DD301787A9

DD301787A9 - INHIBITION OF HIV WITH THE HELP OF SYNERGISTIC COMBINATIONS OF NUCLEOSIDE DERIVATIVES

Info

Publication number: DD301787A9
Application number: DD90338833A
Authority: DD
Inventors: Vera Brankovan; Richard J White
Original assignee: Oncogen
Priority date: 1989-03-17
Filing date: 1990-03-16
Publication date: 1994-01-13
Also published as: NO913659L; GR900100189A; CN1045791A; ZW3290A1; NZ232912A; EP0464137A1; HUT57988A; GR1000618B; IL93783A0; CA2050473A1; WO1990011081A1; KR920700653A; HU902898D0; PT93449A; YU53790A; OA09555A; FI914367A0; JPH04504850A; NO913659D0; EP0464137A4

Abstract

Die Erfindung betrifft die Anwendung von synergistischen Kombinationen von Nucelosidderivaten zur Hemmung der Replikation des Humanimmunmangelvirus (HIV) unter Begrenzung der HIV-Infektion. In einer besonderen Ausführungsform zeigt das Purinnucleosidanalogon Dideoxyinosin in Kombination mit dem Pyrimidinnucleosidanalogon 2',3' -Dideoxy-2',3' -didehydrothymidin (d 4 T) eine starke synergistische Wirksamkeit und eine verringerte zelltoxische Wirksamkeit gegenüber Säugerzellen.{In-vitro-Methode; Hemmung; HIV; synergistische Kombination; Nucleosidderivate; 2,3}The invention relates to the use of synergistic combinations of nuceloside derivatives to inhibit human immunodeficiency virus (HIV) replication while limiting HIV infection. In a particular embodiment, the purine nucleoside analogue dideoxyinosine in combination with the pyrimidine nucleoside analogue 2 ', 3'-dideoxy-2', 3'-dehydrothymidine (d 4 T) exhibits potent synergistic activity and reduced cytotoxic activity against mammalian cells. Method; Inhibition; HIV; synergistic combination; nucleoside; 2,3}

Description

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1. Einleitung1 Introduction

Die Erfindung betrifft eine In-vitro-Methode zur Hemmung von HIV unter Verwendung synergistischer Kombinationen von Nucleosidderivaten, sowie die Verwendung dieser Kombinationen von Nucleosidderivaten, zur Hemmung der Replikation des HIV (Immunmangelvirus beim Menschen), wodurch die Wirkungen der HIV-Infektion begrenzt werden. Eine Verwendung derThe invention relates to an in vitro method of inhibiting HIV using synergistic combinations of nucleoside derivatives, and the use of these combinations of nucleoside derivatives to inhibit the replication of HIV (human immunodeficiency virus) thereby limiting the effects of HIV infection. A use of

Nucleosidkombinationen ist sowohl in vitro als auch in vivo möglich. Der Kern der Erfindung liegt in der Feststellung, daß in Kombination verwendete Nucleosidderivate synergistische Wirkungen derart haben, daß die kombinierte effektive Dosis dieser Stoffe niedriger ist als die Summe der therapeutischen Dosierungen jedes einzeln angewendeten Wirkstoffs. Eine erhöhte antiviralo Wirksamkeit hängt nicht mit einer entsprechenden Erhöhung der Zelltoxizität zusammen. Kombinationen von Nucleosidderivaten sind im Vergleich zu identischen Verbindungen, die getrennt verabreicht werden, für nichtinfizierte Zellen sogar weniger toxisch. Die Erfindung betrifft außerdem pharmazeutische Mittel, die solche synergistische Kombinationen enthalten.Nucleoside combinations are possible both in vitro and in vivo. The gist of the invention is the discovery that nucleoside derivatives used in combination have synergistic effects such that the combined effective dose of these agents is less than the sum of the therapeutic dosages of each individual drug employed. Increased antiviral activity is not associated with a corresponding increase in cell toxicity. Combinations of nucleoside derivatives are even less toxic to uninfected cells compared to identical compounds administered separately. The invention also relates to pharmaceutical compositions containing such synergistic combinations.

2. Ausgangssituation der Erfindung2. Initial situation of the invention

2.1. Immunmangelvirus beim Menschen2.1. Immunodeficiency virus in humans

Das menschliche Immunmangelvirua- (HIV) ist ein Humanretrovirus, von dem man annimmt, daß es der Verursacher des erworbenen Immunmangolsyndroms (AIDS) und des AIDS-bezogenen Komplexes (ARC) ist. Das HlV-Virion oder Viruspartikel ist eine Kugel, die ca. 1000 Angstrom-Einheiton im Durchmesser groß ist. Das Partikel ist von einer Lipiddoppelmembran bedeckt, die von der Außonmembran der infizierten Wirtszelle abgeleitet ist. Die Virusmembran ist von einem Müllglycoprotein besetzt, welches als eine Vorstufe von 1COKd synthetisiert und anschließend zu zwei Glycoproteinen verarbeitet wird: gp41, das die LipiddopDelschicht umspannt, und gp120, das sich über die Lipiddoppelschicht hinaus erstreckt. Die Hülle bedeckt einen Kern, der aus Proteinen besteht, die mit p24 und ρ 18 bezeichnet sind. Die virale RNA wird zusammen mit mehreren Kopien des Enzyms, Umkehrtranskriptase, die den Satz von viraler DNA katalysiert, im Kern getragen.The human immunodeficiency virus (HIV) is a human retrovirus believed to be the causative agent of acquired immune-mongolgy syndrome (AIDS) and AIDS-related complex (ARC). The HIV virion or virus particle is a sphere that is about 1000 angstrom unit in diameter. The particle is covered by a lipid double membrane derived from the outer membrane of the infected host cell. The viral membrane is occupied by a garbage glycoprotein, which is synthesized as a precursor of 1COKd and subsequently processed into two glycoproteins: gp41, which spans the lipid doublet layer, and gp120, which extends beyond the lipid bilayer. The envelope covers a nucleus consisting of proteins designated p24 and ρ18. The viral RNA is carried in the nucleus along with multiple copies of the enzyme, reverse transcriptase, which catalyzes the set of viral DNA.

Das HIV-Genom enthält drei Gens, die die Komponenten der Betroviruspaitikel kodieren: env (Kodierung für die Hüllproteine), gag (Kodierung für die Kernproteine) und pol (Kodierung für Umkehrtranskriptase). Diese drei Gene sind von Abschnitten von Nucleotiden flankiert, die als lange terminale Wiederholungen (LTR) bezeichnet werden. Die LTRs beinhalten Sequenzen, die bei der Steuerung der Expression von Virusgenen eine Rolle spielen. Im Gegensatz zu anderen Retroviren enthält das HIV-Genom jedoch mindestens fünf zusätzliche Gene, von denen drei bekannte Regulationsfunktionen haben und deren Expression eine Auswirkung auf die von dem Virus ausgeübten pathogenen Mechanismen haben soll. Das tat-Gen kodiert ein Protein, das als ein potenter Transaktivator der HIV-Genexpression fungiert und somit eine wichtige Rolle bei der Verstärkung der Virusreplikation spielt. Das rev- oder trs/art-Gen kann die HIV-Synthese durch einen übertragenden Antirepressionsmochanismus nach oben regulieren; rev ermöglicht, daß das integrierte HIV-Virus selektiv entweder Regulationsproteine oder Virionkomponenten erzeugt. Im Gegensatz dazu scheint das nef- oder 3'-orf-Gen die Virusexpression durch Erzeugung e!nes zytoplasmatischen Proteins nach unten zu regulieren, welches wahrscheinlich über einen zweiten Boten die Transkription des HIV-Genoms hemmt. Das vif- oder sor-Gen ist für die Virionbildung nicht notwendig, es ist jedoch entscheidend für die wirksame Generation von infektiösen Virionen und beeinflußt die Virusübertragung In vitro. Da:: or- oder R-Gen kodiert ein immunogenes Protein unbekannter Funktion.The HIV genome contains three genes that encode the components of the betroviral particles: env (encoding for the envelope proteins), gag (coding for the core proteins), and pol (coding for reverse transcriptase). These three genes are flanked by sections of nucleotides called long terminal repeats (LTRs). The LTRs include sequences that play a role in the control of viral gene expression. However, unlike other retroviruses, the HIV genome contains at least five additional genes, three of which have known regulatory functions and whose expression is believed to affect the pathogenic mechanisms that the virus exerts. The tat gene encodes a protein that acts as a potent transactivator of HIV gene expression and thus plays an important role in enhancing viral replication. The rev or trs / art gene can upregulate HIV synthesis through a transmissive anti-repression mechanism; rev allows the integrated HIV virus to selectively generate either regulatory proteins or virion components. In contrast, the nef or 3 'orf gene appears to down-regulate virus expression by producing a cytoplasmic protein which is likely to inhibit transcription of the HIV genome via a second messenger. The vif or sor gene is not necessary for virion formation, but it is critical for the efficient generation of infectious virions and affects viral transmission in vitro. The :: or R gene encodes an immunogenic protein of unknown function.

Die entscheidende Grundlage für die Immunopathogenese der HIV-Infektion ist vermutlich dio Verarmung an der Helfer/ Induktormenge von T-Lymphozyten, die das CD4-Antigen ausprägen, was zu einer tiefen Immunsuppression führt. Das Virustöten dieser Immunzellen wir J als ein Hauptfaktor angesehen, der zu der lähmenden Wirkung beiträgt, die HIV auf das Immunsystem hat. Das HüllglycopiO. ^;n spielt eine wichtige Rolle beim Eintritt von HIV in CD4 positive Wirtszellen. Für den gp 120-Abschnitt ist gezeigt worden, daß er direkt an das zelluläre CD4-Rezeptormoleki^;l bindet, wodurch Tropismus des HIV für Wirtszellen erzeugt wird, die den CD4-Rezeptor ausprägen, z. B. T-Helferzellen (T-4- Zellen), Makrophagen usw. Nach Bindung des HIV an das CD4-Molekül ist der Virus verinnerlicht und ohne Hülle. Einmal verinnerlicht, wird die genomische RNA durch die Enzymumkehrtranskriptase zu DNA transkribiert. Die Provirus-DNA wird dann in die Wirtschromosomen-DNA integriert, und die Infektion kann eine ruhende oder latente Phase annehmen. Wenn es jedoch zur Aktivierung kommt, wird die Provirus-DNA transkribiert. Translation und posttranslationale Verarbeitung führt zu Virusaufbau und zum Sprießen von reifen Virionen von der Zelloberfläche.The crucial basis for the immunopathogenesis of HIV infection is probably the depletion of helper / inducer levels of T lymphocytes expressing the CD4 antigen, leading to deep immunosuppression. Virus killing these immune cells is considered to be a major contributing factor to the debilitating effect that HIV has on the immune system. The HüllglycopiO. ^; n plays an important role in the entry of HIV into CD4-positive host cells. For the gp120 portion has been shown to directly to the cellular CD4-Rezeptormoleki ^{binds l,} providing tropism of HIV is generated for host cells that are expressed the CD4 receptor, z. T-helper cells (T-4 cells), macrophages, etc. After binding of the HIV to the CD4 molecule, the virus is internalized and shell-free. Once internalized, the genomic RNA is transcribed to DNA by the enzyme reverse transcriptase. The proviral DNA is then integrated into the host chromosomal DNA and the infection may assume a quiescent or latent phase. However, when it comes to activation, the provirus DNA is transcribed. Translation and post-translational processing lead to virus build-up and spewing of mature virions from the cell surface.

Wenn es zu einer aktiven Virusreplikation kommt, wird die Wirts-CD-4+-Zelle gewöhnlich getötet. Der genaue Mechanismus, mit dem das HIV seine zytopathische Wirkung ausübt, ist jedoch unbekannt. Es sind eine Reihe von Mechanismen für die Immunopathogenese und die zytopathische Wirkung der HIV-Infektion vorgeschlagen worden: die Akkumulation von großen Mengen nichtintegrierter Virus-DNA in den infizierten Zellen; massive Erhöhung der Durchlässigkeit der Zellmembran beim Sprießen großer Virusmengen von der Zolloberfläche; Spekulationen darüber, daß HIV eine terminale Differenzierung von indizierten T4-Zellen verursachen kann, was zu einer verkürzten Lebensspanne führt. Es gibt zunehmend Anhaltspunkte dafür, daß sowohl das CD4-Molekül als auch die Virushülle eine Rolle bei der zytopathischen Wirkung in HlV-infizierten Zellen durch eine gewisse Förderung der Zellfusion spielen. Ein hervorstechendes Merkmal in der ^ytopathologie der HIV-Infektion ist die Bildung von vielkernigen Synoytia durch die Fusion von 500 Zellen, die durch die gp120/gp41-Hüllproteine induziert zu sein scheinen. Im Gegensatz dazu können HlV-infizierte Makrophagen weiter HIV ohne zytopathische Wirkungen über lange Zeiträume produzieren. Es wird davon ausgegangen, daß der Makrophage ein Hauptreservoir für HIV ist und für den Transport des Virus in das Zentralnervensystem verantwortlich sein kann (Gartner et al., 1986, Science 233:215-219). Bis heute gibt es noch kein Heilmittel gegen AIDS. Es laufen gegenwärtig Impfversuche, um die Verbreitung des Virus unter der Bevölkerung zu bekämpfen. Bemühungen zur Beherrschung des Krankheitsverlaufs bei einem infizierten Patienten sind jedoch hauptsächlich auf den Einsatz von Antivirusmitteln gerichtet.When active virus replication occurs, the host CD4 + cell is usually killed. However, the exact mechanism by which HIV exerts its cytopathic effect is unknown. A number of mechanisms have been proposed for the immunopathogenesis and cytopathic effect of HIV infection: the accumulation of large amounts of unintegrated viral DNA in the infected cells; massive increase in the permeability of the cell membrane when sprouting large amounts of virus from the surface of the zollo; Speculation that HIV may cause terminal differentiation of indexed T4 cells, resulting in a shortened lifespan. There is increasing evidence that both the CD4 molecule and the viral envelope play a role in the cytopathic effect in HIV-infected cells through some promotion of cell fusion. A salient feature in the pathology of HIV infection is the formation of polynuclear syncytia by the fusion of 500 cells that appear to be induced by the gp120 / gp41 envelope proteins. In contrast, HIV-infected macrophages can continue to produce HIV without long-term cytopathic effects. It is believed that the macrophage is a major reservoir of HIV and may be responsible for transport of the virus into the central nervous system (Gartner et al., 1986, Science 233: 215-219). To date, there is still no cure for AIDS. Vaccination attempts are currently underway to combat the spread of the virus among the population. However, efforts to control disease progression in an infected patient are primarily directed to the use of antiviral agents.

2.2. Anti-HIV-Medikamente2.2. Anti-HIV drugs

Es werden gegenwärtig verschiedene therapeutische Methoden erforscht, um die Morbidität und die Mortalität der HIV-Infektion zu reduzieren (Yarchoan et al., 1988, Scientific American 259:110-119; Bartlett, 1988, J. A. M. A. 260: 3051-3052; DeClercq, E., 1986, J. Med. Chem. 29:1561-1569; Yarchoan, R. und Broder, S., 1987, N. Engl. J. Med. 316: 557-564). Die Kenntnis der Physiologie des HIV-Virus hat zu einer Reihe von Gedankengängen geführt, die auf eine Störung der Virusreplikation oder Verbreitung der Infektion abzielen. Ein Eingreifen könnte möglicherweise die Bindung des Virus an Zielzellen, die Fusion mit Zellmembranen, ein Enthüllen der Virusnukleinsäure, die Umkehriranskription des HIVRNA-Genoms in DNA, die Transkription oder Translation von viraler mRNA, die Reifung von Virusproteinen, den Aufbau zu reifen Virionen oder andere auf die Replikation oder Infektiosität bezogene Vorgänge verhindern.Various therapeutic methods are currently being explored to reduce the morbidity and mortality of HIV infection (Yarchoan et al., 1988, Scientific American 259: 110-119; Bartlett, 1988, JAMA 260: 3051-3052; DeClercq, E , 1986, J. Med. Chem. 29: 1561-1569; Yarchoan, R. and Broder, S., 1987, N. Engl. J. Med. 316: 557-564). Knowledge of the physiology of the HIV virus has led to a number of lines of thought that aim to disrupt viral replication or spread the infection. Interference might include virus binding to target cells, fusion with cell membranes, revealing viral nucleic acid, reverse transcription of the HIVRNA genome in DNA, transcription or translation of viral mRNA, maturation of virus proteins, assembly into mature virions, or others prevent replication or infectivity related events.

Verschiedene Methoden zur Verhinderung der Bindung von HIV an Zellmembranen worden geprüft; sie sind auf die Hemmung der Wechselwirkungen zwischen dem HIV-Hüllglycoprotein, gp 120, und dem CD4-Antigen auf Zielzellen wie Holfer-T-Lymphozyten gerichtet. Es ist gezeigt worden, daß die Bindung von gp120 an das CD4-Antigen nicht nur mit einer Viruspenetration der Zellmembranen, sondern auch mit einer Syncytiabildung zusammenhängt (Sodroski et al., Nature 322: 470-474; Lifson et al., 1986, Nature 323: 725-728; Stevenson et al., 1988, Cell 53: 483-496). Smith et al. (1987, Science 238: 1704-1707) haben gezeigt, daß lösliches CD4-Antigon dio HlV-lnfektiosität durch Bindung an Virusteilchen vor deren Auftreffen auf in Zellmembranen eingebettete CD4-Moleküle blockieren kann. Es ist aber auch gezeigt worden, daß Antiidiotypantikörper, die gegen Anti-CD4-Antikörper gerichtet sind, vermutlich durch don Besitz von Proteinkonfigurationen ähnlich den CD4-Determinanten sich an den HIV-Virus in vitro binden (Dalgleish et al., 1989, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology. J. Cell Biochem. Supp. 138, S. 298). Es ist darüber hinaus auch gezeigt worden, daß verschiedene große, sulfierte, negativ geladene Moleküle einschließlich Dextransulfat die HIV-Replikation und Syncytiabildung in vitro hemmen (Yarchoan et al., supra.).Various methods for preventing the binding of HIV to cell membranes have been tested; they are directed to inhibiting the interactions between the HIV envelope glycoprotein, gp 120, and the CD4 antigen on target cells such as Holfer's T lymphocytes. It has been shown that the binding of gp120 to the CD4 antigen is related not only to viral penetration of the cell membranes but also to syncytia formation (Sodroski et al., Nature 322: 470-474; Lifson et al., 1986, Nature 323: 725-728; Stevenson et al., 1988, Cell 53: 483-496). Smith et al. (1987, Science 238: 1704-1707) have shown that soluble CD4 antigonol can block HIV infectivity by binding to virus particles prior to their impact on CD4 molecules embedded in cell membranes. However, antiidiotypic antibodies directed against anti-CD4 antibodies have also been shown to bind to the HIV virus in vitro, presumably by possessing protein configurations similar to the CD4 determinants (Dalgleish et al., 1989, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, J. Cell Biochem., supp. 138, p. 298). In addition, it has also been shown that various large, sulfated, negatively charged molecules, including dextran sulfate, inhibit HIV replication and syncytia formation in vitro (Yarchoan et al., Supra.).

Antisinnoligonucleotide hemmen nachweislich viral induzierte Syncytiumbildung und Expression des viralen p24-Proteins (Agrawäl et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 7079-7083). Diese synthetischen Nucloinsäurepolymere, der HIV-mRNA komplementär, wurden so konstruiert, daß sie die Translation von viraler mRNA zu Protein hemmen; die Bildung von Phosphoramidat- und Phosphorthioatderivaten von Antisinncligonucleotiden hat Verbindungen erzeugt, die der Endonucleasedegradation gegenüber im wesentlichen resistent sind.Antisense oligonucleotides have been shown to inhibit virally induced syncytium formation and expression of the viral p24 protein (Agrawal et al., 1988, Proc. Natl. Acad., USA 85: 7079-7083). These synthetic nucleic acid polymers, complementary to HIV mRNA, have been engineered to inhibit the translation of viral mRNA to protein; the formation of phosphoramidate and phosphorothioate derivatives of antisense nucleotides has produced compounds that are substantially resistant to endonuclease degradation.

Von Ribavirin, das einen Riboseteil und einen Triazolring einschließt, wird angenommen, daß es als ein Anrlogon des Nucleosidguanosin wirkt. Es hat Wirksamkeit gegen mehrere RNA-Viren in vitro, hauptsächlich, so wird angenommen, durch Beeinträchtigung des zum Kappen von viraler mRNA erforderlichen Guanylierungsschrittcs. Über Ribavirin ist berichtet worden, daß es die Replikation des HIV in Kulturen von menschlichen T-Lymphozyten unterdrückt (McCormick et al., The Lancet, 15. Dez., 1984: 1367-1369).Ribavirin, which includes a ribose moiety and a triazole ring, is believed to act as an anchor of the nucleoside guanosine. It has activity against several RNA viruses in vitro, chiefly it is believed that by impairing the guanylation step required to cap viral mRNA. Ribavirin has been reported to suppress the replication of HIV in cultures of human T lymphocytes (McCormick et al., The Lancet, Dec. 15, 1984: 1367-1369).

Die posttranslationale Reifung von Virusproteinen kann aber auch unterbrochen werden; es ist gezeigt worden, daß Castenospermin, das Glycosidasewirksamkeit besitzt, die Synatiumbildung und HlV-lnfektiosität reduziert (Wall et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5644-5648).The posttranslational maturation of viral proteins can also be interrupted; Castenospermine, which has glycosidase activity, has been shown to reduce syncytium formation and HIV infectivity (Wall et al., 1988, Proc Natl Acad., USA 85: 5644-5648).

Die Endschritte bei der HIV-Replikation beinhalten dessen Austritt aus der Wirtszelle und die Infektion von neuen Zellzielen. Man hat festgestellt, daß Alpha-Interferon die HIV-Replikation in vitro unterdrückt (Ho et al., Lancet, 16. März 1985: 602-604), es kann virales Sprießen reduzieren, und es ist gezeigt worden, daß es eine direkte Antitumorwirksamkeit gegen die Kaposi-Krankheit, eine im Zusammenhang mit Aids auftretende Malignität, besitzt. Eine Lipidverbindung, AL721, bestehend aus neutralen Glyceriden, Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin in einem Verhältnis von 7:2:1 hat die nachgewiesene Fähigkeit, Chloresterol aus Zellmembranen zu extrahieren, und scheint die HlV-lnfektiosität zu vermindern (Sarin et al., 1985, N. Engt. J. Med. 313: 1289-1290).The final steps in HIV replication involve its exit from the host cell and the infection of new cell targets. Alpha-interferon has been found to suppress HIV replication in vitro (Ho et al., Lancet, March 16, 1985: 602-604), it can reduce viral sprouting, and it has been shown to have direct antitumor activity against Kaposi's disease, a malignancy associated with AIDS. A lipid compound, AL721, composed of neutral glycerides, phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine in a ratio of 7: 2: 1 has the demonstrated ability to extract chloresterol from cell membranes and appears to reduce HIV infectivity (Sarin et al., 1985, N Engt. J. Med. 313: 1289-1290).

Es werden verschiedene Methoden zur Beherrschung der HIV-Infektion geprüft, die sich auf die Inhibition von viraler Umkehrtranskriptase beziehen. Da es Säugerzellen an endogener Umkbhrtranskriptasewirksamkeit mangelt, bieten diese Methoden eine potentiell selektive Inhibition der Virusrepükation bei minimaler Wirtszellcytotoxizität. Zu Mitteln, die Umkehrtranskriptase hemmen sollen, gehören Phosphonoformat (Sandstrom et al., Lancet, 29. Juni 1985: L1480), Suramin (Mitsuya et al., 1984, Science 226:172-174), Rifabutin (oder Ansamycin, Amad et al., Lancet, 11. Jan. 1986, S.97) und Nucleosidderivate, die unten beschrieben sind.Various methods of controlling HIV infection are examined, which relate to the inhibition of viral reverse transcriptase. Because mammalian cells lack endogenous transcriptional efficacy, these methods offer potentially selective inhibition of virus repellence with minimal host cell cytotoxicity. Agents which are said to inhibit reverse transcriptase include phosphonoformate (Sandstrom et al., Lancet, June 29, 1985: L1480), suramin (Mitsuya et al., 1984, Science 226: 172-174), rifabutin (or ansamycin, Amad et al., Lancet, Jan. 11, 1986, p.97) and nucleoside derivatives described below.

2.2.1. Nucleosidderivate2.2.1. nucleoside

Nucleosidderivate sind modifizierte Formen der Purin-(Adenosin- und Guanosin-) und Pyrimidin- (Thymidin-, Uridin- und Cytidin-)Nucleoside, die die Bausteine der RNA und DNA sind. Umkehrtranskriptase und DNA-Polymerase binden und bauen die Nucleosidderivate in die naszierende DNA-Kette ein, vorausgesetzt, der 5' Kohlenstoff des Derivats kann an die 3' Hydroxylgruppe des vorherigen Nucleotids binden (d. h. durch Bildung einer Phosphodiestorbindung); nachfolgende Nucleotide können nur hinzugefügt werden, wenn das Nucleosidderivat ein Mittel zur Bindung seines 3' Kohlenstoffs an das 5' Phosphat eines anderen Nucleotids enthält. Viele der gegenwärtig als mögliche Anti-HIV-Medikamente untersuchten Nucleosidderivate führen zu einer vorzeitigen Termination der viralen DNA-Replikation, bevor das ganze Virusgenom transkribiert ist. Diesen Derivaten fehlen 3' Substituenten, die an nachfolgende Nucleoside binden könncr und zum Kettenabbruch führen.Nucleoside derivatives are modified forms of the purine (adenosine and guanosine) and pyrimidine (thymidine, uridine and cytidine) nucleosides, which are the building blocks of RNA and DNA. Reverse transcriptase and DNA polymerase bind and incorporate the nucleoside derivatives into the nascent DNA chain, provided that the 5 'carbon of the derivative can bind to the 3' hydroxyl of the previous nucleotide (i.e., by forming a phosphodiester bond); subsequent nucleotides can be added only if the nucleoside derivative contains a means for binding its 3 'carbon to the 5' phosphate of another nucleotide. Many of the nucleoside derivatives currently being studied as potential anti-HIV drugs result in premature termination of viral DNA replication before the entire viral genome is transcribed. These derivatives lack 3 'substituents which could bind to subsequent nucleosides and lead to chain termination.

AZT (3'-Azido-2'_f 3'-dideoxythymidin, Azidothymidin, Zidovucün) ist ein Nucleosidderivat, das, wie gezeigt worden ist, bei der Behandlung von Patienten mit AIDS und ARC wirksam ist. Daten geben an, daß AZT das mittlere Überleben von AIDS-Patienten erhöht (Fischletal., 1987, N. Engl. J. Med. 317:185-191: Greagh-Kirket al., 1988, J. A. N. A. 260:3009-3015). Vorläufige Aussagen deuten darauf hin, daß AZT bei Kindern mit AIDS, HlV-bezogener Psoriasis (Bartlett et al., supra), AIDS-bezogener Dementia (Schmitt et al., 1988, N. Engl. J. Med. 319:1573-1578) und HlV-bezogener Thrombocytopen in (Pottage et al., 1988, J. A. N. A. 260: 3045-3048) wirksam sein kann. AZT wird von Säugerzellen unter Bildung von AZT-Triphosphat (einem Analogon von Thymidintriphosphat) phosphoryliert, welches die Erzeugung von viraler DNA durch mindestens zwei Mechanismen hemmen soll, und zwar durch kompetitive Hemmung und Kettenabbruch (Yarchoan et al., supra). Kompetitive Hemmung tritt auf, weil virale Umkehrtranskriptase AZT-Triphosphat fester bindet als native Nucleotide. Kettenabbruch resultiert aus AZT-Einbau, weil AZT eine 3'-Hydroxylgruppe fehlt, und es daher nicht an nachfolgende Nucleotide anbinden kann.AZT (3'-azido-2 _'f 3'-dideoxythymidine, azidothymidine, Zidovucün) is a nucleoside derivative which has been shown to be effective in the treatment of patients with AIDS and ARC. Data indicate that AZT increases the mean survival of AIDS patients (Fischletal., 1987, N. Engl. J. Med. 317: 185-191: Greagh-Kirk et al., 1988, JANA 260: 3009-3015). Preliminary evidence suggests that AZT may be associated with AIDS-related dementia in children with AIDS, HIV-related psoriasis (Bartlett et al., Supra) (Schmitt et al., 1988, N. Engl. J. Med. 319: 1573- 1578) and HIV-related thrombocytopenes (Pottage et al., 1988, JANA 260: 3045-3048). AZT is phosphorylated by mammalian cells to form AZT triphosphate (an analog of thymidine triphosphate) which is said to inhibit the production of viral DNA by at least two mechanisms, through competitive inhibition and chain termination (Yarchoan et al., Supra). Competitive inhibition occurs because viral reverse transcriptase binds AZT triphosphate more tightly than native nucleotides. Chain termination results from AZT incorporation because AZT lacks a 3'-hydroxyl group and thus can not bind to subsequent nucleotides.

Dideoxynucleoside sind Nucleosidderivate, denen an den 2'- und 3'-Kohlenstoffrückständen Hydroxylgruppen fehlen und die daher zum DNA-Kettenabbruch führen. Zudem hemmen, wie AZT, die 5'-Triphosphatprodukte von 2',3'-Didaoxyadenosin, Dideoxyguanosin, Dideoxycytidin und Dideoxythymidin selektiv die virale Umkehrtranskriptase und die zelluläre ß- und v-DNA-Polymerase, beeinträchtigen jedoch nicht die Funktion von DNA-Polymerase α, dem wichtigsten, während der Zellteilung verwendeten synthetischen DNA-Enzym (Edenberg et al., 1978, J. Eiol. Chem. 253:3273-3280; Waqar et al., 1978, Nucl. Acids Res.5:1933-1946; van der Vilet et al., 1981, Biochemistry 20:2628-2632; Waqar et al., 1984, J. Cell Physiol. 121:402-408). In vitro haben Adenosin-, Guanosin-, Inosin-, Cytidin- undThymidin-2',3'-dideoxynucleoside die HlV-Virusreplikation gehemmt (obwohl das Thymidinderivat eine weniger hemmende Wirksamkeit gezeigt hat); eine im wesentlichen vollständige Unterdrückung des HIV wurde bei Dosen beobachtet, die um einen Faktor von 10 bis ?0 niedriger waren als die Dosen, die zur Hemmung einer starken Vermehrung oder Immunreaktivität von T-Zellen erforderlich waren (Mitsuya und Broder, 1986, Proc. Natl. Acad. Sei.Dideoxynucleosides are nucleoside derivatives which lack hydroxyl groups on the 2 'and 3' carbon residues and therefore lead to DNA chain termination. In addition, like AZT, the 5'-triphosphate products of 2 ', 3'-dideoxyadenosine, dideoxyguanosine, dideoxycytidine and dideoxythymidine selectively inhibit viral reverse transcriptase and cellular β and v DNA polymerase, but do not interfere with the function of DNA polymerase α, the most important synthetic DNA enzyme used during cell division (Edenberg et al., 1978, J. Eiol. Chem. 253: 3273-3280; Waqar et al., 1978, Nucl. Acids Res.5: 1933-1946) van der Vilet et al., 1981, Biochemistry 20: 2628-2632; Waqar et al., 1984, J. Cell Physiol. 121: 402-408). In vitro, adenosine, guanosine, inosine, cytidine and thymidine 2 ', 3'-dideoxynucleosides inhibited HIV viral replication (although the thymidine derivative has demonstrated less inhibitory activity); Substantially complete suppression of HIV was observed at doses 10 to 10 lower than those required to inhibit proliferation or immunoreactivity of T cells (Mitsuya and Broder, 1986, Proc. Natl. Acad.

USA 83:1911-1915). Ahluwalia et al. haben erste Untersuchungen zur Zellpharmakologie von 2',3'-Didooxyinosin durchgeführt (1987, Biochem. Pharm. 36: 3797-380). Die PCT-Veröffentlichung WO 87/01284, internationale Veröffentlichung vom 12. MärzUSA 83: 1911-1915). Ahluwalia et al. have carried out initial studies on the cell pharmacology of 2 ', 3'-didooxyinosine (1987, Biochem. Pharm. 36: 3797-380). PCT Publication WO 87/01284, International Publication of Mar. 12

1987, bezieht sich auf die Hemmung der In-vitro-lnfektiosität und cytopathischer Wirkungen des HIV durch Purin-2',3'-didooxynucleoside einschließlich 2',3'-Dideoxyinosin, 2',3'-Didooxyguanosin und 2',3'-Dideoxyadenosin. Die Europäische Patentanmeldung 0273 277, die am 6. Juli 1988 veröffentlicht wurde, bezieht sich auf die Anwendung von 3'-Deoxythymidin-2'-ene (3'-Deoxy-2',3'-didshydrothymidin d4T), dem 2'- und 3'-Hydroxylgruppen fehlen und das eine Doppolbindung zwischen 2'- und 3'-Kohlenstoffatomoi ι hat, bei der Behandlung von Patienten, die mit dem Retrovirus infiziert sind. Man hat gefunden, daß D4T, auch als 2',3'-Didehydro-2',3'-dideoxythymidin oder 1-(2,3-Dideoxy-ß-D-glycero-pent-2-enofuranosyl)thymin bezeichnet, HlV-Umkehrtranskriptase hemmt und eine Anti-HIV-Wirksamkeit besitzt, die mit AZT vergleichbar ist (Mansuri et al., J. Med. Chem. im Druck). D4T hat möglicherweise auch geringere toxische Wirkungen als AZT (Mansuri et al., supra; Chazzoulietal.,1987, refers to the inhibition of in vitro infectivity and cytopathic effects of HIV by purine 2 ', 3'-didooxynucleosides including 2', 3'-dideoxyinosine, 2 ', 3'-didooxyguanosine and 2', 3 ' -Dideoxyadenosin. European Patent Application 0273 277, published July 6, 1988, relates to the use of 3'-deoxythymidine-2'-ene (3'-deoxy-2 ', 3'-didehydrothymidine d4T), the 2'- and 3 'hydroxyl groups are absent and that has a double bond between 2' and 3 'carbon atoms in the treatment of patients infected with the retrovirus. It has been found that D4T, also referred to as 2 ', 3'-didehydro-2', 3'-dideoxythymidine or 1- (2,3-dideoxy-β-D-glycero-pent-2-enofuranosyl) thymine, HIV Inhibits reverse transcriptase and has anti-HIV activity comparable to AZT (Mansuri et al., J. Med. Chem. In press). D4T may also have lower toxic effects than AZT (Mansuri et al., Supra; Chazzoulietal.

1988, ICAAC, Abstract 1301, S.344).1988, ICAAC, Abstract 1301, p. 344).

Kürzlich sind säurestabile 2',3'-Dideoxy-2'-fluornucleoside, die antivirale Wirkungen zeigen, beschrieben worden. Siehe Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. 0287313 A2, die 2',3'-Dideoxy-2'-fluoradenosin und 2',3'-Dideoxy-2'-fluorinosin beschreibt, und Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichung Nr. 0292023 A2, die ein Fluorpyrimidinderivat, 2',3'-Dideoxy-2'-fluorarabinofuranosylcytosin(F-ddC) beschreibt.Recently, acid-stable 2 ', 3'-dideoxy-2'-fluoronucleosides which exhibit antiviral effects have been described. See European Patent Application, Publication No. 0287313A2, which describes 2 ', 3'-dideoxy-2'-fluoroadenosine and 2', 3'-dideoxy-2'-fluorinosine, and European Patent Application, Publication No. 0292023A2, which is incorporated herein by reference Fluoropyrimidine derivative, 2 ', 3'-dideoxy-2'-fluoroarabinofuranosylcytosine (F-ddC).

2.2.2. Toxische Wirkungen von Anti-HIV-Medlkomenten2.2.2. Toxic effects of anti-HIV medicinal products

Da das HIV von menschlichen Zellen abhängig ist, die den Mechanismus liefern, der zur Vollendung von dessen Lebenszyklus erforderlich ist, ist die Inhibition der Virusreplikation häufig mit zelltoxischen Wirkungen verbunden. Die AZT-Therapie ist mit Knochenmarktoxizität verbunden (Richman et al., 1987, N. Engt. J. Med. 317:192-197) und führt folglich zu einer verminderten Produktion von roten Blutzellen (mit Anämiefolge), Plättchen (mit Thrombozytopenie) und weißen Blutzollen (mit Leukopeniefolge). Nach Bartlett et al. (1988, J. A. M.A. 260: 3051-3052) entwickeln 40% der mit AZT behandelten Patienten letztlich Anämie, was eine Reduzierung der Dosis oder eine Transfusion erforderlich macht, und Leukopenie mit einer verringerten Anzahl von Granulozyten, wodurch die Infektionsanfälligkeit erhöht wird. Nur ca. 60% der Patienten mit ARC oder AIDS scheinen eine fortgesetzte AZT-Anwendung nach einem Jahr Therapie vertragen zu können (Pettinelli, C. B., Feinberg, J., und die AIDS Clinical Trials Group: Safety and tolerance of zidovudine in patients with AIDS and advanced ARC (Sicherheit und Verträglichkeit von Zidovudin in Patienten mit AIDS und fortgeschrittenem ARC), zusammengefaßt; Fischl, M. A., und die AIDS Clinical Trials Group: The safety and efficacy of two doses of zidovudine in the treatment of patients with AIDS (Sicherheit und Wirksamkeit von zwei Dosen von Zidovudin bei der Behandlung von AIDS-Patienten), zusammengefaßt: beide auf der 4. Internationalen AIDS-Konferenz in Stockholm am 15. Juni 1988 vorgetragen und von Bartlett zitiert). Zur Vermeidung dieser toxischen Wirkungen wird AZT in Kombination mit anderen antiviralen Mitteln wie Acyclovirnatrium, Foscarnetnatrium, Interferon-α, β oder γ, Interleukin 2 oder Ampligen getestet. Andere Untersuchungen, bei denen zwischen AZT und 2',3'-Dideoxycytidin (ddC) in der Therapie gewechselt wird, laufen ebenfalls (Yarchoan et al., 1988, Lancet 1: 76-81). Kontinuierliche hohe Dosen ddC (das relativ knochenmarkschonend ist) über mehr als 8 bis 12 Wochen bringen die Ausbildung von schmerzhafter peripherer Neuropathie mit sich. Man hofft, daß durch Wechseln zwischen AZT und ddC die toxischen Wirkungen beider minimiert werden können. Eine Therapie, die sowohl wirksam als a'jch für AIDS-Patienten klinisch verträglich ist, wird gegenwärtig von Forschern im Gesundheitswesen aktiv gesucht.Since HIV is dependent on human cells, which provide the mechanism necessary to complete its life cycle, inhibition of viral replication is often associated with cytotoxic effects. AZT therapy is associated with bone marrow toxicity (Richman et al., 1987, N. Engt. J. Med. 317: 192-197) and consequently results in decreased production of red blood cells (with anemia sequence), platelets (with thrombocytopenia). and white blood cells (with leukopenia). According to Bartlett et al. (1988, J.A.M.A. 260: 3051-3052), 40% of the AZT-treated patients eventually develop anemia, requiring a reduction in dose or transfusion, and leukopenia with a decreased number of granulocytes, thereby increasing the susceptibility to infection. Only about 60% of patients with ARC or AIDS seem to be able to tolerate continued AZT use after one year of therapy (Pettinelli, CB, Feinberg, J., and the AIDS Clinical Trials Group: Safety and tolerance of zidovudine in patients with AIDS and advanced ARC (safety and tolerability of zidovudine in patients with AIDS and advanced ARC), Fischl, MA, and the AIDS Clinical Trials Group: The safety and efficacy of two doses of zidovudine in the treatment of patients with AIDS Efficacy of two doses of zidovudine in the treatment of AIDS patients) summarized: both presented at the Fourth International AIDS Conference in Stockholm on June 15, 1988 and cited by Bartlett). To avoid these toxic effects, AZT is tested in combination with other antiviral agents such as acyclovir sodium, foscarnet sodium, interferon-α, β or γ, interleukin 2 or Ampligen. Other studies switching between AZT and 2 ', 3'-dideoxycytidine (ddC) in therapy are also underway (Yarchoan et al., 1988, Lancet 1: 76-81). Continuous high dose ddC (which is relatively bone marrow-sparing) for more than 8 to 12 weeks involves the development of painful peripheral neuropathy. It is hoped that by switching between AZT and ddC, the toxic effects of both can be minimized. A therapy that is both effective and clinically acceptable to AIDS patients is currently being actively sought by healthcare researchers.

3. Zusammenfassung der Erfindung3. Summary of the invention

Die Erfindung betrifft die Anwendung von synerqistischen Kombinationen von Nucleosidderivaten zur Hemmung der HIV-Replikation und somit zur Begrenzung der HIV-Infektion. Erfindungsgemäß weisen bestimmte Nucleosidderivate, wenn sie zusammen verwendet werden, größere antivirale Wirkungen und eine geringere Zelltoxizität bei niedrigeren Konzentrationen auf als jede Droge einzeln angewendet, wodurch die Behandlung der HIV-Infektion maximiert und toxische Nebenwirkungen minimiert werden.The invention relates to the use of synergistic combinations of nucleoside derivatives to inhibit HIV replication and thus to limit HIV infection. In accordance with the present invention, certain nucleoside derivatives, when used together, have greater antiviral effects and less cell toxicity at lower concentrations than each drug used individually, thereby maximizing the treatment of HIV infection and minimizing toxic side effects.

In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung können das Purinnucleosidanalogon Dideoxyinosin (ddl) und das Pyrimidinnucleosidanalogon 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydrothymidin (d4T) zur Hemmung der HIV-Replikation verwendet werden. Mittels Beispiel wird gezeigt, daß ddl und d4Teine starke synergistische Anti-HIV-Wirksamkeit aufweisen; die Kombination aus ddl und d4T ergab eine größere Anti-HIV-Wirkung, bewirkte jedoch eine geringere Zelltoxizität als jede Verbindung einzeln angewendet.In a specific embodiment of the invention, the purine nucleoside analogue dideoxyinosine (ddl) and the pyrimidine nucleoside analogue 2 ', 3'-dideoxy-2', 3'-didehydrothymidine (d4T) can be used to inhibit HIV replication. By way of example, ddl and d4T are shown to have potent synergistic anti-HIV activity; the combination of ddl and d4T resulted in greater anti-HIV activity, but caused less cell toxicity than either compound used alone.

Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung können Kombinationen aus Fluornucleosidanaloga mit d4Tzur Hemmung der HIV-Replikation angewendet werden. So kann zum Beispiel das Purinnucleosidanalogon 2',3'-Dideoxy-2'-beta-fluorinosin (F-ddl) mit d4T angewendet werden.In another embodiment of the invention, combinations of fluoro-nucleoside analogs with d4T may be used to inhibit HIV replication. For example, the purine nucleoside analogue 2 ', 3'-dideoxy-2'-beta-fluorinosine (F-ddl) can be used with d4T.

3.1. Definitionen und Abkürzungen3.1. Definitions and abbreviations

Die folgenden, hier verwendeten Begriffe, ob im Singular oder Plural, sollen die festgelegten Bedeutungen haben.The following terms used here, whether in the singular or plural, shall have the defined meanings.

Kombinationsindex (Cl): numerische Darstellung der synergistischen oder antagonistischen Wirkungen von Wirkstoffkombinationen, wonach ein Cl von weniger als 1 Synergie, größer als 1 Antagonismus und gleich 1' Additi¹ 'smus darstellt. Der Cl-Wert wird durch Anwendung einer Isobologrammgleichung und Computersimulierung nach Chou und Talalay gewonnen (1984, Adv. Enz. Reg. 22: 27-55 und 1987, in „New Avenues in Developmental Cancer Chemotherapy", Harrapund Connors, Hg., Bristol-Myers Symposium Series, Academic Press, S, 37-64; Hartshorn et al., 1987, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31:168-172).Combination index (Cl): numerical representation of the synergistic or antagonistic effects of drug combinations, according to which a Cl of less than 1 represents synergy, greater than 1 antagonism and equal to 1 'Additi ¹ ' smus. The Cl value is obtained using an isobologram equation and computer simulation according to Chou and Talalay (1984, Adv. Enz. Reg. 22: 27-55 and 1987, in "New Avenues in Developmental Cancer Chemotherapy", Harrapund Connors, ed., Bristol -Myers Symposium Series, Academic Press, S, 37-64; Hartshorn et al., 1987, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 31: 168-172).

Ein Kombinationsindex kann nach der GleichungA combination index can be after the equation

C, „ JPiL. ₊ JPJi- ₊ JMi. bestimmtwerden, (DJ₁ (D_xJ₂ (D_x), (D_x),C, "JPiL. ₊ JPJi ₊ JMi. be determined, (DJ ₁ (D _x J ₂ (D _x ), (D _x ),

wobei (D_x)ι die Dosis von Stoff 1 ist, die zur Erzeugung einer Wirkung von x-% allein erforderlich ist, und (D)i die Dosis von Stoff 1 ist, die zur Erzeugung der gleichen Wirkung von x-% in Kombination (D)₂ erforderlich ist. Analog dazu ist (DJj die Dosis von Stoff 2, die zur Erzeugung einer Wirkung von x-% allein erforderlich ist, und (D)₂ ist die Dosis, die zur Erzeugung der gleichen Wirkung in Kombination mit (D)₁ erforderlich ist. Wie in Hartshorn et al. (supra) boschrieben ist, gibt das Gefälle der Dosis-Wirkung-Kurven an, ob die Stoffe gegenseitig ausschließliche Wirkungen (z. B. ähnliche Wirkungsweise) oder gegenseitig nichtausschließliche Wirkungen (z. B. unabhängige Wirkungsweise) haben.where (D _x ) ι is the dose of substance 1 required to produce an effect of x% alone, and (D) i is the dose of substance 1 used to produce the same effect of x% in combination (D) _{2 is} required. Similarly, (DJj is the dose of substance 2 required to produce an effect of x% alone, and (D) ₂ is the dose required to produce the same effect in combination with (D) ₁ in Hartshorn et al., supra), the slope of the dose-response curves indicates whether the substances have mutually exclusive effects (eg, similar mode of action) or mutually non-exclusive effects (eg, independent mode of action).

Wenn die Stoffe gegenseitig ausschließlich sind, dann ist α 0 (d. h. Cl ist die Summe von zwei Gliedern); wenn die Stoffe gegenseitig nichtausschließlich sind, ist α 1 (d.h. Cl ist die Summe von drei Gliedern).If the substances are mutually exclusive, then α is 0 (that is, Cl is the sum of two terms); if the substances are non-exclusive, α is 1 (i.e., Cl is the sum of three terms).

Synergie: Wirkung von zwei oder mehr Substanzen zur Erreichung eines Effektes, der größer ist als der jeder einzeln angewendeten Substanz. Synergismus bei der antiviralen Wirksamkeit ist so zu vorstehen, daß eine größere antivirale Wirksamkeit damit verbunden ist. Synergismus bei der Zelltoxizität bedeutet eine größere Zelltoxizität. Gewebekulturhemmdosis (z. B. TCID_M) ist die Virusmenge, die zur Reduzierung der Virusexpression um einen gegebenen Prozentsatz, d. h. 50%, erforderlich ist.Synergy: Effect of two or more substances to achieve an effect greater than that of each individual substance applied. Synergism in antiviral efficacy is to be projected so that greater antiviral efficacy is associated therewith. Synergism in cell toxicity means greater cell toxicity. Tissue culture inhibition dose (eg TCID _M ) is the amount of virus required to reduce virus expression by a given percentage, ie 50%.

Toxische Dosis für die Gewebekultur (d. h. TCTD₆₀) ist die Menge an beispielsweise Wirkstoff, die zur Reduzierung der Anzahl an Gewebekulturzellen um einen gegebenen Prozentsatz (d. h, 50%) erforderlich ist.Tissue Culture Toxic Dose (ie, TCTD ₆₀ ) is the amount of, for example, drug required to reduce the number of tissue culture cells by a given percentage (i.e., 50%).

4. Beschreibung der Figuren4. Description of the figures

Figur 1. Antivirale Wirksamkeit von gleichen Gesamtkonzentrationen an d4T (gestrichelte Linie), ddl (punktierte Linie) oder d4T + ddl (Vollinie), die durch p-25-gag-Bindung gemessen und als Hemmung in % ausgedrückt wird.Figure 1. Antiviral activity of equal total concentrations of d4T (dashed line), ddl (dotted line) or d4T + ddl (solid line), measured by p-25 gag binding and expressed as% inhibition.

5. Ausführliche Beschreibung der Erfindung5. Detailed description of the invention

Die Erfindung betrifft die Anwendung von synergistischen Kombinationen von Nucleosidderivaten zur Hemmung der HIV-Replikation, wodurch die Wirkungen der HIV-Infektion begrenzt werden. Erfindungsgemäß üben Kombinationen von bestimmten Nucleosidderivaten stärkere Anti-HIV-Wirkungen aus, sind jedoch mit einer geringeren Zelltoxizität verbunden als einzelne Nucleosidderivate bei vergleichbaten Gesamtwirkstoffkonzentrationen. Obwohl die Anwender nicht verpflichtet sind, den Mechanismus 2u erklären, nach dem die Erfindung funktioniert, kann es sein, daß durch die Bereitstellung von zwei oder mehr Nucleosidderivaten, von denen jedes einzelne natürlich vorkommende Nucleoside in der viralen Umkehrtranskriptasewirksamkeit ersetzen kann, die Wahrscheinlichkeit, daß diese Derivate in die virale DNA-Sequenz eingebaut werden (und folglich die Umkehrtranskription durch Verhinderung der Verlängerung von naszierender DNA beenden), wesentlich erhöht ist.The invention relates to the use of synergistic combinations of nucleoside derivatives to inhibit HIV replication, thereby limiting the effects of HIV infection. According to the invention, combinations of certain nucleoside derivatives exert stronger anti-HIV effects, but are associated with lower cell toxicity than single nucleoside derivatives at comparable total drug concentrations. Although users are not required to explain the mechanism by which the invention works, it may be that by providing two or more nucleoside derivatives, each of which can replace any single naturally occurring nucleoside in viral reverse transcriptase activity, the likelihood that these derivatives are incorporated into the viral DNA sequence (and thus terminate reverse transcription by preventing the extension of nascent DNA) is substantially increased.

Zum Zwecke der Klarheit der Offenbarung und nicht als Einschränkung wird die Beschreibung der Erfindung in drei Abschnitte eingeteilt: 1. Kombinationen von Nucleosidderivaten; 2. In-vitro-Versuch zum Nachweis der HIV-Hemmwirkung von Nucleosidderivatkombinationen und 3. therapeutische Anwendungen von HlV-hemmenden Nucleosidderivatkombinationen.For purposes of clarity of disclosure, and not limitation, the description of the invention is divided into three parts: 1. combinations of nucleoside derivatives; 2. In vitro experiment to demonstrate the HIV inhibitory effect of nucleoside derivative combinations; and 3. Therapeutic applications of HIV inhibitory nucleoside derivative combinations.

5.1. Identifikation von synergistischen Kombinationen von Nucleosidderivaten Erfindungsgemäß umfassen Nucleosidderivate, die in Kombination angewendet werden können, 2',3'-Dideoxyadenosin (ddA); 2',3'-Dideoxyguanosin (ddG); 2',3'-Dideoxyinosin (ddl); 2',3'-Dideoxycytidin (ddC); 2',3'-Dideoxythymidin (ddT); 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydrothymidin (d4T) und 3'-Azido-2',3'-dideoxythymidin (AZT), sind jedoch nicht darauf beschränkt. Es können aber auch halogenierte Nucleosidderivate verwendet werden, vorzugsweise 2',3'-Dideoxy-2'-fluornucleoside wie 2',3'-Dideoxy-2'-fluoradenosin; 2',3'-Dideoxy-2'-fluorinosin; 2',3'-Dideoxy-2'-fluorcytosin und2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydro-2'-fluornucleoside wie 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydro-2'-fluorthymidin (Fd4T), die jedoch nicht darauf beschränkt sind. Die erfindungsgemäßen 2',3'-Dideoxy-2'-fluornucleoside sind vorzugsweise solche, bsi denen die Fluorbindung in der Beta-Konfiguration ist und die 2',3'-Dideoxy-2'-beta-fluoradenosin (F-ddA), 2',3'-Dideoxy-2'-beta-fluorinosin (F-ddl) und 2',3'-Dideoxy-2'-beta-fluorcytosin (F-ddC) einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind.5.1. Identification of synergistic combinations of nucleoside derivatives According to the invention, nucleoside derivatives which can be used in combination include 2 ', 3'-dideoxyadenosine (ddA); 2 ', 3'-Dideoxyguanosine (ddG); 2 ', 3'-dideoxyinosine (ddl); 2 ', 3'-dideoxycytidine (ddC); 2 ', 3'-Dideoxythymidine (ddT); 2 ', 3'-Dideoxy-2', 3'-didehydrothymidine (d4T) and 3'-azido-2 ', 3'-dideoxythymidine (AZT) are, however, not limited thereto. However, it is also possible to use halogenated nucleoside derivatives, preferably 2 ', 3'-dideoxy-2'-fluoronucleosides, such as 2', 3'-dideoxy-2'-fluoroadenosine; 2 ', 3'-dideoxy-2'-fluoroinosine; 2 ', 3'-Dideoxy-2'-fluorocytosine and 2', 3'-dideoxy-2 ', 3'-didehydro-2'-fluoronucleosides such as 2', 3'-dideoxy-2 ', 3'-didehydro-2 Fluorothymidine (Fd4T), but not limited thereto. The 2 ', 3'-dideoxy-2'-fluoro-nucleosides according to the invention are preferably those in which the fluorine-bonding is in the beta-configuration and the 2', 3'-dideoxy-2'-beta-fluoroadenosine (F-ddA), 2 ', 3'-dideoxy-2'-beta-fluorinosine (F-ddl) and 2', 3'-dideoxy-2'-beta-fluorocytosine (F-ddC), but are not limited thereto.

Die Kombination aus 2',3'-Dideoxyinosin (ddl) und 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydrothymidin (d4T) stellt eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar. Die Kombination aus 2',3'-Dideoxy-2'-beta-fluorinosin (F-ddl) und 2',3'^:Dideoxy-2',3'-didehydrothymidin (d4T) stellt ebenfalls eine bevorzugte Ausführungsform dar. Eine ausführlichere Beschreibung der 2',3'-Dideoxy-2'-fluornucleoside und der 2',S'-Dideoxy-2',3'-didehydro-2'-fluornucleoside ist in der gleichzeitig schwebenden Anmeldung der laufenden Nummer 120051 vom 12. November 1987 von Sterzycki, Mensuri und Martin enthalten, auf die hierin in ihrer Ganzheit Bezug genommen wird.The combination of 2 ', 3'-dideoxyinosine (ddl) and 2', 3'-dideoxy-2 ', 3'-didehydrothymidine (d4T) represents a preferred embodiment of the invention. The combination of 2', 3'-dideoxy -2'-beta-fluorinosine (F-ddl) and 2 ', 3' ^: dideoxy-2 ', 3'-didehydrothymidine (d4T) also constitutes a preferred embodiment. A more detailed description of the 2', 3'-dideoxy- 2'-fluoronucleosides and the 2 ', S'-dideoxy-2', 3'-didehydro-2'-fluoronucleosides are included in co-pending application serial number 120051 of Nov. 12, 1987 to Sterzycki, Mensuri and Martin which is incorporated herein by reference in its entirety.

Zur Beurteilung der potentiellen therapeutischen Wirksamkeit von Kombinationen von Nucleosidderivaten können diese Kombinationen nach den auf dem Fachgebiet bekannten Methoden auf ihre antivirale Wirksamkeit geprüft werden. So kann zum Beispiel die Fähigkeit einer Nücleosidkombination zur Hemmung der HlV-Zelltoxizität, Syncytiabildung, Umkehrtranskriptasewirksamkeit oder Erzeugung von viraler RNA oder von Virusproteinen in vitro getestet werden. Kombinationen aus Nucleosidderivaten über einen großen Konzentrationsbereich für jedes Nucleosidderivat können auf antivirale und/oder zelltoxische Wirksamkeit getestet werden, und Kombinationsindices können nach den in Abschnitt 6.1. umrissenen Methoden abgeleitet werden. Eine bevorzugte Methode zum Nachweis der HIV-Hemmwirkung von Kombinationen von Nucleosidderivaten ist in Abschnitt 5.2. und dem Abschnitt 6 über Beispiele dargelegt. Darüber hinaus können Kombinationen von Nucleosidderivaten in vivo unter Anwendung eines Tiermodellsystems für AIDS wie dem Affenimmunmangelvirussystem (SlV-System) auf ihre antivirale Wirksamkeit hin überprüft werden (Kanki et al., 1985, Science 230: 951-954). Da jedoch unterschiedliche Tiergattungen (oder sogar verschiedene Zelltypen innerhalb einer Gattung) in dem Wirkungsgrad, mit dem sie diese Wirkstoffe phosphorylieren, unterschiedlich sind, sollte äußerste Vorsicht beim Extrapolieren der mit einer Gattung gewonnenen Ergebnisse angewendet werden (bzw. auch der für einen Zelltyp innerhalb einer Gattung gewonnenen Versuchsergebnisse) (Yarchoan und Broden, 1987, N. Engl. J. Med.316:557:564; Waqar, 1984, J. Cell. Physiol. 121: 402-408; Furmanetal., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 833-7; Onoetal., 1979, Biochem. and Biophys. Res. Commun. 88: 1255-1262). Für diese Kombinationen können therapeutische sowie zelltoxische Dosen festgelegt werden, und die Kombinationen, die die größte Synergie zeigen, d. h. die höchste antivirale Wirksamkeit und/oder niedrigste Zelltoxizität aufweisen, können für die Anwendung beim Menschen in Betracht gezogen werden.To assess the potential therapeutic efficacy of combinations of nucleoside derivatives, these combinations can be tested for antiviral activity by methods known in the art. For example, the ability of a nucleoside combination to inhibit HIV cell toxicity, syncytia formation, reverse transcriptase activity or production of viral RNA or virus proteins in vitro can be tested. Combinations of nucleoside derivatives over a wide concentration range for each nucleoside derivative can be tested for antiviral and / or cytotoxic efficacy, and combination indices can be determined according to the procedures described in Section 6.1. outlined methods. A preferred method for detecting the HIV inhibitory effect of combinations of nucleoside derivatives is described in Section 5.2. and section 6 on examples. In addition, combinations of nucleoside derivatives in vivo can be tested for antiviral activity using an animal model system for AIDS, such as the simian immunodeficiency virus system (SlV system) (Kanki et al., 1985, Science 230: 951-954). However, since different animal species (or even different cell types within a genus) are different in the efficiency with which they phosphorylate these agents, extreme care should be taken when extrapolating the results obtained with a genus (or even for a cell type within one genus) Genus of experimental results) (Yarchoan and Broden, 1987, N. Engl. J. Med.316: 557: 564; Waqar, 1984, J. Cell. Physiol. 121: 402-408; Furman et al., 1986, Proc. Natl. Acad., USA 83: 833-7; Onoetal., 1979, Biochem and Biophys. Res. Commun., 88: 1255-1262). For these combinations, therapeutic as well as cytotoxic doses may be determined, and the combinations showing the greatest synergy, i. H. have the highest antiviral efficacy and / or lowest cell toxicity, may be considered for human use.

5.2. In-vitro-Versuch zum Nachwels der HIV-Hemmwirkung von Kombinationen von Nucloosldderlvaten5.2. In vitro experiment to demonstrate the HIV inhibitory effect of combinations of Nucloosldderlvaten

Die Hemmwirksamkeit von Kombinationen von Nucleosidderivaten kann mit Hilfe eines In-vitro-Versuchssystems wie den in Abschnitt 6 hierin beschriebenen getestet werden. So kann zum Beispiel die Wirksamkeit einer jeden ausgewählten Nucleosidderivatkombination anhand ihrer relativen Fähigkeit zur Hemmung von (a) der Bildung von Syncytia und (b) der Erzeugung von HIV-Partikel in HlV-infizierten Zellen in vitro unter Anwendung einer Zielzellinie, die mit HIV infiziert werden kann, eingeschätzt werden. Im allgemeinen wurden solche Zellinien von einer T-ZeIIe sein oder myelozytischer/monozytischer Abstammung sein oder von einem anderen Zelltyp stammen, der mit dem Gen für CD4 transfiziort ist. Wenn die Nucleosidderivate aber mit einem „Zielmolekül' verbunden sind, z.B. einem monoklonalen Antikörper, Hormon, Wachs.umsfaktor usw., sollte die Zielzellinie das entsprechende Zelloberflächenantigen oder Rezeptor für das Molekül, das mit dem Nucleosidderivat konjugiert, ausprägen.The inhibitory activity of combinations of nucleoside derivatives can be tested using an in vitro experimental system such as that described in Section 6 herein. For example, the efficacy of each selected nucleoside derivative combination can be determined by its relative ability to inhibit (a) the formation of syncytia and (b) the production of HIV particles in HIV-infected cells in vitro using a target cell line that is infected with HIV can be estimated. Generally, such cell lines would be of a T-cell or myelocytic / monocytic lineage, or derived from another cell type transfected with the gene for CD4. However, when the nucleoside derivatives are linked to a "target molecule", e.g. a monoclonal antibody, hormone, growth factor, etc., the target cell line should express the corresponding cell surface antigen or receptor for the molecule conjugated to the nucleoside derivative.

Zur Beurteilung der Wirksamkeit der ausgewählten Nucleosidderivatkombination sollte die Zielzelle in vitro gezüchtet werden, mit dem HIV infiziert werden und mit einer Reihe von Dosen von Nucleosidderivaten vor, während oder nach der Infektion behandelt werden (es können beispielsweise Verfahren dor begrenzten Verdünnung angewendet werden). Die hemmende Wirkung auf die Virionerzeugung kann, wie beschrieben, beurteilt werden, z. B. durch Messen von (a) der Erzeugung des HIV durch Untersuchen auf HIV-Proteine wie dem 25 gag Viruskernprotein oder der Umkehrtranskriptase in dem Kulturmedium; (b) der Induktion von HIV-Antigenen in Zellen durch Immunfluoressenz oder (c) der Reduktion der Syncytiabildung, die visuell eingeschätzt wird. Die Fähigkeit einer Nucleosidderivatkombination, das HIV zu hemmen, ist bezeichnend für die Hemmwirksamkeit und die Hemmdosis der untersuchten Nucleosidderivatkombination.To assess the efficacy of the selected nucleoside derivative combination, the target cell should be cultured in vitro, infected with HIV, and treated with a variety of doses of nucleoside derivatives before, during, or after infection (for example, limited dilution methods may be used). The inhibitory effect on virion production can be assessed as described, e.g. By measuring (a) the production of HIV by assaying for HIV proteins such as the 25 gag virus core protein or the reverse transcriptase in the culture medium; (b) the induction of HIV antigens in cells by immunofluorescence, or (c) the reduction of syncytia formation, which is assessed visually. The ability of a nucleoside derivative combination to inhibit HIV is indicative of the inhibitory potency and inhibitory dose of the examined nucleoside derivative combination.

5.3. Therapeutische Anwendungen von HlV-hemmenden synergistischen Derivatkombinationen5.3. Therapeutic applications of HIV-inhibiting synergistic derivative combinations

Die synergistische Kombination von Nucleosidderivaten kann erfindiingsgemäß in vivo zur Verhinderung der Bildung von Syncytia und der Erzeugung von HlV-Virionen und somit zur Hemmung der Progression der HIV-Infektion in einem Patienten angewendet werden. Effektive Dosen von Nucleosidderivaten, dia in geeigneten pharmakologischen Trägern rezeptmäßig zubereitet sind, können auf jedem geeigneten Weg einschließlich, aber nicht ausschließlich durch Injektion (z. B. intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan usw.), durch Absorption durch epitheliale oder mukokutane Auskleidungen (z. B. Mundschleimhaut, rektale und vaginale Epithelauskleidungen, Nasopharyngealschleimhaut, Intestinalschleimhaut usw.) u.a. verabreicht werden.The synergistic combination of nucleoside derivatives according to the invention can be used in vivo to prevent the formation of syncytia and the production of HIV virions and thus to inhibit the progression of HIV infection in a patient. Effective doses of nucleoside derivatives that are formulated in suitable pharmacological carriers may be prepared by any suitable route, including, but not limited to, injection (eg, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, etc.), absorption by epithelial or mucocutaneous linings ( eg oral mucosa, rectal and vaginal epithelial linings, nasopharyngeal mucosa, intestinal mucosa, etc.) be administered.

Darüber hinaus können Nucleosidderivate in jedem geeigneten pharmakologischen Träger gemischt, an ein Träger- oder Zielmolekül (z. B. Antikörper, Hormon, Wachstumsfaktor usw.) gebunden und/oder in Liposome, Mikrokapseln und Präparate kontrollierter Freisetzung vor der Vsrabreichung in vivo eingebaut werden.In addition, nucleoside derivatives in any suitable pharmacological carrier can be mixed, linked to a carrier or target molecule (e.g., antibody, hormone, growth factor, etc.), and / or incorporated into liposomes, microcapsules, and controlled release preparations prior to in vivo administration.

Nach einer anderen Ausführungsform können synergistische Kombinationen von Nucleosidderivaten in Verbindung mit anderen Behandlungen für die HIV-Infektion angewendet werden. So können synergistische Nucleosidderivate beispielsweise in Verbindung mit anderen antiviralen Verbindungen, die die Umkehrtranskriptasewirksamkeit hemmen (z. B. AZT), mit löslichen CD4 oder monoklonalen Antikörpern, die die HIV-Absorption in Zeilen hemmen, oder mit anderen Zytokinen und Wachstumsfaktoren (z. B. Interferon α, β oder γ, Tumornekrosefaktor, Interleukine, das granulozytische/monozytische Koloniewachstum stimulierender Faktor, das Koloniewachstum stimulierender Faktor 1 usw.) und mit Stoffen angewendet werden, die zur Behandlung anderer Mikroorganismen oder Viren, mit denen AIDS-Patienten opportunistisch infiziert werden, eingesetzt werden. Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung können synergistische Nucleosidderivate in vitro zum Testen der Wirksamkeit verschiedener Wirkstoffe verwendet werden. In diesem Zusammenhang wäre es vorteilhaft, von einem AIDS-Patienten Knochenmarkproben zu bekommen und das Knochenmark in vitro dem zu testenden Wirkstoff, Verbindung oder Kur auszusetzen, um die zu identifizieren, die beispielsweise das Virus töten, aber normale Zellen schonen, oder die nachzuweisen, die eine Markrepopulation stimulieren. Allerdings weist von AIDS-Patienten stammendes Knochenmark eine sehr schlechte Markkoloniebildung in vitro auf. Dies ist wahrscheinlich auf die Infektion der Vorläufer-CD-34-Zellen mit dem HIV zurückzuführen. Infolgedessen ist die Wirksamkeit der verschiedenen in vitro untersuchten Wirkstoffe schwer oder unmöglich einzuschätzen. Die Anwendung von synergistischen Nucleosidderivaten zur Hemmung des HIV in einom solchen Versuchssystem sollte die Markkoloniebildung in vitro erhöhen und somit das Prüfen von verschiedenen anderen Protokollen und Wirkstoffen hinsichtlich der Markwirksamkeit in vitro gestatten.In another embodiment, synergistic combinations of nucleoside derivatives may be used in conjunction with other treatments for HIV infection. For example, synergistic nucleoside derivatives may be used in conjunction with other antiviral compounds that inhibit reverse transcriptase activity (eg, AZT) with soluble CD4 or monoclonal antibodies that inhibit HIV absorption in cells, or with other cytokines and growth factors (e.g. Interferon α, β or γ, tumor necrosis factor, interleukins, granulocytic / monocytic colony growth stimulating factor, colony growth stimulating factor 1, etc.) and with materials used to treat other microorganisms or viruses that opportunistically infect AIDS patients , are used. In another embodiment of the invention, synergistic nucleoside derivatives can be used in vitro to test the efficacy of various drugs. In this context, it would be advantageous to obtain bone marrow samples from an AIDS patient and to suspend the bone marrow in vitro to the drug, compound or regimen to be tested in order to identify those who, for example, kill the virus but protect normal cells, or who demonstrate which stimulate a marrow population. However, bone marrow derived from AIDS patients has very poor marrow colony formation in vitro. This is probably due to infection of the precursor CD-34 cells with HIV. As a result, the efficacy of the various in vitro tested drugs is difficult or impossible to assess. The use of synergistic nucleoside derivatives to inhibit HIV in such an experimental system should increase in vitro marrow colony formation, thus permitting testing of various other protocols and drugs for in vitro potency.

6. Beispiel: Hemmung der HIV-Infektion durch Anwendung von Dideoxydidehydrothymidin und Dideoxyinosln Die nachfolgend beschriebenen Versuche demonstrieren die hemmende Wirkung von Dideoxydidehydrothymidin (d4T) und Dideoxyinosin (ddl) auf die HIV-Infektion von Zielzellen mit T-Zellursprung in Kultur in vitro.Example 6 Inhibition of HIV infection by the use of dideoxydidehydrothymidine and dideoxyinosine The experiments described below demonstrate the inhibitory effect of dideoxydidehydrothymidine (d4T) and dideoxyinosine (ddl) on the HIV infection of target cells with T cell origin in culture in vitro.

6.1. Stoffe und Methoden6.1. Substances and methods

6.1.1. Zellen und Virus6.1.1. Cells and virus

CEM-F-Zellen wurden ursprünglich aus der akuten lymphoblastischen Leukämie beim Menschen abgeleitet und stellen eine anerkannte T-Lymphoblastoidlinie dar. Sie sind als CCRF-CEM-Zellen bei der American Type Culture Collection (ATCC Nr.CEM-F cells were originally derived from human acute lymphoblastic leukemia and represent a recognized T-lymphoblastoid line. They are known as CCRF-CEM cells in the American Type Culture Collection (ATCC no.

CCL119) verfügbar.CCL119) available.

Der LAV_Bnu-Stamm des Humanimmunmangelvirus (HIV) wurde von Dr. Luc Montagnier vom Pasteur-Institut in Paris, Frankreich, bezogen. Das Virus wurde an CEM-F-Zellen angepaßt und in kleinen aliquoten Mengen in Flüssigstickstoff gelagert. Der Titer des Virus wurde alle zwei bis drei Wochen bestimmt und wird als TCIDm ausgedrückt (Gewebekulturhemmdosen; d. h. die Virusmenge, die zur Reduzierung der Virusexpression um 50% erforderlich ist). In allen in den nachfolgenden Unterabschnitten beschriebenen Versuchen wurde eine Virusdosis von 50TCID₆₀ angewendet.The LAV _Bnu strain of the human immunodeficiency virus (HIV) was Luc Montagnier from the Pasteur Institute in Paris, France. The virus was adapted to CEM-F cells and stored in small aliquots in liquid nitrogen. The titer of the virus was determined every two to three weeks and expressed as TCIDm (tissue culture inhibitor doses, ie the amount of virus required to reduce virus expression by 50%). In all experiments described in the subsections below, a virus dose of 50TCID _{60 was} used.

Sowohl die CEM-F-Zellen als auch das HIV-Virus wurden im LAV/OEM-Medium gezüchtet. Das Medium besteht aus RPM11640, das durch 1 % Glutamin, 100U/ml Penizillin, 100Mg/ml Streptomycin, 2μ9/ΓηΙ Polybren und 10% fötalem Rinderserum ergänztBoth the CEM-F cells and the HIV virus were cultured in the LAV / OEM medium. The medium consists of RPM11640 supplemented with 1% glutamine, 100U / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 2μ9 / ΓηΙ polybrene and 10% fetal bovine serum

6.1.2. Nucleosld.1erlvated4Tundddl6.1.2. Nucleosld.1erlvated4Tundddl

Dideoxydidohydrothymidin (d4T, BMY27857-3/8, Charge #26630-23A) und Didooxyinosin (ddl, BMY40900, Charge #25879-46-1) wurden von der Pharmazeutischen Forschungs- und Entwicklungsabteilung der Bristol-Myers Company bezogen. Beide Verbindungen wurden in 2-3 Tropfen Dimethylsulfoxid (DMSO, D-8779, Sigma Chem. Co.) und LAV/CEM-Modium wiederaufgeschwemmt. Die Suspension wurde dann beschallt (Mikroultraschallbrecher, Kontos) und auf eine Endkonzentration von 1 mM gebracht. Alle Verdünnungen wurden aus diesem 1mM Vorrat vorgenommen. Zur Prüfung der kombinierten AnJ-HIV-Wirkung der Wirkstoffe wurden zwei unterschiedliche Versuchsreihen durchgeführt. In der ersten Reihe wurden die Wirkstoffe so gemischt, daß die Konzentration des einen Wirkstoffs konstant gehalten wurde, während die dos anderen variiert wurde. So wurde beispielsweise d4T bei 0,01,0,1,1 oder 10μΜ gehalten, während der ddl-Bereich bei 0,1,1,10 bis 100μΜ lag. Bei dieser Anordnung war das Verhältnis der Wirkstoffe in jedem Gemisch unterschiedlich. Um den Grad der möglichen Synergie zwischen d4Tund ddl genauer zu bestimmen, wurden in der zweiten Versuchsreihe die Wirkstoffe im Verhältnis von 1:5, beginnend mit 10 und 50 μΜ, gemischt und zweifach verdünnt. Auf diese Weise wurde das Verhältnis der Wirkstoffe durch alle Verdünnungen hindurch konstant gehalten. Die Werte wurden mit Hilfe der Software von „Dose-Effect-Analysis with Microcomputers" (Chou, J., und T.-C. Chow, „Dosis-Wirkung-Analyse mit Mikrorechnern", Else-vier-Biosoft Publishers, 1986) ausgewertet. Die gleichen zwei Protokolle wurden zur Beurteilung der Toxizität von c!4T und ddl auf nichtinfizierte Zellen angewendet, nur daß bei dem Versuch mit gleichem Wirkstoffverhältnis das Verhältnis der Wirkstoffe 1:1 betrug, wobei die Ausgangskonzentration bei beiden Wirkstoffen 100μΜ ausmachte. Azidothymidin (AZT, BMY27755/7, Charge #2300-38) wurde als positive Kontrolle in allen Analysen verwendet.Dideoxydidohydrothymidine (d4T, BMY27857-3 / 8, lot # 26630-23A) and didooxyinosine (ddl, BMY40900, lot # 25879-46-1) were purchased from the Bristol-Myers Company Pharmaceutical Research and Development Department. Both compounds were replenished in 2-3 drops of dimethylsulfoxide (DMSO, D-8779, Sigma Chem. Co.) and LAV / CEM-Modium. The suspension was then sonicated (micro sonicator, accounts) and brought to a final concentration of 1 mM. All dilutions were made from this 1 mM stock. To test the combined AnJ-HIV activity of the drugs, two different series of experiments were performed. In the first row, the active ingredients were mixed so that the concentration of one active ingredient was kept constant while the others were varied. For example, d4T was held at 0.01, 0.1, 1 or 10μ, while the ddI range was at 0.1, 1.10 to 100μ. With this arrangement, the ratio of the active ingredients in each mixture was different. To more accurately determine the degree of potential synergy between d4T and ddl, in the second series of experiments the active ingredients were mixed in a ratio of 1: 5, starting at 10 and 50 μΜ, and diluted twice. In this way, the ratio of active ingredients throughout all dilutions was kept constant. Values were determined using software from "Dose-Effect Analysis with Microcomputers" (Chou, J., and T.-C. Chow, "Microscope Dose-Response Analysis", Else-four-Biosoft Publishers, 1986). evaluated. The same two protocols were used to assess the toxicity of c! 4T and ddl to uninfected cells, except that in the same drug ratio experiment, the ratio of the drugs was 1: 1, with the starting concentration of both drugs being 100μΜ. Azidothymidine (AZT, BMY27755 / 7, lot # 2300-38) was used as a positive control in all analyzes.

6.1.3. Bestimmung der Prollferatlonswlrkung von d4T und ddl6.1.3. Determination of the proliferation amplification of d4T and ddl

Für jede Analyse wurden 2 χ 10⁴ CEM-F-Zellen/Quelle in 96 Platten ausgestrichen. Die Zellen wurden mit jeder der verschiedenen Kombinationen gemischt, von denen jede in vierfacher Ausfertigung vorlag. Das Gesamtvolumen/Quelle bzw. Behälter betrug 250μΙ. Die Platten wurden sechs Tage lang bei 37⁰C und 5% CO₂ inkubiert. Am sechsten Tag wurden die Zellen vier Stunden lang mit 1 pCi/Behälter ³HTdR markiert, (New England Nuclear Corp. spezifische Aktivität 6,7 Ci/mmol), auf Glasfaserfilter geerntet und im Szintillationszähler gezählt (Hertzman, R.J., Segall, M., Bach, M.L., und Bach, F.H., 1971, Histocompatibility matching. Vl. Miniaturization of the mixed leukocyte culture test: A preliminary report. Transplantation, 11: 268-273). Die Ergebnisse wurden als % ³HTdR-Aufnahme der Kontrollprobe ausgedrückt die aus Zellen bestand, die ohne Wirkstoffe inkubiert worden waren. Darüber hinaus können die Ergebnisse als eine toxische Dosis für die Gewebekultur 50 (TCTD₅₀) ausgedrückt werden, die die Menge an Wirkstoff oder Wirkstoffen in pg ausdrückt, die zur Reduzierung der Anzahl von Zellen um 50% im Vergleich zu der Kontrollprobe erforderlich ist.For each analysis, 2 × 10 ⁴ CEM F cells / source were plated in 96 plates. The cells were mixed with each of the various combinations, each in quadruplicate. The total volume / source or container was 250μΙ. The plates were incubated for six days at 37 ^° C. and 5% CO ₂ . On the sixth day, the cells were labeled for 4 hours with 1 pCi / container ³ HTdR, (New England Nuclear Corp. specific activity 6.7 Ci / mmole), harvested on glass fiber filters and counted in the scintillation counter (Hertzman, RJ, Segall, M. , Bach, ML, and Bach, FH, 1971, Histocompatibility matching, Volume 1 of the mixed leukocyte culture test: A preliminary report, Transplantation, 11: 268-273). The results were expressed as% ³ HTdR uptake of the control sample consisting of cells incubated without drugs. In addition, the results may be expressed as a toxic dose to tissue culture 50 (TCTD ₅₀ ) expressing the amount of drug or agents in pg required to reduce the number of cells by 50% compared to the control.

6.1.4. Hemmung der HIV-Repllkatlon6.1.4. Inhibition of HIV replication

Die CEM-F-Zellen wurden in 96 Platten bei 2 x 10⁴ Zellen/Quelle ausgestrichen und mit 50TCID₆O des Virus 45 Minuten lang gemischt. Nach 45 Minuten wurden Nucleosidderivate zu jeder Quelle hinzugegeben und gemäß der Beschreibung für die Proliferationsanalyse inkubiert. Am Ende des sechsten Tages wurden die überstehenden Flüssigkeiten unter Anwendung einer Antigeneinfang-ELISA (enzymverbundene Immunadsorptionsbestimmung), die nachfolgend beschrieben ist, auf das Vorhandensein von viralem Aniigen geprüft. Die Bestimmung verwendet zwei monoklonal Antikörper gegen das virale Kernprotein p24gag (Hu, S. H. et al., 1987, Nature 328: 721-723; und Kinney Thomas, e. et al., 1988,AIDS 2: 25-29).The CEM-F cells were streaked in 96 plates at 2 x 10 ⁴ cells / well and mixed with 50TCID ₆ O of the virus for 45 minutes. After 45 minutes, nucleoside derivatives were added to each well and incubated as described for proliferation analysis. At the end of the sixth day, supernatant fluids were assayed for the presence of viral antigen using an antigen-capture ELISA (Enzyme-Linked Immunoadsorbent Assay), described below. The assay uses two monoclonal antibodies against the core viral protein p24gag (Hu, SH et al., 1987, Nature 328: 721-723, and Kinney Thomas, et al., 1988, AIDS 2: 25-29).

6.1.5. Antigen-Einfang-Bestimmung6.1.5. Antigen capture determination

Für diese Bestimmung wurden Mikrotiterplatten (96 Platten) mit zwei monoklonalen Antikörpern, 25-2 (ATCC #9407) und 25-3 (ATCC #9408), beide bei 1:2 500 verdünnt, bestrichen. Diese Antikörper (Einfangreagenzien) sind spezifisch für ρ 24, ρ40 und ρ 55 HIV gag-Proteine. Meerrettichperoxidase (engl. MRP) - konjugiertes Human-lgG, das aus einem Serum eines seropositiven Menschen rein dargestellt wurde, wurde als ein Signal verwendet. Der Absorptionsgrad (450/630nm) wird nach der Zugabe von Substrat - Tetramethylbenzidin (TMB) - bestimmt. Die OD-Anzeigewerte fallen in drei Kategorien: Versuchswerte = Werte von Quellen, die Zellen, virales Impfmaterial und Nucleosidderivat(e) enthalten; Kontrollwerte = Werte von Quellen, die Zellen und Virus (100%) enthalten; und Hintergrundswerte = Werte von Quellen, die nur virales Impfmaterial enthalten. Der Hintergrundswert wurde von allen OD-Werten abgezogen. Die antivirale Wirkung des bzw. der Nucleosidderivate wird als die ρ 24 gag-Bindung der Kontrolle in % ausgedrückt. Wenn beispielsweise jener Wert 20% beträgt, bedeutet das, daß die Virusreplikation, indirekt durch p25gag-Bindung gemessen, um 80% gehemmt wird.For this determination, microtiter plates (96 plates) were coated with two monoclonal antibodies, 25-2 (ATCC # 9407) and 25-3 (ATCC # 9408), both diluted at 1: 2 500. These antibodies (capture reagents) are specific for ρ24, ρ40 and ρ55 HIV gag proteins. Horseradish peroxidase (MRP) -conjugated human IgG, which was purified from serum from a seropositive human, was used as a signal. The absorbance (450 / 630nm) is determined after the addition of substrate - tetramethylbenzidine (TMB) -. The OD readings fall into three categories: experimental values = values of sources containing cells, viral inoculum and nucleoside derivative (s); Control Values = values of sources containing cells and virus (100%); and background values = values of sources containing only viral inoculum. The background value was subtracted from all OD values. The antiviral activity of the nucleoside derivative (s) is expressed as the% gag binding of the control. For example, if that value is 20%, it means that virus replication, measured indirectly by p25gag binding, is inhibited by 80%.

6.1.6. Syncytiabildung6.1.6. syncytia formation

Vor dem Auffangen der überstehenden Flüssigkeiten für die Antigen-Einfang-Bestimmung wurden alle Quellen visuell untersucht. Dies erfolgte zur Feststellung der Infektion und zur Überprüfung des Zustandes der Zellen. Die Syncytia waren leicht zu beobachten, und obwohl sie nicht gezählt wurden, waren die Unterschiede in der Anzahl zwischen den Quellen offensichtlich.Before collecting the supernatants for antigen capture, all sources were visually inspected. This was done to detect the infection and to check the condition of the cells. The syncytia were easy to observe, and although they were not counted, the differences in the numbers between the sources were evident.

6.1.7. Analyse der Zelltoxizitat6.1.7. Analysis of cell toxicity

Es wurde die Toxizität von d4T und ddl gegenüber der Wirtszelle CEM-F (ATCC CCL119) getestet. CEM-F ist eine T-Zellinie, die konstitutiv den CD4-Rezeptor ausprägt und somit ein geeignetes Wirtszellziel für die HIV-Infektion ist. Die Wirkung von d4T und ddl auf die Proliferation von nichtinfizierten Zellen wurde durch Messen des Thymidineinbaus in nichtinfizierten CEM-F-Zellen, die mit d4T und ddl behandelt wurden, eingeschätzt.The toxicity of d4T and ddl to the host cell CEM-F (ATCC CCL119) was tested. CEM-F is a T cell line that constitutively expresses the CD4 receptor and thus is a suitable host cell target for HIV infection. The effect of d4T and ddI on the proliferation of uninfected cells was assessed by measuring thymidine incorporation in uninfected CEM-F cells treated with d4T and ddl.

6.2. Ergebnisse6.2. Results

6.2.1. HIV-Hemmung durch eine Nucleosldderivatkomblnatlon6.2.1. HIV inhibition by a Nucleosldderivatkomblnatlon

In-vitro-Bestimmungen für p25gag-Protein zeigten eine starke synergistische Wirkung von d4T in Kombination mit ddl für die Hemmung der p25gag-Ausprägung, die eine größore antivirale Wirkung als bei einer einzelnen Anwendung beider Verbindungen darstellt. Die Ergebnisse der Bindungsbestimmungen für p25gag sind in Tabelle I dargestellt. Ein Vergleich zwischen einer Kombination aus d4T und ddl und beiden, bei der gleichen Gesamtkonzentration eingesetzten Wirkstoffen ist in Figur 1 dargestellt.In vitro assays for p25gag protein demonstrated a potent synergistic effect of d4T in combination with ddl for the inhibition of p25gag expression, which is a more potent antiviral effect than a single application of both compounds. The results of binding determinations for p25gag are presented in Table I. A comparison between a combination of d4T and ddI and both active ingredients used at the same total concentration is shown in FIG.

Tabelle I stellt die Ergebnisse einer Reihe von Versuchen dar, die zur Beurteilung der optimalen Konzentrationen und Verhältnisse der Konzentrationen von d4T und ddt zur Erreichung einer maximalen antiviralon Wirksamkeit angewendet wurden. Es wurde ein großer Bereich von Konzentrationen geprüft, indem logarithmische Inkremente in der Konzentration eines jeden Derivats in Mehrfachkombinationen unter Anwendung eines Prüfens nach Schachbrettmuster ausgewertet wurdon.Table I presents the results of a series of experiments used to assess the optimal concentrations and ratios of concentrations of d4T and ddt to achieve maximum antiviral activity. A wide range of concentrations was examined by evaluating logarithmic increments in the concentration of each derivative in multiple combinations using checkerboard pattern testing.

Tabelle I Hemmung der Virusreplikation von d4T und ddl in %*Table I Inhibition of virus replication of d4T and ddl in% *

d4T-Konzentration (μΜ)d4T concentration (μΜ) ddl-Konzentration (μΜ)ddl concentration (μΜ) 0,10.1 11 1010 100100 00 11 33 22 8686 00 __ 2525 1313 3838 8383 0,010.01 22 2626 1111 1313 7676 0,10.1 11 5252 5252 7575 7878 11 2424 9292 8888 9292 9494 1010 8787

' durch p25gag-Bindung gemessenMeasured by p25gag binding

Bei Anwendung von d4T oder ddl in Verbindung mit AZT bei einer Konzentration von 1:10:50 wurde eine synergistische Wirkung erreicht, die geringer war als der bei der Kombination von d4 T und ddl beobachtete Synergismus (siehe Tabelle III und Abschnitt 6.3.).When d4T or ddl was used in conjunction with AZT at a concentration of 1:10:50, a synergistic effect was achieved that was lower than that observed with the combination of d4 T and ddl synergism (see Table III and Section 6.3.).

6.2.2. Verringerte Zelltoxizität einer Kombination von Nucleosidderivaten6.2.2. Decreased cell toxicity of a combination of nucleoside derivatives

Zelltoxizitätsbestimmungen, bei denen der Einbau von ³H-Thymidin gemessen wird, zeigen, daß in Kombination eingesetztes d4T und ddl trotz erhöhter Toxizität für den Virus für CEM-F-Zellen nicht zelltoxischer sind, als dies bei der gleichen Gesamtkonzentration jeder einzeln angewendeten Verbindung der Fail ist. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen über einen großen Konzentrationsbereich von d4T, ddl oder d4T in Kombination mit ddl im Verhältnis 1:1 sind in Tabelle Il dargestellt.Cell toxicity determinations measuring the incorporation of ³ H-thymidine show that d4T and ddl used in combination are not more cytotoxic to CEM-F cells despite increased toxicity to the virus than at the same total concentration of each compound used alone Fail is. The results of these determinations over a wide concentration range of d4T, ddI or d4T in combination with ddl in the ratio 1: 1 are shown in Table II.

Tabelle Il Zelltoxizität von CEM bei Einwirkung von steigenden Konzentrationen von d4T und/oder ddl*Table II Cytotoxicity of CEM upon exposure to increasing concentrations of d4T and / or ddl *

d4T-Konzentration (μΜ)d4T concentration (μΜ) ddl-Konzentration (μΜ)ddl concentration (μΜ) 0,10.1 11 1010 100100 00 __ 11 11 11 00 __ 11 22 33 11 11 11 33 33 99 1414 1010 11 2626 3131 2828 3030 100100 1919

• durch 'H-Thymidin gemessen• Measured by 'H-thymidine

6.3. Diskussion6.3. discussion

Die oben angeführten Werte zeigen, daß die Nucloosidderivate d4T und ddl bei Anwendung in Kombination eine starke synergistische antivirale Wirkung aufweisen. Gemäß Tabelle I führte eine Konzentration von 1 μΜ d4T zu einer 24%igen Hemmung der viralen Wirksamkeit, und eine Konzentration von 10μΜ ddl war mit einer 2%igen Hemmung der viralen Wirksamkeit verbunden. Allerdings wurde mit 1μΜ d4Tin Kombination mit 10μΜ ddl eine HIV-Hemmung von 75% erreicht. Figur 1 enthält eine graphische Darstellung, die die antiviralen Wirksamkeiten von d4T, ddl und d4T + ddl bei der gleichen Nucleosldgesamtkonzentration zeigt und eindeutig die synergistischen Wirkungen von d4T in Verbindung mit ddl angibt. Der Kombinationsindex (Cl) ist eine numerische Darstellung der synergistischen oder antagonistischen Wirkungen von Wirkstoffkombinationen. Der Cl-Wert wird mit Hilfe einer Isobologrammgleichung und Computersimulation nach Chou (siehe Abschnitt 3.1.) gewonnen. Ein Cl-Wert von weniger als 1 repräsentiert Synergie (d. h. das Ganze ist größer als die Summe seiner Teile), ein Cl-Wert von größer als 1 repräsentiert Antagonismus (d. h. das Ganze ist geringer als die Summe seiner Teile, und ein Cl-Wert von 1 repräsentiert Additivismus (d. h. das Ganze ist gleich der Summe seiner Teile). Tabelle III zeigt die Cl-Werte von (d4T + ddl),(d4T + AZT)und(ddl + AZT) fürdie antivirale Wirkung, wenn die Konzentrationen von AZT, d4T und ddl in einem Verhältnis von 1:10:50 stehen.The above values show that the Nulloosidderivate d4T and ddl when used in combination have a strong synergistic antiviral effect. According to Table I, a concentration of 1 μΜ d4T resulted in a 24% inhibition of viral potency, and a concentration of 10 μΜ ddl was associated with a 2% inhibition of viral potency. However, HIV inhibition of 75% was achieved with 1μΜ d4Tin combination with 10μΜ ddl. Figure 1 contains a graph showing the antiviral activities of d4T, ddl and d4T + ddl at the same total nucleoside concentration and clearly indicating the synergistic effects of d4T in conjunction with ddl. The combination index (Cl) is a numerical representation of the synergistic or antagonistic effects of drug combinations. The Cl value is obtained by means of an isobologram equation and computer simulation according to Chou (see Section 3.1.). A Cl value of less than 1 represents synergy (ie, the whole is greater than the sum of its parts), a Cl value greater than 1 represents antagonism (ie, the whole is less than the sum of its parts, and a Cl value of 1 represents additiveism (ie the whole is equal to the sum of its parts) Table III shows the Cl values of (d4T + ddl), (d4T + AZT) and (ddl + AZT) for antiviral activity when the concentrations of AZT , d4T and ddl are in a ratio of 1:10:50.

Tabelle III Cl-Werte für Anti-HIV-Wirkung bei 50-, 70- und 90%iger Hemmung des VirusTable III Cl values for anti-HIV activity with 50, 70 and 90% inhibition of the virus

Verbindung 50% 70% 90%Compound 50% 70% 90%

d4T + ddl 0,024 0,049 0,16d4T + ddl 0.024 0.049 0.16

d4T + AZT 0,53 0,43 0,30d4T + AZT 0.53 0.43 0.30

AZT+ ddl 0,77 0,74 0,75AZT + ddl 0.77 0.74 0.75

Aufgrund des synergistischen Verhältnisses zwischen d4T und ddl können zur Erreichung einer effektiven Virushemmung niedrigere Nucleosidkonzentrationen angewendet werden. Wie in Tabelle Il dargestellt ist, ist eine erhöhte antivirale Wirksamkeit von Kombinationen aus d4T und ddl nicht mit einer erhöhten Zelltoxizität verbunden, so daß eine selektive antiviraleDue to the synergistic relationship between d4T and ddl, lower nucleoside concentrations can be used to achieve effective virus inhibition. As shown in Table II, increased antiviral efficacy of combinations of d4T and ddI is not associated with increased cell toxicity such that a selective antiviral

Wirksamkeit erreicht woraen ist. Darüber hinaus haben Untersuchungen zur Bestimmung von TDw (toxische Dosis) für d 4 T und ddl einzeln i>der in Kombination aufgezeigt, daß, obwohl derTD₆₀-Wert sowohl für d4T als auch für ddl einzeln über 100μΜ lag, der TDso-Weitfür die Kombination aus d4T und ddl 730 μΜ betrug (Daten nicht dargestellt). Der Cl für zelltoxische Wirkungen von Kombinatione'i aus AZT, d4T und ddl bei Konzentrationsverhältnissen von 1:10:10 zeigt, daß bei Konzentrationen, die 90% der HIV-Wirksamkeit hemmen, die Kombination aus d4T und ddl deutlich weniger zelltoxisch ist als gleichermaßen viruzide Konzentrationen von (d4T + AZT) oder (ddl + AZT) (siehe Tabelle IV). Die Kombination aus d4T und ddl ist somit nicht nur vlruzlder als d4T oder ddl einzeln betrachtet, (d4T + ddl) ist sogar weniger zelltoxisch. Das therapeutische Fenster für die Behandlung der HIV-Infektion wird somit durch die Anwendung dieser Nucleosidderivate in Kombination erweitert. Es können bei den Patienten therapeutische Anti-HIV-Wirkungen erreicht werden, ohne daß gefährliche oder schmerzhafte Komplikationen riskiert werden.Effectiveness has been achieved. In addition, studies for the determination of TDw (toxic dose) for d 4 T and ddl individually in combination have shown that although the TD ₆₀ value for both d4T and ddl was individually greater than 100μΜ, the TDso range for the Combination of d4T and ddl 730 μΜ was (data not shown). The Cl for cytotoxic effects of combinations of AZT, d4T and ddl at 1:10:10 concentration ratios indicates that at concentrations that inhibit 90% of HIV efficacy, the combination of d4T and ddI is significantly less cytotoxic than alike virucidal concentrations of (d4T + AZT) or (ddl + AZT) (see Table IV). The combination of d4T and ddl is therefore not only more complete than d4T or ddl considered individually, (d4T + ddl) is even less cytotoxic. The therapeutic window for the treatment of HIV infection is thus extended by the use of these nucleoside derivatives in combination. Therapeutic anti-HIV effects can be achieved in patients without risking dangerous or painful complications.

Tabelle IV Zelltoxizitäts-Cl-Werte bei Nucleosidkonzentrationen, die einer 50- und 90%igen viralen Hemmung entsprechenTable IV Cell toxicity Cl values at nucleoside concentrations corresponding to 50% and 90% viral inhibition

Verbindung 50% 90%Compound 50% 90%

d4T + ddl 2,17 6,40d4T + ddl 2,17 6,40

d4T + AZT 2,45 1,66d4T + AZT 2.45 1.66

AZT+ ddl 2,21 2,37AZT + ddl 2.21 2.37

Claims

An in vitro method of inhibiting HIV characterized in that HIV-infected cells are contacted with a synergistic combination of nucleoside derivatives.

2. Method according to claim 1, characterized in that at least one of the nucleoside derivatives is a 2 ', 3'-dideoxynucleoside.

3. Method according to claim 1, characterized in that one of the nucleoside derivatives is 2 ', 3'-dideoxyinosine.

4. Method according to claim 1, characterized in that one of the nucleoside derivatives is 2 ', 3'-dideoxy-2', 3'-didehydrothymidine.

5. The method according to claim 1, characterized in that one of the nucleoside derivatives is a 2 ', 3'-dideoxy ^' - fluomucleosidderivatist.

6. The method according to claim 5, characterized in that the Fluornucleosidderivat 2 ', 3'-dideoxy-2'-fluorinosine.

7. The method according to claim 6, characterized in that the Fluornucleosidderivat 2 ', 3'-dideoxy-2'-beta-fluorinosin (F-ddl) is.

8. The method according to claim 5, characterized in that the Fluornucleosidderivat 2 ', 3'-dideoxy-2'-fluoradenosine.

9. The method according to claim 8, characterized in that Jas Fluornuoleosidderivat 2 ', 3'-dideoxy-2'-beta-f! Uoradenosine (F-ddA) is.

10. The method according to claim 5, characterized in that the Fluornucleosidderivat 2 ', 3'-dideoxy-2'-fluorocytosine.

A method according to claim 10, characterized in that the fluorine nucleoside derivative is 2 ', 3'-dideoxy-2'-beta-fluorocytosine iF-ddC).

12. The method according to claim 1, characterized in that at least one Nucleosidderivat is chemically bonded to a second molecule.

13. The method according to claim 1, characterized in that the HIV-infected cells with a combination of 2 ', 3'-dideoxyinosine (ddl) and 2', 3'-dideoxy-2 ', 3'-didehydrothymidin (d4T) in contact to be brought.

14. The method according to claim 13, characterized in that the ratio of d4Tzu ddl is between about 1: 1 to 1:10.

15. The method according to claim 13, characterized in that the ratio of d4Tzu ddl is about 1: 5.

16. The method according to claim 1, characterized in that HIV-infected cells with a combination of 2 ', 3'-dideoxy-2'-beta-fluorinosin (F-ddl) and 2', 3'-dideoxy-2 ', 3'-didehydrothymidine (d4T).

17. The method according to claim 1, characterized in that HIV-infected cells with a combination of 2 ', 3'-dideoxy-2'-beta-fluoroadenosine (F-ddA) and 2', 3'-dideoxy-2 ', 3'-didehydrothymidine (d4T).

18. The method according to claim 1, characterized in that HIV-infected cells with a combination of 2 ', 3'-dideoxy-2'-beta-fluorocytosine (F-ddC) and 2', 3'-dideoxy-2 ', 3'-didehydrothymidine (d4T).

19. A pharmaceutical composition comprising an HIV-inhibiting amount of a synergistic combination of nucleoside derivatives according to any one of claims 2 to 18, optionally in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

20. Use of a synergistic combination of nucleoside derivatives according to any one of claims 2 to 18 for the inhibition of HIV in vitro or in an infected mammal in vivo.

21. Use according to claim 20 in combination with another anti-HIV treatment.

Use according to claim 20 in combination with one or more therapies for HIV-associated diseases, including opportunistic infections.