δ 6,15 (t, 1H, Jj.,2· = 6,6 Hz, 1Ή), & 4,54-4,41 (m, 3H, 3' H, 5' H), δ 4,14-4,02 (m, 1H, 4Ή), £ 3,24 (s, 3H, 5'-mesyyli-CH3), £ 1,79 (d, 3H, J56 * 1,0 Hz, 5 5CH3).

3'-atsido-5'-0-(3-klooribentsoyyli)-3’-deoksitymidiini Laskettu: C 50,31, H 3,97, N 17,26, Cl 8,74 Mitattu: C 50,16, H 4,03, N 17,13, Cl 8,66 NMR (DMS0-d6): S 11,37 (S, 1H, 3-NH), δ 7,98-7,43 (m, 5H, 10 5' -fenyyli, 6H), δ 6,17 (dd, 1H, Jr 2a. = 6,1 Hz,

Jr 2b· = 7,2 Hz, l'H), S 4,68-4,48 (m, 3H, 3Ή, 5Ή), £ 4,14-4,11 (m, 1H, 4Ή), & 2,48-2,41 (m, 2H, 2Ή), S 1,64 (d, 3H, J5>6 = 1,2 Hz, 5CH3).

Esimerkki 11 (viite-esimerkki) 15 3'-atsido-3'-deoksitymidiini a) 2,3'-anhydrotymidiini

Tymidiini (85,4 g, 0,353 mol) liuotettiin 500 ml:aan kuivaa DMF:a, ja lisättiin seos N-(2-kloori-l,1,2-trifluorietyyli)dietyyliamiiniin (100,3 g, 0,529 mol) 20 (valmistettu D.E. Ayerin menetelmällä [J. Med. Chem. 6 (1963) 608]). Tätä liuosta pidettiin 70 °C:n lämpötilassa 30 min ja kaadettiin sitten 950 ml:aan etanolia voimakkaasti sekoittaen. Tuote saostui tästä liuoksesta, ja se erotettiin suodattamalla. Etanolisupernatantti jäähdytet-25 tiin ja suodatettiin, jolloin saatiin otsikon mukaista tuotetta. Sp. 228-230 °C.

b) 3'-atsido-3'-deoksitymidiini 2,3-anhydrotymidiini (25 g, 0,1115 mol) ja NaN3 (29 g, 0,446 mol) suspendoitiin DMF:n (250 ml) ja veden 30 (38 ml) seokseen. Reaktioseosta refluksoitiin 5 tuntia ja kaadettiin sitten 1 litraan vettä. Vesiliuos uutettiin EtOAc:lla (3 x 700 ml). EtOAc-uuteliuokset kuivattiin Na2S04:lla, suodatettiin, ja EtOAc poistettiin alipaineessa, jolloin saatiin jäykkäliikkeinen öljy. Tämä öljy se-...35 koitettiin 200 ml:aan vettä, jolloin saatiin kiinteä otsi- 26 85378 kori mukainen tuote, joka otettiin talteen suodattamalla. Sp. 116-118 °C.

Esimerkki 12 3'-atsido-3'-deoksitymidiinin mononatriumsuola 5 Noin 1 g 3'-atsido-3'-deoksitymidiiniä liuotet tiin 50 ml:aan tislattua vettä. pH säädettiin arvoon 12 1 N NaOHilla. Noin puolet liuoksesta kylmäkuivattiin. Otsikon mukainen yhdiste saatiin kylmäkuivattuna jauheena. Alkuaineanalyysi yhdisteelle C10H12N5NaO4 · 6/10 H20 10 Laskettu: C 40,03, H 4,43, N 23,34, Na 7,66 Mitattu: C 39,88, H 4,34, N 23,23, Na 7,90

Esimerkki 13 (viite-esimerkki) 3'-atsido-3'-deoksitymidiinin 5'-monofosfaatin valmistus 15 3'-atsido-3'-deoksitymidiini (0,5 g, 1,87 mmol) liuotettiin 5 ml:aan trietyylifosfaattia, ja seos jäähdytettiin -5 °C:seen. Lisättiin 0,685 ml (7 mmol) fosfori-oksikloridia yhtenä annoksena sekoittaen voimakkaasti liuosta, joka pidettiin sitten -10 °C:ssa 22 tuntia. Seok-20 sesta otettiin näyte ja se lisättiin väkevään ammonium-hydroksidiin. Tämän näytteen TLC-analyysi (selluloosa, n-Pr0H:H20, tilavuussuhde 7:3) osoitti, ettei lähtöainetta ollut jäljellä ja tuote muodosti yhden fluoresoivan täplän, joka liikkui hitaammin kuin nukleosidi. Reaktioseos 25 kaadettiin 20 ml:aan jäävettä. Tämä seos laitettiin jää-hauteeseen, ja liuoksen pH säädettiin arvoon 7,5 lisäämällä 2N Na0H:a. Emäksinen seos uutettiin kerran kloroformilla ja kerran eetterillä. Vesikerroksen pH säädettiin uudelleen arvoon 7,5, ja kerros väkevöitiin alipaineessa 30 jäljellä olevan orgaanisen liuottimen poistamiseksi. Tämä materiaali säilytettiin -10 °C:ssa puhdistukseen asti, joka tehtiin seuraavasti:

Valmistettiin deaktivoitua hiiltä pesemällä kookos-hiiltä (50-200 mesh, 100 g) 500 ml:11a IN HCl:a, 3 1:11a 35 vettä, 35 ml:11a seosta, joka sisälsi 3 % tolueenia 95 i 27 8 5 9 78 %:isessa etanolissa, 600 ml:lla 95 %:ista etanolia ja lopuksi perusteellisesti vedellä. Deaktivoitu hiili (12 ml laskeutunutta kosteaa hiiltä) lisättiin sekoittaen mono-fosfaattiliuokseen (0,72 g, 1,8 mmol, 30 ml). Supernatant-5 ti dekantoitiin, ja hiili pestiin 150 ml:11a vettä. Nukleotidi eluoitiin hiilestä pesemällä seos 120 ml:11a ammo-niumhydroksidin 1,5M liuosta 50 %:isessa etanolissa. Tämä liuos suodatettiin 0,22 pm:n suodattimena, väkevöitiin alipaineessa 10 ml:ksi, suodatettiin Amicon Centriflo CF-10 25-kalvon läpi ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin kiinteää diammonium-3'-atsido-3'-deoksitymidiini-5'-monofos-faattia. Tämä yhdiste karakterisoitiin nukleosidi-5'mono-fosfaatiksi sen perusteella, että 5'-nukleotidaasi pilkkoi sen nukleosidiksi.

15 Esimerkki 14 3'-atsido-5'-difosfaatti-3'-deoksitymidiini a) Bis(tri-n-butyyliammonium)pyrofosfaatti

Valmistettiin DOW 50-pyridiniumhartsipylväs ("Dowex"-ioninvaihtohartsi, DOW Chemical Laboratories) 20 kaatamalla 40 ml hartsia pylvääseen, jonka halkaisija oli 25 mm, ja huuhtomalla vedellä, kunnes eluentti oli väritöntä. Pyrofosfaattidekahydraatti (1,12 g, 2,51 mmol) liuotettiin 30 ml:aan vettä ja kaadettiin pylvääseen. Pylväs eluoitiin vedellä. 125 ml:n fraktio eluenttia, joka 25 sisälsi UV-säteilyä absorboivaa ainetta, otettiin talteen.

Tilavuus pienennettiin 10 ml:ksi alipaineessa, ja lisättiin 1,2 ml tri-n-butyyliamiinia. Tilavuutta pienennettiin alipaineessa, ja jäännös kuivattiin haihduttamalla seos pyridiinin kanssa neljästi. Tuote säilytettiin pakastimes-30 sa (-5 °C).

b) 3'-atsido-5'-monofosfaatti-3'-deoksitymidiinin . . vetymuoto

Monofosfaatin vetymuoto valmistettiin johtamalla esimerkissä 13 saatu ammoniumsuola (0,1 g, 0,283 mmol) 35 liuotettuna 6 ml:aan vettä 1,5 ml:n DOW 50 H*-pylvään (10 ekv.) läpi.

28 85 978 c) 3'-atsido-3'-deoksitymidiinin fosforomorfoli-daatti 0,283 mmol vaiheessa b) saatua monofosfaatin vety-muotoa liuotettiin 9 ml taan vettä. Lisättiin 99 μΐ (1,13 5 mmol, 4 ekv.) morfoliinia, ja liuos kuumennettiin kiehuvaksi. Lisättiin 0,234 g (1,13 mmol, 4 ekv.) disyklohek-syylikarbodi-imidiä t-butanoliin (5 ml) liuotettuna kolmen tunnin aikana. Reaktioseosta refluksoitiin yön yli. Seos jäähdytettiin huoneen lämpötilaan, suodatettiin, ja liuot-10 timet poistettiin alipaineessa. Lisättiin etanolia ja haihdutettiin alipaineessa neljä kertaa. Jäännös liuotettiin metanoliin, ja fosforomorfolidaatti seostettiin lisäämällä eetteriä. Sakka trituroitiin eetterin kanssa neljästi ja kuivattiin pyöröhaihduttimella. Saatiin otsikon 15 mukaista tuotetta.

d) 3'-atsido-3-deoksitymidiini-5'-trifosfaatti ja -difosfaatti

Vaiheessa c) saatu fosforomorfolidaattijohdos kuivattiin tekemällä neljästi pyrimidiiniseoksen haihdutus 20 alipaineessa. Vaiheessa a) saatu bis(n-Bu)3N-pyrofosfaatti kuivattiin myös tekemällä pyridiiniseoksen haihdutus alipaineessa. Fosforomorfolidaatti liuotettiin pyridiiniin (5 ml), ja liuos lisättiin pyrofosfaattireagenssia sisältävään astiaan. Reaktion annettiin edetä yön yli huoneen 25 lämpötilassa. Pyridiini poistettiin alipaineessa. Jäännök seen lisättiin vettä ja se poistettiin neljä kertaa. Jäännös pakastettiin.

Jäännös sulatettiin ja liuotettiin 50 ml:aan vettä. Liuos kaadettiin pylvääseen (1 x 10 cm), joka sisälsi 50 30 mM ammoniumbikarbonaattiliuoksella tasapainotettua DEAE

Sephadex A-25:ttä. Fosfaatit eluoitiin lineaarisella ammo- niumvetykarbonaattigradientilla 50-^ 800 mmol/1 (300 ml). Difosfaattinukleotidia sisältävät fraktiot yhdistettiin ja samoin trifosfaattinukleotidia sisältävät frak-35 tiot. Difosfaatti- ja trifosfaattiliuoksen kuivattiin i 29 8 5 9 78 erikseen alipaineessa, liuotettiin takaisin veteen, kuivattiin uudelleen, liuotettiin takaisin veteen ja kylmä-kuivattiin.

Claims (2)

30 8 5 978

1. Menetelmä 3'-atsido-3'-deoksitymidiinin terapeuttisesti käyttökelpoisen ja farmaseuttisesti hyväksyt-5 tävän suolan tai esterin valmistamiseksi, joka on muu kuin jokin seuraavista 5'-johdannaisista: monofosfaatti, dinatriummonofosfaatti, 2-syaanietyylimonofosfaatti, tri-fosfaatti, p-tolueenisulfonaatti, asetaatti tai metaani-sulfonaatti, tunnettu siitä, että (A) annetaan 10 yhdisteen, jolla on kaava (II), 0 11 HN “3 “ V- o J ® M jossa M on halogeeni, hydroksi tai organosulfonyyli-oksiradikaali, tai sen johdannaisen, kuten esterin tai suolan reagoida litium- tai natriumatsidin kanssa ryhmän 25 muuttamiseksi halutuksi atsidoryhmäksi, tai (B) hydrolysoidaan yhdiste, jolla kaava (III), o HN I

30 I ' R Ί o.—. (m)

35 V-7 N3 31 65 978 jossa R on esteri-, eetteri- tai aralkoksiryhmä, mainitun ryhmän muuttamiseksi halutuksi hydroksiryhmäksi; ja kun 3'-atsido-3'-deoksitymidiini on saatu, muutetaan se farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi tai esteriksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan 3'-atsido-3'-deoksitymidiinin 5'-difosfaatti-, 5'-(3-metyylibutyraat-ti)-, 5’-oktanoaatti-, 5'-palmitaatti-, 5'-(3-klooribent-soaatti)-, 5'-bentsoaatti-, 5'-vetysukkinaatti- tai 5'-10 pivalaattiesteri. 32 85978