BRPI0216042B1

BRPI0216042B1 - Polipeptídeo capaz de se ligar a ANG-2, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, e, uso dos referidos polipeptídeos.

Info

Publication number: BRPI0216042B1
Application number: BRPI0216042-0A
Authority: BR
Inventors: Jonathan Daniel Oliner; Hosung Min
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2019-05-21
Also published as: BRPI0216042B8

Abstract

<b>polipeptídeo capaz de se ligar a ang-2, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, e, uso dos referidos polipeplideos<d>são divulgados peptídeos que se ligam à ang-2. também são divulgados pepticorpos que compreendem os peptideos, métodos de fabricar tais peptídeos e pepticorpos e métodos de tratamento que usam tais peptídeos e pepticorpos.

Description

“POLIPEPTÍDEO CAPAZ DE SE LIGAR A ANG-2, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO

- FARMACÊUTICA, E, USO DOS REFERIDOS POLIPEPTÍDEOS”

Dividido do PI0213223-0 depositado em 11/10/2002

Este pedido reivindica benefício para o Pedido Provisório U.S.

Série N^e 60/328.624 depositado em 11 de outubro de 2001, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a agentes de ligação específicos que reconhecem e se ligam à angiopoietina-2 (Ang-2). Mais especificamente, a invenção diz respeito à produção, uso em diagnóstico e uso terapêutico dos agentes de ligação específicos e fragmentos destes, que especificamente se ligam à Ang-2.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A angiogênese, a formação de novos vasos sanguíneos a partir dos existentes, é essencial para muitos processos fisiológicos e patológicos. Normalmente, a angiogênese é firmemente regulada pelos fatores pró- e anti-angíogênicos, mas no caso de doenças tais como o câncer, doenças neovasculares oculares, artrite e psoríase, o processo pode seguir de modo Ξ20 errado. Folkman, J., Nat. Med., 1: 27 a 31 (1995).

Existem várias doenças conhecidas por estarem associadas , com a angiogênese desregulada ou indesejada. Tais doenças incluem, mas não são limitadas à neovascularização ocular, tais como retinopatias (incluindo a retinopatia diabética), degeneração macular relacionada com a idade, psoríase, hemangioblastoma, hemangioma, arteriosclerose, doença inflamatória, tal como uma doença inflamatória reumatóide ou reumática, especialmente a artrite (que inclui a artrite reumatóide) ou outros distúrbios inflamatórios crônicos, tais como a asma crônica, aterosclerose arterial ou pós transplantacional, endometriose e doenças neoplásticas, por exemplo os chamados tumores sólidos e tumores líquidos (ou hematopóiéticos) (tais como leucemias e linfomas). Outras doenças associadas com a angiogênese indesejada estará evidente àqueles habilitados na técnica.

Embora muitos sistemas de transdução de sinal tenham sido implicados na regulagem da angiogênese, um dos sistemas melhor caracterizado e o mais seletivo em célula endotelial envolve o receptor Tie-2 da tirosina cinase (aludido como “Tie-2” ou “Tie-2R” (também aludido como “ORK”); o Tie-2 de murino também é aludido como “tek”) e seus ligandos, as angiopoietinas (Gale, N. W. e Yancopoulos, G. D., Genes Dev. 13: 1055 a 1066 [1999]). Existem 4 angiopoietinas conhecidas; a angiopoietina-l (“Ang-1”) até a angiopoietina-4 (“Ang-4”). Estas angiopoietinas também são aludidas como “ligandos Tie-2”. (Davis, S., et al., Cell, 87: 1161 a 1169 [1996]; Grosios, K., et al., Cytogenet Cell Genet, 84: 118 a 120 [1999]; Holash, J., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42: 1617 a 1625 [1999]; Koblizek, T. I., et al., Current Biology, 8: 529 a 532 [1998]; Lin, P., et al., Proc Natl Acad Sei USA, 95: 8829 a 8834 [1998]; Maisonpierre, P.

C., et al., Science, 277: 5560 [1997]; Papapetropoulos, A., et al., Lab Invest, 79: 213 a 223 [1999]; Sato, T. N., et al., Nature, 375: 70 a 74 [1998]; Shyu,

K. G., et al., Circulation, 98: 2081 a 2087 [1998]; Suri, C., et al., Cell, 87: 1171 a 1180 [1996]; Suri, C, et al., Science, 282: 468 a 471 [1998]; Valenzuela, D. M., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 96: 1904 a 1909 [1999]; Witzenbichler, B., et al., J Biol Chem, 273: 18514 a 18521 [1998]). Enquanto que a ligação de Ang-1 ao Tie-2 estimula a fosforilação do receptor em células endoteliais cultivadas, a Ang-2 foi observada atuar tanto como agonista quanto como antagonista na fosforilação do receptor Tie-2 (Davis, S., et al., [1996], supra; Maisonpierre, P. C., et al., [1997], supra; Kim, I., J. H. Kim, etal., Oncogene 19(39): 4549 a 4552 (2000); Teichert-Kuliszewska, K., P. C. Maisonpierre, et al., Cardiovascular Research 49(3): 659 a 670 (2001)).

Os fenótipos de knockouts em Tie-2 e Ang-1 de camundongo são similares e sugerem que a fosforilação de Tie-2 estimulada pelo Ang-1 medeia a remodelagem e a estabilização de vasos em desenvolvimento no útero através da manutenção adesão celular sustentada pela célula endotelial (Dumont, D. J., et al., Genes & Development, 8: 1897 a 1909 [1994]; Sato, T. N., et al., Nature, 376: 70 a 74 [1995]; Suri, C., et al., [1996], supra). O papel de Ang-1 na estabilização de vaso é considerada ser conservada no adulto, onde ela é expressada ampla e constitutivamente (Hanahan, D., Science, 277: 48 a 50 [1997]; Zagzag, D., et al., Experimental Neurology, 159: 391 a 400 [1999]). Ao contrário, a expressão de Ang-2 é primariamente limitada aos sítios de remodelagem vascular, onde ela é julgada bloquear a função da Ang-1, induzindo deste modo um estado de plasticidade vascular condutiva à angiogênese (Hanahan, D., [1997], supra; Holash, J., et al., Science, 284: 1994 a 1998 [1999]; Maisonpierre, P. C., etal., [1997], supra).

Numerosos estudos publicados têm significantemente demonstrado a expressão seletiva em vaso da Ang-2 em estados de doença associados com a angiogênese. Estas condições patológicas incluem, por exemplo, psoríase, degeneração macular e câncer (Bunone, G., et al., American Joumal of Pathology, 155: 1967 a 1976 [1999]; Etoh, T., et al., Câncer Research, 61: 2145 a 2153 [2001]; Hangai, M., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42: 1617 a 1625 [2001]; Holash, J., et al., [1999] supra; Kuroda, K., et al., Joumal of Investigative Dermatology, 116: 713 a 720 [2001]; Otani, A., et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40: 1912 a 1920 [1999]; Stratmann, A., et al., American Joumal of Pathology, 153: 1459 a 1466 [1998]; Tanaka, S., et al., J Clin Invest, 103: 34 a 345 [1999]; Yoshida, Y., et al., Intemational Joumal of Oncology, 15: 1221 a 1225 [1999]; Yuan, K., et al., Joumal of Periodontal Research, 35: 165 a 171 [2000]; Zagzag, D., et al., [1999] supra). A maior parte destes estudos focalizaram no câncer, em que muitos tipos de tumor dão a impressão de demonstrar a expressão vascular de Ang-2. Ao contrário com a sua expressão na angiogênese patológica, a expressão de Ang-2 em tecidos normais é extremamente limitada (Maisonpierre, P. C., et al., [1997], supra; Mezquita,

J., et al., Biochemical e Biophysical Research Communications, 260: 492 a 498 [1999]). No adulto normal, os três sítios principais de angiogênese são o ovário, a placenta e o útero; Estes são os tecidos primários em tecidos normais (isto é, não cancerosos) em que o mRNA de Ang-2 foi detectado.

Certos estudos funcionais sugerem que a Ang-2 pode estar envolvida na angiogênese de tumor. Ahmad et al. (Câncer Res., 61: 1255 a 1259 [2001]) descrevem a supra-expressão de Ang-2 e mostram que ela está acentuadamente associada com um aumento no crescimento do tumor em um modelo de xenoenxerto de camundongo. Ver também Etoh et al., supra e Tanaka et al., supra, em que os dados estão apresentados associando acentuadamente a supra expressão de Ang-2 com a hipervascularidade de tumor. Entretanto, ao contrário, Yu et al. (Am. J. Path., 158: 563 a 570 [2001]) reportam dados para mostrar que a supraexpressão de Ang-2 no carcinoma pulmonar de Lewis e nas células de carcinoma mamário TA3 prolongou acentuadamente a sobrevivência de camundongos injetados com os transfectantes correspondentes.

Nos poucos anos passados, várias publicações sugeriram a Ang-1, Ang-2 e/ou Tie-2 como um alvo possível para a terapia anticâncer. Por exemplo, a Patente U.S. N~ 6.166.185, 5.650.490 e 5.814.464 cada uma divulga o conceito de anticorpos de ligando anti-Tie-2 e corpos receptores. Lín et al. (Proc. Natl. Acad. Sei USA, 95: 8829 a 8834 [1998]) injetaram um TÍe-2 que expressa adenovírus, solúvel em camundongos; o Tie-2 solúvel diminuiu acentuadamente o número e o tamanho dos tumores desenvolvidos pelos camundongos. Em um estudo relacionado, Lin et al (J. Clin. Invest., 100: 2072 a 2078 [1997]) injetaram uma forma solúvel de Tie-2 em ratos; este composto reduziu acentuadamente o tamanho do tumor nos ratos. Siemeister et al. (Câncer Res., 59: 3185 a 3189 [1999]) geraram linhagens de célula de melanoma humano que expressam o domínio extracelular de Tie-2, injetaram estas linhagens de célula em camundongos nus e concluíram que o Tíe-2 solúvel acentuadamente resultou em uma “inibição significante” do crescimento do tumor e angiogênese do tumor, em vista desta informação e dado que tanto a Ang-1 quanto a Ang-2 ligam-se ao Tie-2, não está claro a partir destes estudos se a Ang-1, a Ang-2 ou o Tie-2 seriam um alvo atraente para a terapia anticâncer.

A fusão de certos peptideos a uma proteína plasmática estável tal como uma região constante Ig para melhorar a meia vida destas moléculas foi descrita, por exemplo, na publicação PCT WO 00/24782, publicada em 4 de maio de 2000.

A fusão de uma proteína ou fragmento desta a uma proteína plasmática estável tal como uma região constante Ig para melhorar a meia vida destas moléculas foi variadamente descrita (ver, por exemplo, a Patente U.S. 5.480.981; Zheng et al., J. Immunol., 154: 5590 a 5600, (1995); Fisher et al., N. Engl. J. Med., 334: 1697 a 1702, (1996); Van Zee, K. et al., J. Immunol., 156: 2221 a 2230, (1996); Patente U.S. 5.808.029, concedida em 15 de setembro de 1998; Capon et al., Nature, 337: 525 a 531, (1989); Harvill et al., Immunotech., 1: 95 a 105, (1995); WO 97/23614, publicada em 3 de julho de 1997; PCT/US 97/23183, depositada em 11 de dezembro de 1997; Linsley, J. Exp. Med., 174: 561 a 569, (1991); WO 95/21258, publicada em 10 de agosto de 1995).

Uma terapia anti-Ang-2 eficaz poderia beneficiar uma vasta população de pacientes cancerosos por que a maior parte dos tumores sólidos requerem a neovascularização para crescer além de 1 a 2 milímetros no diâmetro. Tal terapia poderia ter aplicação mais ampla também em outras doenças associadas com a angiogênese, tais como retinopatias, artrite e psoríase.

Existe uma necessidade não desenvolvida para identificar novos agentes que especificamente reconheçam e se liguem à Ang-2. Tais agentes, seriam úteis para a triagem de diagnóstico e intervenção terapêutica em estados de doença que estão associados com a atividade da Ang-2.

Consequentemente, é um objetivo da presente invenção fornecer agentes de ligação específicos de Ang-2 que modulem a atividade da Ang-2. Tais agentes da presente invenção tomam a forma de pepticorpos, isto é, peptídeos fundidos a outras moléculas tais como um domínio Fc de um anticorpo, onde a porção peptídica específícamente se liga à Ang-2.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção está direcionada em uma forma de realização aos peptídeos (também aludidos aqui como polipeptídeos) que se ligam à Ang-2. Também abrangidos na presente invenção estão as variantes e derivados de tais peptídeos.

Em uma outra forma de realização, os peptídeos e variantes e derivados destes da presente invenção são vinculados aos veículos.

Em uma outra forma de realização, os peptídeos podem ser fundidos aos domínios Fc, fornecendo deste modo pepticorpos. Opcionalmente, os pepticorpos compreendem pelo menos um peptídeo, por exemplo, SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 76 - SEQ ID NO: 157, assim como variantes e derivados deste. Além disso, os peptídeos podem compreender pelo menos um peptídeo de acordo com as fórmulas apresentadas na SEQ ID NO: 65 - SEQ ID NO: 75 e na SEQ ID NO: 158.

Já em uma outra forma de realização, a invenção fornece moléculas de ácido nucléico que codificam os agentes de ligação específicos e variantes e derivados destes.

Ainda em uma outra forma de realização, a invenção fornece moléculas de ácido nucléico que codificam os pepticorpos, assim como variantes e derivados destes. Opcionalmente, tais moléculas de ácido nucléico incluem a SEQ ID NO: 33 - SEQ ID NO: 53.

Ainda em uma outra forma de realização, a invenção fornece um método de diminuir um tumor pela administração de uma quantidade eficaz dos agentes de ligação específicos da presente invenção a um paciente em necessidade deste. A invenção também fornece um método de inibir a angiogênese em um paciente, que compreende administrar uma quantidade eficaz dos agentes de ligação específicos da presente invenção a um paciente em necessidade deste. A invenção ainda fornece um método de tratar câncer em um paciente, que compreende uma quantidade eficaz dos agentes de ligação específicos da presente invenção a um paciente em necessidade deste.

A invenção também diz respeito a um polipeptídeo capaz de ligar a Ang-2 em que o polipeptídeo compreende a seqüência de aminoácido WDPWT (SEQ ID NO: 65) e em que o polipeptídeo é de 5 a 50 aminoácidos no comprimento, assim como aos sais deste fisiologicamente aceitáveis. O polipeptídeo também pode compreender a seqüência de aminoácido:

WDPWTC (SEQ ID NO: 66) e sais deste fisiologicamente aceitáveis. Adicionalmente, o polipeptídeo pode compreender a seqüência de aminoácido:

Cz²WDPWT (SEQ ID NO: 67) em que z é um resíduo de aminoácido polar, ácido ou neutro e sais deste fisiologicamente aceitáveis. O polipeptídeo pode ainda compreender a seqüência de aminoácido:

Cz² WDPWTC (SEQIDNO: 68) em que z é um resíduo de aminoácido polar, ácido ou neutro e sais deste fisiologicamente aceitáveis.

Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um polipeptídeo capaz de ligar Ang-2 que compreenda uma seqüência de aminoácido da fórmula:

a¹a²a³Ca⁵WDPWTCa¹²a¹³a¹⁴ (SEQIDNO: 69) em que:

a , a e a são cada um independentemente resíduos de aminoácido;

a⁵ é um resíduo de aminoácido;

a¹² está ausente ou é um resíduo de aminoácido;

a¹³ está ausente ou é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro, polar neutro ou um básico;

a¹⁴ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar neutro;

e sais deste fisiologicamente aceitáveis. Em uma forma de realização preferida:

a¹ é V, I, P, W, G, S, Q, N, E, K, R ou H;

a² é V, P, M, G, S, Q, D, E, K, R ou H;

a³ é A, V, P, M, F, T, G, D, E, K ou H; a⁸ é A, V, G, Q, N, D ou E;

=0 a¹² é S, Q, N, D, E, K ou R;

a¹³éL,Tou H; e a¹⁴éV, L, I, WouM.

Em uma forma de realização mais preferida, a¹ é Q; a² é E; a³ é E; a⁵ é D ou E; a¹² é D ou E; a¹³ é H; e a¹⁴ é M.

Será avaliado que o uso de letras minúsculas com números sobrescritos inclusos (tais como a¹ e b¹) são intencionadas para identificar posições de aminoácido e não são intencionadas a indicar as abreviações de letra única para um dado aminoácido. Aqui as abreviações de aminoácido de letra única são dadas em letras maiúsculas.

A invenção ainda diz respeito a um polipeptídeo capaz de ligar Ang-2 que compreenda uma seqüência de aminoácido da fórmula:

b¹b²b³b⁴b⁵b⁶Cb⁸WDPWTCb¹⁵b¹⁶b¹⁷b¹⁸b¹⁹b²⁰ (SEQIDNO: 70) em que:

b¹ está ausente ou é um resíduo de aminoácido;

b está ausente ou é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro, polar neutro ou um básico;

b³, b⁴, b⁵ e b⁶ estão cada um independentemente ausentes ou são resíduos de aminoácido;

b⁸ é um resíduo de aminoácido;

b¹⁵ está ausente ou é um resíduo de aminoácido;

b está ausente ou é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar neutro;

b , b e b estão cada um independentemente ausentes ou são resíduos de aminoácido;

e saís deste físiologicamente aceitáveis. Em uma forma de realização preferida:

b¹ está ausente ou A, V, L, P, W, F, T, G, S, Q, N, K, R ou H; b² está ausente ou A, V, L, I, P, W, Μ, T, G, S, Y, N, K, R ou H;

b³ está ausente ou A, L, I, P, W, Μ, T, G, S, Q, N, E, R ou H; b⁴ é V, I, P, W, G, S, Q, N, E, K, R ou H;

b⁵ é V, P, M, G, S, Q, D, E, K, R ou H;

b⁶ é A, V, P, M, F, T, G, D, E, K ou H;

b⁸éA, V, G, Q, N, DouE;

b^I5éS, Q, N, D, E, KouR; b¹⁶éL, TouH;

b¹⁷é V, L, I, WouM;

b¹⁸ está ausente ou A, V, L, P, W, F, T, G, Y, Q, D, E ou R;

b¹⁹ está ausente ou V, L, I, P, T, G, S, Y, Q, N, D, E ou R; e b²⁰ está ausente ou V, L, P, W, Μ, T, G, S, Y, Q, N, D, K ou R.

Em uma forma de realização mais preferida, b¹ está ausente ou

P ou T; b² está ausente ou I ou N; b³ está ausente ou R ou I; b⁴ é Q; b⁵ é E; b⁶é E; b⁸ é D ou E; b¹⁵ é D ou E; b¹⁶ é H; b¹⁷ é M; b¹⁸ está ausente ou W ou P; b¹⁹ está ausente ou G ou E; e b²⁰ está ausente ou V ou K.

Também será avaliado que a invenção preferivelmente diz respeito a um polipeptídeo que compreenda pelo menos uma seqüência de ^7 aminoácido selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 76 a SEQ ID NO: 118, inclusive, em que o polipeptídeo é capaz de ligarse à Ang-2, assim como sais deste fisiologicamente aceitáveis. As seqüências de peptídeo são apresentadas abaixo:

TABELA 1

PEPTÍDEO	SEQ ID NO.	SEQÜÊNCIA DE PEPTÍDEO
Con4-44	76	PIRQEECDWDPWTCEHMWEV
Con4-40	77	TNIQEECEWDPWTCDHMPGK
Con4-4	78	WYEQDACEWDPWTCEHMAEV
Con4-31	79	NRLQEVCEWDPWTCEHMENV
Con4-C5	80	AATQEECEWDPWTCEHMPRS
Con4-42	81	LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW
Con4-35	82	VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG
Con4-43	83	SISHEECEWDPWTCEHMQVG
Con4-49	84	WAAQEECEWDPWTCEHMGRM
Con4-27	85	TWPQDKCEWDPWTCEHMGST
Con4-48	86	GHSQEECGWDPWTCEHMGTS
Con4-46	87	QHWQEECEWDPWTCDHMPSK
Con4-41	88	NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR
Con4-36	89	KSGQVECNWDPWTCEHMPRN
Con4-34	90	VKTQEHCDWDPWTCEHMREW
Con4-28	91	AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM
Con4-39	92	PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM
Con4-25	93	RAPQEDCEWDPWTCAHMDIK
Con4-50	94	HGQNMECEWDPWTCEHMFRY
Con4-38	95	PRLQEECVWDPWTCEHMPLR
Con4-29	96	RTTQEKCEWDPWTCEHMESQ
Con4-47	97	QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS
Con4-20	98	QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL
C'on4-45	99	WAQQEECAWDPWTCDHMVGL
Con4-37	100	LPGQEDCEWDPWTCEHMVRS
Con4-33	101	PMNQVECDWDPWTCEHMPRS
AC2-Con4	102	FGWSHGCEWDPWTCEHMGST
Con4-32	103	KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP
Con4-17	104	GPRISTCQWDPWTCEHMDQL
Con4-8	105	STIGDMCEWDPWTCAHMQVD
AC4-Con4	106	VLGGQGCEWDPWTCRLLQGW
Con4-1	107	VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG
Con4-Cl	108	TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG
Con4-21	109	TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG
Con4-C2	110	TTIGSMCQWDPWTCAHMQGG
Con4-18	111	WVNEVVCEWDPWTCNHWDTP
Con4-19	112	VVQVGMCQWDPWTCKHMRLQ
Con4-16	113	AVGSQTCEWDPWTCAHLVEV
Con4-ll	114	QGMKMFCÊWDPWTCAHIVYR
Con4-C4	115	TTIGSMCQWDPWTCEHMQGG
Con4-23	116	TSQRVGCEWDPWTCQHLTYT
Con4-15	117	QWSWPPCEWDPWTCQTVWPS
Con4-9	118	GTSPSFCQWDPWTCSHMVQG
TN8-Con4*	4	QEECEWDPWTCEHM

* Será avaliado que certos peptídeos e/ou pepticorpos podem conter o prefixo “TN”, “TN8” ou “TN12” e que este prefixo pode estar presente ou não para um dado pepticorpo. Assim, por exemplo, os termos “TNS-Con4” e “Con4” são aqui usados intercambiavelmente.

Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a uma composição de matéria tendo a fórmula:

(χ'νκ'-ίχ²)» e multímeros desta, em que:

F¹ é um veículo;

X e X são cada um independentemente selecionados de

-OA-P';

-(L')_c-P'-(L²)_d-P²;

-(L')_c-P'-( L²)d-P²-(L³)e-P³; e

-ÍLWLk+lÃ-P/á-P⁴;

em que um ou mais de P, P², P³ e P⁴ cada um independentemente compreende um polipeptídeo como aqui descrito. Por exemplo, em uma forma de realização preferida, P¹, P², P³ e P⁴ cada um pode independentemente compreender um polipeptídeo da SEQ ID NO: 3 à SEQ 15 ID NO: 6, e/ou SEQ ID NO: 76 à SEQ ID NO: 157.

Em uma outra forma de realização, a composição de matéria é das fórmulas:

X^F¹ ou =U F’-X² e sais destes fisiologicamente aceitáveis, onde X¹, F¹ e X² são como aqui definidos. Em uma outra forma de realização, a composição de matéria é da fórmula:

F^l/X-P¹ e sais deste fisiologicamente aceitáveis, onde L , F¹ e P' são como aqui definidos. Já em uma outra forma de realização, a composição de matéria é da fórmula:

Γ'-ίΐ/νρ’-ίίΛτΡ² e sais deste fisiologicamente aceitáveis, onde L , F , P , P e c e d são como aqui definidos. Ainda em uma outra forma de realização a composição de matéria é da fórmula:

e sais deste fisiologicamente aceitáveis. Em uma forma de realização preferida, F¹ é um domínio Fc ou fragmento deste.

A invenção ainda diz respeito a um polipeptídeo capaz de ligar-se à Ang-2 que compreende uma seqüência de aminoácido da fórmula: Pc²Dc⁴Lc⁶c⁷c⁸LY (SEQ ID NO: 71) em que c² é um resíduo de aminoácido hidrofóbico, neutro c⁴ é um A, D ou E c⁶ é um resíduo de aminoácido ácido c⁷ é um resíduo de aminoácido; e c⁸ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro, polar neutro ou básico;

e sais deste fisiologicamente aceitáveis. Em uma forma de realização preferida, c é L ou M. Em uma outra forma de realização preferida, c⁶ é D ou E.

Ξ20 A invenção ainda diz respeito a um polipeptídeo capaz de ligar-se à Ang-2 que compreende uma seqüência de aminoácido da fórmula:

d¹d²d³d⁴Pd⁶Dd⁸Ld¹⁰d^,1d¹²LYd^l5d¹⁶d¹⁷d¹⁸d^I9d²⁰d²¹d²² (SEQ IDNO: 72) em que, d¹ está ausente ou é um resíduo de aminoácido;

d² está ausente ou é um resíduo de aminoácido polar neutro, ácido ou um básico;

d está ausente ou é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar neutro;

d⁴ está ausente ou é um resíduo de aminoácido;

d⁶ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico, neutro;

d⁸ é um A, D ou E;

d¹⁰ é um resíduo de aminoácido ácido;

d¹¹ é um resíduo de aminoácido;

d¹² é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro, polar neutro ou básico;

d¹⁵ está ausente ou é um resíduo de aminoácido polar neutro, ácido ou um básico;

d¹⁶ está ausente ou é um resíduo de aminoácido polar neutro, ácido ou um básico;

d¹⁷ está ausente ou é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar neutro;

d¹⁸ está ausente ou é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar neutro;

d¹⁹ está ausente ou é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro, polar neutro ou básico;

d²⁰ está ausente ou é um resíduo de aminoácido;

d²¹ está ausente ou é um resíduo de aminoácido polar neutro, ácido ou um básico;

d²² está ausente ou é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro, polar neutro ou básico;

d¹ é T, S, Q, RouH;

d²éT,Q,NouK;

d³éF;

d⁴ é M, Q, E ou K;

d⁶ é L ou M;

d⁸éDou E;

d¹⁰ é E;

d¹¹ é Q ou E;

d¹² é T ou R;

d¹⁵ Y, D, E ou K;

d¹⁶ é Q;

d¹⁷éWou F;

d¹⁸ é L, I, M ou T;

d¹⁹éL, FouY;

d²⁰éQ, DouE;

d²¹ está ausente, Q ou H;

d está ausente, A, L, G, S ou R.

Em uma forma de realização preferida, o polipeptídeo compreende pelo menos uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo 15 que consiste de SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 119 à SEQ ID NO: 142, inclusive, em que o polipeptídeo é capaz de ligar-se à Ang-2. As SEQ ID NO:

e SEQ ID NOS: 119 a 142 são apresentadas abaixo:

Peptídeo	SEQ ID NO.	Seqüência de peptídeo
Ll-1	119	QNYKPLDELDATLYEHFIFHYT
LI-2	120	LNFTPLDELEQTLYEQWTLQQS
Ll-3	121	TKFNPLDELEQTLYEQWTLQHQ
Ll-4	122	VKFKPLDALEQTLYEHWMFQQA
Ll-5	123	VKYKPLDELDEILYEQQTFQER
Ll-7	124	TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG
Ll-9	125	SKFKPLDELEQTLYEQWTLQHA
Ll-10	126	QKFQPLDELEQTLYEQFMLQQA
Ll-11	127	QNFKPMDELEDTLYKQFLFQHS
Ll-12	128	YKFTPLDDLEQTLYEQWTLQHV
Ll-13	129	QEYEPLDELDETLYNQWMFHQR
Ll-14	130	SNFMPLDELEQTLYEQFMLQHQ
Ll-15	131	QKYQPLDELDKTLYDQFMLQQG
Ll-16	132	QKFQPLDELEETLYKQWTLQQR
Ll-17	133	VKYKPLDELDEWLYHQFTLHHQ
Ll-18	134	QKFMPLDELDEILYEQFMFQQS
Ll-19	135	QTFQPLDDLEEYLYEQWIRRYH
LI-20	136	EDYMPLDALDAQLYEQFILLHG
Ll-21	137	HTFQPLDELEETLYYQWLYDQL
Ll-22	138	YKFNPMDELEQTLYEEFLFQHA
AC6-L1	139	TNYKPLDELDATLYEHWILQHS
Ll-Cl	140	QKFKPLDELEQTLYEQWTLQQR
L1-C2	141	TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR
L1-C3	142	TNFQPLDELDQTLYEQWTLQQR
LI	6	KFNPLDELEETLYEQFTFQQ

A invenção também diz respeito a um polipeptídeo capaz de ligar-se à Ang-2 que compreende uma seqüência de aminoácido da fórmula:

RPe³e⁴e⁵e⁶e⁷G (SEQ IDNO.73) em que e³ é um resíduo de aminoácido polar neutro;

e⁴ é um resíduo de aminoácido ácido;

e⁵ é um resíduo de aminoácido polar neutro ou um ácido;

e⁶ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico, neutro;

e⁷ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico, neutro;

e sais deste fisiologicamente aceitáveis. Em uma forma de realização preferida, e³ é Y ou C. Em uma outra forma de realização preferida, e⁴ é D ou E. Ainda em uma outra forma de realização preferida e⁶ é I ou Μ. A invenção ainda diz respeito a um polipeptídeo capaz de ligar-se à Ang-2 que compreenda uma seqüência de aminoácido da fórmula:

f^ f^f³ f^RPfVf^f¹ i Gf¹³f¹⁴f’ ^f^<¥ (SEQIDNO: 74) em que, f¹ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar neutro;

f² é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar neutro;

f³ é um resíduo de aminoácido polar neutro ou ácido;

f⁴ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar neutro;

f⁷ é um resíduo de aminoácido polar neutro;

f⁸ é um resíduo de aminoácido ácido;

f⁹ é um resíduo de aminoácido polar neutro ou ácido;

f¹⁰ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico, neutro;

neutro;

neutro; e neutro;

=0 f¹¹ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico, neutro;

f¹³ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar f¹⁴ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar f¹⁵ é um resíduo de aminoácido polar neutro;

f¹⁶ é um resíduo de aminoácido polar neutro;

f¹⁷ é um resíduo de aminoácido polar neutro ou ácido;

f¹⁸ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou básico;

f¹⁹ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar f²⁰ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar e sais deste fisiologicamente aceitáveis

Em uma forma de realização preferida:

f¹ é S, A ou G;

f² éG,QouP;

f³ é Q, G ou D;

f⁴ é L, M ou Q;

f⁷éCouY;

f⁸ é E ou D;

f°éE,GouD;

f¹⁰élou M;

fⁿéFouL;

f¹³éCouW;

f¹⁴ é G ou P;

f¹⁵TouN;

f¹⁶éQ, You K;

f¹⁷ é N, D ou Q;

f¹⁸éL, V, WouR; f¹⁹ é A, Q, Y ou I; e f°éL,A,GouV.

Em uma forma de realização mais preferida, a invenção diz respeito a um polipeptídeo que compreenda pelo menos uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 143 à SEQ ID NO: 148, inclusive, em que o polipeptídeo é capaz de ligar-se à Ang-2 e sais deste fisiologicamente aceitáveis. A SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 143 à SEQ ID NO: 148 são como segue.

Peptídeo	SEQ ID NO:	Seqüência
Conl-1	143	AGGMRPYDGMLGWPNYDVQA
Conl-2	144	QTWDDPCMHILGPVTWRRCI
Conl-3	145	APGQRPYDGMLGWPTYQRIV
Conl-4	146	SGQLRPCEEIFGCGTQNLAL
Conl-5	147	FGDKRPLECMFGGPIQLCPR
Conl-6	148	GQDLRPCEDMFGCGTKDWYG
Conl	3	KRPCEEIFGGCTYQ

Ainda em um outro aspecto, a invenção diz respeito a um polipeptídeo capaz de ligar-se à Ang-2 que compreenda uma seqüência de aminoácido da fórmula:

Cg²Gg⁴g⁵DPFTg^{10 * *}GCg¹³ (SEQ IDNO: 75) em que g² é um resíduo de aminoácido ácido;

g⁴ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico, neutro;

g⁵ é E, D ou Q;

g¹⁰ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar neutro;

T g é um resíduo ácido;

e sais deste fisiologicamente aceitáveis. Em uma forma de realização preferida, g² é E ou D. Em uma outra forma de realização preferida, g⁴ é V ou M. Já em uma outra forma de realização, g¹⁰ é F ou Q.

<

Ainda em uma outra forma de realização, g é D ou E.

A invenção ainda diz respeito a um polipeptídeo capaz de ligar-se à Ang-2 que compreenda uma seqüência de aminoácido da fórmula: h¹h²h³h⁴Ch⁶Gh⁸h⁹DPFTh¹⁴GCh¹⁷h¹⁸h¹⁹h²⁰ (SEQIDNO: 158) em que, h¹ está ausente ou é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro, polar neutro ou um básico;

h² é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar neutro;

h³ é um resíduo de aminoácido ácido;

h⁴ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar neutro;

h⁶ é um resíduo de aminoácido ácido;

h⁸ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico, neutro; h⁹éE,Dou Q;

h¹⁴ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar neutro;

h¹⁷ é um resíduo de aminoácido ácido;

h¹⁸ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro, polar neutro ou um básico;

h¹⁹ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar neutro; e h²⁰ está ausente ou é um resíduo de aminoácido;

e sais deste fisiologicamente aceitáveis.

Em uma forma de realização preferida, h¹ está ausente ou A, L, M, G, K ou H;

h² é L, F ou Q;

h³ é D ou E;

h⁴ é W ou Y;

h⁶ é D ou E;

h⁸éVou M;

h¹⁴ é F ou Q;

h¹⁷ é D ou E;

h¹⁸éM, Y, NouK;

h¹⁹ é L ou Q; e h²⁰ está ausente ou Μ, T, G, S, D, K ou R.

Em uma forma de realização mais preferida, a invenção diz respeito a um polipeptídeo que compreenda pelo menos uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo que consiste da SEQ ID NO: 5 ou SEQ ED NO: 149 à SEQ ID NO: 157 inclusive, em que o dito polipeptídeo é capaz de ligar-se à Ang-2 e sais deste fisiologicamente aceitáveis. A SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 149 à SEQ ID NO: 157 são apresentadas abaixo.

•az

Peptídeo	SEQ ID NO:	Seqüência
12-9-1	149	GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT
12-9-2	150	KLEYCDGMEDPFTQGCDNQS
12-9-3	151	LQEWCEGVÉDPFTFGCEKQR
12-9-4	152	AQDYCEGMEDPFTFGCEMQK
12-9-5	153	LLDYCEGVQDPFTFGCENLD
12-9-6	154	HQEYCEGMEDPFTFGCEYQG
12-9-7	155	MLDYCEGMDDPFTFGCDKQM
12-9-C2	156	LQDYCEGVEDPFTFGCENQR
12-9-C1	157	LQDYCEGVEDPFTFGCEKQR
12-9	5	FDYCEGVEDPFTFGCDNH

Em uma forma de realização altamente preferida, a invenção diz respeito a um uma composição de matéria tendo a fórmula:

(X'),-F'-(X²)_r e multímeros desta, em que:

F¹ é um veículo;

X e X são cada um independentemente selecionados de

-(L')_s-P';

-(L^s-P^CL²),-?²;

-(LV-( L²)t-P²-(L³)U-P³; e

-(L¹)_s-P¹-( L²)t-P²-(L³)U-P³-(L⁴)_V“P⁴;

em que um ou mais de P¹, P², P³ e P⁴ cada um compreende independentemente um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de:

(a) a seqüência de aminoácido WDPWT (SEQ ID NO: 65), em que o dito polipeptídeo é de 5 a 50 aminoácidos no comprimento;

(b) a seqüência de aminoácido WDPWTC (SEQ ID NO: 66);

(c) a seqüência de aminoácido Cz²WDPWT (SEQ ID NO: 67), em que z² é um resíduo de aminoácido polar, ácido ou neutro;

(d) a seqüência de aminoácido Cz²WDPWTC (SEQ ID NO: 68), em que z² é um resíduo de aminoácido polar, ácido ou neutro;

(e) a seqüência de aminoácido Pc²Dc⁴Lc⁶c⁷c⁸LY (SEQ ID NO: 71) em que c² é um resíduo de aminoácido hidrofóbico, neutro; c⁴ é A, D ou E; c⁶ é um resíduo de aminoácido ácido; c⁷ é um resíduo de aminoácido; e c⁸ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro, polar neutro ou básico;

(f) a seqüência de aminoácido RPe³e⁴e⁵e⁶e⁷G (SEQ ID NO: 73) em que e³ é um resíduo de aminoácido polar neutro; e⁴ é um resíduo de aminoácido ácido; e⁵ é um resíduo de aminoácido polar neutro ou um ácido; e é um resíduo de aminoácido hidrofóbico, neutro; e e é um resíduo de aminoácido hidrofóbico, neutro;

(g) a seqüência de aminoácido Cg²Gg⁴g⁵DPFTg¹⁰GCg¹³ (SEQ ID NO: 75) em que g² é um resíduo de aminoácido ácido; g⁴ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico, neutro; g⁵ é um resíduo de aminoácido polar neutro ou um ácido; g¹⁰ é um resíduo de aminoácido hidrofóbico neutro ou polar neutro; e g é um resíduo ácido;

(h) um polipeptídeo da SEQ ID NO: 1;

(i) um polipeptídeo da SEQ ID NO: 2; e (j) um polipeptídeo da SEQ ID NO: 7;

em que L¹, L², L³ e L⁴ são cada um independentemente ligadores; eq,r, s, t, ue v são cada um independentemente 0 ou 1, contanto que pelo menos um de q e r seja 1;

e sais deste fisiologicamente aceitáveis.

Será avaliado que a invenção ainda diz respeito a um polipeptídeo de fusão que compreenda pelo menos um peptideo descrito como 5 aqui descrito e um veículo, em que o polipeptídeo de fusão é capaz de ligar-se à Ang-2 e sais deste fisiologicamente aceitáveis. No polipeptídeo de fusão, o veículo é preferivelmente pelo menos um de um domínio Fc, polietileno glicol, um lipídeo, um grupo colesterol, um carboidrato e um oligossacarídeo. Outros veículos adequados, tais como albumina e outros, serão avaliados por 10 aqueles habilitados na técnica e estão abrangidos dentro do escopo da invenção.

Uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que várias moléculas pode ser inseridas na estrutura de agente de ligação específica. Assim uma dada molécula pode ser inserida, por exemplo, entre as porções de 15 peptideo e veículo dos agentes de ligação específicos ou inserida dentro da própria porção de peptideo, enquanto retém a atividade desejada do agente de ligação específico. Uma pessoa pode facilmente inserir por exemplo, moléculas tais como um domínio Fc ou fragmento deste, polietileno glicol ou outras moléculas relacionadas tais como dextrano, um ácido graxo, um Ξ20 lipídeo, um grupo colesterol, um carboidrato pequeno, um peptideo, um agente citotóxico, um agente quimioterapêutico, uma porção detectável como aqui descrita (que inclui agentes fluorescentes, radiorrótulos tais como radioisótopos), um oligossacarídeo, oligonucleotídeo, um polinucleotídeo, RNA de interferência (ou outro), enzimas, hormônios ou coisa parecida.

Outras moléculas adequadas para a inserção deste modo serão avaliadas por aqueles habilitados na técnica e estão abrangidas dentro do escopo da invenção. Isto inclui a inserção, por exemplo, de uma molécula desejada entre dois aminoácidos consecutivos, opcionalmente unidos por um ligador adequado. Por via de exemplo, na seqüência de pepticorpo Con4(C):

M-Fc-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE (SEQ ID NO: 23) uma pessoa habilitada na técnica poderia facilmente inserir uma molécula desejada entre, por exemplo, os dois resíduos de glutamina adjacentes (“QQ”) para obter uma estrutura e/ou função desejada, enquanto 5 retém a capacidade do peptídeo para ligar-se à Ang-2. Assim, esta seqüência seria modificada como segue:

M-Fc-GGGGGAQ-[molécuIa]-QEECEWDPWTCEHMLE

Moléculas ligadoras adequadas podem ser adicionadas se desejado. Será ainda avaliado que a molécula pode ser inserida em vários 10 locais na molécula, incluindo nas cadeias laterais adequadas, entre o veículo e a seqüência de peptídeo como segue:

M-Fc-[molécuIa]-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE ou em qualquer outro local desejado por uma pessoa habilitada na técnica. Outras formas de realização adequadas estarão evidentes àqueles 15 habilitados na técnica.

Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a um polinucleotídeo que codifica os agentes de ligação específicos (incluindo, mas não limitado aos peptídeos e/ou pepticorpos) da invenção, como aqui descritos. Uma pessoa habilitada na técnica avaliará que onde a seqüência de aminoácido é conhecida, a(s) seqüência(s) de nucleotídeo correspondente(s) pode(m) ser facilmente determinada(s) usando técnicas conhecidas. Ver por exemplo Suzuki, D., A Introduction to Genetic Analysis, W. H. Freeman Pub. Co. (1986). As seqüências de nucleotídeo exemplares que codificam os peptídeos da invenção são apresentadas abaixo. Uma pessoa 25 habilitada na técnica reconhecerá que mais do que um códon pode codificar um dado aminoácido e portanto a invenção diz respeito a qualquer seqüência de nucleotídeo que codifique os peptídeos e/ou pepticorpos da invenção.

Peptídeo	Seq. Id No.	Seqüência de peptídeo	Seqüência de DNA Exemplar
Con4-44	76	PIRQEECDWPWTCEHMWEV	ccgatccgtcaggaagaatgcga ctgggacccgtggacctgcgaâc acatgtgggaagtt (SEQ ID NO: 159)
Con4-40	77	TNIQEECETOPWTCDHMPGK	accaacatccaggaagaatgcga atgggacccgtggacctgcgacc acatgccgggtaaa (SEQ ID ÍNO: 160)
Con4-4	78	WYEQDACEWDPWTCEHMAEV	tggtaGgaacaggacgcttgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatggctgaagtt (SEQ ID NO: 161)
Con4-31	79	NRLQEVCSWDPWTX^EHMENV	aaccgtçtgcaggaagtttgcgâa tgggacccgtggacctgcgaaca catggaaaacgtt (SEQ ID NO: 162)
Con4- C5	80	AATQEECEWDPWTCEHMPRS	gctgctacccaggaagaatgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatgocgcgttcc (SEQ ID NO: 163)
Con4~42	81	LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW	ctgcgteaccaggaaggttgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatgttcgactgg (SEQ ID NO; 164)

Con4-35	82	VPRQKDCEWDPWrCEHMYVG	gttccgcgtcagaaagactgcga atgggacccgtggacctgcgaac acátgtacgttggt (SEQ ID NO: 165)
Con4-43	83	SISHEECEWDPWTCEHMQVG	tccatctcccacgaagaatgcgaa tgggacccgtggacctgcgaaca catgcaggttggt (SEQ ID NO: 360)
Con4-49	84	WAAQEECEWDPWTCEHMGRM	tgggctgcteaggaagaatgcga atgggatccgtggacttgcgaaca catgggtcgtatg (SEQ ID NO: 166)
Con4-27	85	TWPQDKCEWDP^HCEHMGST	acttggccgcaggacaaatgcga atgggmgtggaettgçgam catgggttetact (SEQ ID NO: 167)
Con4-48	86	GHSQEECGWDPWTCEHMGTS	ggtcactcccaggaagaatgcgg ttgggacccgtggacctgcgaac acatgggtacgtcc (SEQ ID NO: 168)
Con4-46	87	QHWQEECEWDPWTCDHMPSK	cagcactggcaggaagaatgcga atgggacccgtggacctgcgacc acatgccgtccaaa (SEQ ID NO; 169)
Con4-41	88	NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR	aacgttcgteaggaaaaatgcgaa tgggacccgtggacctgcgaaca catgccggttegt (SEQ ID NO: 170)
Cou4-36	89	KSGQVECNWDPWTCEIIMPRN	aaatccggtcaggttgaatgcaac tgggacccgtggacctgcgaaca catgccgcgtaac (SEQ ID NO: 171)
Con4-34	90	VKTQEHCDWDPWTCEHMREW	gttaaaacccággaacactgcga ctgggacccgtggacctgcgaac acatgcgtgaatgg (SEQ ID NO: 172)
Con4-28	91	AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM	gcttggggtcaggaaggttgcga ctgggacccgtggacctgcgaac acatgctgccgatg (SEQ ID NO: 173)
Con4-39	92	PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM	ccggttaaccaggaagactgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatgccgccgatg (SEQ ID NO: 174)

Con4-25	93	RAPQEDCEWDPWTCAIIMDIK	cgtgctccgcaggaagactgcga atgggacccgtggacctgcgcte acatggacatcaaa (SEQ ID NO: 175)
Con4-50	94	HGQNMECEWDPWrCEITMFRY	cacggtcagaacatggaatgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatgttccgttac (SEQ ID NO: 176)
Con4-38	95	PRLQEECVWDPWrCEHMPLR	ccgcgtctgcaggaagaatgcgtt tgggacccgtggacctgcgaaca catgccgctgcgt (SEQ ID NO: 177)
Con429	96	RITQEKCEWDPWTCEHMESQ	cgtaccacccaggaaaaatgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatggaatcccag (SEQ ID NO: 178)
Con4-47	97	QTSQEDCWDPWTCDI4MVSS	cagacctcccaggãagactgcgtt tgggacccgtggacctgcgacca catggtttcctcc (SEQ ID NO: 179)
CoM-20	98	QVÍGlUrBWDPWTCEHLEGL	caggttatcggtcgtccgtgcgaa tgggacccgtggacctgcgaaca cctggaaggtctg (SEQ ID NO: 180)
Con4-45	99	WAQQEECAWDPWTCDHMVGL	tgggctcagcaggaagaatgcgc ttgggacccgtggacctgcgacc acatggttggtctg (SEQ ID NO: 181)
Con4-37	100	LPGQEDCEWDPWTCEHMVRS	ctgccgggtcaggaagactgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatggttcgttcc (SEQ ID NO: 182)
Con4-33	101	PMNQVECD wdp wtcehmprs	ccgatgaaccaggttgaatgcga ctgggacccgtggacctgcgaac acatgccgcgttcc (SEQ CD NO: 183)
AC2- Con4	102	FGWSHGCEWPWTCEHMGST	ttcggttggtctcacggttgcgaat gggatecgtggacttgcgaacac atgggttctacc (SEQ D£> NO: 184)
Con4-32	103	KSTQDDCDWDPWTCEWVGP	aaatccacccaggacgactgcga ctgggacccgtggacctgcgaac acatggttggtccg (SEQ ID NO: 185)

Con4-17	104	GPRISTCQWDPWTCEHMDQL	—.................^:·™ · - -....... ......... ggtccgc gtatctccacctgccag tgggacccgtggacctgcgaaca catggaccagcÊg (SEQ ID NO: 186)
Con4-8	105	ST1GDMCEWDPWTCAHMQVD	tccaccatcggtgacatgtgcgaa tgggacccgtggacctgcgctca catgcaggttgac (SEQ ID NO: 187)
A.C4- Con4	.106	VIájGQGCEWDPWTCRLLQGW	gttctgggtggtoagggttgcgaa ítgggacccgtggacctgccgtctg ctgcagggttgg (SEQ ID NO: 188)
Con4-I	107	VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG	g^tetãggtggtcagggttgccag tgggaçccgtggacctgctecca cctggaagacggt (SEQ ID NO: 189)
Con4~ Cl	108	TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG	accaccatcggttccatgtgcgaa tgggacccgtggacçtgcgctoa catgcagggtggt (SEQ ID NO: 190)
Con4-21	109	TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG	accaaaggtaaatccgtttgccag tgggaoccgtggacctgctccca catgcagtccggt (SEQ ID NO: 191)
Con4- C2	110	TEIGSMCQWDPWTCAHMQGG i	accacc atcggttccatgtgccag tgggacccgtggacctgcgctca catgcagggtggt (SEQ ID NO: 192)
Con4-18	111	WVNEVVCEWDPWTCNHWDIP	tgggttaacgaagttgtttgcgaat gggacccgtggacctgcaaccac tgggacacccog (SEQ ID NO: 193)
Con4“19	112	VVQVGMCQWDPWTCEHMRLQ	gttgttcaggttggtatgtgccagt gggacccgtggacctgcaaacac atgcgtctgcâg (SEQ ID NO: 194) \|

Con4“16	113	ÂVGSQTCEWDPWTCAHLVEV	gôtgttggttcccagacctgcgaat gggacccgtggacctgcgcfôac ctggttgaagtt (SEQID NO: 195)
Con4-ll	114	QGMIO1FCEWDPWTCAHIVYR	cagggtatgaaaatgttctgcgaat gggacccgtggacctgcgçtcac aíGgtttaccgt (SEQ ID NO: 196)
Con4- C4	115	TTIGSMCQWDFWTCEHMQGG	accaccatcggttccatgtgccag tgggacccgtggacctgcgaaca catgcagggtggt (SEQ ID NO: 197)
Coii4-23	116	TSQRVGCEWDPWTCQHLTYT	acctcccagcgtgttggttgcgaat gggacccgtggacctgccagcac ctgacctacacc (SEQ ID NO: 198)
Con4-15	117	QWSWPCEWDPWTCQTVWPS	cagtggtcctggccgccgtgcga atgggacccgtggacctgccaga ccgtttggccgtcc (SEQ ID NO: 199)
Con4-9	118	GTSPSFCQWDPWTCSHMVQG	ggtacctccccgtccttotgccagt gggacccgtggacctgctcccac atggttcagggt(SEQ!D NO: 200)
TN8- Con4	4	QEECEWDPWTCEHM	çaggaagaatgcgaatgggaccc atggacttgcgaacacatg (SEQIDNO: 201)

Lll	119	QNY^WEWATLYEHFIFHYT	cagaactacaaaccgctggacga actggacgctaccctgtacgaaca cttcatcttocactacacc (SEQ ID NO: 202)
Ll-2	120'	LNFTPLDELEQTLYEQUmLQQS	ctgaacttcaccccgctggacgaa ctggaacagaccctgtacgaaca gtggaccctgcagcagtcc (SEQIDNO: 203)
: Ll-3	121	TKJWLDELEQTLYEQWTLQIIQ	accaaartcaacccgctggacga actggaacagaccçtgtacgaac í agtggaccctgcagcaccag (SEQ ID NO: 204)

L14	122	VKFKPLDALEQTLYEHWMFQQA	gttaaattcaaaccgctggacgct ctggaacagaccctglacgaaca ctggatgttccagcaggct (SEQ IDNO: 205)
Ll-5	123	VKYKPLDELDEnATQQTFOER	gttaaatacaaaccgctggacgaa ctggacgaaatcctgtacgaacag cagaccttccaggaacgt (SEQ IDNO: 206)
Ll-7	124	TNFiMPMDDLEQRLVTQFILQQG	acc aacttcatgccgatggacgac ctggaacagcglctgtacgaaca ^!gttcatcctgc agcagggt (SEQIDNO: 207)
Ll-9	125	SKFKPLDELEQTLYEQWTLQHA	tccaaattcaaacGgctggacgaa ctggaac agacGcEgtaegaaca gtggaccctgcagcacgct (SEQ.jp NO: 2081.....................
L140	126	QKFQPLDELEQTLYIÍQFMT^QQA	cagaaattccagccgctggacga actggaacagaccctgtacgaac agttcatgctgcagcaggct (SEQIDNO: 209)
Ll-11	127	QNFKPMDELEDTLYKQFLFQHS	cagaacttcaaaccgatggacga attggaagacaccctgtacaaaca gttectgttccagcactcc (SEQ IDNO: 210)
Ll-12	128	ykftplddleqtlyeqwtlqhv	tacaaattcaccccgçtggacgac ctggaacagaccc tgtac gaaca gtggaccctgcagcacgtt (SEQIDNO: 211)
Ll-13	129	QFARiPEDFJJ/ETLYNQWMFHQR	caggaaUcgaaccgctggacga actggacgaaaccctgtacaacc agtggatgttocaccagcgt (SEQ IDNO: 212)
LM4	130	SNFMPLDELEQTIATQFMLQHQ	tccaacttcatgccgctggacgaa ctggaaçagaccctgtacgaaca gttcatgctgcagcaccag (SEQ IDNO: 213)
Ll-15	131	QKYQPLDELDKTLYDQEMLQQG	cagaaataccagccgjctggacga actggacaaaaccctgtacgatca gttoatgctgcagcagggt (SEQ ID NO: 214)

Ll-16	132	QKFQPLDELEETLYKQWTLQQR	cagaaattccâgccgctggacga actggaagaaaccctgtacaaac > agtggaccctgcagcagcgt (SEQIDNO: 215)
LM7	133	VKYKPLDELDEWLYHQFTLHHQ	gttaaatacaaaccgctggacgaa ctggacgaatggctgtaccacca gttcaccctgcaccaçcag (SEQIDNO: 216)
LI-18	134	QKFMPLDELDEILYEQFMFQQS	cagaaattcatgccgctggac gaa ctggacgaaatoctgtacgaacag ttcatgttccagcagtccc (SEQ ID NO: 217)
Ll-19	135	QTFQPLDDLEEYLYEQWIRRYEI	Gagaccttccagccgclggacga cctggaagaatacttgtacgaaca gtggatccgtcgttaccac i (SEQIDNO: 218)
Ll-20	136	EDYNWLDAEDAQLYEQFILLHG	gaagactacatgccgctggacgc tctggacgctcagctgtacgaaca gttcatcctgctgcacggt (SEQ IDNO: 219)
Ll-21	137	HTFQPLDELEETLYYQWLYDQL	cacaccttccagccgctggacga actggaagaaaccctgtactacca gtggctgtacgaccagctg (SEQ IDNO: 220)
Ll-22	138	YKFWMDELEQTLYEEFLFQIÍA	tacaaattcaacccgatggacgaa ctggaacagaccctgtacgaaga attectgttccagcacgct (SEQ ID NO: 221)
AC6-L1	139	TNYKPLDELDATLYEHWILQHS	accaactacaaaccgctggacga actggacgctaccctgtacgaaca ctggatcctgcagcactcc (SEQIDNO: 222)
Li-Cl	140	QKFOLDELEQTEYEQWTLQQR	cagaaattcaaaccgctggacga actggaacagaccctgtacgaac agtggaccctgcagcagcgt (SEQ IDNO: 223)
L1-C2	141	TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR	^xaaattccagccgctggacga actggaccagaecctgtacgaac agtggaccctgcagcagcgt (SEQIDNO: 224)

L1-C3	142	TNFQFLDEIDQTLYEQWTLQQR	ãccaacttccagccgctggacga actggaecagaccctgtacgaac agtggaccctgcagcagçgt. (SEQIDNO: 225)
LI	6	KFNPLDELEETLYEQFTFQQ	aaattcaacccgctggacgagctg gaagagactctgtacgaacagttt acttttcaacag (SEQ ID NO: 226)

Conl-1	143	AGGMRPYDGMLGWPNYDVQÁ	gctggtggtatgcgtccgtacgac ggtatgctgggttggccgaactaG gacgttcaggct (SEQ ID NO: 227)
Conl-2	144	QTWDDPCMHILGPVTWRRCI	cagacttgggacgatccglgcatg cacattctgggÉccggttacttggc gtcgttgcatc (SEQ ID NO: 228)
ConI-3	145	APGQRPYDGMLGWPTYQRIV	gctccgggtcagcgtccgtacga cggtatgctgggttggccgaccta ccagcgtatcgtt (SEQ ID NO: 229)
Conl-4	146	SGQLRPCEETGCGTQNLAL	tccggtcagctgcgtecgtgcgaa gaaalcttcggttgcggtacccag aacctggctctg (SEQ ID NO: 230)
Conl-5	147	FGDKRPLECMFGGPIQLCPR	ttcggtgacaaacgtccgçtggaa tgcatgttcggtggtccgatccag ctgtgcccgcgt (SEQ ID NO: 231)
Conl-6	148	GQDLRPCEDMFGCGTKDWYG	ggtcaggacctgçgtcGgtgcga agacatgttcg^tgcggtaccaa agactggtacggt (SEQ ID NO: 232)

12-9-1	149	GFEYCIXjMEDPFrFGCDKQT	ggtttcgaatactgcgacggtatg gaagacccgttcacctteggttgc gacaaacagacG (SEQ ID NO: 233)
» 12-9-2	150	KLEYCDGMEDPFTQGCDNQS	aaactggaatactgcgacggtatg gãagacccgttcacccagggttg cgacaaccagtcc (SEQ ID NO: 234)
12-9-3	151	L,QEWCEGVEDPFTFGCEKQR	ctgcaggâatggtgcgaaggtgtt

			gaagacocgttcaccttcggttgc gaaaaacagcgt (SEQ ID NO: 235)
12-9-4	152	AQDYCEGMEDPFIWCEMQK	gctcaggactautgcgaaggtatg gaagacccgttcaccttcggttgc gaaatgcagaaa (SEQ ID NO: 236)
12-9-5	153	LLDYCEGVQDPFTFGC.ENID	ctgctggactactgcgaaggtgtt caggacccgttcaccttcggttgc gaaaacctggac (SEQ ID NO: 237)
12-9-6	154	HQEYCEGMEDPFEFGCETQG	caccaggaatactgcgaaggtat¹ggaagacccgttçaccttcggttg cgaataccagggt (SEQ ff> NO: 238)
12-9-7	155	MLDYCEGMDDPFTFGCDKQM	atgctggactactgcgaaggtatg gacgacccgttcaccttcggttgc gacaaacagatg (SEQ ID NO: 239)
12-9-02	156	LQDYCEGVEDPFTFGCENQR	çtgcaggactactgcgaaggtgtt gaagacccgttcaccttcggttgc gaaaaccagcgt (SEQ ID NO: 240)
12-9-C1	157	LQDYCEGVEDPFTFGCEKQR	ctgcaggactactgcgaaggtgtt gaagacccgttcaccttcggttgc gaaaaacagcgt (SEQ ID NO: 241)
12-9	5	FDYCEGVEDPFTFGCDNH	ttcgactactgcgaaggtgttgaa gacccgttcactttcggctgtgata accac (SEQ Π) NO: 242)

Ainda em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a vetores de expressão que compreendem pelo menos um polinucleotídeo da invenção. Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito a células hospedeiras que compreendem o vetor de expressão. 5 Será avaliado que as células hospedeiras são preferivelmente células procarióticas (tais como células de E. coli) ou células eucarióticas.

A invenção também diz respeito a uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de uma composição como aqui descrita, em mistura com um portador farmaceuticamente aceitável.

A invenção também diz respeito a um método de inibir a angiogênese indesejada em um mamífero que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou composição como 5 aqui descritos. A invenção também diz respeito a um método de modular a angiogênese em um mamífero que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou composição como aqui descritos. A invenção ainda diz respeito a um método de inibir o crescimento de tumor caracterizado pela angiogênese indesejada em um mamífero que 10 compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou composição como aqui descritos. Adicionalmente, a invenção diz respeito a um método de tratar câncer em um mamífero que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou composição como aqui descritos e um agente quimioterapêutíco. Em uma 15 forma de realização preferida, o agente quimioterapêutíco é pelo menos um de 5-FU, CPT-11 e Taxotere. Será avaliado, entretanto, que outros agentes quimioterapêuticos adequados e outras terapias contra o câncer podem ser usados.

A invenção também diz respeito a um método de modular pelo “10 menos um de permeabilidade vascular ou vazamento de plasma em um mamífero que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou composição como aqui descritos. A invenção ainda diz respeito a um método de tratar pelo menos um de doença neovascular ocular, obesidade, hemangioblastoma, hemangioma, 25 arteriosclerose, doença inflamatória, distúrbios inflamatórios, aterosclerose, endometriose, doença neoplástica, doença relacionada com o osso ou psoríase em um mamífero que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo ou composição como aqui descritos.

Será avaliado que os agentes de ligação específicos da invenção podem ser usados para tratar várias doenças associadas com a angiogênese desregulada ou indesejada. Tais doenças incluem, mas não são limitadas à neovascularização ocular, tais como retinopatias (que inclui a 5 retinopatia diabética e a degeneração macular relacionada com a idade), psoríase, hemangioblastoma, hemangioma, arteriosclerose, doença inflamatória, tais como uma doença inflamatória reumatóide ou reumática, especialmente artrite (que inclui a artrite reumatóide) ou outros distúrbios inflamatórios crônicos, tais como a asma crônica, aterosclerose arterial ou 10 pós-transplantacional, endometriose e doenças neoplásticas, por exemplo os chamados tumores sólidos e tumores líquidos (tais como leucemias). As doenças adicionais que podem ser tratadas pela administração dos agentes de ligação específicos estará evidente àqueles habilitados na técnica. Tais doenças adicionais incluem, mas não são limitadas à obesidade, 15 permeabilidade vascular, vazamento de plasma e distúrbios relacionados com o osso, que incluem a osteoporose. Assim, a invenção ainda diz respeito a métodos de tratar estas doenças associadas com a angiogênese desregulada ou indesejada.

Outras formas de realização desta invenção estarão facilmente Σ20 evidentes a partir da divulgação fornecida com estas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS

A Figura 1 representa um gráfico do volume do tumor (eixo y) versus o tempo (eixo x) em camundongos que carregam o tumor A-431 tratados com o pepticorpo TN8-Con4-C da presente invenção ou com solução 25 salina tamponada com fosfato (PBS). Os detalhes estão descritos nos Exemplos.

A Figura 2 representa um gráfico da concentração de pepticorpo (eixo y) versus o tempo no pós-dose (eixo x) em camundongos do tipo selvagem tratados com uma dose de 50 pg de pepticorpo 2xCon4-C, Ll35

7-N ou L1-21-N. Os detalhes estão descritos nos Exemplos.

A Figura 3 representa um gráfico do volume do tumor (eixo y) versus o tempo (eixo x) em camundongos que carregam o tumor A431 tratados com pepticorpo 2xCon4-C de acordo com a presente invenção ou com solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou pepticorpo de controle. Os detalhes estão descritos nos Exemplos.

A Figura 4 representa um gráfico que representa o crescimento in vitro de células A431 cultivadas tratadas com pepticorpo Con4-C de acordo com a presente invenção, pepticorpo de controle ou não tratadas. Os detalhes estão descritos nos Exemplos.

A Figura 5 representa um gráfico do volume do tumor (eixo y) versus o tempo (eixo x) em células de tumor Colo205 tratadas com pepticorpo Con4-C, pepticorpo Ll-7-N, pepticorpo L1-21-N ou pepticorpo 2xCon4-C de acordo com a presente invenção ou com solução salina tamponada com fosfato (PBS), anticorpo anti-Ang-2 (Ab536) ou Fc. Os detalhes estão descritos nos Exemplos.

A Figura 6 representa um gráfico do volume do tumor (eixo y) versus o tempo (eixo x) em camundongos que carregam o tumor de xenoenxerto de Colo205 tratados com doses variáveis de pepticorpo 2xCon4-C de acordo com a presente invenção ou com solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou Fc. Os detalhes estão descritos nos Exemplos.

A Figura 7 representa um gráfico do volume do tumor (eixo y) versus o tempo (eixo x) em camundongos que carregam o tumor de xenoenxerto de Colo205 tratados com pepticorpo 2xCon4-C de acordo com a presente invenção ou com pepticorpos de controle. A Figura 7 também representa um gráfico da área tingida com CD31/área total do tumor para estes pepticorpos. Os detalhes estão descritos nos Exemplos.

A Figura 8 representa um gráfico do volume do tumor (eixo y) versus o tempo (eixo x) em camundongos que carregam o tumor de xenoenxerto de Colo205 tratados com o pepticorpo 2xCon4-C de acordo com a presente invenção ou com solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou pepticorpo de controle. Os detalhes estão descritos nos Exemplos. Este 5 gráfico mostra que os pepticorpos anti-Ang-2 são capazes de inibir o crescimento do tumor Colo205 independente de quando a dosagem começa.

A Figura 9 representa um resumo das taxas de resposta completa (CR) obtidas em camundongos nus fêmeas que usam anticorpo Ab536 ou com pepticorpo 2xCon4-C, tanto nos modelos de xenoenxerto de 10 A431 quanto nos de Colo-205. Os detalhes estão descritos nos Exemplos.

A Figura 10A representa um gráfico do volume do tumor (eixo y) versus o tempo (eixo x) em camundongos que carregam o tumor de xenoenxerto de Colo205 tratados com pepticorpo 2xCon4-C de acordo com a presente invenção ou uma combinação de 2xCon4-C e taxotere ou com solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou com PBS mais taxotere. Os detalhes estão descritos nos Exemplos.

A Figura 10B representa um gráfico do volume do tumor (eixo y) versus o tempo (eixo x) em camundongos que carregam o tumor de xenoenxerto de Colo205 tratados com pepticorpo 2xCon4-C de acordo com a Σ20 presente invenção ou uma combinação de 2xCon4-C e 5-FU ou com solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou com PBS mais 5-FU. Os detalhes estão descritos nos Exemplos.

A Figura 11A representa um gráfico de níveis de intumescimento da pata (AUC ± SE) em um modelo de artrite induzida por adjuvante em ratos tratados com pepticorpo 2xCon4-C de acordo com a presente invenção ou com solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou com pepticorpo de controle ou normal ou controles de artrite. Os detalhes estão descritos nos Exemplos.

A Figura 11B representa um gráfico de densidade mineral óssea da pata (BNM) em um modelo de artrite induzida por adjuvante em ratos tratados com pepticorpo 2xCon4-C de acordo com a presente invenção ou com solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou com pepticorpo de controle ou normal ou controles de artrite. Os detalhes estão descritos nos 5 Exemplos.

A Figura 11C representa um gráfico de mudança no peso corpóreo em um modelo de artrite induzida por adjuvante em ratos tratados com pepticorpo 2xCon4-C de acordo com a presente invenção ou com solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou com pepticorpo de controle 10 ou normal ou controles de artrite. Os detalhes estão descritos nos Exemplos.

A Figura 12 representa dois gráficos que representam a inibição da angiogênese córnea induzida por VEGF em ratos. O primeiro gráfico representa vários vasos sangüíneos medidos em ratos tratados com albumina sérica bovina (BSA), VEGF mais solução salina tamponada com 15 fosfato (PBS) ou VEGF mais o pepticorpo Con4-C da invenção. O segundo gráfico representa a área de vasos sangüíneos (mm²) em ratos tratados com BSA, VEGF mais solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou VEGF mais pepticorpo Con4-C da invenção. Os detalhes estão descritos nos Exemplos.

As Figuras 13A, 13B e 13C representam os dados de mapeamento de epítopo (O.D. 370) para a Ang-2 humana de comprimento completo (hAng-2), para o término N de hAng-2 e para o término C de hAng-2, respectivamente, para os pepticorpos TN8-Con4-C, LI-7-N e 129-3-C de acordo com a invenção, assim como para os pepticorpos de controle, 25 Tie2-Fc, C2B8 ou 5B12. Os detalhes estão descritos nos Exemplos.

A Figura 14 representa a afinidade de ligação (KD) do pepticorpo 2 xCon-4-C de acordo com a invenção, que usa o ensaio Sapidyne KinExA. Os detalhes estão descritos nos Exemplos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os cabeçalhos de seção são aqui usados apenas com propósitos de organização e não devem ser interpretados de nenhum modo como limitantes da matéria objeto descrita.

Técnicas padrão podem ser usadas para a produção de molécula de DNA recombinante, proteína e anticorpo, assim como para a cultura de tecido e transformação celular. As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são tipicamente realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como habitualmente realizado na técnica que usa procedimentos convencionais tais como aqueles apresentados em Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]) ou como aqui descritos. A menos que definições específicas sejam fornecidas, a nomenclatura utilizada em conexão e os procedimentos e técnicas de laboratório de química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica aqui descritos são aqueles bem conhecidos e habitualmente usados na técnica. As técnicas padrão podem ser usadas para as sínteses químicas, análises químicas, preparação, formulação e liberação farmacêuticas e tratamento de pacientes. DefíniçõesOs termos usado por toda este relatório descritivo são definidos como segue, a menos que de outro modo limitados em exemplos específicos.

O termo “Ang-2” refere-se ao polipeptídeo apresentado na Figura 6 da Patente U.S. N^a 6.166.185 (“ligando-2 Tie-2”) ou fragmentos deste assim como aos polipeptídeos relacionados que incluem variantes aléficas, variantes de união, variantes derivadas, de substituição, de supressões e/ou de inserção, peptídeos e polipeptídeos de fusão e homólogos interespécies. O polipeptídeo de Ang-2 pode ou não incluir resíduos terminais adicionais, por exemplo, seqüências líder, seqüências alvejadoras, metionina de terminal amino, resíduos metionina e lisina de terminal amino, e/ou seqüências de proteínas identificadoras ou de fusão, dependendo da maneira em que ele é preparado.

O termo “biologicamente ativo” quando usado em relação a Ang-2 ou um agente de ligação específico de Ang-2 refere-se a um peptídeo 5 ou polipeptídeo tendo pelo menos uma característica de atividade de Ang-2 ou de um agente de ligação específico de Ang-2. Um agente de ligação específico de Ang-2 pode ter atividade agonística, antagonística ou neutralizadora ou bloqueadora com respeito a pelo menos uma atividade biológica de Ang-2.

O termo “agente de ligação específico” refere-se a uma molécula, preferivelmente uma molécula proteinácea, que especificamente se liga à Ang-2 e variantes e derivados desta, como aqui definido. Um agente de ligação específico pode ser uma proteína, peptídeo, ácido nucléico, carboidrato, lipídeo ou composto de peso molecular pequeno que se liga preferencialmente à Ang-2. Em uma forma de realização preferida, o agente de ligação específico de acordo com a presente invenção é um peptídeo ou um pepticorpo, assim como fragmentos, variantes ou derivados destes, sozinhos ou em combinação com outras seqüências de aminoácido, fornecidas pelas técnicas conhecidas. Tais técnicas incluem, mas não são limitadas à divagem _30 enzimática, divagem química, síntese de peptídeo ou técnicas recombinantes.

Os agentes de ligação específicos anti-Ang-2 da presente invenção são capazes de ligar porções de Ang-2 que modulem, por exemplo, inibam ou promovam, a atividade biológica de Ang-2 e/ou outras atividades associadas com a Ang-2.

O termo “variantes,” como aqui usado, inclui aqueles peptídeos e polipeptídeos em que resíduos de aminoácido são inseridos, suprimidos e/ou substituídos na seqüência de aminoácido que ocorre naturalmente (ou pelo menos uma conhecida) no lugar do agente de ligação. As variantes da invenção incluem as proteínas de fusão como descrito abaixo.

“Derivados” incluem aqueles agentes de ligação que foram quimicamente modificados em alguma maneira distinta das variantes de inserção, supressão ou substituição.

“Especificamente se liga à Ang-2” refere-se à capacidade de um agente de ligação específico (tal como um pepticorpo ou porção peptídica deste) da presente invenção para reconhecer e ligar polipeptídeo de Ang-2 humano maduro, de comprimento completo ou de comprimento parcial ou um ortólogo deste, tal que a sua afinidade (como determinada, por exemplo, pelos ensaios de ELISA de Afinidade ou BIAcore como aqui descritos) ou a sua 10 capacidade de neutralização (como determinada por exemplo, pelos ensaios de ELISA de Neutralização aqui descritos ou ensaios similares) seja pelo menos 10 vezes tão grande, mas opcionalmente 50 vezes tão grande, 100, 250 ou 500 vezes tão grande ou ainda pelo menos 1000 vezes tão grande quanto a afinidade ou capacidade de neutralização do mesmo para qualquer outra 15 angiopoietina ou outro peptídeo ou polipeptídeo, em que a porção peptídica do pepticorpo é primeiro fundida a uma porção de Fc humana para a avaliação em tal ensaio.

O termo “epítopo” refere-se àquela porção de qualquer molécula capaz de ser reconhecida e ligada por um agente de ligação |20 específico, por exemplo, um pepticorpo, a uma ou mais das regiões de ligação de antígeno do agente de ligação. Os epítopos usualmente consistem de agrupamentos de superfície quimicamente ativa de moléculas, tais como por exemplo, cadeias laterais de aminoácidos ou carboidrato e têm características estruturais tridimensionais específicas assim como características de carga 25 específicas. Os epítopos como aqui usados podem ser contíguos ou não contíguos.

O termo “epítopo inibidor e/ou neutralizador” é um epítopo, que quando ligado por um agente de ligação específico tal como um pepticorpo, resulta na perda (ou pelo menos a diminuição) da atividade

biológica da molécula, célula ou organismo que contenha tal epítopo, in vivo, in vitro ou in situ. No contexto da presente invenção, o epítopo neutralizador está localizado ou está associado com uma região biologicamente ativa de Ang-2. Altemativamente, o termo “epítopo ativador” é um epítopo, que 5 quando ligado por um agente de ligação específico da invenção, tal como um anticorpo, resulta na ativação ou pelo menos na manutenção de uma conformação biologicamente ativa, de Ang-2.

O termo “fragmento de pepticorpo” refere-se a um peptídeo ou polipeptídeo que compreende menos do que um pepticorpo completo, intacto.

O termo “que ocorre naturalmente” quando usado em conexão com materiais biológicos tais como moléculas de ácido nucléico, polipeptídeos, células hospedeiras e outros, refere-se àqueles que são encontrados na natureza e não modificados por um ser humano.

O termo “isolado” quando usado em relação a Ang-2 ou a um agente de ligação específico de Ang-2 refere-se a um composto que está livre de pelo menos um polipeptídeo ou composto contaminante que é encontrado no seu ambiente natural e preferível e substancialmente livre de quaisquer outros polipeptídeos de mamífero contaminantes que poderíam interferir com

o seu uso terapêutico ou em diagnóstico.

O termo “maduro” quando usado em relação ao pepticorpo de

Ang-2 ou um fragmento deste ou a qualquer outro agente de ligação específico proteináceo de Ang-2 refere-se a um peptídeo ou um polipeptídeo que carece de uma seqüência líder ou de sinal. Quando um agente de ligação da invenção é expressado, por exemplo, em uma célula hospedeira procariótica, o peptídeo ou polipeptídeo “maduros” também podem incluir resíduos de aminoácido adicionais (mas ainda carece de uma seqüência líder) tais como uma metionina de terminal amino ou um ou mais resíduos de metionina e lisina. Um peptídeo ou polipeptídeo produzidos desta maneira podem ser utilizados com ou sem estes resíduos de aminoácido adicionais tendo sido removidos.

Os termos “quantidade eficaz” e “quantidade terapeuticamente eficaz” quando usados em relação a um agente de ligação específico de Ang-2 refere-se a uma quantidade de um agente de ligação específico que é útil ou 5 necessário para sustentar uma mudança observável no nível de uma ou mais atividades biológicas de Ang-2. A mudança pode ser um aumento ou diminuição no nível de atividade da Ang-2. Preferivelmente, a mudança é uma diminuição na atividade da Ang-2.

O termo “pepticorpo” refere-se a uma molécula que compreende um domínio de anticorpo Fc ligado a pelo menos um peptídeo. A produção de pepticorpos está no geral descrita na publicação PCT WO 00/24782, publicada em 4 de maio de 2000.

O termo “variantes,” como aqui usado, inclui aquelas moléculas tais como peptídeos ou combinações de peptídeo-veículo tais como 15 os pepticorpos da presente invenção em que os resíduos de aminoácido são inseridos, suprimidos e/ou substituídos na seqüência de aminoácido para tais moléculas. As variantes tendo um ou mais aminoácidos inseridos incluem proteínas de fusão como descrito abaixo.

“Derivados” incluem aqueles peptídeos e/ou combinações de |20 peptídeo-veículo tais como pepticorpos que foram quimicamente modificados em alguma maneira distinta das variantes de inserção, supressão ou substituição.

O termo “fragmento” refere-se a um peptídeo ou combinação de peptídeo-veículo que compreende menos do que a seqüência de 25 aminoácido de comprimento completo de tais peptídeos e/ou combinações de peptídeo-veículo. Um tal fragmento pode originar-se, por exemplo, de uma truncagem no término amino, uma truncagem no término carbóxi e/ou uma supressão interna de um resíduo ou resíduos da seqüência de aminoácido do peptídeo ou combinação de peptídeo-veículo. Os fragmentos podem resultar

da união de RNA alternativa ou da atividade de protease in vivo ou in vitro. Tais fragmentos também podem ser construídos pelos métodos químicos de síntese de peptídeo ou pela modificação de um polinucleotídeo que codifica um peptídeo, combinação de peptídeo-veículo ou uma porção Fc e/ou porção peptídica de um pepticorpo.

O termo “Fc” refere-se a um tipo de veículo da presente invenção e compreende a seqüência de um fragmento de ligação não antigênica de um anticorpo que resulta da digestão proteolítica de um anticorpo inteiro, seja na forma monomérica ou multimérica. A fonte do Fc na presente invenção é preferivelmente Fc totalmente humano e pode ser qualquer uma das imunoglobulinas, embora a IgGl e IgG2 sejam preferidas. Entretanto, as moléculas Fc que são parcialmente humanas ou obtidas a partir de espécies não humanas também são aqui incluídas. As Fc’s são fabricadas de polipeptídeos monoméricos que podem ser ligados em formas diméricas ou multiméricas pela associação covalente (isto é, ligações de dissulfeto) e não covalentes. O número de ligações de dissulfeto intermoleculares entre as subunidades monoméricas de moléculas Fc nativas varia de 1 a 4 dependendo da classe (por exemplo, IgG, IgA, IgE) ou subclasse (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2). Um exemplo de uma Fc nativa é um dímero ligado por dissulfeto que resulta da digestão com papaína de uma IgG [ver Ellison et al. (1982), Nucl. Acids. Res. 10: 4071 a 4079]. O termo “Fc nativo” como aqui usado é genérico para as formas monoméricas, diméricas e multiméricas.

O termo “domínio Fc” abrange moléculas de Fc nativas e Fc variante e seqüências como definidas acima. Como com as variantes de Fc e Fc’s nativas, o termo “domínio Fc” inclui moléculas nas formas monomérica ou multimérica, sejam digeridas a partir de anticorpo inteiro ou produzidas por outros meios.

O termo “multímero” como aplicado aos domínios de Fc ou

moléculas que compreendem domínios de Fc refere-se às moléculas tendo duas ou mais cadeias polipeptídicas covalente, não covalentemente associadas ou pelas interações tanto covalentes quanto não covalentes. As moléculas IgG tipicamente formam dímeros; IgM, pentâmeros; IgD, dímeros; e IgA, 5 monômeros, dímeros, trímeros ou tetrâmeros. Os multímeros podem ser formados explorando-se a seqüência e a atividade resultante da fonte de Ig nativa da Fc ou derivatizando-se (como definido abaixo) uma tal Fc nativa.

O termo “dímero” como aplicado aos domínios de Fc ou às moléculas que compreendem os domínios de Fc refere-se às moléculas tendo 10 duas cadeias polipeptídicas covalente ou não covalentemente associadas.

O termo “veículo” refere-se a uma molécula que impede a degradação e/ou aumenta a meia vida, reduz a toxicidade, reduz a imunogenicidade ou aumenta a atividade biológica de uma proteína terapêutica. Os veículos exemplares incluem um domínio Fc assim como um 15 polímero linear (por exemplo, polietileno glicol (PEG), polilisina, dextrano, etc.); um polímero de cadeia ramificada (Ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 4.289,872 a Denkenwalter et al., concedida em 15 de setembro de 1981; Patente U. S. N^a 5.229.490 a Tam, concedida em 20 de julho de 1993; WO 93/21259 por Frechet et al., publicada em 28 de outubro de 1993); um lipídeo; um grupo de colesterol (tal como um esteróide); um carboidrato ou oligossacarídeo; ou qualquer proteína natural ou sintética, polipeptídeo ou peptídeo que se ligam a um receptor remanescente. Os veículos são ainda descritos a seguir.

Os termos “derivatizante” e “derivado” ou “derívatizado” 25 compreendem processos e compostos resultantes respectivamente em que (1) o composto tem uma porção cíclica; por exemplo, reticulação entre os resíduos de cisteinila dentro do composto; (2) o composto é reticulado ou tem um sítio de reticulação; por exemplo, o composto tem um resíduo de cisteinila e assim forma dímeros reticulados em cultura ou in vivo', (3) uma ou mais ligações de peptidila são substituídas por uma ligação que não de peptidila; (4) o término N é substituído por -NRR1, NRC(O)R1, -NRC(O)OR1, -NRS(O)2R1, -NHC(O)NHR, um grupo succinimida ou benziloxicarbonil-NH- substituídos ou não substituídos, em que R e RI e os 5 substituintes do anel são como definidos a seguir; (5) o término C é substituído por -C(O)R2 ou -NR3R4 em que R2, R3 e R4 são como definidos a seguir; e (6) compostos em que porções de aminoácido individuais são modificados através do tratamento com agentes capazes de reagir com cadeias laterais ou resíduos terminais selecionados. Os derivados são mais descritos a 10 seguir.

O termo “peptídeo” refere-se a moléculas de cerca de 3 a cerca de 75 aminoácidos, com moléculas de cerca de 5 a 50 aminoácidos preferidas, de 8 a 40 mais preferidas e aquelas de cerca de 10 a 25 aminoácidos as mais preferidas. Os peptídeos podem ser de seqüências de aminoácido de 15 ocorrência natural ou artificiais (isto é, que não ocorrem naturalmente). Os peptídeos exemplares podem ser gerados por qualquer um dos métodos aqui apresentados, tais como transportados por uma coleção de peptídeo (por exemplo, uma coleção de demonstração de fago), gerados pela síntese química, derivados pela digestão de proteínas ou gerados usando técnicas de β 0 DNA recombinante.

O termo “farmacologicamente ativo” significa que uma substância assim descrita é determinada ter atividade que afeta um parâmetro médico (por exemplo, pressão sangüínea, contagem de célula sangüínea, nível de colesterol) ou estado de doença (por exemplo, câncer, distúrbios 25 autoimunes, etc.).

Os termos “peptídeo antagonista” ou “peptídeo inibidor” referem-se a um peptídeo que bloqueia ou de algum modo interfere com a atividade biológica da proteína associada de interesse ou tem atividade biológica comparável a um antagonista ou inibidor conhecido da proteína associada de interesse. Assim, o termo “peptídeo antagonista de Ang-2” compreende peptideos que podem ser identificados ou derivados como tendo características antagonísticas de Ang-2.

Adicionalmente, os sais fisiologicamente aceitáveis dos compostos desta invenção também são aqui abrangidos. Por “sais fisiologicamente aceitáveis” é intencionado quaisquer saís que sejam conhecidos ou mais tarde verificados serem farmaceuticamente aceitáveis. Alguns exemplos específicos são: acetato; trifluoroacetato; hidroaletos, tais como cloridretos e bromidretos; sulfato; citrato; tartarato; glicolato; e oxalato, mesilato e fosfato.

Pepticorpos

Um aspecto da presente invenção diz respeito ao desenvolvimento de pepticorpos Ang-2. A interação de um ligando de proteína com o seu receptor freqüentemente ocorre em uma interface relativamente grande. Entretanto, como demonstrado para o hormônio do crescimento humano e seu receptor, apenas uns poucos resíduos chave na interface contribuem para a maior parte da energia de ligação. Clackson et al., Science 267: 383 a 386 (1995). O corpo do ligando de proteína meramente demonstra os epítopos de ligação na topologia certa ou serve às funções não relacionadas com a ligação. Assim, as moléculas de apenas comprimento “peptídico” (no geral de 2 a 40 aminoácidos) podem ligar-se à proteína receptora de um dado ligando de proteína grande. Tais peptideos podem imitar a bioatividade do ligando de proteína grande (“agonistas peptídicos”) ou, através da ligação competitiva, inibem a bioatividade do ligando de proteína grande (“antagonistas peptídicos”).

A tecnologia de demonstração de fago tem emergido como um método poderoso na identificação de tais agonistas e antagonistas peptídicos. Ver, por exemplo, Scott et al. Science 249: 386 (1990); Devlin et al., Science 249: 404 (1990); Patente U.S. N- 5.223.409, concedida em 29 de junho de

1993; Patente U.S. N° 5.733.731, concedida em 31 de março de 1998; Patente U.S. N° 5.498.530, concedida em 12 de março de 1996; Patente U.S. N^s5.432.018, concedida em 11 de julho de 1995; Patente U.S. N^Q 5.338.665, concedida em 16 de agosto de 1994; Patente U.S. N^e 5,922,545, concedida em

13 de julho de 1999; WO 96/40987, publicada em 19 de dezembro de 1996; e

WO 98/15833, publicada em 16 de abril de 1998 (cada uma das quais é incorporada por referência). Nas coleções de demonstração de fago peptídicas, as seqüências de peptídeo aleatórias podem ser demonstradas pela fusão com proteínas de revestimento de fago filamentoso. Os peptideos demonstrados podem ser eluídos por afinidade contra um domínio extracelular imobilizado por anticorpo de um receptor, se desejado. O fago retido pode ser enriquecido pelas rodadas sucessivas de purificação por afinidade e repropagação. Os melhores peptideos de ligação podem ser seqüenciados para identificar resíduos chave dentro de uma ou mais famílias estruturalmente relacionadas de peptideos. Ver, por exemplo, Cwirla et al., Science 276: 1696 a 1699 (1997), em que duas famílias distintas foram identificadas. As seqüências de peptídeo também podem sugerir quais resíduos podem ser substituídos com segurança pela triagem de alanina ou pela mutagênese ao nível de DNA. As coleções de mutagênese podem ser J20 criadas e triadas para otimizar ainda mais a seqüência dos melhores aglutinates. Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401 a 424 (1997).

A análise estrutural da interação de proteína-proteína também pode ser usada para sugerir peptideos que imitem a atividade de ligação de 25 ligandos de proteína grandes. Em uma tal análise, a estrutura cristalina pode sugerir a identidade e a orientação relativa de resíduos críticos do ligando de proteína grande, a partir do qual um peptídeo pode ser planejado. Ver, por exemplo, Takasaki et al., Nature Biotech 15: 1266 a 1270 (1997). Estes métodos analíticos também podem ser usados para investigar a interação entre uma proteína receptora e peptídeos selecionados pela demonstração de fago, que pode sugerir outra modificação dos peptídeos para aumentar a afinidade de ligação.

Outros métodos competem com a demonstração de fago na pesquisa de peptídeo. Uma coleção de peptídeo pode ser fundida com o término carbóxi do repressor lac e expressada na E. coli. Um outro método com base na E. coli permite a demonstração na membrana externa da célula pela fusão com uma lipoproteína associada a peptidoglicano (PAL). A seguir, este e métodos relacionados são coletivamente aludidos como “demonstração

de E. coli” Em um outro método, a tradução de RNA aleatório é parada antes da liberação de ribossoma, resultando em uma coleção de polipeptídeos com seu RNA associado ainda ligado. A seguir, este e métodos relacionados são

coletivamente aludidos como “demonstração de ribossoma.” Outros métodos utilizam a ligação química de peptídeos ao RNA. Ver, por exemplo, Roberts e

Szostak, Proc Natl Acad Sei USA, 94: 12297 a 12303 (1997). A seguir, este e métodos relacionados são coletivamente aludidos como “triagem de

RNA-peptídeo.” As coleções de peptídeo quimicamente derivadas foram desenvolvidas em que os peptídeos são imobilizados em materiais não biológicos estáveis, tais como varetas de polietileno ou resinas permeáveis a solvente. Uma outra coleção de peptídeo quimicamente derivada usa fotolitografia para triar peptídeos imobilizados em lâminas de vidro. A seguir, estes e métodos relacionados são coletivamente aludidos como “triagem química de peptídeo.” A triagem química de peptídeo pode ser vantajosa em que ela permite o uso de D-aminoácidos e outros análogos não naturais, assim 25 como elementos não peptídicos. os métodos tanto biológicos quanto químicos são revisados em Wells e Lowman, Curr. Opin. Biotechnol., 3: 355 a 362 (1992).

Conceitualmente, pode-se verificar miméticos peptídicos de qualquer proteína usando a demonstração de fago e os outros métodos acima

mencionados. Estes métodos foram usados para o mapeamento de epítopo, para a identificação de aminoácidos críticos nas interações de proteínaproteína e como guias para a verificação de novos agentes terapêuticos. Ver, por exemplo, Cortese et al., Curr. Opin. Biotech. 7: 616 a 621 (1996). As 5 coleções de peptideo estão sendo agora usadas mais frequentemente em estudos imunológicos, tais como o mapeamento de epítopo. Ver Kreeger, The Scientist 10(13): 19 a 20 (1996).

Os peptídeos identificados pela triagem da coleção de demonstração de fago foram considerados como “guias” no desenvolvimento 10 de agentes terapêuticos ao invés de como os próprios agentes terapêuticos, lll Igual às outras proteínas e peptídeos, eles provavelmente podem ser rapidamente removidos in vivo pela filtração renal, pelos mecanismos de depuração celular no sistema reticuloendotelial ou pela degradação proteolítica [Francis, (supra)]. Como um resultado, a técnica presentemente 15 usa peptídeos para validar alvos medicamentosos ou como esqueletos para o planejamento de compostos orgânicos que não poderiam ter sido tão fácil ou tão rapidamente identificados através da triagem de coleção química [Lowman, (supra); Kay et al., (supra)]. A técnica beneficiar-se-ia de um processo pelo qual tais peptídeos poderiam mais facilmente produzir agentes terapêuticos contra a angiogênese.

Estrutura de Pepticorpos

Nas composições de matéria preparadas de acordo com esta invenção, o peptideo pode ser ligado a um veículo através do término N ou término C do peptideo. Assim, as moléculas de veículo-peptídeo desta 25 invenção podem ser descritas pelas cinco fórmulas seguintes e seus multímeros:

(X₁)_aT₁-(X₂)_b	(FÓRMULA I)
Xi-F_t	(FÓRMULA II)
Fi-X₂	(FÓRMULA III)
FHLOc-Pi	(FÓRMULA IV)
FHLOc-PríLAi^	(FÓRMULA V)

em que:

Fi é um veículo (preferivelmente um domínio Fc);

Xi e X₂ são cada um independentemente selecionados de -(I4)_c-P_b -(Li)_c-P_r(L₂)_d-P₂, -(L₁)_c-P₁-(L₂)_d-P₂-(L₃)_e-P₃ e -(1^4^-(1^P₂-(L₃)_e-P₃-(L₄)_rP₄

Ρμ P2, P3 ^e P4 são cada um independentemente seqüências de peptídeos farmacologicamente ativos como aqui descrito;

Li, L₂, L₃ e L₄ são cada um independentemente ligadores; e “a”, “b”, 49c”7 “d”, “e” e “f” são cada um independentemente 0 ou 1, contanto que pelo menos um de “a” e “b” seja 1.

Peptídeos

A presente invenção considera peptídeos que seletivamente se ligam ou especificamente se ligam à Ang-2. Qualquer quantidade de tais peptídeos pode ser usada em conjunção com a presente invenção, a demonstração de fago, em particular, é útil na geração de peptídeos para o uso na presente invenção como tem sido mostrado que a seleção por afinidade de coleções de peptídeos aletórios pode ser usada para identificar ligandos peptídicos para qualquer sítio de qualquer produto de gene. Dedman et al., J. Biol. Chem. 268: 23025 a 23030 (1993).

Os peptídeos nesta invenção podem ser preparados por qualquer um dos métodos divulgados na técnica. As abreviações de aminoácido de letra única são usadas. Ο “X” em qualquer seqüência (e por todo este relatório descritivo, a menos que de outro modo especificado em um caso particular) significa que qualquer um dos 20 resíduos de aminoácido que ocorrem naturalmente ou qualquer aminoácido que não ocorre naturalmente (descrito abaixo sob “Variantes”), pode estar presente. Qualquer um destes peptídeos pode ser ligado em tandem (isto é, seqüencialmente), com ou sem ligadores e exemplos ligados em tandem são fornecidos na tabela. Os ligadores são listados como “L” e podem ser qualquer um dos ligadores aqui descritos. As repetições em tandem e os ligadores são mostrados separados por hífens para clareza. Qualquer peptídeo que contenha um resíduo de cisteinila pode ser reticulado com um outro peptídeo que contenha Cys, cada um ou ambos os quais podem estar ligados a um veículo. Qualquer peptídeo 5 tendo mais do que um resíduo Cys pode formar também uma ligação de dissulfeto intrapeptídica. Qualquer um destes peptídeos pode ser derivatizado como aqui descrito. Para os derivados em que o término carboxila pode ser encapuzado com um grupo amino, o grupo amino de encapuzamento é -NH₂. Para os derivados em que os resíduos de aminoácido são substituídos por porções outras que não resíduos de aminoácido, as substituições são denotadas por S, que significa qualquer uma das porções descritas em Bhatnagar et al., J Med. Chem. 39: 3814 a 3819 (1996) e Cuthbertson et al., J. Med. Chem. 40: 2876 a 2882 (1997), que são incorporadas por referência. Todos os peptídeos são ligados através de ligações peptídicas a menos que de 15 outro modo mencionado.

Veículos

Em uma forma de realização, esta invenção fornece pelo menos um peptídeo para ser ligado a pelo menos um veículo (Fl, F2) através do término N, término C ou uma cadeia lateral de um dos resíduos de p aminoácido do(s) peptídeo(s). Veículos múltiplos também podem ser usados; por exemplo, Fc’s em cada término ou um Fc em um término e um grupo PEG no outro término ou uma cadeia lateral.

Um domínio Fc é um veículo preferido. O domínio Fc pode ser fundido aos términos N ou C dos peptídeos ou em ambos os términos N e

C.

Como mencionado acima, as variantes Fc são veículos adequados dentro do escopo desta invenção. Um Fc nativo pode ser extensivamente modificado para formar uma variante Fc de acordo com esta invenção, contanto que a ligação ao receptor remanescente seja mantida. Ver, por exemplo a WO 97/34631 e WO 96/32478. Em tais variantes Fc, pode-se remover um ou mais sítios de um Fc nativo que forneça características estruturais ou atividade funcional não requerida pelas moléculas de fusão desta invenção. Pode-se remover estes sítios, por exemplo, substituindo-se ou 5 suprimindo-se resíduos, inserindo-se resíduos no sítio ou truncando-se porções que contenham o sítio. Os resíduos inseridos ou substituídos também podem ser aminoácidos alterados, tais como peptidomiméticos ou D-aminoácidos. As variantes Fc podem ser desejáveis por várias razões, diversas das quais são descritas abaixo. As variantes Fc exemplares incluem 10 moléculas e seqüências em que:

1. Os sítios envolvidos na formação de ligação de dissulfeto são removidos. Tal remoção pode evitar a reação com outras proteínas que contenham cisteína presentes na célula hospedeira usada para produzir as moléculas da invenção. Para este propósito, o segmento contendo cisteína no 15 término N pode ser truncado ou resíduos de cisteína podem ser suprimidos ou substituídos com outros aminoácidos (por exemplo, alanil, seril). Mesmo quando resíduos de cisteína são removidos, os domínios Fc de cadeia única pode ainda formar um domínio Fc dímérico que é mantido não covalentemente junto.

2. Um Fc nativo é modificado para tomá-lo mais compatível com uma célula hospedeira selecionada. Por exemplo, pode-se remover a seqüência PA próxima ao término N de um Fc nativo típico, que pode ser reconhecido por uma enzima digestiva na E. coli tal como a prolina iminopeptidase. Pode-se também adicionar um resíduo de metionil de 25 terminal N, especialmente quando a molécula é recombinantemente expressada em uma célula bacteriana tal como a E. coli.

3. Uma porção do término N de um Fc nativo é removida para impedir a heterogeneidade do terminal N quando expressado em um célula hospedeira selecionada. Para este propósito, pode-se suprimir qualquer um dos primeiros 20 resíduos de aminoácido no término N, particularmente . aqueles nas posições 1, 2, 3, 4 e 5.

«r

4. Um ou mais sítios de glicosilação são removidos. Os resíduos que são tipicamente glicosilados (por exemplo, asparagina) podem conferir resposta citolítica. Tais resíduos podem ser suprimidos ou substituídos com resíduos não glicosilados (por exemplo, alanina).

5. Os sítios envolvidos na interação com complemento, tais como o sítio de ligação Clq, são removidos. Por exemplo, pode-se suprimir ou substituir a seqüência EKK do IgGl humano. O recrutamento de complemento pode não ser vantajoso para as moléculas desta invenção e assim pode ser evitado com uma tal variante Fc.

6. Sítios são removidos que afetam a ligação aos receptores de Fc outros que não um receptor remanescente. Um Fc nativo pode ter sítios para a interação com certas células sangüíneas brancas que não são requeridas para as moléculas de fusão da presente invenção e assim podem ser removidos.

7. O sítio ADCC sítio é removido. Os sítios ADCC são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Molec. Immunol. 29 (5): 633 a 639 (1992) com respeito aos sítios ADCC na IgGl. Estes sítios, também, não são ~0 requeridos para as moléculas de fusão da presente invenção e assim podem ser removidos.

8. Quando o Fc nativo é derivado de um anticorpo não humano, o Fc nativo pode ser humanizado. Tipicamente, para humanizar um Fc nativo, substituir-se-á resíduos selecionados no Fc nativo não humano com resíduos que são normalmente encontrados no Fc nativo humano. Técnicas para a humanização de anticorpo são bem conhecidas no ramo.

Um veículo alternativo seria uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, anticorpo, fragmento de anticorpo ou molécula pequena (por exemplo, um composto peptidomimético) capaz de ligar-se a um receptor remanescente. Por exemplo, poder-se-ía usar como um veículo um polipeptídeo como descrito na Patente U.S. N² 5.739.277, concedida em 14 de abril de 1998 a Presta et al. Os peptideos também poderiam ser selecionados pela demonstração de fago para a ligação ao receptor remanescente FcRn. Tais receptor remanescente-compostos de ligação também são incluídos dentro do significado de “veículo” e estão dentro do escopo desta invenção. Tais veículos devem ser selecionados quanto a meia vida aumentada (por exemplo, evitando-se seqüências reconhecidas pelas proteases) e imunogenicidade diminuída (por exemplo, favorecendo-se as seqüências não imunogênicas, como verificado na humanização de anticorpo).

Como mencionado acima, veículos poliméricos também podem ser usados para Fj e F₂. Vários meios para ligar porções químicas úteis como veículos estão correntemente disponíveis, ver, por exemplo, a Publicação Internacional do Patent Cooperation Treaty (“PCT”) N² WO 96/11953, intitulado “N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods,” aqui incorporada por referência em sua totalidade. Esta publicação PCT divulga, entre outras coisas, a ligação seletiva de polímeros solúveis em água ao término N de proteínas.

Um veículo polimérico preferido é o polietileno glicol (PEG). O grupo PEG pode ser de qualquer peso molecular conveniente e pode ser linear ou ramificado. O peso molecular médio do PEG preferivelmente variará de cerca de 2 quiloDalton (“kDa”) a cerca de 100 kDa, mais preferivelmente de cerca de 5 kDa a cerca de 50 kDa, o mais preferivelmente de cerca de 5 kDa a cerca de 10 kDa. Os grupos PEG no geral serão ligados aos compostos da invenção por intermédio da acilação ou alquilação redutíva através de um grupo reativo na porção de PEG (por exemplo, um grupo aldeído, amino, tiol ou éster) a um grupo reativo no composto da invenção (por exemplo, um grupo aldeído, amino ou éster).

Uma estratégia útil para a PEGuilação de peptideos sintéticos consiste de combinar, através da formação de uma ligação conjugada em solução, um peptídeo e uma porção de PEG, cada um carregando uma funcionalidade especial que seja mutuamente reativa contra a outra. Os peptideos podem ser facilmente preparados com a síntese de fase sólida 5 convencional como conhecido na técnica. Os peptideos são “pré ativados” com um grupo funcional apropriado em um sítio específico. Os precursores são purificados e completamente caracterizados antes de reagir com a porção de PEG. A ligação do peptídeo com PEG usualmente ocorre na fase aquosa e pode ser facilmente monitorada pela HPLC analítica de fase reversa. Os 10 peptideos PEGuilados podem ser facilmente purificados pela HPLC preparativa e caracterizados pela HPLC analítica, análise de aminoácido e espectrometria de massa de dessorção a laser.

Os polímeros de polissacarídeo são um outro tipo de polímero solúvel em água que podem ser usados para a modificação de proteína. Os 15 dextranos são polímeros de polissacarídeo compreendidos de subunidades individuais de glicose predominantemente ligados pelas ligações a 1-6. O próprio dextrano está disponível em muitas faixas de peso molecular e está facilmente disponível em pesos moleculares de cerca de 1 kDa a cerca de 70 kDa. O dextrano é um polímero solúvel em água adequado para o uso na —0 presente invenção como um veículo por si só ou em combinação com um outro veículo (por exemplo, Fc). Ver, por exemplo, a WO 96/11953 e WO 96/05309. O uso de dextrano conjugado a imunoglobulinas terapêuticas ou de diagnóstico foi relatado; ver, por exemplo, a Publicação de Patente Européia N° 0 315 456, que é aqui incorporada por referência. O dextrano de cerca de 1 25 kDa a cerca de 20 kDa é preferido quando o dextrano é usado como um veículo de acordo com a presente invenção.

Ligadores

Qualquer grupo “ligador” é opcional. Quando presente, a sua estrutura química não é crítica, visto que ele serve primariamente como um espaçador. O ligador é preferivelmente fabricado de aminoácidos ligados juntos pelas ligações peptídicas. Assim, em formas de realização preferidas, o ligador é fabricado de 1 a 20 aminoácidos ligados pelas ligações peptídicas, em que os aminoácidos são selecionados dos 20 aminoácidos que ocorre naturalmente. Um ou mais destes aminoácidos podem ser glicosilados, como é bem entendido por aqueles na técnica. Em uma forma de realização mais preferida, os 1 a 20 aminoácidos são selecionados de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina e lisina. Ainda mais preferivelmente, um ligador é fabricado de uma maioria de aminoácidos que não são estericamente impedidos, tais como glicina e alanina. Assim, os ligadores preferidos são poliglicinas (particularmente (Gly)s, (Gly)g), poli(Gly-Ala) e polialaninas. As combinações de Gly e Ala também são preferidas como o é o ligador aqui aludido como Kl e tendo uma seqüência de aminoácido apresentada aqui nos Exemplos.

Os ligadores não peptídicos também são possíveis. Por exemplo, ligadores alquílicos tais como -NH-(CH₂)_S-C(O)-, em que s = 2 a 20 podem ser usados. Estes ligadores alquilícos podem ser ainda substituídos por qualquer grupo não estericamente impedido tal como alquila inferior (por exemplo, acila inferior C_rC6, halógeno (por exemplo, Cl, Br), CN, NH₂, fenila, etc. Um ligador não peptídico exemplar é um ligador de PEG e tem um peso molecular de 100 a 5000 kDa, preferivelmente de 100 a 500 kDa. Os ligadores peptídicos podem ser alterados para formar derivados na mesma maneira como descrito acima.

Variantes e Derivados

As variantes e derivados dos agentes de ligação específicos estão incluídos dentro do escopo da presente invenção. As variantes incluídas dentro são variantes de inserção, de supressão e de substituição. É entendido que um agente de ligação específico particular da presente invenção pode conter um, dois ou todos os três tipos de variantes. As variantes de inserção e de substituição podem conter aminoácidos naturais, aminoácidos não convencionais (como apresentados abaixo) ou ambos.

Em um exemplo, as variantes de inserção são fornecida em que um ou mais resíduos de aminoácido, que ocorrem naturalmente ou aminoácidos não convencionais, suplementam uma seqüência de aminoácido de peptídeo ou de um pepticorpo. As inserções podem estar localizadas em cada um ou em ambos os términos da proteína ou podem estar posicionadas dentro de regiões internas da seqüência de aminoácido do pepticorpo. As variantes de inserção com resíduos adicionais em cada um ou em ambos os términos podem incluir, por exemplo, proteínas de fusão e proteínas que incluem etiquetas ou rótulos de aminoácido. As variantes de inserção incluem peptídeos e pepticorpos em que um ou mais resíduos de aminoácido são adicionados à seqüência de aminoácido do peptídeo ou pepticorpo ou fragmento deste.

Os produtos variantes da invenção também incluem peptídeos e pepticorpos maduros em que as seqüências líder ou de sinal são removidas e as proteínas resultantes tendo resíduos de terminal amino adicionais, cujos aminoácidos podem ser naturais ou não naturais. Agentes de ligação específicos (tais como pepticorpos) com um resíduo de metionil adicional na posição de aminoácido -1 (Met-1-pepticorpo) são considerados, como o são os agentes de ligação específicos com resíduos de metionina e lisina adicionais nas posições -2 e -1 (Met^-Lys-¹-). As variantes tendo resíduos Met, Met-Lys, Lys adicionais (ou um ou mais resíduos básicos, no geral) são particularmente úteis para a produção de proteína recombinante realçada em células hospedeiras bacteriana.

A invenção também abrange variantes de agente de ligação específicas tendo resíduos de aminoácido adicionais que surgem do uso de sistemas de expressão específicos. Por exemplo, o uso de vetores comercialmente disponíveis que expressam um polipeptídeo desejado como parte do produto de fusão da glutationa-S-transferase (GST) fornece o polipeptídeo desejado tendo um resíduo de glicina adicional na posição de aminoácido -1 depois da divagem do componente de GST do polipeptídeo desejado. As variantes que resultam da expressão em outros sistemas de vetor também são consideradas, incluindo aquelas em que os rótulos de polihistidina são incorporados na seqüência de aminoácido, no geral nos términos carbóxi e/ou amino da seqüência.

As variantes de inserção também incluem proteínas de fusão em que os términos amino e/ou carbóxi do peptídeo ou pepticorpo são fundidos a um outro polipeptídeo, um fragmento deste ou aminoácidos que não são no geral reconhecidos como sendo parte de qualquer seqüência de proteína específica. Os exemplos de tais proteínas de fiisão são polipeptídeos imunogênicos, proteínas com meia vidas circulantes longas, tais como as regiões constantes da imunoglobulina, proteínas marcadoras, proteínas ou polipeptídeos que facilitam a purificação do peptídeo ou pepticorpo desejados e seqüência de polipeptídeos que promovem a formação de proteínas multiméricas (tais como motivos de zíper de leucina que são úteis na formação/estabilidade do dímero.

Este tipo de variante insercional no geral tem toda ou uma porção substancial da molécula nativa, ligada ao término N ou C, a todo ou a uma porção de um segundo polipeptídeo. Por exemplo, as proteínas de fusão tipicamente utilizam seqüências líder de outras espécies para permitir a expressão recombinante de uma proteína em um hospedeiro heterólogo. Uma outra proteína de fusão útil inclui a adição de um domínio imunologicamente ativo, tal como um epítopo de anticorpo, para facilitar a purificação da proteína de fusão. A inclusão de um sítio de clivagem na junção de fusão ou próximo a ela facilitará a remoção do polipeptídeo estranho depois da purificação. Outras fusões úteis incluem a ligação de domínios funcionais, tais como sítios ativos de enzimas, domínios de glicosilação, sinais de alvejamento celular ou regiões de transmembrana.

Existem vários sistemas de expressão de proteína de fusão comercialmente disponíveis que podem ser usados na presente invenção, os sistemas particularmente úteis incluem mas não são limitados ao sistema de 5 glutationa-S-transferase (GST) (Pharmacia), o sistema de proteína de ligação da maltose (NEB, Beverley, MA), o sistema FLAG (IBI, New Haven, CT) e o sistema 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA). Estes sistemas são capazes de produzir peptídeos e/ou pepticorpos recombinantes que carregam apenas uma quantidade pequena de aminoácidos adicionais, que são improváveis de afetar 10 signifícantemente a atividade do peptídeo ou pepticorpo. Por exemplo, tanto o sistema FLAG quanto o sistema 6xHis adicionam apenas seqüências curtas, ambos os quais são conhecidas por serem deficientemente antigênicos e que não afetam adversamente a dobra de um polipeptídeo para a sua conformação nativa. Uma outra fusão de terminal N que é considerada ser útil é a fusão de 15 um dipeptídeo Met-Lys na região do terminal N da proteína ou peptídeos.

Uma tal fusão pode produzir aumentos benéficos na expressão ou atividade da proteína.

Outros sistemas de fusão produzem híbridos de polipeptídeo onde é desejável excisar o parceiro de fusão do peptídeo ou pepticorpo “0 desejados. Em uma forma de realização, o parceiro de fusão é ligado ao pepticorpo recombinante por uma seqüência de peptídeo que contenha uma seqüência de reconhecimento específica para uma protease. Os exemplos de seqüências adequadas são aquelas reconhecidas pela protease do Vírus Etch do Tabaco (Life Technologies, Gaithersburg, MD) ou Factor Xa (New 25 England Biolabs, Beverley, MA).

A invenção também fornece polipeptídeos de fusão que compreendem todo ou parte de um pepticorpo ou peptídeo da presente invenção, em combinação com fator de tecido truncado (tTF). O tTF é um agente alvejador vascular que consiste de uma forma truncada de uma proteína indutora de coagulação humana que atua como um agente coagulante de vasos sangüíneo de tumor, como descrito nas Patentes U.S. N—: 5.877.289, 6.004.555, 6.132.729, 6.132.730, 6.156.321 e Patente Européia Ν^Ώ EP 0988056. A fusão de tTF ao pepticorpo ou peptídeo anti-Ang-2 ou fragmentos destes facilita a liberação de anti-Ang-2 para as células alvo.

Em um outro aspecto, a invenção fornece variantes de supressão em que um ou mais resíduos de aminoácido em um peptídeo ou pepticorpo são removidos. As supressões podem ser efetuadas em um ou em ambos os términos do pepticorpo ou da remoção de um ou mais resíduos dentro da seqüência de aminoácido do pepticorpo. As variantes de supressão necessariamente incluem todos os fragmentos de um peptídeo ou pepticorpo.

Ainda em um outro aspecto, a invenção fornece variantes de substituição de peptídeos e pepticorpos da invenção. As variantes de substituição incluem aqueles peptídeos e pepticorpos, em que um ou mais resíduos de aminoácido são removidos e substituídos com um ou mais aminoácidos alternativos, aminoácidos estes que podem ser que ocorrem naturalmente ou que não ocorrem naturalmente. As variantes de substituição geram peptídeos ou pepticorpos que são “similares” ao peptídeo ou pepticorpo originais, em que as duas moléculas têm uma certa porcentagem de aminoácidos que são idênticos. As variantes de substituição incluem substituições de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, aminoácidos dentro de um peptídeo ou pepticorpo, em que o número de substituições pode ser de até dez por cento ou mais, dos aminoácidos do peptídeo ou pepticorpo. Em um aspecto, as substituições são conservativas por natureza, entretanto, a invenção abrange substituições que também são não conservativas e também inclui aminoácidos não convencionais.

A identidade e a similaridade de peptídeos e pepticorpos relacionados podem ser facilmente calculadas pelos métodos conhecidos. Tais métodos incluem, mas não são limitados àqueles descritos em Computational

72.

Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nova Iorque (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M. e Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nova Jérsei (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nova Iorque (1991); e Carillo et al., SLAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988).

Os métodos preferidos para determinar a relacionabilidade ou identidade percentual de dois peptídeos ou polipeptídeos ou um polipeptídeo e um peptídeo, são planejados para dar o maior emparelhamento entre as seqüências testadas. Os métodos para determinar a identidade são descritos em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos de programa de computador preferidos para determinar a identidade entre duas seqüências incluem, mas não são limitados ao pacote de programa GCG, que inclui GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12: 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403 a 410 (1990)). O programa BLASTX é publicamente disponível do National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., supra (1990)). O algoritmo de Smith Waterman bem conhecido também pode ser usado para determinar a identidade.

Certos esquemas de alinhamento para alinhar duas seqüências de aminoácido podem resultar no emparelhamento apenas de uma região curta das duas seqüências e esta região de alinhamento pequena pode ter identidade de seqüência muito alta ainda que não exista nenhuma relação significante entre as duas seqüências de comprimento completo. Consequentemente, em certas formas de realização, o método de alinhamento selecionado (programa

GAP) resultará em um alinhamento que transpõem pelo menos dez por cento do comprimento completo do polipeptídeo alvo que é comparado, isto é, pelo menos 40 aminoácidos contíguos onde as seqüências de pelo menos 400 aminoácidos estão sendo comparadas, 30 aminoácidos contíguos onde as 5 seqüências de pelo menos 300 a cerca de 400 aminoácidos estão sendo comparadas, pelo menos 20 aminoácidos contíguos onde as seqüências de 200 a cerca de 300 aminoácidos estão sendo comparadas e pelo menos 10 aminoácidos contíguos onde as seqüências de cerca de 100 a 200 aminoácidos estão sendo comparadas.

Por exemplo, usando o algoritmo de computador GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), dois polipeptídeos para os quais a identidade de seqüência percentual deva ser determinada são alinhadas quanto ao emparelhamento ótimo de seus respectivos aminoácidos (a “extensão emparelhada”, como determinada pelo algoritmo). Em certas formas de realização, um penalidade de abertura de intervalo (que é tipicamente calculada como 3X a diagonal média; a “diagonal média” é a média da diagonal da matriz de comparação que é usada; a “diagonal” é a pontuação ou número designados a cada emparelhamento de aminoácido perfeito pela matriz de comparação particular) e uma penalidade ”0 de extensão de intervalo (que é usualmente 1/10 vezes a penalidade de abertura de intervalo), assim como uma matriz de comparação tal como PAM 250 ou BLOSUM 62 são usadas em conjunção com o algoritmo. Em certas formas de realização, uma matriz de comparação padrão (ver Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3) (1978) para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 89: 10915 a 10919 (1992) para a matriz de comparação BLOSUM 62) também é usada pelo algoritmo.

Em certas formas de realização, os parâmetros para uma comparação de seqüência de polipeptídeo incluem os seguintes:

Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48: 443 a 453 (1970);

Matriz de Comparação: BLOSUM 62 de Henikoff et al., supra (1992);

Penalidade de Intervalo: 12

Penalidade de Comprimento de Palavra: 4

Patamar de Similaridade: 0

O programa GAP pode ser útil com os parâmetros acima. Em certas formas de realização, os parâmetros anteriormente mencionados são os 10 parâmetros de valor padrão para as comparações de polipeptídeo (junto com nenhuma penalidade para os intervalos de extremidade) que usam o algoritmo GAP.

Em certas formas de realização, os parâmetros para as comparações de seqüência de molécula de polinucleotídeo (como oposto a 15 uma seqüência de aminoácido) incluem os seguintes:

Algoritmo: Needleman et al, supra (1970);

Matriz de comparação: emparelhamentos = +10, desemparelhamentos = 0

Penalidade de Intervalo: 50

ΞΙ0 Penalidade de Comprimento de Intervalo: 3

O programa GAP também pode ser útil com os parâmetros acima. Os parâmetros anteriormente mencionados são os parâmetros de penalidade para as comparações de molécula de polinucleotídeo.

Outros algoritmos exemplares, penalidades de abertura de 25 intervalo, penalidades de extensão de intervalo, matrizes de comparação, patamares de similaridade, etc. podem ser usados, incluindo aqueles apresentados no Program Manual, Wísconsin Package, Versão 9, setembro, 1997. As escolhas particulares a serem feitas estará evidente àqueles de habilidade na técnica e dependerá da comparação específica a ser feita, tais como DNA-para-DNA, proteína-para-proteína, proteína-para-DNA; e adicionalmente, se a comparação está entre pares dados de seqüências (caso este em que GAP ou BestFit são no geral preferidos) ou entre uma seqüência e uma base de dados grande de seqüências (caso este em que FASTA ou BLASTA são preferidos).

Como aqui usado, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações seguem o uso convencional. Ver Immunology—A Synthesis (2^aEdição, E. S. Golub e D. R. Gren, Eds., Sínauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que é aqui incorporado por referência para qualquer propósito.

Os aminoácidos podem ter estereoquímica L ou D (exceto para Gly, que não é nem L nem D) e os polipeptídeos e composições da presente invenção podem compreender uma combinação de estereoquímicas. Entretanto, a estereoquímica L é preferida. A invenção também fornece moléculas reversas em que a seqüência do terminal amino até o terminal carbóxi dos aminoácidos é virada em sentido contrário. Por exemplo, o reverso de uma molécula tendo a seqüência normal X_rX₂-X₃ seria X₃-X₂-Xi. A invenção também fornece moléculas retro-reversas em que, como acima, a seqüência do terminal amino para o terminal carbóxi de aminoácidos é virada em sentido contrário e os resíduos que são normalmente enantiômeros “L” são alterados para a forma esteroisomérica “D”.

Os estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais tais como aminoácidos α,α-dissubstituídos, N-alquil aminoácidos, ácido lático e outros aminoácidos não convencionais também podem ser componentes adequados para os polipeptídeos da presente invenção. Os exemplos de aminoácidos não convencionais incluem, sem limitação: ácido aminoadípico, beta-alanina, ácido beta-aminopropiônico, ácido aminobutírico, ácido piperidínico, ácido aminocaprióico, ácido aminoeptanóico, ácido aminoisobutírico, ácido aminopimélico, ácido diaminobutírico, desmosina, ácido diaminopimélico, ácido diaminopropiônico. N-etilglicina, N-etilaspargina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, sarcosina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, norvalina, norleucina, oritina, 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε5 Ν,Ν,Ν-trimetillisina, ε-Ν-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilistidina, 5-hidroxilisina, α-Ν-m.etilarginina e outros aminoácidos similar e aminoácidos (por exemplo, 4-hidroxiprolina).

Similarmente, a menos que de outro modo especificado, a extremidade à esquerda das seqüências de polinucleotídeo de filamento único 10 é a extremidade 5’; a direção à esquerda das seqüências de polinucleotídeo de filamento duplo é aludida como a direção 5’. A direção de adição de 5’ para 3 ’ de transcrito de RNA nascente é aludida como a direção de transcrição; as regiões de seqüência no filamento de DNA tendo a mesma seqüência como o RNA e que são 5’ em relação à extremidade 5’ do transcrito de RNA são 15 aludidas como “seqüências a montante”; as regiões de seqüência no filamento de DNA tendo a mesma seqüência como o RNA e que são 3’ em relação á extremidade 3’ do transcrito de RNA são aludidas como “seqüências a jusante”.

Será avaliado que os resíduos de aminoácido podem ser “0 divididos em classes com base nas suas propriedades de cadeia lateral comuns:

1. Hidrofóbico Neutro: Alanina (Ala; A), Valina (Vai; V), Leucina (Leu; L), Isoleucina (Ile; I), Prolina (Pro; P), Tríptofano (Trp; W), Fenilalanina (Phe; F) e Metionína (Met, M).

2. Polar Neutro: Glicina (Gly; G); Serina (Ser; S), Treonina (Thr; T), Tirosina (Tyr; Y), Cisteína (Cys; C), Glutamina (Glu; Q), Asparagina (Asn; N) e Norleucina.

r r r

3. Acido: Acido Aspártico (Asp; D), Acido Glutâmico (Glu;

E);

4) Básico: Lisina (Lys; K), Argínina (Arg; R), Histidina (His; H). Ver Lewin, B., Genes V, Oxford University Press (1994), p. 11.

As substituições de aminoácido conservativas podem abranger resíduos de aminoácido não convencionais, que são tipicamente incorporados pela síntese química de peptideo ao invés de pela síntese em sistemas biológicos. Estes incluem, sem limitação, peptidomiméticos e outras formas reversas ou invertidas de porções de aminoácido. As substituições não conservativas podem envolver a troca de um membro de uma dessas classes no lugar de um membro de uma outra classe.

Ao realizar tais trocas, de acordo com certas formas de realização, o índice hidropátíco de aminoácidos pode ser considerado. A cada aminoácido foi designado um índice hidropátíco com base na sua hidrofobicidade e características de carga. Eles são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2), leucina (+3,8), fenilalanina (+2,8), cisteína/cistina (+2,5), metionina (+1,9), alanina (+1,8), glicina (-0,4), treonina (-0,7), serina (-0,8), triptofano (-0,9), tirosina (-1,3), prolina (-1,6), histidina (-3,2), glutamato (-3,5), glutamina (-3,5), aspartato (-3,5), asparagina (-3,5), lisina (-3,9) e arginina (4,5).

A importância do índice de aminoácido hidropátíco na conferência da função biológica interativa em uma proteína é entendido na técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105 a 131 (1982). É conhecido que certos aminoácidos podem ser substituídos no lugar de outros aminoácidos tendo um índice ou pontuação hidropáticos similares e ainda retêm uma atividade biológica similar. Ao realizar trocas com base no índice hidropátíco, em certas formas de realização, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ± 2 estão incluídas. Em certas formas de realização, aqueles que estão dentro de ± 1 estão incluídos e em certas formas de realização, aqueles dentro de ± 0,5 estão incluídos.

Também é entendido na técnica que a substituição de aminoácidos iguais pode ser feita eficazmente com base na hidrofilicidade, particularmente onde o pepticorpo ou peptídeo biologicamente funcionais por meio desta criados são intencionados para o uso em formas de realização imunológicas, como no presente caso. Em certas formas de realização, a 5 hidrofilicidade local média maior de uma proteína, como controlada pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com a sua imunogenicidade e antigenicidade, isto é, com uma propriedade biológica da proteína.

Os seguintes valores de hidrofilicidade foram designados a estes resíduos de aminoácido: arginina (+3,0), lisina (+3,0), aspartato (+3,0 ±

1), glutamato (+3,0 + 1), serina (+0,3), asparagina (+0,2), glutamina (+0,2), glicina (0), treonina (0,4), prolina (-0,5 ± 1), alanina (-0,5), histidina (-0,5), cisteína (-1,0), metionina (-1,3), valina (-1,5), leucina (-1,8), isoleucina (-1,8), tirosina (-2,3), fenilalanina (-2,5) e triptofano (-3,4). Ao realizar trocas com 15 base nos valores de hidrofilicidade similares, em certas formas de realização, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ± 2 está incluída, em certas formas de realização, aquelas que estão dentro de ± 1 estão incluídas e em certas formas de realização, aquelas dentro de ± 0,5 estão incluídas. Pode-se também identificar epítopos de seqüências de ”0 aminoácido primárias com base na hidrofilicidade. Estas regiões também são aludidas como regiões de núcleo epitópicas.”

As substituições de aminoácido exemplares são apresentadas na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2

Substituições de Aminoácido

Resíduos Originais	Substituições Exemplares	Substituições Preferidas
Ala	Vai, Leu, Ile	Vai
Arg	Lys, Gin, Asn	Lys
Asn	Gin, Glu, Asp	Gin
Asp	Glu, Gin, Asp	Glu
Cys	Ser, Ala	Ser
Gin	Asn, Glu, Asp	Asn
Glu	Asp, Gin, Asn	Asp
Gly	Pro,Ala	Ala
His	Asn, Gin, Lys, Arg	Arg
Ile	Leu, Vai, Met, Ala, Phe, Norleucina	Leu
Leu	Norleucina, Ile, Vai, Met, Ala, Phe	Ile
Lys	Arg, Ácido 1,4 Diamino-butírico, Gin, Asn	Arg
Met	Leu, Phe, Ile	Leu
Phe	Leu, Vai, Ile, Ala, Tyr	Leu
. Pro	Ala	Gly
Ser	Thr, Ala, Cys	Thr
Thr	Ser	Ser
Trp	Tyr, Phe	Tyr
Tyr	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Vai	Ile, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina	Leu

Um técnico habilitado será capaz de determinar as variantes adequadas do polipeptídeo como aqui apresentadas usando técnicas bem conhecidas. Em certas formas de realização, uma pessoa habilitada na técnica pode identificar áreas adequadas da molécula que podem ser trocadas sem destruir a atividade pelas regiões alvej adoras não acreditadas serem importantes para a atividade. Em certas formas de realização, pode-se identificar resíduos e porções das moléculas que são conservadas entre 10 peptideos ou polipeptídeos similares. Em certas formas de realização, mesmo áreas que podem ser importantes para a atividade biológica ou para a estrutura podem ser objetos para substituições de aminoácido conservativas sem destruir a atividade biológica ou sem afetar adversamente a estrutura do polipeptídeo.

Adicionalmente, uma pessoa habilitada na técnica pode rever estudos de estrutura-função que identificam resíduos em polipeptídeos similares que são importantes para a atividade ou estrutura. Em vista de uma tal comparação, pode-se prognosticar a importância de resíduos de 5 aminoácido em uma proteína que correspondam aos resíduos de aminoácido que são importantes para a atividade ou estrutura em proteínas similares. Uma pessoa habilitada na técnica pode optar por substituições de aminoácido quimicamente similar para tais resíduos de aminoácido prognosticados importantes.

Uma pessoa habilitada na técnica também pode analisar a estrutura tridimensional e a seqüência de aminoácido em relação àquela estrutura em polipeptídeos similares. Em vista de tal informação, uma pessoa habilitada na técnica pode prognosticar o alinhamento de resíduos de aminoácido de um anticorpo com respeito à sua estrutura tridimensional. Em certas formas de realização, uma pessoa habilitada na técnica pode escolher não fazer mudanças radicais nos resíduos de aminoácido prognosticados como estando na superfície da proteína, visto que tais resíduos podem estar envolvidos em interações importantes com outras moléculas. Além disso, uma pessoa habilitada na técnica pode gerar variantes de teste que contenham uma Ξ20 única substituição de aminoácido em cada resíduo de aminoácido desejado.

As variantes podem ser depois triadas usando ensaios de atividade conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Tais variantes poderíam ser usadas para se obter informação a respeito de variantes adequadas. Por exemplo, se verificou-se que uma mudança em um resíduo de aminoácido particular 25 resultou em atividade destruída, indesejavelmente reduzida ou inadequada, as variantes com uma tal mudança podem ser evitadas. Em outras palavras, com base na informação obtida de tais experimentos de rotina, uma pessoa habilitada na técnica pode facilmente determinar os aminoácidos onde outras substituições devem ser evitadas sozinhas ou em combinação com outras mutações.

Várias publicações científicas foram dedicadas ao prognóstico da estrutura secundária. Ver Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422 a 427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2): 222 a 245 (1974); Chou et al., 5 Biochemistry, 113(2): 211 a 222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat.

Areas Mol. Biol., 47: 45 a 148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47: 251 a 276 e Chou et al., Biophys. J., 26: 367 a 384 (1979). Além disso, programas de computador são correntemente disponíveis para ajudar com o prognóstico da estrutura secundária. Um método de prognosticar a estrutura secundária está fundamentado na modelagem de homologia. Por exemplo, dois polipeptídeos ou proteínas que têm uma identidade de seqüência maior do que 30 % ou similaridade maior do que 40 % freqüentemente têm topologias estruturais similares. O desenvolvimento recente das bases de dados estruturais de proteína (PDB) tem fornecido prognosticabilidade realçada de estrutura secundária, que inclui o número potencial de vezes dentro de uma estrutura do polipeptídeo ou da proteína. Ver Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1): 244 a 247 (1999). Foi sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369 a 376 (1997)) que existe um número limitado de vezes em um dado polipeptídeo ou proteína e que uma vez um número crítico —0 de estruturas tenha sido resolvido, o prognóstico estrutural tomar-se-á dramaticamente mais preciso.

Os métodos adicionais de prognosticar a estrutura secundária incluem “encadeamento” (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377 a 387 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1): 15 a 19 (1996)), “análise de perfil” (Bowie et al., Science, 253: 164 a 170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183: 146 a 159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sei., 84(13): 4355 a 4358 (1987)) e “ligação evolucionária” (Ver Holm, supra (1999) e Brenner, supra (1997)).

St

Em certas formas de realização, as variantes de pepticorpo incluem variantes de glicosilação em que um ou mais sítios de glicosilação, tais como um sítio de glicosilação ligado em N, foi adicionado ao pepticorpo. Um sítio de glicosilação ligado em N é caracterizado pela seqüência: Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr, em que o resíduo de aminoácido designado como X pode ser qualquer resíduo de aminoácido exceto prolina. A substituição ou adição de resíduos de aminoácido para criar esta seqüência fornece um novo sítio potencial para a adição de uma cadeia de carboidrato ligada em N. Altemativamente, as substituições que eliminam esta seqüência removerá uma cadeia de carboidrato ligada em N existente. Também é fornecido um rearranjo de cadeias de carboidrato ligadas em N em que um ou mais sítios de glicosilação ligados em N (tipicamente aqueles que são de ocorrência natural são eliminados e um ou mais novos sítios ligados em N são criados.

A invenção também fornece “derivados” que incluem pepticorpos que carregam modificações outras que não ou além de inserções, supressões ou substituições de resíduos de aminoácido. Preferivelmente, as modificações são covalentes por natureza e incluem por exemplo, ligação química com polímeros, lipídeos, outras porções orgânicas e inorgânicas. Os derivados da invenção podem ser preparados para aumentar a meia vida circulante de um pepticorpo ou podem ser planejados para melhorar a capacidade de alvejamento do pepticorpo às células, tecidos ou órgãos desejados.

Os derivados exemplares incluem porções em que uma ou mais das seguintes modificações foram feitas:

• Uma ou mais das ligações de peptidil [-C(O)NR-] (ligações) foram substituídas por uma ligação não peptidílica tais como uma ligação de -CH₂-carbamato [-CH₂~OC(O)NR-]; uma ligação de fosfonato; uma ligação de -CH₂-sulfonamida [-CH₂-S(O)₂NR-]; uma ligação de uréia (-NHC(O)NH-]; uma ligação de -CH₂-amina secundária; ou uma ligação peptidílica alquilada [-C(O)NR6- onde R6 é alquila inferior];

• Peptídeos em que o término N é derivatizado a um grupo -NRR¹; a um grupo -NRC(O)R; a um grupo -NRC(O)OR; a um grupo -NRS(O)₂R; a um grupo -NHC(O)NHR, onde R e R¹ são hidrogênio ou alquila inferior, com a condição de que R e R¹ não sejam ambos hidrogênio; a um grupo succinimida; a um grupo benziloxicarbonil-NH- (CBZ-NH-); ou a um grupo benziloxicarbonil-NH- tendo de 1 a 3 substituintes no anel de fenila selecionados do grupo que consiste de alquila inferior, alcóxi inferior, cloro e bromo; e

A • Peptídeos em que o término C livre é derivatizado a -C(O)R onde R é selecionado do grupo que consiste de alcóxi inferior e-NR R onde R³ e R⁴ são independentemente selecionados do grupo que consiste de hidrogênio e alquila inferior. Por “inferior” é intencionado um grupo tendo de 1 a 6 átomos de carbono.

Adicionalmente, modificações de aminoácidos individuais podem ser introduzidas nos polipeptídeos ou composições da invenção reagindo-se resíduos de aminoácido alvejados do peptídeo com um agente derivatizante orgânico que é capaz de reagir com as cadeias laterais ou resíduos terminais selecionados. Os seguintes são exemplares:

Lisinil e resíduos de terminal amino podem ser reagidos com ΞΞ0 ácido succínico ou outros anidridos de ácido carboxílicos. A derivatização com estes agentes tem o efeito de reverter a carga dos resíduos de lisinila. Outros reagentes adequados para a derivatização de resíduos que contenham alfa-amino incluem imidoésteres tais como picolinimidato de metila; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroboroidreto; ácido trinitrobenzenossulfônico;

O-metilisouréia; 2,4 pentanodiona; e reação catalisada por transaminase com glioxilato.

Os resíduos de arginil podem ser modificados pela reação com um ou diversos reagentes convencionais, entre eles fenilglioxal,

2,3-butanodiona, 1,2-cicloexanodiona e ninhidrina. A derivatização de resíduos de arginina requer que a reação seja realizada em condições alcalinas por causa do alto pKa do grupo funcional guanidina. Além disso, estes reagentes podem reagir com os grupos de lisina assim como o grupo arginina guanidino.

A modificação específica de resíduos de tirosil por si tem sido extensivamente estudada, com interesse particular na introdução de rótulos espectrais em resíduos de tirosil pela reação com compostos de diazônio aromáticos ou tetranitrometano. Mais habitualmente, N-acetilimidizol e tetranitrometano podem ser usados para formar espécies de O-acetil tirosil e derivados 3-nitro, respectivamente.

Grupos laterais carboxil (aspartil ou glutamil) podem ser seletivamente modificados pela reação com carbodiimidas (R’-N=C=N“R) tais como l-cicloexil-3-(2-morfolinil-(4-etil) carbodiimida ou l-etil-3-(4azônia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Além disso, os resíduos de aspartil e 15 glutamil podem ser convertidos a resíduos de asparaginil e glutaminil pela reação com íons amônio.

Os resíduos de glutaminil e asparaginil são frequentemente desamídados aos resíduos de glutamil e aspartil correspondentes. Altemativamente, estes resíduos podem ser desamidados sob condições Ξ20 brandamente ácidas. Cada uma das formas destes resíduos caem dentro do escopo desta invenção.

A derivatização com agentes bifuncionais é útil para a reticulação dos peptídeos ou seus derivados funcionais a uma matriz de suporte insolúvel em água ou a outros portadores macromoleculares. Os 25 agentes de reticulação habitualmente usados incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetÍl)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidroxissuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidossalicílico, imidoésteres homobifuncionais, que incluem os ésteres de díssuccinimidila tais como 3,3’-ditiobis (succinimidilpropionato) e maleimidas bifuncionais tais como bis-N-maleimido-l,8-octano. Os agentes de derivatização tais como metil-3[(p-azidofenil)ditio]propioimidato produzem intermediários fotoativáveis que são capazes de formar reticulações na presença da luz. Altemativamente, as matrizes insolúveis em água reativas tais como carboidratos ativados por brometo de cianogênio e os substratos reativos descritos nas Pat. U.S. N²

3.969.287, 3.691.016, 4.195.128, 4.247.642, 4.229.537 e 4.330.440 podem ser utilizados para a imobilização de proteína.

Outras modificações possíveis incluem a hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de seril ou treonil, oxidação do átomo de enxofre em Cys, metilação dos grupos alfa-amino das cadeias laterais de lisina, argínina e histidina (Creighton, T. E., Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79 a 86 (1983)), acetilação da amina de terminal N e, em alguns exemplos, a amidação dos grupos carboxila do terminal C.

Tais porções derivatizadas preferivelmente melhoram uma ou mais características que incluem atividade anti-angiogênica, solubilidade, absorção, meia vida biológica e outras dos compostos. Altemativamente, as porções derivatizadas podem resultar em compostos que têm as mesmas ou essencialmente as mesmas, características e/ou propriedades do composto que não é derivatizado. As porções podem altemativamente eliminar ou atenuar quaisquer efeitos colaterais indesejáveis dos compostos e outros.

Os compostos da presente invenção podem ser mudados também ao nível de DNA. A seqüência de DNA de qualquer porção do composto pode ser mudada nos códons mais compatíveis com a célula hospedeira escolhida. Para a E. coli, que é a célula hospedeira preferida, códons otimizados são conhecidos na técnica. Os códons podem ser substituídos para eliminar sítios de restrição ou para incluir sítios de restrição silenciosos, que podem ajudar no processamento do DNA na célula hospedeira selecionada. As seqüências de DNA do veículo, ligador e peptídeo podem ser modificadas para incluir qualquer uma das mudanças de seqüência precedentes. Assim, todas as modificações, substituições, derivatizações, etc. aqui debatidas aplicam-se igualmente a todos os aspectos da presente invenção, incluindo mas não limitado aos peptideos, dímeros e multímeros peptídicos, ligadores e veículos.

Adicionalmente, uma pessoa habilitada na técnica pode rever os estudos de estrutura-função que identificam resíduos em peptideos similar que são importantes para a atividade ou estrutura. Em vista de uma tal comparação, pode-se prognosticar a importância de resíduos de aminoácido em um peptídeo que correspondam aos resíduos de aminoácido que são importantes para a atividade ou estrutura em peptideos similares. Uma pessoa habilitada na técnica pode optar por substituições de aminoácido quimicamente similares para tais resíduos de aminoácido prognosticados importantes dos peptideos.

Uma pessoa habilitada na técnica também pode analisar a estrutura tridimensional e a seqüência de aminoácido em relação àquela estrutura em polipeptídeos similares. Em vista daquela informação, uma pessoa habilitada na técnica pode prognosticar o alinhamento de resíduos de aminoácido de um peptídeo com respeito à sua estrutura tridimensional. Uma pessoa habilitada na técnica pode escolher não fazer mudanças radicais nos resíduos de aminoácido prognosticados estarem na superfície da proteína, visto que tais resíduos podem estar envolvidos em interações importantes com outras moléculas. Além disso, uma pessoa habilitada na técnica pode gerar variantes de teste que contenham uma única substituição de aminoácido em cada resíduo de aminoácido desejado. As variantes podem ser depois triadas usando ensaios de atividade conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Tais dados seriam usados para se obter informação a cerca das variantes adequadas. Por exemplo, se verificou que uma mudança em um resíduo de aminoácido particular resultou em atividade destruída, indesejavelmente

reduzida ou inadequada, variantes com uma tal mudança seriam evitadas. Em outras palavras, com base na informação obtida de tais experimentos de rotina, uma pessoa habilitada na técnica pode facilmente determinar os aminoácidos onde outras substituições seriam evitadas sozinhas ou em combinação com outras mutações.

Várias publicações científicas se dedicaram ao prognóstico da estrutura secundária. Ver Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422 a 427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2): 222 a 245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2): 211 a 222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45 a 148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47: 251 a 276 e Chou et al., Biophys. J., 26: 367 a 384 (1979). Além disso, programas de computador são correntemente disponíveis para ajudar com o prognóstico da estrutura secundária. Um método de prognosticar a estrutura secundária está fundamentado na modelagem de homologia. Por exemplo, dois polipeptídeos ou proteínas que têm uma identidade de seqüência maior do que 30 % ou similaridade maior do que 40 % freqüentemente têm topologias estruturais similares. O desenvolvimento recente das bases de dados estruturais de proteína (PDB) tem fornecido prognosticabilidade realçada de estrutura secundária, que inclui o número potencial de vezes dentro de uma estrutura do polipeptídeo ou da proteína. Ver Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1): 244 a 247 (1999). Foi sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369 a 376 (1997)) que existe um número limitado de vezes em um dado polipeptídeo ou proteína e que uma vez um número crítico de estruturas tenha sido resolvido, o prognóstico estrutural tomar-se-á dramaticamente mais preciso.

Os métodos adicionais de prognosticar a estrutura secundária incluem “encadeamento” (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 377 a 387 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1): 15 a 19 (1996)), “análise de perfil” (Bowie et al., Science, 253: 164 a 170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym.,

183: 146 a 159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sei., 84(13): 4355 a 4358 (1987)) e “ligação evolucionária” (Ver Holm, supra (1999) e Brenner, supra (1997)).

A invenção abrange ainda agentes de ligação específicos derivados, por exemplo pepticorpos, covalentemente modificados para incluir uma ou mais ligações de polímero solúvel em água, tais como polietileno glicol, polioxietileno glicol ou polipropileno glicol, como descrito nas Patentes U.S. N~: 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192, e 4.179.337. Ainda outros polímeros úteis conhecidos na técnica incluem monometóxi-polietileno glicol, dextrano, celulose ou outros polímeros com base em carboidratos, poli-(N-vinil pirrolidona)-polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, um co-polímero de óxido de polipropileno / óxido de etileno, polióis polioxietílados (por exemplo, glicerol) e álcool polivinílico, assim como misturas destes polímeros. Particularmente preferidos são pepticorpos covalentemente modificados com subunídades de polietileno glicol (PEG). Os polímeros solúveis em água pode ser ligados em posições específicas, por exemplo no término amino dos pepticorpos ou aleatoriamente ligados a uma ou mais cadeias laterais do polipeptídeo. O uso de PEG para melhorar a capacidade terapêutica para agentes de ligação específicos, por exemplo pepticorpos e para anticorpos humanizados em particular, está descrito na Patente US N~ 6.133.426 a Gonzales et al., concedida em 17 de outubro de 2000.

A invenção também considera derivatizar a porção de peptídeo e/ou veículo dos compostos. Tais derivados podem melhorar a solubilidade, absorção, meia vida biológica e outros dos compostos. As porções podem altemativamente eliminar ou atenuar quaisquer efeitos colaterais indesejáveis dos compostos e outros. Os derivados exemplares incluem compostos em que:

1. O composto ou alguma porção deste é cíclico. Por exemplo, a porção peptídíca pode ser modificada para conter dois ou mais resíduos Cys (por exemplo, no ligador), que pode ciclizar pela formação de ligação de dissulfeto.

2. O composto é reticulado ou é tomado capaz de reticulação entre as moléculas. Por exemplo, a porção peptídica pode ser modificada para conter um resíduo Cys e deste modo ser capaz de formar uma ligação de dissulfeto intermolecular com uma molécula igual. O composto também pode ser reticulado através do seu término C.

3. Uma ou mais ligações de peptidil [-C(O)NR-] (ligações) são substituídas por uma ligação não peptidílica. As ligações não peptidílicas exemplares são -CH2-carbamato [-CH₂-OC(O)NR-], fosfonato, -CH₂-sulfonamida [-CH₂-S(O)₂NR-], uréia [-NHC(O)NH-], -CH₂-amina secundária e peptídeo alquilado [-C(O)NR^- em que R_b é alquila inferior].

4. O término N é derivatizado. Tipicamente, o término N pode ser acilado ou modificado para uma amina substituída. Os grupos derivados de terminal N exemplares incluem -NRRj (outro que não -NH₂), -NRC(O)Ri, -NRC(O)ORi, NRS(O)₂Ri, -NHC(O)NHR_b succinimida ou benziloxicarbonil-NH- (CBZNH-), em que R e Ri são cada um independentemente hidrogênio ou alquila inferior e em que o anel de fenila pode ser substituído com 1 a 3 substituintes selecionados do grupo que 720 consiste de alquila C1-C4, alcóxi C1-C4, cloro e bromo.

5. O término C livre é derivatizado. Tipicamente, 0 término C é esterificado ou amidado. Por exemplo, pode-se usar métodos descritos na técnica para adicionar (NH-CH₂-CH₂-NH₂)2 aos compostos desta invenção no término C. Igualmente, pode-se usar os métodos descritos na técnica para adicionar -NH₂ aos compostos desta invenção no término C. os grupos derivados do terminal C exemplares incluem, por exemplo, ~C(O)R₂ em que R₂ é alcóxi inferior ou -NR3R4 em que R₃ e R4 são independentemente hidrogênio ou alquila Ci-Cg (preferivelmente alquila C_rC₄).

6. Uma ligação de dissulfeto é substituída com uma outra, preferivelmente porção de reticulação mais estável, (por exemplo, um alquileno). Ver, por exemplo, Bhatnagar (supra); Alberts et al., Thirteenth Am. Pep. Symp., 357 a 359 (1993).

7. Um ou mais resíduos de aminoácido individuais são modificados. Vários agentes derivatizantes são conhecidos por reagir especificamente com as cadeias laterais selecionadas ou resíduos de terminal, como descrito em detalhes abaixo.

Os resíduos de lisinil e os resíduos de terminal amino podem ser reagidos com ácido succínico ou outros anidridos de ácido carboxílico, que revertem a carga dos resíduos de lisinil. Outros reagentes adequados para derivatizar resíduos que contenham alfa-amino incluem imidoésteres tais como picolinimidato de metila; fosfato de píridoxal; piridoxal; cloroboroidreto; ácido trinitrobenzenossulfônico; O-metilisouréia; 2,4 pentanodiona; e reação catalisada por transaminase com glioxilato.

Os resíduos de arginil podem ser modificados pela reação com qualquer um ou combinação de diversos reagentes convencionais, que incluem fenilglioxal, 2,3-butanodiono, 1,2-cicloexanodiona e ninhidrina. A derivatização de resíduos de arginil requerem que a reação seja realizada em condições alcalinas por causa do pKa alto do grupo funcional de guanidina. Além disso, estes reagentes pode reagir com os grupos de lisina assim como com o grupo epsílon-amino da arginina.

A modificação específica de resíduos de tirosil foi estudada extensivamente, com interesse particular na introdução de rótulos espectrais em resíduos de tirosil pela reação com compostos de diazônio aromáticos ou tetranitrometano. Mais habitualmente, N-acetilimidizol e tetranitrometano são usados para formar espécies de O-acetil tirosil e derivados 3-nitro, respectivamente.

Os grupos de cadeia lateral de carboxila (aspartil ou glutamil) podem ser seletivamente modificados pela reação com carbodiimidas (R’-N=C=N-R’) tais como l-cicloexil-3-(2-morfolÍnil-(4-etil) carbodiimida ou l-etil-3-(4-azônia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Além disso, os resíduos de aspartil e glutamil podem ser convertidos aos resíduos de asparaginil e glutaminil pela reação com íons amônio.

Os resíduos de glutaminil e asparaginil podem ser desamidados aos resíduos de glutamil e aspartil correspondentes. Alternativamente, estes resíduos são desamidados sob condições brandamente ácidas. Cada uma das formas destes resíduos caem dentro do escopo desta invenção.

Os resíduos de cisteinil podem ser substituídos por resíduos de aminoácido ou outras porções para eliminar as ligações de dissulfeto ou, ao contrário, para estabilizar a reticulação. Ver, por exemplo, Bhatnagar, (supra).

A derivatização com agentes bifuncionais é útil para a reticulação dos peptídeos ou seus derivados funcionais a uma matriz de 15 suporte insolúvel em água ou a outros veículos macromoleculares. Os agentes de reticulação habitualmente usados incluem, por exemplo, l,l-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres de N-hidróxisuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidossalícílico, imidoésteres homobifuncionais, que incluem os ésteres de dissuccinimidila tais como 3,3’“0 ditiobis(succinimidilpropionato) e maleimidas bifuncionais tais como bis-Nmaleimido-l,8-octano. Os agentes derivatizantes tais como metil-3-[(pazidofenil)ditio]propioimidato produzem intermediários fotoativáveis que são capazes de formar reticulações na presença de luz, Alternativamente, as matrizes insolúveis em água reativas tais como carboidratos ativados por 25 brometo de cianogênio e os substratos reativos descritos na Patente U.S. N—

3.969.287, 3.691.016, 4.195.128, 4.247.642, 4.229.537, e 4.330.440 são utilizados para a imobilização de proteína.

Os grupos de carboidrato (oligossacarídeo) podem ser convenientemente ligados aos sítios que são conhecidos por serem sítios de

glicosilação em proteínas. No geral, os oligossacarídeos ligados em O são ligados aos resíduos de serina (Ser) ou treonina (Thr) enquanto os oligossacarídeos ligados em N são ligados aos resíduos de asparagina (Asn) quando eles são parte da seqüência Asn-X-Ser/Thr, onde X pode ser qualquer 5 aminoácido exceto prolina. X é preferivelmente um dos 19 aminoácidos que ocorrem naturalmente outros que não prolina. As estruturas de oligossacarídeos ligados em N e ligados em O e os resíduos de açúcar encontrados em cada tipo são diferentes. Um tipo de açúcar que é habitualmente encontrado em ambos é o ácido N-acetilneuramínico (aludido 10 como ácido siálico). O ácido siálico é usualmente o resíduo terminal dos ⁼ oligossacarídeos tanto ligados em N quanto ligados em O e, em virtude da sua carga negativa, pode conferir propriedades ácidas ao composto glicosilado. Tal(is) sítio(s) pode(m) ser incorporado(s) no ligador dos compostos desta invenção e é(são) preferivelmente glicosilado(s) por uma célula durante a 15 produção recombinante dos compostos polipeptídicos (por exemplo, em células de mamífero tais como CHO, BHK, COS). Entretanto, tais sítios podem ser ainda glicosilados pelos procedimentos sintéticos ou semi-sintéticos conhecidos na técnica.

Outras modificações possíveis incluem a hidroxilação de =0 prolina e lisina, a fosforilação de grupos hidroxila de resíduos de seril ou treonil, a oxidação do átomo de enxofre em Cys, a metilação dos grupos de alfa-amino das cadeias laterais de lisina, arginina e histidina [Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), pp. 79 a 86 (1983)].

Os compostos da presente invenção podem ser mudados também ao nível do DNA. A seqüência de DNA de qualquer porção do composto pode ser mudada para códons mais compatíveis com a célula hospedeira escolhida. Para a E. coli, que é a célula hospedeira preferida, os códons otimizados são conhecidos na técnica. Os códons podem ser substituídos para eliminar sítios de restrição ou para incluir sítios de restrição silenciosos, que podem ajudar no processamento do DNA na célula hospedeira selecionada. As seqüências de DNA do veículo, ligador e peptídeo podem ser modificadas para incluir qualquer uma das mudanças de seqüência precedentes.

Maturação de Afinidade

Uma forma de realização da presente invenção inclui peptideos e pepticorpos “maturados por afinidade”. Este procedimento considera aumentar a afinidade ou a bio-atividade dos peptideos e pepticorpos da presente invenção que usam demonstração de fago ou outras tecnologias de seleção. Com base em uma seqüência de consenso (que é gerada para uma coleção de peptideos relacionados), coleções de demonstração de fago secundárias direcionadas podem ser geradas em que os aminoácidos de “núcleo” (determinada a partir da seqüência de consenso) são mantidos constantes ou são influenciados na freqüência de ocorrência. Altemativamente, uma seqüência de peptídeo individual pode ser usada para gerar uma coleção de demonstração de fago influenciada, direcionada. Panning de tais coleções pode produzir peptideos (que podem ser convertidos a pepticorpos) com ligação realçada à Ang-2 ou com bio-atividade realçada. Análogos Não Peptídicos/Miméticos de Proteína

Além disso, análogos não peptídicos de peptideos que fornecem uma estrutura estabilizada ou biodegradação diminuída, também são considerados. Os análogos miméticos de peptídeo podem ser preparados com base em um peptídeo inibidor selecionado pela substituição de um ou mais resíduos pelas porções não peptídicas. Preferivelmente, as porções não peptídicas permitem que o peptídeo retenha a sua conformação natural ou estabilize uma conformação preferida, por exemplo, bioativa, que retenha a capacidade para reconhecer e ligar Ang-2, Em um aspecto, o análogo/ mimético resultante exibe afinidade aumentada de ligação para Ang-2. Um exemplo de métodos para a preparação de análogos miméticos não peptídicos a partir de peptídeos é descrito em Nachman et al., Regul. Pept. 57: 359 a 370 (1995). Se desejado, os peptídeos da invenção podem ser modificados, por exemplo, pela glicosilação, amidação, carboxilação ou fosforilação ou pela 5 criação de sais de adição de ácido, amidas, ésteres, em particular ésteres de terminal C e derivados de N-acíla dos peptídeos da invenção. Os pepticorpos também podem ser modificados para criar derivados peptídicos pela formação de complexos covalentes ou não covalentes com outras porções. Os complexos covalentemente ligados podem ser preparados pela ligação das 10 porções químicas aos grupos funcionais nas cadeias laterais de aminoácidos que compreendem os pepticorpos ou nos términos N ou C.

Em particular, é previsto que os peptídeos podem ser conjugados a um grupo repórter, que inclui, mas não limitado a um radiorrótulo, um rótulo fluorescente, uma enzima (por exemplo, que catalisa 15 uma reação colorimétrica ou fluorimétrica), um substrato, uma matriz sólida ou um portador (por exemplo, biotina ou avidina). A invenção consequentemente fornece uma molécula que compreende uma molécula de pepticorpo, em que a molécula preferivelmente ainda compreende um grupo repórter selecionado do grupo que consiste de um radiorrótulo, um rótulo Ξ20 fluorescente, uma enzima, um substrato, uma matriz sólida e um portador.

Tais rótulos são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica, por exemplo, rótulos de bíotina são particularmente considerados. O uso de tais rótulos é bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica e é descrito, por exemplo, nas Patentes U.S. N~ 3.817.837, 3.850.752, 3.996.345, e 25 4.277.437. Outros rótulos que serão úteis incluem mas não são limitados a rótulos radioativos, rótulos fluorescentes e rótulos quimiolumínescentes. As Patentes U.S. que dizem respeito ao uso de tais rótulos incluem, por exemplo, as Patentes U.S. N~ 3.817.837, 3.850.752, 3.939.350, e 3.996.345. Qualquer um dos pepticorpos da presente invenção pode compreender um, dois ou mais de qualquer um destes rótulos.

Métodos de fabricar Peptídeos

Os peptídeos da presente invenção podem ser gerados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas no ramo. Por exemplo, tais 5 peptídeos podem ser sintetizados em solução ou em um suporte sólido de acordo com técnicas convencionais. Vários sintetizadores automáticos são comercialmente disponíveis e podem ser usados de acordo com protocolos conhecidos. Ver, por exemplo, Stewart e Young (supra); Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 105: 6442, (1983); Merrifield, Science 232: 341 a 347 (1986);

Barany e Merrifield, The Peptides, Gross e Meienhofer, eds, Academic Press, Nova Iorque, 1 a 284; Barany et al., Int. J. Pep. Protein Res., 30: 705 a 739 (1987); e Patente U.S. N² 5.424.398, cada uma aqui incorporada por referência.

Os métodos de síntese de peptídeo de fase sólida usam um copoli(estirenodivinilbenzeno) contendo de 0,1 a 1,0 mM de aminas/g de polímero. Estes métodos para a síntese de peptídeo usam proteção de butiloxicarbonila (t-BOC) ou 9-fluorenÍlmetiloxicarbonila (FMOC) de grupos alfa-amino. Ambos os métodos envolvem a síntese escalonada por meio da qual um único aminoácido é adicionado em cada etapa partindo do término C 20 do peptídeo (Ver, Coligan et al., Curr. Prot. Immunol., Wiley Interscience, 1991, Unidade 9). Na conclusão da síntese química, o peptídeo sintético pode ser desprotegido para remover os grupos de bloqueio de aminoácido t-BOC ou FMOC e clivados do polímero pelo tratamento com ácido em temperatura reduzida (por exemplo, HF líquido-10 % de anisol durante cerca de 0,25 a cerca de 1 hora a 0^o C). Depois da evaporação dos reagentes, os peptídeos são extraídos do polímero com solução a 1 % de ácido acético que é depois liofilizado para produzir o material bruto. Este pode ser normalmente purificado por técnicas tais como filtração em gel em Sephadex G15 que usa ácido acético a 5 % como um solvente. A liofilização das frações apropriadas da coluna produzirá os peptideos ou derivados de peptídeo homogêneos, que podem ser depois caracterizados por técnicas padrão tais como a análise de aminoácido, cromatografia de camada fina, cromatografia líquida de alto desempenho, espectroscopia de absorção de ultravioleta, rotação molar, solubilidade e quantificados pela degradação de Edman de fase sólida.

Outros métodos, tais como peptideos de seleção de uma coleção de demonstração de fago, também são disponíveis. As coleções podem ser preparadas a partir de conjuntos de aminoácidos como aqui descritos. A demonstração de fago pode ser particularmente eficaz em identificar peptideos úteis de acordo com a invenção. Em resumo, prepara-se uma coleção de fago (que usa por exemplo fago ml 13, fd ou lambda), demonstrando insertos de 4 a cerca de 80 resíduos de aminoácido. Os insertos podem representar, por exemplo, uma série completamente degenerada ou influenciada. Pode-se então selecionar insertos que carregam fagos que se ligam ao antígeno desejado. Este processo pode ser repetido através de diversos ciclos de resseleção de fago que se liga ao antígeno desejado. As rodadas repetidas levam ao enriquecimento de seqüências particulares que carregam fago. A análise de seqüência de DNA pode ser conduzida para identificar as seqüências dos peptideos expressados. A porção linear mínima da seqüência que se liga ao antígeno desejado pode ser determinada. Pode-se repetir o procedimento usando uma coleção influenciada que contenha insertos contendo parte ou toda a porção linear mínima mais um ou mais resíduos degenerados adicionais a montante ou a jusante desta. Estas técnicas podem identificar peptideos da invenção com afinidade ainda maior de ligação para Ang-2 do que os agentes aqui já identificados.

Independente da maneira em que os peptideos são preparados, uma molécula de ácido nucléico que codifica cada tal peptídeo e pepticorpo pode ser gerada usando procedimentos de DNA recombinante padrão. A seqüência de nucleotídeo de tais moléculas de DNA pode ser manipulada

como apropriado sem mudar a seqüência de aminoácido que ela codifica levando-se em conta a degenerescência do código de ácido nucléico assim como levando-se em conta a preferência de códon em células hospedeiras particulares.

As técnicas de DNA recombinantes são um método conveniente para preparar pepticorpos de comprimento completo e outros agentes de ligação proteináceos grandes específicos da presente invenção ou fragmentos destes. Uma molécula de DNA que codifica o pepticorpo ou fragmento pode ser inserida em um vetor de expressão, que pode ser por sua vez inserido em uma célula hospedeira para a produção do anticorpo ou fragmento.

No geral, uma molécula de DNA que codifica um peptideo ou pepticorpo pode ser obtida usando-se procedimentos aqui descritos nos Exemplos. As sondas e as condições de hibridização típicas são aquelas tais 15 como apresentadas em Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press [1994]). Depois da hibridização, a mancha sondada pode ser lavada em uma severidade adequada, dependendo de fatores tais como o tamanho da sonda, a homologia esperada da sonda para o clone, o tipo de coleção que é triada e o número de clones que são triados. Os 30 exemplos de triagem de severidade alta são 0,1 X SSC e 0,1 por cento de SDS a uma temperatura entre 50 e 65° C.

Os métodos de triagem de híbrido duplo de levedura também podem ser usados para identificar peptídeos da invenção que se ligam à Ang-2. Assim, o antígeno ou um fragmento deste, pode ser usado para triar 25 coleções peptídicas, que incluem as coleções de demonstração de fago, para identificar e selecionar agentes de ligação de Ang-2, por exemplo pepticorpos, da presente invenção.

Altemativamente, uma variedade de sistemas de vetor de expressão/hospedeiro podem ser utilizados para conter e expressar os peptídeos da invenção. Estes sistemas incluem mas não são limitados a microorganismos tais como bactérias transformadas com bacteriofago recombinante, vetores de expressão de DNA plasmídico ou cosmídico; a levedura transformada com vetores de expressão de levedura; sistemas de célula de inseto infectada com vetores de expressão viral (por exemplo, baculovírus); sistemas de célula vegetal transfectada com vetores de expressão viral (por exemplo, o vírus mosaico da couve-flor, CaMV; o vírus mosaico do tabaco, TMV) ou transformada com vetores de expressão bacterianos (por exemplo, plasmídeo Ti ou pBR322); ou sistemas de célula animal. As células de mamífero que são úteis nas produções de proteína recombinante incluem mas não são limitadas às células VERO, células HeLa, linhagens de célula do ovário de hamsters chineses (CHO), células COS (tais como COS-7), células W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 e 293. Os protocolos exemplares para a expressão recombinante dos peptídeos são descritos aqui abaixo.

O termo “vetor de expressão” refere-se a um plasmídeo, fago, vírus ou vetor, para expressar um polipeptídeo a partir de uma seqüência de DNA (RNA). Um vetor de expressão pode compreender uma unidade transcricional que compreende uma montagem de (1) um elemento ou elementos genéticos tendo um papel regulador na expressão de gene, por exemplo, promotores ou realçadores, (2) uma estrutural ou seqüência que codifica o agente de ligação que é transcrito em mRNA e traduzido em proteína e (3) seqüências de início e término de transcrição apropriadas. As unidades estruturais intencionadas para o uso em levedura ou sistemas de expressão eucarióticas preferivelmente incluem uma seqüência líder que permitem a secreção extracelular de proteína traduzida por uma célula hospedeira. Altemativamente, onde a proteína recombinante é expressada sem uma seqüência líder ou de transporte, ela pode incluir um resíduo de metionil de terminal amino. Este resíduo pode ou não ser subsequentemente clivado a partir da proteína recombinante expressada para fornecer um produto peptídico final.

Por exemplo, os peptídeos podem ser recombinantemente expressados em levedura usando um sistema de expressão comercialmente 5 disponível, por exemplo, o Sistema de Expressão da Pichia (Invitrogen, San Diego, CA), seguindo as instruções do fabricante. Este sistema também conta com a seqüência pre-pro-alfa para direcionar a secreção, mas a transcrição do inserto é direcionada pelo promotor da álcool oxidase (A0X1) na indução pelo metanol.

O peptídeo secretado é purificado do meio de cultivo de levedura, por exemplo, pelos métodos usados para purificar o peptídeo de sobrenadantes de célula bacteriana e de mamífero.

Altemativamente, o cDNA que codifica o peptídeo pode ser clonado no vetor de expressão de baculovírus pVL1393 (Pharmingen, San 15 Diego, CA). Este vetor pode ser usado de acordo com as diretrizes do fabricante (Pharmingen) para infectar células de Spodoptera frugiperda em meio isento de proteína sF9 e para produzir a proteína recombinante. A proteína recombinante pode ser purificada e concentrada a partir do meio usando uma coluna de heparina-Sepharose (Pharmacia).

Altemativamente, o peptídeo pode ser expressado em um sistema de inseto. Os sistemas de inseto para a expressão de proteína são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica. Em um tal sistema, o vírus da poliedrose nuclear da Autographa californica (AcNPV) pode ser usado como um vetor para expressar genes estranhos em células de Spodoptera 25 frugiperda ou em Trichoplusia larvae. A seqüência que codifica o peptídeo pode ser clonada em uma região não essencial do vírus, tal como o gene da poliedrina e colocado sob o controle do promotor da poliedrina. A inserção bem sucedida do peptídeo tomará o gene da poliedrina inativo e produzirá vírus recombinante que carece da proteína de revestimento. Os vírus recombinantes podem ser usados para infectar células de S. frugiperda ou Trichoplusia larvae em que o peptídeo é expressado. Smith et al., J. Virol. 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sei. (USA) 91: 3224 a 3227 (1994).

Em um outro exemplo, a seqüência de DNA que codifica o peptídeo pode ser amplificada pela PCR e clonada em um vetor apropriado por exemplo, pGEX-3X (Pharmacia). O vetor pGEX é planejado para produzir uma proteína de fusão que compreende a glutationa-S-transferase (GST), codificada pelo vetor e uma proteína codificada por um fragmento de 10 DNA inserido no sítio de clonagem do vetor. Os iniciadores para a PCR podem ser gerados para incluir por exemplo, um sítio de divagem apropriado. Onde a porção de fusão é usada unicamente para facilitar a expressão ou de outro modo não é desejável como uma ligação ao peptídeo de interesse, a proteína de fusão recombinante pode ser então clívada da porção GST da 15 proteína de fusão. A construção peptídica específica pGEX-3X/agente de ligação é transformada em células XL-1 Blue da E. coli (Stratagene, La Jolla CA) e os transformantes individuais isolados e cultivados. O DNA plasmídico de transformantes individuais pode ser purificado e parcialmente seqüenciado usando um seqüenciador automatizado para confirmar a presença do agente Ξ^Ο de ligação específico desejado que codifica o inserto de ácido nucléico na orientação apropriada.

Certas composições peptídicas da presente invenção são aquelas em que um pepticorpo é conjugado a qualquer peptídeo anti-tumor tal como o fator de necrose de tumor (TNF). Em um método particularmente 25 preferido, as quimeras peptídicas TNF-agente de ligação específico são geradas como fusões recombinantes com seqüências que codificam peptídeo fundidas na matriz para seqüências que codificam TNF (Novagen, Madison, WI). O cDNA peptídeo-TNF pode ser clonado pelo vetor pET-1 lb (Novagen) e a expressão de TNF-peptídeos em BL21 E. coli pode ser induzida de acordo com a instrução do fabricante para pETllb. TNF-peptídeos solúveis podem ser purificados a partir de lisados bacterianos pela preparação com sulfato de amônio, cromatografia de interação hidrofóbica em Phenyl-Sepharose 6 Fast Flow, cromatografia de troca iônica em DEAE-Sepharose Fast Flow e cromatografia de filtração em gel em Sephacryl-S300 HR.

A proteína de fusão, que pode ser produzida como um corpo de inclusão insolúvel nas bactérias, pode ser purificada como segue. As células hospedeiras podem ser sacrificadas pela centrifugação; lavadas em NaCl 0,15 M, Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM; e tratadas com 0,1 mg/ml de losozíma (Sigma, St. Louis, MO) durante 15 minutos na temperatura ambiente. O lisado pode ser depurado pela sonificação e os fragmentos de célula podem ser pelotizados pela centrifugação durante 10 minutos a 12.000 X g. A pelota contendo a proteína de fusão pode ser recolocada em suspensão em Tris 50 mM, pH 8 e EDTA 10 mM, disposta em camada em 50 % de glicerol e centrifugada durante 30 minutos a 6000 X g. A pelota pode ser recolocada em suspensão em solução salina tamponada com fosfato padrão (PBS) livre de Mg++ e Ca++. A proteína de fusão pode ser ainda purificada pelo fracionamento da pelota recolocada em suspensão em um SDS-PAGE desnaturante (Sambrook et al., supra). O gel pode ser embebido em KC1 0,4 M para visualizar a proteína, que pode ser excisada e eletroeluída em tampão fluente em gel que carece de SDS. Se o GST/proteína de fusão é produzido em bactérias como uma proteína solúvel, ela pode ser purificada usando o Módulo de Purificação GST (Pharmacia).

A proteína de fusão pode ser submetida à digestão para clívar o GST do peptídeo da invenção. A reação de digestão (20 a 40 mg de proteína de fusão, 20 a 30 unidades de trombina humana (4000 U/mg, Sigma) em 0,5 ml de PBS pode ser incubada de 16 a 48 horas na temperatura ambiente e carregada em um gel de SDS-PAGE desnaturante para fracionar os produtos de reação. O gel pode ser embebido em KCI 0,4 M para visualizar as faixas de proteína. A identidade da faixa de proteína que corresponde ao peso molecular esperado do peptídeo pode ser confirmada pela análise de seqüência de aminoácido usando um seqüenciador automatizado (Applied Biosystems Modelo 473A, Foster City, CA). Altemativamente, a identidade pode ser confirmada realizando-se a HPLC e/ou a espectrometria de massa dos peptideos.

Altemativamente, uma seqüência de DNA que codifica o peptídeo pode ser clonada em um plasmídeo contendo um promotor desejado e, opcionalmente, uma seqüência líder [Better et al., Science 240: 1041 a 1043 (1988)]. A seqüência desta construção pode ser confirmada pelo seqüenciamento automatizado. O plasmídeo pode ser depois transformado na cepa MC 1061 da E. coli usando procedimentos padrão que utilizam a incubação com CaCl? e tratamento de choque térmico das bactérias (Sambrook et al., supra). As bactérias transformadas podem ser cultivadas em meio LB suplementado com carbenicilina e a produção da proteína expressada pode ser induzida pelo cultivo em um meio adequado. Se presente, a seqüência líder pode efetuar a secreção do peptídeo e ser clivada durante a secreção.

A proteína recombinante secretada pode ser purificada a partir do meio de cultura bacteriana pelos métodos descritos aqui abaixo.

Os sistemas hospedeiros mamíferos para a expressão da proteína recombinante são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica. As cepas da célula hospedeira podem ser escolhidas quanto a uma capacidade particular para processar a proteína expressada ou produzir certas modificações pós tradução que serão úteis em fornecer atividade de proteína. Tais modificações da proteína incluem, mas não são limitadas à acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. Células hospedeiras diferentes tais como CHO, HeLa, MDCK, 293, W138 e outras têm mecanismos celulares específicos e mecanismos característicos para tais atividades pós tradução e podem ser escolhidas para garantir a modificação e o processamento corretos da proteína estranha introduzida.

É preferível que as células transformadas sejam usadas para a produção de proteína de longa duração, alto rendimento e como tal a expressão estável é desejável. Uma vez que tais células são transformadas com vetores que contenham marcadores selecionáveis junto com o cassete de expressão desejado, as células podem ser deixadas para desenvolver durante 1 a 2 dias em um meio enriquecido antes que elas sejam mudadas para meio seletivo. O marcador selecionável é planejado para conferir resistência à seleção e a sua presença permite o desenvolvimento e a recuperação de células que expressem com sucesso as seqüências introduzidas. Grumos resistentes de células estavelmente transformadas podem ser proliferados usando as técnicas de cultura de tecido apropriadas para a célula.

Vários sistemas de seleção podem ser usados para recuperar as células que foram transformadas para a produção de proteína recombinante. Tais sistemas de seleção incluem, mas não são limitados aos genes da HSV timidina cinase, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase e adenina fosforibosiltransferase, em células tk, hgprt ou aprt, respectivamente. Também, a resistência a anti-metabólito pode ser usada como a base de seleção para DBFR que confere resistência ao metotrexato; gpt que confere resistência ao ácido micofenólico; neo que confere resistência ao amínoglicosídeo G418 e confere resistência ao clorsulfuron; e hygro que confere resistência à higromicina. Os genes selecionáveis adicionais que podem ser úteis incluem trpB, que permite que as células utilizem indol no lugar do triptofano ou hisD, que permite que as células utilizem histinol no lugar da histídina. Os marcadores que dão uma indicação visual para a identificação de transformantes incluem antocianínas, β-glicuronidase e seu substrato, GUS e luciferase e seu substrato, a luciferina.

Purificação e Redobra de Agentes de Ligação Específicos l&f93

Em alguns casos, os agentes de ligação específicos tais como os peptídeos e/ou pepticorpos desta invenção pode necessitar serem “redobrados” e oxidados em uma estrutura terciária apropriada e gerar ligações de dissulfeto de modo a serem biologicamente ativos. A redobra pode ser realizada usando-se vários procedimentos bem conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, por exemplo, expor o agente polipeptídico solubilizado a um pH usualmente acima de 7 na presença de um agente caotrópico. A seleção do caótropo é similar às escolhas usadas para a solubilização de corpo de inclusão, entretanto um caótropo é tipicamente usado em uma concentração mais baixa. Um agente caotrópico exemplar é a guanidina. Na maioria dos casos, a solução de redobra/oxidação também conterá um agente redutor mais a sua forma oxidada em uma relação específica para gerar um potencial de redox particular que permita que o embaralhamento de dissulfeto ocorra para a formação de pontes de cisteína. Alguns pares de redox habitualmente usados incluem císteína/cistamina, glutationa/ditiobisGSH, cloreto cúprico, ditíotreitol DTT/ditiano DTT e 2-mercaptoetanol (bME)/ditio-bME. Em muitos exemplos, um co-solvente pode ser usado para aumentar a eficiência da redobra. Os co-solventes habitualmente usados incluem glicerol, polietileno glicol de vários pesos moleculares e arginina.

Pode ser desejável purificar os peptídeos e pepticorpos da presente invenção. As técnicas de purificação de proteína são bem conhecidas por aqueles de habilidade na técnica. Estas técnicas envolvem, em um nível, o fracionamento bruto das frações proteináceas e não proteináceas. Tendo separado o peptideo e/ou pepticorpo de outras proteínas, o peptideo ou polipeptídeo de interesse podem ser ainda purificados usando-se técnicas cromatográficas e eletroforéticas para se obter a purificação parcial ou completa (ou purificação até a homogeneidade). Os métodos analíticos particularmente adaptados para a preparação de pepticorpos e peptídeos ou a presente invenção são a cromatografia de troca iôníca, a cromatografia de exclusão; eletroforese em gel de poliacrilamida; focalização isoelétrica. Um método particularmente eficiente de purificar peptídeos é a cromatografia líquida de proteína rápida ou mesmo a HPLC.

Certos aspectos da presente invenção dizem respeito à purificação e em formas de realização particulares, à purificação substancial, de um pepticorpo ou peptídeo da presente invenção. O termo “pepticorpo ou peptídeo purificado” como aqui usado, é intencionado a referir-se a uma composição, isolável de outros componentes, em que o pepticorpo ou peptídeo é purificado em qualquer grau relativo ao seu estado naturalmente obtenível. Um peptídeo ou pepticorpo purificado portanto também refere-se a um pepticorpo ou peptídeo que seja livre do ambiente no qual ele pode ocorrer naturalmente.

No geral, “purificado” referir-se-á a uma composição de peptídeo ou pepticorpo que foi submetida ao fracionamento para remover vários outros componentes e cuja composição substancialmente retém a sua atividade biológica expressada. Onde o termo “substancialmente purificada” é usado, esta designação referir-se-á a uma composição de peptídeo ou pepticorpo em que o pepticorpo ou peptídeo formam o componente principal da composição, tal como constituindo cerca de 50 %, cerca de 60 %, cerca de 70 %, cerca de 80 %, cerca de 90 %, cerca de 95 % ou mais das proteínas na composição.

Vários métodos para quantificar o grau de purificação do peptídeo ou pepticorpo serão conhecidos por aqueles de habilidade na técnica considerando a presente divulgação. Estes incluem, por exemplo, determinar a atividade de ligação específica de uma fração ativa ou avaliar a quantidade de peptídeo ou pepticorpo dentro de uma fração pela análise de SDS/PAGE. Um método preferido para avaliar a pureza de uma fração de peptídeo ou pepticorpo é calcular a atividade de ligação da fração, para compará-la com a atividade de ligação do extrato inicial e para assim calcular o grau de purificação, aqui estimado por um “número de vezes de purificação.” As unidades atuais usadas para representar a quantidade de atividade de ligação, naturalmente, será dependente da técnica de ensaio particular escolhida para seguir a purificação e se o pepticorpo ou peptídeo exibe ou não uma atividade de ligação detectável.

Várias técnicas adequadas para o uso na purificação serão bem conhecidas por aqueles de habilidade na técnica. Estas incluem, por exemplo, precipitação com sulfato de amônío, PEG, anticorpos (imunoprecipitação) e outros ou pela desnaturação térmica, seguida por centrifugação; as etapas de cromatografia tais como a cromatografia de afinidade (por exemplo, Proteína-A-Sepharose), troca iônica, filtração em gel, fase reversa, hidroxilapatita e cromatografia de afinidade; focalização isoelétrica; eletroforese em gel; e combinações de tais e outras técnicas. Como é no geral conhecido na técnica, acredíta-se que a ordem de conduzir as várias etapas de purificação pode ser mudada ou que certas etapas podem ser omitidas e ainda resultar em um método adequado para a preparação de um agente de ligação específico substancialmente purificado.

Não existe nenhuma exigência geral de que o peptídeo ou pepticorpo da presente invenção sempre sejam fornecidos no seu estado mais purificado. De fato, é considerado que produtos de agente de ligação menos substancialmente específicos terão utilidade em certas formas de realização. A purificação parcial pode ser realizada usando-se menos etapas de purificação em combinação ou utilizando-se formas diferentes do mesmo esquema de purificação geral. Por exemplo, é avaliado que uma cromatografia de coluna de troca catiônica realizada utilizando um aparelho de HPLC no geral resultará em uma purificação de “dobra” maior do que a mesma técnica utilizando um sistema de cromatografia de baixa pressão. Os métodos que exibem um grau mais baixo de purificação relativa pode ter vantagens na

recuperação total do peptídeo ou pepticorpo ou na manutenção da atividade de ligação do peptídeo ou pepticorpo.

É conhecido que a migração de um peptídeo ou polipeptídeo pode variar, algumas vezes significantemente, com condições diferentes de 5 SDS/PAGE [Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm, 76: 425 (1977)). Portanto será avaliado que sob condições de eletroforese diferentes, os pesos moleculares evidentes de produtos de expressão de agente de ligação específico purificados ou parcialmente purificados podem variar.

Ensaios de Ligação

Os ensaios de ligação imunológica tipicamente utilizam um agente de captura para ligar-se especificamente ao análito do agente alvo e frequentemente imobilizá-lo. O agente de captura é uma porção que especificamente se liga ao análito. Em uma forma de realização da presente invenção, o agente de captura é um peptídeo ou pepticorpo ou fragmento deste que especificamente se liga à Ang-2. Estes ensaios de ligação imunológica são bem conhecidos na técnica [Asai, ed, Methods in Cell Biology, Vol. 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc, Nova Iorque (1993)].

Os ensaios de ligação imunológica freqüentemente utilizam ΞίΟ um agente de rotulação que sinalizará a existência do complexo de ligação formado pelo agente de captura e antígeno. O agente de rotulação pode ser uma das moléculas que compreendem o complexo de ligação; isto é pode ser um agente de ligação específico rotulado ou um anticorpo anti-agente de ligação específico rotulado. Altemativamente, o agente de rotulação pode ser 25 uma terceira molécula, habitualmente um outro anticorpo, que se liga ao complexo de ligação. O agente de rotulação pode ser, por exemplo, um anticorpo anti-agente de ligação específico que carrega um rótulo. O segundo anticorpo, específico para o complexo de ligação, pode carecer de um rótulo, mas pode estar ligado por uma quarta molécula específica para a espécie de anticorpos da qual o segundo anticorpo é um membro. Por exemplo, o segundo anticorpo pode ser modificado com uma porção detectável, tal como biotina, que pode ser depois ligado por uma quarta molécula, tal como estreptavidina rotulada com enzima. Outras proteínas capazes de ligar especificamente regiões constantes de imunoglobulina, tais como a proteína A ou a proteína G também podem ser usadas como o agente de rotulação. Estas proteínas de ligação são constituintes normais das paredes celulares das bactérias estreptocócicas e exibem uma reatividade não imunogêníca forte com as regiões constantes da imunoglobulina de uma variedade de espécies. Akerstrom, J. Immunol., 135: 2589 a 2542 (1985); Chaubert, Mod. Pathol., 10: 585 a 591(1997).

Por todos os ensaios, as etapas de incubação e/ou lavagem podem ser requeridas depois de cada combinação de reagentes. As etapas de incubação podem variar de cerca de 5 segundos a várias horas, preferivelmente de cerca de 5 minutos a cerca de 24 horas. Entretanto, o tempo de incubação dependerá do plano geral do ensaio, análito, volume de solução, concentrações e outros. Usualmente, os ensaios serão realizados na temperatura ambiente, embora eles possam ser conduzidos em uma faixa de temperaturas.

A. Ensaios de ligação não competitiva:

Os ensaios de ligação imunológica podem ser do tipo não competitivo. Estes ensaios têm uma quantidade de análito capturado que é diretamente medida. Por exemplo, em um ensaio de “sanduíche” preferido, o agente de captura (anticorpo ou pepticorpo) pode ser diretamente ligado a um substrato sólido onde ele é imobilizado. Estes agentes de captura imobilizados capturam então (se ligam ao) antígeno presente na amostra de teste. A proteína assim imobilizada é depois ligada a um agente de rotulação, tal como um segundo anticorpo tendo um rótulo. Em um outro ensaio “sanduíche” preferido, o segundo anticorpo carece de um rótulo, mas pode ser ligado por um anticorpo específico rotulado a anticorpos das espécies das quais o segundo anticorpo é derivado. O segundo anticorpo também pode ser modificado com uma porção detectável, tal como biotina, à qual uma terceira molécula rotulada pode especificamente ligar-se, tal como estreptavidina. Ver 5 Harlow e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch 14, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988), aqui incorporado por referência.

B. Ensaio de Ligação Competitiva:

Os ensaios de ligação imunológica podem ser do tipo competitivo. A quantidade de análito presente na amostra é medida 10 indiretamente medindo-se a quantidade de um análito adicionado deslocado ou competido, de um agente de captura (anticorpo ou pepticorpo) pelo análito presente na amostra. Em um ensaio de ligação competitiva preferido, uma quantidade conhecida de análito, usualmente rotulado, é adicionada à amostra e a amostra é depois contatada com o agente de captura. A quantidade de 15 análito rotulado ligado ao anticorpo é inversamente proporcional à concentração de análito presente na amostra (Ver, Harlow e Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Ch 14, pp. 579 a 583, supra).

Em um outro ensaio de ligação competitiva preferido, o agente de captura é imobilizado em um substrato sólido. A quantidade de proteína 30 ligada ao agente de captura pode ser determinada medindo-se a quantidade de proteína presente em um complexo de proteína/anticorpo ou alternativamente medindo-se a quantidade de proteína não complexada remanescente. A quantidade de proteína pode ser detectada fomecendo-se uma proteína rotulada. Harlow e Lane (supra).

Já um outro ensaio de ligação competitiva preferido, a inibição de hapteno é utilizada. Aqui, um análito conhecido é imobilizado em um substrato sólido. Uma quantidade conhecida de anticorpo é adicionada à amostra e a amostra é contatada com o análito imobilizado. A quantidade de anticorpo ligado ao análito imobilizado é inversamente proporcional à quantidade de análito presente na amostra. A quantidade de anticorpo imobilizado pode ser detectada detectando-se a fração imobilizada de anticorpo ou a fração que permanece em solução. A detecção pode ser direta onde o anticorpo é rotulado ou indireta pela adição subsequente de uma porção rotulada que especificamente se liga ao anticorpo como descrito acima.

C. Utilização de Ensaios de Ligação Competitiva:

Os ensaios de ligação competitiva podem ser usados para determinações de reatividade cruzada para permitir que um técnico habilitado determine se um complexo de proteína ou enzima que é reconhecido por um pepticorpo da invenção é a proteína desejada e não uma molécula de reação cruzada ou para determinar se o pepticorpo é específico para o antígeno e não se liga a antígenos não relacionados. Nos ensaios deste tipo, o antígeno pode ser imobilizado a um suporte sólido e uma mistura de proteína desconhecida é adicionada ao ensaio, que competirá com a ligação dos pepticorpos à proteína imobilizada. A molécula competidora também se ligara a um ou mais antígenos não relacionados ao antígeno. A capacidade das proteínas para competir com a ligação dos pepticorpos ao antígeno imobilizado é comparada com a ligação pela mesma proteína que foi imobilizada ao suporte sólido para determinar a reatividade cruzada da mistura de proteína.

D. Outros Ensaios de Ligação

A presente invenção também fornece métodos de Western blot para detectar ou quantificar a presença de Ang-2 em uma amostra. A técnica no geral compreende separar proteínas de amostra pela eletroforese em gel com base no peso molecular e transferir as proteínas para um suporte sólido adequado, tal como filtro de nitrocelulose, um filtro de náilon ou filtro de náilon derivatizado. A amostra é incubada com pepticorpos ou fragmentos destes que especificamente se ligam à Ang-2 e o complexo resultante é detectado. Estes pepticorpos podem ser diretamente rotulados ou

100 altemativamente podem ser subsequentemente detectados usando anticorpos rotulados que se ligam especificamente ao pepticorpo.

Ensaio de Diagnóstico

Os agentes de ligação derivados, tais como peptídeos e pepticorpos ou fragmentos destes, da presente invenção são úteis para o diagnóstico de condições ou doenças caracterizadas pela expressão de Ang-2 ou subunidades ou em ensaios para monitorar pacientes que são tratados com indutores de Ang-2, seus fragmentos, agonistas ou inibidores da atividade da Ang-2. Os ensaios de diagnóstico para Ang-2 incluem métodos que utilizam U2um pepticorpo e um rótulo para detectar Ang-2 em fluidos corpóreos humanos ou extratos de células ou tecidos. Os pepticorpos da presente invenção podem ser usados com ou sem modificação. Em um ensaio de diagnóstico preferido, os pepticorpos serão rotulados pela ligação, por exemplo, de um rótulo ou uma molécula repórter. Uma ampla variedade de rótulos e moléculas repórter é conhecida, alguns dos quais já foram aqui descritos. Em particular, a presente invenção é útil para o diagnóstico de doença humana.

Uma variedade de protocolos para medir as proteínas Ang-2 que usam pepticorpos específicos para proteína respectiva é conhecida na técnica. Os exemplos incluem ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e classificação de célula ativada pela fluorescência (FACS). Um imunoensaio de sítio duplo, com base monoclonal que utiliza anticorpos monoclonais reativos a dois epítopos não interferentes em Ang-2 é preferido, mas um ensaio de ligação competitiva pode ser utilizado. Estes ensaios são descritos, por exemplo, em Maddox et al., J. Exp. Med, 158: 1211 (1983).

De modo a fornecer uma base para diagnóstico, valores normais ou padrão para a expressão de Ang-2 humana são usualmente estabelecidos. Esta determinação pode ser realizada combinando-se fluidos

101 corpóreos ou extratos celulares de pacientes normais, preferivelmente humanos, com um pepticorpo para Ang-2, sob condições adequadas para a formação de complexo que são bem conhecidas na técnica. A quantidade de formação de complexo padrão pode ser quantificada comparando-se a ligação dos pepticorpos com quantidades conhecidas da proteína Ang-2, tanto com amostras de controle quanto de doença. Depois, os valores padrão obtidos a partir das amostras normais podem ser comparados com os valores obtidos a partir das amostras de pacientes potencialmente afetados pela doença. O desvio entre os valores padrão e do paciente sugere um papel para a Ang-2 no estado de doença.

Para aplicações em diagnóstico, em certas formas de realização os pepticorpos ou peptideos da presente invenção tipicamente serão rotulados com uma porção detectável. A porção detectável pode ser qualquer uma que seja capaz de produzir, direta ou indiretamente, um sinal detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo, tal como ³H, ¹⁴C, p, S ou I, um composto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina; ou uma enzima, tal como alcalino fosfatase, β-galactosidase ou rábano peroxidase. Bayer et al., Meth. Enz., 184: 138 a 163, (1990).

Doenças

A presente invenção fornece um agente de ligação tal como um peptídeo, pepticorpo ou fragmento, variante ou derivado destes que se ligam à Ang-2 que são úteis para o tratamento de doenças e condições patológicas humanas. Agentes que modulem a atividade de ligação da Ang-2 ou outra atividade celular, podem ser usados em combinação com outros agentes terapêuticos para realçar os seus efeitos terapêuticos ou a diminuição potencial de efeitos colaterais.

Em um aspecto, a presente invenção fornece reagentes e métodos úteis para tratar doenças e condições caracterizadas pelos níveis

102 indesejáveis ou aberrantes de atividade da Ang-2 em uma célula. Estas doenças incluem canceres e outras condições hiperproliferativas, tais como hiperplasia, psoríase, dermatite de contato, distúrbios imunológicos e infertilidade.

A presente invenção também fornece métodos de tratar câncer em um animal, incluindo seres humanos, que compreende administrar ao animal uma quantidade eficaz de um agente de ligação específico, tal como um pepticorpo, que iniba ou diminua a atividade da Ang-2. A invenção é ainda direcionada aos métodos de inibir o desenvolvimento de célula cancerosa, que inclui processos de proliferação celular, invasibilidade e metástase em sistemas biológicos. Os métodos incluem o uso de um composto da invenção como um inibidor do desenvolvimento de célula cancerosa. Preferivelmente, os métodos são utilizados para inibir ou reduzir o desenvolvimento de célula cancerosa, invasibilidade, metástase ou incidência de tumor em animais vivos, tais como mamíferos. Os métodos da invenção também são facilmente adaptáveis para o uso em sistemas de ensaio, por exemplo, ensaiar o desenvolvimento de célula cancerosa e suas propriedades, assim como identificar compostos que afetem o desenvolvimento de célula cancerosa.

Os canceres tratáveis pelos métodos da presente invenção preferivelmente ocorrem em mamíferos. Os mamíferos incluem, por exemplo, seres humanos e outros primatas, assim como animais de estimação ou de companhia tais como cães e gatos, animais de laboratório tais como ratos, camundongos e coelhos e animais de fazenda tais como cavalos, porcos, carneiros e gado.

Os tumores ou neoplasmos incluem desenvolvimentos de células de tecido em que a multiplicação das células é descontrolada e progressiva. Alguns de tais desenvolvimentos são benignos, mas outros são denominados malignos e podem levar à morte do organismo. Os neoplasmos

103 ou canceres malignos são distinguidos dos desenvolvimentos benignos em que, além de exibir proliferação celular agressiva, eles podem invadir os tecidos circundantes e metastatizar. Além disso, os neoplasmos malignos são caracterizados em que eles apresentam uma perda maior de diferenciação 5 (desdiferenciaçao maior) e da sua organização em relação a um outro e seus tecidos circundantes. Esta propriedade também é chamada de “anaplasia,”

Os neoplasmos tratáveis pela presente invenção também incluem tumores sólidos, isto é, carcinomas e sarcomas. Os carcinomas incluem aqueles neoplasmos malignos derivados de células epiteliais que 10 infiltram (invadem) os tecidos circundantes e dão origem a metástases. Adenocarcinomas, são carcinomas derivados de tecido glandular ou que formam estruturas glandulares reconhecíveis. Uma outra categoria ampla ou canceres incluem sarcomas, que são tumores cujas células são embutidas em uma substância fibrilar ou homogênea como tecido conectivo embriônico. A 15 invenção também permite o tratamento de canceres dos sistemas mielóides ou linfóídes, que incluem leucemias, linfomas e outros canceres que tipicamente não se apresentam como uma massa tumoral, mas são distribuídos nos sistemas vasculares ou linforreticulares.

O tipo de câncer ou células de tumor passíveis ao tratamento 30 de acordo com a invenção incluem, por exemplo, tumor que produz ACTH, leucemia linfocítica aguda, leucemia não linfocítica aguda, câncer do córtex adrenal, câncer de bexiga, câncer de cerebral, câncer de mama, câncer de cervical, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielocítica crônica, câncer de colorretal, linfoma de célula T cutânea, câncer endometrial, câncer esofágico, 25 sarcoma de Ewing, câncer da vesícula biliar, leucemia de célula pilosa, câncer da cabeça e pescoço, linfoma de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, câncer renal, câncer hepático, câncer pulmonar (célula pequena e não pequena), efusão peritoneal maligna, efusão pleural maligna, melanoma, mesotelioma, mieloma múltiplo, neuroblastoma, glioma, linfoma que não de Hodgkin,

104 osteossarcoma, câncer ovariano, câncer ovariano (célula germinativa), câncer pancreático, câncer peniano, câncer prostático, retinoblastoma, câncer de pele, sarcoma de tecido mole, carcinomas de célula escamosa, câncer estomacal, câncer testicular, câncer da tireóide, neoplasmos trofoblásticos, câncer uteríno, câncer vaginal, câncer da vulva e tumor de Wilms.

A invenção é particularmente ilustrada aqui em referência ao tratamento de certos tipos de canceres experimentalmente definidos. Nestes tratamentos ilustrativos, modelos in vitro e in vivo no estado da técnica padrão foram usados. Estes métodos podem ser usados para identificar agentes que 10 podem ser esperados ser eficazes em regimes de tratamento in vivo. Entretanto, será entendido que o método da invenção não é limitado ao tratamento destes tipos de tumor, mas estende-se a qualquer tumor sólido derivado de qualquer sistema de órgão. Os canceres cuja invasibilidade ou metástase é associada com a expressão ou atividade de Ang-2 são 15 especialmente suscetíveis a serem inibidos ou mesmo induzidos a regredir por meio da invenção.

A invenção também pode ser praticada pela inclusão com um composto da invenção tal como um pepticorpo em combinação com um outra agente quimioterapêutico anticâncer, tal como qualquer agente Σ20 quimioterapêutico convencionai. A combinação de um agente de ligação específico com tal outros agentes pode potenciar o protocolo quimioterapêutico. Numerosos protocolos quimioterapêuticos apresentar-seão por si só na mente dos profissionais habilitados como sendo capazes de incorporar no método da invenção. Qualquer agente quimioterapêutico pode 25 ser usado, incluindo agentes de alquilação, antimetabólitos, hormônios e antagonistas, radioisótopos, assim como produtos naturais. Por exemplo, o composto da invenção pode ser administrado com antibióticos tais como doxorrubicina e outros análogos de antraciclina, mostardas de nitrogênio tais como ciclofosfamida, análogos de pirimidina tais como 5-fluorouracila,

105 cisplatina, hidroxiuréia, taxol e seus derivados naturais e sintéticos e outros. Como um outro exemplo, no caso de tumores mistos, tais como adenocarcinoma da mama, onde os tumores incluem células dependentes de gonadotropina e independentes de gonadotropina, o composto pode ser 5 administrado em conjunção com leuprolida ou goserelina (análogos peptídicos sintéticos de LH-RH). Outros protocolos antineoplásticos incluem o uso de um composto de tetraciclina com uma outra modalidade de tratamento, por exemplo, cirurgia, radiação, etc., também aludidas aqui como “modalidades antineoplásticas adjuntas.” Assim, o método da invenção pode 10 ser utilizado com regimes convencionais tais com o benefício de reduzir efeitos colaterais e realçar a eficácia.

A presente invenção fornece assim composições e métodos úteis para o tratamento de uma ampla variedade de canceres, incluindo tumores sólidos e leucemias. Tipos de câncer que podem ser tratados incluem, 15 mas não são limitados a: adenocarcinoma da mama, próstata e cólon; todas as formas de carcinoma broncogênico do pulmão; mielóíde; melanoma; hepatoma; neuroblastoma; papiloma; apudoma; coristoma; branquioma; síndrome carcinóide maligna; doença cardíaca carcinóide; carcinoma (por exemplo, de Walker, de célula basal, basoescamoso, de Brown-Pearce, ductal, 30 tumor de Ehrlich, de Krebs 2, de célula de merkel, mucinoso, pulmonar de célula não pequena, de célula em aveia, papilar, cirroso, bronquiolar, broncogênico, de célula escamosa e de célula transicional); distúrbios histiocíticos; leucemia; histiocitose maligna; doença de Hodgkin; carcinoma de célula pulmonar pequena imunoproliferativa; linfoma que não de Hodgkin;

plasmacitoma; reticuloendoteliose; melanoma; condroblastoma; condroma; condrossarcoma; fíbroma; fíbrossarcoma; tumores de célula gigante; histiocitoma; lipoma; lipossarcoma; mesotelioma; mixoma; mixossarcoma; osteoma; osteossarcoma; cordoma; craniofaringioma; disgerminoma; hamartoma; mesenquimoma; mesonefroma; miossarcoma; ameloblastoma;

106 cementoma; odontoma; teratoma; timoma; tumor tofoblástico. Além disso, os seguintes tipos de canceres também podem ser tratados: adenoma; colangioma; colesteatoma; ciclindroma; cistadenocarcinoma; cistadenoma; tumor de célula granulosa; ginandroblastoma; hepatoma; hidradenoma; tumor 5 de célula de ilhota; tumor de célula de Leydig; papiloma; tumor de célula de Sertolí; tumor de célula tecal; leiomioma; leiomiossarcoma; mioblastoma; mioma; miossarcoma; rabdomioma; rabdomiossarcoma; ependimoma; ganglioneuroma; glioma; meduloblastoma; meningíoma; neurilemoma; neuroblastoma; neuroepitelioma; neurofibroma; neuroma; paraganglioma;

chemodectoma; angioceratoma; biperplasia angiolinfocítica com eosinofilia; angioma esclerosante; angiomatose; glomangioma; hemangioendotelioma; hemangioma; hemangiopericitoma; hemangiossarcoma; linfangioma; linfangiomioma; linfangiossarcoma; pinealoma; carcinossarcoma; condrossarcoma; cistossarcoma filóides; fíbrossarcoma; hemangiossarcoma;

leiomiossarcoma; leucossarcoma; lipossarcoma; linfangiossarcoma; miossarcoma; mixossarcoma; carcinoma ovariano; rabdomiossarcoma; sarcoma; neoplasmos; nerofíbromatose; e displasia cervical.

Um outro aspecto da presente invenção é usar os materiais e métodos da presente invenção para prevenir e/ou tratar qualquer condição 20 hiperproliferativa da pele que inclui psoríase e dermatite de contato ou outras doenças híperproliferativas. Foi demonstrado que pacientes com psoríase e dermatite de contato têm atividade elevada da Ang-2 dentro destas lesões [Ogoshi et al., J. Inv. Dermatol., 110: 818 a 823 (1998)]. Preferivelmente, agentes de ligação específicos, específicos para Ang-2 serão usados em 25 combinação com outros agentes farmacêuticos para tratar seres humanos que expressam estes sintomas clínicos. Os agentes de ligação específicos podem ser liberados usando qualquer um dos vários portadores através de vias de administração aqui descritas e outras que são bem conhecidas por aqueles de habilidade na técnica.

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Outros aspectos da presente invenção incluem tratar várias retinopatias (incluindo a retinopatia diabética e a degeneração macular relacionada com a idade) em que a angiogênese está envolvida, assim como distúrbios/doenças do trato reprodutivo feminino tais como endometriose, 5 fibróides uterinos e outras tais condições associadas com a proliferação vascular disfuncional (incluindo o desenvolvimento microvascular endometrial) durante o ciclo reprodutivo feminino.

Ainda um outro aspecto da presente invenção diz respeito a tratar o desenvolvimento vascular anormal que inclui as malformações 10 arteriovenosas cerebrais (AVMs) dano e reparo à mucosa gastrointestinal, ulceração da mucosa gastroduodenal em pacientes com uma história de doença de úlcera péptica, que inclui a isquemia que resulta do acidente vascular cerebral, um amplo espectro de distúrbios vasculares pulmonares na doença hepática e hipertensão portal em pacientes com hipertensão portal não 15 hepática.

Um outro aspecto da presente invenção é a prevenção de canceres utilizando as composições e métodos fornecidos pela presente invenção. Tais reagentes incluirão agentes de ligação específicos tais como pepticorpos contra Ang-2.

720 Composições Farmacêuticas

As composições farmacêuticas de agentes de ligação específicos de Ang-2 tais como pepticorpos estão dentro do escopo da presente invenção. As composições farmacêuticas que compreendem anticorpos estão descritas em detalhes, por exemplo, na Patente US 25 6.171.586, a Lam et al., concedida em 9 de janeiro de 2001. Tais composições compreendem uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um agente de ligação específico, tais como um anticorpo ou um fragmento, variante, derivado ou fusão deste como aqui descrito, em mistura com um agente farmaceuticamente aceitável. Em uma forma de realização preferida,

108 as composições farmacêuticas compreendem agentes de ligação específicos antagonistas que modulam parcial ou completamente pelo menos uma atividade biológica de Ang-2 em mistura com um agente farmaceuticamente aceitável. Tipicamente, os agentes de ligação específicos serão 5 suficientemente purificados para a administração a um animal.

A composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou preservar, por exemplo, o pH, a osmolaridade, viscosidade, claridade, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou penetração da 10 composição. Os materiais de formulação adequados incluem, mas não são limitados aos aminoácidos (tais como glícina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogeno-sulfito de sódio); tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos, outros ácidos orgânicos); agentes de 15 volume (tais como manitol ou glicina), agentes queladores [tais como ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA)]; agentes complexantes (tais como cafeína, polivinilpirrolidona, betaciclodextrina ou hidroxipropil-betaciclodextrina); enchedores; monossacarídeos; dissacarídeos e outros carboidratos (tais como glicose, manose ou dextrinas); proteínas (tais como Σ20 albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas); agentes corantes; flavorizantes e diluentes; agentes emulsificadores; polímeros hidrofílicos (tais como polivinilpirrolidona); polipeptídeos de peso molecular baixo; contraíons formadores de sal (tais como sódio); preservantes (tais como cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, 25 metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (tais como glicerina, propileno glicol ou polietileno glicol); álcoois de açúcar (tais como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; tensoatívos ou agentes de umectação (tais como plurônicos, PEG, ésteres de sorbitano, polissorbatos tais como polissorbato 20, polissorbato 80,

109 triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes realçadores de estabilidade (sacarose ou sorbitol); agentes realçadores de tonicidade (tais como haletos de metal alcalino (preferivelmente cloreto de sódio ou potássio, manitol, sorbitol); veículos de liberação; diluentes; excipientes e/ou 5 adjuvantes farmacêutica. (Remington’s Pharmaceutic Sciences, 18^a Edição,

A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990).

A composição farmacêutica ótima será determinada por uma pessoa habilitada na técnica dependendo, por exemplo, da via intencionada de administração, plano geral de liberação e dosagem desejada:. Ver por 10 exemplo, Remington’s Pharmaceutic Sciences, supra. Tais composições podem influenciar o estado física, a estabilidade, a taxa de liberação in vivo e a taxa de depuração in vivo do agente de ligação específico.

O veículo ou portador primários em uma composição farmacêutica pode ser aquosa ou não aquosa por natureza. Por exemplo, um 15 veículo ou portador adequados podem ser água para injeção, solução salina fisiológica ou fluido cerebrospinhal artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para a administração parenteral. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina sérica são outros veículos exemplares. Outras composições MO farmacêuticas exemplares compreendem tampão Tris em tomo do pH 7,0 a

8,5 ou tampão de acetato em tomo do pH 4,0 a 5,5, que podem ainda incluir sorbitol ou um substituto adequada por conseguinte. Em uma forma de realização da presente invenção, as composições de agente de ligação podem ser preparadas para a armazenagem misturando-se a composição selecionada 25 tendo o grau desejado de pureza com agentes de formulação opcionais (Remington’s Pharmaceutic Sciences, supra) na forma de uma torta liofilizada ou uma solução aquosa. Além disso, o produto de agente de ligação pode ser formulado como um liofilizado usando excipientes apropriados tais como sacarose.

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As composições farmacêuticas podem ser selecionadas para a liberação parenteral. Alternativamente, as composições podem ser selecionadas para a inalação ou para a liberação enteral tal como oral, auralmente, oftalmicamente, retalmente ou vaginalmente. A preparação de 5 tais composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro da habilidade da técnica.

Os componentes de formulação estão presentes nas concentrações que são aceitáveis para o sítio de administração. Por exemplo, tampões são usados para manter a composição em um pH fisiológico ou em 10 um pH levemente mais baixo, tipicamente dentro de uma faixa de pH de cerca de 5 a cerca de 8.

Quando a administração parenteral é considerada, as composições terapêuticas para o uso nesta invenção podem estar na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável isenta de pirogênio, que 15 compreende o agente de ligação específico desejado em um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente adequado para a injeção parenteral é água destilada estéril em que um agente de ligação é formulado como uma solução estéril, isotônica, apropriadamente preservada. Já uma outra preparação pode envolver a formulação da molécula desejada 30 com um agente, tal como microesferas injetáveis, partículas bio-erodíveis, compostos poliméricos (ácido polilático, ácido poliglicólico), pérolas ou lipossomas, que fornecem a liberação controlada ou prolongada do produto que pode ser depois liberado por intermédio de uma injeção depósito. O ácido hialurônico também pode ser usado e este pode ter o efeito de promover a 25 duração prolongada na circulação. Outros meios adequados para a introdução da molécula desejada incluem dispositivos de liberação de medicamento implantáveis.

Em um outro aspecto, as formulações farmacêuticas adequadas para a administração parenteral podem ser formuladas em soluções aquosas,

111 preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hanks, solução de Ringer ou solução salina fisiologicamente tamponada. As suspensões de injeção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetil celulose sódica, sorbitol ou 5 dextrano. Adicionalmente, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosas apropriadas. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, tais como óleo de gergelim ou ésteres de ácido graxo sintéticos, tais como oleato de etila, triglicerídeos ou lipossomas. Polímeros de amino policatiônicos não lipídicos 10 também podem ser usados para liberação. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores adequados ou agentes para aumentar a solubilidade dos compostos e permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

Em uma outra forma de realização, uma composição 15 farmacêutica pode ser formulada para inalação. Por exemplo, um agente de ligação pode ser formulado como um pó seco para a inalação. As soluções de inalação de molécula de polipeptídeo ou ácido nucléico também podem ser formuladas com um propelente para a liberação de aerossol. Já em uma outra forma de realização, as soluções podem ser nebulizadas. A administração Ξ20 pulmonar é ainda descrita no Pedido PCT N- PCT/US94/ 001875, que descreve a liberação pulmonar de proteínas quimicamente modificadas.

Também é considerado que certas formulações podem ser oralmente administradas. Em uma forma de realização da presente invenção, moléculas de agente de ligação que são administradas desta maneira podem 25 ser formuladas com ou sem aqueles portadores habitualmente usados na combinação de formas de dosagem sólidas tais como tabletes e cápsulas. Por exemplo, uma cápsula pode ser planejada para liberar a porção ativa da formulação no ponto no trato gastrointestinal quando a biodisponibilidade é maximizada e a degradação pre-sistêmica é minimizada. Agentes adicionais

125

112 podem ser incluídos para facilitar a absorção da molécula de agente de ligação. Diluentes, flavorizantes, ceras de ponto de fusão baixo, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes desintegradores de tablete e aglutinantes também podem ser utilizados.

As composições farmacêuticas para a administração oral também podem ser formulados usando portadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica em dosagens adequadas para a administração oral. Tais portadores permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como tabletes, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, lamas, suspensões e outros, para a ingestão pelo paciente.

As preparações farmacêuticas para o uso oral podem ser obtidas através da combinação de compostos ativos com excipientes sólidos e processando-se a mistura resultante mistura de grânulos (opcionalmente, depois da moagem) para se obter núcleos de tabletes ou drágeas. Os auxiliares adequados podem ser adicionados, se desejado. Os excipientes adequados incluem enchedores de carboidrato ou proteína, tais como açúcares, que incluem lactose, sacarose, manitol e sorbitol; amido de milho, trigo, arroz, batata ou outras plantas; celulose, tal como metil celulose, hidroxipropilmetil-celulose ou carboximetilcelulose sódica; gomas, que incluem a arábica e tragacanto; e proteínas, tais como gelatina e colágeno. Se desejado, agentes desintegrantes ou solubilizadores podem ser adicionados, tais como a polivinil pirrolidona reticulada, ágar e ácido algínico ou um sal deste, tal como alginato de sódio.

Os núcleos de drágeas podem ser usados em conjunção com revestimentos adequados, tais como soluções de açúcar concentradas, que também podem conter goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos adequados ou misturas de solvente. Corantes ou

113 pigmentos podem ser adicionados aos revestimentos de tabletes ou drágeas para a identificação do produto ou para caracterizar a quantidade de composto ativo, isto é, a dosagem.

As preparações farmacêuticas que podem ser usadas oralmente 5 também incluem cápsulas de encaixe fabricadas de gelatina, assim como cápsulas moles, seladas fabricadas de gelatina e um revestimento, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe podem conter ingredientes ativos misturados com enchedores ou aglutinantes, tais como lactose ou amidos, lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio, e, opcionalmente, 10 estabilizadores. Nas cápsulas moles, os compostos ativos podem ser dissolvidos ou colocados em suspensão em líquidos adequados, tais como óleos graxos, líquido ou polietileno glicol líquido com ou sem estabilizadores.

Uma outra composição farmacêutica pode envolver uma quantidade eficaz de agente de ligação em uma mistura com excipientes não 15 tóxicos que são adequados para a fabricação de tabletes. Dissolvendo-se os tabletes em água estéril ou outro veículo apropriado, as soluções podem ser preparadas em forma de dose unitária. Os excipientes adequados incluem, mas não são limitados a, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes de L20 ligação, tais como amido, gelatina ou acácia; ou agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.

As composições farmacêuticas adicionais estarão evidentes àqueles habilitados na técnica, incluindo formulações que envolvem moléculas de agente de ligação em formulações de liberação prolongada ou 25 controlada. As técnicas para formular uma variedade de outros meios de liberação prolongada ou controlada, tais como portadores lipossômicos, mícropartícuias bio-erodíveis ou pérolas porosas e injeções de depósito, também são conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Ver por exemplo, a PCT/US93/00829 que descreve a liberação controlada de micropartículas

1*5

114 poliméricas porosas para a liberação de composições farmacêuticas. Os exemplos adicionais de preparações de liberação prolongada incluem matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos formados, por exemplo películas ou microcápsulas. As matrizes de liberação prolongada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactídeos (U.S. 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato [Sidman et al., Biopolimers, 22: 547 a 556 (1983)], polí (2-hidroxietil-metacrilato) [Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167 a 277, (1981)] e [Langer et al., Chem. Tech., 12: 98 a 105 (1982)], etileno vinil acetato (Langer et al., supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988). As composições de liberação prolongada também incluem lipossomas, que podem ser preparados por qualquer um de diversos métodos conhecidos na técnica. Ver por exemplo, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 82: 3688 a 3692 (1985); EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949.

A composição farmacêutica a ser usada para a administração in vivo tipicamente deve ser estéril. Isto pode ser realizado pela filtração através de membranas de filtração estéreis. Onde a composição é liofilizada, a esterilização usando este método pode ser conduzida antes ou a seguir da liofílização e reconstituição. A composição para a administração parenteral pode ser armazenada na forma liofilizada ou em solução. Além disso, as composições parenterais no geral são colocadas em um recipiente tendo um orifício de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasco de solução intravenosa tendo uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.

Uma vez que a composição farmacêutica foi formulada, ela pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou um pó desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas em uma forma pronta para o uso ou em uma forma (por exemplo, liofilizada) que requeira reconstituição antes da administração.

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115

Em uma forma de realização específica, a presente invenção está direcionada aos kits para produzir uma unidade de administração de dose única. Os kits podem conter cada um tanto um primeiro recipiente tendo uma proteína seca quanto um segundo recipiente tendo uma formulação aquosa.

Também incluídos dentro do escopo desta invenção estão os kits contendo seringas pré enchidas de câmara única e múltipla (por exemplo, seringas de líquido e liosseringas).

Uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica a ser terapeuticamente utilizada dependerá, por exemplo, do contexto e objetivos 10 terapêuticos. Uma pessoa habilitada na técnica avaliará que os níveis de dosagem apropriados para o tratamento variará assim dependendo, em parte, da molécula liberada, da indicação para a qual a molécula de agente de ligação está sendo usada, da via de administração e do tamanho (peso corpóreo, superfície corpórea ou tamanho do órgão) e da condição (da idade e 15 da saúde geral) do paciente. Consequentemente, o médico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para se obter o efeito terapêutico ótimo, Uma dosagem típica pode variar de cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Em outras formas de realização, a dosagem pode variar de 0,1 mg/kg até cerca de 100 30 mg/kg; ou de 1 mg/kg até cerca de 100 mg/kg; ou de 5 mg/kg até cerca de 100 mg/kg.

Para qualquer composto, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente nos ensaios de cultura celular ou em modelos de animal tais como camundongos, ratos, coelhos, cães, porcos ou macacos. Um 25 modelo de animal também pode ser usado para determinar a faixa de concentração apropriada e a via de administração. Tal informação pode ser depois usada para determinar as doses úteis e a vias para a administração em seres humanos.

A dosagem exata será determinada considerando-se fatores

116 relacionados com o paciente que requer o tratamento. A dosagem e a administração são ajustadas para fornecer níveis suficientes do composto ativo ou para manter o efeito desejado. Os fatores que podem ser levados em conta incluem a gravidade do estado de doença, a saúde geral do paciente, a 5 idade, peso e gênero do paciente, tempo e frequência de administração, combinação(ões) medicamentosa(s), sensibilidades de reação e resposta à terapia. As composições farmacêuticas de ação duradoura podem ser administradas a cada 3 a 4 dias, a cada semana ou bissemanalmente dependendo da meia vida e taxa de depuração da formulação particular.

A freqüência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos da molécula de agente de ligação na formulação usada. Tipicamente, uma composição é administrada até que uma dosagem seja atingida que alcance o efeito desejado. A composição pode ser portanto administrada como uma dose única ou como doses múltiplas (nas mesmas ou 15 concentrações/dosagens diferentes) com o tempo ou como uma infusão contínua. Outro refinamento da dosagem apropriada é rotineiramente feito. As dosagens apropriadas podem ser averiguadas através do uso de dados de dose-resposta apropriados.

A via de administração da composição farmacêutica está de =0 acordo com métodos conhecidos, por exemplo oralmente, através de injeção pelos meios intravenoso, intraperitoneal, intracerebral (intra-parenquimatoso), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal, vias intralesionais, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, subcutâneo, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópico, sublingual, uretral, 25 vaginal ou retal, pelos sistemas de liberação prolongada ou pelos dispositivos de implantação. Onde desejado, as composições podem ser administradas pela injeção de bolo ou continuamente pela infusão ou pelo dispositivo de implantação.

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Alternativa ou adicionalmente, a composição pode ser

117 administrada localmente por intermédio da implantação de uma membrana, esponja ou um outro material apropriado sobre o qual a molécula desejada foi absorvida ou encapsulada. Onde um dispositivo de implantação é usado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequados e a 5 liberação da molécula desejada pode ser por intermédio da difusão, bolo de liberação controlada ou administração contínua.

Em alguns casos, pode ser desejável usar composições farmacêuticas em uma maneira ex vivo. Em tais exemplos, as células, tecidos ou órgãos que foram removidos do paciente são expostos às composições 10 farmacêuticas depois do que as células, tecidos e/ou órgãos são subsequentemente implantados de volta no paciente.

Em outros casos, um agente de ligação da presente invenção tal como um pepticorpo pode ser liberado implantando-se certas células que foram geneticamente engendradas, usando métodos tais como aqueles aqui 15 descritos, para expressar e secretar o polipeptídeo. Tais células podem ser células de animal ou de ser humano e podem ser autólogas, heterólogas ou xenogênicas. Opcionalmente, as células podem ser imortalizadas. De modo a diminuir a chance de uma resposta imunológica, as células podem ser encapsuladas para evitar a infiltração de tecidos circundantes. Os materiais de Ξ20 encapsulação são tipicamente biocompatíveis, fechamentos ou membranas poliméricas semi-permeáveis que permitem a liberação do(s) produto(s) de proteína mas impedem a destruição das células pelo sistema imune do paciente ou por outros fatores nocivos dos tecidos circundantes.

Terapia de Combinação

Agentes de ligação específicos da invenção tais como pepticorpos podem ser utilizados em combinação com outros produtos terapêuticos no tratamento de doenças associadas com a expressão de Ang-2. Estes outros produtos terapêuticos incluem, por exemplo tratamento por radiação, quimioterapia e terapias alvejadas tais como Herceptin®, Rituxan®,

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Gleevec® e outros. As terapias de combinação adicionais não especificamente aqui listadas também estão dentro do escopo da presente invenção.

O tratamento de quimioterapia pode utilizar agentes anti-neoplásticos incluindo, por exemplo, agentes alquiladores que incluem: 5 mostardas de nitrogênio, tais como mecloretamina, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalan e clorambucil; nitrosouréias, tais como carmustina (BCNU), lomustina (CCNU) e semustina (metil-CCNU); etíleníminas/ metilmelamina tais como trietilenomelamina (TEM), trietileno, tiofosforamida (tiotepa), hexametilmelamina (HMM, altretamina); alquil 10 sulfonatos tais como busulfan; triazinas tais como dacarbazina (DTIC); antimetabólitos que incluem análogos do ácido fólico tais como metotrexato e trimetrexato, análogos de pirimidina tais como 5-fluorouracila, fluorodesoxiuridina, gemcitabina, citosina arabinoside (AraC, citarabina), 5-azacitidina, 2,2’-difluorodesoxicitidina, análogos de purina tais como 15 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, azatioprina, 2’-desoxicoformicina (pentostatina), eritroidroxinonil adenina (EHNA), fosfato de fludarabina e 2-clorodesoxiadenosina (cladríbina, 2CdA); produtos naturais que incluem medicamentos antimitóticos tais como paclitaxel, alcalóides vinca incluindo vinblastina (VLB), vincristina e vinorelbina, taxotere, estramustina e fosfato Ξ20 de estramustina; ppipodofilotoxinas tais como etoposide e teniposide;

antibióticos tais como actimomicina D, daunomicina (rubidomicina), doxorubicina, mitoxantrona, idarubicina, bleomicinas, plicamicina (mitramicina), mitomicina C e actinomicina; enzimas tais como L-asparaginase; modificadores de resposta biológica tais como interferon-alfa, 25 EL-2, G-CSF e GM-CSF; agentes mistos que inclui complexos de coordenação de platina tais como cisplatina e carboplatina, antracenodionas tais como mitoxantrona, uréia substituída tal como hidroxiuréia, derivados de metilidrazina que incluem N-metilidrazina (MIH) e procarbazina, supressores adrenocorticais tais como mitotano (ο,ρ-DDD) e aminoglutetimida;

119 hormônios e antagonistas que incluem antagonistas de adrenocorticosteróide tais como prednisona e equivalentes, dexametasona e aminoglutetimida; progestina tal como caproato de hidroxiprogesterona, acetato medroxiprogesterona e acetato de megestrol; estrogênio tal como 5 dietilstilbestrol e equivalentes de etinil estradiol; antiestrogênio tal como tamoxifeno; androgênios que incluem propionato de testosterona e fluoximesterona/equivalentes; antiandrogênios tais como flutamida, análogos do hormônio que libera gonadotropina e leuprolide; e antiandrogênios não esteróides tais como flutamida.

A terapia de combinação com fatores de desenvolvimento pode incluir citocinas, linfocinas, fatores de desenvolvimento ou outros fatores hematopoiéticos tais como M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNFO, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF, trombopoietina, fator de célula tronco e eritropoietina. Outros são composições podem incluir angiopoietinas conhecidas, por exemplo Ang-1, -2, -4, -Y, e/ou o polipeptídeo como a Ang humana e/ou o fator de desenvolvimento endotelial vascular (VEGF). Os fatores de desenvolvimento incluem angiogenina, proteína morfogênica óssea 1, proteína morfogêníca 30 óssea 2, proteína morfogênica óssea 3, proteína morfogênica óssea 4, proteína morfogênica óssea 5, proteína morfogênica óssea 6, proteína morfogênica óssea 7, proteína morfogênica óssea 8, proteína morfogênica óssea 9, proteína morfogênica óssea 10, proteína morfogênica óssea 11, proteína morfogênica óssea 12, proteína morfogênica óssea 13, proteína morfogênica óssea 14, proteína morfogênica óssea 15, receptor da proteína morfogênica óssea IA, receptor da proteína morfogênica óssea IIB, fator neurotrófico derivado do cérebro, fator neurotrófico ciliar, receptor , do fator neurotrófico ciliar, fator quimiotático neutrofílico induzido pela citocina 1, fator quimiotático neutrofílico induzido pela citocina 2, fator quimiotático neutrofílico induzido

120 pela citocina 2, fator de desenvolvimento de célula endotelial, endotelina 1, fator de desenvolvimento epidérmico, atraente neutrofílico derivado de epitelial, fator de desenvolvimento de fibroblasto 4, fator de desenvolvimento de fibroblasto 5, fator de desenvolvimento de fibroblasto 6, fator de desenvolvimento de fibroblasto 7, fator de desenvolvimento de fibroblasto 8, fator de desenvolvimento de fibroblasto 8b, fator de desenvolvimento de fibroblasto 8c, fator de desenvolvimento de fibroblasto 9, fator de desenvolvimento de fibroblasto 10, fator de desenvolvimento de fibroblasto ácido, fator de desenvolvimento de fibroblasto básico, receptor do fator neutrófico derivado de linhagem de célula glial 1, receptor do fator neutrófico derivado de linhagem de célula glial 2, proteína relacionada com o desenvolvimento, proteína relacionada com o desenvolvimento 1, proteína relacionada com o desenvolvimento 2, proteína relacionada com o desenvolvimento 3, fator de desenvolvimento epidérmico de ligação de heparina, fator de desenvolvimento de hepatócito, receptor do fator de desenvolvimento de hepatócito, fator de desenvolvimento semelhante à insulina I, receptor do fator de desenvolvimento semelhante à insulina, fator de desenvolvimento semelhante à insulina II, proteína de ligação do fator de desenvolvimento semelhante à insulina, fator de desenvolvimento de queratinócito, fator inibidor da leucemia, receptor do fator inibidor da leucemia 1, fator de desenvolvimento de nervo, receptor do fator de desenvolvimento de nervo, neurotrofina-3, neurotrofina-4, fator de desenvolvimento da placenta, fator de desenvolvimento da placenta 2, fator de desenvolvimento de célula endotelial derivado de plaqueta, fator de desenvolvimento derivado de plaqueta, cadeia A do fator de desenvolvimento derivado de plaqueta, fator de desenvolvimento derivado de plaqueta AA, fator de desenvolvimento derivado de plaqueta AB, cadeia B do fator de desenvolvimento derivado de plaqueta, fator de desenvolvimento derivado de plaqueta BB, receptor do fator de desenvolvimento derivado de plaqueta 1,

121 receptor do fator de desenvolvimento derivado de plaqueta 2, fator estímulador de desenvolvimento de célula pré B, fator de célula tronco, receptor do fator de célula tronco, fator de desenvolvimento transformante 1, fator de desenvolvimento transformante 2, fator de desenvolvimento 5 transformante 1, fator de desenvolvimento transformante 1,2, fator de desenvolvimento transformante 2, fator de desenvolvimento transformante 3, fator de desenvolvimento transformante 5, fator de desenvolvimento transformante latente 1, proteína de ligação I do fator de desenvolvimento transformante 1, proteína de ligação II fator de desenvolvimento 10 transformante 1, proteína de ligação III do fator de desenvolvimento transformante 1, receptor do fator de necrose de tumor tipo I, receptor do fator de necrose de tumor tipo II, receptor ativador de plasminogênío do tipo urocinase, fator de desenvolvimento endotelial vascular e proteínas quiméricas e fragmentos destes biológica ou imunologicamente ativos.

Imunoterapêuticos

Os imunoterapêuticos no geral contam com o uso de células e moléculas efetoras imunes para alvejar e destruir células cancerosas. Os efetores imunes podem ser, por exemplo, um pepticorpo da presente invenção que reconhece algum marcador na superfície de uma célula alvo. O MO pepticorpo sozinho pode servir como um efetor de terapia ou pode recrutar outras células para efetuar realmente a morte celular. O pepticorpo também pode ser conjugado a um medicamento ou toxina (quimioterapêutíco, radionuclide, cadeia A de ricina, toxina do cólera, toxina da coqueluche, etc.) e assim pode meramente servir como um agente alvejador.

De acordo com a presente invenção, as formas mutantes de

Ang-2 podem ser alvejadas pela imunoterapia de pepticorpos ou conjugados r de pepticorpo da invenção. E particularmente considerado que as composições de pepticorpo da invenção podem ser usadas em um método de terapia combinada em conjunção com a terapia alvejada à Ang-2.

122

A imunoterapia passiva tem provado ser particularmente eficaz contra vários canceres. Ver, por exemplo, a WO 98/39027.

Os seguintes exemplos são intencionados apenas com propósitos de ilustração e não devem ser interpretados de nenhum modo como limitantes do escopo da invenção.

Exemplo 1

Expressão de Ang-2 em Tecido Patológico e Normal

A expressão de Ang-2 foi examinada em tecido normal e patológico usando a hibridização in situ. Fragmentos das seqüências de Ang-2 humana (Número de Acesso no Genbank: AF004327, nucleotídeos de 1274 a 1726) e de murino (Número de Acesso no Genbank: AF004326, nucleotídeos de 1135 a 1588) foram amplificadas pela transcriptase reversa-PCR a partir de cDNA pulmonar fetal humano ou de murino, clonados no plasmídeo pGEM-T e verificadas pelo seqüenciamento. Sondas de RNA de anti-sentido rotuladas com ³³P foram transcritas a partir de padrões plasmídicos linearizados usando ³³p-UTP e RNA polimerase. Blocos de tecidos fixos em formaldeído, embutidos em parafina foram seccionados a 5 pm e coletados em lâminas carregadas. Antes da hibridização in situ, os tecidos foram permeabilizados com HC1 0,2 M, seguido pela digestão com proteinase K e acetilação com trietanolamina e anidrido acético. As seções foram hibridizadas com a sonda radio-rotulada durante a noite a 55° C depois submetidas à digestão com RNase e uma lavagem de alta severidade em cerca de 0,1 X SSC a 55° C. As lâminas foram mergulhadas em emulsão Kodak NTB2, expostas a 4° C durante 2 a 3 semanas, desenvolvidas e contratingidas. As seções foram examinadas com campo escuro e iluminação padrão para permitir a avaliação simultânea da morfologia de tecido e sinal de hibridização.

Os resultados indicaram que no pós natal normal humano, a expressão de Ang-2 é restrita aos poucos tecidos contendo vasculatura angiogênica, tais como o ovário, a placenta e o útero. Nenhuma expressão de

123

Ang-2 foi detectável no coração, cérebro, rim, fígado, pulmão, pâncreas, baço, músculo, amígdala, timo, apêndice, linfônodo, vesícula biliar, próstata ou testículos de ser humano adulto normal. Em camundongo de cinco semanas de idade (mas não macaco ou ser humano adultos), os rins demonstraram a expressão proeminente de Ang-2 nos vasos retos. Para determinar se esta expressão foi uma sobra do desenvolvimento embriônico, este experimento foi repetido nos rins derivados de camundongos variando em idade até um ano de idade usando a sonda de Ang-2 de murino e as condições descritas acima. A expressão de Ang-2 foi observada diminuir durante o desenvolvimento neonatal, mas foi ainda evidente nos rins de camundongos de um ano de idade.

A expressão de Ang-2 também foi detectada virtualmente em todos os tipos de tumor testados, incluindo, tumores humanos primários tais como carcinoma de cólon (5 casos), carcinoma de mama (10 casos), carcinoma de pulmão (8 casos), glioblastoma (1 caso), tumores humanos metastáticos tais como carcinoma de mama (2 casos), carcinoma de pulmão (2 casos) e carcinoma ovariano (2 casos) que metastatizaram para o cérebro e modelos de tumor de roedor tais como C6 (glioma de rato), HT29 (carcinoma de cólon humano), Colo-205 (carcinoma de cólon humano), HCTI 16 (carcinoma de cólon humano), A431 (carcinoma epidermóide humano), A673 (rabdomiossarcoma humano), HT1080 (fíbrossarcoma humano), PC-3 (carcinoma prostático humano), B16F10 (melanoma de murino), MethA (sarcoma de murino) e carcinoma pulmonar de Lewis encontrados. Adicionalmente, a expressão de Ang-2 foi detectada em neovasos desenvolvendo em um tampão de Matrigel em resposta ao VEGF e em um modelo de hipoxia de camundongo de retinopatia de prematuridade.

Exemplo 2

Ensaio Molecular para Avaliar Pepticorpos de Ang-2

Ensaios moleculares (ELISA de Afinidade, ELISA de

124

Neutralização e BIAcore) foram desenvolvidos para avaliar a ligação de pepticorpo direta à Ang-2 e membros da família relacionados e o efeito dos pepticorpos na interação de Ang-2 :Tie-2. Estes ensaios in vitro são descritos como segue.

ELISA de Afinidade

Para a triagem inicial de pepticorpos anti-Ang-2 candidatos, Ang-2 humana purificada (R.&D Systems, Inc; catálogo número 623-A; a Ang-2 é fornecida como uma mistura de 2 versões truncadas) ou polipeptídeo de Ang-2 de murino (preparado como descrito acima) foram usados. Para os ensaios de ligação confirmatórios, a Ang-2 humana foi obtida de meio condicionado de células 293T humanas transfectadas com DNA de Ang-2 humana de comprimento completo e cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) isento de soro contendo cerca de 50 microgramas por ml de albumina sérica bovina (BSA).

Usando placas de microtítulo, aproximadamente 100 microlitros por reservatório de Ang-2 foram adicionados a cada reservatório e as placas foram incubadas cerca de 2 horas, depois do que as placas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo cerca de 0,1 por cento de Tween-20 quatro vezes. Os reservatórios foram depois bloqueados usando cerca de 250 microlitros por reservatório de cerca de 5 por cento de BSA em PBS e as placas foram incubadas na temperatura ambiente durante cerca de 2 horas. Depois da incubação, a solução de bloqueio em excesso foi descartada e cerca de 100 microlitros de cada pepticorpo antiAng-2 candidato foram adicionados a um reservatório em uma série de diluição começando a uma concentração de cerca de 40 nanomolares e depois diluindo-se em série de 4 vezes em PBS contendo cerca de 1 por cento de BSA. As placas foram depois incubadas durante a noite na temperatura ambiente. Depois da incubação, as placas foram lavadas com PBS contendo cerca de 0,1 por cento de Tween-20. A lavagem foi repetida quatro vezes

125 adicionais, depois do que cerca de 100 microlitros por reservatório de IgG(Fc)-BRP anti-humano de cabra (Pierce Chemical Co., catálogo # 31416) previamente diluída 1:5000 em PBS contendo 1 por cento de BSA foi adicionado. As placas foram incubadas aproximadamente 1 hora na temperatura ambiente, as placas foram depois lavadas cinco vezes em PBS contendo cerca de 0,1 por cento de Tween-20, depois do que cerca de 100 microlitros por reservatório de substrato TMB (Sistema de Substrato Líquido de 3,3’,5,5’-TetrametilbenzÍdÍna; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, número de catálogo T8665) foi adicionado e as placas foram incubadas cerca de 5 a 15 minutos até desenvolvida a cor azul. A absorbância foi depois lida em um espectrofotômetro a cerca de 370 nm.

ELISA de Neutralização

Placas de microtítulo às quais polipeptídeo Ang-2 humano foi ligado foram preparadas como descrito para o ELISA de Afinidade. Os pepticorpos anti-Ang-2 candidatos foram titulados de 1000 nM a 0,22 pM em diluições de 4 vezes em uma solução de PBS contendo cerca de 1 % de BSA e cerca de 1 nM de Tie-2 (fornecida como uma molécula Tie-2-Fc onde a porção Tie-2 contém apenas a porção extracelular solúvel da molécula; R&D

Systems, número de catálogo 313-TI). Depois cerca de 100 microlitros da 20 solução de anticorpo/Tie-2 foram adicionados a cada reservatório, as placas foram incubadas durante a noite na temperatura ambiente e depois lavadas cinco vezes em PBS contendo cerca de 0,1 por cento de Tween-20. Depois da lavagem, cerca de 100 microlitros por reservatório de anticorpo anti-Tie-2 (Pharmingen Inc., catálogo # 557039) foram adicionados a uma concentração 25 final de cerca de 1 micrograma por ml e as placas foram incubadas cerca de 1 hora na temperatura ambiente. Em seguida, cerca de 100 microlitros por reservatório de IgG-IIRP anti-camundongo de cabra (Pierce Chemical CO., catálogo # 31432) foram adicionados a uma diluição de 1:10.000 em PBS contendo cerca de 1 por cento de BSA. As placas foram incubadas na

126 temperatura ambiente durante cerca de 1 hora, depois do que elas foram lavadas cinco vezes com PBS contendo cerca de 0,1 por cento de Tween-20. Cerca de 100 microlitros por reservatório de substrato de TMB (descrito acima) foi depois adicionado e a cor foi deixada desenvolver. A absorbância 5 foi depois lida em um espectrofotômetro a 370 nm.

Afinidade BIAcore

Uma análise de afinidade de cada pepticorpo de Ang-2 candidato foi realizada em um BIAcore 2000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) com PBS e 0,005 por cento de tensoativo P20 (Biacote, Inc.) como tampão 10 fluente. A Proteína Recombinante G (Repligen, Needham, MA) foi imobilizada em uma lasca de sensor CM5 grau de pesquisa (Biacore, Inc.) por intermédio de grupos de amina primária usando o Kit Amine Coupling (Biacore, Inc.) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante.

Os ensaios de ligação foram realizados capturando-se primeiro cerca de 100 Ru de cada pepticorpo anti-Ang-2 candidato na Proteína G imobilizada, depois do que várias concentrações (0 a 100 nM) de huAng-2 ou mAng-2 foram injetadas na superfície do anticorpo ligado a uma razão de fluxo de 50 μΐ/min durante 3 minutos. Os parâmetros cinéticos de ligação de pepticorpo que inclui k_a (constante da taxa de associação), kj (constante da 20 taxa de dissociação) e K_D (constante de equilíbrio de dissociação) foram determinados usando o programa de computador BIA evaluation 3.1 (Biacore, Inc.). As constantes de equilíbrio de dissociação mais baixas indicaram afinidade maior do pepticorpo para a Ang-2.

Exemplo 3

Identificação de Peptídeos de Ligação Ang-2

1. Preparação de Pérolas Magnéticas Revestidas com Ang-2

A. Imobilização de Ang-2 em pérolas magnéticas

Para a eluição não específica, a proteína Ang-2 biotinilada (Angiopoietina-2 Recombinante Humana Biotinilada, R&D Systems, Inc.;

127 número de catálogo BT 623) foi imobilizada em Streptavidin Dynabeads (Dynal, Lake Success, NY) a uma concentração de cerca de 4 pg da proteína Ang-2 biotinilada por 100 μΐ do estoque de pérola do fabricante para todas as três rodadas de seleção. Para as eluições de antígeno (Ang-2) e receptor 5 (Tie-2), 2 pg de proteína Ang-2 biotinilada foram imobilizados em 50 μΐ das

Streptavidin Dynabeads para a segunda rodada de seleção. A concentração de revestimento foi reduzida a cerca de 1 pg de proteína Ang-2 biotinilada por 50 μΐ do estoque de pérola para a terceira rodada de seleção. Drenando-se as pérolas para um lado de um tubo usando um imã e pipetando-se o líquido, as 10 pérolas foram lavadas cinco vezes com a solução salina tamponada com fosfato (PBS) e recolocadas em suspensão em PBS. A proteína Ang-2 biotinilada foi adicionada às pérolas lavadas na concentração acima e incubadas com rotação durante 1 hora na temperatura ambiente, seguido por umas poucas horas até uma incubação durante a noite a 4°C com rotação. As 15 pérolas revestidas com Ang-2 foram depois bloqueadas adicíonando-se BSA a cerca de 1 % da concentração final e incubando durante a noite a 4°C com rotação. As pérolas revestidas com Ang-2 resultantes foram depois lavadas cinco vezes com PBS antes de serem submetidas aos procedimentos de seleção.

|j20 B. Preparação de pérola por seleção negativa

Pérolas adicionais também foram preparadas para seleções negativas. Para cada condição de panning, 500 μΐ do estoque de pérola do fabricante foram submetidos ao procedimento acima (seção IA) exceto que a etapa de incubação com Ang-2 biotinilada foi omitida. Na última etapa de 25 lavagem, as pérolas foram divididas em cinco alíquotas de 100 μΐ.

2. Seleção de Fago de Ligação de Ang-2

A. Estratégia global

Três coleções de fago filamentoso, designadas como “TN8-IX” (5 x 10⁹ transformantes independentes), “ΤΝ12-Γ (l,4x 10⁹

128 transformantes independentes) e “Linear” (2,3 x 10⁹ transformantes independentes) (todos da Dyax Corp.), foram usadas para selecionar o Fago de Ligação de Ang-2. Cada coleção foi depois submetida à eluição não específica, eluição de Ang-2 e eluição de receptor (TÍe-2). Nove condições de 5 panning diferentes foram realizadas para Ang-2 (TN8-IX usando o método de eluição não específica, TN8-IX usando o método de eluição de Ang-2, TN8-IX usando o método de eluição de Tie-2, TN12-I usando o método da eluição não específica, TN12-I usando o método da eluição de Ang-2 e TN124 usando o método da eluição de Tie-2, Linear usando o método da 10 eluição não específica, Linear usando o método da eluição de Ang-2 e Linear usando o método da eluição de Tie-2). Para todas as três coleções, o fago da primeira rodada de seleção foi eluído apenas em uma maneira não específica para outras rodadas de seleção. As eluições de Ang-2 e Tie-2 foram usadas nas segunda e terceira rodadas de seleção. Para a coleção linear, a seleção foi 15 realizada apenas na segunda rodada para as eluições de Ang-2 e Tie-2.

B. Seleção Negativa

Para cada condição de panning, cerca de 100 equivalentes de coleção aleatória para TN8-IX e TN12-I (cerca de 5 x 10¹¹ pfu para TN8-IX e cerca de 1,4 x 10¹¹ pfu para TN12-I) e cerca de 10 equivalentes de coleção —±20 aleatória para a coleção linear (cerca de 1 x 10¹¹ pfu) foram aliquotados do estoque da coleção e diluídos a cerca de 400 μΐ com PBST (PBS com 0,05 % de Tween-20). Depois da última lavagem, o líquido foi drenado da primeira alíquota de 100 μΐ das pérolas preparadas para a seleção negativa (seção 1B), o estoque de coleção diluído a aproximadamente 400 μΐ foi adicionado às 25 pérolas. A mistura resultante foi incubada durante cerca de 10 minutos na temperatura ambiente com rotação. O sobrenadante de fago foi drenado usando o imã e adicionado à segunda alíquota de 100 μΐ para uma outra etapa de seleção negativa. Deste modo, cinco etapas de seleção negativa foram realizadas.

129

C. Seleção usando as pérolas revestidas com a proteína Ang-2

O sobrenadante de fago depois da última etapa de seleção negativa (seção 1B) foi adicionado às pérolas revestidas com Ang-2 (seção IA). Esta mistura foi incubada com rotação durante uma a duas horas na temperatura ambiente, deixando o fago ligar-se à proteína alvo. Depois que o sobrenadante foi descartado, as pérolas foram lavadas cerca de dez vezes com PBST seguido por duas lavagens com PBS.

D. Eluição não específica

Depois que o líquido de lavagem final foi drenado (seção 2C), 10 cerca de 1 ml da solução de sais Min A (60 mM K₂HPO₄, 33 mM KH₂PO₄,

7,6 mM (NH4)SO₄ e 1,7 mM de citrato de sódio) foi adicionado às pérolas. Esta mistura de pérola foi adicionada diretamente a uma amostra de bactéria concentrada para infecção (ver abaixo as seções 3 A e 3B).

E. Eluição de antígeno (Ang-2) de fago ligado

Para a rodada 2, depois da última etapa de lavagem (seção 2C), o fago ligado foi eluído das pérolas magnéticas adicionando-se 100 μΐ de 1 pM, 0,1 nM e 10 nM de proteína Ang-2 recombinante (Angiopoietina-2 Humana Recombinante, R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota) sucessivamente com uma incubação de 30 minutos para cada condição. O —±20 fago remanescente foi eluído não especificamente (seção 2D). O fago eluído de 10 nM e as eluições não específicas foram combinados e eles foram submetidos a terceira rodada de seleção (ver Seção 4, abaixo).

Para a rodada 3, depois da última etapa de lavagem (seção 2C), o fago ligado foi eluído das pérolas magnéticas adicionando-se cerca de 1 nM 25 da proteína Ang-2 recombinante e 10 nM da proteína Ang-2 recombinante sucessivamente com uma incubação de 30 minutos para cada condição. Além disso, o fago foi eluído com 1 ml de solução 100 mM de trietilamina (Sigma, St. Louis, Missouri) durante cerca de 10 minutos em um girador. O pH da solução de trietilamina contendo o fago foi neutralizado com 0,5 ml de

130

Tris-HCl 1 Μ (pH 7,5). Depois da última eluição com solução de trietilamina

100 mM, o fago remanescente foi eluído adicionando-se pérolas às bactérias (seção 2D).

F. Eluição do Receptor (Tie-2) de fago ligado

Para a rodada 2, depois da última etapa de lavagem (seção 2C), o fago ligado foi eluído das pérolas magnéticas adicionando-se cerca de 100 μΐ de 1 pM, 0,1 nM e 10 nM de proteína Tie-2 recombinante (Quimera

Tie-2-Fc Humana Recombinante, R&D Systems, Inc., Mínneapolis, Minnesota) sucessivamente com uma incubação de 30 minutos para cada condição. O fago remanescente foi eluído não especifícamente (seção 2D). O fago eluído de 10 nM e as eluições não específicas foram combinados e eles foram submetidos à terceira rodada de seleção (ver a seção 4 abaixo).

Para a rodada 3, depois da última etapa de lavagem (seção 2C), o fago ligado foi eluído das pérolas magnéticas adicionando-se cerca de 1 nM 15 de proteína Ang-2 recombinante e 10 nM de proteína Tie-2 recombinante sucessivamente com uma incubação de 30 minutos para cada condição. Além disso, o fago foi eluído com 1 ml de solução 100 mM de trietilamina (Sigma, St. Louis, Missouri) durante 10 minutos em um girador. O pH do fago contendo a solução de trietilamina foi neutralizado com 0,5 ml de 1 M Tris-HCl (pH 7,5). Depois da última eluição com 100 mM de solução de trietilamina, o fago remanescente foi eluído adicionando-se pérolas à bactéria (seção 2D).

3, Amplificação

A. Preparação de células plaqueadas

Cultura de E. coli fresca (XL-1 Blue MRF) foi cultivada a uma

ODôoo d^e cerca de 0,5 em meio LB contendo cerca de 12,5 pg/ml de tetraciclina. Para cada condição de panning, cerca de 20 ml desta cultura foi congelada em gelo e centrifugada. A pelota de bactérias foi recolocada em suspensão em cerca de 1 ml da solução de Sais Min A.

131

B. Transdução

Cada mistura de cada método de eluição diferente apresentada acima (seções 2D, 2E e 2F) foi adicionada a uma amostra de bactérias concentrada (seção 3A) e incubadas a cerca de 37° C durante cerca de 15 5 minutos. Aproximadamente 2 ml de meio NZCYM (2 xNZCYM, 50 pg/ml de Ampicilina) foram adicionados a cada mistura e incubados a cerca de 37° C durante 15 minutos. A solução de 4 ml resultante foi plaqueada em uma placa de NZCYM ágar grande contendo cerca de 50 pg/ml de Ampicilina e incubadas durante a noite a 37° C.

C. Colheita de Fago

Cada mistura de bactérias/fago foi cultivada durante a noite em uma placa de NZCYM ágar grande (seção 3B), depois do que elas foram raspadas em cerca de 35 ml de meio LB. A placa de ágar foi ainda enxaguada com 35 ml adicionais de meio LB. A mistura de bactérias/fago resultante em meio LB foi centrifugada para pelotizar as bactérias. Aproximadamente 50 ml do sobrenadante de fago foi depois transferida para um tubo frasco e cerca de

12,5 ml de solução de PEG (20 % PEG8000, 3,5 M de acetato de amônio) foi

adicionado e incubado em gelo durante 2 horas para precipitar o fago. O fago precipitado foi centrifugado e recolocado em suspensão em 6 ml de tampão de ressuspensão de fago (250 mM de NaCl, 100 mM de Tris pH 8, 1 mM de EDTA). Esta solução de fago foi ainda purificada centrifugando-se as bactérias remanescentes e precipitando o fago pela segunda vez adicionandose cerca de 1,5 ml da solução de PEG. Depois de uma etapa de centrifugação, a pelota de fago foi recolocada em suspensão em cerca de 400 μΐ de PBS.

Esta solução foi submetida a uma centrifugação final para livrar a solução de qualquer fragmento de bactérias remanescentes. A preparação de fago resultante foi titulada usando ensaios de formação de placa padrão.

4, Seleção e Amplificação Adicionais

Na segunda rodada, a preparação de fago amplificado (cerca

132 de IO¹⁰ pfu) da primeira rodada (seção 3C) foi usada como o fago de entrada para realizar as etapas de seleção e amplificação (seções 2 e 3). Para as eluições Ang-2 e TÍe-2, o fago de 10 nM e eluições não específicas foram combinados e amplificados para a terceira rodada de seleção. A preparação de fago amplificado (cerca de 10⁹ pfu) da 2^a rodada por sua vez foi usada como o fago de entrada para realizar a 3^a rodada de seleção e amplificação (seções 2 e 3). Depois das etapas de eluição (seções 2D, 2E e 2F) da 3^a rodada, uma fração pequena do fago eluído foi colocado em placa como no ensaio de formação de placa (seção 3C). As placas individuais foram coletadas e colocadas em placas de microtítulo de 96 reservatórios contendo 100 μΐ de I tampão TE em cada reservatório. Estas placas mestras foram incubadas a 4^o C durante a noite para permitir o fago de eluir no tampão TE.

5. Análise Clonal

Os clones de fago foram analisados pelo ELISA de fago e 15 seqüenciamento de DNA.

As seqüências foram classificadas com base nos resultados combinados destes dois ensaios.

A. ELISA de Fago

Uma cultura de XL-1 Blue MRT foi cultivada até que a OD_ó00|^0 atingiu cerca de 0,5. Cerca de trinta μΐ desta cultura foi aliquotada em cada reservatório de uma placa de microtítulo de 96 reservatórios. Cerca de 10 μΐ de fago eluído (seção 4) foram adicionados a cada reservatório e deixado infectar as bactérias durante cerca de 15 minutos na temperatura ambiente. Cerca de 100 μΐ de meio LB contendo aproximadamente 12,5 pg/ml de 25 tetraciclina e aproximadamente 50 pg/ml de ampicilina foram adicionados a cada reservatório. A placa de microtítulo foi depois incubada com agitação durante a noite a cerca de 37° C. A proteína Ang-2 recombinante (cerca de 1 pg/ml em PBS) foi deixada ligar-se às placas Maxisorp de 96 reservatórios (NUNC) durante a noite a cerca de 4^o C. Como um controle, a estreptavidina

133 pura foi revestida em uma placa Maxisorp separada a cerca de 2 pg/ml em PBS.

No dia seguinte, o líquido nas placas Maxisorp revestidas com proteína foi descartado e cada reservatório foi bloqueado com cerca de 300 μΐ 5 de solução a 5 % de leite a cerca de 4^o C durante a noite (altemativamente, 1 hora na temperatura ambiente). A solução de leite foi depois descartada e os reservatórios foram lavados três vezes com a solução de PBST. Depois da última etapa de lavagem, cerca de 50 μΐ de PBST-4 % de leite foram adicionados a cada reservatório das placas Maxisorp revestidas com proteína.

Cerca de 50 μΐ de culturas durante a noite de cada reservatório na placa de

I microtítulo de 96 reservatórios foi transferida para os reservatórios correspondentes das placas revestidas com Ang-2 assim como as placas revestidas com estreptavidina de controle. A mistura de 100 μΐ em cada tipo de placa foi incubada durante cerca de 1 hora na temperatura ambiente. O líquido foi descartado das placas Maxisorp e os reservatórios foram lavados cerca de três vezes com PBST. O anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) foi diluído a cerca de 1:7.500 e cerca de 100 μΐ da solução diluída foram adicionados a cada reservatório das placas Maxisorp durante uma incubação de aproximadamente 1 hora na temperatura |βθ ambiente. O líquido foi mais uma vez descartado e os reservatórios foram lavados cerca de cinco vezes com PBST. Cerca de 100 μΐ de substrato TMB (Sigma) foi depois adicionado a cada reservatório e a reação foi interrompida com cerca de 50 μΐ da solução 5 N de H2SO4. A OD₄₅₀ foi lida em um espectrofotômetro (Molecular Devices).

B. Seqüenciamento dos clones de fago

Para cada clone de fago, o padrão de seqüenciamento foi preparado usando a PCR. O seguinte par de oligonucleotídeos foi usado para amplificar um fragmento de aproximadamente 500 nucleotídeos: Iniciador 1: 5’-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3’ (SEQ ID NO:

134

54)

Iniciador 2: 5’-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3’ (SEQ ID NO:

55)

A seguinte mistura foi preparada para cada clone:

Reagentes	Volume (μΐ) / Tubo
dH₂O	26,25
Glicerol a 50 %	10
lOx Tampão de PCR (w/o MgCl₂)	5
25 mM MgCl₂	4
10 mM de mistura de dNTP	1
100 μΜ iniciador 1	0,25
100 μΜ iniciador 2	0,25
Taq polimerase	0,25
Fago em TE (seção 4)	3
Volume de reação final	50

Para a PCR, um termociclador (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) foi usado para rodar os seguintes programas: 94° C durante 5 minutos; (94° C durante 30 s, 55° C durante 30 s, 72° C durante 45 s) x 30 ciclos; 72° C durante 7 minutos; esfriar a 4^o C. O produto de PCR de cada reação foi purificado usando o kit de purificação de PCR de Reservatório Múltiplo QIAquick da Qiagen), seguindo o protocolo do fabricante. O produto de PCR purificado foi depois ensaiado rodando-se a cerca de 10 μΐ de cada mistura de reação de PCR com cerca de 1 μΐ de corante (10 x BBXS corante de carga em gel de agarose) em um gel de agarose a 1 %. O produto remanescente foi depois seqüenciado usando o Seqüenciador ABI 377 (Perkin Elmer) seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante.

6. Classificação de seqüência e determinação da seqüência de consenso

A. Classificação e análise de seqüência

As seqüências de peptídeo que foram traduzidas a partir de seqüências de nucleotídeo variáveis (seção 5B) foram correlacionadas com os dados de ELISA. Os clones que apresentaram uma OD₄₅o alta nos reservatórios revestidos com Ang-2 e uma OD450 baixa nos reservatórios revestidos com estreptavidina foram dados uma classificação prioritária mais

135 alta. Às seqüências que ocorreram múltiplas vezes também foi dada uma classificação prioritária alta. As seqüências candidatas foram escolhidas com base nestes critérios para outra análise como peptídeos ou pepticorpos.

B. Determinação da seqüência de consenso

Três classes diferentes de motivos de consenso foram gerados a partir da coleção TN8-IX como segue:

KRPCEEXWGGCXYX

KRPCEEXFGGCXYX

XXXCXDXYWYCXXX

XXXCXDXYTYCXXX

XXXCXDXFWYCXXX XXXCXDXFTYCXXX XXXCXWDPWTCEXM (SEQIDNO: 56) (SEQIDNO: 57)

(SEQIDNO: 61) (SEQIDNO: 62) (SEQIDNO: 63) (SEQ ID NO: 64) (SEQIDNO: 58)

Um motivo de consenso foi gerado a partir da coleção TN12-I:

WSXCAWFXGXXXXXCRRX (SEQ ID NO: 59)

Para todas as seqüências de motivo consenso, as “seqüências de aminoácido de núcleo” sublinhadas de cada seqüência de consenso foram obtidas determinando-se o aminoácido que ocorre mais frequentemente em

cada posição. “X” refere-se a qualquer aminoácido que ocorre naturalmente. As duas cisteínas adjacentes às seqüências de núcleo foram aminoácidos fixos nas coleções TN8-IX e TN12-I.

Os peptídeos identificados como ligação a Ang-2 são apresentados na Tabela 3 abaixo.

Tabela 3 - Peptídeos de Ligação de Ang-2

Peptídeo	SEQ ID NO:	Seqüência
TN8-8	1	KRPCEEMWGGCNYD
ΊΝ8-14	2	HQICKVVDPWTCKHW
TN8-Conl	3	KRPCEEEFGGCTYQ
TN8-Con4	4	QEECEVVDPWTCEHM
ΊΝ12-9	5	FDYCEGVEDPFIFGCDNH
LI	6	KFNPLDELEETLYEQFTFQQ
C17	7	QYGCDGFLYGCMIN

136 * Exemplo 4

Construção de Pepticorpos Que Codificam o DNA

Os peptídeos modificados selecionados como potencialmente inibidores para a ligação Ang-2:Tie-2 (ver Tabela 3) foram usados para 5 construir proteínas de fusão em que um monômero de cada peptideo ou um dímero em tandem de cada peptideo (com um ligador entre as unidades de monômero) foram fundidos na matriz ao DNA que codifica um ligador seguido pela região Fc da IgGl humana. Cada peptideo modificado foi construído pelo recozimento de pares de oligonucleotídeos (“oligos”) para 10 gerar um polinucleotídeo duplex que codifica o peptideo junto com um ligador compreendido, dependendo do peptideo, de cinco resíduos de glicina, oito resíduos de glicina ou um resíduo de lisina; estas construções foram geradas como fragmentos Ndéí a Xho\. Estas moléculas de polinucleotídeo duplex foram ligadas no vetor (pAMG21-Fc terminal N, descrito mais abaixo) 15 contendo o gene Fc humano, que foi previamente digerido com Ndet e ATzoI.

As misturas de ligação resultantes foram transformadas pela eletroporação nas células 2596 da cepa da E. coli (GM221, descrito mais abaixo) usando procedimentos padrão. Os clones foram triados quanto a capacidade para produzir o produto de proteína recombinante e para possuir a fusão de gene 0 tendo uma seqüência de nucleotideo correta. Um tal clone único foi selecionado para cada um dos peptídeos modificados (isto é, produtos de fusão de peptideo Fc).

Construção do Vetor de Terminal N pAMG21-Fc

PÁMG21

O plasmídeo de expressão pAMG21 (ATCC N~ 98113) é derivado do vetor de expressão pCFM1656 (ATCC N² 69576) e do sistema de vetor de expressão descrito na Patente dos Estados Unidos N² 4.710.473, seguindo-se o procedimento descrito no Pedido de Patente Internacional publicado WO 00/24782 (ver a porção o Exemplo 2 neste que se estende da

137 página 100 a 103, assim como as Figuras 17A e 17B).

Vetor de terminal N Fc

O vetor de terminal N Fc foi criado usando a cepa da E. coli

3788, o monômero pAMG21 Tpo_Gly5_Fc, como um padrão. A informação sobre a clonagem desta cepa pode ser encontrada na WO 00/24782 (Ver o Exemplo 2 e a Figura 10 neste). Um iniciador 5’PCR (descrito mais abaixo) foi planejado para remover a seqüência de peptídeo Tpo no pAMG Tpo Gly5 e substituí-la com um poliligador contendo os sítios ApaLI e Xhol. Usando a cepa 3788 como um padrão, a PCR foi realizada com Expand Long

Polimerase, usando o oligonucleotídeo da SEQ ID NO: 8, abaixo, como o iniciador 5’ e um iniciador 3’ universal, a SEQ ID NO: 9, abaixo. O produto de PCR resultante foi purificado em gel e digerido com enzimas de restrição Ndel e BsrGI. Tanto o plasmídeo quanto o polinucleotídeo que codificam o peptídeo de interesse junto com o seu ligador foram purificados em gel usando colunas giratórias de purificação em gel Qiagen (Chatsworth, CA). O plasmídeo e o inserto foram depois ligados usando procedimentos de ligação padrão e a mistura de ligação resultante foi transformada em células E. coli (cepa 2596). Os clones únicos foram selecionados e o seqüenciamento de DNA foi realizado. Um clone correto foi identificado e este foi usado como

Ξ20 uma fonte de vetor para os peptídeos modificados aqui descritos.

Iniciador 5’:

ACAAACAAACATATGGGTGCACAGAAAGCGGCCGCAAAAAAA

CTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACA (SEQ ID NO: 8)

Iniciador 3’:

GGTCATTACTGGACCGGATC (SEQ ID NO: 9)

Além de fabricar estes peptídeos modificados como fusões de terminal N ao Fc (pepticorpos de terminal N), alguns deles também foram fabricados como produtos de fusão de terminal C (pepticorpos de terminal C). O vetor usado para fabricar as fusões de terminal C é descrito abaixo.

138

Construção de vetor Fc de terminal C

O vetor Fc de terminal C para os peptideos modificados foi criado usando a cepa 3728 da E. coli, o monômero pAMG21 Fc-Gly5- Tpo, como um padrão. A informação sobre a clonagem desta cepa pode ser encontrada na WO 00/24782 (Ver o Exemplo 2 e a Figura 7 neste). Um iniciador de 3’ PCR (SEQ ID NO: 10) foi planejado para remover a seqüência de peptídeo Tpo e para substituí-la com um políligador contendo os sítios ApaLI e Xhol. Usando a cepa 3728 como um padrão, a PCR foi realizada com a Expand Long Polimerase usando um iniciador 5’ universal (SEQ ID NO: 11) e o iniciador 3’ anteriormente mencionado. O produto de PCR resultante foi purificado em gel e digerido com enzimas de restrição BsrGI e BamHI. Tanto o plasmídeo quanto o polinucleotídeo que codificam cada peptídeo de interesse com o seu ligador foram purificados em gel via colunas giratórias de purificação em gel da Qiagen. O plasmídeo e o inserto foram depois ligados usando procedimentos de ligação padrão e a mistura de ligação resultante foi transformada nas células da E. coli (cepa 2596). Os clones únicos foram selecionados e o seqüenciamento de DNA foi realizado. Um clone correto foi identificado e usado como uma fonte de vetor para os peptideos modificados aqui descritos.

Iniciador 5’:

CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG (SEQ ID NO: 10)

Iniciador 3*: TTTGTTGGATCCATTACTCGAGTTTTTTTGCGGCCGCTTTCTGTG CACCACCACCTCCACCTTTAC (SEQ ID NO: 11)

GM221 (#2596). Cepa hospedeira #2596, usada para expressar as proteínas de fusão Fc-peptídeo, é uma cepa K-12 da E. coli modificada para conter o promotor lux e tanto o repressor lambda sensível à temperatura cI857s7 na região ebg precoce quanto o repressor lacI^Q na região ebg tardia. A presença destes dois genes repressores permite o uso deste hospedeiro com

139 uma variedade de sistemas de expressão. A designação ATCC para esta cepa é202174.

Exemplo 5

Produção de Pepticorpos

Expressão na E. coli. As culturas de cada uma das construções de fusão pAMG21-Fc na E. coli GM221 foram cultivadas a 37° C em meio de Caldo Terrífico (Ver Tartof e Hobbs, “Improved media for growing plasmid and cosmid clones”, Bethesda Research Labs Focus, Volume 9, página 12, 1987, citado na referência anteriormente mencionada Sambrook et al.). A indução da expressão de produto de gene a partir do promotor luxPR foi obtida a seguir da adição do autoindutor sintético, N-(3-oxoexanoil)-DLhomosserina lactona, ao meio de cultura a uma concentração fmal de 20 nanogramas por mililitro (ng/ml). As culturas foram incubadas a 37° C por um adicional de seis horas. As culturas bacterianas foram depois examinadas pela mícroscopia quanto a presença de corpos de inclusão e coletados pela centrifugação. Corpos de inclusão refráteis foram observados em culturas induzidas, indicando que as fusões Fc foram mais provavelmente produzidas na fração insolúvel na E. coli. As pelotas de célula foram lisadas diretamente pela recolocação em suspensão em tampão de amostra de Laemmli contendo 10 % de β-mercaptoetanol e depois analisadas pela SDS-PAGE. Na maioria dos casos, uma faixa tingida com coomassie intensa do peso molecular apropriado foi observada em um gel de SDS-PAGE.

Purificação. As células foram quebradas em água (1/10) usando homogeneização de alta pressão (duas passadas a 14.000 PSI (96,6 MPa)) e os corpos de inclusão foram colhidos pela centrifugação (4000 RPM em uma centrífuga J-6B, por uma hora). Os corpos de inclusão foram solubilizados em guanidina 6 M, 50 mM de Tris, 10 mM de DTT, pH 8,5, durante uma hora a uma razão de 1/10. Para peptideos lineares fundidos a Fc, a mistura solubilizada foi diluída vinte e cinco vezes em uréia a 2 M, 50 mM

140 de Tris, 160 mM de arginina, 2 mM de cisteína, pH 8,5. A oxidação foi deixada processar durante dois dias a 4^o C, seguindo a formação do composto ligado a dissulfeto (isto é, homodímero Fc-peptídeo). Para os peptídeos cíclicos fundidos a Fc, este mesmo protocolo foi seguido com a adição das 5 seguintes três condições de dobra: (1) uréia 2 M, 50 mM de Tris, 160 mM de arginina, 4 mM de cisteína, 1 mM de cistamina, pH 8,5; (2) uréia 4 M, 20 % de glicerol, 50 mM de Tris, 160 mM de arginina, 2 mM de cisteína, pH 8,5; e (3) uréia 4 M, 20 % de glicerol, 50 mM de Tris, 160 mM de arginina, 4 mM de cisteína, 1 mM de cistamina, pH 8,5. A proteína redobrada foi dializada 10 contra uréia 1,5 M, 50 mM de NaCl, 50 mM de Tris, pH 9,0. O pH desta mistura foi diminuído para pH 5 com ácido acético. O precipitado foi removido pela centrifugação e o sobrenadante foi ajustado a um pH de 5 a

6,5, dependendo do ponto isoelétrico de cada produto de fusão. A proteína foi filtrada e carregada em VC sobre uma coluna HP de SP-Sepharose 15 equilibrada em 20 mM de NaAc, 50 mM de NaCl no pH determinado para cada construção. A proteína foi eluída usando um gradiente linear de 20 volumes da coluna no mesmo tampão variando de 50 mM de NaCl a 500 mM de NaCl. O pico foi reunido e filtrado.

Os pepticorpos gerados usando os procedimentos acima são ΞΞ0 apresentados na Tabela 4 abaixo.

141

Tabela 4

Pepticorpo	Seqüência de Pepticorpo
U(N)	MGAQKM^>WBLEBTLYEQFrFQQLEGGGGG-Fe (SEQ EDNO:12)
L1(N)WT	MKlWLDaEElLIEQHTQQLEGGGGG-Fc (SEQID NO: 13)
L1(N)1KWT	l^NPLDELEETLYEQFTFQQGSGSATGGSGSTASSGS GSATHLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO; 14)
2xLl (N)	MGAQKFNPLDELEETLYEQETFQQGGGGGGGGKFNPL DELEETLYEQFEFQQLEGGGGG-Fc (SEQ ID NO:15)
2xLl(N)WT	MrFNPLDELEETEYEQFlTQQGGGGGGGKFNPLDELEE TLYEQFPFQQLEGGGGGTc (SEQ ID NO: 16)
Gm4(N)	MGAQQEEÇEWPWTCEHMEEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 17)
Con4 (N) 1K-WT	mqsecbwdpwtcehmgsgsatggsgstassgsgsath LEGGGGG-Fc (SEQ ID NOtlS)
2xCon4(N)lK	MGAQQEECETOPWCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGS ATHQffiCSWDPWTCHHMLEGGGGG-R (SEQID NO:19)
U(C)	M-Fc-GGGCK1AQI<FN^tPLDELEETLYEQFTEQQLE (SEQ !DNQ:20) ,

142

LKQIK	M-Fcgggggaqgsgsatggsgstassgsgsathkfntldele EILYBQFTFQQLE (SEQ ID NO;21)
2xLl (Q	M-Fc- GGGGGAQKIWLDBLEETLYEQFTFQQGGGOGGGGKF NPLDELEETLYEQFTFQQEE (SEQ ID NO.22)
Con4(C)	M-Fé-GGGGGAQQEECEWDFWTCEHMLE (SBQJD NO:23)
Con4(QlK	M-Fc- GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDP WTCEHMLE (SEQIDNO:24)
2xCon4 (C) 1K	M-Fc- GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASS GSGSATHQEECWDPWCEHMLE (SEQ IDNO:25)
Coa4-Ll (N)	MGAQEECÍTOPWCSMGGGGGGGGKFNPLDELEBT LYEQFTFQQGSGSATGGSGSTASSGSGSÂTHEEGGGGGFc (SEQIDNO:26)
Con4-Ll (C)	Ní-Fc- ¹ GGGGGA-QGSGSATGGSGSTA.SSGSGSATHKFNPLDELE BTLYEQFTFQQGGGGGQEECBTOPWTCEHMEE (SEQ IDNG27)
TN-12-9 (N)	MGAQ-WYCEGVEDPFTFGCDNHLB-GGGGG-Fc (SEQ ID NO:28)
C17 (N)	MGAQ-QYGCDGFLYGBhNLE-GGGGG-Fc (SBQID NO:29)
TN8-8 (N)	MGAQ-KIiPCEEMWGGCNYDIEGGGGGFc (SEQID NO.GO)
TN8-14 (N)	MGAQ-HQICKWDPWTCKHWLEGGGGG-Fc (SEQID NO;31)
CoalíM)	MGAQ-KRPCEEITGGCTYQLEGGGGG-Fc (SEQID NO:32)

Na Tabela 4, “Fc” refere-se à seqüência Fc IgGl humana. A coluna dois apresenta a seqüência de aminoácido do pepticorpo. A sua porção Fc é rotulada “Fc” e é como apresentada na SEQ ID NO: 60 abaixo. Será avaliado que onde um rótulo é usado, por exemplo, “Con4” ou “Con-4”, este 5 refere-se ao peptídeo Con-4, ao passo que o uso do sufixo “C”, “(C)” ou “-C”;

ou “N”, “(N)” ou “-N” nelas indica que a molécula é um pepticorpo como

143 aqui descrito. Os sufixos “N”, “(N)” ou “-N” em um nome de pepticorpo indica que o peptídeo de ligação de Ang-2 (ou peptídeos) é/são de terminal N em relação ao domínio Fc e os sufixos “C”, “(C)” ou “-C” indicam que o peptídeo de ligação de Ang-2 (ou peptídeos) é/são de terminal C em relação 5 ao domínio Fc. Além disso, 2xCon4 (C) IK, como definido na SEQ ID NO:

25, também pode ser aludido sem o sufixo “1K” anexo.

A seqüência de aminoácido da porção Fc de cada pepticorpo é como segue (do término amino ao término carbóxí):

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV

SBEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVL

HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEYv’ESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVNH-IEALHNHYTQKSLS LSPGK(SEQ IDNO: 60)

A seqüência de DNA (SEQ ID NOs: 33 a 53) que codificam os pepticorpos correspondentes aos pepticorpos SEQ ID NOs: 12 a 32, respectivamente, na Tabela 4) é apresentada abaixo:

144

SEQIDNO: 33

ATGGGTGCACAGAAATTCAACCCGCTGGÀCGAACTGGAAGMACTCT GTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGG ACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG GACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGÁT CTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA

AGACCCTGAGGTCAAGTrCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGÀGGTGC ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCÁCGTAC CGTGTGGTCAGCGTCCrCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGC aaggagtacaagtgcaâggtctccaacaaagccctcccagcccccatc

GAGAAAACCÂTCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGT 1¾

GTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGGTGÁCCAAGAACCAGGTCAG CCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGA GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC CCGTGCTGGACTCCGACGGCrCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGT

GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAI’ GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC TCCGGGTAAATAATGGATCC

SEQ ID NO:34

ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAÁCTGGAAGAAACrCTGTACGAACA GTTCACTTrCCAGCAGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCA CACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACrCCTGGGGGGACCGTCAGT TTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGICACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGA

GGTCAAGTrCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA

GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTOTGGTCA

GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA

AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCGTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCA tctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctg CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC ctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagc aatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctgga

CTCCGACGGCTCCrfCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG

CAGGTGGCAGCAGGGGAACGirrrCTCATGCfCCGTGATGCATGAGGC

TCTGCACAÂCCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCfGTCTCCGGGTAA

ATAA

145

SEQID.N.O:35

ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACA GTTCAOTTCCAGCAGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTICCGGCTCC ACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCATCTCGAGGGTGGAGGC ggtggggacaaaactcacacatgtccaccttgcccagcacctgaactc ctggggggaccgtcagttttcctcttccccccaaaacccaaggacacc CTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG agccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgt ggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtàcaaca GCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGC tgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctccca GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCÀAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAA ccaggtcagcctgacctocctggtcaaaggcttctâtcccagcgacat cgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactâcaaga CCACCtCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCITCCTCTACAGCAA gctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcat gctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcc tctccctgtctccgggtaaataa

SEQ>NOj36

ATGGGTGCACAGAAATTCAACCCGCTGGACGAACrGGAAGAAACTCT

GTACGAACAGTTCACrrrCCAGCAGGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGG TAAGTTCAACCCACTGGATGAGCTGGAAGAGACTCTGTATGAACAGTT CACTTTCCAGCAACTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACA CATGTCCACCTBK^CAGCACÇTGAAOTXTGGGGGGACCGTCAGTTT TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC ctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgag GTCAAGTrCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATÀATGCCAAG acaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcag CGTCCTCACCGTCCI'GCACC/\GGACTGGCTGAATGGCAAGGAG1ACAA gtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccat ctccaaâgcoâàágggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgc ccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcc tggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagca ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCrGGAC tccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagc AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCrCATGíGCCGTGATGCATGAGGCT CrGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTOTCTCCGGGTAAA TAA

146

SEOIDNO:37

ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACA GTTCACTTTCCAGCAGGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAGTTCÁACCC ACTGGATGAGCTGGAAGAGACTCTGTATGAACAGTTCACTrTCCAGCA ACTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTT GCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAOTTTTCCTCTTCCCCCC AAAACCCAAGCIACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATG cgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactg GrACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAÀAGCCGCGGG AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCC TGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCC AACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAA agggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccggg ATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT TCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG GGGAACGTCrTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCrCTGCACAACCAC TACACGÇAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA

SEQ ID NO:38

ATGGGTGCACAGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGA ACACATGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTC CACCITGCCCAGCACCTGAACTíXIXjGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCIT CCCCGCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGT CAGATGaaTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT caactggtaçgtggaçggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagc cgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctc accgicctgcaccaggactogctoaatggcaaggagtácaagtgcaa GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA AGCCAAAGGGCAGCCCaJAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT

147

SEO1DNO.-39

ATGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACITGCGAACACATGGG AlGCGGTTCTGCTACrGGTGGTTCCGGCTCCACCGCÂAGCTCTGGTTCA GGCAGTGCGACTCATCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCA CACATGTCCACC1TGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGT TTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAlGATCTCCCGGACO cctoaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctga GGTCAAGTTCAAÇTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA gacáaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtca GCGTCCrCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCrGAATGGCAAGGAGTACA agtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaacca tctccaaagccaaagggcagccccgagáaccacaggtgtacaccctg cccccatcccgggatgagctgaccaagaaccággtcagcctgacctgc CTGGTCAAAGGCITCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA ctccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagag CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGC TCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCÇCTGTCTCCGGGTAA ATAA

SBQmiSM

ATGGGTGCACAGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACITGCGA acacatgggatccggttctgctactggtggttccggctccaccgcaag ctctggttcaggcagtgcgactcatcaggaàgaatgcgaatgggaccc ATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAA CTCACACATGTCCAíXnTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT CAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCG gaccccígaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagacc ctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggággtgcataatg CCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTG GTGAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAG

148

SE0IDN0;41

ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTrGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGCKKJACCGTCAGTTTrCCrCTTCCCCCCAAAACCXAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA

GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCrGACCAAGAACCA GGTCAGCCTGACCTGCCrGGTCAAAGGCTTCrATCCCAGCGACATCGC CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA CGCCrCJCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGrCirCTOAlOCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC CCTOTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGAAATTCAACCC GCTGGACGAGCTGGAAGAGACTCTGTACGAACAGTTTACTTTTCAACA GCTCGAGTAA

SEO1DNOI42

ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCrTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTTTrCCTCITCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGIUAGATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCrGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC CCCATCGAGÁAAACCATCTCCAÂAGCCAAAGGGCAGCCCCGÂGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCrGACCAÁGAÁCCA GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGÇAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA

149 ,SEOID>);43

ATOGACAAAACTCACACATGTCCACCTTG(XCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTÇCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGAa^CCTGAGGTCACATGCGTGGIGGTGGAÇGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA

GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA

CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGÁGAACC ÁCAGGTGTACACCCTGCCCCCATCXCGGGATGAGCrGACCAAGAACCA GGTCAGCCTGACCTQCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA

CGCCTCCCGTGCTGGAGrCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTJGTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGAAATTCAACCC GCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTrCCAGCA GGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAGTTCÁACCCACTGGATGAGCT

GGAAGAGACTCTGTATGAACAGTTCACTrrCCAGCAACTCGAGTAA

SEQJD.N0A1

ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG

GGGGGACCGTCAGTTITIXTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC

ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGÁCGTGAGC cacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggaçggcgtgga GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCC3CGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA atggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc cccatcgagâaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaacc ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC

CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA

CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCITCTrCCTCTACAGCAAGCr CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCfCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCClüTC CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGCAGGAAGAAT GCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGTAA

150

SEOIDNO:45

ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC atgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagc CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTrCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGÂGCAGTACAACAGCA cgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctga ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCrCCAAÇAAAGCCCTCCCAGCC CCCATCGAGAAAACGATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCXCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA ggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatggc cgtggagtgggagagcaâtgggcagccggagaacaactacaagacca CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTrCrTCCTCTACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCAC/VACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGTTC rGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTICAGGCAGTGC GACTCATCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACA TGCTCGAGTAA

SEQ!ANO:46

ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACrCCTG GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGÂTCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA cgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctga ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC cccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagcccçgagáacc ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA ggtcagcctgacgtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgc CCGGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTfCTTCCTCTACAGC/VAGCT caccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctc cgtgatgcatgaggctctgcácaaccactacacgcagaagagcctctc cctgtctccgggtaaaggtggaggtggiggtgcacagcaggaagaat GCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGGGATCCGGTTCTGCrA CTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCrCTGGTrCAGGCAGCGCGACTC ATCÀGGAAGAATGCGAÂTGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTC GAGTAA

151

SgQID HQ147

ATGGGTGCACAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACA CArGGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAATTCAACCCGCTGGACGA ACTGGAAGAAACrCTGTACGAACAGTTCACTTTCCÂGCAGGGATCCGG TTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTrCAGGCAGT GCGACTCATCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGgGACAAAACTCACACATGT CCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCr 'lUCCCCCAAAACCCAAGGÁCACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG TCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGÀGGTGCATAATGCCAAGACAAAG CCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAÁGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA AGCCAAAGGGCAGC/CCCGAGAAGCACACtGTGTACACCCTGCCCCCAT CCCGGGATGAGarGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAGCTGCCTGGTCA aaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggg cagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgac GGCTCCTrCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG €JAGCAGGGGAAC'GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA

SEOH>NO:48

ATGGÂCAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTrriCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCQTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCrGA atggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcc CCCATCGAGAÁAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC acaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaacca GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCrATCCCAGÇGACATCGC cgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacàactacaagacca CGCCTCCJCGTGCrGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT caccgtggacaagagcaggtggcagcâggggaacgtcttcicatgctc CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACrACACGCAGAAGAGCCTCTC CCJrGTCTCXGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGTTC tgctactggtggttccggcigcaccgcaagctctggttcaggcagtgc GACTCATAAATTCAACCCGCIGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGA ACAGTrCACTTTCCAGCAGGGTGGTGGCGGTGGTCAGGAAGAATGCGA ATGGGACCCATOGACTTGCGAACACATGCTCGAGTAA

152

SEOIDNO:49

ATGGGTGCACAGTTCGACTACTGCGAAGGTGTTGAAGACCCGTTCACT TTCGGTTGCGACAACCACCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAàC TCACACATGTCCÂCCTTGCCCAGCÁCCTGAACTCCTGGGGGGACCGTC AGTnTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT GzXGGrCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACâAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGT CAGCGTCCTCACCGTCCrGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTA CAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAAC CATCrCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCC TGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGIUAGCOTGACCT GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA gcaatgggcagccggagáacaactacaágaccacgcctcccgtgctg gactccgacggctccttcttcctctâcagcaagctcaccgtggacaag agcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag GCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCrCCCTGTCTCCGGGT AAATAA

AIGGGTGCACAGCAGTACGGTTGCGACGGTTTTCTGTACGGTTGCATG ATCAACCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCAC/YCATGTCC ACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTrC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC AACTGGTACGTGGACGGGGTGGAGGTGÇATAATGCCAAGACAAAGCC GCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCGTCA ccgtcctgcáccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaag GTCTCCAACAAAGCCCrCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCÀAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC CGGGATGAGCTGACCAAGAÁCCAGGTCAGCCTGACCTOCCrGGTCAA AGGCrrcTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC ggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagâgcaggtgg CAGGAGGGGAACGTCTrCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCICCCTGTCTCCGGGTAAATAA

153

ATGGGTGCACAGAAACGCCCATGCGAAGAAATGTGGGGTGGTTGCAA CTACGACCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTC CACCTI'GCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCG^frCAGn.TrCCTCTT CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCrCCCGGACCCCTGAGGT cacatgcgtggtggtggacgtoagccacgaagaccctgaggtcaagtt caactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagc cgggggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctc accgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaa ggtctccaacaaagccctcccagcxicccatcgagaaaaccatctccaa agccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacacgctgcccccat CCCGGGATGAGCTGACCAÂGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCrGGTCA aaggcttctátcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggg cagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgac GGCTCCTTCTTCCrCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTTCrCATGCTCCGTGATGCATGAGGCrCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA

SEQJPJ4O;52

ÁTGGGTGCACAGCACCAGATCTGCAÂATGGGACCCGTGGACCTGCAA ACACTGGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTC CACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTITCCTCTT CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGT CACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACOTACCGIOTGGTCAGGGTCCTC ACCGrTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA agccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccat CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG cagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctogactccgac ggctccitcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtgg cagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcac aaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaataa

SEOJDNO:53

ATGGGTGCACAGAAACGTCCATGCGAAGAAATCrTCGGTGGTTGCACC TACCAGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCC ACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGT1TTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagcc GCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCA CCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCrGCCCCCATCC cgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaa aggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggc agccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgac GGCTCCTTCTrcCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG CAGCAGGGGAACGTCTTCrcATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA

154

Exemplo 6

Ensaios de Pepticorpo

Catorze dos pepticorpos foram testados usando o ELISA de neutralização e três dos pepticorpos foram testados usando o ELISA de 5 afinidade. Os resultados estão apresentados na Tabela 5.

Tabela 5

	hAng-2	mAng-2	hAng-1
Pepticorpo	IC 50 (nM)	EC 50 (nM)	IC 50 (nM)	EC 50 (nM)	IC 50 (nM)	EC 50 (nM)
2xCon4 (C) 1K	0,04		0,02
Con4-Ll (C)	0,05		0,04
Con4 (C)	0,20		0,30
2 xLl (N)	0,65 .		0,80
Con4(N)	0,85	0,03	0,72	0,07	Nenhuma Inibição	Nenhuma Ligação
2 xLl (C)	0,90		1,0
Con4 (N) 1K-WT			1,9
LI (N)	6		11		Nenhuma Inibição
C17(N)	9		13		Nenhuma Inibição
12-9 (N)	21		7,7		Nenhuma Inibição
Conl (N)	26		-200		Nenhuma Inibição
8-14 (N)	45		33		Nenhuma Inibição
LI (C)	65		37
8-8 (N)	80		-700		No Inibição
Pepticorpo de controle negativo 4883	Nenhuma Inibição	Nenhuma Ligação	Nenhuma Inibição	Nenhuma Ligação	Nenhuma Inibição	Nenhuma Ligação

A seqüência de aminoácido de pepticorpo de controle negativo

4883 é como segue (a porção Fc está sublinhada, o ligador é “GGGGG” e a porção peptídica está em negrito):

MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD

VSBEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVL

HODY&NGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISKAKGQPREPOVYTLPPS

RDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEVzESNGOPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLYSKLTVDKSRWOQGNVFSCSVNIHEALHNHYTQKSLSLS

155

PGK-GGGGG-CTAGYHWNSDCECCRRN (SEQ ID NO: 243)

Será avaliado que o uso do termo “Nenhuma Inibição” aqui não é intencionado a indicar que os compostos não tenham qualidades ínibidoras. Ao invés, “Nenhuma Inibição” como aqui usado refere-se àqueles compostos que quando testados usando o ensaio de ELISA de neutralização sob as condições aqui descritas exibiram um valor IC₅o maior do que 1000 nM, que foi a concentração mais alta na qual estes compostos foram triados. Embora qualidades ínibidoras signifícantes não renham sido observadas para as moléculas rotuladas como não exibindo “nenhuma inibição”, será avaliado que estas moléculas podem de fato demonstrar qualidades Ínibidoras sob condições de ensaio diferentes ou em ensaios diferentes. Em uma forma de realização preferida, será avaliado que a invenção diz respeito a pepticorpos que têm qualidades ínibidoras usando os ensaios aqui descritos.

Dois dos pepticorpos foram testados usando o ensaio de afinidade BIAcore (como descrito no Exemplo 21). Os resultados são apresentados na Tabela 6 abaixo.

Tabela 6

Afinidades de Pepticorpo (Pb) para hAng-2 e mAng-2

	hAng-2		mAng-2
Pepticorpo	K_D(nM)	ka(l/Ms)	k_d(l/s)	K_D(nM)	k_a(l/Ms)	k_d (1/s)
Pb LI (N) .	3,1	2,9 x 10⁵	9,1 x 10'⁴	0,42	5,6 x 10⁵	2,3 x 10’⁴
Con4(N)	0,67	3,3 xl0^b	2,2 x 10^-4	0,60	7,3 x 10^s	4,4 x IO^-4
TN12-9 (N)	8,2	1,2 x 105	1,0 x IO'³	0,32	7,2 xlO⁵	2,3 x1o^-4

Exemplo 7

Estudos de Eficácia Terapêutica Com Pepticorpo Ang-2 Sístemicamente Administrado

O pepticorpo Ang-2, TN8-Con4-C, foi subcutaneamente administrado a camundongos que carregam o tumor A431 em um programa de uma vez ao dia 72 horas depois da inoculação do tumor. As doses de pepticorpo usadas foram 1000, 200, 40 e 8 pg/camundongo/dia. Um total de 20 doses foi dado a todos os animais. Os volumes de tumor e os pesos

156 corpóreos foram registrados três vezes/semana. No final do estudo, os animais foram sacrificados e o seu soro foi coletado para medir os níveis de pepticorpo pelo ELISA. Os tumores e um painel de tecidos normais foram coletados de todos os grupos.

Os resultados são mostrados na Figura 1. Como pode ser observado, diferenças signifícantes no crescimento do tumor foram observadas entre o grupo tratado com o pepticorpo Ang-2 e o de controle de veículo. Todas as quatro doses de pepticorpo Ang-2 inibiu o crescimento do tumor quando comparado çom os controles de veículo (p < 0,0001 vs. controle de veículo usando medida repetida ANOVA). Ao contrário, os tumores no grupo de controle continuaram a crescer em uma taxa muito maior. O tratamento com este pepticorpo não teve nenhum efeito significante nos peso corpóreos terminais, os peso de órgãos ou os parâmetros de hematologia dos animais tratados nas doses acima.

Exemplo 8

1. Construção de Coleções de Peptideo Secundário de Ang-2

A. Células E. coli Eletrocompetentes

Células competentes em eletroporação Epicurian Coli® XL1Blue MRF (Stratagene #200158) foram adquiridas da Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA).

B. Modificação do Vetor pCESl

A PCR foi realizada usando Extend Long Template PCR Systems (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN) com 1 pg de vetor pCESl (TargetQuest Inc.) como um padrão. O volume da mistura de PCR foi 100 μΐ que conteve 1 x tampão de PCR, 200 nM de cada um dos dois iniciadores: 5’-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3’ (SEQ ID NO: 244) e 5’GGTGGTGCGGCCGCACTCGAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCA-3’ (SEQ ID NO: 245), 200 nM de dNTP e 3 unidades (U) de Tag DNA

157 polimerase. O sistema de PCR TRIO-Thermoblock (Biometra) foi conduzido como segue: 94° C durante 5 minutos; 30 ciclos de 94° C durante 30 segundos, 50° C durante 30 segundos, 72° C durante 45 segundos; e 72° C durante 10 minutos; esfriado a 4^o C.

Os produtos de PCR foram depois conduzidos em um gel de agarose a 1 % e purificados com Coluna Giratória QIAGEN da QIAGEN Inc., Valencia, CA) de acordo com os protocolos do fabricante. Uma segunda reação de PCR foi realizada com 5 μΐ de produtos de PCR e 200 nM de cada um dos dois iniciadores 5’-CAAACGAATGGATCCTC 10 ATTAAAGCCAGA-3’ (SEQ ID NO: 246) e 5’AACACAAAAGTGCACA GGGTGGAGGTGGTGGTGCGGCCGCACT-3’ (SEQ ID NO: 247) sob as mesmas condições de PCR como descrito acima.

Os produtos de PCR e o vetor pCES 1 original foram depois separadamente digeridos em uma reação de 100 μΐ contendo 1 x tampão 15 NEB2, 60 U de ApaLI (New England Biolabs, Beverly, MA), 60 U de BamHI (New England Biolabs) a 37° C durante 1 hora. O DNA digerido foi depois purificado usando uma coluna giratória QIAGEN e ligado junto em uma reação de 40 μΐ contendo 1 x tampão de ligação e 40 U de T4 DNA ligase (New England Biolabs) na temperatura ambiente durante a noite.

=:0 Os vetores foram transfectados na E. coli e incubadas a 37° C durante a noite. As colônias únicas isoladas foram selecionadas e o plasmídeo foi depois purificado usando uma Coluna giratória QIAGEN. O ínserto correto foi confirmado pelo seqüencíamento de DNA.

C. Preparação de DNA Vetorial

Um micrograma de DNA vetorial pCESl modificado (da seção 1B acima) foi transformado em 40 μΐ de E. coli XLl-blue eletrocompetente (da seção IA acima) usando o Gene Pulser II (BIO-RAD, Hercules, CA) ajustado a 2500 V, 25 pF e 200 ohms. A amostra de bactérias transformadas foi depois imediatamente transferida em um tubo contendo 960

158 μΐ de SOC (2 % de triptona, 0,5 % de extrato de levedura, 10 mM de NaCl,

2,5 mM de KC1, 20 mM de glicose, 10 mM de MgSO₄, 10 mM de MgCl₂) e a cultura foi deixada desenvolver a 37° C com agitação durante 1 hora.

As células foram depois espalhadas sobre a placa de 2 xYTAGT (2 xYT com 100 pg/ml de ampicilina, 12,5 pg/ml de tetraciclina e 2 % de glicose) e incubadas a 37° C durante a noite. Uma colônia única foi confirmada pelo seqüenciamento e usada para inocular 2 litros de meio 2 xYTAGT a 37° C com agitação durante a noite. O DNA vetorial plasmídico foi purificado com o Kit QIAGEN Plasmid Maxi de acordo com os protocolos do fabricante.

D. Digestão de DNA Vetorial

Total de cerca de 2000 microgramas de DNA Vetorial (da seção IC acima) foi digerido em 5000 μΐ de reação contendo lx tampão ΝΈΒ 2, 300 U de ApaLI e 300 U de Xhol a 37° C durante a noite. A reação de digestão de restrição foi incubada durante a noite a 37° C e analisada em um gel de agarose a 0,8 % pré fabricado (Embi Tec, San Diego, CA). O DNA vetorial linearizado foi depois excisado do gel e extraído com o Kit de Extração em Gel QIAquick (QIAGEN Inc.) de acordo com as diretrizes do fabricante.

E. Preparação de Oligonucleotideos de Coleção

Seis oligonucleotideos de coleção (1 fixo e 5 dopados) foram planejados com base nas seqüências que derivaram dos resultados descritos acima. O oligonucleotideo de coleção fixa foi: 5’-CACAGTGCACAGGGTNNYNNKNNKNNKNNKNNKNNYS ARTGGGATCCGTGGASCNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKCATT CTCTCGAGATCA-3’ (número de coleção 20) (SEQ ID NO: 248);

e dois dos oligonucleotideos de coleção dopados a 70 % foram como segue:

5’-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKaaKcgKccKNNKga

159

KgaKatKttKc,gKggKNNKacKtaKcaKNNKNNKNNKCATTCTC TCGAGATCA-3’ (número de coleção 27); (SEQ ID NO: 249); 5’-CACAGTGCACAGGGTNNKaaKttKaaKccKctKgaKgaKctKgaKga KacKctKtaKgaKcaKttKacKttKcaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA3’ (número de coleção 99); (SEQ ID NO: 250);

As letras minúsculas representam uma mistura de 70 % das bases indicadas e 10 % de cada um dos outros três nucleotídeos). Os outros três dos oligonucleotídeos de coleção dopados a 91 % foram como segue: 5’-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKcaKgaKgaKTGCgaKtg KgaKccKtgKacKTGCgaKcaKatKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGA TC A-3’ (número de coleção 94); (SEQ ID NO: 251); 5’-CACAGTGCACAGGGTNN-KttKgaKtaKNNKgaKggKgtKgaKgaKcc KttKacKttKggKNNKgaKaaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3 ’ (número de coleção 25); (SEQ ED NO: 252);

e 5’-CACAGTGCACAGGGTNNKaaKttKaaKccKctKgaKgaKctKgaKga KacKctKtaKgaKcaKttKacKttKcaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3’ (número de coleção 26); (SEQ ID NO: 253);

Para os oligos acima, aqueles habilitados na técnica avaliarão que “N” indica que cada um dos quatro nucleotídeos (A, T, C e G) são igualmente representados durante a síntese de oligo e “K” indica que os nucleotídeos G e T foram igualmente representados durante a síntese de oligo. As letras minúsculas representam uma mistura de 91 % das bases indicadas e 3% de cada um dos outros três nucleotídeos. Cada um destes oligonucleotídeos foi usado como padrão na PCR.

O kit Expand High Fidelity PCR System (Roche Diagnostics Corp.) foi usado para as reações de PCR. Cada coleção oligo foi amplificada em uma reação de PCR de 50 μΐ de noventa e seis reservatórios que conteve 1 nM de um oligonucleotídeo de coleção, IX tampão de PCR, 300 nM de cada 'Π

160 um dos iniciadores:

5'-CAC/\GTGCACAGGGT-3’ (SEQ ID NO: 254);

e

5’-TGATCTCGAGAGAATG-3’, (SEQ ID NO: 255);

200 μΜ de dNTP, 1,5 mM de MgCl₂ e 350 U da Expand polimerase. O termociclador (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) foi usado para conduzir o seguinte programa: 94° C durante 5 minutos; 25 ciclos de (94° C durante 30 segundos, 52,5° C durante 60 segundos, 72° C durante 30 segundos); 72° C durante 10 minutos; esfriar a 4^o

C. Os nucleotídeos livres foram depois removidos usando o kit de Purificação de PCR QIAquick da QIAGEN Inc. Cat # 28104) de acordo com os protocolos do fabricante.

F. Digestão de Oligonucleotídeos de Coleção

Para cada coleção os produtos de PCR (seção 1E) foram digeridos em uma reação de 1200 μΐ que conteve 1 x tampão NEB 2, 750 U de ApaLI e 750 U de Xhol a 37° C durante a noite. O DNA digerido foi separado em um gel de agarose a 3 % pré fabricado (Embi Tec). A faixa de DNA de interesse de cada reação foi cortado do gel e extraído com filtro de tubo de centrífuga COSTAR Spín-X, 0,22 pm de acetato de celulose (Coming Inc., Cat #8160).

G. Ligação de Vetor com Oligonucleotídeos de Coleção

A reação de ligação de 450 μΐ conteve o vetor linearizado (seção ID) e cada produto de PCR de coleção digerido (seção 1F) n relação molar de 1:5, lx tampão de ligação NEB e 20.000 U da T4 DNA ligase a 16° C durante a noite. Os produtos ligados foram incubados a 65° C durante 20 minutos para inativar a T4 DNA ligase e mais incubados com 100 U de Notl a 37° C durante 2 horas para minimizar a auto-ligação do vetor. Os produtos ligados foram depois purificados por uma extração com fenol/clorofórmio padrão (Molecular Cloníng: A Laboratory Manual, Maniatis et al., 3^a Edição,

172

161

Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000) e recolocados em suspensão em 120 μΐ de H₂O.

H. Transformação por Eletroporação

Para cada coleção, doze reações de eletroporação foram realizadas. Para cada transformação, 10 μΐ do DNA vetorial ligado (seção 1G) e 300 μΐ de células XL1-BLUE MRF’ (seção IA) foram misturadas em uma cubeta de 0,2 cm (BIO-RAD). A mistura resultante foi pulsada pelo Gene Pulser II ajustando a 2500 V, 25 uF e 200 ohms. As bactérias transformadas das doze reações de eletroporação foram depois combinadas e transferidas em um frascos contendo 26 ml de SOC para incubação a 37° C durante 1 hora. As células foram adicionadas a 450 ml de 2 xYTAG e cultivadas a 37° C com agitação durante 5 horas. As células foram centrifugadas a 4000 rpm durante 15 minutos a 4^o C. As pelotas de célula foram depois recolocadas em suspensão em 12 ml de glicerol a 15 % /2 xYT e armazenadas a -80° C. Este foi o estoque primário das coleções. Os títulos mostraram tamanhos de coleção de 5,0 x 10⁹ (número de coleção 20), 3,3 x 10¹⁰ (número de coleção 94), 4,7 x 10⁹ (número de coleção 25), 5,0 x 10⁹ (número de coleção 26), 3,6 x 10⁹ (número de coleção 27) e 4,2 x 10⁹ (número de coleção 99) transformantes independentes.

2. Amplificação das Coleções A. Fabricação do Estoque Secundário das Coleções

A partir do estoque de células da coleção primária (da seção 1H acima), células suficientes para cobrir um excesso de 10X de cada tamanho de coleção foram usadas para inocular o meio de 2 xYTAGT (2YT com 100 pg/ml de ampicilina, 12,5 pg/ml de tetraciclina e 2 % de glicose) de modo que a ODôoo de partida fosse de 0,1. As culturas foram deixadas desenvolver a 37° C com agitação durante várias horas até a ODgoo ⁼ 0,5. Um alíquota de um décimo de cada coleção foí coletada e cultivada em frascos separados durante mais duas horas a 37° C. Estas sub-culturas foram depois

162 centrifugadas a 4000 rpm usando um rotor Beckman JA-14 durante 10 minutos a 4^o C e as pelotas de bactérias recolocadas em suspensão em 7,0 ml (para cada coleção) de glicerol a 15 % /2 xYT para armazenagem a -80° C.

B. Indução de Fago

Biotech) foram adicionadas às culturas bacterianas remanescentes a ODgoo: 0,5 (da Seção 2A acima) até a concentração final de 3 x 10⁹ pfu/ml. O fago auxiliar foi deixado infectar bactérias a 37° C durante 30 minutos sem agitação e 30 minutos com agitação lenta. As células infectadas foram centrifugadas com 5000 rpm durante 15 minutos a 4^o C. As pelotas de célula foram recolocadas em suspensão no mesmo volume (da seção 2A acima) com o meio 2 χΥΤΑΚ (2YT com 100 pg/ml de ampicilina e 40 pg/ml de canamicina). A produção de fagomídeo foi deixada ocorrer a 30° C durante a noite com agitação.

C. Colheita de Fago

As culturas de bactérias da seção 2B acima foram centrifugadas a 5000 rpm durante 15 minutos a 4^o C. Os sobrenadantes foram depois transferidos em novas garrafas e 0,2 volume de PEG a 20 % /NaCl 2,5 M foram adicionados e incubados em gelo durante 1 hora para precipitar os =30 fagomídeos. Os fagomídeos precipitados foram centrifugados a 10.000 rpm durante 30 minutos a 4^o C e cuidadosamente recolocados em suspensão com 100 ml de PBS frio. A solução de fagomídeo foi ainda purificada centrifugando-se as células remanescentes com 4000 rpm durante 10 minutos a 4^o C e precipitando os fagomídeos adicionando-se 0,2 volume de PEG a 20 25 % /NaCl a 2,5 M. Os fagomídeos foram centrifugados a 10.000 rpm durante minutos a 4^o C e as pelotas de fagomídeo recolocadas em suspensão com ml de PBS frio. Seis ml de solução de glicerol a 60 % foram adicionados à solução de fagomídeo para armazenagem a -80° C. Os títulos de fagomídeo foram determinados por um procedimento padrão (Molecular Cloning,

163

Maniatis et al 3^a Edição).

3. Seleção de Fago de Ligação de Ang-2

A. Imobilizaçao de Ang-2 em Pérolas Magnéticas

A Ang-2 biotinilada (da seção 3A acima) foi imobilizada na

Dynabead M-280 Estreptavidina (DYNAL, Lake Success, NY) a uma concentração de 2000 ng de proteína Ang-2 por 100 μΐ do estoque de pérola do fabricante. Depois de retirar as pérolas para um lado de um tubo usando um imã e pipetando o líquido, as pérolas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e recolocadas em suspensão em

PBS. A proteína Ang-2 biotinilada foi adicionada às pérolas lavadas na concentração acima e incubadas com rotação durante 1 hora na temperatura ambiente. As pérolas revestidas com Ang-2 foram depois bloqueadas adicionando-se BSA a uma concentração final de 2 % e incubando durante a noite a 4^o C com rotação. As pérolas revestidas com Ang-2 resultantes foram depois lavadas duas vezes com PBST (PBS com 0,05 % de Tween20) antes de serem submetidas aos procedimentos de seleção.

B. Seleção Usando as Pérolas revestidas com Ang-2

Cerca de 1000 vezes o equivalente de coleção de fagomídeos (da seção 2C acima) foram bloqueados durante um hora com 1 ml de PBS Ξ20 contendo 2 % de BSA. A amostra de fagomídeo bloqueada foi submetida a três etapas de seleção negativa adicionando-a às pérolas em branco (mesmas pérolas como a seção 3A mas sem nenhum revestimento de proteína Ang-2) e esta mistura foi incubada na temperatura ambiente durante 15 minutos com rotação. O sobrenadante contendo fagomídeo foi puxado usando um imã e 25 transferido para um segundo tubo contendo pérolas em branco (as mesmas pérolas como descritas na seção 3A acima mas sem o revestimento da proteína Ang-2 sobre elas) e esta mistura incubada na temperatura ambiente durante 15 minutos com rotação.

O procedimento foi repetido. O sobrenadante contendo

164 fagomídeo foi depois puxado usando imã e transferido para um novo tubo contendo pérolas revestidas com a proteína Ang-2 (da seção 3A) e a mistura foi incubada na temperatura ambiente durante 1 hora com rotação. Depois o sobrenadante foi descartado, as pérolas ligadas ao fagomídeo foram lavadas 10 vezes com 2 % leite-PBS; 10 vezes com 2 % BSA-PBS; 10 vezes com PBST e duas vezes com PBS. Os fagomídeos foram depois deixados eluir em 1 ml de solução a 100 mM de trietilamina (Sigma, St. Louis, MO) durante 10 minutos em um girador. O pH da solução contendo o fagomídeo foi neutralizado adicionando-se 0,5 ml de Tris-HCl 1 M (pH 7,5). Os fagomídeos resultantes foram usados para infectar 10 ml de bactérias YCU-Blue N4RF’ recém cultivadas (OD₆₀o de cerca de 0,5) a 37° C durante 30 minutos sem agitar e 30 minutos com agitação lenta. Todas as células XL1-BLUE N4RF’ infectadas foram depois colocadas em placa em uma placa de 2 xYTAG de 15 x 15 cm e incubadas a 30° C durante a noite.

C. Indução e Colheita de Fago

Uma alíquota de 10 ml de meio 2 xYTAGT foi adicionada à placa (da seção 3B) para recolocar em suspensão as células XL1-BLUE NMF’. Todas as células XL1-BLUE N4RF’ foram coletadas em um tubo e uma alíquota de 250 μΐ destas células foi adicionada a 25 ml de 2 xYTAGT e cultivadas a 37° C até OD₆oo - 0,5. O fago auxiliar M13KO7 foi adicionado a uma concentração final de 3 x 10⁹ cfu/ml e incubado a 37° C durante 30 minutos sem agitar e 30 minutos com agitação lenta. As células foram centrifugadas com 5000 rpm durante 10 minutos a 4^o C e recolocadas em suspensão com 25 ml de 2 xYTAK. Estas bactérias foram deixadas desenvolver a 30° C durante a noite com agitação. Os fagomídeos induzidos foram colhidos e purificados como na seção 2C.

D. Segunda Rodada de Seleção

A segunda rodada de seleção foi realizada como esboçado na seção 3B a 3C exceto para os seguintes. Cerca de 100 vezes equivalentes de

165 coleção de fagomídeos resultantes da seção 3C foram usados como o fagomídeo de entrada. A quantidade de proteína Ang-2 biotinilada (seção 3 A) revestida sobre a Dynabead M-280 Estreptavidina foi diminuída para 20 ng. As pérolas ligadas a fago foram depois lavadas 10 vezes com 2 % de leite-PBS; 10 vezes com 2 % de BSA-PBS; 10 vezes com PBST, onde a lavagem final envolveu incubação de 60 minutos na temperatura ambiente em PB ST. As pérolas foram lavadas duas vezes com PBS. As condições de eluição foram as mesmas como a primeira rodada (seção 3B).

E. Terceira Rodada de Seleção

A terceira rodada de seleção foi realizada como esboçado na seção 3B a 3C acima exceto os seguintes. Cerca de 10 vezes equivalentes de coleção de fagomídeos resultantes da seção 3D foram usados como o fagomídeo de entrada. Cerca de 2 ng de proteína Ang-2 biotinilada (da seção 3 A) foi usado para revestir sobre a Dynabead M-280 Estreptavidina. As pérolas ligadas a fago foram lavadas 10 vezes com 2 % leite-PBS; 10 vezes com 2 % BSA-PBS; 10 vezes com PBST, onde a lavagem final envolveu incubação de 60 minutos na temperatura ambiente em PBST. As pérolas foram lavadas duas vezes com PBS. As condições de eluição foram as mesma como a primeiro rodada (seção 3B).

F. Quarta Rodada de Seleção

A quarta rodada de seleção foi realizada como esboçado na seção 3B a 3C acima exceto para os seguintes. Fagomídeos equivalentes de coleção resultantes da seção 3E foram usados como o fagomídeo de entrada. A quantidade de proteína Ang-2 biotinilada (seção 3A) revestida sobre a Dynabead M-280 Estreptavidina foi diminuída para 0,4 ng para as coleções 25, 26 e 27. Para as coleções 20 e 94, a quantidade de revestimento foi mantida como a terceira rodada a 2 ng. A coleção 99 não foi realizada para a etapa de seleção da quarta rodada. As condições de eluição foram as mesma como na primeira rodada (seção 3B).

166

4. ANÁLISE CLONAL

A. Preparação de Placa Mestra

Colônias únicas da seleção da segunda rodada foram coletadas e inoculadas em placas de 96 reservatório contendo 120 μΐ de 2 xYTAGT por 5 reservatório. As placas de 96 reservatórios foram incubadas em 30° C agitadas durante a noite. Quarenta microlitros de glicerol a 60 % foram adicionadas por reservatório para armazenagem a -80° C.

B. ELISA de Fagomídeo

Alíquotas de cerca de 2 μΐ de células da placa mestra (da seção

4A acima) foram inoculadas em uma placa de 96 reservatórios Costar® fresca (Coming incorporated, Coming, NY, cat. #9794) que conteve, 100 μΐ de 2 xYTAGT por reservatório e esta nova placa de células foi cultivada a 37° C até aproximadamente OD₆₀o = 0,5.

Quarenta μΐ de 2 xYTAGT contendo fago auxiliar M13KO7 (1,5 x 10¹³ cfú/ml) foram adicionados a cada reservatório e a placa de 96 reservatórios foi incubada a 37/ C durante 30 minutos sem agitar e uma outra 30 minutos com agitação lenta. A placa foi centrifugada a 2000 rpm (centrífuga de mesa Beckman CS-6R) durante 10 minutos a 4^o C. Os sobrenadantes foram removidos dos reservatórios e cada pelota de célula foi =20 recolocada em suspensão usando 150 μΐ de 2 xYTAK por reservatório. A placa foi incubada a 30° C durante a noite para a expressão de fagomídeo.

A proteína Ang-2 humana foi revestida em placa Maxisorp de reservatórios (NUNQ a 1 pg/ml em lxPBS a 4^o C durante a noite. Como um controle, 2 % de BSA (Sigma) foram revestidos em uma placa Maxisorp separada. No dia seguinte, as culturas celulares durante a noite foram centrifugadas a 2000 rpm durante 10 minutos a 4^o C. Dez μΐ de sobrenadante de cada reservatório foram transferidos para uma nova placa de 96 reservatórios contendo solução de BSA/PBS para diluir o sobrenadante a 1:10. As misturas resultantes foram incubadas durante 1 hora na temperatura

167 ambiente com agitação para bloquear os fagomídeos. Nesse meio tempo, a placa revestida com a proteína Ang-2 foi bloqueada com 400 μΐ de 2 % de solução de BSA/PBS por reservatório durante 1 hora na temperatura ambiente com agitação. A solução de BSA foi descartada e cada reservatório foi lavado três vezes com solução de PBS. Depois da última etapa de lavagem, 100 μΐ de soluções de fagomídeo bloqueadas foram adicionados a cada reservatório da placa revestida com a proteína Ang-2 assim como a placa de controle e incubadas durante 1 hora na temperatura ambiente com agitação. O líquido foi descartado e cada reservatório foi lavado três vezes com solução de PBST. Cem μΐ do anti-M13 mAb conjugado com HRP (Amersham Pharmacia Biotech) na diluição de 15.000 foram adicionados a cada reservatório das placas revestida com a proteína Ang-2 e de controle e estas placas foram incubadas durante 1 hora na temperatura ambiente com agitação. O líquido foi descartado mais uma vez e cada reservatório foi lavado três vezes com solução de PBST. Cem μΐ de substratos quimioluminescentes LumiGLO (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) foram adicionados aos reservatórios e cada reservatório foi lido pela máquina Luminoskan Ascent DLRearly (Labsystems, Franklin, MA).

C. Seqüenciamento dos Clones de Fago

A reação de PCR foi realizada usando 1 μΐ de bactéria de cada reservatório da placa mestra (seção 4A) como um padrão. O volume de cada mistura de PCR foi de 50 μΐ contendo lx tampão de PCR, 300 nM de cada um dos dois iniciadores:

5’-GTTAGCTCACTCATTAGGCAC-3’ (SEQ ID NO: 256) e 5’-GTACCGTAACACTGAGTTTCG-3’, (SEQ IDNO: 257);

200 μΜ de dNTP, 2 mM de MgCl₂ e 2,5 U de taq DNA polimerase (Roche Molecular Biochemicals). O Sistema de PCR GeneAmp 9700 (Applíed Biosystems) foi usado para conduzir o seguinte programa: 94° C durante 5 minutos; 40 ciclos de (94° C durante 45 segundos, 55° C durante

168 segundos, 72° C durante 90 segundos); 72° C durante 10 minutos; esfriar a 4^o C. Os produtos de PCR foram purificados com o kit de Purificação por PCR QIAquick 96 (QIAGEN Inc.) de acordo com as diretrizes do fabricante. Todos os produtos de PCR purificados foram seqüenciados com o iniciador 5’-TTACACTTTATGCTTCCG-3’ (SEQ ID NO: 258) usando o Seqüenciador ABI 3770 (Perkin Elmer) de acordo com as diretrizes do fabricante.

5. Classificação de Seqüência

As seqüências de peptídeo que foram traduzidas a partir das seqüências de nucleotídeo (da seção 4C acima) foram correlacionadas com os dados do ELISA. Os clones que apresentaram leitura de OD alta nos reservatórios revestidos com Ang-2 e leitura de OD baixa nos reservatórios revestidos com BSA foram considerados mais importantes. As seqüências que ocorreram múltiplas vezes foram também consideradas importantes. Vinte e quatro seqüências de peptídeo da coleção 20, 26 seqüências de peptídeo da coleção 94, 7 seqüências de peptídeo da coleção 25, 18 seqüências de peptídeo da coleção 26, 6 seqüências de peptídeo da coleção 27 e 4 seqüências de peptídeo da coleção 99 foram escolhidos para mais análise e geração de pepticorpo. Adicionalmente, onze seqüências de consenso das coleções 20 e 94, três seqüências de consenso das coleções 26 e 99 e duas da coleção 25 foram deduzidas e usadas para gerar pepticorpos. Os pepticorpos na Tabela 7 foram avaliados usando o protocolo do ELISA de Neutralização descrito aqui no Exemplo 10. Os resultados estão mostrados na Tabela 7.

169

Tabela 7

Pbs iiiaturado por afinidade derivado de Con4	hAng-2:Tie2 IC₅o(nM)	Seqüência de Pepticorpo (SEQ H) NO: )
Con4-44 (C)	0.09	; MXc-GGGGGAQ- PIRQEECDWDPWTCEHMWEV-LE (SEQIDNO: 259)
Con4A0(C)	0.10	M-Fc-GGGGGAQ- TNIQEECEWDPWTCDHMPGK-LE (SEQ IDNO: 260)
Con44 (C)	0.12	M-Bí-GGGGGAQ- WYEQDACEWDPWTCEHMAEV-LE (SEQ IDNO: 261)
Con4-31 (C)	0.16	M-Fc-GGGGGAQ- NRI^EVCETOPWTCEHMENV-IE (SEQIDNO: 262)
Con4-C5 (C)	0J6	M-Ec-GGGGGAQaatqeecewdpwtcekmprs-le (SEQIDNO: 263)
Cou4-42(C)	0.17	M-Ec-GGGGGAQ- LRIIQEGCEWJOPWTCEHMFDWXE

170

		(SEQIDNO: 264)
Con4-35 (Q	0.18	M-Fc-GGGGGAQ- VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG-LE (SEQIDNO: 265)
Con.4-43 (C)	0.18	M-Fc-GGGGGAQ- SISHEECETOPWTCEHMQVG-LE (SEQIDNO: 266)
Con.4-49 (C)	0.19	M-Fc-GGGGGAQ- WAAQEBCEWDPWTCEHMGRM-LE (SEQIDNO: 267)
Con4-27 (C)	0.22	M-Fc-GGGGGAQ· TWPQDKCEWDPWTCEHMGST-LE (SEQIDNO: 268)
Con4-48 (C)	0,26	M-Fc-GGGGGAQ- GHSQEECGWDPWTCEHMGTS-LE (SEQIDNO: 269)
C0H4-46 (C)	0.26	M-Fc-GGGGGAQ- QHWQEECEWDPWTCDHMPSK-LE (SEQ ID NO: 270)
Con.4-41 (C)	0.26	M-Fc-GGGGGAQ- NVRQEKCEWDPWTCEBMPVR-LE (SEQIDNO: 271)
Con4-36 (C)	0.28	M-FcGGGGGAQ- KSGQVECNWDPWTCBHMPRN-LE (SEQIDNO: 272)
Con4-34(C)	0.28	M-Fc-GGGGGAQ- VKTQEHCDWDPWTCEHMREW-IE (SEQIDNO: 273)
Con4~28 (C)	0.30^;	M-R-GGGGGAQ- AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM-LB (SEQIDNO: 274)
Con4-39 (C)	0,30	M-Fc-GGGGGAQ- PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM-LE (SEQIDNO; 275)
Coü4-25 (C)	0.31	M-Fc-GGGGGAQ- RAPQEDCETOFWTCAHMDIK-LE (SEQIDNO: 276)

171

Con4-50(C)	0.38	M-Fc-GGGGGAQ- HGQNMECEWDPWTCEHMERY-LE (SEQ IDNO: 277)
Con.4-38 (C)	0.40	M-Fc-GGGGGAQ- PRLQEECVWDPWTCEHMPLR-LE (SEQ ID NO: 278)
Con4-29 (C)	0,41	MFc-GGGGGAQ- RTTQEKCEWDPWTCEHMESQ-ΙΈ (SEQIDNO: 279)
Con4*47 (C)	0,44	M-Fc-GGGGGAQ- QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS-LE (SEQ PD NO: 280)
Con4-20(C)	0.48	M-Fc-GGGGGAQ- QVIGRPCEWDPWTCEHLEGVW (SEQ IDNO: 281)
Con4-45 (C)	0.48	M-Fc-GGGGGAQ- WAQQEECAWDPWTCDHMVGULE (SEQ IDNO: 282)
Con4-37 (C)	0.49	M-Fb-GGGGGAQ- LPGQEDCEWDPWTCEHMVRS-LE (SEQ IDNO: 283)
Con4-33 (C)	0.52	M-Fc-GGGGGAQ- PMNQVECDWDPWTCEHMPRS-LE (SEQ IDNO: 284)
AC2-Con4 (C)	0.52	M-Fc-GGGGGAQ- FGWSHGCEWDPWCEHMGST-LE (SEQ IDNO: 285)
Con4-32 (C)	0.75	M-Fc-GGGGGAQ KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP-LE (SEQ IDNO: 286)
Con4-17(C)	0.96	M-Fc-GGGGGAQ- GPRISTCQWDPWTCEHMDQL-LE (SEQ IDNO: 287)
Con4-8 (C)	1.20	M-FoGGGGGAQ- STIGDMCEWDPWTCAHMQVD-I,E (SEQ IDNO: 288)
AC4-Cqh4 (C)	L54	M-Fc~GGGGGAQ· VLGGQGCEWDPWTCRLLQGW-LE (SEQ IDNO 289)
Ccn44 (Ç)	2.47	M-Fc-GGGGGAQ- VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG-LE (SEQ IDNO: 290)
Con4-Cl (C)	2.75	M-FcGGGGGAQ- ttigsmcewdpwtcahmqgg-le

172

		(SEQ IDNO: 291)
Con4-21 (C)	3.21	M-Fc-GGGGGAQ- TKGKSVCQWPWTCSHMQSG-LE (SEQ IDNO: 292)
Con4~C2 (C)	3.75	M~F<>GGGGGAQ- THGSMCQWDPWTCABMQGG-LE (SEQ IDNO: 293)
Con4~18 (C)	4.80	M-FcGGGGGAQ- WVNEVVCEWPWTOMHWDTP-LE (SEQIDNO: 294)
Con449 (C)	5.76	M-Fc-GGGGGÀQ- VVQVGMCQWDPWTCKHMRLQ-LE (SEQ IDNO: 295)
Con4-16(C)	6.94	M-Fc-GGGGGÀQ- AVGSQTCEWDFWTCAHLVEV“LE (SEQ IDNO: 296)
Con4-11 (C)	9.70	M-Fc-GGGGGAQ- QGMKMFCEWDPWTCAHIVYR-l.B (SEQ ID NO: 297)
Con4-C4(C)	9.80	M-Fc-GGGGGAQ- THGSMCQWDPWTCEEMQGG-LE (SEQ IDNO: 298)
Ccm4-23 (C)	9.88	M-Fc-GGGGGAQ- TSQRVGCEWDPWTCQin.TYT-LE (SEQ IDNO: 299)
Con4-15 (O	15.00	M-Fb-GGGGGAQ- QWSWPPCEWDPWTCQTWPS-EE (SEQ ID NO: 300)
Con4-9(C)	20.11	M-Fc-GGGGGAQ- GTSPSFCQWDPWTCSHMVQG-LE (SEQ ID NO: 301)
Con4-10 (C)	86.61	M-Fg-GGGGGAQ- TQGLHQCEWDPWTCKVLWPS-LE (SEQ IDNO: 302)
Con4-22 (C)	150.00	MJfc-GGGGGAQ- VWSQVCQWDPWTCNLGGDW-LE (SEQ ID NO: 303)
Con4-3 (C)	281.50	M-Fç-GGGGGAQ- DKE3ECQWPWCQFFYGA-LE (SEQ IDNO: 304) í

173

Con4-5 (C)	nenhuma inibição	MWGGGGGAQ- ATFARQCQWDPWTCALGGNW-LE (SEQIDNO: 305)
Con4-30 (C)	nenhuma inibição	M-Fc*GGGGGAQ- GPAQEECEYDPY'TCEPWLNELE (SEQIDNO: 306)
CWE26(C)	nenhuma inibição	M-Fc-GGGGGAQrpedmcsqwdpwtwhlqgyc-le (SEQIDNO: 307)
Con4-7 (C)	nenhuma inibição	M-Fc-GGGGGAQ- LWQLAVCQWDPQTGDHMGAL-LE (SEQIDNO: 308)
Con4-12 (C)	nenhuma inibição	MÍc4GGGGAQ- \| TQLVSLCEWDPWTCRLLDGWEE (SEQIDNO: 309)
Con4-13 (C) í	nenhuma inibição	M-Fc-GGGGGAQmggagrcewdpwtcqllqgw-le (SEQ ID NO: 310)
Ccm4-14(C)	nenhuma inibição	M-Fc-GGGGGAQ- MHJNÉCQWDPWTCSFOEA-LE (SEQIDNO: 311)
Con4-2 (C)	nenhuma inibição	M-Fc-GGGGGAQ* FGWSHGCEWDPWTCRLLQGW-LE (SEQIDNO: 312)
Con4-6 (0)	nenhuma inibição	M4N-GGGGGAQ- WPQTEGCQWDPWTCR1XHGW-LE (SEQID NO: 313)
Con4-24 (C)	nenhuma inibição	Kl-Fc-GGGGGAQ- PDTRQGCQYWWTCRLYGNW-LE (SEQIDNO: 314)
ACLCon4(C)	nenhuma inibição	M-FoGGGGGAQ- TWPQDKCTWDPWTCRLLQGW-LE (SEQIDNO: 315)
AC3-Con4 (C)	nenhuma inibição	M“Fc43GGGGAQ- DKILEECEWDPWTCRLLQGW-LE (SEQIDNO; 316)
AC5-Con4 (0)	nenhuma inibição	M-Fc-GGGGGAQ- AATQEECEWDPWTCRLLQGW-LE (SEQIDNO; 317)

174

Fbs maturado por afinidade derivado de LI	hÃng-2:Tie2 IC_S0(«M>	Seqüência de pepticorpo (SEQ Π) NO:)
LI-7 (N)	0.03	MGAQ- TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG- LEGGGGG-Fc (SEQID NO: 318)
AC6-LI (N)	0.03	MGAQ- TNYKPLDELDATLYEHW1I.QHS LEGGGGG-Fc (SEQIDNO: 319)
Ll-15 (N)	0.04	MGAQ- QKYQPLDEWKTLYDQPMLQQG LEGGGGG-Fc (SEQID NO: 320)
LL2(N)	0.04	MGAQ4OTTPU>E^ LEGGGGG-Fc (SBQIDNO: 321)
Ll-10 (N)	0.05	MGAQ- QKFQPLDELEQTLYEQFMLQQA LEGGGGG-Fc (SEQIDNO;322),
Ll-13 (N)	0.05	MGAQ- QEWWEWEILYNQWMFHQR LEGGGGG-Fc (SEQID NO: 323)
Ll-5 (N)	0,05	MGAQ-VOKPLDELDER.YEQQTFQER LEGGGGG-Fc (SEQID NO: 324)
L1C2(N)	0.05	MGAQ- TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR LEGGGGG-Fc (SEQID NO: 325)
L1-C3(N)	0.06	MGAQ- ^rIYNFQPLDELDQ^rriA’EQWrLQQR LEGGGGG-Fc (SEQID NO: 326)
Ll-11 (N)	0.07	MGAQ- QNFKPMDELEDTI.YKQFLFQHS LEGGGGG-Fc (SEQID NO: 327)

175

L1-17 (Ν)	0*08	MGAQ- WYKPLDELDEWLYHQFTLHHQ LEGGGGGFc (SEQ ID NO: 328)
L1-12(N)	0,08	MGAQ- YKFTPLDDLEQTLYEQVvTLQW LEGGGGG-Fg (SEQ ID NO: 329)
Ll-1 (N)	0.08	MGAQ-QNYKPWEIJ)ArLYEHFETIYT LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 330)
L14(N)	0.08	MGAQ- VSPjKPWALEQTLYBHWMFQQA LEGGGGG-Fc (SEQIDNO: 331)
LL20 (N)	0.09	MGAQ- EDYMPDDALDAQLYEQFELLHG LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 332)
LI-22 (N)	0.09	MGAQ- YKFNPMDELEQTLYEHFLFQHA LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 333)
LL14(N)	0,11	MGAQ- snewldeieqtlyeqfmlqhq LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 334)
L146 (N)	0.11	MGAQ- QOQPLDELEETLYKQWITQQR LEGGGGG-Fc (SEQ Π) NO: 335)
Ll-18 (N)	0.16	MGAQ-QKFMPLDELDEILYEQFMFQQS LEGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 336)
Ll-3 (N)	0.16	MGAQ- TKFNPLDELEQTLYEQWILQHQ LEGGGGG-Fc (SEQ1DNO: 337)
Ll-21 (N)	0.17	MGAQ- HTFQPLDSJEEILYYQWLYDQL LEGGGGG-Fc (SEQIDNO: 338)

176

Ll-Cl ÇN)	0.56	MGAQ- i QKFKPLDELEQ'r'LYEQW’TLQQR LEGGGGG-Fc (SEQIDNO: 339)
tl-19 (N)	1.26	MGAQ- QTFQPLDDLEEYLYEQWRRYH LEGGGGG-Fc (SEQIDNO: 340)
LÊ9(N)	1.62	MGAQ- SKFKPLDELEQTLYEQWTLQHA LBGGGGG-Fc (SEQ ID NO: 341)

Pbs inaturado por afinidade derivado de Conl	IiAng-2:Tie2 iCso (uM)	Seqüência de pepticorpo (SEQ ID NO:)
Conl4(C)	1.68	M-Fc-GGGGGAQ- SGQLRPCEEIFGCGTQNLAL-LE (SEQ ID NO: 342)
Conl-1 (C)	3.08	M-Fc-GGGGGAQ- AGGMRPYDGMLGWPNYDVQA-LE (SEQIDNO: 343)
Conl-6 (C)	8.60	M-Fc-GGGGGAQ- GQDLRPCEDMFGCGTKDWYG-LE (SEQ ID NO: 344)
Cõfll-3 (C)	16.42	M-FoGGGGGAQ- APGQRPYDGMLGWTYQRIV-IE (SEQIDNO; 345)
Conl-2 (C)	nenhuma inibição	M-Fc-GGGGGAQ- QTWDDPCMHILGPVTWRRCMJB (SEQIDNO: 346)
Conl-5 (C)	nenhuma inibição	M-Fc-GGGGGAQ- FGDKRPLECMFGGPIQLCPR-LE (SEQIDNO: 347)
Originário: Conl (C)	26.00	We-GGGGGAQ-KRPCEEIFGGCIYQ- EE (SEQIDNO: 348)

177

Phs maturado por afinidade derivado de 12-9	hAng-2:Tie2 IQu.CbM)..	Seqüência de pepticorpo (SEQ ID NO:)
12*9-3(0	0.81	M-Fc-GGGGGAQ- LQEWCEGVEDPFTFGCEKQR-LB (SEQIDNO: 349)
12-9-7 (Q	0.93	M-Fc-GGGGGAQ- AiLDYCEGMDDPrTFGCDKQM-LE (SEQIDNO: 350)
12-9-6(0	0.95	M-Fc-GGGGGAQ- HQEYCBGMEDPFIEGCEYQG-LE (SEQIDNO: 351)
12-9-C2(O	1.41	M-Fc-GGGGGAQ- LQDYCEGVEDPFTFGCEMQRLE (SEQIDNO: 352)
12-9-5 (C)	1.56	M-Fc-GGGGGAQ- LLDYCEGVQDPFTFGCENID-LE (SEQIDNO: 353)
12-9-1 (O	1.84	M-Fc-GGGGGAQ- GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT-LE (SEQIDNO: 354)
12-9-4(0	2.05	JÍFó-GGGGGAQ- AQDYCEGMEDPFTFGCEMQK-LE (SEQIDNO: 355)
12-9-C1 (O	2.68	M-Fc-GGGGGAQ1QDYCEGVEDPFTFGCEKQR-LE (SEQIDNO: 356)
12-9-2 (C)	8.42	M-Fc-GGGGGAQ- KLEYCDGMEDPl^TQGCDNQSLE (SEQIDNO: 357)
Origináro: 12-9 (C)	15.00	M-Fc-GGGGGAQ- FDYCEGVEDPFTFGCDNH-LE (SEQIDNO: 358)

Exemplo 9

Seis amostras de pepticorpos anti-Ang2 foram testadas quanto a sua atividade de ligação à huAng2 (R&D Systems, BNO12103A) no BIAcore. A proteína G foi imobilizada a uma lasca CM5 de acordo com o 5 protocolo de ligação de amina padrão (BIAcore Inc.) e os pepticorpos foram depois injetados em uma superfície de proteína G para capturar (RL -100 Ru). Para testar a ligação entre hAng2 e o pepticorpo capturado, 0,3 nM a 40

178 nM de huAng2 foram injetados nas superfícies do pepticorpo capturado e os sensogramas de ligação foram analisados usando BIAevaluation 3.0 (BIAcore Inc.). A Tabela 8 resume os resultados deste experimento.

Tabela 8

Pepticorpo	Lot#	KD(M)	ka (1/Ms)	kd (1/s)
Con4-44 (C)	011702	2,lE-10	2,9E+05	5,9E-05
Ll-7 (N)	022102	2,4E-10	3,7E+05	8,7E-05
Ll-10 (N)	021302	7/7E-10	l,5E+05	L1E-04
Ll-21 (N)	021802	2,4E-10	5,6E+05	l,4E-04
Con4 (C)	33456-77	3,8E-10	5,3E+05	2,0E-04
2xCon4 (C) 1K	092501	3,4E-10	4,8E+05	L6E-04

Exemplo 10

ELISA de Neutralização

O meio condicionado de Ang-2 humana, de murino, cão e rato e Ang-1 humana e de murino foram diluídos em DMEM/50 pg/ml de BSA como segue: hAng-2 - diluição 1:64; mAng-2 - diluição 1:64; Ang-2 de rato não diluído; cão Ang-2 - diluição 1:32; hAng-1 - diluição 1:4; e mAng-1 diluição 1:4.

O grau ao qual cada um destes meios condicionados foi diluído foi determinado pela sua capacidade para ligar 1 nM de hTie2-Fc (fornecida como uma molécula Tie-2-Fc onde a porção Tie-2 contém apenas a porção extracelular solúvel da molécula; R&D Systems, número de catálogo 313-TI) a 50 % de ligação maximamente obtenível (isto é, platô). Placas de microtítulo foram revestidas com 100 μΐ do meio condicionado diluído. Para os ELISAs de neutralização de Ang-2, os pepticorpos anti-Ang2 candidatos foram titulados de 62,5 nM a 0,015 pM em diluições de 4 vezes em uma solução de PBS contendo cerca de 1 % de BSA e cerca de 1 nM de TÍe-2 (fornecida como uma molécula Tie-2-Fc onde a porção Tie-2 contém apenas a porção extracelular solúvel da molécula; R&D Systems, número de catálogo 313-TI). Para os ELISAs de neutralização de Ang-1, pepticorpo anti-Ang-2 candidatos foram titulados de 1000 nM a 0,2 pM em diluições de 4 vezes em uma solução de PBS contendo cerca de 1 % de BSA e cerca de 1 nM de Tie-2

179 (fornecida como uma molécula Tie-2-Fc onde a porção Tie-2 contém apenas a porção extracelular solúvel da molécula; R&D Systems, número de catálogo 313-TI).

Depois que cerca de 100 microlitros da solução de pepticorpo/

Tie-2 foram adicionados a cada reservatório, as placas foram incubadas durante a noite na temperatura ambiente e depois lavadas cinco vezes em PBS contendo cerca de 0,1 por cento de Tween-20. Depois da lavagem, cerca de 100 microlitros por reservatório de anticorpo anti-Tie-2 (Pharmingen Inc., catálogo #557039) foram adicionados a uma concentração final de cerca de 1 micrograma por ml e as placas foram incubadas cerca de 1 hora na temperatura ambiente. Em seguida, cerca de 100 microlitros por reservatório de IgG-IHRP anti-camundongo de cabra (Pierce Chemical Co., catálogo #31432) foram adicionados a uma diluição de 1:10.000 em PBS contendo cerca de 1 % de BSA.

As placas foram incubadas na temperatura ambiente durante cerca de 1 hora, depois do que elas foram lavadas cinco vezes com PBS contendo cerca de 0,1 por cento de Tween-20. Cerca de 100 microlitros por reservatório de substrato TMB (SIGMA, catálogo # T8665) foram depois adicionados e a cor azul foi deixada desenvolver. A absorbância foi depois M0 lida em um espectrofotômetro a 370 nm. Os resultados são apresentados na Tabela 9 abaixo.

180

Tabela 9

Neutralização Mediada por Pepticorpo de Interações Angiopoietina:Tie2

	hAng-2	mAng-2	rAng-2	cAng-2	hAng-1	m Ang-1
Pepticorpo	IC₅₀ (nM)	IC₅₀ (nM)	IC₅₀ (nM)	IC₅o (nM)	IC₅₀(nM)	IC₅₀ (nM)
2xCon4 (C)	0,026	0,035	0,024	0,047	3,0	3,2
Con4(C)	0,197	0,289	0,236	0,540	200	300
Con4-44 (C)	0,08	0,16	0,22	—	43	—
Con4-40 (C)	0,20	0,27	0,35	——	> 1000	—
Ll-7 (N)	0,046	0,063	0,035	0,108	> 1000	> 1000
Ll-21 (N)	0,179	. 0,249	0,204	0,608	> 1000	> 1000
L140(N)	0,06	0,06	0,06		> 1000	—

Exemplo 11

Estudo PK >92

Planejamento de Estudo

Camundongos CD-1 machos, pesando 20 a 30, foram aleatoriamente divididas em cada grupo de tratamento com pepticorpo (2xCon4-C, L1-7-N e L1-21-N). Os animais receberam um único bolo IV (n = 38/grupo) ou uma única administração SC de 50 pg de pepticorpo (n = 40 34/grupo). As injeções foram feitas via a veia da cauda e sob a pele sobre os ombros para as administrações IV e SC, respectivamente.

Amostragem de Sangue e Métodos Analíticos

As amostras de sangue foram coletadas para cada medição da concentração de pepticorpo anti-Ang2 na pré dose e a 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48, Hí5 72, 96, 120, 144, 168, 216, 264, 312 e 336 horas depois da administração para os grupos SC e IV. Amostras adicionais foram coletadas a 5 e 30 minutos após a dose para os grupos IV. Dois animais foram sangrados por ponto no tempo e os animais foram sacrificados depois da amostragem. O sangue (aproximadamente 0,50 ml) foi coletado de uma punção cardíaca em tubos 20 separadores de soro microtainer® de polipropileno. As amostras foram mantidas em gelo durante aproximadamente 20 minutos ou até que a formação de coágulo ocorreu. O soro foi separado das amostras de sangue pela centrifugação durante aproximadamente 10 minutos de 2 a 8^o C e armazenado a aproximadamente -70° C até ensaiado. As amostras foram

181 medidas usando um ensaio de fluorescência resolvido em tempo verificado (TRF) com um limite inferior de quantificação (LLOQ) de 100 ng/ml. Placas de microtítulo NUNC fluoroMaxisorp foram revestidas com proteína Ang-2 de camundongo recombinante. As placas foram depois bloqueadas com uma 5 solução de proteína para reduzir a ligação não específica. Os padrões, os controles de qualidade e amostras desconhecidas foram preparadas em 10 % de tampão de ensaio de soro de camundongo e pipetados em reservatórios de placas de microtítulo. Os pepticorpos foram ligados especificamente à Ang-2 imobilizada. Depois da retirada por lavagem de quaisquer substâncias não 10 ligadas (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.), um anticorpo monoclonal IgG (H+L) anti-Humano de cabra biotinilado (Jackson ImunoResearch Laboratories Inc.) foi adicionado aos reservatórios. A seguir de uma etapa de lavagem para remover qualquer anticorpo monoclonal biotinilado não ligado, estreptavidina rotulada com európio foi adicionada aos reservatórios. Depois 15 de separar por lavagem a estreptavidina európio não ligada, o európio ligado foi liberado da estreptavidina com uma· ácido solução pipetada em cada reservatório. O sinal fluorescente foi gerado e lido na leitora fluorimétrica da Wallac. A faixa de ensaio para a análise de pepticorpo anti-Ang-2 no soro de camundongo é 0,078 a 5 pg/ml.

“0 Análise Farmacocinética

Os dados de concentração-tempo médios do compósito para cada grupo foram submetidos à análise não compartimentais usando WinNonlin Professional (Versão 3.3, Pharsight Corp., Mountain View, CA). Os tempos de amostragem nominal foram usados para a análise PK, visto que 25 as amostras foram coletadas dentro de 10 % do tempo nominal. Todos os valores de concentração menos do que o LLOQ foram ajustados a zero antes da análise PK. Os seguintes parâmetros PK foram estimados:

• A meia vida terminal (1½) foi calculada como t>/₂ , onde

Kel

182 k_ei ίθί ^a constante de taxa terminal de primeira ordem estimada via regressão linear da fase de decaimento log-línear terminal.

• A área sob a curva de concentração sérica-tempo (AUC(o-ú]tímo)) foi estimada usando o método trapezoidal linear/log de tempo 0 5 até último, o tempo da última concentração quantificável (Cúitimo)·

A área sob a curva de tempo 0 até infinito (AUC(o-co)) foi estimado como a soma da AUC(o-úitímo) correspondente e os valores Cúitimo/kei prognosticados:

- — — — ---- —IVUIUUIU/ ' TT' 1 fiel • A biodisponibilidade Absoluta (F) depois da administração

SC foi calculada como:

_F=auc(Q-^c_x100

AUC(0-oo)ZF

Os resultados estão apresentados na Figura 2.

Exemplo 12

Camundongos nus fêmeas foram injetados subcutaneamente com 1x10 células A431 no dia 0 do estudo. No dia 3, o pepticorpo de Ang-2 2xCon4-C foi administrado subcutaneamente a uma dose de 200 pg/camundongo/dia. Os volumes de tumor e os pesos corpóreos foram registrados em intervalos regulares, como mostrado na Figura. Diferenças 20 significantes no crescimento do tumor foram observadas entre o grupo tratado com pepticorpo de Ang-2 versus o controle de veículo e pepticorpo de controle (p < 0,0001 vs. cada controle usando medições repetidas ANOVA, com o teste post hoc de Scheffe). O tratamento com este pepticorpo não teve nenhum efeito significante sobre os pesos corpóreos. Os resultados estão 25 apresentados na Figura 3.

Exemplo 13

Curva de Desenvolvimento In vitro de A431

Células A431 foram semeadas em placas de cultura de tecido

183 de 96 reservatórios a 2000 células por reservatório, em 200 μΐ de DMEM suplementado com 10 % de soro bovino fetal (FBS). O meio foi depois aspirado 16 horas após a semeadura. Os seguintes foram depois adicionados de volta nos reservatórios e ajustados em triplicata: 100 μΐ por reservatório de DMFM, 10 % de FBS, 1 mg/ml de pepticorpo de controle negativo 4883 ou pepticorpo TN8-Con4. Os mesmos ajustes foram repetidos em 5 placas. O meio de uma placa foi aspirado a 24, 48, 72, 96 e 120 horas após o tratamento. Cem μΐ de ácido tricloroacético a 10 % (TCA) por reservatório foram depois adicionados e as placas foram depois armazenadas a 4° C. Todas as placas foram coletadas quando a última placa esteve em 10 % de TCA durante um mínimo de 4 horas. O TCA a 10 % foi jogado fora e os reservatórios foram enxaguados 5 vezes com água de torneira. As células foram depois tingidas com 100 μΐ de sulforodamina B a 0,4 % (Sigma S-9012) em ácido acético a 1 % (Sigma A-6283) durante 10 minutos na temperatura ambiente e depois lavadas 5 vezes com ácido acético a 1 %. As placas foram depois secadas ao ar. O corante foi solubilizado com 300 μΐ de Tris a 20 nM não tamponado (pH >10) durante 2 horas em um agitador rotativo. A densidade ótima (OD) foi depois lida a 540 nm em uma leitora de placa de microtítulo. Os resultados estão apresentados na Figura 4.

Exemplo 14

Camundongos nus fêmeas foram injetados subcutaneamente com 2 x 10⁶ células Colo-205 mais Matrigel (2:1) no dia 0 do estudo. No dia 3, os pepticorpos de Ang-2 LI-7-N, L1-21-N, Con4-C e 2xCon4-C foram subcutaneamente administrados na dose de 14 pg/camundongo, duas vezes por semana. O anticorpo anti-Ang-2 Ab536, 47 pg/camundongo, três vezes por semana, foi administrado como um controle positivo. Os volumes de tumor e os pesos corpóreos foram registrados em intervalos regulares.

Diferenças significantes no crescimento do tumor foram observadas entre cada um dos grupos tratados com pepticorpo Ang-2 versus

184 controle de veículo e pepticorpo de controle (p < 0,0001 vs. cada controle usando ANOVA de medição repetida, com teste post hoc de Scheffe). O tratamento com estes pepticorpos não teve nenhum efeito significante sobre os pesos corpóreos (resultados não mostrados). Os resultados são apresentados na Figura 5.

Exemplo 15

Camundongos nus fêmeas foram injetados subcutaneamente com 2 x 10⁶ de células Colo-205 mais Matrigel (2:1) no dia 0 do estudo. No dia 3, o pepticorpo Ang-2 2xCon4C foi administrado subcutaneamente nas doses de 14, 2,8 e 0,56 pg/camundongo, duas vezes por semana. Os volumes de tumor e os pesos corpóreos foram registrados em intervalos regulares, como mostrado. Diferenças significantes no crescimento do tumor foram observadas entre as duas doses mais altas do grupo tratado com pepticorpo Ang-2 versus controle de veículo e pepticorpo de controle (p = 0,003 para a dose intermediária e p < 0,0001 para a dose alta, usando ANOVA de medição repetida, com teste post hoc de Scheffe). O tratamento com estes pepticorpos não teve nenhum efeito significante sobre os pesos corpóreos. A linha tracejada representa uma redução do n total do grupo, de 10 para 9 camundongos, devido à morte de um camundongo por razões desconhecidas. Os resultados estão apresentados na Figura 6.

Exemplo 16

Pepticorpos Anti-Ang-2 vs. Tumores de Xenoenxerto Colo-205

Camundongos nus fêmeas foram injetados subcutaneamente com 2 x 10⁶ células Colo-205 mais Matrigel (2:1) no dia 0 do estudo. No dia 3, o pepticorpo Ang-2 2xCon4-C ou o pepticorpo de controle foram administrados subcutaneamente na dose de 350 pg/dia. Os tumores dos grupos tratados com pepticorpo de controle (como descrito na Tabela 5) foram colhidos no dia 14 (controle igualado no tamanho) ou Dia 18 (controle igualado no tempo). Os tumores do grupo tratado com 2xCon4(C) foram

185 depois colhidos no dia 18. Os volumes de tumor foram registrados em intervalos regulares, como mostrado. Diferenças significantes no crescimento do tumor foram observadas entre o grupo de controle igualado no tempo e o grupo tratado com 2xCon4-C (p = 0,0154 pelo ANOVA de medição repetida, 5 com teste post hoc de Scheffe). O tratamento com estes pepticorpos não teve nenhum efeito significante sobre o peso corpóreo.

Os tumores preparados para a análise de imagem foram bíssecados coronalmente e metade subitamente congelada em OCT (Sakura Finetek USA Inc., Torrance, CA). Crio-seções foram imunoisto10 quimicamente tingidas usando CD31 anti-camundongo (catálogo #553370, BD PharMingen, San Diego, CA) a 2 pg/ml, com DAB como o cromogênio. As seções de tumor foram dígítalmente fotografadas em ampliação de objetiva de 20X. Quatro campos de “ponto circular” por tumor foram capturados, com dez tumores por grupo de tratamento. Um sistema de análise 15 de imagem MetaMorph (Universal Imaging Corporation, Downington, PA) foi usado para threshold os vasos sangüíneos tingidos com CD31 dentro das imagens. As áreas de tingimento positivos em CD31 foram expressadas como uma relação do tecido de tumor total dentro de cada campo. Os resultados estão apresentados na Figura 7.

“0 Exemplo 17

Camundongos nus fêmeas foram injetados subcutaneamente com 2 x 10⁶ células Colo-205 mais Matrigel (2:1) no dia 0 do estudo. O tratamento com 350 pg/camundongo, s.c. duas vezes por semana, do pepticorpo de Ang-2 2xCon4-C ou pepticorpo de controle equivalente 25 começou nos dias 3, 10 ou 15 do estudo. Os volumes de tumor e os pesos corpóreos foram registrados em intervalos regulares. Diferenças significantes no crescimento do tumor foram observadas entre todos os grupos tratados com pepticorpo Ang-2 versus controle de veículo (p = 0,089 para o grupo do dia 15 e p < 0,0001 para os grupos dos dias 3 e 10, usando ANOVA de

186 medição repetida, com teste post hoc de Scheffe). O tratamento com estes pepticorpos não teve nenhum efeito significante sobre os pesos corpóreos. Os resultados estão apresentados na Figura 8 (pesos corpóreos não mostrados).

Exemplo 18

Um resumo de taxas de resposta completa (CR) foi obtido usando anticorpo Ab536 a 47 pg/camundongo nu fêmea, administrados intraperitonealmente três vezes por semana ou com pepticorpo 2xCon4(C), dado subcutaneamente em programas de dosagem múltipla em estudos de duração prolongada diferentes (> 10 semanas de dosagem) tanto no modelo de xenoenxerto A431 quanto Colo-205. CR como aqui usado refere-se a um resultado em que nenhum tumor mensurável permaneceu a seguir do tratamento. Os resultados estão apresentados na Figura 9.

Exemplo 19

a) Combinação de Pb com Taxotere no Modelo de Tumor Colo-205

Camundongos nus fêmeas foram injetados subcutaneamente com 2 x 10⁶ células Colo-205 mais Matrigel (2:1) no dia 0 do estudo. No dia 14 do estudo, os tratamentos foram iniciados com a) 350 pg/camundongo, s.c. duas vezes por semana, do pepticorpo Ang-2 2xCon4-C, b) 20 mg/kg de qwx3 i.p. de taxotere ou c) uma combinação de ambos. Os volumes de tumor e os pesos corpóreos foram registrados em intervalos regulares. Diferenças significantes no crescimento do tumor foram observadas entre todos os grupos de tratamento versus controle de veículo (p < 0,0001 usando ANOVA de medição repetida, com teste post hoc de Scheffe). Além disso, o grupo de terapia de combinação foi significantemente diferente do que cada um dos agentes de monoterapia (p < 0,0001 vs. 2 xCon-4-C e p = 0,0122 vs taxotere). A linha tracejada representa uma redução do n total do grupo, de 10 para 9 camundongos, devido à morte de um camundongo por razões desconhecidas. O tratamento com estes pepticorpos não teve nenhum efeito significante sobre os pesos corpóreos. Os resultados estão apresentados na Figura 10a.

187

b) Combinação de Pb com 5-FU no Modelo de Tumor Colo-205

Camundongos nus fêmeas foram injetados subcutaneamente com 2 x 10⁶ células Colo-205 mais Matrigel (2:1) no dia 0 do estudo. No dia 14 do estudo os tratamentos iniciaram com a) 350 pg/camundongo, s.c. duas 5 vezes por semana, do pepticorpo de Ang-2 2xCon4-C, b) 50 mg/kg qdx5 i.p. de 5-FU ou c) uma combinação de ambos. Os volumes de tumor e pesos corpóreos foram registrados em intervalos regulares, como mostrado.

Diferenças signifícantes no crescimento do tumor foram observadas entre todos os grupos de tratamento versus controle de veículo (p 10 < 0,0001 usando ANOVA de medição repetida, com teste post hoc de

Scheffe). Além disso, o grupo de terapia de combinação foi signíficantemente diferente do que cada um dos agentes de monoterapia (p = 0,0375 vs. 2xCon-4-C e p = 0,0453 vs. 5-FU). Uma redução transitória no peso corpóreo foi observada no grupo tratado com 5-FU (18 % no dia 20 do estudo) assim 15 como com o grupo da terapia de combinação (16 % no dia 20 do estudo), seguido por uma recuperação completa dos pesos corpóreos. Os resultados estão apresentados na Figura 10b.

Exemplo 20

Modelo de Artrite de Adjuvante

Ratos Lewis machos (120 a 130 g, Charles River, Wilmington

MA) foram alojados dois por gaiola tampada com filtro em uma sala ambientalmente controlada (temperatura 23 ± 2^o C, umidade relativa 50 ± 20 %) em um ciclo de 12 horas de luz/escuro. Os animais foram alimentados com uma ração de roedor comercial (Formulação 8640; Tek Lab, Madison, 25 WI) e receberam água de torneira purificada em filtro ad libitum. Os teores de cálcio e fósforo da dieta foram 1,2 % e 1,0 %, respectivamente.

A artrite de adjuvante foi induzida por uma única injeção de 0,5 mg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra mortos por calor (Dífco Laboratories, Detroit, MI) colocados em suspensão em 0,05 ml de óleo de

188 parafina (Crescent Chemical Co,, Hauppauge, NY) intradermicamente na base da cauda. O início clínico da artrite foi no dia 9 como indicado pelo intumescimento da para traseira e dificuldades ambulatórias. Exceto no grupo tratado com 2xCon4(c) (que foi tratado a partir do Dia 1 depois da imunização), os tratamentos foram dados como injeções subcutâneas diárias começando no dia 9 depois da imunização (antes do início da artrite) e continuando até o dia 18.

Monitoramento Clínico da Artrite de Adiuvante.

A progressão da inflamação foi clinicamente avaliada pela medição intermitente do volume da pata traseira usando pletismografia aquosa de acordo com os métodos descritos por Feige et al., Cellular Molec. Life Sei., 57: 1457 a 1470 (2000). A inibição da inflamação da pata foi calculada com base na área sob a curva (AUC) usando a regra trapezoidal de acordo com a fórmula:

[1 - {(AdA tratada) - normal) / (AdA não tratadas - normal)}] x 100

Além disso, o peso corpóreo total foi determinado diariamente durante o regime de tratamento de 9 dias como um ponto final suplementar por que a perda de peso corpóreo mostrou ser paralelo à progressão da inflamação da junta neste modelo de artrite. Os animais foram sacrificados sob CO₂ no dia 18.

A perda da densidade mineral óssea (BMD) foi examinada na necrópsia (dia 18 após a imunização). As patas traseiras foram removidas na linha da pele (exatamente próximo ao tornozelo (jarrete)), imerso em 70 % de etanol e depois varrido na orientação horizontal usando um densitômetro de raio X de feixe em forma de leque (Modelo QDR-4500A; Hologic, Waltham, MA). Ver Feige et al., supra. Depois da varredura, uma caixa retangular (29 x 25 mm) centralizada no calcâneo foi posicionada para delinear o sítio a ser analisado e algoritmos patenteados (Hologic software) calcularam a área óssea, o teor mineral ósseo e a densidade mineral óssea.

189

Todos os resultados foram expressados como a média ± erro padrão. Um valor p de 0,05 foi usado para delinear as diferenças significantes entre os grupos. Um teste ANOVA de Kruskal-Wallis e um de Mann-Whitney U. usando software estatístico comercial (Statsoft v3.0; Statsoft, Tulsa, OK) foram realizados nos dados clínicos (variáveis contínuas).

Os resultados estão apresentados nas Figuras 11a, 11b e 11c, respectivamente.

Exemplo 21

Modelo de Angiogênese Córnea

Efeito de CON4(C) na Angiogênese induzida por VEGF em Ratos

O pepticorpo Ang-2 CON4(C) foi avaliado no modelo córneo de angiogênese em ratos. A angiogênese foi induzida implantando-se um disco de náilon embebido em VEGF (ou controle de BSA) no estroma córneo (n = 8/grupo). O pepticorpo TN8CON4-C foi administrado pela injeção sub-cutânea a 1,0 ou 0,1 mg/rato/dia durante sete dias. Dois outros grupos de animais foram tratados com a mesma dose de pepticorpo de controle negativo 4883. Todos os grupos foram pré tratados com uma única dose de carga de 3,0 ou 0,3 mg que foi três vezes a dose de manutenção de 1,0 ou 0,1 mg (ver Figura). Depois de sete dias de tratamento, dois pontos finais vasculares foram determinados a partir de cada imagem digital da córnea de rato: o número de vasos que intersectam o ponto central entre o disco e o limbo e a área de vasos sangüíneos. O tratamento com TN8CON4-C significantemente inibiu a angiogênese induzida por VEGF em uma maneira dependente da dose (p < 0,04), ao passo que o tratamento com o pepticorpo de controle não teve nenhum efeito significante em cada um dos pontos finais. Não houve evidência de toxicidade evidente com base nos pesos corpóreos dos animais tratados. Os resultados estão apresentados na Figura 12.

Exemplo 22

Mapeamento de Epítopo

190

Proteínas de Ang-2 humanas (hAng-2) de comprimento completo (aminoácidos de 1 a 495), de terminal N (aminoácidos de 1 a 254) e de terminal C (aminoácidos de 255 a 495) foram clonadas em um vetor de expressão mamífero direcionado com CMV com rótulos óxHis de terminal C.

As três construções resultantes mais um controle de vetor foram transitoriamente expressadas em células 293T. Os meios condicionados foram depois coletados a partir das células transfectadas e o nível de expressão de Ang-2 nos meios foi estimado pelo ELISA anti-6xhis e Western blotting.

O epítopo de ligação de anticorpos e pepticorpos anti-Ang-2 foi determinado pela sua capacidade para ligar-se às três versões de hAng-2 humano pelo ELISA de acordo com o seguinte protocolo: uma placa de ensaio de 96 reservatórios de alta ligação foi revestida com 100 μΐ de meio condicionado por reservatório e incubada a 37° C durante 1 hora. O meio condicionado foi aspirado e a placa foi bloqueada com 200 μΐ por reservatório de 5 % de BSA em PBS na temperatura ambiente durante 1 hora. A solução de bloqueio foi depois aspirada. 100 μΐ por reservatório de anticorpo, pepticorpo ou Tie2-Fc foram adicionados a 1 pg/ml em 1 % de BSA em PBS e incubados na temperatura ambiente durante 1 hora. Os reservatórios foram lavados 4 vezes com 200 μΐ de Tween a 0,1 % em PBS. 100 μΐ por 30 reservatório de IgG anti-humano de cabra conjugado a HRP ou IgG anti-camundongo de cabra foram adicionados e incubados na temperatura ambiente durante 45 minutos. Os reservatórios foram depois lavados com 200 μΐ de Tween a 0,1 % em PBS 4 vezes. 100 μΐ por reservatório de substrato TMB foram depois adicionados. A O.D. foi lida a 370 nm.

Os resultados estão apresentados na Figura 13 a, Figura 13b e

Figura 13c.

Exemplo 23

Devido a certas limitações de sensibilidade inerentes no ensaio BiaCore, a afinidade de ligação também foi avaliada usando um ensaio de

191

Sepidyne KinExA.

A ligação de 2xCon4-C (Pb5714) à huAng-2 foi testada em KinExA (Sapidyne, Boise, ID). Pérolas Reacti-Gel 6x (Pierce, Rockford, IL) foram pré revestidas com huAng-2 e bloqueadas com BSA. Amostras com 10 pM e 30 pM de 2xCon4-C foram incubadas com várias concentrações (0,3 pM - 3 nM) de huAng-2 na temperatura ambiente durante 8 horas antes de conduzir através das pérolas revestidas com huAng-2. A quantidade do pepticorpo ligado à pérola foi quantificada pelo anticorpo anti-humano-Fc de cabra rotulado fluorescente (Cy5) (Jackson Imuno Research, West Grove, PA). O sinal de ligação é proporcional à concentração de pepticorpo livre no equilíbrio.

A constante de equilíbrio de dissociação (Ko) foi obtida a partir da regressão não linear das curvas de competição usando um modelo de ligação homogêneo de sítio único de curva dupla (software KinEx®). K_D foi depois determinada ser de aproximadamente 2 pM para a ligação de 2xCon4-C com huAng-2.

Como é mostrado na Figura 14, usando o ensaio KinExA o pepticorpo 2xCon4 mostrou ter ~2 pM de afinidade para hAng-2.

Exemplo 24

Peptídeos PEGuilados

O peptídeo LI-7 foi sintetizado com um sintetizador 431 ABI usando um protocolo de ligação padrão e a ligação dupla do resíduo 14 (met) ao resíduo 1 (Cys) do terminal N, a numeração do término N para o término

C.

Conjugação de Peptídeo LI-7 com Metóxi-poli(etileno glicolj-maleimida; PM: 5 KDa; denominado “mPEG5K-(Peptídeo LI-7)”

Uma solução de 0,8 mg de peptídeo LI-7 em 400 μΐ de tampão 1 (20 mM de fosfato, 5 mM de EDTA, pH 6,5) foi tratada com 13,5 mg de metoxipoli(etileno glicolj-maleimida (PM = 5 KDa; Shearwater Corp.); 0,27

192 ml de uma solução 50,0 mg/ml em tampão 1. A mistura de reação foi incubada a 4^o C durante a noite, depois diluída com 1,6 ml, de tampão A (20 mM de Tris cloridreto, pH 7,2) e dializada em um cassete Slide-A-Lyzer (3500 MWCO, Pierce) contra o mesmo tampão. A mistura de reação dializada foi purificada pela cromatografia de troca iônica em uma coluna de 1,0 ml HiTrap Q Sepharose HP (Amersham Biosciences Corp.). O pico do produto foi eluído em duas frações de 1,0 ml via um gradiente de 100 % de tampão A a 100 % de tampão B (tampão A + 0,5 M de NaCl) em 40 volumes da coluna.

As frações de produto combinadas foram concentradas a 250 μΐ contendo

0,23 mg de proteína/ml com um Dispositivo Centrífugo NEcrosep IK (Pall

Life Sciences).

Conjugação de Peptídeo LI-7 com 1,11-bis-maleimidotetraetilenoglícol; denominado “PEQ4(Peptídeo L1 -7)3”

Uma solução de 1,0 mg de peptídeo LI-7 em 500 μΐ de tampão

1 (20 mM de fosfato, 5 mM de EDTA, pH 6,5) foi tratada com 0,0375 mg de

1,11-bismaleimidotetraetilenogIicol (Pierce) (0,375 ml de uma solução 0,1 mg/ml em tampão 1). A mistura de reação foi incubada a 4^o C durante 3,33 horas, depois de dializada em um cassete Slide-A-Lyzer (3500 MWCO, Pierce) contra tampão A (20 mM de Tris cloridreto, pH 7,2). A mistura de 30 reação dializada foi purificada pela cromatografia de troca iônica em uma coluna de 1,0 ml HiTrap Q Sepharose HP (Amersham Biosciences Corp.). O pico de produto dimérico foi eluído em três frações de 1,0 ml via um gradiente de 100 % de tampão A a 100 % de tampão B (tampão A + 0,5 M de

NaCl) em 40 volumes da coluna. As frações de produto combinadas foram concentradas a 550 μΐ contendo 0,12 mg de proteína/ml com um Dispositivo

Centrífugo Microsep 1 K (Pall Life Sciences).

Conjugação de Peptídeo Ll-7 com Polifetilene glicol)-bis-maleimida: PM 3,4

KDa; denominado “PEG3.4K(Peptídeo L 1-7)2”

Uma solução de 3,0 mg de Peptídeo Ll-7 em 1,5 ml de tampão

193 (20 mM de fosfato, 5 mM de EDTA, pH 6,5) foi tratado com 1,125 mg de poli(etilene glicol)-bis-maleimida (PM = 3,4 KDa, Shearwater Corp.); 0,563 ml de uma solução 2,0 mg/ml em tampão 1. A mistura de reação foi incubada a 0^o C durante a noite, depois de dializado em um cassete Slide-A-Lyzer (3500 MWCO, Pierce) contra tampão A (20 mM de Tris cloridreto, pH 7,2). A mistura de reação dializada foi purificada pela cromatografia de troca iônica em uma coluna de 5,0 ml HiTrap Q Sepharose HP (Amersham Biosciences Corp.). O pico do produto foi eluído em três frações de 3,0 ml via um gradiente de 100 % de tampão A a 100 % de tampão B (tampão A + 0,5 M de NaCl) em 40 volumes de coluna. As frações de produto combinadas foram concentradas a 850 μΐ contendo 0,24 mg de proteína/ml com dois Dispositivos Centrífugos NEcrosep 1K (Pall Life Sciences).

Os resultados de espectroscopia de massa MALDI-TOF foram

como segue:

Amostra #	Identidade	Exp. MS	Obs. MS
1	Ll-7 (Peptídeo não PEGuilado)	3.545	3.538,7
2	mPEG5K-(Peptídeo Ll-7)	8.500	8.851
3	PEO4(Peptídeo Ll-7)₂	7.443	7.446,29
4	PEG3.4K(Peptídeo Ll-7)₂	10.550	10.552 6.882,61 3.550,13

Será avaliado que o “2” subscrito para o PEG3.4K(Peptídeo

Ll-7) e PEO4(Peptídeo Ll-7) indica que existem dois peptideos por cadeia polimérica, uma localizado em cada extremidade do polímero.

Determinação de ICsn

A IC₅o para a inibição da interação hAng2:hTie2-Fc para os peptideos Ll-7 livre e PEGuilado foi determinada pelo ELISA de Neutralização como descrito no Exemplo 2. Para o ELISA de Neutralização, as placas de microtítulo às quais o polipeptídeo humano de Ang-2 foi ligado foram preparadas como descrito no Exemplo 2 para o ELISA de Afinidade. Os peptideos Ll-7 anti-Ang-2 PEGuilados e livres candidatos foram titulados a partir de 1000 nM a 0,2 pM em diluições de 4 vezes em uma solução de

194

PBS contendo cerca de 1 % de BS A e cerca de 1 nM de Tie-2 (fornecida como uma molécula de Tie-2-Fc onde a porção Tíe-2 contém apenas a porção extracelular solúvel da molécula; R&D Systems, número de catálogo 313-TI). Depois que cerca de 100 microlitros da solução de anticorpo/Tie-2 foram adicionados a cada reservatório, as placas foram incubadas durante a noite na temperatura ambiente e depois lavadas cinco vezes em PBS contendo cerca de 0,1 por cento de Tween-20. Depois da lavagem, cerca de 100 microlitros por reservatório de anticorpo anti-Tie-2 (Pharmingen Inc., catálogo # 557039) foram adicionados a uma concentração final de cerca de 1 micrograma por ml e as placas foram incubadas cerca de 1 hora na temperatura ambiente. Em seguida, cerca de 100 microlitros por reservatório de IgG-BRP anticamundongo de cabra (Pierce Chemical CO., catálogo # 31432) foram adicionados a uma diluição de 1:10.000 em PBS contendo cerca de 1 por cento de BS A. As placas foram incubadas na temperatura ambiente durante cerca de 1 hora, depois do que elas foram lavadas cinco vezes com PBS contendo cerca de 0,1 por cento de Tween-20. Cerca de 100 microlitros por reservatório de substrato TMB (descrito acima) foram depois adicionados e a cor foi deixada desenvolver. A absorbância foi depois lida em um espectrofotômetro a 370 nm.

Os peptideos LI-7 (C-GGGGG-AQ-TNFMPMDDLEQRLYEQ FILQQG-LE) (SEQ ID NO: 359) incluíram: uma Cisteína de terminal N para ligar ao PEG; e um ligador 5Gly. As seqüências flanqueadoras AQ e LE estavam presentes tanto no clone de fago original quanto no pepticorpo. Os resultados da IC₅o da inibição de hAng-2:Tie2 foram como segue:

Peptídeo	IC_so(nM)
Peptídeo LI-7	0,49
mPEG5K-(Peptídeo LI-7)	11,7
PEO4(Peptídeo Ll-7)₂	0,064
PEG3.4K(Peptídeo Ll-7)₂	0,058

1/2

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipetídeo capaz de se ligar à Ang-2, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido SEQ ID NO:25 e a sequência de aminoácidos da Fc em SEQ ID NO:25 é definida em SEQ ID NO:60, e sais fisiologicamente aceitáveis do mesmo.
2. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de codificar um polipeptídeo conforme definido na reivindicação 1.
3. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de ser conforme definido em SEQ ID NO: 46.
4. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 2 ou 3.
5. Célula hospedeira procariótica, caracterizada pelo fato de compreender o vetor de expressão conforme definido na reivindicação 4.
6. Célula hospedeira procariótica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de E. coli.
7. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender uma quantidade eficaz de um polipeptídeo conforme definido na reivindicação 1, misturado a um veículo farmaceuticamente aceitável para o mesmo.
8. Uso de um polipeptídeo conforme definido na reivindicação

1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para inibir angiogênese em um mamífero
9. Uso de um polipeptídeo conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de angiogênese em um indivíduo.
10. Uso de um polipeptídeo conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para modular angiogênese em um mamífero.

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11. Uso de um polipeptídeo conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para inibir o crescimento de tumor em um mamífero, que tem como característica angiogênese indesejada.
12. Uso de um polipeptídeo conforme definido na reivindicação 1 com um agente quimioterapêutico, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento de câncer em um mamífero.
13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o agente quimioterapêutico é pelo menos um dentre 5-FU, CPT11, e Taxotere.
14. Uso de um polipeptídeo conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para modular pelo menos um de permeabilidade vascular ou vazamento de plasma em um mamífero.
15. Uso de um polipeptídeo conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar pelo menos um de doença neovascular ocular, obesidade, hemangioblastoma, hemangioma, arteriosclerose, doença inflamatória, distúrbios inflamatórios, aterosclerose, endometriose, doença neoplásica, doença relacionada aos ossos, ou psoríase em um mamífero.
16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a doença inflamatória é artrite.