PT87039B

PT87039B - Processo para a preparacao de uma composicao farmaceutica para tratamento de infeccoes virais humanas

Info

Publication number: PT87039B
Application number: PT87039A
Authority: PT
Inventors: William A Carter
Original assignee: Hem Res Inc
Priority date: 1987-03-23
Filing date: 1988-03-22
Publication date: 1992-11-30
Also published as: FI881305A; PT87039A; EP0286224B1; ES2066782T3; AU1256288A; EP0286224A2; KR880010777A; KR960013435B1; NO881246D0; IE63823B1; DK156688D0; JP2656938B2; IE880839L; HUT46542A; EP0286224A3; JPS6425A; OA08724A; IL85646A0; CA1316832C; CN1049357C

Description

MEMÕRIA DESCRITIVA

DOMÍNIO DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito ao uso de ARNdc em combinação sinergística com outros produtos que inibem a actividade ou a expressão virais para o controle ou no tra tamento de doenças virais. As composições farmacêuticas úteis neste tratamento também são divulgadas.

Os ARNs de dupla cadeia (ARNdc's), tais como poli I.poli C, podem agir como modificadores de respois ta biológica desenvolvendo actividades antivirais, antineoplãsicas e imunomodulatõrias. Entre os efeitos pleiotrópicos responsa ' veis por estas respostas biológicas estão a indução de interfe• rão (IFN) e de outras citoquinas, bem como a activação de certas

enzimas de indução de IFN, incluindo a sintetase de 2,5-oligoadeJ nilato e uma guinase de proteína associada aos ribosomas. Estas * propriedades tornam os ARNdc’s em candidatos atraentes para o tratamento de infecções pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), o retrovírus responsável pela síndrome da imunodeficiênt cia adquirida (SIDA). De facto, o ARNdc desemparelhado da forma i (R) r(I)_n.r(C^2-14^,u^n ^{ou Am}Pli-9^ene ' (uma marca registada dos U.S.: da HEM Research, Inc., Rockville, Maryland USA) tem um perfil dej toxicidade baixo nos humanos, e activo contra a infecção de HIV j quer iⁿ vitro quer in vivo, e ê correntemente (usado) em ensaiosi clínicos controlados efectuados em larga escala do complexo rela cionado com SIDA (ARC).

A American Foundation for AIDS Rese arch (AmFAR) lista correntemente mais de 60 produtos que estão a ser testados para serem usados no tratamento de ARC e de SIDA. Este enorme potencial de terapia de agente simples ê ampliada pe lo possível sinergismo em terapia combinada.

Alternativamente, a terapia combina da tem o potencial para antagonismo como demonstrado in vitro com azitotimidina (AZT) e ribavirina. Por estas razões, decidi caracterizar o potencial global do ARNdc desemparelhado no trata mento de ARC e SIDA, sendo o HIV usado como um patogénio virai prototípico. Levei a cabo esta investigação realizando in vitro múltiplas análises de substâncias usando ARNdc desemparelhado co mo substância núcleo em combinação com outros agentes que em con junto compreendem pelo menos cinco modos diferentes de ataque a esse vírus. Estes agentes incluem rIFN-alfa A, rlFN-beta Ser 17 e rIFN-y como citoquinas; azidotomidina e fosfonoformiato (fosfo carnet) como inibidores de transcrição reversa; ribavarina como um inibidor putativo de direcção de mecanismos de cobertura de ARNm adequado; anfotericina B como uma molécula de ligação de lí‘ pido com actividade anti-HIV; e castanospermina como um inibidor de processamento de glicoproteínas (1). Uma das substâncias, azi dotimidina, actua sinergisticamente in vitro com ARNdc desempare lhado como se descreve com mais pormenor a seguir. Descobri que cada uma dessas substâncias ministradas separadamente tem activi dade anti-HIV dependente da dose que é sinergística com ARNdc de semparelhado nas doses mais efectivas.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito ao uso de combinações sinergísticas de ARNdc's, especialmente ARNdc's desemparelhados, juntos com um membro de uma larga gama de compostos antivirais no tratamento de doenças virais. A combinação ê administrada a um paciente numa quantidade suficiente para ini bir a actividade virai, inibir a expressão virai ou ambas. As composições farmacêuticas contendo um ARNdc e outro composto com actividade antiviral são descritas e os resultados desta combina ção demonstrando sinergismo estão registados a seguir.

Apresentam-se na presente memória dados que verificam o papel de ARNdc como um agente sinergístico com varias outras modalidades no controle da expressão virai em geral e de retroviroses em particular utilisando HIV (vírus da SIDA) como um vírus humano prototípico associado com doença huma na de debilidade crónica. A invenção inclui terapias para possíveis infecções virais para além de HIV que têm um mecanismo comum de multiplicação/patogénese virai, no todo ou em parte, e coerentemente são sensíveis à combinação particular empregue. 0 sinergismo na inibição actividade/expressão virai ê inesperadamente verificado com uma ampla gama de compostos díspares incluindo citoquinas, inibidores de transcriptase inversa, lisófilos e inibidores de processamento de glicoproteína, além de compostos antivirais semelhantes.

tratamento efectivo da SIDA tem-se tornado obviamente numa preocupação crescente entre os médicos de praticamente todos os países do mundo. A azidotimidina, o primeiro produto aprovado nos Estados Unidos para o tratamento de ARC e SIDA, ê extremamente tóxica. Esta toxicidade in vivo ê manifestada por 30% aproximadamente dos pacientes que receberam azitotimidina e necessitaram de transfusões de sangue. Os resultados das minhas experiências sugerem que as substâncias como a azidotimidina com toxicidade alta in vivo podem ser dadas em doses de toxicidade substancialmente mais baixa se combinadas com

ARNdc desemparelhado. A terapia de combinação pode não sõ reduzir a dose efectiva da substância necessária para a actividade antiviral, desse modo reduzindo a sua toxicidade, mas pode também melhorar o efeito antiviral absoluto como um resultado do ataque ao vírus através de múltiplos mecanismos. As actividades pleiotrõpicas do ARNdc junto com as sinergias referidas aqui sugerem que o ARNdc em geral e o ARNdc desemparelhado em particular, são uma substância núcleo efectiva para terapia de combinação produzindo os tratamentos mais efectivos e menos tóxicos pa-i ra ARC e SIDA. ;

Estudos com oito substâncias antivii rais diferentes, representando cinco classes gerais de antivirais diferentes, em combinação com ARNdc, especialmente com os ARNdc's desemparelhados como se define com maior pormenor a seguir, demonstraram que os ARNdc's, especialmente os ARNdc's desemparelhados, proporcionam um complemento sinerglstico ã terapia antiviral em geral, e no tratamento de infecções por HIV incluindo o complexo relacionado com SIDA (ARC) e a própria SIDA especificamente. Estes ARNdc's quando administrados com outras substâncias antivirais conhecidas por causarem toxicidade significativa quando administradas isoladamente e em quantidades efec tivas para remeter a condição virai, tem o benefício de permitir' ao clínico reduzir a quantidade do componente toxico da combina-j ção sem efeitos adversos nos resultados terapêuticos desejados do tratamento.

Para demonstrar o sinergismo das : combinações desta invenção realizaram-se múltiplas analises do j efeito de substâncias com ARN de cadeia dupla desemparelhado (Am pligen) como substância núcleo para identificar outros agentes e mecanismos através dos quais o ARNdc desemparelhado pode potenci ar uma intervenção terapêutica efectiva na infecção por vírus (HIV) na imunodeficiência humana.

Para demonstrar o sinergismo das combinações da presente invenção, levaram-se a cabo analises de efeito de produtos múltiplos com ARN de dupla cadeia desemparelhado (Ampligen) como substância núcleo, com o fim de identificar outros agentes e mecanismos através dos quais o ARNdc desem â

parelhado possa potenciar a intervenção terapêutica efectiva na infècção do vírus da imunodeficiência humana (HIV). As actividades antivirais foram definidas por uma microanâlise de infècção utilizando células MT-2 como células visadas e HTLV-III_B produzi do em células H9 como uma fonte de vírus. A gama dos agentes ensaiados incluiu o rIFN-alfa A, o rIFN-beta SER 17 e o rlFN-^ como citoquinas; azidotomidina e fosfonoformiato (fosfocarnet) como inibidores de transcrição reversa; ribavarina cotno um inibidor putativo de direcção de mecanismos de cobertura de ARNm adequado; anfotericina B como uma molécula lipofilica; e castanospermina como um inibidor de processamento de glicoproteínas (glu cosidase I). Separadamente, cada produto demonstrou uma activida de anti-HIV dependente da dose e, quando usadas em combinação com ARNdc desemparelhado, demonstrou sinergismo.

Se bem que o ARNdc desemparelhado seja sinergístico com todos os três IFNs para a actividade anti-HIV em microensaios de infècção, não potência a inibição induzi da por IFN da produção de vírus em culturas de células H9/HTLV-III„. Os resultados destes estudos sugerem que as actividades pleiotrõpicas dos ARNdc's diferem das dos IFN e podem proporcionar sinergia em terapia combinada com uma ampla gama de substâncias anti-virais para o tratamento da SIDA.

Os procedimentos e as composições terapêuticas da presente invenção incluem os agentes acima referidos como exemplos e para ilustração de várias classes menciona das. Vários outros agentes ainda para serem descobertos mas sinergísticos quando em combinação com ARNdc's estão também incluí dos no âmbito da presente invenção.

Por ARNdc desemparelhado entendem -se aqueles nos quais a formação de pontes de hidrogénio (empilhamento de bases) entre as cadeias complementares estâ relativa mente intacta, isto ê, ê interrompida em média menos de um par de bases em cada 29 resíduos de bases consecutivos. 0 termo ARNdc desemparelhado deve ser entendido em concordância.

ARNdc pode ser um complexo dum po liinosinato e dum policitidilato contendo uma proporção de bases de uracilo ou de bases de guanidina, por exemplo, de 1 em 5 até

semparelhado pode ser poli I . poli C,U no qual a proporção de C! para U ê de cerca de 12 a 14 para 1, de preferência de 13 para ! 1, e os coeficientes de sedimentação de poli I e de poli C,U são) ambos menores do que 9 e estão à distância de 2 unidades um do ί _a ! outro, sendo de preferência de cerca de 6,5 a 7,5. ;

Os ARNdc desemparelhados preferidos! para utilização na presente invenção são baseados em copolinu- i cleõtidos seleccionados de entre poli (C_n,G), nos quais n é um número inteiro com um valor entre 4 e 29 e são análogos desemparelhados de complexos dos ácidos poli-riboinosínico e poli-ribocitidílico formados por modificação de rI_n.rC_n para incorporação de bases desemparelhadas (uracilo ou guanidina) ao longo da cadeia de poli-ribocitilidato (rC_n). Alternativamente o ARNdc pode ser derivado de poli (I). poli (C) ARNdc por modificação do esqueleto de ribosilo do acido poli-riboinosínico (rl^)r por exemplo por inclusão de resíduos de 2’-O-metil-ribosilo. Estes anãlo gos desemparelhados de rI_n.rC_n, dos quais os considerados preferidos correspondem ãs formulas geraisrl_n.r,U)_n, e rl_n.r(C₂g/G)_n, são descritos por Cárter e Ts’o nas Patentes U.S. 4 130 641 4 02 222. Os ARNdc's descritos nesses publicações são em geral adequados para utilização de acordo com a presente in- ; venção.

São agentes específicos de ARNdc's desemparelhados adequados para a presente invenção os seguintes:

poli	(I) .	poli	(c₄,u)
poli	(I).	poli	(c₇,u)
poli	(I) .	poli	(^ci₃,u)
poli	(I) .	poli	(c₂₂,^u)
poli	(I).	poli	(c₂₀,g)
poli	(I) .	poli	(C₂g,G) e
poli	(I) .	poli	(C ) 23 G>p

A quantidade de ARNdc desemparelhado administrada ê de preferência suficiente para atingir uma con centração de sangue de pico de desde 0,1 microgramas por mililitro de ARNdc atê 1000 microgramas por mililitros na circulação

de sangue sistémica, distai em relação ao ponto de perfusão, imei diatamente a seguir à administração. 0 ARNdc ê administrado por via parenteral (por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea)^ intranasal, rectal ou oral quando substancialmente protegido conj

I tra as endonucleases do tracto gastrointestinal.

Quando se utiliza interferão (alfa). para a linfoquina, deve proporcionar-se uma quantidade de cerca de 0,01 a 100 000 IRU por mililitro do fluído corporal do pacien: te. Quando são administrados ambos os agentes (um ARNdc e outro ; composto antivirai), estes podem ser administrados sob a forma duma mistura ou administrados separadamente mas simultaneamente | ou então sequencialmente. A substância antiviral complementar j usada com o ARNdc e administrada em quantidades consistentes com as instruções no rótulo do produto ou com outras instruções para o uso e frequentemente numa quantidade algo mais reduzida, muitas vezes substancialmente mais reduzida, devido ao uso concorrente do ARNdc e do resultado sinergístico da combinação.

A administração de um ARNdc e de ou tro agente antiviral em combinação inclui as formas de apresen tação nas quais os dois agentes são administrados em conjunto sob a forma de uma mistura terapêutica, e ainda procedimentos nos quais os dois agentes são administrados separadamente mas em; simultâneo, p. ex., como por meio de linhas intravenosas separa-i das no mesmo indivíduo. A administração em combinação inclui I ainda a administração separada de um dos produtos na qual um dos^!produtos é dado em primeiro lugar seguido pouco tempo depois pe-| lo segundo. í

Um grupo de estudos in vitro foram i i levados a efeito para a avaliação de Ampligen, um ARNdc desempa-;¹relhado, para terapia em combinação no tratamento de doenças virais utilizando HIV como um prototipo patogênico virai humano crónico e subagudo. Os materiais e os métodos usados são descritos seguidamente.

Células e vírus - Usou-se com alvo para infecções em análises por microtitulação um clone da linha de células MT-2 transformada por HTLV-I, o qual apresenta citóli se completa por infecção com HIV. O vírus.foi preparado a partir

de líquidos de uma cultura de H9/HTLV-III_B por centrifugação a filtração de 0,45 pm para eliminação das células. Os títulos virais foram determinados a partir de valores de dose infecciosa de cultura de tecidos de 50% (TCID-50) obtidos por microtitula- ] ção de ponto de viragem em células MT-2. Todas as culturas foram! cultivadas e mantidas em meio RPMI-1640 contendo 16% de soro fe-·

I tal inactivado por tratamento térmico e 50 ug de gentamicina ί (Sigma)/ml. | i

Agestes antivirais - Os produtos ! rIFN-<XA (> 10θ IU/mg) , rlFN-^ (1,4 x 10θ IU/mg) e azidotimidina i foram obtidos da sociedade Hoffman-La Roche. O rIFN-/3 Ser 17 i 8 (1,0 x 10 IU/mg) foi obtido da sociedade Triton Biosciences. Os IFNs foram calibrados em células WISH tratadas com vírus da esto matite vesicular e analisados quantitativamente para avaliação do efeito citopãtico conforme descrito anteriormente (2). Os padrões de referência foram obtidos da Organização Mundial de Saúde (IFN-^ humano, padrão WHO B,69/19 e IFN-OC humano, WHO n9. G-023-902-527) ou do National Institute of Allergy and Infectious Disease (IFN- , National Institutes of Health n9. Gg23-901y i

-530). A anfotericina B (Fungizona) foi obtida de GIBCO, a casta] i nospermina de Boehringer Mannheim, a ribavirina (Virazole) de Vi· ratei, Inc., a 3'-azido-3¹-desoxitinidina (AZT, Retrovar), grau ' de investigação, de Roche Laboratories, e o fosfonoformiato (Fos! carnet) de Astra Alab AB. O ARNdc desemparelhado &mpligen) foi ! fornecido sob a forma de um põ liofilizado num tampão salino por! HEM Research, Inc., Rockville, Maryland. ]

Análise de infecção por microtitu- ! lação - As actividades anti-HIV foram medidas numa análise de in fecção por microtitulação tal como descrito (2). Em resumo, analisaram-se em triplicado em placas de microtitulação de 96 alvêo los diluições em série duplicadas de cada produto isoladamente e em combinações de proporções fixas com ARNdc desemparelhado. O grau de citõlise foi medido por meio da absorção de corante vi- ; tal (vermelho neutro) por células aderentes a poli-L-lisina como o ponto final da infecção. As células foram incubadas na presença de diluições dos produtos durante 1 hora antes da adição dos vírus. No caso da anfotericina B, prê-incubaram-se tanto os ví-

rus como as células com os produtos antes da infecção. As células foram infectadas a uma multiplicidade de 0,1 de modo que a j citólise final fosse predominantemente devida a viriões de proge|

I nia sintetizados na presença do produto. O grau de protecção em ; percentagem foi derivado dos valores de Α^θ do corante nos al- í vêolos em analise relativos à diferença em absorção entre as cêlulas de comparação e os alvéolos de vírus de comparação usando a fórmula:

% de protecção = (vírus de experiência negativo)_____ (vírus negativo em relação a células)

Cálculo de sinergia - Os efeitos combinados dos produtos foram calculados pelo método da análise I de produtos múltiplos de Chou e Talalay usando a equação:;

Cl = ^(D)1 + ^(D)2 + OC<D)1<P)₂I (ϋχ)_χ (Dx) ₂ (Dx)₁(Dx)₂I ΐ em que Cl ê o índice de combinação, (Dx) ê a dose do produto 1 i necessária para produzir x por cento de efeito quando isolado e ί (D)i ê a dose do produto 1 necessária para produzir o mesmo efei to de x por cento em combinação com (D)₂· Os valores de (Dx)₂ θ (D)2 são derivados dê modo similar em relação ao produto 2. O va lor de oc ê determinado a partir do gráfico da curva dose-efeito ' usando a equação do efeito médio: ' fa/fu = (D/Dm)^ra j em que fa é a fracção afectada pela dose D, fu ê a fracçao não „ „ - i afectada, Dm e a dose necessária para um efeito de 50% e m e o declive da curva dose-efeito. Para produtos mutuamente exclusi- ; vos (isto é, com modo de acção similar), tanto os produtos isolai damente como a sua mistura dão linhas paralelas no gráfico do I efeito médio. Os produtos mutuamente não exclusivos (isto ê, com! modo de acção independente) darão linhas paralelas no gráfico do efeito médio mas em mistura darão uma curva com uma concavidade j voltada para cima. Se os agentes são mutuamente exclusivos, oc ê 0 e se são mutuamente não exclusivos, cx é 1. Os valores obtidos na hipótese dé que são mutuamente não exclusivos são sempre li• geiramente superiores do que para produtos mutuamente exclusivos.

Os valores de Cl inferiores a 1 indicam sinergia, os valores > 1 indicam antagonismo e os valores iguais a 1 indicam efeitos aditivos .

Analise da transcritase reversa As actividades da transcritase reversa em líquidos de culturas foram analisadas em precipitados de polietilenoglicol, conforme descrito em (3), usando poli (A).(dT)como iniciador modelo (Boehringer Mannheim) e 25 pCi de /metil-^H7~dTTP (80,1 Ci/mmol, New England Nuclear) por reacção.

A revisão e a análise destes estudos deram os seguintes resultados e conclusões:

Actividades antivirais - No Quadro apresenta-se a capacidade de cada produto isoladamente ou em combinação com ARNdc desemparelhadopara proteger células visadas de infecção por HlV. Com a excepção da ribavirina, observou-se protecção completa a todas as concentrações de cada produto logo no início do período de incubação imediatamente após a citolise nos alvéolos dos vírus de comparação (sem efectores). A citolise induzida por vírus nas doses mais baixas destes produtos ocorreu um dia mais tarde e as analises foram repetidas nesse momento a fim de que se pudessem estabelecer relações dependentes da dose. As análises foram -também processadas para a ribavirina nesse momento, embora nunca se tenha alcançado protecção integral com qualquer concentração sub-tôxida deste produto, mesmo nos primei ros estádios da infecção. As concentrações mais eficazes (>10% protecção) de cada produto produziram uma maior actividade anti-HIV em combinação com ARNdc desemparelhado do que usados isoladamente. Todos os produtos não mostraram toxicidade para com células MT-2 nas concentrações utilizadas nestes estudos.

QUADRO 1

Efeito de vários produtos antivirais em combinação com ARNdc desemparelhado sobre a citopaticidade induzida por HIV

ARNdc desemparelhadc (pg/ml)	) 10	20	Percentagem média de protecção para as concentrações de efecto
40	80	res rIFN-QC (IU/ml) 160 320
	0
0	0	9	19	19	20	23 28
04	8	13
08	17		24
16	20			32
32	16				44
64	31					67
128	28					74
ARNdc
de s emp arelhado				rIFN-(IU/ml)
(ug/ml)
	0	10	20	40	80	160 320
0	0	11	27	22	29	45 58
04	12	31
08	36		61
16	44			60
32	62				85
64	71					100
128	81					100
ARNdc
desemparelhado					rIFN-y (IU/ml)
(ug/ml)
	0	7	14	28	56	112 224
0	0	12	16	23	29	30 28
04	9	14
08	22		26
16	38			51
32	51				71
64	72					84
128	71					87

QUADRO 1 (cont.)

ARNdc desemparelhado (pg/ml)	Azidomicina (IU/ml)
	0 002	004	008	016	032	064	128	256
0	0	5	3	5	8	17	30	58	100
04	3	2
08	1		1
16	4			9
32	7				23
64	9					65
128	10						84
256	16							94
512	35					•			100
				Percentagem media de	protecção
ARNdc				para as concentrações	de	efec-
desemparelhado			tores	Ribavirina	(pg/ml)
(pg/ml)	0	04	08	16	32	64
0	0	6	7	10	12	13
04	5	5
08	5		5
16	7			18
32	12.				31
64	40 .					51
ARNdc
desemparelhado				Foscarnet	(pg/ml)
(pg/ml)	0 2	4	8	16 32	64	128	256
0	0 18	42	71	88 95	96	96	99
04	12 31
08	29	63
16	37		85
32	52			92
64	65			97
128	73				97
256	79					99
512	83						98

Ί O

QUADRO 1 (cont.)

ARNdc desemparelhado (pg/ml)	01	⁰²	04	Amfotericina	(gg/ml) 32
	0	08	16
0	0	6	' 9	14	71	95	92
04	9	8
08	18		12
16	30			41
32	33				92
64	55					100
128	65						90
ARNdc desemparelhado (pg/ml) 0	8	16	32	Zastanospermina 64 128 256	(pg/ml) 512
0	0	3	6	10	14	26	58	90
04	8	7
08	16		21
16	43			52
32	57				83
64	59					100
128	78						97
256	81							100

Efeitos de produtos múltiplos - No Quadro 2 são apresentados os valores de Cl para ARNdc desemparelhado em combinações binarias com oito outros produtos anti-HIV com valores de protecção de 50% e 90%. Foram observados vãrios graus de sinergia. O maior grau de sinergia foi observado entre o ARNdc desemparelhado e o rIFN-(X , com os valores de Cl no seu nível inferior (0,01 a 0,01). O menor grau de sinergia foi obser vado com anfotericina B, com valores de Cl máximos do observado e indicando um efeito aditivo a 50% de protecção Cl=0,90 pr 1/08) Outros produtos que demostram sinergia com o ARNdc desemparelhado (valores de Cl inferiores a 1) foram rIFN-(5 , rlFN-y, azidoti midina, ribavirina, fosfonoformiato, anfotericina B e castanospermina. Observou-se uma diferença muito pequena quando os valores de Cl foram calculados para a hipótese de exclusividade mútua em comparação de não exclusividade mútua para cada produto experimentado.

QUADRO 2

Valores de Cl para Efeitos de Produtos em Combinação com

ARNdc desemparelhado como produto núcleo

Produto	Cl para os valores de protecção em % seguintes*
50	90	95
rIFN-tX A	.01	< .01	<.01
	(.01)	(< .01)	(< .01)
rIFN-(3	.34	.14	.10
	(.36)	(.14)	(.10)
rIFN-y	.55	.37	.33
	(.56)	(.37)	(.33)
Azidotimidina	.55	.40	.37
	(.56)	(.40)	(-37)
Ribovirina	.35	.19	.15
	(.35)	(.19)	(.15)
Fosfonoformiato	.58	.65	.70
	(.63)	(.68)	(.72)
Anfotericina B	.90	.67	.65
	(1.08)	(.71)	(.67)
Castanospermina	.55	.21	.16
	(.61)	(.23)	(.17)

* Os valores de Cl foram calculados a partir dos dados do Quadro

1. Os valores > 1 indicam antagonismo, os valores < 1 indicam sinergismo e os valores =1 indicam um efeito aditivo. Os valores de Cl foram calculados na hipótese de exclusividade mútua e são apresentados juntamente com valores obtidos na hipótese de não exclusividade mútua entre parêntesis.

Síntese virai - A produção de vírus em culturas de H9/HTLV-III_B foi examinada na presença e na ausên cia de IFNs, de ARNdc desemparelhado e da combinação destes produtos (Quadro 3) . 0 ARNdc desemparelhado isoladamente (50 pg/ml); tinha um efeito muito pequeno sobre a produção de vírus (diminui! ção de 6¾) enquanto que os IFNs rIFN-o<A, rIFN-£3 e rIFN-y (500 lU/ml) inibiam a produção de virus em 53%, 56% e 20% respectivamente. A presença de ARNdc desemparelhado tinha como resultado uma ligeira redução da inibição da produção de vírus induzida pe los IFNs, sendo esta inibição diminuida de 53% para 47% para o rIFN-OCA, de 56% para 51% para o rlFN-^ e de 20% para 15% para o rIFNy. Outros estudos (não apresentados) indicaram que estas concentrações de ARNdc desemparelhado e de rIFNs isoladamente ou em combinação não tinham qualquer efeito sobre a divisão celular).

QUADRO 3 í

Efeito de ARNdc desemparelhado sobre a inibição induzida por IFN da produção de HIV

Efector*			cpm RT/ml (x 10^J	Med. cpm ) RT/ml (xlO	% de diminui ção
Comparação-1			877	910	-
Comparação-2			943
ARNdc desemparelhado	-	1	896
ARNdc desemparelhado	—	2	807	852	6
rIFN-<x A-l			426
rIFN-c* A-2			430	428	53
rIFN-£ -1			396
rIFN-js -2			400	398	56
ARNdc desemparelhado	+	rIFN-«A-l	418
ARNdc desemparelhado	+	rIFN-oe A-2	540	479	47
ARNdc desemparelhado	+	rIFN-£ -1	411
ARNdc desemparelhado	+	rIFN-0 -2	485	448	51
Comparação-3			1,945
Comparação-4			2,081	2,013	—
rIFN-y-1			1,508
rIFN-y-2			1,696	1,602	20
ARNdc desemparelhado	+	rIFN-y-1	1,669
ARNdc desemparelhado	+	rIFN-y-2	1,738	1,704	15

Ί /

* Culturas em duplicado com iguais densidades de células H9/HTL V-III_B lavadas foram incubadas na presença e na ausência de efectores durante 48 horas. Os líquidos das culturas condicionadas foram em seguida recolhidos e analisados para detecção de actividade de transcritase reversa. Numa segunda experiência ensaiou-se IFN-y + ARNdc desemparelhado e em consequência teve uma série de ensaios de comparação separada. ARNdc desemparelhado =50 ug/ml, IFNs = 500 IU/ml.

As sinergias observadas neste estudo entre o ARNdc desemparelhado e as cinco classes de produtos anti-HIV sugerem que o ARNdc desemparelhado pode ter um papel po deroso e versátil como produto núcleo em terapia de combinação para ARC e SIDA. Os ARNs de dupla cadeia, incluindo o ARNdc desemparelhado, activam as enzimas induzidas por IFN implicadas no estabelecimento de um estado antiviral, incluindo a sinteatse de 2,5-oligoadenilato e uma quinase de proteína associada aos ribos^ somas. Observei que os 2,5-oligoadenilatos inibem as transcritases reversas retrovirais, uma descoberta que sugere que a activa ção da sintetase de 2,5-oligoadenilato por ARNdc desemparelhado pode representar um mecanismo singular para a actividade antiviral contra vírus que necessitam transcrição reversa para replica ção. Mais importante é o facto de que nem todas as actividades pleiotrõpicas dos IFNs parecem ser partilhadas com o ARNdc desem parelhado. Esta circunstância ê exemplificada pelo facto de que os efeitos semelhantes a gripe da terapia com IFN não ocorrem du rante a terapia com ARNdc desemparelhado, bem como a observação de que o ARNdc desemparelhado não inibiu a produção de HIV como ocorria com os IFNs nem potenciou esta actividade dos IFNs (ver Quadro 3). Estes últimos resultados estão em contraste com o sinergismo observado entre o ARNdc desemparelhado ,e os IFNs no estabelecimento de um estado antiviral (ver Quadro 2), sugerindo ainda que estes produtos têm vias para a actividade antiviral co muns bem como outras vias distintas.

Verifiquei que outra classe de produtos anti-HIV, os inibidores de transcrição reversa, são também sinergísticos com o ARNdc desemparelhado. Uma ampla família de análogos de 2',3'-didesoxinucleõsidos podem ser metabolizados_ftornando-se inibidores potentes da transcritase reversa retroviral. Por exemplo, R. Yarchoan e S. Broder (New England Journal of Medicine, 1987, Fevereiro 26, volume 316, páginas 557-564) descrevem dois didesoxinucleõsidos designados 3¹-azido-3'-desoxi timidina (AZT) e 2¹,3’-didesoxicitidina (DDC), que são análogos da timidina utilizada naturalmente e da 2¹-desoxicitidina, respectivamente. Ver também Patente U.S. N9. 4 724 232, que descreve o uso de AZT no tratamento de ARC e de SIDA em quantidades de 5 a 250 mg por quilograma de peso corporal do receptor por dia. Tornou-se evidente que os nucleõsidos fosforilados inibem os retrovírus actuando como terminadores de cadeia de tal modo que a transcritase reversa virai resulta ludibriada ao adicionar estes análogos ã cadeia de ADN em crescimento; este mecanismo bloqueia a formação ulterior da ligação 5’-3' de fosfodiêster tendo deste modo como resultado uma terminação prematura da cadeia de ADN. Podem observar-se efeitos similares com análogos de purina, tais como 2¹,3’-didesoxiadenosina. Infelizmente, estes vários análogos de pirimidina e de purina podem também inibir várias enzimas das células normais, tais como a polimerase alfa de ADN que ocor re na medula õssea e em outros órgãos. Estas inibições das funções das células normais levam, deste modo, a várias toxocidades profundas. Por exemplo a administração crónica de AZT causa anemia grave e leucopenia em mais de 50% dos casos; deste modo, mui tos pacientes tratados com AZT necessitam de transfusões de sangue regulares e podem acabar por morrer em virtude dos efeitos colaterais dos danos da medula óssea, já enfraquecida em virtude da infecção anterior por retrovírus.

Os dois inibidores usados nesta investigação foram azidotimidina e fosfocarnet. A azidotimidina, um análogo da timidina, torna-se fosforilada intracelularmente e ê incorporada no ADN nascente, causando-lhe uma terminação prematura da cadeia. A azidotimidina fosforilada é utilizada pela transcritase reversa 100 vezes mais eficientemente do que pelas polimerases de ADN celulares, permitindo deste modo uma aparente mente gama de selectividade. 0 fosfonoformiato (Foscarnet), um outro inibidor da transcritase reversa, possui uma forte actividade anti-HIV in vitro alem de inibir selectivamente a polimerase de ARN do vírus da gripe e a polimerase de ADN do vírus do herpes. Ambos estes produtos apresentam uma inibição potente e selectiva do HIV em experiências de infecção por microtitulação. 0 sinergismo observado para estes produtos em relação ao ARNdc desemparelhado sugere que este sinergismo pode também ser observado com outros inibidores da transcritase reversa.

Os ARNdc's em geral e o Ampligen em particular podem reduzir substancialmente pelo menos por um factor de 5 a concentração de AZT necessária para uma actividade vi rustática significativa in vitro. Para além disso, para as altas concentrações de AZT experimentadas, existe uma relação sinergíis tica entre os dois compostos. Por Gonseguinte, o Ampligen permite diminuir a dose terapêutica eficaz de AZT in vivo com uma con comitante diminuição na toxicidade associada à AZT.

Uma vez que os dois produtos actuam através de mecanismos de acção inteiramente diferentes, estes produtos não provocarão in vivo toxicidades para além das associadas a cada produto isoladamente. Na verdade, não observei qualquer facto indicativo de toxicidade clínica sinergística mes mo quando se combinou o Ampligen com as moléculas mais intimamen te aparentadas, como os interferões. Para além disso, uma vez que o Ampligen tem demonstrado clinicamente nas minhas investiga ções várias actividades de imunomodulação, para além das suas propriedades antivirais (ambas possivelmente mediadas através de mecanismos similares tais como a via matabõlica 2'-5’ oligo A), o uso de Ampligen em conjugação com AZT pode ter efeitos benéficos pronunciados e a longo termo no decurso de infecções por HIV muito para além do que actualmente relato como resultados in vitro.

A importância e a especificidade da minha invenção não pode ser melhor ilustrada do que à luz do relatório sobre a combinação de AZT com outro produto anti-SIDA po tente, chamado ribavarina, publicado em Science, 1987, Março 13, pelo laboratório do Dr. Hirsch, de Harvard: neste trabalho relata-se o profundo antagonismo quando se adiciona AZT a rebavarina

a fim de conseguir uma potenciação terapêutica. Isto ê, quando se adicionam outros produtos a inibidores da transcritase reversa, aqueles na verdade prejudicam o potencial terapêutico destes últimos em vez de o ampliarem.

A combinação sinergística de ARNDdcf s e de inibidores de transcritase reversa são também úteis no tratamento de tumores cancerosos induzidos por retrovírus. !

A ribavirina pode representar uma I categoria de produtos anti-HIV que interferem com o processamento do 5'ARNm. Se bem que o mecanismo da actividade antiviral da ribavirina não seja claro, pensa-se que este produto compita com a quanosiria na formação de estruturas de fechamento de ARNm e/ou interfira com a metilação funcional destas moléculas. Outros ini bidores de ARNm's funcionais de HIV, tais como ADNs de sentido contrário, poderão também apresentar sinergia para este mecanismo anti-HIV com ARNdc desemparelhado.

A anfotericina B, um antibiótico an tifungico macrolido polieno que interactua com esteróis e se liga a estes de modo irreversível, representa ainda outra categoria singular de agentes que são activos contra uma variedade de vírus com invólucro de lípidos, incluindo o HIV. Se bem que a an fotericina B apresente toxicidades graves in vivo, a forma de e£ ter metílico deste produto também apresenta actividade anti-HIV e tem um perfil de baixa toxicidade celular in vitro. Por conseguinte, o éster metílico da anfotericina B pode ser mais benéfico em terapia combinada com ARNdc desemparelhado do que o compos. to original.

último agente que apresenta siner gismo com o ARNdc desemparelhado foi a castanospermina. A castai nospermina ê um alcaloide vegetal que inibe o processamento das i glicoproteínas e foi investigada porque o invólucro do HIV contém duas proteínas com alto grau de glicosilação, a gpl20, que ê uma glicoproteína da membrana exterior, e a gp41, que é uma glicoproteína transmembrana. A interacção entre a gpl20 a o antigene de superfície OKT4 das células T, que actua como um receptor para os vírus, ê parcialmente responsável pelo tropismo celular do HIV. Estudos recentes por outros com glicolases e lecitinas mostraram que a glicosilação de proteínas desempenha um papel im portante na interacção gpl20-LKT4 e na infecção por HIV. A maturação das glicoproteínas depende duma série de enzimas para o processamento das fracções de hidratos de carbono que habitualmente tem como resultado a transformação de sacaridos com alto conteúdo em manose em oligossacãridos de tipo complexo. A castanospermina inibe a glucosidase I, resultando uma proteína N-glicosilada do tipo de alto grau de manose. Em condições de infecção por viriões descendentes sintetizados na presença de castanos permina, a infectividade do HIV foi atenuada (ver Quadro 1). Esta atenuação era independente de qualquer efeito que a castanospermina possa ter tido no estado de glicosilação dos receptores e era realmente devida a uma redução no rendimento dos vírus infecciosos, conforme determinado em análises por TCDI-50, sem qualquer efeito sobre a produção global de vírus conforme medida pela actividade da transcritase reversa associada ao vírus. A descoberta de que esta actividade anti-HIV é sinergística com o ARNdc desemparelhado (Quadro 2) sugere que o ARNdc desemparelhado devera ser sinergístico com agentes que interferem com a liga çâo do HIV a receptores. Estes agentes incluirão anticorpos de neutralização, peptídeos de bloqueio, tais como o peptídeo T, ou outros inibidores do processamento das glicoproteínas.

Claims

Processo para a preparação de uma compo sição farmacêutica para o tratamento de infecções por vírus, ca racterizado por se incorporar uma quantidade de ARN de dupla ca deia (ARNdc) para ter actividade de inibição de vírus em combinação com outro inibidor de actividade virai, de expressão virai ou de ambos, que permita atingir uma concentração de sangue de pico de desde 0,1 microgramas por mililitro de ARNdc até 1000 microgramas por mililitros na circulação de sangue sistémica, distai em relação ao ponto de perfusão, imediatamente a seguir à administração.

- 2â -

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o ARNdc ser um ARNdc desemparelhado, de preferência da fórmula rl_n.r,U)_n·

- 3â -

Processo para a preparação de uma compo sição farmacêutica para o tratamento de infecções por vírus de imunodeficiência humana (human immunodeficiency virus, HIV), in cluindo SIDA e complexo relacionado com SIDA, caracterizado por se incorporar uma quantidade de ARNdc para ter actividade de inibição de vírus que permite atingir uma concentração de sangue de pico de desde 0,1 microgramas por mililitro de ARNdc até 1000 microgramas por mililitros na circulação de sangue sistémi ca, distai em relação ao ponto de perfusão, imediatamente a seguir ã administração, em combinação com uma quantidade suficien te para ter actividade de inibição de vírus de um agente anti-viral escolhido de entre o grupo de citoquinas, inibidores de transcrição reversa lipo-hilos e inibidores de processamento de glicoproteínas.

i

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o agente antiviral ser escolhido de entre o grupo constituído pelos interferões rIFN-oC, rlFN-^ , rIFNy, por azidotimidina, fosfonoformato, ribavirina, anfotericina B e por castanospermina.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se incorporar na composi ção terapêutica um ARNdc e 3'-azido-3' deoxitimidina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Processo de acordo com qualquer dasj reivindicações 1 ou 3 a 5, caracterizado por o ARNdc ser desempaj relhado e ter a fórmula rl_n.r(C_2g,G)_n·

- 7~ Processo de acordo com a reivindica ção 6, caracterizado por o ARNdc conter regiões de quebra de ligação e por o ARNdc apresentar a propriedade da razão terapêutica favorável da fórmula rl_n-r(^cn_i4'U)_n.

A requerente declara que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados nos Estados Unidos da América em 23 de Março de 1987 e em 25 de Novembro de 1987, sob os números de serie 028,823 e 125,097, respectivamente.