PT100340A - Composicao farmaceutica que contem arns de cadeia dupla util para evitar a resistencia a analogos nucleosidicos - Google Patents
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Description
Descrição referente à patente de in venção de HEM PHARMACEUTICALS CORP., norte-americana, industrial e comercial, estabelecida em One Penn Cen-ter, Suite 660, Philadelphia, Pen-nsylvania 19103, Estados Unidos da América,(inventor: William A.Cárter, residente nos Estados Unidos da América) , para "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA QUE CONTÉM ARNs DE CADEIA DUPLA ÚTIL PARA EVITAR A RESISTÊNCIA A ANÁLOGOS NUCLEOSÍPICOS".
DESCRIÇÃO A utilização de análogos nucleosídi-cos como agentes antivirais é comum, particularmente contra retrovírus. Os vírus são sujeitos a modificações genéticas, ou mutações, que lhes conferem uma resistência relativa a estes agentes antivirais. Quando ocorre resistência, os vírus multiplicam-se mais rapidamente e a doença que eles provocam acelera-se. Empregando ARNdc's relativamente no início da in-fecção reduz-se a probalidade de aparecimento de resistência virai. Mesmo mais tarde durante a infecção quando já ocorreu uma mutação genética, os ARNdc's repõem a susceptibilidade do vírus aos agentes antivirais que já se tinham tornado ine-m ficazes. Este facto pode ser observado pelo resultado clinica • mente inesperado de que a utilização prolongada das duas mo- C.R. 1
dalidades em combinação provoca uma melhor recuperação da função imune do hospedeiro e uma maior dificuldade na de-tecção de vírus do que pode ser observado quando se aplica o agente antiviral isoladamente. A terapia prolongada de doenças virais, particularmente de afecções por retrovirus, está associada à emergência de resistência virai (referências 1 e 2) . Idealmente, os análogos nucleosídicos utilizados em terapia são incorporados em informação genética virai que deste modo se torna defeituosa ou incompleta, provocando uma redução em eficácia do ciclo de crescimento virai. A descendência virai defeituosa ou incompleta apresenta uma infectividade po tencial menor. No entanto, por modificação da sua carga genética, o vírus pode tornar-se relativamente resistente, gerando deste modo uma descendência infecciosa mesmo na presença de análogos nucleosídicos. Ocorrem alterações genéticas típicas no gene da polimerase (isto é, o componente virai que dirige a incorporação do nucleósido antiviral em primeiro lugar) permitindo que o vírus escape destas formas de bloqueio antiviral, o caso melhor estudado até agora é a interaç ção entre os rectrovírus, por exemplo, o HIV (vírus da imuno-deficiência humana) e a 3'-azido-3'-desoxitimidina, também chamada AZT ou zidovudina. A mutação ou as mutações que conferem resistência à AZT frequentemente conferem simultânea mente resistência a vários outros fármacos, como seja (mas sem que se limite a estes) a didesoxiinosina (DDI) e a dide-soxicitidina (DDC).
Descrevem-se procedimentos para retardar, reduzir ou retardar e reduzir simultaneamente o aparecimento de vírus resistentes a análogos nucleosídicos num paciente atacado por uma infecção por HIV (positivos em relação a HIV) por administração de uma quantidade eficaz durante um período de tempo adequado de um ARNdc desemparelhado antes da terapia com o análogo nucleosídico.
Também se descrevem procedimentos te rapêuticos para melhorar a morbilidade das células mononuclea * res do sangue periférico (CMSP), principalmente os linfócitos • T4 ou CD4, de um paciente infectado com um retrovirus que se 2 f Γ\ tornou resistente a análogos núcleosidos por administração de uma quantidade eficaz de um ARNdc desemparelhado ao paciente. O ARNdc pode ser um complexo de um poliinosinato e um policitidilato que contêm uma proporção de bases uracilo ou guanina, por exemplo desde de 1 em 5 até de 1 em 30 destas bases (poli I * poli (C4-29x>u ou G)).
Os ARNdc podem ser da fórmula geral rln*r(Cl:L-14,U)n ou rln'r(C12,U)n. Outros exemplos adequados de ARNdc são discutidos em seguida.
Por "ARNdc desemparelhado" entende--se um ARNdc em que as ligações de hidrogénio (empilhamento das bases) entre as cadeias correspondentes se encontram relativamente intactas, isto é, são interrompidas em média menos de um par de bases em cada 29 resíduos de pares de bases consecutivos. 0 termo "ARNdc desemparelhado" deve ser entendido em concordância. Os ARNdc's preferidos para utilização na presente invenção são baseados em copolinucleótidos seleccionados de entre poli (Gn,U) e poli (Cn,G) nos quais n é um número inteiro com um valor de desde 4 a 29 e são análogos desemparelhados de complexos de ácidos polirriboinosínico e polirribocitidílico, formado por modificação de rln, rCn de modo a incorporar bases não correspondentes (uracilo ou guanina) ao longo da cadeia de polirribocitidilato (rCn). Em alternativa, o ARNdc pode ser derivado do ARNdc poli(I)'poli (C) por modificação da coluna vertebral de ribosilo do ácido polirriboinosínico (rln), por exemplo por inclusão de resíduos de 2-0-metil-ribosilo. Os complexos desemparelhados podem ser complexados por um polímero de estabilização de ARN como por exemplo lisina e celulose. Estes análogos desemparelhados de rIn*rCn, de que os preferidos apresentam a fórmula geral rln* *r (C1;L_14,U)n ou rlnl*r(C29'G)n' são descritos por Cárter e Ts' o nas Patentes US 4 130 641 e 4 024 222, cuja memória descritiva se dá como aqui transcrita por referência. Os ARNdc's descritos nas referidas patentes são em geral adequados para utilização de acordo com a presente invenção. 0 ARNdc desemparelhado preferido é o rln*r (cn_i4/u)n * ou AMPLIGEN^ da HEM Research, Inc. de Rockville, MD, EUA e • encontra-se no mercado sob a forma de um pó liofilizado. 3
I
Outros exemplos de ARNdc desempare-lhado para utilização na presente invenção incluem:-poli (I) * poli (C4,U) poli (I) * poli (CyfU) poli (I) * poli (C13,U) poli (I) * poli (C22/u) poli (I) * poli (C20,G) poli (I) ' poli (C29,G) e poli (I) * poli (Cp23,G>p
Outra classe de ARNdc's adequados para a presente invenção são ARNdc's curtos de estrutura definida, por exemplo oligonucleótidos da fórmula: 5'fecho-(I)n-fecho 3' 3'fecho-(I)m-fecho 5' em que m e n são ambos superiores a 5 e inferiores a 100, I é monofosfato de inosina, c é monofosfato de citidina e em que os fechos numa cadeia são complementares dos fechos na cadeia oposta, ou um oligonucleótido com a estrutura : 5'fecho-[ (I)jjA]j-fecho 3' 5'fecho-[ (C)yU]k-fecho 5' em que x e y são ambos superiores a 5 e inferiores a 25, j e k são ambos superiores ale inferiores a 10, e I e C possuem os significados anteriormente definidos, A é um nucleótido que não é I e U é um nucleótido que forma um par de bases com A.
Em alternativa, o oligonucleótido curto pode ter a estrutura: 5'(l)n-charneira-(C)m3' em que n, m, I e C possuem os significados anteriormente definidos.
Estes oligonucleótidos podem possuir substituições numa cadeia que não são complementares na cadeia oposta. De preferência estes oligonucleótidos são esta-j bilizados por registos internos de heteropolímeros complemen-• tares e é desejável que os fechos e as charneiras de ambos os 4
oligonucleótidos contenham regiões de heterolpolímero complementar. Estes oligonucleótido de preferência possuem prolonga mentos de cadeia simples. Estes oligonucleótidos são descritos em PCT/US89/02172.
Os pacientes são tratados com perfu-sões intravenosas de 200 a 700 mg de rl.r(0^^-14/u) conforme necessário, por exemplo de uma vez por semana até com uma frequência superior, que pode chegar a ser diária, de acordo com as melhorias clínicas verificadas. A quantidade de ARNdc administrada e a frequência da administração devem proporcionar um nível de desde 0,01 a 1000 microgramas de ARNdc por mililitro da circulação de sangue sistémico do paciente imediatamente a seguir à administração num ponto distai do ponto de perfusão. São exemplos ilustrativos de agentes antivirais constituídos por análogos nucleosídicos e Zidovu-dina (azidotimidina, RETR0VIr(r) ou AZT, como normalmente é designada na presente memória descritiva) que é a 3'-azido--3'-desoxitimidina, um análogo nucleosídico antiviral para o tratamento sistémico da sindrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) ou do complexo relacionado com a SIDA (CRS) causado pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV, HTLV-I, HTLV -II, HTLV-III, LAV, ARV e designações semelhantes para várias estirpes) . A dose habitual para um adulto é de 200 mg de quatro em quatro horas, durante todo o dia. Para um paciente de 70 kg a dose correspondente é de 2,9 mg por kg de peso corporal de quatro em quatro horas. Foram usadas doses até um máximo de 60 mg por kg de peso corporal diariamente. Habitualmente usam-se quantidades inferiores às quantidades normais e correntes do agente antirretroviral análogo nucleosídico quando se usa em coadministração com um ARNdc desempare-lhado, conforme é ilustrado mais em pormenor pela discussão que se segue.
BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um quadro que mostra o período em meses até ao falecimento de 298 pacientes com SIDA "completamente desencadeada" em termos de proporção de pa 5 A figura 2 A figura 3 A Figura 4 A Figura 5 A figura 6
cientes sem ocorrências críticas relacionadas com a SIDA comparando com o tratamento com AZT "precoce" (quadrados) antes da ocorrência de sin tomas ou "tardio" (círculos) após o aparecimento dos sintomas. compara a utilização precoce de ARNdc ou a sua utilização simultânea com a de AZT para o controlo do crescimento retroviral em comparação com o crescimento retroviral rápido no caso de se usar AZT isoladamente. compara os efeitos relativos de um ARNdc e de AZT administrados como monoterapia com o de placebo e de ARNdc e AZT como terapia combinada na manutenção por períodos longos das células CD4 na doença por HIV em alteração média em linfóci-tos CD4T durante o número de semanas indicado. relaciona o número de dias de terapia combinada (AZT e ARNdc) com a alteração em percentagem no nível médio de linfócitos T4, mostrando que o ARNdc Ampligen(R) prolonga o período de estabilização das células T4 na doença por HIV para além do previsto com AZT isolada. Indicam-se as doses médias para cada membro da combinação. é um gráfico que relaciona o número de dias em regime combinado de Ampligen^R^ e AZT com a alteração média (aumento) em percentagem nas células T4, amostrando que o Ampligen^R^ faz aumentar e/ou estabilizar os níveis de células T4 na doença por HIV para além do período de tempo durante o qual a AZT é eficaz. é um gráfico que relaciona a proporção de pacien tes com HIV sem ocorrências críticas durante um período de 12 meses para a administração de placebo, de AZT isolada, a monoterapia com Ampli-gen^R) e a terapia combinada de Ampligen^ e AZT. 6
Nas Figuras 4 e 6 o número de pacien tes é indicado próximo dos pontos correspondentes aos dados relevantes entre parêntesis, enquanto que nas Figuras 3 e 5 é indicado por "N=".
Na Figura 2 a co-cultura de HIV foi efectuada conforme descrito na referência 3 usando células mononucleares de sangue periférico (CMSP) dos casos 1 e 3. Após 4, 7 e 14 dias de co-cultura, as CMSP foram recolhidas e dissolvidas numa solução de cianato da guanidina usada para dissolver as células e libertar os componentes virais. Mediu--se o ARN do HIV por hibridação molecular conforme descrito em seguida mais em pormenor. A Figura 1 mostra o desenvolvimento de ocorrências críticas (desenvolvimento de SIDA completamente desencadeada ou falecimento) num grupo de veteranos referido publicamente com frequência formado por pacientes infeç tados por HIV tratados "precocemente" (por exemplo antes da ocorrência de sintomas como sejam perda de peso, suores noc-turnos, etc,) ou "tardiamente" (isto é, após a ocorrência dos sintomas referidos incluindo infecções associadas ao HIV causadas por fungos ou bactérias) com AZT. É evidente a partir da observação da Figura 1 que a administração "precoce" de AZT não prolonga a vida. As amostras de sangue são colhidas de indivíduos que de senvolveram afecções críticas mostra um enriquecimento na con centração de vírus resistentes à AZT (seguidamente designados •p * por ΑΖΤΛ) enquanto que os pacientes que permaneceram sem afeç ções críticas durante uma observação com uma duração de apro-ximadamente 40 meses tinham geralmente mais vírus sensíveis à AZT (AZT®).
Em seguida caracterizo mais em por menor as sensibilidades relativas à AZT de fracções isoladas de HIV (típicas recolhidas de indivíduos cujas doenças progri dem apesar da terapia com AZT e comparo estes resultados com fracções isoladas virais incluindo de vírus de hepatite de pacientes cuja doença se encontra relativamente mais contro-| lada. É evidente que o aparecimento de vírus AZTR contribuem • para um encurtamento da esperança de vida. São exemplos de re 7
trovirus humanos típicos o HTLV-l, o HTLV-2 e o HTLV-3 e vírus que se multiplicam por meio de mecanismos semelhantes incluindo determinados vírus da hepatite.
Descrevo na presente memória uma invenção que contribui para resolver este problema actualmente insolúvel. A presente invenção pode ser praticada de múltiplos modos incluindo: (a) reduzindo o aparecimento de vírus AZTR por utilização de classes específicas de ARNdc's antes da exposição do vírus a AZT ou de outros análogos e (b) ultrapassando as proprxedades letais do HIV AZT (ou de outros vírus resistentes análogos) por adição de AKNdc ao regime. 0 regime de ARNdc/análogo nucleosídico mostra uma sinergia inesperada contra o HIV AZTR sem uma toxicidade sinergística correspondente e deste modo constitui verdadeiramente uma combinação singular e inesperadamente útil de fãrmacos que pode contribuir para salvar vidas quando usada correctamente.
Obteve-se uma pista de como o tratamento combinado com Ampligen(R)-AZT reduz a carga virai do HIV por meio dos meus estudos baseados segundo os quais se usaram vírus sem células obtidos a partir de pacientes a que foi administrada uma monoterapia de Ampligenou de AZT ou um tratamento combinado com Ampligen(R)-AZT a fim de infectar células de sangue periférico humano fresco que tinham sido an teriormente expostas a Ampligen(R), a AZT ou a Ampligen(R) e AZT. Os vírus do paciente a quem foi administrada uma monoterapia de apenas AZT durante mais de um ano eram insensíveis a AZT (AZT 0,5 μΜ = inibição de 4 %; ED50 < 5 μΜ) mas era tão sensível ao Ampligen (R) isolado como o vírus HIV de tipo selvagem (Ampligen(R) 0,5 μg/ml=inibição de 80%; 0,5 μg/ml ED50 < 0,5 μg/ml). Para além disso, a combinação Ampligen(R)-AZT causou uma inibição superior do HIV (93%) que o Ampligen(R) isolado. Os vírus dos pacientes a quem foi administrado o Ampligen isolado ou a combinação Ampligen-AZT apresentavam uma resistência relativa à AZT, eram sensíveis ao Ampli- * gen^R) e eram ainda mais sensíveis à combinação Ampligen- • -AZT. Quando se compararam resultados com muitas fracções 8 isoladas virais de pacientes com diferentes programas de terapia, tornou-se evidente que os vírus de pacientes a quem foi administrado Ampligen(R) antes da exposição à AZT eram mais sensíveis à AZT (bem como a outros análogos nucleosídi-cos) do que os vírus derivados de pacientes a quem se administrara AZT em primeiro lugar. QUADRO 1
RESISTÊNCIA AOS FÁRMACOS DE FRACCÕES DE HIV
Fracção de HIV Ampligen(R) ed50 (Mg/ml AZT ED50 (/xg/molar) índice da combinação Fenótipo em relação a AZT H112-2 2 0,03 0,5 sensível 6910-6 3 2 0,2 resistente Caso ns 1 1 0,6 0,4 parcialmente resistente Caso nQ 2 1 0,2 0,2 parcialmente resistente Caso ns 3 0,5 > 5 0,2 resistente Caso ns 4 1 > 5 0,8 resistente Caso n2 5 0,5 > 5 0,2 resistente Caso ns 6 2 > 5 0,3 resistente a = A interacção AZT-Ampligen^R^ foi determinada por análise isóbola (referência 4). 0 índice de combinação (IC) é definido por IC + (Ac/Ag) + (Bc/Bs),em que Ac e Bc são as concentrações dos fármacos usados no tratamento com a combinação e Ag e Bg são as concentrações dos fármacos que, quando usados isoladamente, dão o mesmo efeito que o tratamento combinado. Quando IC < 1 os fármacos são sinergísticos, quando IC = 1 os fármacos são aditivos e quando IC > 1 os fármacos são antagonistas. Por ED50 estende-se a dose que inibe in vitro a multiplicação do vírus a 50%. 9 1
Na Figura 2, I representa uma forma de concretização típica da presente invenção na qual a utilização precoce de Ampligen^) ou a sua utilização simultânea com a AZT tem de facto como resultado um benefício substancial em termos de abaixamento da concentração corporal de vírus prejudiciais como por exemplo retrovírus. A curva de produção em crescimento rápido de ARN (ácido ribonucleico) virai representada por círculos em branco indica um crescimento virai descontrolado, enquanto que as duas linhas quase horizontais ilustram um bom controlo da produção de vírus por meio da abordagem por combinação. Os círculos em branco na Fi gura 2 ilustrativos do desenvolvimento rápido de vírus AZTR simbolizam por conseguinte o paciente típico da Figua 1 que, quando lhe é administrada AZT isoladamente, procede o seu avanço para fases mais terminais da doença.
Alguns ARNdc's e notavelmente os ARNdc's desemparelhados mostram uma inibição sinergística dos retrovírus quando combinados com AZT (ou com outros análogos nucleosídicos) qualquer que seja o fenótipo de resistência ao fármaco (Quadro 1). Por H112-2 e 6910-6 representam-se clones protótipos bera caracterizados que apresentam sensibilidade e resistência típica, respectivamente, enquanto que do caso n® 1 ao caso ns 6 se trata de vírus isolados de pacientes específicos expostos a vários regimes (por exemplo os pacientes nss 1, 2 e 3 são os mesmos da Figura 2 e os pacientes 4, 5 e 6 foram tratados inicialmente apenas com AZT, como se representa na Figura 1).
Quando eu utilizei em clínica a combinação de fármacos em conjunto, os resultados foram novamente inesperados e de modo nenhum previsíveis a partir dos resultados clínicos observados dos dois fármacos administrados em separado (monoterapia). Por exemplo, a AZT (e outros análogos) administrada isoladamente provoca um aumento transitório de determinadas células imunes (referência 5) , designadas por células CD4, que se encontram entre as células imunes mais favorecidas para o ataque por determinados re- * trovírus e por determinados vírus de herpes (especialmente • HHV 6) . Após este aumento transitório (observado após aproxi- 10
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madamente cerca de 12 a 16 semanas), o número de células imunes deteriora-se à medida que o HIV prolifera e que se dá o aparecimento de HIV AZTR (Figura 3). 0 número entre parêntesis refere-se ao número de indivíduos estudados. Por comparação, o Ampligen(R) isoladamente causa uma "linha" horizontal do número de células CD4 ao longo do tempo (Figura 30, por exemplo, o número de células imunes não aumenta nem diminui (por outras palavras, o número de células encontra-se estabilizado) a doses de Ampligen(R) de aproximadamente 400 a 500 mg administradas duas vezes por semana por perfusão IV.
Aos pacientes que receberam a mono-terapia de AZT foram administrados 2 00 mg por via oral de 4 em 4 horas, diãriamente (1200 mg/dia). Aos pacientes com mo-noterapia de Ampligen^^ foi administrado um mínimo de duas. perfusões por via IV por semana (dose média entre 463 e 555 mg por semana) . [Os pacientes a quem foi administrado o tratamento combinado apresentado na Figura 4 receberam por perfusão doses típicas de "Ampligen^ de 400 mg duas vezes por semana com uma dose média diária de AZT concomitante de entre 300 e 540 mg]. A tendência na alteração média nos linfõcitos T4 para os grupos a quem foi administrado placebo e a monoterapia com AZT (após 26 semanas) este em concordância com a evidência de que o curso da doença é inexoravelmente no sentido do agravamento. Sem intervenção terapêutica eficaz a alteração média nas contagens de linfócitos dos pacientes a quem foi administrado placebo é no sentido de decréscimo. Após um aumento inicial, mesmo os pacientes que recebiam monoterapia de AZT experimentaram uma deterioração nas suas contagens médias de células T4 e deu-se o aparecimento de HIV AZTr. Este decréscimo a partir da semana 12 parece acompanhar o decréscimo verificado nos pacientes que recebiam placebo.
Uma comparação dos declives pelo método estatístico das linhas de regressão linear construídas a partir da alteração no número médio de células T4 a partir da semana 12 para os grupos com monoterapia com AZT e com placebo mostra que estes eram significativamente diferentes (p < 11 τ
0,01 e ρ < 0,01, respectivamente) de um declive de 0, que representa "ausência de alteração" nos níveis médios de células T4. A "ausência de alteração " representa tipicamente uma estabilização da afecção imunológica, um "declive negativo" representa uma deterioração da doença, mas o resultado mais desejável é um declive positivo que sugere uma recuperação da doença (imune), e este resultado não pode ser obtido pelos re gimes de monoterapia estudados. 0 Ampligen^ isoladamente anula o declíneo esperado das células CD4 após doze semanas de monoterapia com AZT ou placebo. 0 declive da linha de regressão da série do nível médio das células CD4 durante o tratamento com Ampligen(R) não é estatisticamente diferente da linha horizontal que reflecte a ausência de perda de células CD4 ao longo do tempo
Valor de P p > 0,2 p < 0,01 p < 0,01
Ampligen(R) AZT Placebo
Comparação do declive com a horizontal (sem alteração) não significativo significativo significativo A monoterapia com Ampligen(R) (Figura 3) anula o grave decréscimo no número médio de linfóci-tos T4 verificado tanto nos pacientes a quem foi administrado placebo como nos pacientes tratados com AZT (após um aumento transitório durante doze demanas), mas o nível médio de lin-fócitos T4 não aumenta. Para além disso, no grupo tratado com Ampligen(R), o pequeno decréscimo (estatisticamente não significativo) no número médio de linfócitos T4 observado num ano (Figura 3) pode ser facilmente invertido provocando deste modo uma estabilização do número de linfócitos T4 ainda mais significativa por meio do aumento de dose para valores superiores a 200 mg duas vezes por semana (valores não apresentados) . 0 declive de uma linha de regressão construída a partir da alteração no número médio de células T4 observado a partir da semana 12 no grupo submetido a monoterapia com Am- 12
pligen^) não foi significativamente diferente de 0, indicando por conseguinte uma estabilização da doença. Os grupos tratados com monoterapia com Ampligen ^, com monoterapia com AZT ou com placebo apresentados na Figura 3 tinham valores de média e da mediana dos níveis absolutos de linfõcitos T4 (também chamados células CD4) aproximadamente equivalentes. Comparei em seguida estes grupos com um novo grupo a quem foi administrado um tratamento combinado de Ampligene AZT. O novo grupo tinha de facto níveis médios e absolutos mais baixos (aproximadamente 33%) deste indicador prognóstico da progressão da infecção com HIV, indicando por conseguinte que os pacientes que o constituíam estavam em maior risco de morte ou de outras "ocorrências críticas".
Os efeitos relativos do Ampligen e da AZT na manutenção de longo prazo do número de células CD4 por mm3 em doentes com HIV são apresentados no quadro seguinte. QUADRO 2
Tratamento Número de Pacientes Linha de Mediana base Média Mediana absoluta da alteração no número de células CD4 ao fim de 1 ano Ampligen + AZT 11 201 248 +15 só Ampligen (R) 54 311 350 -15 só AZT 260 3501 355 -281 Placebo 253 3591 356 -591 13 1
Estimativa reduzida nos dados resumidos na referência 5
Conforme se nota na Figura 3, ao ter-se completado 1 ano de tratamento, a mediana do número absoluto de linfócitos T4 diminuiu de 59 células aproximadamente 4,9 células por mês) nos pacientes a quem foi admi- nistrado placebo; diminuiu 28 células (aproximadamente 2,3 u
células por mês nos pacientes que receberam a monoterapia de AZT; e diminuiu ligeiramente, 15 células aproximadamente 1,25 células por mês), nos pacientes que receberam a monoterapia de Ampligen(R). No entanto, o grupo a que foi administrada a terapia combinada de Ampligen^R^ e AZT, que tinham os níveis absolutos de linfócitos T4 mais baixos tanto em mediana como em média antes do tratamento (estando portanto em maior risco) experimentaram de facto um aumento no nível médio absoluto de células T4 de 15 células mesmo após um ano do regime combinado. Estes resultados estão resumidos no Quadro 2 e são apresentados mais em pormenor na Figura 4. A Figura 4 demonstra as alterações em série nos níveis médicos de linfócitos durante 1 ano de tratamento combinado, as quais podem ser comparadas com os efeitos da monoterapia com Ampligen^R^, da monoterapia com AZT e do placebo na Figura 3. A linha de base para a comparação é calculada a partir da série de números médios absolutos de linfócitos T4 dos pacientes medidos durante 'o período de três meses imediatamente antes do início da terapia combinada. 0 aumento observado no primeiro período de dezanove dias está em concordância com o anterior-mente descrito para o início da monoterapia com AZT conforme se pode observar na Figura 3 anterior. No entanto, os aumentos subsequentes, verificados a partir do dia 180 até ao dia 540 da terapia combinada, são estatisticamente significativos e não são observados em pacientes que receberam a monoterapia com AZT. (Uma análise não paramétrica confirmou um aumento estatisticamente significativo (p < 0,05) nas contagens de células T4 em 1 ano. Esta análise foi efectuada em virtude da possibilidade de que os níveis em células T4 não fossem distribuídos normalmente devido à dimensão relativamente pequena da amostra). Deste modo, a duração do aumento de linfócitos T4 é mais prolongada do que o aumento transitório de 3 a 6 meses esperado pela monoterapia com AZT e deve ser atribuída à presença de ARNdc. Para além disso, este efeito foi observado com doses relativamente baixas tanto de ARNdc como de AZT. Esta observação está em concordância com verificações 14
anteriores de que, a uma dose de apenas 200 mg quatro vezes por semana durante 1 a 4 meses, a monoterapia com Ampligen(R) estabilizou o decréscimo do número de células T4 esperado em pacientes infectados por HIV e sem tratamento (T4 =60 a 300 células/mm3 e que este efeito foi sustentado quando os pacientes continuaram com o mesmo tratamento durante 5 a 8 meses (Figura 3).
Construiu-se uma linha de regressão (Figura 5) a partir da alteração média de percentagem nas con tagens de linfócitos T4 desde o dia 135 até ao dia 630 de terapia combinada de ARNdc e AZT. A média da contagem de lín-fócitos de série T4 de cada paciente durante 91 a 180 dias do regime de tratamento combinado serviu como linha de base para a determinação das mudanças de percentagem. Esta linha de base foi seleccionada como um ponto após o qual o efeito antecipado da AZT sobre os níveis de células T4 se dissipava norma lmente.
Usando métodos estatísticos, o decli ve positivo da linha de regressão e os declives dos limites de confiança de 95% indicam que a terapia combinada de Ampligen(R) com AZT anulou com êxito o decréscimo de longo prazo das células T4 esperado em pacientes sem tratamento (4 a 6 células por mês) ou os de longo prazo (> 6 meses) da monoterapia com AZT. Deste modo o tratamento com a combinação sustenta de facto os níveis de células T4 indefinidamente e durante períodos de tempo muito mais prolongados do que ante-riormente observado com a monoterapia com AZT e este facto ilustra uma utilidade básica da minha invenção sobre os vírus resistentes e nucleósidos, especialmente os retrovírus.
Finalmente a Figura 6 corrobora a utilidade da minha invenção ao apresentar a proporção de pacientes em que se verificou o progresso até uma infecção opor tunistíca dependente da SIDA, um linfoma, ("ocorrência crítica") , enquanto lhes era administrado um placebo, uma monoterapia de AZT, uma monoterapia de Ampligen(R) ou uma terapia combinada de Ampligen(R) e AZT. * Conforme se indica na Figura 6, apro • ximadamente 10% dos pacientes a quem era administrado placebo 15
sofreram uma ocorrência crítica durante o período de observação de 6 meses. Os números de pacientes no início, ao fim do mês 6 e ao fim do mês 12 do estudo são indicados entre parêntesis. Dos pacientes a quem foi administrada AZT, aproxi-madamente 4% sofreram uma ocorrência critica durante este período, é de notar especialmente que se evitou a formação esperada de tumores quando se administra apenas AZT (referência 6) por meio do tratamento combinado. Para além disso, nenhum paciente neste estudo com uma contagem absoluta de linfócitos T4 superior a 115 células/mm3 no início sofreu uma ocorrência crítica enquanto lhes era administrado Ampligen^R^ simultânea mente com AZT, embora estivessem mais sujeitos a este risco devido aos sistemas imunes marcadamente deteriorados antes do início do regime de combinação, tendo um nível médio de células CD4 de apenas 201 como linha de base (Quadro 2).
Em simultâneo com a prática da presente invenção é possível adicionar judiciosamente linfoqui-nas, como por exemplo interleuqunas e interferões, após o estabelecimento do controlo de replicação virai.
REFERÊNCIAS CITADAS 1. 2. 3. 4.
Larder, B. A. et al pp. 436-441 Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Vol. 34, March 1990.
Larder, B. A. et al. pp. 1731-1734, Science, Vol. 243, 1989.
Jackson, J.B. et al. pp. 1416-1418. Journal Clin. Microbiology, Vol. 216, 1990; Thompson J. D. et al. pp. 371-378, Analytical Biochem Vol. 182, 1989.
Berenbaum, M. C. pp. 269-333. Advances in Câncer Research Vol. 35, 1981.
Fischl, M. et al. p. 727-733, Annals of Internai Medicine Vol. 112, 1990.
Pluda, J. M. et al pp. 276-282
Annals pf Internai Medicine, Vol. 113 (number 4, 1990. 16 5.
Claims (3)
- REIVINDICAÇÕES - ia - Composição farmacêutica útil para re tardar, reduzir ou simultaneamente retardar e reduzir o apare cimento de vírus resistentes e análogos nucleosídicos num paciente com uma infecção por HIV, destinada a ser administrada, antes da terapia com um agente anti-retroviral constituído por um análogo nucleosídico, caracterizada por conter uma quantidade eficaz de um ARNdc (ácido ribonucleido de cadeia dupla) desemparelhado.
- - 2* - Composição farmacêutica útil para combater a morbilidade de células mononucleares do sangue periférico de um paciente infectado com um HIV resistente a um análogo nucleosídico caracterizada por conter uma quan tidade eficaz de um ARNdc desemparelhado.
- - 3» - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser adequada para administrar ao paciente antes da terapia com um agente anti--retroviral constituído por um análogo nucleosídico. - 4ã - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada por as referidas células serem linfócitos CD4. - 5» - Composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizada por o ARNdc desemparelhado ser um ácido poliadenílico complexado com ácido poliuridílico. - 6s - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por o ARNdc desemparelhado ser um complexo de poliinosinato e policitidilato que contém de 1 para 5 a 1 para 30 bases de uracilo ou de gua-nina. 17Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6,caracterizada por o ARNdc desemparelha-do ser rln*r(cn_i4/ u)n ou o ARNdc desemparelhado conter regiões de quebra de ligações e apresentar a propriedade propor ção terapêutica favorável de rIn'r(cn_x4/ u)n* - 8ã - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por a quantidade de ARNdc desemparelhado administrada ter como resultado un nível de 2 a 1 000 microgramas de ARNdc desemparelhado por mililitro do sangue da circulação sistémica do paciente. - ga - Composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizada por ARNdc ser um oligonucleótido curto de estrutura definida pela fórmula: 5'fecho-(I)n-fecho 3' 3'fecho-(C)m-fecho 5' em que m e n são ambos superiores a 5 e inferiores a 100, I é monofosfato de inosina, C é monofosfato de citidina ou 5'fecho-[ (ΐ)χΑ]j-fecho 3' 3'fecho-[ (C)yU]k-fecho 5' em que x e y são ambos superiores a 5 e inferiores a 25, j e k são ambos superiores ale inferiores a 10, I e C possuem os significados anteriormente definidos, A é um nucleótido que não é I e U é um nucleótido que forma par de bases com A, ou 5'(I)n-dobradiça-(C)m3' em que m, n, possuem os sigificados anteriormente definidos com a condição de que os fechos numa cadeia são complementares dos fechos de cadeia oposta. 18 - 10» - Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 9,caracterizada por o oligonucleótido ser estabilizado por registos internos de heteropolímero complementar e o fecho ou dobradiça ou ambos conterem regiões de heteropolimero complementar. - llâ - Composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3 caracterizada por o referido agente anti-retroviral análogo nucleosídico ser zidovudina, didesoxiinosina, didesoxicitidina ou uma combinação destes agentes. - 12§ - Composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizada por o referido desemparelhado ARNdc ser rInr^11-14' u^n* A requerente reivindica a prioridade do pedido norte-americano apresentado em 16 de Abril de 1991, sob o número de série 07/686,200. Lisboa, 3 de Abril de 199219
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