PT93449A - Processo para a inibicao do virus da imunodeficiencia humana (hiv) - Google Patents

Description

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MMORIA DESCRITIVA 1. INTRODUÇÃO 0 presente invento refere-se ao uso de combinaçães de deriva dos de nucleósidos para inibir a replicação do vírus da imunodefi-ciencia humana (HIY), limitando assim os efeitos da infecçâo provo cada por HIV. 0 fundamento do invento reside no facto de se ter verificado que derivados de nucleósidos, usados em combinação, pos suem efeitos sinérgicos, de tal forma que a dose combinada e eficaz destes agentes ê menor do que a soma das dosagens terapêuticas de qualquer das drogas usadas individualmente; o aumento da activi dade anti-viral não está associado a um aumento comensurável da citotoxicidade; de facto, as combinaçães de derivados de nucleósidos são menos tóxicas para células não infectadas do que os compos tos idênticos administrados separadamente.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO

2.3,. VÍRUS DA 1MUN0DERIGIENGIA HUMANA 0 vírus da imunodeficiência humana (HIV) é um retrovírus humano que se crê ser o agente causador do sindroma da imunodefieiên cia adquirida (SIDA) e do complexo associado com a SIDA (ARO). 0 virião ou a partícula do vírus da SIDA é uma esfera com cerca de 1000 angstrom de diâmetro. A partícula está coberta por uma men-brana formada por uma bicamada de lípido, derivada da membrana exterior da célula hospedeira infectada. A membrana virai é constituída por uma glicoproteína de envelope que é sintetizada como um precursor de 160 Nd e, subsequentemente, processada em duas glico-proteínas: a gp41 que abrange a bicamada de lípido e a gpl20 que se estende para além da bicamada de lípido . 0 envelope cobre um núcleo formado por proteínas designadas por p24 e pl8, 0 ARN virai ê transportado no núcleo con^nntamente com várias cópias da enzima, transcriptase inversa, que catalisa a reunião do ADN virai. 0 genoma do HIV contém três genes que codificam os componen tes das partículas de retrovírus: o env (que codifica as proteínas do envelope), o gag (que codifica as proteínas do núcleo) e o pol (que codifica transcriptase inversa). Estes três genes são -3- 70 766 5624-079-118 flanqueados por prolongamentos de nucleôtidos denominados repetições terminais longas (RH). As RED incluem sequências que desen penham um papel no controlo da expressão de genes Tirais. No entanto, contrariamente a outros retrovírus, o genoma do HIV inclui, pelo menos, cinco genes adicionais, três dos quais possuem funções reguladoras conhecidas, e cuja expressão se julga ter impacto nos mecanismos patogénicos exercidos pelo vírus. 0 gene tat codifica uma proteína que actua como um trans-activador potente da expressão do gene do HIV e, consequentemente, desempenha um papel impor tante na amplificação da replicação do vírus. 0 gene rev ou trs/ /art pode supra-regular a síntese do HIV por um mecanismo de operação anti-repressãoj o rev permite ao vírus HIV integrado produzir, selectivamente, quer proteínas reguladoras, quer componentes de viriâo. Em contraste, o gene nef ou 51-orf parece infra-regu-lar a expressão do vírus, produzindo uma proteína citoplasmática que, presumivelmente, através de um segundo mensageiro, inibe a transcrição do genoma do HIV. 0 gene vif ou sor não é essencial para a formação do virião, mas ê crítico para a geração eficiente de viriões infecciosos e influencia a transmissão do vírus in vi-tro. 0 gene pr ou R codifica uma proteína imunogénica de função desconhecida.

Grê-se que, a base crítica para a imunopatogénese da infec-ção provocada por HIV é a eliminação do subgrupo auxiliar/indutor de linfócitos Ϊ que exprime o antigénio CD4, resultando numa imu-nosupressão profunda. Grê-se que a morte virai destas células imunológicas é um faetor importante que contribui para o efeito enfraquecedor que o HIV tem no sistema imunológico. A glicopro-teína do envelope desempenha um papel importante na entrada do HIV em células hospedeiras GD4 positivas. Eoi demonstrado que a porção gpl20 se liga direotamente à molécula reeeptora celular CD4, produzindo assim tropismo de HIV pára células hospedeiras que exprimem o receptor GB4, por exemplo, células auxiliares I (células Ϊ4), macréfagos, etc.

Apés o HIV se ligar à molécula de 0D4, o vírus é intemali-zado e des-revestido. Uma vez internalizado, o ARI genómico é transcrito em ADN pela enzima, transcriptase inversa, 0 AM pro-viral é então integrado no ADN cromossémico hospedeiro e a infec -4- 70 766 5624-079-118 ção pode assumir uma fase “dormente” ou latente. No entanto, assim que ocorre a activação, o ADN proviral ê transcrito. 0 processamento de tradução e pós-tradução resulta na reunião do vírus e no trotar de viriões maduros da superfície da célula.

Quando ocorre a replicação activa do vírus, a célula hospedeira +0D4 ê, usualmente, morta. No entanto, o mecanismo exacto pelo qual o HIY exerce o seu efeito citopático é desconhecido. Foram propostos diversos mecanismos para a imunopatogénese e para o efeito citopático da infeeçâo por HIY: a acumulação de grandes quantidades de ADN virai não integrado nas células infectadas; o aumento maciço na permeabilidade da membrana celular quando grandes quantidades de vírus rebentam a superfície da célula; especulações de que o HIY pode induzir a diferenciação terminal de célu las 14 infectadas, conduzindo a períodos de vida mais curtos. Há uma evidência crescente de que, tanto a molécula CD4 como o envelope virai desempenham um papel no efeito citopático em células infectadas por HIY, promovendo de alguma forma a fusão celular.

Uma característica proeminente na citopatologia da infecção por HIY ê a formação de sincícios multinucleados formados pela fusão de cerca de 500 células, que parece ser induzida pelas proteínas do envelope gpl20/gp41. Hm contraste, os macréfagos infectados por HIY podem continuar a produzir HIY sem efeitos citopáticos durante longos períodos de tempo; crê-se que o maerófago ê o reservatório principal de HIY e que pode ser responsável pelo trans porte do vírus para o sistema nervoso central (G-artner et al., 1986, Science 233:215-219).

Até á data não há possibilidade de cura para a SIDA. Estão em curso diversas tentativas para encontrar uma vacina, de forma a controlar a disseminação do vírus entre as populações. No entan to, os esforços para controlar o curso da doença num paciente infectado têm sido dirigidos, principalmente, no sentido da utiliza çâo de agentes anti-virais.

2.2. MEDICAÇÕES ANII-HIY

Estão actualmente a ser exploradas diversas tentativas tera pêuticas num esforço para diminuir a morbidez e a mortalidade da infecção por HIY (Yarchoan et al., 1988, Scientific American 259:110-119; Bartlett, 1988, J.A.M.A. 260:3051-3052; De Clercq, -5- 70 766 5624-079-118 Ε., 1986, J. Med. Chem. 29:1561-1569; Yarchoan, R. e Broder, S., 1987, N. Engl. J. Med. 316:557-564). 0 conhecimento da fisiolo gia do vírus HIY resultou em diversas análises racionais, concebidas para interferir com a replicaçâo virai ou com a disseminação da infeeção. A intervenção poderia, potencialmente, impedir a li gação do vírus a células alvo, a fusão com as membranas celulares, o desrevestimento do ácido nucleieo virai, a transcrição inversa do genoma do ARE de HIY em ADI, a transcrição ou a tradução do ARlm virai, o processamento de proteínas virais, a reunião em viriões maduros ou outros acontecimentos relacionados com a replicaçâo ou com a infecciosldade

Estão a ser testados diversos métodos para impedir a ligação de HIY às membranas celulares; estes métodos são dirigidos para a inibição de interacçSes entre a glicoproteína do envelope do HIY, gpl20, e o antigénio CB4 em células alvo, tais como os linfócitos T auxiliares. Mostrou-se que a ligação da gpl20 ao antigénio CD4 estava associada não apenas à penetração virai das membranas celulares, mas também à formação "de sincícios (Sodroski et al., lature 322:470-474; Iiifson et al., 1986, lature 323:725-728; Stevenson et al., 1988, Oell 53:483-496). Smith et al., (1987, Science 238:1704-1707) mostrou que o antigénio GD4 solúvel pode bloquear a infecciosldade- do HIY ligando-se a proteínas virais, antes de estas encontrarem as moléculas CD4 embebidas nas membranas celulares.

Em alternativa, mostrou-se que os anticorpos anti-idiotipo, dirigidos contra anticorpos anti-CD4, se ligam ao vírus HIY, in vitro, presumivelmente, por possuírem configurações proteicas semelhantes às dos determinantes de 0D4 (Dalgleish et al., 1989, UCIA Symposia on Molecular and Cellular Biology. J. Oell Biochem. Supp. 13B, p. 298). Adicionalmente, mostrou-se que diversas moléculas grandes, sulfata das e carregadas negativamente, incluindo sulfato de dextrana, ini bem a replicaçâo de HIY e a formação de sincício in vitro (Yarcho-an et al., supra).

Mostrou-se que os oligonueleótidos anti-sentido inibem a for mação de sincícios induzidos por vírus e a expressão da proteína virai p24 (Agrawal et al., 1988, Proc. lati. Acad, Sei. U.S.A. 85:7079-7083). Estes polímeros sintéticos de ácidos nucleicos, complementares do AEUm de HIY, foram concebidos para inibir a tra- -6- 70 766 5624-079-118 dução do ARUm virai em proteínas? a formação de derivados fosfora-midato e fosforotioato dos oligonucleÓtidos anti-sentido produziu compostos substancialmente resistentes à degradação por endonuclease.

Crê-se que a ribavirina, compreendendo uma porção ribose e um anel triazol, actua como um análogo do nucleósido guano sina.

Possui actividade contra diversos vírus de ARH, in vitro, principalmente, segundo se crê, por interferir com o passo de guanilaçâo requerido para o revestimento do ARUm virai. Referiu-se que a ribavirina suprime a replicação de HIY em culturas de linfócitos Ϊ humanos (McCormick et al., The lancet, Dec. 15, 1984:1367-1569).

Altemativamente, o processamento pós-tradução das proteínas virais pode ser interrompido? mostrou-se que a castanospermina, uma actividade de glicosidase de planta reduz a formação de sincí-cios e a infecciosidade de HI7 (Wall et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.À. 8^:5644-5648).

Os passos finais da replicação do HIY envolvem a sua saída da célula hospedeira e a infecção de novos alvos celulares. Mostrou-se que o interferão alfa suprime a replicação de HIY in vitro (Ho et al., Lancet, 16 de Março 1985:602-604), que pode reduzir os rebentos virais e que possui uma actividade anti-tumor directa, con tra o sarcoma de Kaposi, uma situação maligna associada à SIDA. Demonstrou-se que um composto de lípido, AL 721, composto por gli-céridos neutros, fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina numa pro porção 7:2:1, possui uma capacidade demonstrada para extrair coles terol das membranas celulares e parece diminuir a infecciosidade do HIY (Sarin et al., 1985, N. Engl. J. Med. 313:1289-1290).

Actualmente, estão a ser testados diversos métodos para controlar a infecção provocada por HIY, métodos esses relacionados com a inibição da transcriptase inversa virai. Uma vez que as célu las de mamíferos não possuem actividade endógena de transcriptase inversa, estes métodos oferecem uma inibição potencialmente selec-tiva da replicação virai com uma citotoxicidade mínima para a célula hospedeira. Os agentes que se crê que inibem a transcriptase inversa incluem o fosfonoformato (Sandstrom et al., Lancet Junho 29, 1985:L1480), suramina (Mitsuya et al., 1984, Science 226:172--174), rifabutina (ou ansamicina, Amand et al., Lancet, Janeiro 11, 1986 p, 97) e os derivados de nucleósidos, descritos infra. -7- 70 766 5624-079-118

2.2.3,. DERIVADOS PE HUCLEÔSIDOS

Os derivados de nucleósidos são formas modificadas dos nucleósidos purina (adenosina e guano sina) e pirimidina (timidina, uridina e citidina) que são os blocos de construção de ARE e de ADE. A transeriptase inversa e a ADE-polimerase ligarão e incorporarão os derivados de nucleósidos na cadeia nascente de ADE, des de que o carbono 5’ do derivado se possa ligar ao grupo hidroxilo 3' do nucleótido anterior (isto é formando uma ligação fosfodiés-ter); os nucleótidos subsequentes só podem ser adicionados se o derivado de nucleósido possuir um meio de ligar o seu carbono 3' ao fosfato 5’ de outro nucleótido. Muitos destes derivados de nucleó sidos, sob estudo como medicamentos potenciais anti-HIV, resultam na terminação prematura da replicação do ABE virai, antes da totalidade do genoma virai ter sido transcrita. Estes derivados têm falta de substituintes 3* que se possam ligar a nucleósidos subsequentes e resultam na terminação da cadeia.

Mostrou-se que o AZT (31-azido-2’,31-didesoxitimidina, azido timidina, zidovudina) Ó um derivado de nucleósido que é eficaz no tratamento de pacientes com SIDA e IRC; os resultados indicam que a AZT aumenta a sobrevivência média dos pacientes com SIDA (Eischl et al., 1987, E. Engl. J. Med. 317:185-191; Greagh-Kirk, et al., 1988, J.A.M.A. 260:3009-3015). As evidências preliminares sugerem que a AZT pode ser eficaz em crianças com SIDA, na psoríase associada ao HIV (Bartlett et al., supra), na demência associada à SIDA (Sehinitt et al., 1988, E. Engl. J. led. 319:1573-1378) e tromboci-topenia associada ao HIV (Pottage et al., 1988, J.A.M.A. 260:3045--3048). a AZ! é fosforilada por células de mamíferos para formar o trifosfato de AZT (um análogo do trifosfato de timidina) que se crê que inibe a produção de ADE virai, por, pelo menos, dois mecanismos: inibição competitiva e terminação de cadeia (Yarehoan et al., supra). A inibição competitiva ocorre porque a transeriptase inversa virai se liga ao trifosfato de AZT, mais fortemente, do que aos nucleótidos nativosj a terminação da cadeia resulta da in corporação de AZT porque a AZT não tem um grupo hidroxilo 3' e por tanto não se pode ligar a nucleótidos subsequentes.

Os didesoxinucleósidos são derivados de nucleósidos com falta de grupos hidroxilo nos resíduos de carbono 2’ e 3' e resultam -8- 70 766 5624-079-118 portanto na terminação da cadeia de ABI. Adicionalmente, tal como a AZT, os produtos de trifosfato 5' de 2’, 3'-didesoxiadenosina, didesoxiguanosina, didesoxieitidina e didesoxitimidina, inibem se leetivamente a transcripta.se inversa virai e a AM-polimerase, p> e , celular, mas não interferem com a função da AM-polimerase <* , a enzima sintética de ABI mais importante, utilizada durante a divisão celular (Edenberg et al., 1978, J. Biol. Gliem. 255;5275-5280; Waqar et al., 1978, lucl. Acids Res. .5:1933-1946; van der Vilet et al., 1981, Biochemistry 20:2628-2652; Waqar et al., 1984, J. Oell. Physiol. 121:402-408). In vitro, os 2’, 3,-didesoxinucleósidos de adenosina, guanosina, inosina, citidina e timidina inibiram a re-plicação do vírus HIV (apesar de o derivado da timidina exibir menos actividade inibidora); observou-se uma supressão essencialmente completa do vírus HIV em doses inferiores, por um factor de 10 a 20, as necessárias para inibir a proliferação ou reactividade imunológica de células T (Mitsuya e Broder, 1986, Proc. lati. Acad. Sei U.S.A. 8^:1911-1915). Ahluwalia et al., realizaram estudos ini ciais sobre a farmacologia celular de 2*, 5’-didesoxiinosina (1987, Biochm. Pharm. 56:5797-5800). A publicação PCI WO 87/01284, publicação internacional datada de 12 de Março, 1987, refere-se à inibição da infeeciosidade in vitro, e aos efeitos eitopáticos de HIV, pelos 2’, 3’-didesoxinucleósidos de purina, incluindo a 2‘, 5’-didesoxiinosina, a 2*, 3'-didesoxiguanosina e a 2*, 3’-didesoxiadeno sina. 0 pedido de patente europeia 0275277, publicado em 6 Julho de 1988, refere-se à utilização de 5’-desoxitimidina-2’-eno (3'-de-soxi-2’, 3,-didesidrotimidina d4T), que não possuí grupos hidroxilo 2’ e 3' e que tem uma ligação dupla entre os átomos de carbono 2‘ e 3’, no tratamento de pacientes infectados com um retrovírus. Verificou-se que a D4T, também designada por 2’, 31-didesidro-2', 3*-di desoxitimidina, ou 1-(2,3 didesoxi- β-B-glicero-pent-2-enofuranosil)-timina, inibe a transcriptase inversa dò HIV e que possui actividade anti-HIV comparável a AZT (Mansuri et al., J. Med. Ohem., no prelo). AD4T pode também possuir efeitos tóxicos menores do que os da AZT (Mansuri et al., supra; Ghazzouli et al., 1988, IGAAO, Abstract 1301, p. 344).

Recentemente descreveram-se 2‘, 3,-didesoxi-2'-fluoronucleó-sidos estáveis em ácido, que exibem efeitos anti-virais. Veja-se -9- 70 766 5624-079-118 o pedido de patente Europeia, Publicação ]P 0287313 A2 que descre ve a 2f, 3,-didesoxi-2,-fluoroadenosina e a 2', 3*-didesoxi-2*-fluo roinosina e o pedido de patente Europeia, Publicação IP 0292023 A2 que descreve um derivado de fluoropirimidina, 2f, 3'-didesoxi-2’--fluoro-arabinofuranosilcitosina (E-ddO),

2.2.2. EEEIIOS TÓXICOS DAS ESDlCAgOES ΜΐΙ-HIV

Uma vez que o HIY depende das células humanas para fornecer a'1 maquinaria* necessária para se completar o seu ciclo de vida, a inibição da replicação virai está frequentemente associada a efei tos citotóxicos. A terapia com ΑΖΐ está associada a toxicidade para a medula óssea (Richman et al., 1987, N. Engl. J. Med. 317;192--197) e, consequentemente, à diminuição da produção de glóbulos ver melhos (resultando em anemia), de plaquetas (resultando em trombo-citopenia) e de glóbulos brancos (resultando em leucopenia). De acordo com Bartlett et al. (1988, J.A.M.A. 260;3031-3032). 40 por cento dos pacientes tratados com ΑΖΪ desenvolvem, em último estágio, anemia, requerendo redução da dosagem ou transfusão, e leucopenia, com uma diminuição do número de granulócitos, aumentando assim a sua susceptibilidade a infecçães; apenas cerca de 60 por cento dos pacientes com ARO ou SIDA parecem ter capacidade de tole rar o uso continuado de AZS, após um ano de terapia (Pettinelli, 0. B., Eeinberg J. e o AIDS Clinicai Trials G-roup; Safety and to-lerance of zidovudine in patients with AIDS and advanced ARO, resumido ; Eischi, M.A. e o AIDS Olinical Trials Group; lhe safety and efficacy of two doses of zidovudine in the treatment of patients with AIDS, resumido ? 'tendo sido r ambos apresentados na Quar ta Conferencia Internacional sobre a SIDA, Estocolmo, 15 de Junho 1988 e citados por Bartlett).

De forma a evitar estes efeitos tóxicos, a ΑΖΪ está a ser testada em combinação com outros agentes anti-virais tais como o aciclovir de sódio o fuscamet de sódio, o interferão- <χ , βou , a interleucina 2 ou o ampligénio. Estão também a decorrer outros estudos, alternando a AZT com terapia com 2', 3*-didesoxicitina (ddO) (Yarchoan et al., 1988, lancet 1:76-81). A administração contínua de doses elevadas de ddO (que é relativamente pouco prejudicial para a medula) durante mais de oito a doze semanas, está associada ao desenvolvimento de neuropatia periférica dolorosa; -10- 70 766 5624-079-118 espera-se que a alternância entre a AZ!£ e a ddC possa minimizar os efeitos tóxicos de ambas. Actualmente está a ser activamente estu dado por vários investigadores, um regime terapêutico que seja efi caz e elinicamente tolerável pelos pacientes com SIDA.

3. DESGRiglO SUMÁRIA DO INVENTO 0 presente invento refere-se ao uso de combinações sinérgicas de derivados de nucleôsidos, para inibir a replicação do vírus da imunodeficiência humana (HI7) e consequentemente, para limitar a infecção por ΗΓ7. De acordo com o invento, certos derivados de nucleôsidos, usados em conjunto, exibem maiores efeitos anti-virais e menor citotoxicidade, para concentrações mais baixas, do que qualquer das drogas usadas separadamente, maximizando assim o tra tamento da infecçSo por HIV e minimizando os efeitos secundários tóxicos.

Numa concretização particular do presente invento, o nucleó sido análogo da purina, didesoxiinosina (ddl) e o nucleósido análogo da pirimidina 2f, 3‘-didesoxi-2', 3'-didesidrotimidina (d4T), podem ser usados para inibir a replicação do HIV. Mostra-se, como exemplo, que a ddl e a d4T exibem uma forte actividade sinérgica anti-HIV; a combinação da ddl e da d4T produziu um maior efeito anti-HIV, mas estava associada a uma menor citotoxicidade que qual quer dos compostos usados separadamente.

Noutra concretização do presente invento, podem-se utilizar combinações de análogos de fluoronucleósidos com d4T, para inibir a replicação de HIV. Por exemplo, o nucleósido análogo da purina, 2', 3,-didesoxi-2,-beta-fluoroinosina (F-ddl), pode ser usado com d4T.

3.Í. DEFINIÇÕES E ABREVIATURAS

Os termos que se seguem tal como são aqui utilizados, quer no singular, quer no plural, têm os significados abaixo designados. índice de Combinação (IC); representação numérica dos efeitos si-nérgicos ou antagonistas de combinações de drogas, em que um IC inferior a um representa sinergia, superior a um represen ta antagonismo e igual a um representa aditivismo. 0 valor de IC é obtido usando uma equação de isobolograma e simula- -11 70 766 5624-079-118 ção em computador de acordo com Ohou e Talalay (1984, Adv. Enz. Reg. 22:27-55 e 1987, in HNew Avenues in Developmental Câncer Chemoterapy", Harrap and Connors, eds., Bristol-Myers Symposium Series, Academic Press, pg 37-64; Hartshorn et a!., 1987, Antimicrobial Agents and Chemoterapy 31:168-172), Um índice de combinação pode ser determinado com a equação: IC= M-i(D_), ÍSL2_ , * (3» 1 (P) em que ^ é a dose de agente 1 requerida para produzir, sozinho, x por cento .de efeito e (D)^ é a dose de agente 1 requerida para produzir o mesmo efeito de x por cento em com binação com (D^· Similarmente, (D,^ é a dose de agente 2 requerida para produzir, sozinho, x por cento de efeito e (D)g é a dose requerida para produzir o mesmo efeito em com binação com (D)^. Como descrito em Hartshom et al, (supra), o declive das curvas dose-efeito indica se os agentes possuem efeitos mutuamente exclusivos (por exemplo, modos de acção semelhantes) ou efeitos mutuamente não exclusivos (por exemplo, modo de acção independente).

Se os agentes são, mutuamente, exclusivos, então C^ê 0 (isto é, 10 é a soma de dois termos; se os agentes são, mutuamente, não exclusivos,<X é 1 (isto ê, IC é a soma de tres termos).

Sinergia: acção de duas ou mais substâncias para alcançar um efeito maior do que o obtido com qualquer uma das substâncias usadas individualmente. 0 sinergismo em actividade anti-virai deverá ser entendido como significando maior actividade anti-viral; o sinergismo em citotoxicidade deverá ser enten dido como significando maior citotoxicidade.

Dose Inibidora de Cultura de Tecidos (isto é DICT^q)- quantidade de vírus necessária para reduzir a expressão virai numa dada percentagem, isto é, em 50 por cento.

Dose Tóxica para Cultura de Tecidos (isto é DTCT^)- quantidade de droga requerida para reduzir o número de células na cultura de tecidos numa dada percentagem (isto ê, em 50 por cento).

4. DESCRIÇÃO DAS FIGURAS -12- 70 766 5624-079-118

Eigura 1. Actividade anti-viral de concentrações totais iguais de d4I (linha a tracejado), ddl (linha a ponteado) ou d4T + ddl (linha a cheio), medida por ligação a p25gag, expressa como percentagem de inibição.

5. DESCRIÇÃO DETAIHADA DO INVENTO 0 presente invento refere-se ao uso de combinações sinérgi-cas de derivados de nucleósidos para inibição da replicação de HIV, limitando assim os efeitos da infecção provocada por HIV. De acor do com o invento, as combinações de certos derivados de nucleósidos exercem efeitos anti-HIV mais fortes, mas estão associados a uma menor citotoxicidade que os derivados de nucleósidos isolados, a concentrações de droga totais, comparáveis.

Apesar de os requerentes não terem o dever nem a obrigação de explicar o mecanismo de funcionamento do invento, pode referir--se que, fornecendo dois ou mais derivados de nucleósidos, podendo qualquer um dos quais substituir os nucleósidos de ocorrência natu ral na actividade virai de transcriptase inversa, a probabilidade destes derivados serem incorporados na sequência do ADR virai (e consequentemente, de terminarem a transcrição inversa, impedindo o alongamento do ADI nascente) ê, substancialmente, aumentada.

De forma a clarificar a descrição e não de modo algum, como limitação, a descrição do presente invento será dividida em três secções: (l) combinações de derivados de nucleósidos; (2) análises in vitro para demonstrar o efeito inibidor de HIV, das combinações de derivados de nucleósidos e (5) usos terapêuticos das com binações de derivados de nucleósidos, inibidores de HIV. 5.1. IDENTIFICAÇÃO DE COMBINAÇÕES SINÊRCICAS DE DERIVADOS DE NUCDEÔSIDOS_

De acordo com o presente invento, os derivados de nucleósidos que podem ser usados em combinação incluem, mas não se limitam a, 2’, 3'-didesoxiadenosina (ddA); 2’, 3’-didesoxiguanosina (ddG·); 21, 3'-didesoxiinosina (ddl); 2’, 3’-didesoxicitidina (ddO); 2*, 3’-didesoxitimidina (ddl); 2f, 3,-didesoxi-2t, 3’-didesidroti-midina (d4T) e 3*-azido-2', 3'-didesoxitimidina (AZT). Alternativamente, podem-se usar derivados halogenados de nucleósidos, prefe rivelmente, 2*, 3'-didesoxi-2’-fluoronucleósidos, incluindo, mas -13- 70 766 5624-079-118 não se limitando a, 2’, 3’-didesoxi-2*-fluoroadenosina; 2’, 3*-didesoxi-2 ’-fluoroinosina; 21, 3 *-didesoxi-2*-fluorocitosina; e 2*, 3*-didesoxi-2*, 31-didesidro-2*-fluoronucleósidos, incluindo mas não se limitando a 2’, 3 *-didesoxi-2’, 3*-didesidro-2’-fluorotimi dina (JM43?). Preferivelmente, os 2’, 3'-didesoxi-2'-fluoronucleé sidos do invento são aqueles em que a ligação do átomo de flúor está na configuração beta, incluindo, mas não se limitando a 2*, 3*-didesoxi-2’-beta-fluoroadenosina (P-ddA), 2’, 3'-didesoxi-2’--beta-f luoroinosina (P-ddl) e 2*, 3'-didesoxi-2*-beta-fluorocito-sina (F-ddC). A combinação de 2’, 3*-didesoxiinosina (ddl) e 2’, 3*-dide-soxi-2*, 3*-didesidrotimidina (d4S) representa uma concretização preferida do invento. A combinação de 2’, 3'-didesoxi-2*-beta--fluoroinosina (F-ddl) e 2’, 3*-didesoxi-2*, 3'-didesidrotimidina (d4f) representa também uma concretização preferida. Para uma des crição mais detalhada dos 2', 3’-didesoxi-2'-fluoronucleésidos e dos 2’, 3'-didesoxi-2’, 3*-didesidro-2'-fluoronucleósidos, veja-se o pedido co-pendente Us 120051, depositado em 12 de Movembro de 1987 por Sterzycki, Mansuri e Martin, que é aqui incorporado na íntegra como referencia.

Para avaliar a eficácia terapêutica potencial das combinações de derivados de nucleésidos, estas combinações podem ser testadas, relativamente à sua actividade anti-virai, de acordo com métodos bem conhecidos na arte. Por exemplo, a capacidade de uma combinação de nucleésidos para inibir a eitotoxicidade de HIF, a formação de sincício, a actividade de transcriptase inversa ou a geração de AM ou proteínas virais, pode ser testada in vitro»

As combinações de derivados de nucleésidos, dentro de uma grande gama de concentrações para cada um deles, podem ser testadas relativamente a actividade anti-viral e/ou citotôxiea, e os índices de combinação podem ser calculados de acordo com os métodos de lineados na Secção 6.1. infra. Um método preferido para demonstrar o efeito inibidor de HIV, das combinações de derivados de nucleésidos, é estabelecido na secção 5.2 e no exemplo da secção 6, infra. Adicionalmente, as combinações de derivados de nucleésidos podem ser testadas quanto à actividade anti-viral in vivo, usando um sis tema modelo animal pára a SIDA, tal como o sistema vírus da imuno- -14- 70 766 5624-079-118 deficiência de símios (VIS) (Kanki et al., 1985, Science 230:951--954); no entanto, uma vez que espécies diferentes de animais (ou mesmo diferentes tipos de células numa mesma espécie) diferem na eficiência com que fosforilam estas drogas, dever-se-á utilizar uma prudência extrema na extrapolação dos resultados experimentais obtidos com uma espécie (ou com um dado tipo de células de uma espécie), para outra espécie (Yarchoaa e Broden, 1987, N. Engl. J. Mted. 316:557-564; Waqar, 1984, J. Gell. Physiol. 121:402-408; Purman et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 83:833-7; Ono et al., 1979, Biochem. and Biophys. Res. Oommun. 88:1255-1262). Podem-se estabelecer doses terapêuticas, bem como citotóxicas, para estas eom-binaçães e aquelas que mostrarem maior sinergia, isto é, que este jam associadas a maior actividade anti-viral e/ou a menor citoto-xicidade, poderão ser consideradas para uso em humanos.

5.2. ANÁDISE IN VlfRO PARA BEMONSIRAR 0 EFEITO INIBIDOR BE HIV DAS GOMBINAQÕBS BE DERIVADOS BE NUCLEÔSIDOS A actividade inibidora das combinaçSes de derivados de nu-cleésidos pode ser testada usando um sistema de ensaio in vitro. tal como qualquer um dos aqui descritos na Secção 6 et seq. Por exemplo, a eficácia de qualquer combinação de derivados de nucleé sidos seleccionada, pode ser estabelecida pela sua capacidade relativa para inibir (a) a formação de sincícios e (b) a produção de partículas de HIV em células infectadas com HIY in vitro, usan do uma linha de células alvo que possa ser infectada com HIV. Geralmente, essas linhas de células serão as de uma linhagem de célula I ou as de uma linhagem mieloeítica/monocítica ou outro ti po de célula transfectada com o gene do GD4. Altemativamente, se os derivados de nucleésidos forem ligados a uma molécula alvejante por exemplo, um anticorpo monoclonal, hormona , factor de crescimento, etc., a linha de células alvo deverá exprimir o antigênio ou o receptor de superfície da célula, apropriado para a molécula conjugada com o derivado de nucleôsido.

Para estabelecer a eficácia de combinação de derivados de nu cleósidos escolhida, a célula alvo deverá ser cultivada in vitro, infectada com HIY e tratada com uma série de doses de derivados de nucleésidos antes, durante ou após a infecção (por exemplo, po dem-se utilizar técnicas de diluição limitada). 0 efeito inibidor 70 766 5624-079-118 -15- ' i\ sobre a produção de viriões pode ser estabelecido como se descrevem, por exemplo, medindo (a) a produção de HIY, testando as proteínas de HIY tais como a proteína do núcleo virai 25 gag ou a transcriptase inversa, no meio de cultura; (b) a indução de antigé nios do HIY em células, por imunofluoresceneia; ou (c) a redução de formação de sincícios, estabelecida visualmente. A capacidade de uma combinação de derivados de nueleósidos para inibir o HIY ê indicadora de actividade inibidora e da dose inibidora da combina ção de derivados de nueleósidos testada. 5.3. USOS TERAPÊUTICOS DE COMBINAÇÕES SIKÊRGICAS DE DERIYA-POS INIBIDORES DE HIY_ A combinação sinérgiea de derivados de nueleósidos pode ser usada de acordo com o invento, in vivo para impedir a formação de sincícios e a produção de viriões de HIY e, assim, inibir a progressão da infecção com HIY num paciente exposto. As doses eficazes dos derivados de nueleósidos, formulados em transportadores farmacológicos adequados, podem ser administradas, por qualquer via apropriada, incluindo, mas não se limitando a injecçâo (por exemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, etc.), por absorção através dos revestimentos epiteliais ou muco-cutâneos (por exemplo, mucosa oral, revestimentos epiteliais rec-tais e vaginais, mucosa nasofaríngica, mucosa intestinal, etc.); etc.

Adicionalmente, os derivados de nueleósidos podem ser misturados em qualquer veículo farmacológico adequado, ligado a uma molécula transportadora ou alvejante (por exemplo, anticorpo, hor mona, factor de crescimento, etc.) e/ou incorporados em lipossomas, microcápsulas e preparações de libertação controlada, antes da admi nistração in vivo.

Noutra concretização, as combinações sinérgicas de derivados de nueleósidos podem ser usadas em conjunção com outros tratamentos contra a infecção provocada por HIY. Por exemplo, e não como limitação, os derivados sinêrgicos de nueleósidos podem ser usados em conjunção com outros compostos anti-virais que inibem a actividade de transcriptase inversa (por exemplo AZT); com anticorpos 0D4 ou monoclonais solúveis, que inibem a absorção de HIY nas células; ou com outras citoquinas e factores de crescimento (por exemplo; in- -16- 70 766 5624-079-118 terferâod, ou ^ ; factor de necrose de tumores, interleucina-2, factor estimulante de colónias granulocíticas/monocíticas; factor 1 estimulante de colónias, etc.); e com agentes que são usados pa ra tratar outros microrganismos ou vírus que, oportunisticareúte,in fectam os pacientes com SIDA.

Noutra concretização do invento, os derivados sinêrgicos de nucleósidos podem ser usados in vitro para testar a eficácia de diferentes drogas. Neste contexto, seria vantajoso obter amostras de medula óssea de um paciente com SIDA e expor a medula, in vitro, á droga, composto ou regime a testar, de forma a identificar aqueles que, por exemplo, matam o vírus mas poupam as células normais ou aqueles que estimulam a re-popuLação da medula. No entanto, a medula óssea de pacientes com SIDA exibe, in vitro, uma formação de colónias de medula muito pobre. Este facto deve-se, provavelmente, à infecçâo das células precursoras CD 54 com HIY. Como re sultado, a eficácia de diversas drogas, testadas in vitro, é difí cil ou impossível de estabelecer. 0 uso de derivados sinêrgicos de nucleósidos para inibir HIY num tal sistema de ensaio, deveria aumentar a formação de colónias de medula in vitro e, consequente mente, permitir o teste da vários outros protocolos e drogas relativamente à actividade da medula in vitro. 6. EXEMPLO; INIBIÇÃO DA iNEECÇlO POR HIY USANDO DIDESOXIDI-DESIDROTIMIBINA E BIDESOXIIIOSINA._

As experiências descritas abaixo demonstram o efeito inibi-dor da didesoxididesidrotimidina (d4T) e didesoxiinosina (ddl) na infecçâo por HIY de células alvo originárias de células I em cultura in vitro.

6.3.. MATERIAIS E MÉTODOS

6.1.1. CÉLULAS E YÍRUS

As células CEM-P foram originariamente derivadas a partir de leucemia linfoblástica humana aguda e representam uma linha linfo-blastóide T estabeleeida. Encontram-se disponíveis no American Type Culture Collection como células CCRE-CEM (ATCC N2 CCL 119). A estirpe LAY-g^ do vírus da imunodeficiência humana (HIY), foi obtida do Dr. Luc Montagnier, Instituto Pasteur, Paris, França. -17- 70 766 5624-079-118 0 vírus foi adaptado a células CEM-3? e armazenado, em pequenas alí quotas, em azoto líquido. 0 título do vírus foi determinado de duas em duas até três em três semanas e é expresso como TCID^q (doses inibidoras de cultura de tecido; isto é, a quantidade de vírus necessária para reduzir a expressão virai em 50%), Em todas as experiências descritas nas subsecções abaixo, usou-se uma dose virai de 50 TOID^q.

As células CM-F e o vírus HIV foram ambos cultivados em meio MV/CEM. 0 meio consiste em KPMI 1640, suplementado com 1% de glutamina, 100 U/blL de Penicilina, 100 p,g/ml de Estreptomicina, 2 /tg/ml de Polibrene e 10% de soro de bovino fetal.

6,3.,2. DERIVADOS DE EUCLEOSIPOS D4T E DPI A didesoxididesidrotimidina (d4T, ΒΜΪ27857-3/8, lote #26630--23A) e a didesoxiinosina (ddl, ΒΜΓ40900, lote «#=25879-46-1) foram obtidas de Pharmaceutical Research, and Development Division of Bris tol-Myers Company. Ambos os compostos foram re-suspendidos em 2-3 gotas de dimetilsulfóxido (DMSO, D-8779, Sigma Chem. Co.) e em meio MV/CM. A suspensão foi então sonificada (disruptor Microultra-sonic, Kontes) e levada a uma concentração final de 1 mM. Todas as diluições foram realizadas a partir dessa solução de reserva 1 mM. Para testar o efeito combinado anti-HIV das drogas, realizaram-se dois conjuntos diferentes de experiências. No primeiro conjunto, as drogas foram misturadas de forma que a concentração de uma delas se mantivesse constante, enquanto se fazia variar a concentração da outra droga. Por exemplo, a d4T foi mantida a 0,01, 0,1, 1 ou 10 JM enquanto a ddl variou entre 0,1, 1, 10 e 100 /*M. Nesta experiência a proporção das drogas em cada mistura era diferente. Para determinar com maior precisão o grau possível de sinergia entre a d4T e a ddl, no segundo conjunto de análises, as drogas foram misturadas numa proporção 1:5, começando com 10 e 50 μM e diluídas de um para dois. Desta forma a proporção das duas drogas foi mantida constante em todas as diluições. Os dados foram avaliados usando o suporte lógico "Dose Effect Analysis with. Microcomputers" (Chou, J., e T.C. Chow, Elsevier-Biosoft Publis-hers 1986). Usaram-se os mesmos dois protocolos para avaliar a toxicidade de d4T e ddl em células não infectadas, com a excepção de que na experiência de proporção de drogas constante, a propor- -18- 70 766 5624-079-118 ção de drogas usada foi de 1:1, com uma concentração inicial de 100jMfí para ambas as drogas, A azidotimidina (AZT, ΒΜΪ27755/7, lote #2500-38) foi usada como controlo positivo em todas as análises.

6.1.3. DETERMINAÇÃO DO EFEITO PROLIFERA!!IV0 DE D4T E DE DPI__

Para cada análise colocaram-se 2 x 10^ células CEM-F/cavidade em placas de 96 cavidades. As células foram misturadas com cada uma das diferentes combinações, com cada ensaio em quadruplicado. 0 volume total/cavidade foi de 250 j/L. As placas foram incubadas durante seis dias a 37°0 e com 5% de OOg. Io sexto dia, as células foram marcadas durante quatro horas com 1 JM31/cavidade de ^HTdR (lew England luclear Corp. aetividade específica 6,7 Ci/mmol), colhidas em filtros de fibra de vidro e contadas no contador de cintilação (Hartzman, R.J., Segall, M., Bach, M.L., e Bach, F.H., 1971, Histoeompatibility matching. 71. Miniaturization of the mixed leukocyte culture test: A preliminary report. Transplanta-tion, 11:268-273). Os resultados foram expressos como percentagem

X da incorporação de HTdR do controlo que consistia em células incubadas sem drogas. Adicionalmente, os resultados podem ser expressos como uma dose tóxica para cultura de tecidos 50 (DTGT^q) que representa a quantidade em da droga ou drogas, necessária para reduzir o número de células em 50$, relativamente ao controlo. 6.1.4. IIIBIgÃO PA EBPLIQAQAO DE HI7

As células OM-F foram colocadas em placas de 96 cavidades com 2 x 10^ células/cavidade e misturadas com 50T0ID^q de vírus durante 45 minutos. Após 45 minutos, os derivados de nucleósidos foram adicionados a cada uma das cavidades e incubaram-se como se descreveu para o ensaio de proliferação. Io final do sexto dia os sobrenadantes foram testados quanto à presença de antigénios virais, usando um ensaio ELISA de captura de antigénios descrito abaixo. 0 ensaio utiliza dois anticorpos monoclonais contra a proteína do núcleo virai p24gag (Hu, S.H. et al., 1987, lature 328:721-723; e Kinney Thomas, E. et al., 1988, AIDS 2:25-29).

6.1.5. EISAIO DE CAPTURA DE ANTIGÉNIOS

Para este ensaio, revestiram-se placas de Microtítulo (pia- -19- 70 766 5624-079-118 cas de 96 cavidades) com dois anticorpos monoclonais: 25-2 (ΑΪ00 #=9407) e 25-5 (ASCC #=9408), cada um diluído de 1;2500. Estes anticorpos (reagentes de captura) são específicos para as proteínas gag de HIV p24, p40 e p55. Usou-se como sinal IgG humana, con jjugada com peroxidade de rábano, purificada a partir do soro de um indivíduo seropositivo. A absorváncia (450/650 nm) ê determinada apôs a adição do substrato - t e trame tilbenzidina (TM33). As leituras de DO caiem em três categorias: Experimentais = valores de cavidades contendo células, inóculo virai e derivado (s) de nucleó-sido; Controlos = valores de cavidades contendo células e vírus (100%); e Residuais = valores de cavidades contendo apenas inôcu-lo virai. 0 valor residual foi subtraído a todos os valores de DO. 0 efeito antiviral do(s) derivado(s) de nucleósido é expresso como a percentagem de ligação de p24gag do controlo. Por exem pio, se esse valor é 20%, isto significa que a replicação virai, medida indirectamente através da ligação de p25gag, ê inibida em 80%.

6.3.. 6. FORMAÇÃO DE SINOÍCIOS

Antes da recolha dos sobrenadantes para o ensaio de captura de antigênios, todas as cavidades foram examinadas visualmente.

Isto foi efectuado para assegurar que a infecçSo tinha tido lugar e também para verificar o estado das células. Os sincícios eram de fácil observação e apesar da não terem sido contados, as diferenças numéricas entre as cavidades eram muito evidentes.

6.3.. 7. ANÁLISE DE TOXICIDADE

As toxicidades de D4T e de DDI foram testadas contra a célu la hospedeira OEM-F (AfCC CCL119). A CEM-F é uma linha de células I que exprime constitutivamente o receptor CD4 e, deste modo é uma célula hospedeira alvo, apropriada para a infecção por HIV. 0 efei to de D4I e de DDI na proliferação de células não infectadas, foi estabelecido medindo a incorporação de timidina em células CEM-F não infectadas, tratadas com D4I e DDI.

6.2. RESULfADOS

6.2.1. INIBIÇÃO DE HIV POR UMA COMBINAÇÃO DE DERIVADOS DE NUCLEÓSIDOS

Os ensaios in vitro para a proteína p25gag revelaram um for- -20- 70 766 5624-079-118 te efeito sinérgico da d4T em combinação com a ddl, para iniMr a expressão de p25gag, representando uma actividade anti-viral maior do que a de qualquer dos compostos usados individualmente. Os resultados dos ensaios de ligação para a p25gag são apresentados na Tabela lj na Figura 1 apresenta-se uma comparação entre uma com binação de d4T e de ddl e qualquer uma das drogas usadas nas mesmas concentrações totais.

Ia Tabela 1 apresentam-se os resultados de uma série de experiências realizadas para seleccionar as concentrações e as proporções de concentrações óptimas de d4T e DDI para alcançar o máximo de actividade anti-viral. Testou-se uma grande gama de concentrações, avaliando os incrementos logarítmicos na concentração de cada derivado em múltiplas combinações, utilizando um esquema de teste '•checkerboard".

Tabela 1

Percentagem de Inibição de Replicação Virai de d4T e de ddl* concentração de ddl ( /^M)

Concentração de D4T (m) 0 o'.i 1 10 100 0 — 1 3 2 86 0,01 2 25 13 38 83 H O 1 26 11 13 76 1 24 52 52 15 78 10 87 92 88 92 94 ^ determinada por ligação de p25gag Quando se usou a d4T ou a ddl em conjunto com a AZT, para ui concentração de 1:10:50, alcançou-se um efeito sinérgico inferior á sinergia observada para a combinação de d4T e de ddl (veja-se a Tabela III e a Secção 6,5).

6.2.2. CITOTOXICIDADE DIMINUÍDA DE TJMA COMBINAÇÃO DE DERIVADOS DE NUC1EÔSID0S -21- 70 766 5624-079-118 χ

Os ensaios de citotoxicidade medindo a incorporação de H-ti-midina, demonstram que a d4T e a ddl, usadas em combinação, não são mais citotóxie&s para células Cffl-ϊ do que a mesma concentração total de qualquer um dos compostos usado individualmente, apesar da maior toxicidade para o vírus. Os resultados destes ensaios sobre uma grande gama de concentrações de d41» ddl ou d4T em combinação com ddl, numa proporção 1:1, são apresentados na Tabela II.

Tabela II

Percentagem de citotoxicidade de CEK exposto a concentrações crescentes de d4T e/ou de ddl* concentração de ddl (><-M)

Concentração de D4T (,u,M) 0 0,1 1 10 100 0 — — 1 1 1 1 1 1 2 3 1 10 1 3 3 9 14 100 19 26 31 28 30 X %- determinada pela incorporação de -Ή-timidina

6.5. DISCUSSÃO

Os resultados apresentados anteriormente indicam que os deri vados de nucleósido d4T e ddl exibem um forte efeito anti-viral si nêrgico, quando usados em combinações. Por exemplo, com referência à Tabela I, uma concentração de 1 de d4T resultou em 24 por cento de inibição de actividade virai e uma concentração de 10>wM de ddl estava associada a 2 por cento de inibição de actividade virai; no entanto 1>M de d4T combinado com 10/4SÍ de ddl alcançaram 75 por cento de inibição de HIV. A Pigura 1 contém um gráfico que mostra as actividades anti-virais de d4T, ddl e (d4T + ddl) nas mesmas concentrações totais de nucleésido e mostra claramente os efeitos sinêrgicos da d4T usada em conjunção com a ddl. 0 índice de combinação (IC) é uma representação numérica dos efeitos sinêrgicos ou antagonistas das combinações de drogas. 0 -22- 70 766 5624-079-118 valor de 10 ê obtido usando uma equação de isobolograma e simulação em computador, de acordo com Chou (veja-se Secção 3.1). Um valor de 10 menor que um representa sinergia (isto ê, o total ê maior do que a soma das partes), IC maior que um representa antagonismo (isto é, o total é menor do que a soma das partes) e IC igual a um representa aditivismo, (isto é, o total é igual á soma das partes). A Tabela III apresenta os valores de 10 de (d4T + ddl), (d4T + AZT) e (ddl + AZT) em relação ao efeito anti-viral, quando as concentrações de AZT, d4T e ddl se encontram na propor ção 1:10:50.

Tabela III

Valores de IC em relação ao efeito anti-viral para 50, 70 e 90 por cento de inibição do vírus 50% 70% 90% Composto D4T + DDI 0,024 0,049 0,16 D4T + AZT 0,53 0,43 0,30 AZT + DDI 0,77 0,74 0,75

Devido à relação sinérgica entre a d4T e a ddl podem-se usar concentrações inferiores de nucleósido para alcançar uma inibição virai eficaz. Como se mostra na Tabela II, a actividade anti-viral aumentada das combinações de d4T e ddl não está associada a um aumento de citotoxicidade e, consequentemente, consegue-se uma actividade anti-viral selectiva. Adicionalmente, os estudos desen volvidos para estabelecer a DTp.0 (dose tóxica) para a d4T e para a ddl, isoladas ou em combinação, revelaram que enquanto as DT^Q para a d4T e para a ddl, individualmente, eram superiores a 100 >M, a DTpj0 para a combinação de D4T e de DDI era de 730 /M (resultados não apresentados). 0 IC para efeitos eitotóxicos de combinações de AZT, d4T e ddl, em proporções de concentração de 1:10:10, res-pectivamente, mostra que, a concentrações que inibem 90% da aetivi dade de HIV, a combinação de d4T e de ddl ê nitidamente inferior a concentrações igualmente virocidas de (d4T + AZT) ou (ddl + AZT) (veja-se a Tabela IV). Assim, não só a combinação de d4T e ddl é ΤΟ 766 5624-079-118 -23- mais virocida do que a d43? ou a ddl consideradas individualmente, como ainda (d4$ + ddl) ê menos citotóxica. 0 horizonte terapêutico para o tratamento da infecçSo provocada por HIV é portanto alargado pelo uso destes derivados de nucleósidos em combinação; os efeitos terapêuticos anti-HIV podem assim ser alcançados nos pacientes,sem risco de complicações perigosas ou dolorosas.

tabela IV

Valores de 10 para a citotoxicidade para concentrações de nucleósido correspondentes a 50 e 90 por cento de inibição virai

Composto 50% 90% D4T + DDI 2,17 6,40 D4T + AZT 2,45 1,66 AZT + DDI 2,21 2,37

Claims (3)

1. -24 -24 /? 70 766 5624-079-118 REIVINDICAÇÕES 1», - Processo para a inibição do vírus da imunodeficiencia humana (HIV) caracterizado por compreender o contacto de células infectadas por HIV com uma combinação sinêrgica de derivados nucleó sidos. 2®. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o processo se realizar in vitro. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte rizado por pelo menos, um dos derivados nucleósidos ser um 2',3'--didesoxinucleôsido. 4§# „ Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte rizado por pelo menos um dos derivados nucleósidos ser a 2’,3’-di-desoxi-inosina. 5§. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracte rizado por um dos derivados nucleósidos ser a 2*,3‘-didesoxi-2’,3'--didesidrotimidina. 6ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracte rizado por um dos derivados de nucleósido ser um derivado de 2·,3*--didesoxi-21-fluoronucleósido. 7~. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o derivado de fluoronucleósido ser a 2’,3’-didesoxi-2’-fluo ro-inosina.
2. 82. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o derivado de fluoronucleósido ser a 2’,3’-didesoxi-2’-be-ta-fluoro-inosina (E-ddl), 9~. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o derivado de fluoronucleósido ser a 2*,3'-didesoxi-2’-fluo roadenosina, 102. - processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o derivado de fluoronucleósido ser a 2’,3*-didesoxi-2’--beta-fluoroadenosina (E-ddA).
3. 112. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o derivado de fluoronucleósido ser a 2’,3'-didesoxi-2’--fluorocitosina. -25- 70 766 5624-079-118 12^. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o derivado de flúoronuele6sido ser a 2', 3 ’ -didesoxi-2’ -be t a-fluoro cito sina (F-ddC). 13-· - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por, pelo menos, um derivado de nucleósido estar quimicamente ligado a uma segunda molécula. 14â. - Processo para a inibição de HIV caracterizado por com preender o contacto de células infeetadas por HIV com uma combinação de 2*,3'-didesoxi-inosina (ddl) e de 2',3’-didesoxi-2’,3*-dide sidrotimidina (d41). 15-. - Processo de acordo com a reivindieação 14, caracterizado por a proporção de d4f para ddl estar entre cerca de 1:1 a 1:10. 16^. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a proporção de d4f para ddl ser de cerca de 1:5. 17§. - Processo de inibição de HIV caracterizado por compreender o contacto de células infectadas por HIV com uma combinação de 2’,3’-didesoxi-2’-beta-fluoro-inosina (P-ddl) e de 2’,3’-didesoxi-2 ’,3’-didesidrotimidina (d4f). 18ã. - Processo de inibição de HIV caracterizado por compreender o contacto de células infectadas por HIV com uma combinação de 2',3’-didesoxi-2’-beta-fluoroadenosina (P-ddA) e de 2’,3’-didesoxi-2’ ,3'-didesidrotimidina (d4f). 19â. - Processo de inibição de HIV caracterizado por compreender o contacto de células infectadas por HIV com uma combinação de 2',3'-didesoxi-2’-beta-fluorocitosina (E-ddQ) e de 2',3’-dide-soxi-2',3'-didesidrotimidina (d4T). lisboa, 15. ME 19>Q Por ONCOGEN 1IMIPED PARTNERSHIP - 0 AGMEE OFICIAI -