PT87996B

PT87996B - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas uteis para a correccao de anormalidades em complexos imunologicos de circulacao e na funcao dos monocitos contendo arn de dupla cadeia

Info

Publication number: PT87996B
Application number: PT87996A
Authority: PT
Inventors: William A Carter
Original assignee: Hem Res Inc
Priority date: 1987-07-17
Filing date: 1988-07-15
Publication date: 1995-03-31
Also published as: EP0300680A2; PT87996A; HUT47432A; EP0300680A3; JPS6490126A; OA08890A; NO882853L; AU1820588A; FI883352A0; CA1326999C; NZ225310A; NO175023C; CN1035050A; JP2601520B2; IE76914B1; IE881894L; ES2093607T3; DE3855527T2; AU1761195A; DK399288D0

Description

EPÍGRAFE: » PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES

FARMACÊUTICAS ÚTEIS PARA A CORRECÇÃO DE ANORMALIDADES EM COMPLEXOS IMUNOLÓGICOS DE CIRCULAÇÃO E NA FUNÇÃO DOS MONÔCITOS CCN TENDO ARN DE DUPLA CADEIA

INVENTORES: Dr.William A.Cárter.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos da América em 17 de Julho de 1987 sob o n^e. 074,616 e em 24 de Novembro de 1987, sob o n^s. 124,577.

INPl. MOO. 113 R F 16732

Descrição da patente de invenção de HEM Research, Inc., norte-americana, industrial e comercial, estabelecida em 12280 Wilkins Avenue, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos da América (inventor: Dr. William A. Cárter, residente nos Estados Unidos da América) para

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ÚTEIS

PARA A GORRECÇÀO DE ANORMALIDADES EM COMPLEXOS IMUNOLOGICOS DE CIRCULAÇÃO E NA FUNÇ&O

DOS MONOCITOS CONTENDO ARN

DE DUPLA CADEIA

Descrição

GSP *

Várias afecçães inflamatórias importantes do homem são caracterizadas por complexos imunológicos em circulação (CIC), os quais são prihcipalmente complexos anticorpo-antigene no soro. Os CICs persistentes estão etiologicamente associados com várias doenças, incluindo lupus er tmatoso sistémico (LES), artrite reumatóide (AR), várias doenças malignas, HIV, bem como com doenças infecciosas devidas a outros virus, a bactérias e a parasitas. 0 processo normal de desaparecimento dos CICs, isto é, a eliminação por monócitos/macrófagos, após o seu transporte para o fígado i—

é também prejudicado nas doenças mencionadas e ainda em outras doenças relacionadas. Deste modo, as afecções associadas das funçSes dos monócitos do sangue periférico e a capacidade fagocítica são normalmente observadas nestes grupos de pacientes idênticos; colectivamente, estas deficiências podem muitas vezes levar à destruição inflamatória maciça de vários tecidos do corpo bem como à diminuição da capacidade para resistir a vários agentes patogénicos bacterianos, virais e fúngicos aos quais estes individuos estão inevitavelmente expostos.

Descrevo na presente memória descritiva um novo processo por meio do qual a maioria destes defeitos funcionais podem ser controlados com uma melhoria simultânea do estado clinico.

Especificamente, descrevo um procedimento que utiliza ARNs de dupla cadeia que simultaneamente reduzem as deposições de produtos imunológicos anormais de CIO e também melhoram a função dos monócitos — todos estes efeitos inconvenientes para os seres humanos. Também se descrevem procedimentos para protecção das células derivadas do timo e da medula óesea de infecções e/ou difusã de virus segundo o qual se administra uma quantidade eficaz de ARNdc emparelhado ou desemparelhado com capacidade de conferir resistência aos virus sem toxicidade celular adversa.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A formação dos complexos imunológicos inicia-se normalmente como um processo benigno de um sistema imune funcionando normalmente mas pode dar origem a lesões de vários órgãos e tecidos. A actividade do complemento, um produto normal do sangue, pelos CIC pode conduzir a uma série de acontecimentos destrutivos, incluindo a lise celular e a deposição de CICs em várias paredes de vasos, membranas de células, etc.. Os antigenes responsáveis pelo

inicio desta resposta imune patogénica são frequentemente desconhecidos na prática clinica específica mas podem ser microorganismos, tumores ou mesmo os próprios tecidos do corpo. Também algumas doenças, como a hepatite B, podem ser acompanhadas por afecções do complexo imune. Os CIGs tem sido até agora relacionados com o diagnóstico e com a medição da eficiência da terapia em várias situações clínicas de tal modo que, nos últimos 10 anos, foram desenvolvidas mais de 40 métodos de análise para detectar e quantificar estes complexos imunes em líquidos patológicos humanos. Várias brochuras de produtos preparados por importantes empresas industriais, por exemplo uma brochura do Maryland Medicai Laboratory designada por 4/87 ou uma brochura dos Roche Biomedical Laboratories preparada em 1987, indicam quais as doenças associadas com os CICs e atestam a grandeza dos problemas químicos relacionados com o aumento de produção de CICs no homem.

Os CICs podem, na verdade, conter parti cuias viricas, como no caso da inclusão de vírus do próprio HIV emCICs de doentes com SIDA (Morrow et al., Clin. Immunolog.y and Immuno Pathology, Vol. 40, p. 515, 1986). Os CICs, especialmente se estiverem presentes em concentrações elevadas, podem causar realmente um efeito imunossupressivo e podem mesmo causar o bloqueamento do sistema reticuloendotelial vital para o organismo (ver referências citadas em Morrow et al.). Deste modo, os Cls em circulação podem constituir uma das razões para o funcionamento anormal de monócitos-macrófagos em muitas doenças humanas e de animais. Em concordância, é evidente que, enquanto que a formação de pequenas quantidades de CI podem fazer parte de uma resposta patofisiológica normal à doença, e síntese em excesso de CI causará e/ou acelerará várias doenças.

A formação de complexos imunes constitui ikm parâmetro útil particularmente na avaliação de doenças reumáticas, como seja artrite reumatóide e lupus sistémico. De um modoespecífico, parece que níveis elevados de

complexos imunes permitem a despistagem da actividade patológica em muitos doentes ao longo do tempo.

Entre os métodos usados para a avaliação dos CICs no homem figura o método de análise do receptor CRI, uma glicoproteína que se liga a certos fragmentos í (principalmente a C3G e a C4G) do sistema complemento. Os eritrócitos, ou glóbulos vermelhos (GVs) contém à superfície a maior parte dos receptores CRI em circulação no corpo. Aparentemente são os receptores CRI que conferem aos GVs a capacidade de retirar os CICs transportando-os para o fígado, de onde s~o eliminados pelos monócitos/macrófagos locais (ver (Tusk et al., J. Clin. Investigation, Vol. 78, P. 977, 1986, e artigos citados nesta referência ). Várias doen ças que envolvem autoanticorpos e CIC, tais como artrite, lepra e SIDA, estão associados com baixos níveis de CRI dos eritrócitos.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção prepara-se uma composição farmacêutica útil para o tratamento de doenças inflamatórias por incorporação de um ARNdc, de preferência de um ARNdc desemparelhado. Uma causa subjacente das afecções inflamatórias está na ausência de disponibilidade de receptores CRI e no aumento de níveis de C^ em circulação, conforme explicado seguidamente em pormenor. Estes indicadores são feitos voltar ao normal pelo tratamento com ARNdc.

Estudei um grupo de indivíduos com sinais de infecção por HIV anterior a fim de determinar as várias relações entre o nível de CIC, o nível de CRI e a gravidade da doença (estado clínico).

Para além disso, utilizei outros ensaios (designados como ensaio directo do Coombs) a fim de determinar se os complexos imunes estavam ligados aos GVs dos pa- 4 -

cientes e em que medida os respectivos sistemas reticuloendoteliais eram operacionais após levar a cabo estas medições da base de medida, de acordo com a função e o número de monócitos. Verifiquei que era possível eliminar tanto as duas afecções imunológicas como o estado clínico deteriorado de uma maneira coordenada por administração de certas moléculas de ARNdcs.

Em primeiro lugar seieccionei indivíduos com uma história anterior de exposição a HIV, uma afecção imunológica prototípica, porque (a) estes indivíduos tinham demonstrado ser o grupo protópipo manifestando altos níveis de complexos imunes (ver McDougal et al., J. Clin. Immun., Vol. 5, p. 130. 1985 e referências citadas neste trabalho), (b) o microorganismo causador (etiológico) é conhecido e (c) a doença possui uma importância sem precedentes nas crónicas da saúde pública. Por outro lado, foram anteriormente investigadas várias modalidades terapêuticas — produtos químicos e produtos biológicos — (interferões, interleuquinas, extractos de timo, isoprinosina, fracções polipeptídicas derivados do timo, etc.) e nenhuma destas tinha mostrado qualquer capacidade demonstrável de alterar as profundas alterações imunológicas ou o curso clínico inexorável de deterioração. Por fim, existem muitas razões que levam a pensar que a identificação de um novo regime terapêutico que leve a uma diminuição da formação de complexos imunes ou ao aumento da sua eliminação possa.ter ramificações profundas em muitas outras doenças. De facto, uma nova evidência indica que a diminuição progressiva da actividade de CRI (devida à formação progressiva de CIC) está associada com o progresso das doenças por retrovírus/inflamatórias a partir de um estado de portador assintomático até à condição terminal de moribundo (ver Inada et al., AIDS Research, Vol. 2, p. 235, 1966 e referências citadas neste trabalho).

Por ARNdc emparelhado entende-se um

ARNdc no qual as ligações de hidrogénio (empilhamento de

bases) entre as duas cadeias que o formam estão relativamente intactas, isto é, estão interrompidas em média menos de um par de bases em cada 29 resíduos consecutivos de bases.

A expressão ARNdc desempareihado deve ser entendido em concordância.

ARNdc pode ser um complexo de um poliinosinato e de um policitidilato contendo uma proporção de bases de uracilo ou de bases de guanidina, por exemplo, desde 1 em 5 até 1 em 30 destas bases (poli I.poli (C^-C^g x / U ou G).

ARNdc pode ter a fórmula geral rlp-r(C,U)_fi, Posteriormente discutem-se outros exemplos adequados de ARNdc's.

Os ARNdc¹s preferidos para a utiliza ção na presente invenção são baseados em copolinucleótidos seleccionados de entre poli (C_n,U) e poli (C_n,G) nos quais n é um número inteiro com um valor desde 4 até 29 e são análogos desemparelhados de complexos dos ácidos polirriboinosínico e polirribocitidílico formados por modificação de rI_n.rC_n a fim de se incorporar bases, desemparalhadas (uracilo e guadidina) ao longo da cadeia de polirribocitidilato (rC_n). Am alternativa, o ARNdc pode ser derivado do ARNdc poli (I). poli (C) por modificação do esqueleto de ácido polirriboinosínico (rl_n), por exemplo por inclusão de resíduos de 2'-0-metilo-ribosilo, Estas complexos desemparelhados podem ser complexados com um polímero de estabilidade de ARN, como seja a lisina ou a celulose. Estes análogos desemparelhados de rI_n,rC_n, dos quais são preferidos os da fórmula geral rI_n.r(C₁₁_₁^,U)_n rInlr(C₂g,G)_n, são descritos por Cárter e Ts'o nas Patentes US 4 130 641 e 4 024 222 que aqui se dão por re*-. produzi da s. Os ARNdc' s descritos nessas publicações são geralmente adequados para utilização na presente invenção.

Outros exemplos de ARNdc's desemparelhados úteis para utilização na presente invenção os seguintes

poli	(I) ·	poli	(c₄,u)
poli	(I) .	poli	(C₇,U)
poli	(I).	poli	(c₁₅,u)
poli	(I) ·	poli	(C₂2’^U)
poli	(I) .	poli	(c₂₀,g)
poli	(I) .	poli(	.C₂g»G) e
poli	(I) ·	poli	(C_p) 23 G > p

De acordo com a utilização que lhes é dado na presente memória descritiva, o termo linfoquin ,s inclui os interferães, de preferência o interferão alfa, as interêuquinas, especificamente a interleuquina 1 (IL-1), e a interleuquina-2 recombinante (rIL-2) e o factor de necrose de tumor (TNP). Também se consideram incluídas as células destruidoras activadas por linfoquina (lymphokine activated killer cells = LAK) formadas em animais em resposta à exposição a uma linfoquina.

Quando a linfoquina usada é o interferão (alfa), proporciona-se uma quantidade desde 0,01 até 100 000 IEU por mililitro de fluído corporal do paciente. Quando a linfoquina é a IL-2, de preferência a rIL-2, a quantidade administrada situa-se numa gama desde cerca de 2 unidades de IL-2 por kg de peso corporal do paciente até um valor próximo dos níveis inaceitáveis para o paciente devido à toxicidade, os quais podem atingir 10° unidades de IL-2. No entanto os valores que permitem uma margem de manobra perante a recepção tóxica situam-se entre cerca de 10 e cerca de 10 de IL-2 por kg de peso corporal.

As quantidades habituais de ARNdc administrado proporcionam um nível desde 0,1 até 1 000 micro gramas de ARNdc por mililitro do fluído corporal do paciente

Por fluído corporal pretende-se significar uma solução de

soro, sais vitaminas, etc„, que circula no interior do organismo e banha os tecidos. Quando se administram os dois agentes, conforme descrito anteriormente, os dois agentes activos podem ser administrados sob a forma duma mistura, separada mas simultaneamente e sequencialmente₀

A administração de um ARNdc e de uma linfoquina em combinação inclui formas de apresentação em que os dois agentes são administrados em conjunto sob a forma de uma mistura terapêutica e ainda procedimentos em que os dois agentes são administrados separadamente mas simultaneamente, por exemplo por meio de duas linhas intravenosas separadas no mesmo individuo. A administração em combinação inclui ainda a administração separada de uma das substâncias em primeiro lugar seguindo-se a administração da outra pouco tempo depois.

Restauração da Formação alterada de Complexos Imunes pelos ARNdc's: 0 Quadro 1 apresenta os seguintes resultados clínicos representativos antes, durante e depois da administração de um ARNdc, o r^IríC^-·^,^^ tendo-se sido dados 50 a 200 mg duas vezes por semana a individuos com cerca de 60 quiiosgramas. 0 ensaio do Complexo Imune (Inada, 1986, referência citada anteriormente) faz a busca de complexos com capacidade de implementar o processo integral de activação do complemento. Resumida mente, combinam-se em primeiro lugar soro do paciente inactivado termicamente e complemento de cobaia e em seguida reduzem-se (usando dTT, ditiotreitol) e por fim adicionam-se a GYs normais, que servem de células indicadoras, com um conteúdo predeterminado conhecido de receptores CRI livres. Se estive retn presentes complexos imunes no soro do paciente, os GYs indicadores sofrem agregação; estes fenómeno é designado por homoglutinação por aderência imune de IAHA. Euusei o ensaio do receptor CRI livre para determinar o nível de actividade de receptor CRi livre nos GVs do paciente; comparem-se, por exemplo, os resultados no meu Quadro 1 com

os da Inada em vários indivíduos não tratados (conforme se mostra na Figura 1 deste Autor, AIDS Research, Vol. 2,

N8 3, p. 238, 1986)). Em primeiro lugar misturei complexos imunes, complemento e os espíritos de GVs do paciente, de acordo com uma técnica descrita por Inada e bem conhecida dos especialistas da matéria. Se os GVs do paciente possuem receptores CRI disponíveis, os CICs ligam-se de tai modo que quando os GVs indicadores (de individuos normais) sâo adicionados, não se encontram CICs na solução sob forma livre e os GVs indicadores não se agregam. Se ocorrem quaisquer graus de agregação, este facto indica que os espiritos dos GVs do paciente não possuem capacidade para se ligarem aos CICs devido à ausência de receptores CRI disponíveis, A ausência de receptores CRI neste caso parece ser devida à saturação destes receptores pelo aito nível (anormal) de complexos imunes em circulação, Um baixo nível de receptor CRI livre é um mau sinal prognóstico e muitas vezes está relacionado com um alto nível de CICs.·

- 9 Relações entre Níveis de CIC conteúdo de receptor

CRI Livre, Ensaio directo de Coombs e Eficácia da administração de AKRdc sobre a correcção destes parâmetros imunológicos anormais (patogénicos)

Quadro 1

Paciente íematócrito

Complexo

Imune

Receptor livre

CRI

Ensaio directo

			micrograma s/ml		de Coombs
fjo. pré	-tratado	40	32	-	Ig-G, IgM,
♦> í.	semanas	'.0	1 6	+·	IgG, IgM,
··	semanas	5 6	<·,	♦ ♦	IgG, IgM.
8	semanas	60	0	♦ 4	IgG, IgM
1 6	semanas	G 0	0	*44	traços de
íir, pré	-tratado	'.5	6 0	♦	IgM, c 3
	semanas	ó A	ro	•	0
4	semanas	65	0	♦ 4	0
3	semanas	6 5	0	♦ 4	0
1 6	semanas	65	0	4 4 4	0
uja. pré	-tratad o	56	36	4	IgG, IgM. C
4	semanas		23	4 ♦	IcG . C 3
3	semanas	35	1 6	♦ 4 4	içg, traços
:o	semanas	35	4	4 4 4	0
60	semanas	SS	0		0
r-.cn. pré-tratado	54	5C	-	IgG, IçK. C 3
3	semanas	36	4	+	IgG
0	semanas	36	4	♦ *	traços de
					traços de
<10	semanas	36	0	4 4 4	0
Vol	untários	normais	(10) deram resultados negativos para co
plexo imune,	para CRI e negativos	para Coobs.

IgM, ^C3 m-

possível verificar facilmente que eu fui capaz de restaurar estes parâmetros desde doenças inflamatórias para a normalidade essencial por administração de ARNdc. Uma comparação do Quadro 1 através dos dados apresentados no Quadro imediatamente anterior com a Figura 1 e com o Quadro 1 de Inada et al., mostra claramente que os meus resultados com pacientes atingidos pela doença, após administração de ARNdc, se aproximam muito dos valores completamente normais de 37 indivíduos saudáveis relatados por Inada et al. com os mesmos parâmetros laboratoriais compreensivos.

Descrevi acima um resumo da técnica de Inada et al. para o receptor CRI livre que foi usado no contexto da presente invenção. Utilizei também a técnica de Inada et al. Para medir os tipos presentes de moléculas imunes ligadas aos GVs do paciente (ensaio de Coombs directo antes, durante e depois de administração de ARNdc. Especificamente, duas classes de imunoglobulinss — designadas por IgG e IgM — quando ligadas a GVs indicam um processo imune anormal activo. Por exemplo, Inada não encontrou indivíduos normais que apresentassem um ensaio GVs indicam um processo imune anormal activo. Por exemplo, Inada não encontrou indivíduos normais que apresentassem um ensaio directo de Coombs positivo, enquanto que 64 a 84$ dos pacientes cpm infecções por retrovirus activas eram francamente positivas e o grau de positívidade estava correlacionada com o estado clínico. Determinei também se estes GVs continham ou não um revestimento formado por um componente específico do sistema complemento designado por C^, o qual constitui também um indicador adicional de confiança de uma reacção im ne ou inflamatória anormal. Especificamente, a presença de C^ nos GVs indica uma activação do sistema complemento ou da cascata na qual os componentes C^, C^, C₂ θ por fim C^ se ligam sequencialmente aos GVs. Para além disso, demonstrei ainda o facto completamente inesperado de que o ARNdc tinha a capacidade de corrigir a concentração anormal de componen11

tes do sistema inflamatório (por exemplo, as moléculas de I_G, I_M e C_x) ligados aos GVs em circulação do paciente.

E importante notar que a cinética da recuperação de deficientes membros da respostas imune no meu trabalho mostrou também que eu atingia com o ARNdc aparentemente uma causa primária do processo fundamental da doença. Por exemplo, o nível de complexos imunes caiu rapidamente (Quadro 1), em relação com as melhorias rápidas do quadro clínico enquanto que o ensaio directo de Coombs apenas melhorou lentamente. As minhas observações estáo de acordo com a tese de que (a) o desaparecimento (wash out) do resultado anormal do ensaio de Coombs é lento e muitas vezes leva 2 a 3 meses — o tempo de vida aproximado dos eritrócitos — enquanto que (b) os níveis de CIC caiem mais rapidamente porque o seu aparecimento inicialmente se dá normalmente apenas depois da saturação dos GVs com complexos imunes anormais, conforme se determina peio ensaio direc to de Coombs, Uma comparação do meu Quadro 1 (última coluna, dados do ensaio de Coombs directo) com as Figuras 2 e 3 de Inada apresenta uma evidência inegável do efeito que eu pude verdadeiramente corrigir estas afecções imunológicas profundas no meu grupo de pacientes até uma normalidade essencial, conforme definida pelos critérios imunológicos desenvolvidos de modo completamente independente por Inada et al. com um grupo de população completamente saudável e normal; note-se, por exemplo, que no grupo de Inada nenhum, individuo saudável tinha determinantes de imunoglobulina ou fragmentos de complemento C^ detectáveis nos respectivos GVs.

Restauração da função alterada dos monócitos sanguíneos: Embora as funções dos monócitos-macrófagos desempenhem um papel central (a) no início e na modulação da resposta imune bem como (b) no mecanismo de defesa contra os microrganismos, estas células tem sido pouco estudadas; ver Roux-Lombard et al., European J. of Clin. Investigation, Vol. 16, p. 262, 1986 e referências

eitadas neste trabalho. Por exemplo, os monócitos/matrófagos podem fagocirtar (engolir) vários microorganismos e produzir intermediários que apresentam reacção ao oxigénio com alto poder bactericida. Estas células também podem segregar prostaglandinas que, como se sabe, alteram as funções das células T. Deste modo, tomando em consideração o papel complementar e de charneira na modulação imune face aos outros parâmetros que examinei no Quadro 1, estudei a fagocidade e a capacidade bactericida (uma função crítica) dos monócitos e o número das células periféricas antes, durante e depois da administração de ARNdc num grupo idêntico de individuos.

As células mononucleares foram obtidas por mim a partir de sangue heparinizado por centrifugação de gradiente de densidade em Picoll-Hypaque. A viabilidade destas células era superior a 95%, de acordo com o ensaio de exclusão do corante azul de tripan. Em seguida medi as subpopulaçães de monócitos e de linfócitos T por meio de utilização de anticorpos monoclonais padrão, incluin do MC>2 (para monócitos), OKT^, OKT^, OKTg, etc., seguida de imunoglobulinas de cabra anti-rato conjugadas com fluoresceina obtidas de Ortho Diagnostics, inc., Raritan, New Jersey,EUA, a fim de facilitar a sua enumeração.

Quadro 2

Restauração da Função/Número de Monócitos no Sangue Reduzidos era Indivíduos cora Complexos Imunológicos em Circulação por administração de ARNdc

Raciente $ de Monócitos Número de Monócitos (Marcador M0₂) (por ml) %de Bactérias Mortas (gama normal= 10-62%)

Pajo, pr 2	é-tratado semanas	1 6	55 330	0 4
4	semanas	12	660	1 0
a	semanas	18	990	18
16	semanas	1 7	935
ciin, pré-tratado	2	I 26	3
c	semanas	8	504	10
6	semanas	lí	819	35
3	semanas	15	945	40
16	semanas	I 9	1 1 97	40
Tuja , pré	-tratado	2	98	0
4	semanas	1 1	539	4
S	semanas	10	4 90	15
20	semana s	12	588	20
40	semana s	18	882	35
Poca . ργ-θ	-tratado	1	40	2
8	semanas	9	315	16
20	se inanas	12	420	24
40	semanas	20	700	40

Avaliei também a capacidade bactericida pela qual a técnica normal usando Staph.ylococcus aureus na presença de soro autóiogo ou de tipo AB de vários dadores (Cruchard et al., Diagnostic immunol.. Vol. 2, p. 203, 1984, cuja descrição se dá por reproduzida), No Quadro 2 os resultados são expressos sob a forma de percentagem de bactérias mortas depois de 1 hora de incubação.

Quadro 2 mostra que ocorre na verdade uma recuperação inesperada e rápida tanto do número como das funções dos monócitos nos individuos sem compromisso que receberam a administração programada do ARNdc desemparelhado da fórmula ri , ^(C-,-, _1A, U) , também designado por Ampligen ' ⁷ (uma marca registada de Hem Research. Inc., de Rockville, Maryland,EUA). Tentativas anteriores de outros autores para restaurar estas funções por meio da utilização de outras linfoquinas nunca tiveram êxito, infelizmente. Quando se comparam os Quadros 1 e 2, torna-se evidente que consegui um efeito com vários aspectos em termo da restauração de múltiplos efeitos da capacidade imunoiógica simultaneamente e que consegui este efeito com uma cinética de resposta favorável e com ausência aparente de toxicidade do rec eptor.

Quadro 3 mostra que o efeito de protecção do ARNdc se esdsende muito para além dos vários componentes do sistema imune das células T. Neste quadro são introduzidos dados a fim de indicar a eficácia do ARNdc na protecção das células da linhagem da medula óssea tais como os monócitos/macrófagos. mas não indicar a eficácia do ARNdc na protecção das células da linhagem da medula óssea tais como os monocitos/macrófagos, mas não limitada a essas células. As célnlas T são consideradas como pertencendo à linhagem derivada do timo e por consequência eu demonstrei na presente memória descritiva a capacidade adicional de certas dosagens de ARNdc's para proteger especificamente células humanas de origem derivada da medula óssea e do timo: isto é, as células podem ser protegidas das infecções

Λ

virais animais sem um efeito adverso detectável sobre as funções celulares normais incluindo os respectivos ciclos de replicação. Utiliza-se um HIV (virus) como protótipo porque este virus é capaz de apresentar um comportamento mimético de outros virus, com potencial citolítico agudo, com potencial citolítico sub-agudo ou mesmo com potencial inte_rativo genómico (potencial de latência e/ou de provocação do cancro).

Quadro 3 confirma o efeito antiviral sobre vários virus isolados (por exemplo, HTLV-IILg e HTLV IIIpp) bem como sobre várias células visadas (por exemplo, células U937 ou H9).

A possibilidade de evitar e/ou de controlar a infecção em células derivadas da medula óssea sem toxicidade é de alta relevância terapêutica uma vez que muitos virus animais usam de facto estas células como reser vatório de origem virai primária ou secundária. Por exemplo o HIV pode usar macrófagos, megacariócitos e várias células que correspondem a factores de estimulação de colónias como um aspecto significativo da sua patogenicidade e da sua capacidade para estapar aos sistemas de imunovigilância do hospedeiro.

rp

Φ

φ

^Φ

S

Ο

Π3

ΤΟ

τΟ

φ

ε

φ

rp

φ

•Ρ

Φ

rp

Φ

ίΧ

Φ

rp

Τ3

X ο

τ3

S

Ό

ε

ΤΟ

ε

τ3

ε

ΤΟ

ε

<0

ο χ

CÚ

\

Ρρ

cn

\ Ρρ

cn

Ρμ

cn

\

ÍP

cn

\

Ρρ

'Ό

'—1—I

•Ό

ε

ΡΙ

το

ε ρ

ΤΟ

e

ρ

τ3

ε

Ρ

ΤΟ

8

ρ

•Ρ

h~1

•Η

χ

Ρ

Οη Ρ

•Ρ

CL

ρ

•Ρ

χ

Ρ

-Ρ

X

Ρ

>

X

>

ο

>

ο

>

Ο

>

CJ

>

Ο

•Ρ

X QJ

•Ρ

-—-

φ

•Ρ

φ

•Ρ

φ

•Ρ

—-

φ

♦Ρ

—'

φ

-Ρ

Ό

-Ρ

Χ5

-Ρ

το

•Ρ

τθ

-Ρ

ΤΟ

ο

QJ

ο

X

ο

ÊP

CJ

£Ρ

ο

Η

φ

X

<

X

<

(X

>.ο ΰ'''»

<

Κ

>,ο

X

ΰ'--

χ <

•π r-X

X .1

Ο

CJ — Γ—

I—I f<~> cn <; ·._,

X

Ο < Ο <£

Ο X > Ο l·--1 κ m ο χ < < I—I S X S\O χ ω

C0

X χ η X χι < C X 03 <

ζ*_

Ο X X X X ί—ι > tz,

OJ ca

X I—I X X 3 co ί-ι ε

-Ρ ο Ε έ ra α θ’ ω

X ο X ω

QJ η to α> c> Ρ •Η Ο Τ3 X Ε ® Ο > ο —-

						1	1		1	1	1
'Ρ		Ρ		Ρ		ρ		Ρ
ο		ο		ο		ο		ο		ο
r—	σ	·—		*—	ο	Τ“	X	’—	ο	*“
χ	ο	X		X	ο	X		X	ο	X	¹
—		σ		co	’	ττ	ΡΊ	ΓΝ		νο	ΡΊ
υτ				cri		ΓΝ		Γ^'		ΡΤ
		LH		Γ--				un
Ο		ο		ο		Ò		ο	ο
	ο	Γ—		r—	ο	r“	οτ		m
X	ο	X	ΡΊ	X	ο	X	•	X	I	ο
ΡΟ		ΡΟ		co			ΓΜ	VJO	ο
						Γ\Ι		00
Ρ		’ΤΓ		Ρ
Ο		ο		Ο	ΡΊ			Ò
«—		’—	m	’—	ΓΧΙ		,_	’—	Γ^*		,—
χ	ο	X		X	¹	ο	V	χ	¹	ο	V
Ο		Ο	ΓΝ	U0	Ο			Ο	ΡΊ
					Γ\ί
ΓΧ		m						m
'77		m
Ο	CO			Ο
1-	’—	,—		1-			,—		ΓΧΙ		1—
X		χ	—	X	ΡΊ	ο	V	ο	¹	ο	V
’ΡΟ	ΡΊ	ο		00					⁵

cn		co		m
	LA				Γ\Ι			I		I
\|	¹	j	V	\|	•	\|	V	1		1	V
	m
ΐ I ί I
X		X
Ρ		Μ	ο	Ρρ		Ρρ
Ρ C	X	m	X	Ε	X ο	X	C	X ο
h-l GJ	Ρ	'	Ρ	3	χ ’jn	χ	QJ	X	LE
I Μ	1		ρ	Μ	χ	X	ω	X
£> ·Ρ	£>	Ε	Ρ	•Ρ	Ρ		X	Ρ	χ
Ρ *—	4	X	QJ	1	rp	1	Ε	I	Ρ	1	Ε
íp PL	X	&0 —'		X	>	QJ	>	X	>	QJ
οο ε	X	cn rp	*Ρ	ε	X	Μ X	X	ε	X	Μ X
\ -7	\	χ ε	Ρ	-<	X ·	η ε		α;	X	χ ε
Γ-		ο-	•Η	X		X X \	X		X	rp
κ> ε			X Μ	\	ε		X Μ	\	ε	\	X bO
σ> qj	cn	ε α	cn	φ	cn	3 Ε	σ>	0)	X	ε ε
χ χ	X	<	X	03	X <	=<	X ω	X	*<

Célula produtora/isolado de HIV-1 usando células U937 como células visadas com e sem Ampligene, conforme indicado .

RT = Transcritase inversa (Reverse transcriptase)

IIP = Imunofluorescencia indirecta (Indirect Imunofluorescence ) expressa em °/o de células positivas usando um soro humano anti-p24.

Claims

Processo para a preparação de uma composição farmacêutica útil para o tratamento de uma afecção inflamatória determinada por elevação de complexos imunológicos em circulação no sangue do paciente caracterizado por se incorporar como principio activo um ARN de dupla cadeia.

- 25 Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a afecção inflamatória ser causada por um microrganismo, como seja um vírus, uma bactéria ou um protozário, por um processo autoimune, artrite reumatóide, hepatite ou lupus eritematoso sistémico.

_ 3â _

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a afecção inflamatória ser classificada como hapatita tipo A, tipo B ou tipo nãoA/B de agen- 18 - te etiológico virai.

- 4- Processo para a preparação de uma composição farmacêutica útil para restaurar a capacidade imunológica do paciente caracterizado por se incorporar como prin cipio activo um ARN de dupla cadeia.

_ 5§ _

Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o ARN de dupla cadeia ser um poli I completado com poli C, de preferência em que o poli I complexado com poli C é adicionalmente complexado com um polímero de estabilização de ARN, como seja lisina ou-celulose.

- 6â Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o ARN de dupla ’ cadeia ser um ácido poiiadenílico complexado com ácido poliuridílico, de preferência desemparelhado.

_ 7§ _

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o ARN de dupla cadeia ser desemparelhado e ser um complexo de um poliinosinato e um policitidilato contendo de 1 a 5 para 1 em 30 base uracilo ou guanidina e de preferência o ARNdc desemparelhado ser rI_n.r(C₁₁_₁₄,U)_n.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por a composição farmacêutica conter uma combinação de um ARN de dupla cadeia e uma linfoquina, como seja um interferão ou uma interieuquina.

_ 9& _

Processo para a preparação de uma composição farmacêutica útil para a protecção de células derivadas do timo ou da medula óssea de infecção virai ou da disseminação virai caracterizado por se incorporar como principio activo um ARN de dupla cadeia emparelhado ou désemperalhado capaz de conferir resistência virai sem toxicidade celular adversa.

- 10® Processo dd acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o ARNdc ser um poli I complexado com poli C.

- 11® Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o poli I complexado com poli C ser adicionalmente complexado com um polímero de estabilização de ARN.

- 12® Processo de acordo com a reivindicação

11, caracterizado por o polímero de estabilização de ARN ser lisina ou celulose.

- 13§ Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o ARNdc ser um ácido poliadenílico complexado com ácido poliuridílico.

- 14® Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o ARN de dupla cadeia serdesemparelhado.

- 15® Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o ARN de dupla cadeia desempareIhado ser um complexo de um poliincosinato e um policitidilato contendo de 1 a 5 para 1 em 30 bases uracilo ou guanidina.

- 16® Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o ARN de dupla cadeia desemparelhado ser rI_n.r(C_i;L__l4,U)_n.

- 17® Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o ARN de dupla cadeia conter regiões de quebra de ligação e apresentar a propriedade da relação terapêutica favorável de rI„.r(C_{13 η}.,υ) n 11-14 n.

- 18^ Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o ARN de dupla cadeia desemparelhado ser incorporado na composição farmacêutica numa quantidade que resulta num nível de 1 a 1000 microgramas por mililitro do fluído corporal do paciente.

A requerente declara que os primeiros pedidos desta patente foram apresentados nos Estados Unidos da América em 17 de Julho de 1987 sob o número de Série 074,616 e em 24 de Novembro de 1987, sob o número de série 124,577.