RU2016572C1

RU2016572C1 - Композиция для лечения спида

Info

Publication number: RU2016572C1
Application number: SU884355439A
Authority: RU
Inventors: А.Картер Вилльям
Original assignee: Хем Рисерч, Инк.
Priority date: 1987-03-23
Filing date: 1988-03-22
Publication date: 1994-07-30
Also published as: IE63823B1; FI881305A; NZ223868A; PT87039A; FI881305A0; ES2066782T3; DK156688A; DE3876125D1; NO881246D0; DE3876125T2; DK156688D0; NO881246L; CA1316832C; AU1256288A; JPS6425A; EP0286224A2; HUT46542A; CN88101606A; PT87039B; KR880010777A

Abstract

Изобретение относится к области медицины, а именно к фармакологии. Цель изобретения - снижение токсичности. Сущность изобретения: композиция для лечения СПИДа содержит вирусный ингибитор, например азидотимидин или α-интерферон и двуниточную не полностью спаренную РНК. Положительный эффект: улучшение лечения вирусных инфекций, имеющих общий патогенез. 3 табл.

Description

Изобретение относится к области медицины, а именно к фармакологии.

Целью изобретения является снижение токсичности.

Изобретение включает использование синергетических сочетаний не полностью спаренной ds-PHK с другими агентами противовирусного действия, например с азидотимидином или α-интерфероном.

ds-PНК является неполностью спаренной, предпочтительно rIn˙ r/с_11-14, U/n или амплиген.

Азидотимидин первое лекарство, одобренное в США для лечения СПИДа, является крайне токсичным препаратом.

Результаты исследований показали, что лекарства, подобные азидотимидину, обладающие высокой токсичностью in vivo, могут употребляться в значительно более низкой дозе при сочетании с неполностью спаренной ds-PНК.

Под неполностью спаренной ds-PНК понимают те, у которых водородная связь прерывается в среднем не менее чем на одну пару оснований на каждые 20 последовательных остатков оснований.

Исследования восьми различных антивирусных лекарств, относящихся к пяти различным общим классам антивирусных агентов при сочетании с "не полностью спаренной" ds-PНК, как более детально определено ниже, показатели, что указанная ds-РНК обеспечивает синергетическое дополнение к антивирусной терапии в общем и особенно при лечении HIV инфекций, включая относящийся к СПИду комплекс и сам СПИД.

Для показа синергизма сочетаний сделаны анализы множественного лекарственного действия с "не полностью спаренной" двуниточной РНК (Амплиген) в качестве ядра лекарства для идентификации других агентов и механизмов, через которые "не полностью спаренная" РНК может оказывать эффективное терапевтическое воздействие на инфекцию вирусом человеческого иммунодефицита (HIV). Антивирусные активности были определены с помощью микротитрования инфекции с использованием МТ-2 клеток в качестве мишени и НТ V-III₂, продуцированным в Н9 клетках, в качестве источника вируса. Область испытанных агентов включает в качестве цитокина азидотимидин в качестве ингибитора обратной транскрипции. Отдельно каждое лекарство показывает зависимую от дозы анти HIV-активность и при использовании в сочетании с "не полностью спаренной" ds-РНК показывает синергизмы.

Плейотропическая активность ds-РНК отличается от таковой IFN и может обеспечить синергизм в сочетательной терапии с широким кругом антивирусных лекарств для лечения СПИДа.

ds-РНК может быть комплексом полиинозината и полицитидилата, содержащим пропорцию урациловых оснований или гуанидиновых оснований, например от 1 в 5 до 1 в 30 таких основаниях (поли I, поли (С_4-29 х V или G). ds-РНК могут быть поли I. поли C ˙ V, в которых соотношение С и V cоставляет примерно 12-14:1, предпочтительно 13:1, и коэффициенты седиментации поли I и поли С, V оба меньше 9 и внутри 2 единиц друг от друга, оба предпочтительно примерно 6,5 до 7,5.

"Не полностью спаренная" ds-РНК, предпочтительная для использования в изобретении, основана на сополинуклеотидах, выбранных из поли (С_n, С), у которых n является целым числом, имеющим значения от 4 до 29, и является "не полностью спаренными" аналогами комплексов полирибоизозиновой и полирибоцитидиловой кислот, образованных модификацией rIn rC_п для введения непарных оснований (урацил или гуанидин) вдоль полирибоцитидилатной (rC_n) цепи. Альтернативно, ds-РНК может происходит из поли I поли С ds-РНК за счет модификации рибозильной основы полирибоинозиновой кислоты (rI_п), например, путем включения 2' -0-метилрибозильных остатков.

Примеры "неполностью спаренной ds-РНК:
поли (I) . поли (С₄, V)
поли (I) . поли (С₇, V)
поли (I) . поли (С₁₃, V)
поли (I) . поли (С₂₂, V)
поли (I) . поли (С₂₀, G)
поли (I) . поли (С₂₉, G) и
поли (I) . поли (С_р) 23 G > р
Количество вводимой "не полностью спаренной" ds-РНК предпочтительно является достаточным для достижения пика концентрации в крови от 0,1 мкг/мл ds-РНК до 1000 мкг/мл в кровеносной системе сразу после дистального введения из точки инфузии. ds-РНК вводят парентерально (внутривенно, внутримышечно, подкожно), интраназально, ректально или орально при подходящей защите против нуклеаз желудочно-кишечного тракта.

При использовании в качестве лимфокина интерферона (альфа) количество предусматривается от 0,01 до 100 000 IRV на 1 мл жидкости тела пациента. При введении обоих агентов (ds-РНК и другого антивирусного соединения) они могут быть введены в виде смеси, введены раздельно, но одновременно, или последовательно. Дополнительный антивирусный агент, используемый с ds-РНК, вводят в количествах, совпадающих с меченым продуктом или другими направлениями для использования, часто значительно уменьшенных из-за конкурентного использования ds-РНК и синергетического результата сочетания.

Введение РНК и другого антивирусного агента (в сочетании) включает представления, в которых оба агента вводят вместе в виде терапевтической смеси, а также процедуры, в которых оба агента вводят раздельно, но одновременно, например, по отдельным внутривенным линиям одному и тому же индивидууму. Кроме того, введение в сочетании включает раздельное введение одного из лекарств, при котором одно лекарство вводится первым, а затем через короткий промежуток времени вводят второе.

Проведена группа исследований in vitro для оценки Амплигена, "не полностью спаренной" ds-PНК для сочетательной терапии при лечении вирусных заболеваний с использованием HIV в качестве прототипического хронического/подострого человеческого вирусного патогена. Используемые материалы и методы описаны ниже.

Клетки и Вирус - Клон линии МТ-2 Т-клеток, трансформированных НТL V-I, который показывает полный цитолиз при инфекции НIV, используют в качестве мишени для инфекции и анализе микротитрованием. Вирус готовят из жидкой культуры Н9/НТL V-III_в при низкой скорости центрифугирования и 0,45 мкМ фильтрации для удаления всех клеток. Титры вирусов были определены из величины до 50% дозы инфекции культуры ткани (ТСIД-50), полученной в конечной точке микротитрования МТ-2 клеток. Все культуры выращивают и сохраняют в РРМI-1640, содержащем 16% инактивированной нагреванием плодной сыворотки коровы и 50 мкг гентамицина (Сигма) мл..

Антивирусные агенты - Человеческий rIFN- αA (> 10⁸ Ме/мг) и азидотимидин получены от Гоффман-Ла-Рош. Человеческий rFN βSer 17(1,0 ˙10⁸ МЕ/мг) получен от Тритон Биссайеноиз. IFN были калиброваны в WISH клетках, зараженных вирусом везикулярного стоматита и проанализированы на цитопатический эффект "не полностью спаренная" ds-РНК (Амплиген) представлены в виде лиофилизированного порошка в солевом буфере НЕМ Рисерч.

Анализ микротитрования инфекции. Анти-HIV-активности измерены в анализе на микротитрование инфекции. Двукратные серийные разбавления каждого лекарства одного и в сочетании при фиксированном соотношении с "не полностью спаренной" ds-РНК анализируют в трехкратной повторности на микроплатах с 96 ячейками. Цитолиз измеряют с помощью жизнеспособного красителя (нейтральный красный), принимая полилизиновые приставшие клетки как конечную точку инфекции. Клетки инкубируют в присутствии разбавлений лекарства в течение 1 ч перед добавлением вируса. В случае атфотерицина В как вирус, так и клетки были предварительно инкубированы с лекарством перед заражением. Клетки инфицируют при множественности 0,1 таким образом, чтобы конечная точка цитолиза была бы преобладающей из-за потомства вирионов, синтезированных в присутствии лекарства. Процент защиты был вычислен из величины А₅₄₀ красителя на испытуемых стенках по отношению к разнице поглощения между клеточным контролем и вирусным контролем на стенках, используя формулу
% защиты =

Расчет синергизма - эффекты объединенного лекарства были вычислены с помощью метода множественного анализа лекарства Шу и Таллалай с использованием уравнения:
CI=

+

где Cl представляет собой индекс сочетания, (Дх)₁ является дозой одного лекарства I, требующейся для получения х% эффекта, и (Д)₁ является дозой лекарства 1, требующейся для получения тех же х % эффекта при сочетании с (Д)₂. Величины (Дх)₂ и (Д)₂ подобным образом относятся к лекарству 2. Величина определена из графика кривой эффекта дозы с использованием уравнения эффекта медианы
fa/fn = (Д) Д_m)^m где fa является фракцией, затронутой дозой Д, fn является незатронутой фракцией, Д_m является дозой, требующейся для 50% эффекта и m является наклоном кривой доза-эффект. Для взаимно исключающих лекарств (а именно, подобных по способу действия) оба лекарства в отдельности и их смесь дают параллельные линии на графике эффекта медианы.

Взаимно неисключающие лекарства (а именно, независимого способа действия) будут давать параллельные линии на графике эффекта медианы, но в смеси будут давать вогнутую вверх кривую. Если агенты являются взаимно исключающими, αравно 0, а если они являются взаимно неисключающими, αравно 1. Величины, полученные при допуске взаимной неисключительности, будут всегда несколько выше, чем для взаимно исключающих лекарств. Величины Сl < 1 указывают на синергизм, величины > 1 указывают на антагонизм, а величины, равные 1, указывают на дополнительные эффекты.

Анализ обратной транскритазы.

Определены активности обратной транскритазы в жидких культурах в полиэтиленгликолевых преципитатах, используя поли (А) . (dТ)₁₅ в качестве матрицы праймера и 25 мкКю (метил-3Н) dТТР (80,1 Кю/ммоль) на реакцию.

Антивирусная активность - способность каждого лекарства самого или в сочетании в "не полностью спаренной" ds-РНК защищать матричные клетки от HIV инфекции показаны в табл.1. Наблюдается полная защита при всех концентрациях каждого лекарства в начале периода инкубации сразу после цитолиза на стенках вирусного контроля. Индуцированный вирусом цитолиз при более низких дозах этого лекарства происходит на день позже и снова проводят анализ в это время таким образом, чтобы можно было получить зависящие от дозы соотношения. Все лекарства являются нетоксичными для МТ-2 клеток при концентрациях, используемых в этих исследованиях.

Множественные лекарственные эффекты - Величины Сl для "не полностью спаренной" ds-РНК в двойной сочетании с восемью другими анти-HIV лекарствами при величинах защиты 50% и 95% приведены в табл.2. Наблюдаются различные степени синергизма. Наибольшая степень синергизма наблюдается между "не полностью спаренной" ds-РНК и r IFN- α,когда СI величина будет самой маленькой (0,01 до < 0,01).

Сl величины были вычислены из данных табл.1. Величины > 1 указывают на антагонизм, < 1 указывают на синергизм, а равные 1 указывают на дополнительный эффект. Сl величины, вычисленные при допущении взаимной исключительности, даны вместе с величинами, полученными при допущении взаимной неисключительности в скобках.

Синтез вируса. Исследована продукция вируса в Н9/НТL-V-III_вкультурах в присутствии и в отсутствии IFN "не полностью спаренной" ds-РНК и при сочетании этих лекарств (табл. 3). Одна "не полностью спаренная" ds-РНК (50 мкг/мл) оказывает очень малое воздействие на продукцию вируса (6% уменьшения), тогда как rIFN αА ингибирует продукцию вируса на 53%. Наличие "не полностью спаренной" ds-PHК приводит в результате к среднему снижению при ингибировании продукции вируса, индуцированного INF, при этом ингибирование снижается от 53% до 47% для rNF- αА.

Синергизм, наблюдаемый в этих исследованиях между "не полностью спаренной" ds-РНК и пятью классами анти-HIV лекарств, подтверждает что "не полностью спаренная" ds-РНК может играть существенную и многостороннюю роль в качестве ядра лекарства в сочетательной терапии для ARC и СПИДа. Двуниточные РНК, включая "не полностью спаренные" ds-РНК активируют IFN-индуцируемые ферменты, включенные в основу противовирусного состояния, включая 2,5-олигоаденилат синтетазу и рибосом-ассоциированный белок киназу. 2,5-Олигоаденилаты ингибируют ретровирусные обратные транскриптазы, то есть активация 2,5-олигоаденилат синтетазы "не полностью спаренной" ds-РНК может иметь единый механизм для антивирусной активности против вирусов, которым требуется обратная транскритаза для репликации. Не все плейотропические активности против вирусов, которым требуется обратная транскритаза для репликации. Не все плейотропические активности IFN могут быть разделены с ds-РНК. Это подтверждается тем фактом, что гриппо-подобные побочные эффекты терапии интерфероном не встречаются во время терапии "не полностью спаренными" ds-РНК. Найдено, что "не полностью спаренные" ds-РНК никогда не ингибируют HIV продукцию, как IFN, не делают возможным проявление этой активности IFN (табл.3). Эти результаты находятся в противоречии с синергизмом, наблюдаемым между "не полностью спаренными" ds-РНК и IFN при оценке антивирусного состояния (см.табл.2), далее подтверждая, что эти лекарства имеют общие, а также отличные пути для антивирусной активности..

Азидотимидин, аналог тимидина, становится фосфорилированным внутриклеточно и включается в возникающую ДНК, где он вызывает преждевременный обрыв цепи. Фосфорилированный азидотимидин используется обратной транскриптовой в 100 раз более эффективно, чем клеточными ДНК полимеразами, что приводит, по-видимому, к широкому окну в селективности. Это лекарство показывает сильное селективное ингибирование HIV в опыте по микротитрованию инфекции. ds-РНК в общем и Амплиген в частности может значительно уменьшить, по крайней мере в 5 раз, концентрацию AZТ, требующуюся для заметной вирусстатической активности In vitro. Кроме того, при более высокой испытуемой концентрации AZТ имеется синергетическое соотношение между двумя соединениями. Следовательно, Амплиген позволит снизить эффективную терапевтическую дозу AZТ in vitro с сопутствующим снижением связанной с AZТ токсичности.

Использование амплигена в сочетании с AZТ может вызывать резко выраженные и длительные благоприятные эффекты во время HIV инфекции.

Использование изобретения позволит улучшить лечение вирусных инфекций, имеющих общий патогенез вирусной мультипликации.

Claims

КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СПИДА, содержащая вирусный ингибитор азидотимидин или α- -интерферон, отличающаяся тем, что, с целью снижения токсичности, дополнительно содержит α_s РНК при следующем количественном соотношении компонентов, г/кг массы:
Азидотимидин 0,35 - 17,5
или α- -интерферон (60,6 - 63,6)10⁹ МЕ
α_s-РНК 0,006 - 6,0