CN113727602B - 抗nme抗体及治疗癌症或癌症转移的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了抗NME抗体及其在治疗或预防疾病中的用途。本申请涉及治疗或预防受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用针对NME家族成员制备的抗体。所述NME家族可以是NME7家族。

Description

抗NME抗体及治疗癌症或癌症转移的方法
背景技术
1.技术领域
本申请涉及NME蛋白、衍生自NME蛋白的肽和由其肽产生的抗体或根据其与所述肽结合的能力而选择的抗体或抗体片段。本申请还涉及治疗或预防与患者的NME表达相关的疾病。
2.总体背景和现有技术：
NDPK(核苷二磷酸蛋白激酶)蛋白是组在一起的蛋白家族，因为它们都含有NDPK结构域。首先发现的NME蛋白，先前称为NM23蛋白，是NM23-H1和NM23-H2。数十年来，人们不清楚它们是诱导分化还是阻止造血细胞分化。本发明人先前发现，当NM23-H1是结合MUC1*生长因子受体的二聚体时，它会阻止分化，但在较高浓度下，NM23-H1变成不结合MUC1*的六聚体，而且它会诱导分化。NM23过去常被称为转移抑制因子，当时发现它在一些极具侵袭性的癌症中表达不足。本发明人先前公开了NM23-H1二聚体结合绝大多数癌症上过度表达的MUC1*生长因子受体的胞外结构域并使之二聚化，并且这种结合促进了癌细胞的生长。相反，在较高浓度下，NM23形成不结合MUC1*且不促进肿瘤发生的四聚体和六聚体。最近，已经发现了更多的NME家族蛋白(NME 1-10)，但直到现在，还没有阐明它们的功能。NME7是新发现的NME家族蛋白，但与其他NME家族成员不同，它的NDPK结构域没有酶活性。NME7在成体组织中要么根本不表达，要么以极低的水平表达。
发明内容
本申请涉及一种治疗或预防受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用针对NME家族成员制造的抗体。NME家族可以是NME7家族。所述抗体可以结合至NME7。所述抗体可以结合至NME7AB或NME7AB样蛋白。所述抗体可以结合至NME7-X1。所述抗体可以抑制NME7与其同源结合伴侣之间的结合。所述同源结合伴侣可以是MUC1*。所述同源结合伴侣可以是MUC1*胞外结构域的PSMGFR部分。在一个方面，所述抗体可能因其结合至选自图6至图9中所列肽(SEQ ID NO:88至145)的肽的能力而被产生或选择。优选地，所述肽可以选自图9中所列出的那些肽(SEQ ID NO:141至145)。
所述肽可以与图6至图9中所列出的肽(SEQ ID NO:88至145)高度同源，或者在N末端或C末端添加或减去至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸残基。在一个方面，所述抗体可能因其结合至NME7AB或NME7-X1但不结合至NME1的能力而被选择。所述抗体可以是多克隆的、单克隆的、二价的、单价的、双特异性的、含有可变区的抗体片段或抗体模拟物。所述抗体可以是人的或人源化的。所述抗体可以是单链scFv。
在另一个方面，本发明涉及一种治疗或预防受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用与NME7AB的诸多区域高度同源或相同的肽。所述肽可以与图6中所列肽中的一种或多种至少80％同源。所述肽可以与图7中所列肽中的一种或多种至少80％同源。所述肽可以与图8中所列肽中的一种或多种至少80％同源。所述肽可以与图9中所列肽中的一种或多种至少80％同源。所述肽可以选自图6至图9中所列出的肽(SEQ ID NO:88至145)。所述肽可以选自图9中所列出的那些肽(SEQ ID NO:141至145)。或者，所述肽可以与图6至图9中所列出的肽(SEQ ID NO:88至145)高度同源，或者在N末端或C末端添加或减去至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸残基。所述肽可以通过间隔基或接头连接至另一种肽。
在另一个方面，本发明涉及一种用于治疗或预防癌症的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR的靶向性胞外部分包含至少一个属于NME家族成员的肽片段。NME家族可以是NME7家族。所述NME7家族成员可以是NME7。或者，所述NME7家族成员可以是NME7AB或NME7AB样蛋白。所述NME7家族成员还可以是NME7-X1。所述CAR的靶向性胞外部分可以包括图6至图9中所列肽中的肽(SEQ ID NO:88至145)。所述肽可以选自图9中所列出的那些肽(SEQ ID NO:141至145)。所述肽可以包括与图6至图9中所列出的肽(SEQ ID NO:88至145)高度同源，或者在N末端或C末端添加或减去至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸残基的肽。所述肽可以通过间隔基或接头连接至另一种肽。
在又一个方面，本发明涉及一种治疗或预防癌症或癌症转移的方法，包括将根据技术方案3的嵌合抗原受体工程化至免疫系统细胞中并将所述细胞施用至有需要的受试者。
在另一个方面，本发明涉及一种用于治疗或预防癌症的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述嵌合抗原受体的靶向性胞外部分包含结合至NME7AB、NME7AB样蛋白或NME7-X1的抗体部分。所述抗体部分可以是单链scFv，或者可以是人的或人源化的。
在又一个方面，本发明涉及一种给人接种疫苗以对抗癌症或转移性癌症的方法，包括用NME家族成员的肽片段使人免疫。NME家族可以是NME7家族。所述NME7家族成员可以是NME7或NME7b。所述NME7家族成员可以是NME7AB或NME7AB样蛋白。NME7家族可以是NME7-X1。免疫肽可以是来自图6至图9中所列肽(SEQ ID NO:88至145)的肽。优选地，所述肽可以选自图9中所列出的那些肽(SEQ ID NO:141至145)。所述免疫肽可以包括与图6至图9中所列出的肽(SEQ ID NO:88至145)高度同源，或者在N末端或C末端添加或减去至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸残基的肽。所述免疫肽可以通过间隔基或接头连接至另一种肽。
在又一个方面，本发明涉及一种治疗或预防受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用抑制NME7、NME7b、NME7AB样蛋白或NME7-X1表达的核酸。所述核酸可以是抑制NME7、NME7AB样蛋白或NME7-X1表达的反义核酸。所述核酸可以是抑制NME7、NME7AB样蛋白或NME7-X1表达的抑制性RNA、siRNA、RNAi或shRNA。
在另一个方面，本发明涉及一种治疗或预防受试者的癌症的方法，包括向所述受试者施用抑制NME7、NME7b、NME7AB样蛋白或NME7-X1表达的经基因编辑的核酸。可以将所述抑制NME7、NME7b、NME7AB样蛋白或NME7-X1表达的经基因编辑的核酸插入细胞中，然后可以施用于患者。可以使用病毒载体将所述抑制NME7、NME7b、NME7AB样蛋白或NME7-X1表达的经基因编辑的核酸插入细胞中。所述病毒载体可以是慢病毒系统。
在另一个方面，本发明涉及一种使癌细胞生长的方法，包括使所述细胞与NME7AB、NME7b、NME7AB样蛋白或NME7-X1、2i或5i接触。所述方法可以包括在含有NME7AB、NME7b、NME7AB样蛋白或NME7-X1、2i或5i的培养基中培养所述细胞，或者使所述细胞在表达人NME7AB、NME7b、NME7AB样蛋白或NME7-X1或施用了NME7AB、NME7b、NME7AB样蛋白或NME7-X1的动物中生长。所述癌细胞可以是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌、黑色素瘤或脑癌细胞。可以对所述细胞测试药物候选物。可以通过比较癌症生长与无药物对照组、或比较转移标记物或干细胞标记物的表达水平与无药物对照组、或比较所得细胞相较于无药物对照组在动物中从低细胞拷贝数形成肿瘤的能力并确定候选药物治疗癌症或转移的功效来评估药物的功效。所述细胞可能是从正进行癌症治疗评估的患者获得，并且使用上述方法基于结果选择对该患者有效的药物。所述细胞可能不是从正进行癌症治疗评估的患者获得，但是使用上述方法基于结果选择对该患者有效的药物。
在另一个方面，本发明涉及一种从具有衍生自NME序列的序列的肽或肽模拟物产生抗体或抗体样分子的方法。所述NME可以是NME7。所述肽可以用作免疫原以产生抗体或抗体样分子。所述肽可以施用于动物以产生抗NME7抗体。所述肽可以施用于人类以产生抗NME7抗体。所述肽可以具有图6至图9中所列出的序列(SEQ ID NO:88至145)。优选地，所述肽可以选自图9中所列出的那些肽(SEQ ID NO:141至145)。所述肽可以包括与图6至图9中所列出的肽(SEQ ID NO:88至145)高度同源，或者在N末端或C末端添加或减去至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸残基的肽。
在另一个方面，本发明涉及一种检测癌症存在或癌症进展的方法，包括以下步骤：
1)从患有癌症或有罹患癌症风险的患者获得样品；
2)对该样品进行能够检测或测量NME7家族成员的水平或编码NME7家族成员的核酸的水平的测定；
3)将测试样品中所测量的NME7家族成员或NME7家族成员编码核酸的水平与对照患者或对照细胞中的水平相比较；
4)测定NME7家族成员或编码NME7家族成员的核酸的水平与对照组相比有所升高；以及
5)如果与测试组相比较的对照组来自先前诊断为患有癌症的供体，则得出所述测试样品的供体患有癌症或存在癌症进展的结论。在这种方法中，在循环或组织中检测到NME7家族成员可能是患者的癌症指标。所述NME7家族成员可以是NME7、NME7b、NME7-X1或NME7AB样蛋白。
在又一个方面，本发明涉及一种方法，包括：
在患者中检测NME7家族成员或MUC1*的存在；以及
向表现出NME7家族成员或MUC1*表达的患者施用一种或多种抗NME7或抗MUC1*抗体。所述NME7家族成员可以是NME7、NME7b、NME7-X1或NME7AB样蛋白。
在又一个方面，本发明涉及一种治疗或预防癌症的方法，包括：
1)从疑似患有癌症或有罹患癌症风险或有罹患转移性癌症风险的患者获得样品；
2)测量NME7家族成员或NME7家族成员编码核酸的量，其中测量水平显著高于在对照样品中测量的水平；
3)确定所述患者患有癌症或已罹患更具侵袭性或转移性的癌症；
4)向所述患者施用有效量的抑制NME7家族成员表达、抑制NME7切割或抑制NME7与其靶标结合的治疗剂。所述NME7家族成员的靶标可以是MUC1*。所述NME7家族成员的靶标可以是MUC1*胞外结构域的PSMGFR部分。所述NME7家族成员可以是NME7、NME7b、NME7-X1或NME7AB样蛋白。
在以上关于癌症的任一种方法中，癌症可以包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肝癌、黑色素瘤或脑癌。
在一个方面，本发明涉及一种结合SEQ ID NO:145或SEQ ID NO:169的NME7 B3肽的NME7特异性抗体或其片段。所述抗体可以是单克隆抗体或二价、单价、Fab或单链可变片段抗体(scFv)。所述抗体可以连接至抗体药物缀合物。所述药物可以连接至毒素或原毒素。
本发明还涉及一种编码所述抗体的分离的核酸。
本发明还涉及一种表达上述单克隆抗体的分离的杂交瘤。所述抗体可以特异性地结合NME7AB或NME7-X1，但不结合NME1。所述抗体可能会破坏NME7AB和MUC1*胞外结构域之间或NME7-X1和MUC1*胞外结构域之间的相互作用。或者，所述抗体可能会破坏NME7AB和PSMGFR之间或NME7-X1和PSMGFR之间的结合。此外，所述抗体可能会破坏NME7AB和N-10之间或NME7-X1和N-10之间的结合。
在另一个方面，所述抗体可能不会破坏NME7AB和MUC1*胞外结构域之间或NME7-X1和MUC1*胞外结构域之间的相互作用。NME7AB或NME7-X1结合N-10肽(SEQ ID NO:170)，但不结合C-10肽(SEQ ID NO:171)。具体来说，所述抗体可以是5A1、4A3或5D4。
所述抗体可以包含重链可变区中的氨基酸序列，包括以下：
CDR1区中的YTFTNYGMN(SEQ ID NO:439)；
CDR2区中的WINTYTGEPTYVDDFKG(SEQ ID NO:440)；和
CDR3区中的LRGIRPGPLAY(SEQ ID NO:441)；以及
轻链可变区中的氨基酸序列，包括
以下：
CDR1区中的SASSSVSYMN(SEQ ID NO:444)；
CDR2区中的GISNLAS(SEQ ID NO:445)；和
CDR3区中的QQRSSYPPT(SEQ ID NO:446)。
在另一个方面，所述抗体可以包含重链可变区中的氨基酸序列，包括以下：
CDR1区中的NTFTEYTMH(SEQ ID NO:429)；
CDR2区中的GFNPNNGVTNYNQKFKG(SEQ ID NO:430)；和
CDR3区中的RYYHSTYVFYFDS(SEQ ID NO:431)；以及
轻链可变区中的氨基酸序列，包括
以下：
CDR1区中的SASQGISNYLN(SEQ ID NO:434)；
CDR2区中的YTSSLHS(SEQ ID NO:435)；和
CDR3区中的QQYSKLPYT(SEQ ID NO:436)。
在另一个方面，所述抗体可以包含重链可变区中的氨基酸序列，包括以下：
CDR1区中的NTFTEYTMH(SEQ ID NO:388)；
CDR2区中的GFNPNNGVTNYNQKFKG(SEQ ID NO:389)；和
CDR3区中的RYYHSLYVFYFDY(SEQ ID NO:390)；以及
轻链可变区中的氨基酸序列，包括
以下：
CDR1区中的ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO:393)；
CDR2区中的EGNTLRP(SEQ ID NO:394)；和
CDR3区中的LQSDNLPLT(SEQ ID NO:395)。
所述抗体可以是人的、人源化的或工程化的抗体模拟物。
所述抗体可以是非人的，诸如鼠的或骆驼的。
本发明还涉及一种向患者施用以预防或治疗癌症的方法，包括向所述患者施用包含上述抗体的组合物。
本发明还涉及一种用于在患者中预防或治疗癌症转移的方法，包括向所述患者施用包含上述抗体的组合物。
本发明还涉及一种用于诊断癌症或癌症转移的方法，包括使患者样本和正常样本与上述抗体接触，并比较来自两个样本的结果，其中所述患者样本中存在与所述抗体的阳性结合表明所述患者存在癌症或癌症转移。所述抗体可以连接至成像剂。所述患者样本可以是血液、体液、组织、循环细胞、体外的、体内的，包括手术中的。
本发明还涉及一种经工程化以表达抗NME7AB抗体或其片段的细胞。所述细胞可以是免疫细胞，诸如T细胞或NK细胞，或者干细胞或祖细胞，优选接下来分化成T细胞的干细胞或祖细胞。
所述细胞可以包含识别肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体(CAR)。抗NME7抗体的表达可以是可诱导的。可以将编码抗NME7AB抗体的核酸插入Foxp3增强子或启动子中。所述抗NME7AB抗体可以在NFAT诱导系统中。NFATc1反应元件可以插入到被插入Foxp3增强子或启动子区域中的抗体序列的上游。
所述抗NME7AB抗体或其片段可以结合NME7 B3肽，或者破坏NME7AB或NME7-X1与MUC1*胞外结构域的PSMGFR肽的结合。
所述CAR可以识别肿瘤相关抗原和抗NME7抗体。所述肿瘤相关抗原可以是MUC1*。
本发明还涉及一种抗癌疫苗，其包含含有一种或多种衍生自图6至图9中所列出的NME7AB的肽或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％序列同一性的肽作为免疫原性引发部分的组合物。所述肽可以是SEQ ID NO:141-145的肽或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％序列同一性的肽。所述肽可以是SEQ ID NO:145的肽或与其具有至少80％、85％、90％、95％、97％序列同一性的肽。
在另一个方面，本发明涉及一种包含上述抗体的BiTE。
在又一个方面，本发明涉及一种产生抗NME7AB抗体的方法，其中使NME7 B3肽中的半胱氨酸残基突变以避免二硫键形成。
在又一个方面，本发明涉及一种产生具有增强的转移潜能的细胞的方法，包括将所述细胞与NME7AB或NME7-X1一起培养。
本发明还涉及一种经工程化以表达NME7AB或NME7-X1的细胞、一种表达NME7AB或NME7-X1的转基因动物，其中NME7AB或NME7-X1可以是人的，而且其中NME7AB或NME7-X1的表达可以是可诱导的。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一张彩色附图。本专利或专利申请公布与彩色附图的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。
根据下文给出的详细描述和仅以说明方式给出且因此对本发明不具限制性的附图，将会更充分地理解本发明，并且其中：
图1示出了来自ELISA夹心测定的HRP信号图，表明了NME7-AB使MUC1*胞外结构域肽二聚。
图2是T47D癌细胞在传统培养基或含有NME7的培养基中培养之后的干细胞标记物和癌症干细胞标记物的基因表达的RT-PCR测量图，其中将变为非贴壁的细胞(漂浮物)与仍然贴壁的那些细胞分开进行分析。
图3是DU145前列腺癌细胞的多种干细胞和推定癌症干细胞标记物的基因表达的RT-PCR测量图。在传统培养基或者含有NME1二聚体(“NM23”)或NME7(NME7-AB)的培养基中培养细胞。不使用Rho激酶抑制剂，因为到第2代时，细胞仍然贴壁。
图4是转移性标记物和多能干细胞标记物的RT-PCR测量图，示出了先前被证明可以使干细胞恢复到更初始状态的2i抑制剂(GSK3-β和MEK抑制剂)还诱导癌症达到更具转移性的状态，但与NME7AB不一样。
图5是人NME1与人NME7-A或NME7–B结构域之间的序列比对。
图6列出了来自人NME7的免疫原性肽，与NME1具有低序列同一性，并且因它们产生用于治疗或预防癌症的治疗性抗NME7抗体的能力而被选择。
图7列出了来自人NME7的免疫原性肽，可能对结构完整性或与MUC1*结合非常重要，因其产生用于治疗或预防癌症的治疗性抗NME7抗体的能力而被选择。
图8列出了来自人NME1的免疫原性肽，可能对结构完整性或与MUC1*结合非常重要，并且因其产生用于治疗或预防癌症的治疗性抗NME7抗体的能力而被选择。
图9列出了来自人NME7的免疫原性肽，因其与NME1的低序列同一性以及因其与牵涉于癌症的细菌NME1蛋白的同源性而被选择。这些肽因为它们产生用于治疗或预防癌症的治疗性抗NME7抗体的能力而为优选的。该图中所示的肽包括并且添加了共价结合在C末端的半胱氨酸。
图10A至图10B示出了ELISA测定图，其中使NME7-AB(图10A)或NME1(图10B)吸附到平板并测试由NME7肽A1、A2、B1、B2和B3产生的抗NME7抗体与NME7结合但不与NME1结合的能力。C20是一种抗NME1抗体。
图11示出了ELISA测定图，其中测试了所产生的抗NME7抗体抑制NME7-AB与表面固定MUC1*肽结合但不抑制NME1结合的能力。
图12示出了癌细胞生长实验图，其中在存在或不存在NME7抗体或衍生自NME7的短肽的情况下使乳腺癌细胞生长，从而用于产生或选择抗体。另外，通过用接近整个NME7-AB肽(氨基酸100-376)免疫产生的抗体被证明抑制癌细胞生长。
图13示出了癌细胞生长实验图，其中在存在或不存在NME7抗体的组合或衍生自NME7的短肽的组合的情况下使乳腺癌细胞生长，从而用于产生或选择抗体。两种抗体以及它们的免疫性NME7-AB肽都抑制癌细胞生长。
图14A至图14B示出了当癌细胞在NME7-AB或2i抑制剂(这两种抑制剂都能够将癌细胞转化到更具转移性的状态)中生长时以及存在或不存在NME7衍生肽A1、A2、B1、B2和B3时的科学家观察结果表。NME7-AB肽抑制贴壁癌细胞向漂浮细胞转变，RT-PCR测量显示这增加了转移标记物、尤其是CXCR4的表达。
图15A至图15C示出了在NME7-AB或2i抑制剂(各自将癌细胞转化至更具转移性的状态)中生长的T47D乳腺癌细胞中的CXCR4和其他转移性标记物表达的RT-PCR测量图，以及抗NME7抗体对转移性转化的抑制作用。图15A示出了在存在或不存在抗NME7抗体的情况下，在NME7AB或2i中生长的T47D癌细胞的CXCR4表达的PCR图。图15B示出了在存在NME7AB免疫肽的情况下，在2i抑制剂中生长72小时或144小时的T47D乳腺癌细胞中CXCR4、CHD1和SOX2表达的RT-PCR测量图，并示出了所述肽本身对转移性转化具抑制性。图15A中的抑制剂组合2和3中使用的肽A1、A2和B1也是抑制性肽。肽B3最具抑制性并且是图15A中测试的最具抑制性的抗体，即抗体61的免疫肽。图15C示出了Y轴的比例被缩小的图15B的图。
图16示出了图31中用于对CXCR4进行RT-PCR测量的样品中的记录RNA水平以及CXCR4表达以及对照管家基因的阈值循环数的表格。
图17示出了一组人干细胞和癌细胞中的NME7-X1表达的RT-PCR测量图。
图18示出了一组人干细胞和癌细胞中的NME7、NME7a、NME7b和NME7-X1表达的RT-PCR测量图。NME7a是全长NME7，NME7b缺失了DM10结构域的一小部分，NME7-X1缺失了所有DM10结构域和第一NDPK A结构域N末端的一小部分。标记为NME7的条柱意指使用了可检测NME7a和NME7b两者的引物。
图19A至图19F示出了蛋白质印迹照片，其中使用通过用NME7衍生肽进行免疫产生的抗体来探测各种癌细胞系中NME7种类的表达。图19A示出了蛋白质印迹，其中使用结合A1肽的抗体52来探测一组细胞是否存在全长NME7、NME7AB或NME7-X1。图19B示出了蛋白质印迹，其中使用结合B1肽的抗体56来探测一组细胞是否存在全长NME7、NME7AB或NME7-X1。图19C示出了蛋白质印迹，其中使用结合B3肽的抗体61来探测一组细胞是否存在全长NME7、NME7AB或NME7-X1。图19D示出了蛋白质印迹，其中使用针对NME7 A和B结构域产生的市售多克隆抗体H278来探测一组细胞中是否存在NME7。如诸图所示，抗体H278也识别NME1。图19E示出了在网站上公开的市售抗NME7抗体B9的凝胶，证明其结合具有全长NME7的表观分子量的种类。图19F示出了蛋白质印迹，其中我们使用抗NME7抗体B9来探测仅加载有NME1的凝胶。如图中可见，抗体B9识别NME1以及全长NME7。这并不奇怪，因为与抗体H278一样，B9是针对NME7的A和B结构域产生的，其中NME1的A结构域与NME7AB的A结构域高度同源。
图20A至图20C示出了与标准培养基相比，在含有NME7-AB的无血清培养基中培养之后癌细胞中的转移标记物的RT-PCR测量图。图20A示出了MUC1阳性卵巢癌细胞系SK-OV3增加了转移标记物CXCR4、CDH1(又名E-钙粘蛋白)、SOX2和NME7-X1的表达；图20B示出了MUC1阴性卵巢癌细胞系OV-90增加了转移标记物CXCR4和NME7-X1的表达；图20C示出了表达最低水平的MUC1的乳腺癌细胞系MDA-MB增加了转移标记物CDH1(又名E-钙粘蛋白)和SOX2的表达。
图21A至图21F示出了蛋白质印迹照片和所分析的癌细胞系的描述。对于图21A和图21B中的蛋白质印迹，所有癌症样品都经过标准化，以便将它们以40ug/mL的浓度加载到凝胶上。在图21A中，使用抗串联重复单克隆抗体VU4H5探测各种癌细胞系中全长MUC1的表达。在图21B中，使用多克隆抗PSMGFR抗体探测各种癌细胞系中切割形式MUC1*的表达。图21C是所分析的癌细胞系的描述。图21D示出了HER2阳性BT474乳腺癌细胞，标记为“BT474(亲本细胞)”，几乎不表达MUC1或MUC1*，直到它们获得对赫赛汀和其他化疗药物的抗性为止，标记为“BTRes1”。通过在亚致死水平的赫赛汀中培养细胞，使亲本细胞对赫赛汀、紫杉醇、多柔比星和环磷酰胺具有抗性。图21D示出了HER2的表达水平没有改变，但MUC1*的表达随着细胞获得赫赛汀抗性而显著增加。图21E示出了与抗药性转移细胞相比，亲本BT474细胞在存在或不存在抗MUC1*Fab的情况下响应于赫赛汀治疗而生长的图。如图中可见，BT474亲本细胞示出了细胞生长的赫赛汀浓度依赖性降低，而两种赫赛汀抗性细胞系BTRes 1和BTRes2示出了癌细胞生长没有响应于赫赛汀治疗而降低。然而，当用抗MUC1*Fab治疗时，抗性细胞系示出了癌细胞生长的赫赛汀浓度依赖性降低。图21F示出了与抗药性BTRes1细胞相比，亲本BT474细胞在存在或不存在抗MUC1*Fab的情况下响应于紫杉醇治疗的细胞死亡百分比的图。
图22A至图22E示出了免疫共沉淀实验的蛋白质印迹照片。将T47D乳腺癌细胞提取物与针对MUC1胞质尾的抗体Ab-5或对照抗体IgG一起孵育，并进行免疫共沉淀。用两种不同的市售抗NME7抗体B9(图22A)和CF7(图22B)对凝胶进行印迹。两个凝胶都示出了在约33kDa和约30kDa处的独特NME7条带。剥下凝胶并且用针对MUC1*胞外结构域的抗体抗PSMGFR(图22C)和(图22D)重新探测，由此证明了NME7种类和MUC1*相互作用。将重组NME7-AB和重组NME7-X1混合在一起并且在凝胶上跑胶，然后用抗NME7抗体进行探测，证明了天然存在于乳腺癌细胞中并且与MUC1*相互作用的两种独特NME7种类是NME7-AB样种类和NME7-X1(图22E)。
图23A至图23C示出了免疫共沉淀实验的蛋白质印迹照片。将人诱导多能干细胞iPS7或胚胎干细胞HES3细胞提取物与针对MUC1胞质尾的抗体Ab-5或对照抗体IgG一起孵育，并进行免疫共沉淀。用市售抗NME7抗体B9对凝胶进行印迹(图23A)。两种细胞类型都示出了在约33kDa和约30kDa处的独特NME7条带。剥下凝胶并且用针对MUC1*胞外结构域的抗体抗PSMGFR(图23B)重新探测，由此证明了NME7种类和MUC1*相互作用。将重组NME7-AB和重组NME7-X1混合在一起并且在凝胶上跑胶，然后用抗NME7抗体进行探测，证明了天然存在于乳腺癌细胞中并且与MUC1*相互作用的两种独特NME7种类是NME7-AB样种类和NME7-X1(图23C)。
图24示出了测定新的抗NME7抗体结合NME7-AB的能力的ELISA实验图。已知NME7-AB结合至MUC1*的胞外结构域。多孔板表面包被有重组NME7-AB。将抗NME7-AB抗体单独加入孔中。进行标准洗涤，并且通过加入HRP结合的二抗使之可视化。如可见，10种新的抗NME7抗体中有7种强结合至NME7-AB。
图25示出了测定新的抗NME7抗体结合NME1的能力(优选无能力)的ELISA实验图。多孔板表面包被有重组NME1-S120G二聚体，已知它们也结合至MUC1*胞外结构域。将抗NME7-AB抗体单独加入孔中。进行标准洗涤，并且通过加入HRP结合的二抗使之可视化。如可见，只有一种抗体示出了仅最低限度的NME1结合。
图26示出了ELISA竞争性抑制测定的图。制造NME7-AB/抗NME7抗体复合物，然后加入到包被有MUC1*胞外结构域肽PSMGFR的多孔板。记起NME7-AB具有两个伪相同结构域A和B，各结构域能够结合至MUC1*胞外结构域。结合至B结构域中的NME7 B3肽的抗体不结合至NME7 A结构域。因此，预计只能部分抑制NME7-AB/MUC1*相互作用。
图27示出了ELISA置换测定的图。首先使NME7-AB结合至板上的表面固定的MUC1*胞外结构域肽，然后通过加入抗NME7抗体加以破坏。
图28示出了ELISA置换测定的图。在此情况下，用缺失了PSMGFR序列的10个N末端氨基酸的截短MUC1*肽N-10包被多孔板。已知NME7-AB结合至N-10肽。使NME7-AB结合至板上的表面固定的N-10肽，然后通过加入抗NME7抗体加以破坏。
图29示出了在其正常推荐培养基RMPI、仅含有4nM(最佳)或8nM NME7-AB作为生长因子的无血清培养基、或仅含有8nM NME1 S120G二聚体作为生长因子的无血清培养基中培养的T47D乳腺癌细胞样品中存在的RNA的量的图；由于NME1是同型二聚体，而NME7-AB是包括两个假相同结构域的单体，因此8nM NME1是4nM NME7-AB的摩尔当量。在存在或不存在抗NME7 B3抗体的情况下培养癌细胞。在此实验中，将漂浮细胞与贴壁细胞分离并单独分析。大量数据表明，漂浮细胞是癌症干细胞。样品中RNA量的增加或减少表明某一剂分别增加或减少了给定群体中所产生细胞的数目。
图30示出了在正常推荐培养基RPMI、仅含有4nM(最佳)或8nM NME7-AB作为生长因子的无血清培养基、或仅含有8nM NME1 S120G二聚体作为生长因子的无血清培养基中培养的T47D乳腺癌细胞中转移标记物CXCR4的PCR测量图；由于NME1是同型二聚体，而NME7-AB是包括两个假相同结构域的单体，因此8nM NME1是4nM NME7-AB的摩尔当量。在存在或不存在抗NME7 B3抗体的情况下培养癌细胞。在此实验中，将漂浮细胞与贴壁细胞分离并单独分析。大量数据表明，漂浮细胞是癌症干细胞。如图中可见，在NME7-AB培养基中生长增加了漂浮细胞群体中的CXCR4，而抗NME7 B3抗体降低了其表达，表明抗NME7抗体减少了癌症干细胞的产生。
图31示出了在正常推荐培养基RMPI、仅含有4nM(最佳)或8nM NME7-AB作为生长因子的无血清培养基、或仅含有8nM NME1 S120G二聚体作为生长因子的无血清培养基中培养的T47D乳腺癌细胞中干细胞标记物和转移标记物SOX2的PCR测量图；由于NME1是同型二聚体，而NME7-AB是包括两个假相同结构域的单体，因此8nM NME1是4nM NME7-AB的摩尔当量。在存在或不存在抗NME7 B3抗体的情况下培养癌细胞。在此实验中，将漂浮细胞与贴壁细胞分离并单独分析。大量数据表明，漂浮细胞是癌症干细胞。如图中可见，在NME7-AB培养基中生长增加了漂浮细胞群体中的SOX2表达，而抗NME7 B3抗体降低了其表达，表明抗NME7抗体减少了癌症干细胞的产生。
图32示出了在正常推荐培养基RMPI、仅含有4nM(最佳)或8nM NME7-AB作为生长因子的无血清培养基、或仅含有8nM NME1 S120G二聚体作为生长因子的无血清培养基中培养的T47D乳腺癌细胞中干细胞标记物和转移生长因子受体MUC1的PCR测量图；由于NME1是同型二聚体，而NME7-AB是包括两个假相同结构域的单体，因此8nM NME1是4nM NME7-AB的摩尔当量。在存在或不存在抗NME7 B3抗体的情况下培养癌细胞。在此实验中，将漂浮细胞与贴壁细胞分离并单独分析。大量数据表明，漂浮细胞是癌症干细胞。如图中可见，在NME7-AB培养基中生长增加了漂浮细胞群体中的MUC1表达，而抗NME7 B3抗体降低了其表达，表明抗NME7抗体减少了癌症干细胞的产生。
图33A至图33B示出了尾静脉注射癌细胞后第6天免疫受损nu/nu小鼠的IVIS照片。图33A示出了注射500,000个T47D-wt乳腺癌细胞的小鼠的IVIS照片。图33B示出了注射10,000个在含NME7-AB的最低限度培养基中生长10天的T47D乳腺癌细胞的小鼠的IVIS照片。收集漂浮细胞。这些漂浮细胞在本文中被称为癌症干细胞，CSC。如图中可见，注射了野生型癌细胞的小鼠没有表现出转移征象。然而，注射了少50倍的细胞但注射了癌症干细胞的小鼠表现出了注射的癌细胞明显转移。
图34A至图34D示出了尾静脉注射癌细胞后第10天免疫受损nu/nu小鼠的IVIS照片。图34A示出了注射了500,000个T47D-wt乳腺癌细胞的小鼠的IVIS照片。图34B示出了注射了10,000个T47D-CSC(癌症干细胞)的小鼠的IVIS照片。图34C示出了注射了10,000个T47D-CSC(癌症干细胞)且在第7天注射了抗NME7抗体的小鼠的IVIS照片。图34D示出了发射光子的IVIS测量的手动记录。如图中可见，选择用于治疗的小鼠比相当的T47D-CSC小鼠具有更大转移性。第6天注射游离NME7-AB可以阻断第一次抗体注射的功效。注射了500,000个T47D-wt细胞的对照小鼠示出了一些微弱光子发射，这可能是背景或存活的癌细胞。
图35A至图35C示出了尾静脉注射癌细胞后第12天免疫受损nu/nu小鼠的IVIS照片。图35A示出了注射了500,000个T47D-wt乳腺癌细胞的小鼠的IVIS照片。图35B示出了注射了10,000个未用抗NME7抗体治疗的T47D-CSC(癌症干细胞)的小鼠在可以拍摄IVIS照片之前就死于过度的肿瘤负荷。图35C示出了注射了10,000个T47D-CSC(癌症干细胞)且在第7天和第10天注射了抗NME7抗体的小鼠的IVIS照片。如图中可见，用抗NME7抗体治疗的小鼠正在清除癌症转移灶。注射了500,000个T47D-wt细胞的对照小鼠示出了较弱光子发射，表明较少的存活癌细胞或可能是背景。
图36A至图36B示出了尾静脉注射癌细胞后第14天免疫受损nu/nu小鼠的IVIS照片。图36A示出了注射了500,000个T47D-wt乳腺癌细胞的小鼠的IVIS照片。图36B示出了注射了10,000个T47D-CSC(癌症干细胞)且在第7天、第10天和第12天注射了抗NME7抗体的小鼠的IVIS照片。如图中可见，用抗NME7抗体治疗的小鼠接近完全不含癌症转移灶。注射了500,000个T47D-wt细胞的对照小鼠没有显示出光子发射。
图37A至图37V示出了癌细胞尾静脉注射后第6天至第26天免疫受损nu/nu小鼠的IVIS照片的时程。图37A、图37C、图37E、图37G、图37I、图37K、图37M和图37O示出了第0天向尾静脉中注射500,000个T47D-wt细胞的小鼠的IVIS照片。图37B、图37D、图37F、图37H、图37J、图37L、图37N和图37P示出了已经在第0天向尾静脉中注射10,000个T47D癌症干细胞，自第7天至第17天施用抗NME7抗体，接着暂停治疗，然后在第21天恢复治疗的小鼠的IVIS照片。图37Q、图37R、图37S、图37T和图37U示出了自暂停抗NME7抗体治疗的第17天至恢复抗体治疗的第21天至第26天之间经治疗的小鼠的放大IVIS照片。图37V示出了IVIS测量的比例尺。如此时程中可见，已经在NME7中生长的癌细胞很容易转移，并且可以通过用结合NME7的抗体治疗来有效地治疗、预防或逆转这种转移。
图38A至图38C示出了免疫受损nu/nu小鼠自注射500,000个T47D野生型乳腺癌细胞或10,000个T47D癌症干细胞后第6天至第19天的IVIS照片的时程。图38A示出了尾静脉内(i.v.)注射的小鼠。图38B示出了腹膜内(i.p.)注射的小鼠。图38C示出了皮下(s.c.)注射的小鼠。
图39A至图39C示出了用结合B3肽的抗NME7抗体染色的人肺组织样本。该图示出了正常组织上缺乏NME7表达，NME7表达随着肿瘤等级和转移增加而增加。
图40A至图40C示出了用结合B3肽的抗NME7抗体染色的人小肠组织样本。该图示出了正常组织上缺乏NME7表达，NME7表达随着肿瘤等级和转移增加而增加。
图41A至图41D示出了用结合B3肽的抗NME7抗体染色的人结肠组织样本。该图示出了正常组织上缺乏NME7表达，NME7表达随着肿瘤等级和转移增加而增加。
图42A至图42F示出了每只重约20g的雌性nu/nu小鼠的照片，它们经尾静脉内注射10,000个荧光素酶阳性T47D转移性乳腺癌干细胞并且用抗NME7AB抗体4A3(又称8F9A4A3)治疗。为了对癌细胞进行成像，经腹膜内注射荧光素酶底物荧光素，10分钟后在IVIS仪器中拍照。图42A至图42C示出了动物面向下的IVIS照片。图42D至图42F示出了动物面向上的IVIS照片。图42A和图42D示出了注射磷酸盐缓冲盐水溶液的对照动物。图42B和图42E示出了一种预防模型，其中在注射转移性癌细胞前24小时给动物注射抗NME7AB抗体4A3，然后大约每隔一天注射，在22天内总共进行12次抗体注射。图42C和图42F示出了一种逆转模型，其中在注射转移性癌细胞后24小时给动物注射抗NME7AB抗体4A3，然后大约每隔一天注射，在20天内总共进行11次抗体注射。
图43A至图43F示出了每只重约20g的雌性nu/nu小鼠的照片，它们经尾静脉内注射10,000个荧光素酶阳性T47D转移性乳腺癌干细胞并且用抗NME7AB抗体5A1(又称8F9A5A1)或5D4(又称5F3A5D4)治疗。为了对癌细胞进行成像，经腹膜内注射荧光素酶底物荧光素，10分钟后在IVIS仪器中拍照。图43A至图43C示出了动物面向下的IVIS照片。图43D至图43F示出了动物面向上的IVIS照片。图43A和图43D示出了注射磷酸盐缓冲盐水溶液的对照动物。图43B、图43E、图43C和图43F示出了一种预防模型，其中在注射转移性癌细胞前24小时给动物注射抗NME7AB抗体，然后大约每隔一天注射，在22天内总共进行12次抗体注射。在第27天获取图像。
图44A至图44D示出了在第0天经尾静脉内注射与NME7AB混合至最终浓度32nM的10,000个荧光素酶阳性T47D转移性乳腺癌干细胞的雌性nu/nu小鼠的照片。在第1天和第2天，动物经尾静脉内注射更多的32nM NME7AB，我们已经证明了这会增加转移。这是个证明了已建立的转移灶被逆转的系统。在第7天，用个别抗NME7AB抗体8F9A5A1、8F9A4A3或5F3A5D4治疗动物。图44A示出了注射磷酸盐缓冲盐水溶液的对照动物。图44B示出了用抗NME7AB单克隆抗体8F9A5A1(又称5A1)治疗的动物。图44C示出了用抗NME7AB单克隆抗体8F9A4A3(也称为4A3)治疗的动物。图44D示出了用抗NME7AB单克隆抗体5F3A5D4(也称为5D4)治疗的动物。绿色箭头表示指定时期内的低抗体剂量(5-7mg/kg)，而红色箭头表示高剂量(15mg/kg)。如图中可见，用抗NME7AB抗体治疗的动物与对照动物相比具有较少转移，尽管用抗体治疗的组中有许多动物在任何治疗前都具有较多转移。较高浓度的抗NME7AB抗体比低浓度更有效。举例来说，在第11天和第17天之间，用高剂量治疗动物，并且大部分治疗过的动物截至约第17天已经清除了转移灶。然而，1次低剂量抗体导致转移复发。截至第32天，动物再次对高剂量治疗有反应。
图45A至图45B示出了在第0天经皮下向右侧腹注射与NME7AB混合至最终浓度32nM然后与基质胶1:1vol:vol混合的10,000个荧光素酶阳性T47D转移性乳腺癌干细胞的雌性nu/nu小鼠的照片。第0天至第6天允许肿瘤移植物进展。然后通过尾静脉注射抗NME7AB抗体对动物进行静脉内治疗。给对照动物注射PBS。图45A示出了对照动物的IVIS照片。图45B示出了经尾静脉内注射抗NME7AB抗体5A1、4A3和5D4的混合液达到15mg/kg总浓度的动物的IVIS照片。在第7天和第18天之间施用抗体或PBS 4次。如图中可见，抗NME7AB抗体治疗的动物与对照组相比显示较少转移。在治疗组中，5只动物中有2只具有比对照组中的那些更大的原发肿瘤。这可能是因为抗NME7AB抗体阻止了癌细胞扩散，因此它们仍然集中在原发肿瘤中。在本实验中，PCR分析表明，与NME7AB一起培养11天之后，T47D乳腺癌细胞的CXCR4上调了109倍，OCT4上调了2倍，NANOG上调了3.5倍，而且MUC1上调了2.7倍。
图46A至图46Q示出了在第0天经皮下向右侧腹注射与NME7AB混合至最终浓度32nM然后与基质胶1:1vol:vol混合的10,000个荧光素酶阳性T47D转移性乳腺癌干细胞的雌性nu/nu小鼠的照片。第0天至第6天允许肿瘤移植物进展。然后通过尾静脉注射抗NME7AB抗体对动物进行静脉内治疗。给对照动物注射PBS。第38天，将动物处死并收集肝脏，然后通过IVIS进行分析以检测已经转移至肝脏的癌细胞。图46A至图46B示出了仅注射PBS的对照动物的全身IVIS照片。图46C至图46D示出了注射抗NME7AB抗体5A1的对照动物的全身IVIS照片。图46E至图46F示出了注射抗NME7AB抗体4A3的对照动物的全身IVIS照片。图46G至图46H示出了注射抗NME7AB抗体5D4的对照动物的全身IVIS照片。图46A、图46C、图46E和图46G是在任何治疗前第7天拍摄的IVIS照片。图46B、图46D、图46F和图46H是在抗NME7AB抗体治疗或模拟治疗后第31天拍摄的IVIS照片。如图中可见，PBS对照组的动物在全身IVIS照片中显示出转移(蓝点)，而用抗NME7AB抗体治疗的动物则没有。图46I至图46P示出了处死后从动物收集的肝脏和肺的照片和IVIS照片。图46I、图46K、图46M和图46O是常规照片。图46J、图46L、图46N和图46P是IVIS照片，示出了已经转移到那里的癌细胞。如图中可见，抗NME7AB抗体大大抑制了向乳腺癌转移的主要部位肝脏的转移。图46Q是通过IVIS仪器针对从对照动物与经治疗动物收集的肝脏发出和计数的测量光子的条形图。
图47A至图47F示出了免疫荧光实验的照片，其中针对NME7AB的存在对各种癌细胞系进行染色。图47A示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的T47D乳腺癌细胞。图47B示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的ZR-75-1乳腺癌细胞(又称1500s)。图47C示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的H1975非小细胞肺癌细胞。图47D示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的H292非小细胞肺癌细胞。图47E示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的HPAFII胰腺癌细胞。图47F示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的DU145前列腺癌细胞。如图中可见，我们测试的所有癌细胞系都显示出NME7AB的强膜染色。这些实验中使用的单克隆抗体是5D4。同时，使用NME7AB抗体5A1和4A3将相同的细胞系染色并产生了相同的结果。
图48A至图48I示出了免疫荧光实验的照片，其中针对NME7AB的存在对各种肺癌细胞系进行染色。图48A至图48C示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的H1975非小细胞肺癌细胞，即腺癌。图48A是DAPI和抗NME7AB染色的叠加。图48B示出了单独的抗NME7AB染色。图48C是DAPI和抗NME7AB染色的叠加的放大视图。图48D至图48F示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的H292非小细胞肺癌细胞，即粘液表皮样肺癌。图48D是DAPI和抗NME7AB染色的叠加。图48E示出了单独的抗NME7AB染色。图48F是DAPI和抗NME7AB染色的叠加的放大视图。图48G至图48I示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的H358非小细胞肺癌细胞，即转移性细支气管肺泡癌。图48G是DAPI和抗NME7AB染色的叠加。图48H示出了单独的抗NME7AB染色。图48I是DAPI和抗NME7AB染色的叠加的放大视图。
图49A至图49I示出了在NME7AB中培养之前和之后癌细胞系乳腺T47D、肺H1975、肺H358和胰腺HPAFII的PCR图。图49A测量了乳腺转移标记物CXCR4。图49B测量了干细胞标记物OCT4。图49C测量了转移标记物ALDH1。图49D测量了干细胞标记物SOX2。图49E测量了干细胞标记物NANOG。图49F测量了标记物CDH1，又称E-钙粘蛋白。图49G测量了转移标记物CD133。图49H测量了干细胞标记物ZEB2。图49I测量了干细胞、癌症和转移标记物MUC1。漂浮细胞又称肿瘤球，能够独立地贴壁生长，并显示出比贴壁细胞更高的转移标记物。注射癌症干细胞的动物是注射NME7AB生长的漂浮细胞的动物。如图中可见，在NME7AB中培养后，转移标记物、干细胞标记物或上皮间质转变(EMT)标记物升高，表明转变至更强转移性状态。
图50A至图50D示出了经尾静脉内注射10,000个癌细胞的NSG小鼠的IVIS照片，所述癌细胞是与NME7AB一起培养10天之后的NCI-H358亲本细胞或NCI-H358细胞。图50A和图50C示出了注射了已经在NME7AB中生长了10天的NCI-H358肺癌细胞的小鼠的IVIS照片。图50B和图50D示出了注射了亲本NCI-H358细胞的小鼠的IVIS照片。图50A和图50B示出了小鼠面向下成像的IVIS照片。图50C和图50D示出了小鼠面向上成像的IVIS照片。如图中可见，NME7AB生长的细胞具有大大增加的转移潜能。
图51示出了在二聚NM23-H1(又称NME1)或NME7AB中培养2代或3代前后MUC1阴性前列腺癌细胞系PC3的PCR图。该图示出了干细胞、癌细胞以及转移标记物的倍数差异。如图中可见，在NME1或NME7AB中重复培养诱导干细胞、癌症和转移标记物上调，而且还使MUC1表达上调了5至8倍。
具体实施方式
定义
在本申请中，“一个/种(a、an)”用于指代单个和多个对象。
如本文所用，“约”或“基本上”通常提供受精确数字限制的余地。举例来说，如在多肽序列长度的上下文中所用，“约”或“基本上”表明所述多肽不限于所述氨基酸数目。只要存在功能活性，诸如其结合活性，就可以包括在N末端或C末端添加或减去的一些氨基酸。
如本文所用，“与一种或多种其他治疗剂组合”施用包括以任何顺序同时(并行)和连续施用。
如本文所用，“氨基酸”是指所有天然存在的L-α-氨基酸。该定义意在包括正亮氨酸、鸟氨酸和高半胱氨酸。
如本文所用，一般而言，术语“氨基酸序列变体”是指其氨基酸序列与参考(例如天然序列)多肽相比具有一些差异的分子。氨基酸变化可以是天然氨基酸序列中的取代、插入、缺失或任何期望的此类变化的组合。
取代变体是指去除了天然序列中至少一个氨基酸残基并在它的相同位置插入不同的氨基酸的变体。取代可以是单个的，其中分子中只有一个氨基酸被取代，或者它们可以是多个的，其中同一分子中有两个或更多个氨基酸被取代。
序列内氨基酸的取代物可以选自该氨基酸所属类别的其他成员。举例来说，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本发明范围内还包括表现出相同或相似生物活性的蛋白质或其片段或衍生物，以及在翻译过程中或之后经差异性修饰(例如通过糖基化、蛋白水解切割、连接到抗体分子或其他细胞配体等等)的衍生物。
插入变体是在紧邻天然氨基酸序列中特定位置的氨基酸处插入一个或多个氨基酸的变体。紧邻氨基酸意指与氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团相连。
缺失变体是去除了天然氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的变体。通常，缺失变体将在分子的特定区域中缺失一个或两个氨基酸。
如本文所用，“片段”或“功能衍生物”是指本发明多肽的生物活性氨基酸序列变体和片段，以及共价修饰，包括通过与有机衍生剂反应获得的衍生物、翻译后修饰、具有非蛋白质聚合物的衍生物和免疫粘附素。
如本文所用，“载体”包括在所采用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或哺乳动物无毒的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。通常，药学上可接受的载体是pH缓冲水溶液。药学上可接受的载体的实例包括但不限于缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂如聚乙二醇(PEG)和
如本文所用，术语“药学上可接受的载体和/或稀释剂”包括任何和全部溶剂、分散介质、包覆剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。用于药学活性物质的此类介质和试剂的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，预期将其用于治疗组合物中。补充性活性成分也可以并入组合物中。
为施用方便和剂量均匀配制剂量单位形式的肠胃外组合物是特别有利的。如本文所使用的剂量单位形式是指作为单一剂量适用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上分立的单元；每个单位含有预定量的活性物质，其经计算可与所需的药用载体结合以产生期望的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格由下述规定并且直接取决于下述：(a)活性物质的独特特征和待实现的特定治疗效果，和(b)混配此类活性物质以用于治疗患有身体健康受损的疾患的活受试者的疾病的领域内的固有限制。
混配主要活性成分以便以有效量与合适的药学上可接受的载体一起呈剂量单位形式方便且有效地施用。例如，单位剂型可以含有0.5μg至约2000mg范围内的量的主要活性化合物。以比例表示，活性化合物通常以约0.5μg/ml存在于载体中。在含有补充活性成分的组合物的情况下，剂量是通过参考所述成分的常用剂量和施用方式而确定的。
如本文所用，“载体”、“多核苷酸载体”、“构建体”和“多核苷酸构建体”在本文中可互换使用。本发明的多核苷酸载体可以呈几种形式中的任一种，包括但不限于RNA、DNA、包封在逆转录病毒外壳中的RNA、包封在腺病毒外壳中的DNA、被包装成另一种病毒或病毒样形式(诸如单纯疱疹和腺结构，诸如聚酰胺)的DNA。
如本文所用，“宿主细胞”包括可以是或已经是本发明载体的接受者的个别细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，并且该子代可能由于天然、偶然或故意突变和/或改变而未必与原始亲本细胞完全同一(在形态方面或在总DNA补体方面)。
如本文所用，“受试者”是脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。
如本文所用，用于治疗目的的“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农场动物，以及动物园动物、体育动物或宠物动物，如狗、猫、牛、马、羊、猪等等。优选地，哺乳动物是人。
如本文所用，“治疗”是用于获得有益或所需的临床结果的途径。出于本发明的目的，有益的或所需的临床结果包括但不限于症状的缓减、疾病程度的缩减、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分缓解或是全部缓解)，无论它们是可检测的或是不可检测的。“治疗”还可意指与未接受治疗时预期的存活期相比延长存活期。“治疗”是指治疗性治疗与防治性或预防性措施两者。需要治疗的那些包括已经患有所述病症的那些以及需要预防所述病症的那些。“缓和”疾病意指与未治疗的情况相比，疾病状态的程度和/或不希望的临床表现被减低并且/或者进展的时程被减缓或延长。
如本文所用，“A1”肽、“A2”肽、“B1”肽、“B2”肽和“B3”肽是指结合至人NME7AB但不(或显著更少)结合至人NME1的肽。用于产生这些抗体的肽对NME7AB和NME7-X1都是通用的，并且如下所示。
A1是NME7A肽1(A结构域)：MLSRKEALDFHVDHQS(SEQ ID NO:141)
A2是NME7A肽2(A结构域)：SGVARTDASES(SEQ ID NO:142)
B1是NME7B肽1(B结构域)：DAGFEISAMQMFNMDRVNVE(SEQ ID NO:143)
B2是NME7B肽2(B结构域)：EVYKGVVTEYHDMVTE(SEQ ID NO:144)
B3是NME7B肽3(B结构域)：AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(SEQ ID NO:145)
此外，为了清楚起见，NME7A(带有大写字母“A”)是指NME7的亚单元A部分。NME7a(带有小写字母“a”)是指本申请中其他部分描述的全长NME7。而且，NME7B(带有大写字母“B”)是指NME7的亚单元B部分。NME7b(带有小写字母“b”)是指部分缺乏DM10区域的NME7种类，它在本申请的其他部分进行了描述。
如本文所用，术语“抗体样”意指可以经工程改造以使它含有抗体的部分但不是自然界中天然存在的抗体的分子。实例包括但不限于CAR(嵌合抗原受体)T细胞技术和技术。CAR技术使用与T细胞的一部分融合的抗体表位，以使得身体的免疫系统定向攻击特定的靶蛋白或细胞。/>技术由“抗体样”文库组成，所述“抗体样”文库是合成人fab的集合体，然后针对与来自靶蛋白的肽表位的结合对所述人fab进行筛检。然后可以将所选的Fab区工程改造到支架或框架中，以使它们类似于抗体。
如本文所用，“抑制NME家族成员蛋白的剂的有效量”是指阻碍NME家族成员蛋白与其同源受体诸如之间的激活相互作用的剂的有效量。
如本文所用，“NME衍生片段”是指作为NME片段或与作为NME片段的肽序列高度同源的肽序列。
如本文所用，“MUC1*”胞外结构域主要由PSMGFR序列(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6))定义。因为MUC1切割的确切位点取决于剪切它的酶，而且切割酶因细胞类型、组织类型或细胞进化时间而各异，所以MUC1*胞外结构域的确切序列可能会在N末端有所不同。
如本文所用，术语“PSMGFR”是如GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6)所示的MUC1生长因子受体一级序列的首字母缩写。就此而言，“N-编号”如“N-10PSMGFR”或简写为“N-10”、“N-15PSMGFR”或简写为“N-15”、或者“N-20PSMGFR”或简写为“N-20”是指PSMGFR在N末端缺失的氨基酸残基的数目。同样，“C-编号”如“C-10PSMGFR”或简写为“C-10”、“C-15PSMGFR”或简写为“C-15”、或者“C-20PSMGFR”或简写为“C-20”是指PSMGFR在C末端缺失的氨基酸残基的数目。缺失和添加的混合物也是有可能的。举例来说，N+20/C-27是指野生型MUC1的肽片段，其中PSMGFR在N末端添加20个氨基酸并且在C末端缺失27个氨基酸。
如本文所用，“MUC1*的胞外结构域”是指缺乏串联重复结构域的MUC1蛋白胞外部分。在大部分情况下，MUC1*是一种切割产物，其中MUC1*部分由一个没有串联重复的短胞外结构域、一个跨膜域和一个胞质尾组成。尚不清楚MUC1的确切切割位置，可能是因为它似乎可以被不止一种酶切割。MUC1*的胞外结构域将包括大部分PSMGFR序列，但可能有额外的10-20个N末端氨基酸。
如本文所用，“高同源性”被认为是任两种多肽之间的指定重叠区域中具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％同一性。
如本文所用，编号1-10的“NME家族蛋白”或“NME家族成员蛋白”是组合在一起的蛋白质，因为它们都具有至少一个NDPK(二磷酸核苷激酶)结构域。在一些情况下，NDPK结构域就能够催化ATP转化为ADP而言不具功能性。NME蛋白以前称为NM23蛋白，编号为H1和H2。最近，已经鉴定了多达十(10)个NME家族成员。在本文中，术语NM23和NME可互换。在本文中，术语NME1、NME2、NME5、NME6、NME7、NME8和NME9用于指代天然蛋白质以及NME变体。在某些情况下，这些变体更易溶，在大肠杆菌中表达更好，或者比天然序列蛋白更易溶。举例来说，如本说明书中使用的NME7可能意指天然蛋白质或变体，诸如具有优越商业适用性的NME7AB，因为变异允许在大肠杆菌中高产率表达正确折叠的可溶性蛋白质。NME7AB主要由NME7 A和B结构域组成，但缺乏位于天然蛋白质N端末的大部分DM10结构域(SEQ ID NO:39)。本文所指的“NME1”与“NM23-H1”可互换。还意图本发明不受NME蛋白质的确切序列限制。突变体NME1-S120G，也称为NM23-S120G，在整个本申请中均可互换使用。S120G突变体和P96S突变体是优选的，因为它们偏好二聚体形成，但在本文可称为NM23二聚体、NME1二聚体、或者二聚NME1或二聚NM23。
如本文所提及的NME7意图指具有约42kDa分子量的天然NME7。
“NME7家族”是指全长NME7以及约30kDa、33kDa分子量的天然存在或人工产生的切割形式，或者约25kDa分子量的切割形式、缺乏或部分缺乏DM10前导序列(SEQ ID NO:162)的变体，即SEQ ID NO:82或147所表示的NME7的NME7氨基酸1-91，诸如NME7b、NME7-X1、NME7AB或重组NME7蛋白，或其变体，可以改变它们的序列以允许有效表达或增加产量、溶解度或使NME7更有效或在商业上更可行的其他特征。“NME7家族”还可以包括“NME7AB样”蛋白，它是在癌细胞中表达的30至33kDa范围内的蛋白质。
如本文所用，“维持干细胞处于初始状态或使始发态干细胞恢复初始状态的剂”是指单独或组合地维持干细胞处于初始状态，从而类似于胚胎内细胞团的细胞的蛋白质、小分子或核酸。实例包括但不限于人NME1二聚体、细菌、真菌、酵母、病毒或寄生虫NME蛋白，它们与人NME蛋白具有高度序列同一性，尤其是NME1、NME7、NME7-X1、NME7AB、NME6、2i(Silva J等人，2008；Hanna等人，2010)、5i(Theunissen TW等人，2014)、抑制MBD3、CHD4(Rais Y1等人，2013)、BRD4或JMJD6(Liu W等人，2013)表达的核酸，诸如siRNA。
如本文所用，术语“NME7AB”、“NME7AB”和“NME-AB”可互换使用。
如本文所用，“促进多能性的剂”或“使体细胞恢复干细胞样或癌症样状态的剂”是指单独或组合地诱导或抑制某些基因的表达，使得遗传特征转变为更类似于干细胞或癌细胞的遗传特征的蛋白质、小分子或核酸。实例包括但不限于NME1二聚体、NME7、NME7-X1、NME7AB、2i、5i，抑制MBD3、CHD4、BRD4或JMJD6表达的核酸(诸如siRNA)，与人NME1、NME2、NME5、NME6、NME7、NME8或NME9、优选与涵盖NDPK结构域的区域具有高度序列同源性的微生物NME蛋白。
如本文所用，关于被称为“小分子”的剂，它可以是合成的化学或化学为主的分子，其分子量在50Da和2000Da之间，更优选在150Da和1000Da之间，还更优选在200Da和750Da之间。
如本文所用，关于被称为“天然产物”的剂，它可以是化学分子或生物分子，只要该分子存在于自然界中即可。
如本文所用，FGF、FGF-2或bFGF是指成纤维细胞生长因子(Xu RH等人，2005；Xu C等人，2005)。
如本文所用，“rho相关激酶抑制剂”可以是小分子、肽或蛋白质(Rath N等人，2012)。rho激酶抑制剂在此处和其他部分缩写为ROCi或ROCKi或Ri。具体rho激酶抑制剂的使用意在为示例性的，并且可以替代任何其他rho激酶抑制剂。
如本文所用，术语“癌症干细胞”或“肿瘤起始细胞”是指表达与更具转移性状态或更具侵袭性癌症相关的基因水平的癌细胞。术语“癌症干细胞”或“肿瘤起始细胞”还可以指当移植到动物体内时产生肿瘤需要的细胞少得多的癌细胞。癌症干细胞和肿瘤起始细胞通常对化疗药物具有抗性。
如本文所用，术语“干细胞/癌”、“癌样”、“干细胞样”是指细胞获得干细胞或癌细胞的特征、共用干细胞、癌细胞或癌症干细胞的基因表达谱的重要要素的状态。干细胞样细胞可以是经历诱导达到较不成熟状态，诸如增加多能性基因表达的体细胞。干细胞样细胞还指已经经历了一定程度的去分化或处于亚稳定状态，从此它们可以改变其终末分化的细胞。癌样细胞可以是尚未完全表征但呈现出癌细胞的形态和特征，诸如能够非锚定依赖性地生长或能够在动物体内产生肿瘤的癌细胞。
如本文所用，不同长度的“间隔基”或“接头”可以并入肽中的任一处。间隔基连接通常通过酰胺连键，但其他官能团也是可能的。
NME、NME7和NME7蛋白质家族
本发明人发现NME7和NME7-X1在早期人类干细胞还有大部分癌细胞中高度表达(图17、图18、图19A至图19F、图22、图23、图39、图40、图41、图47、图48)。图17示出了一组人干细胞和癌细胞中的NME7-X1表达的RT-PCR测量图。图18示出了一组人干细胞和癌细胞中的NME7、NME7a、NME7b和NME7-X1表达的RT-PCR测量图。NME7a是全长NME7，NME7b缺失了DM10结构域的一小部分，NME7-X1缺失了所有DM10结构域和第一NDPK A结构域N末端的一小部分。标记为NME7的条柱意指使用了可检测NME7a和NME7b两者的引物。图19A至图19F示出了蛋白质印迹照片，其中使用通过用NME7衍生的短肽进行免疫产生的抗体来探测各种癌细胞系中NME7种类的表达。图19A示出了用结合NME7衍生肽A1的本发明抗体#52探测的蛋白质印迹。图19B示出了用结合NME7衍生肽B1的本发明抗体#56探测的蛋白质印迹。图19C示出了用结合NME7衍生肽B3的本发明抗体#61探测的蛋白质印迹。图22A至图22E示出了免疫共沉淀实验的蛋白质印迹照片。将T47D乳腺癌细胞提取物与针对MUC1胞质尾的抗体Ab-5或对照抗体IgG一起孵育，并进行免疫共沉淀。用两种不同的市售抗NME7抗体B9(图22A)和CF7(图22B)对凝胶进行印迹。两个凝胶都示出了在约33kDa和约30kDa处的独特NME7条带。剥下凝胶并且用针对MUC1*胞外结构域的抗体抗PSMGFR(图22C)和(图22D)重新探测，由此证明了NME7物质和MUC1*相互作用。将重组NME7-AB和重组NME7-X1混合在一起并且在凝胶上跑胶，然后用抗NME7抗体进行探测，证明了天然存在于乳腺癌细胞中并且与MUC1*相互作用的两种独特NME7种类是NME7-AB样种类和NME7-X1(图22E)。图23A至图23C示出了免疫共沉淀实验的蛋白质印迹照片。将人诱导多能干细胞iPS7或胚胎干细胞HES3细胞提取物与针对MUC1胞质尾的抗体Ab-5或对照抗体IgG一起孵育，并进行免疫共沉淀。用市售抗NME7抗体B9对凝胶进行印迹(图23A)。两种细胞类型都示出了在约33kDa和约30kDa处的独特NME7条带。剥下凝胶并且用针对MUC1*胞外结构域的抗体抗PSMGFR(图23B)重新探测，由此证明了NME7种类和MUC1*相互作用。将重组NME7-AB和重组NME7-X1混合在一起并且在凝胶上跑胶，然后用抗NME7抗体进行探测，证明了天然存在于乳腺癌细胞中并且与MUC1*相互作用的两种独特NME7种类是NME7-AB样种类和NME7-X1(图23C)。图39A至图39C示出了用结合B3肽的抗NME7抗体染色的人肺组织样本。该图示出了正常组织上缺乏NME7表达，NME7表达随着肿瘤等级和转移增加而增加。图40A至图40C示出了用结合B3肽的抗NME7抗体染色的人小肠组织样本。该图示出了正常组织上缺乏NME7表达，NME7表达随着肿瘤等级和转移增加而增加。图41A至图41D示出了用结合B3肽的抗NME7抗体染色的人结肠组织样本。该图示出了正常组织上缺乏NME7表达，NME7表达随着肿瘤等级和转移增加而增加。图47和图48示出的免疫荧光照片示出了NME7由多种癌细胞系的胞外受体分泌并与其结合。
此外，我们证明了与NM23-H1一样，NME7结合干细胞和癌细胞上的MUC1*生长因子受体并使其二聚(图1)。图5示出了NME1和NME7 A和B结构域的序列比对。
本发明人最近发现NME7是在极早期胚胎干细胞中表达的NME1的原始形式(NM23-H1)。NME7在成体组织中要么根本不表达，要么以极低的水平表达。然而，本发明人发现NME7在癌细胞和组织中以高水平表达，而且在转移性癌细胞和组织中以甚至更高的水平表达。NME7的切割形式可以是分泌形式，从而允许它结合并激活胞外受体。我们检测了MW 42kDa的全长NME7，以及大约33kDa和30kDa的NME7种类。33kDa和30kDa种类由癌细胞分泌。蛋白质印迹检测到了细胞溶解物中的全长NME7，但在其条件培养基中检测到了较小的30-33kDaNME7种类。用识别NME7的抗体或仅识别DM10结构域的抗体探测的蛋白质印迹表明，分泌到条件培养基中的低分子量NME7种类缺乏DM10结构域。这些数据与天然存在的NME7种类跟我们产生的重组NME7AB相当的观点一致，因为它们具有几乎相同的分子量，两者都是分泌的，并且都缺乏DM10结构域的91个氨基酸，这可能会保持蛋白质留在细胞内。
我们发现了一种新的NME7同种型NME7-X1，并且还发现它在干细胞和癌细胞中过度表达，特别是在前列腺癌中过度表达(图17、图18、图19和图22)。分子量约30kDa的NME7-X1包含NME7氨基酸125-376，而我们产生的分子量约33kDa的重组NME7AB跨越氨基酸92-376，因此包括33个以上N末端氨基酸。NME7b跨越氨基酸37-376并且仅缺乏DM10结构域的37个氨基酸，在前列腺癌中也过度表达(图18)。我们产生了人重组NME7-X1，并证明它是癌细胞中分泌的30kDa NME7种类，其运行速度正好低于天然存在的约33kDa NME7种类，后者似乎是一种天然存在的“NME7AB样”蛋白，是一种切割产物或替代同种型。
我们测试了一组癌细胞系，并且发现它们表达高水平的NME7和较低分子量物质，这些物质可能是类似于NME7AB的截短物，诸如NME7AB样蛋白，或替代同种型，诸如NME7-X1。
NM23-H1(又名NME1)必须是二聚体，而NME7是具有两个MUC1*胞外结构域结合位点的单体。我们产生了缺乏DM10结构域的重组人NME7，我们称之为NME7AB。夹心ELISA结合测定显示重组NME7AB同时结合两个PSMGFR肽，其中MUC1*的胞外结构域包括大部分或全部PSMGFR序列(图1)。在纳米颗粒结合测定中，NME7还显示能够结合MUC1*胞外结构域的PSMGFR部分并使其二聚。
禁用NME7、阻断其与其结合伴侣的相互作用或抑制其表达的剂是有效的抗癌治疗剂。此类剂可以是抗体、小分子或核酸。它们可以直接作用于NME7，作用于调节NME7表达的分子，或作用于将NME7切割成促癌形式的酶。
我们发现，与NM23-H1二聚体一样，重组NME7AB单体完全能够在没有任何其他生长因子、细胞因子或血清的情况下支持多能人干细胞生长。竞争性抑制NME7和本质上由PSMGFR序列构成的MUC1*胞外结构域之间的相互作用诱导了干细胞分化，证明了正是NME7和MUC1*的相互作用促进了干细胞生长并抑制了分化。
接下来，我们证明了单独的NME7AB也能够完全支持人癌细胞生长。NME7AB在加入到常规癌细胞生长培养基中时刺激了癌细胞生长，尤其是MUC1阳性和MUC1*阳性癌细胞的生长。抑制NME7与MUC1*的相互作用抑制了癌细胞生长。用抗MUC1*Fab阻断MUC1*生长因子受体有效地抑制了癌细胞生长。类似地，结合NME7的抗体抑制了癌细胞生长。在通过抗NME7抗体抑制癌症生长的一个实例中，多克隆抗体是通过用跨越氨基酸100-376的NME7部分使动物免疫而产生(图12和图13)。然而，我们发现用来自NME7AB或来自NME7-X1的较短肽进行免疫产生的抗体也能抑制癌症生长。具体来说，它们抑制了MUC1和MUC1*阳性癌症的生长。本发明的抗NME7抗体抑制了非贴壁“漂浮”细胞的形成，这些细胞能够形成肿瘤球并且可以从原发肿瘤移动并转移(图14、图16、图29)。本发明的抗NME7抗体抑制了转移性和干细胞标记物上调，现在认为这也是转移的特征(图15、图30、图31、图32)。
NME7导致癌症转移
本发明人还发现，在含有NME7AB的基本培养基中培养癌细胞诱导了多种癌细胞向更具转移性的状态转变。这种诱导的转移状态的证据包括从贴壁细胞生长变为非贴壁细胞生长(又名“漂浮”细胞)以及伴随特异性转移标记物上调，这些转移标记物尤其在漂浮细胞中上调。这些在NME7AB中培养后被上调的转移标记物包括但不限于CXCR4、CHD1又名E-钙粘蛋白、MUC1、ALDH1、CD44和多能干细胞标记物，诸如OCT4、SOX2、NANOG、KLF2/4、FOXa2、TBX3、ZEB2和c-Myc(图2、图3、图20、图49、图51)。在NME7AB中培养的癌细胞在异种移植到测试动物中时具有显著更高的植入率，超过90％。另外，极少量植入癌细胞在测试动物中形成肿瘤，这证明了NME7AB已经将它们转化成了癌症干细胞，也称为转移性癌细胞。与在常规培养基中生长的亲本细胞相比，在NME7AB中培养并注射到带有雌激素释放丸的NOD/SCID/GAMMA小鼠尾静脉中的癌细胞在动物体内从较少数目的细胞转移(图33至图38)。因为癌细胞会产生NME7切割产物或本质上与NME7AB等效的替代同种型，所以这里描述的方法不限于使用NME7AB；其他NME7种类也行。举例来说，我们发现了另一种NME7同种型NME7-X1由癌细胞表达。它与我们的重组NME7AB相同，但X1同种型从N末端缺失33个氨基酸。NME7-X1有望像NME7AB一样发挥功能。在癌细胞中还检测到了“NME7AB样”蛋白为约33Da的种类。
我们注意到，本发明人先前的工作证明了仅NME7AB能够将人干细胞恢复到早前的初始状态。我们发现在存在使干细胞恢复到更初始状态的其他试剂的情况下培养癌细胞会使癌细胞转变到更易转移的状态。我们证明了在NME7AB(图2)或在二聚NME1(图3)或“2i”抑制剂(图4)中培养癌细胞各自能够将常规癌细胞转化为转移性癌细胞，也称为癌症干细胞“CSC”或肿瘤起始细胞“TIC”。然而，NME7AB比NME1(也称为NM23-H1，优于2i)更好地诱导癌细胞进入更具转移性的状态。
2i是给与研究人员发现的两种生化抑制剂的名称，它们使人干细胞恢复到更初始的状态。2i是MEK和GSK3-β抑制剂PD0325901和CHIR99021，它们被加入到培养基中，分别达到最终浓度约1mM和3mM。NME7AB和NME7-X1在加入到不同批次的基本培养基时最终浓度为约4nM，以使癌细胞转化为转移细胞，但在约1nM到16nM范围内的较低和较高浓度也能很好地发挥作用。人或细菌NME1二聚体以最终浓度4nM至32nM使用，这些实验中通常使用16nM，其中人NME带有S120G突变。如果使用野生型，则可能需要较低浓度。预期这些确切浓度并不重要。重要的是NME1蛋白是二聚体，并且发生这种情况的浓度范围在低纳摩尔范围内，但某些突变允许更高的浓度以便保持呈二聚体形式。同样，NME7蛋白的浓度可能会有所不同。NME7AB和NME7-X1是单体，并且用于将癌细胞转化为转移细胞的浓度应当允许蛋白质保持呈单体形式。
其他人已经证明除了NME7、NME7AB、NME7-X1以及2i抑制剂MEKi和GSK3i以外，其他试剂和抑制剂也会导致干细胞恢复到更初始状态。这些抑制剂，“i”包括JNKi、p38i、PKCi、ROCKi、BMPi、BRAFi、SRCi以及生长因子激活和LIF(Gafni等人，2013；Chan等人，2013；Valamehr等人，2014；Ware等人，2014；Theunissen等人，2014)。这些试剂还可用于使癌细胞进展到更具转移性的状态。然后，已经使用任何单一因子或者使干细胞恢复到更初始状态的抑制剂或生长因子的组合诱导而转变为更具转移性状态的细胞可以用作发现工具来鉴定或测试用于治疗或防止癌症转移的药物。
已经提出了各种分子标记物作为转移癌细胞的指标。不同的癌症类型可能有不同的分子被上调。举例来说，受体CXCR4在转移性乳腺癌中被上调，而E-钙粘蛋白，也称为CHD1，在转移性前列腺癌中被上调更多。除了这些特异性转移标记物以外，典型多能性标记物如OCT4、SOX2、NANOG和KLF4也会随着癌症变成转移性的而被上调。通过PCR测定起始癌细胞和后来的转移癌细胞，以测量这些基因的表达水平。我们证明了这些癌细胞在诸如NME7AB等导致它们转化为更具转移性的状态(如转移标记物和多能干细胞标记物的表达增加所证明)的剂中培养，起到转移性癌细胞的作用。
癌细胞群是否具转移性的功能测试将在免疫受损的小鼠体内植入极低数量(例如200个)的细胞并观察它们是否会发展成肿瘤。通常需要5至6百万个癌细胞才能在免疫受损的小鼠中形成肿瘤。我们证明了仅仅50个NME诱导的转移性癌细胞就在小鼠体内形成了肿瘤。此外，在整个测试期间注射人NME7AB、NME1或NME7-X1的小鼠发生了远端转移。
在一项特定实验中，在标准RPMI培养基中培养T47D人乳腺癌细胞14天，每48小时更换培养基，并在约75％汇合时通过了胰蛋白酶消化。然后将细胞平铺到6孔板中，并在补充有4nM NME7AB的基本干细胞培养基(见实施例1)中培养。每48小时更换培养基。到约第4天，一些细胞从表面脱离并漂浮。小心地更换培养基以保留“漂浮物”，因为这些是具有最高转移潜能的细胞，如通过RT-PCR测量转移标记物所证明。在第7天或第8天，收集漂浮物并计数。保留样品以用于RT-PCR测量。测量的关键标记物是CXCR4，它在NME7AB中短暂培养之后被上调了40-200倍。
将新收集的漂浮转移细胞异种移植到已经植入了90天缓释雌激素丸的雌性nu/nu无胸腺小鼠的侧腹。漂浮细胞各自以10,000、1,000、100或50个细胞进行异种移植。每组6只小鼠有一半还在原始植入部位附近每天注射32nM NME7AB。还向小鼠植入6百万、10,000或100个在不含NME7AB的RPMI培养基中培养的亲本T47D细胞作为对照组。即使在仅仅植入了50个细胞时，植入NME7诱导的漂浮细胞的小鼠也会出现肿瘤。植入了漂浮细胞并且每天接受NME7AB注射的小鼠还在不同的器官中出现了远端肿瘤或远端转移。在植入NME7AB培养的癌细胞之后注射人NME7AB的12只小鼠中有11只(92％)在注射部位出现了肿瘤。在植入之后未注射人NME7AB的12只小鼠中只有7只(58％)出现了肿瘤。表现出肿瘤并注射了人NME7AB的11只小鼠中有9只或82％在远离注射部位处出现了多个肿瘤。未注射NME7AB的小鼠无一出现多发可见肿瘤。
处死之后，RT-PCR和蛋白质印迹表明注射了NME7AB的小鼠身上的远端肿块的确是人乳腺肿瘤。对其器官的类似分析表明，除了远端肿块以外，小鼠还随机转移到肝和肺，具有植入的人乳腺癌细胞的人乳腺癌特征。正如预期的那样，只有植入了6百万个细胞的小鼠长出了肿瘤。
我们已经证明了人重组NME7AB在大小和序列上与NME7-X1和30-33kDa NME7切割产物相当。我们已经证明了NME7AB促进癌症生长并导致癌细胞加速进入高转移性癌症干细胞(CSC)状态，也称为肿瘤起始细胞(TIC)。因此，我们得出结论，去除了DM10结构域的NME7-X1和NME7切割产物也促进癌症生长并导致癌细胞加速进入高转移性癌症干细胞(CSC)状态，也称为肿瘤起始细胞(TIC)。在一个实施例中，在无血清培养基中并且在不存在任何其他生长因子或细胞因子的情况下将NME7AB加入癌细胞。在7至10天内，癌细胞已经恢复为高转移性CSC/TIC，如通过作为转移性癌细胞的指标的分子标记物(如CXCR4)的表达增加了100倍以上所证明。在一个实施例中，在标准RPMI培养基或在加入了重组NME7AB至最终浓度为16nM的基本干细胞培养基(实施例1)中培养T47D乳腺癌细胞。10天之后收集细胞并通过RT-PCR分析CSC分子标记物的表达，这些标记物升高了10至200倍(图2)。这是我们如何将一种癌细胞类型转变为更具转移性状态的具体而详细的例子。不希望本发明受这些细节限制，因为有多种癌细胞以这种方式转化，多种试剂使干细胞恢复到更初始状态，还使癌细胞进展到更易转移状态，以及多种浓度的加入试剂使癌细胞转化。其他类型的癌细胞需要在NME7AB中培养更长时间段，才能显著上调转移标记物以及能够由植入的极少数目的癌细胞形成肿瘤。举例来说，在与人NME1或人NME7具有高度同源性的NME7AB、2i、人NME1或细菌NME1中培养的前列腺癌细胞在2-3次传代之后显示出转移标记物显著增加。
转移标记物CXCR4在转移性乳腺癌细胞中尤其升高，而CHD1在转移性前列腺癌中尤其升高。这里，我们证明了当癌细胞转化为更具转移性的细胞时，多能干细胞标记物如OCT4、SOX2、NANOG、KLF2/4和TBX3也被上调。
以类似方式培养的DU145前列腺癌细胞和在NME7AB中培养的那些细胞也显示CSC标记物的表达显著增加(图3)。在前列腺癌细胞中，与未在NME7AB中生长的对照癌细胞以及其他多能干细胞标记物相比，CHD1(又名E-钙粘蛋白)和CXCR4被上调。图20A至图20C示出了卵巢癌细胞系SK-OV3、OV-90和乳腺癌细胞系MDA-MB在与NME7AB一起培养72或144小时之后都从贴壁细胞转变为非贴壁漂浮细胞并且转移标记物的表达有所增加。卵巢、前列腺、胰腺癌细胞和黑色素瘤细胞也在NME7AB中进行培养，并且在培养仅仅3天之后就转化到更具转移性的状态。图21示出了乳腺、卵巢、前列腺、胰腺癌细胞和黑素瘤细胞表达MUC1和MUC1*。
这里，我们已经证明NME7AB将多种癌细胞转化到更具转移性的状态。我们还证明了癌细胞表达天然存在的物质，其分子量与重组NME7AB 33kDa的分子量大致相同(图17、图18、图19和图22，而且还缺乏像NME7AB那样的DM10结构域，而且还表达替代同种型NME7-X130kDa，后者与NME7AB的序列相同，但在N末端缺失33个氨基酸。对T47D乳腺癌细胞进行免疫共沉淀实验，其中将细胞提取物与针对MUC1胞质尾的抗体Ab-5或对照抗体IgG一起孵育，并进行免疫共沉淀。通过凝胶电泳分离免疫沉淀物质。用两种不同的市售抗NME7抗体对凝胶进行印迹。两个凝胶都示出了在约33kDa和约30kDa处的独特NME7条带(图22A至图22B)。剥下凝胶并且用针对MUC1*胞外结构域的抗体抗PSMGFR(图22C至图22D)重新探测，由此证明了NME7种类和MUC1*相互作用。将我们制造的重组NME7AB和重组NME7-X1混合在一起并且在凝胶上跑胶，然后用抗NME7抗体进行探测，证明了天然存在于乳腺癌细胞中并且与MUC1*相互作用的两种独特NME7种类是NME7AB样种类和NME7-X1(图22E)。在人干细胞中进行了类似实验。图23A至图23C示出了免疫共沉淀实验的蛋白质印迹照片。将人诱导多能干细胞iPS7或胚胎干细胞HES3细胞提取物与针对MUC1胞质尾的抗体Ab-5或对照抗体IgG一起孵育，并进行免疫共沉淀。用市售抗NME7抗体B9对凝胶进行印迹(图23A)。两种细胞类型都示出了在约33kDa和约30kDa处的独特NME7条带。剥下凝胶并且用针对MUC1*胞外结构域的抗体抗PSMGFR(图23B)重新探测，由此证明了NME7种类和MUC1*相互作用。将我们制造的重组NME7AB和重组NME7-X1混合在一起并且在凝胶上跑胶，然后用抗NME7抗体进行探测，证明了天然存在于乳腺癌细胞中并且与MUC1*相互作用的两种独特NME7种类是NME7AB样种类和NME7-X1(图23C)。因为NME7AB是重组蛋白，所以我们不知道与重组NME7AB相比，天然存在的种类是否可能含有额外的1-15个额外氨基酸或缺乏1-15个额外氨基酸，但仍以相同的表观分子量运作。“NME7AB样”意指表观分子量为约33kDa的NME7种类，其能够以重组NME7AB的方式发挥作用，因为它能够刺激癌细胞生长，诱导癌细胞向更具转移性的状态转变，并且能够完全支持人干细胞的多能生长。
我们得出结论，表达NME7和较低分子量NME7种类的癌细胞系和癌细胞群含有一些癌细胞，它们是CSC或转移性癌细胞。通过在NME7AB、NME7-X1或较低分子量NME7种类中培养细胞，可以使这些癌症更具转移性或增加转移性细胞群。图19示出了一组全部表达NME7以及33kDa低分子量NME7AB样种类和30kDa NME7-X1的癌细胞的蛋白质印迹。图21示出了癌细胞系T47D乳腺癌、PC3和DU145前列腺癌、BT-474乳腺癌、CHL-1和A2058两种黑色素瘤细胞系以及CAPAN-2和PANC-1两种胰腺细胞系都表达MUC1和MUC1*。在图21A中，BT474细胞似乎不表达MUC1或MUC1*，然而，我们之前证明了(Fessler等人，2009)当这些HER2阳性乳腺癌细胞对化疗药物有抗性时，即具有转移性时，它们是通过增加MUC1*表达来实现(图21D)。用抗MUC1*Fab阻断MUC1*受体逆转了它们对赫赛汀(图21E)、紫杉醇(图21F)以及其他化疗剂的抗性。通过在NME7AB、NME7-X1或较低分子量NME7种类中培养细胞，可以使这些癌症类型和其他表达NME7和较低分子量NME7种类(诸如33kDa、30kDa)的癌症类型更具转移性或增加转移性细胞群。
相反，可以通过用抗NME7抗体处理细胞来逆转这些和其他表达NME7和较低分子量NME7种类(诸如33kDa或30kDa)的癌症类型的转移潜能。将抗NME7抗体或者结合NME7AB或NME7-X1的抗体施用至患者以用于治疗或预防癌症，包括乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌和肝癌。因为我们已经证明了NME7AB通过结合并激活MUC1*生长因子受体发挥其致瘤作用，所以抗NME7抗体将对抗任何MUC1*阳性癌症有效，包括但不限于乳腺癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、胃结直肠癌、前列腺癌、脑癌、黑色素瘤、肾癌等等。向患者施用抗NME7、抗NME7AB或抗NME7-X1抗体以用于治疗或预防NME7AB、NME7AB样或NME7-X1阳性或MUC1*阳性癌症。
测试患者癌细胞的有效疗法
NME7AB、NME7-X1以及2i和其他使干细胞恢复到更初始状态的试剂也会诱导癌细胞向更具转移性的状态转变。用这些试剂中的任一种或组合处理后，癌细胞具有更高植入率，并且导致在测试动物中形成肿瘤所需的细胞减少了多达100,000倍。因此，可以使用本公开中描述的方法使得能够将患者的原发肿瘤细胞异种移植到测试动物中。
然后可以对受体动物测试候选治疗剂。以这种方式鉴定的有效治疗剂可以用于治疗供体患者或其他患有类似癌症的患者。在一个实施方案中，鉴定特定患者或特定癌症类型的有效治疗剂的方法包括以下步骤：1)从细胞系、患者或将施用测试治疗剂的患者获得癌细胞；2)在NME7AB、NME7-X1、人NME1、与人NME1或NME7具有高度同源性的细菌NME1、2i或其他被证明可使干细胞恢复到更初始状态的试剂中培养癌细胞；3)将所得癌细胞植入测试动物中，还可以对其施用人NME7AB、NME7-X1、人NME1、与人NME1或NME7具有高度同源性的细菌NME1、2i或其他被证明可使干细胞恢复到更初始状态的试剂，或动物是人NME7AB或NME7-X1的转基因动物；4)向动物施用候选抗癌治疗剂；5)评估治疗剂的功效；以及6)对供体患者或另一患有类似癌症的患者施用有效的治疗剂。
抗NME7抗体
抗NME7抗体是有效的抗癌剂。NME7是一种生长因子，它促进癌细胞生长，而且还促进它们进展到更具转移性的状态或更具侵袭性的状态。NME7和约33kDa或30kDa的NME7截短形式已经被证明完全支持癌症生长，即使在缺乏任何其他生长因子或细胞因子的无血清培养基中也是如此。在拉下测定(pull-down assay)、ELISA和纳米颗粒结合实验中，我们已经证明了生长因子受体MUC1*是NME7和NME7AB的结合伴侣。通过消除所有其他生长因子或细胞因子来促进这种相互作用，增加了癌症干细胞标记物的表达。即使在存在血清的情况下使用特异性结合NME7的多克隆抗体阻断这种相互作用也能主动杀死癌细胞。因此，抗NME7或抗NME7AB抗体是有效的抗癌剂，可以施用于患者以治疗或预防癌症。所有癌症中超过75％是MUC1*阳性的。MUC1*是MUC1的跨膜切割产物，其中大部分胞外结构域已经脱落，留下含有大部分PSMGFR序列并且可能在PSMGFR序列边界的N末端含有9至20个额外氨基酸的胞外结构域部分。
本发明的一个方面是治疗或预防受试者的癌症的方法，包括向受试者施用有效量的抗NME7抗体。在一种情况下，抗NME7抗体能够结合NME7AB。在另一种情况下，抗NME7抗体能够结合NME7-X1。在又一种情况下，施用于患者的抗NME7抗体抑制或阻止它与它的靶标结合以促进癌症。在一种情况下，靶标是切割MUC1的胞外结构域。更具来说，促进癌症的NME7靶标是MUC1*胞外结构域的PSMGFR区。在一个方面，有效的治疗剂是破坏或阻止NME7种类与主要由MUC1*的PSMGFR部分或PSMGFR肽组成的MUC1*胞外结构域之间的相互作用的治疗剂。用于治疗或预防癌症的剂是直接或间接抑制NME7、NME7AB样切割产物或替代同种型(包括NME7-X1)的表达或功能的那些剂。在一种情况下，有效的抗癌治疗剂是结合NME7种类或禁用其致瘤活性的剂。用于治疗或预防癌症的有效治疗剂是结合或禁用NME7、NME7AB样切割产物或替代同种型或NME7-X1的剂。在一个方面，结合NME7种类的治疗剂是抗体。抗体可以是多克隆的、单克隆的、双特异性的、二价的、单价的、单链的、scFv，或者可能是动物来源、人-动物嵌合体、人源化或人的抗体模拟物。抗体可以通过用NME7种类或其片段接种或免疫来产生，或者例如针对其结合NME7种类，包括NME7、NME7AB样切割产物或替代同种型，包括NME7-X1的能力从抗体的文库或库中选择。
抗NME7抗体的产生
抗NME7抗体可以在患者体外(诸如在宿主动物中)或患者体内产生。抗体可以通过NME7或NME7片段的免疫来产生，或者基于其结合所期望的NME7种类(诸如NME7AB或NME7-X1)的能力从可能是天然的、合成的、完整的或抗体片段的抗体的文库或库中选择。在一个方面，抗体是通过免疫产生，或因其结合从图6至图9中所列出的那些肽中选出的肽的能力而被选择。在另一个方面，抗体是由序列与人NME1的序列不同一的肽产生，或者抗体是因其结合NME7种类的能力和它们无结合人NME1的能力而被选择。
一种用于鉴定能产生可抑制癌症生长和抑制向转移转变的抗体的NME7或NME7-X1衍生肽或本身具有抑制性的肽的方法如下：1)对人NME1、人NME7、人NME7-X1和几种与人NME1或人NME7具有高序列同源性的细菌或真菌NME蛋白的蛋白序列进行比对；2)鉴定所有NME之间具有高序列同源性的区域；3)鉴定NME7或NME7-X1独有但侧接高序列同源性区域的肽序列。然后合成肽并用于在人类或宿主动物中产生抗体。在以下情况下选择所得抗体用于治疗用途：1)它们结合NME7AB或NME7-X1，但不结合NME1；2)能够抑制癌症生长；3)能够抑制癌细胞向更具转移性的状态转变；或4)抑制体内转移。在一些情况下，用于治疗用途的抗体因其破坏NME7AB或NME7-X1与MUC1*胞外结构域、PSMGFR肽或N-10肽结合的能力而被选择。
抗NME7抗体用于治疗癌症的用途
抑制癌症生长或向更具转移性的状态转变的那些抗体被选择用作抗癌治疗剂并且可以施用给患者以治疗或预防癌症。例如，可以通过工程改造或制造人嵌合抗体或完全人抗体来进一步优化所选抗体。为了证明这种方法的功效，我们从疑似对其癌功能至关重要的NME7区域中选择了NME7肽。然后，我们使用这些肽产生抗体，然后测试所得抗体以及免疫肽的以下能力：a)抑制癌症生长；b)抑制癌细胞向转移性癌细胞的诱导转变。选择NME7肽作为用于抗体产生的免疫剂和作为抑制剂本身(图9，实施例7)。肽A1(SEQ ID NO:141)、A2(SEQ ID NO:142)、B1(SEQ ID NO:143)、B2(SEQ ID NO:144)和B3(SEQ ID NO:145)，其中A是指肽所衍生的结构域，即NDPK A结构域，而B表示肽衍生自NDPK B结构域(图5)。使用各肽作为免疫原，并各自注射到2只兔子中以产生多克隆抗体。从免疫过的兔子的血液中收集的抗体在用免疫肽衍生过的柱上进行纯化。然后测试纯化过的抗体结合人NME7的能力。所得抗体都根据需要与人NME7结合，但不结合人NME1(图10A至图10B，实施例8)。这些结果表明，通过选择序列见于NME7中但与NME1中不完全同一的肽，可以产生特异性结合NME7但不结合NME1的抗体。因为NME1具有健康功能，因此在大部分情况下需要产生不干扰NME1的抗体。还测试了抗体抑制NME7结合MUC1*胞外结构域肽的能力。图11中所示的ELISA实验表明，抗体抑制NME7AB与MUC1*胞外结构域肽结合远超过它们抑制NME1的结合。回想一下，NME7 A结构域和B结构域各自都可以结合PSMGFR肽。因此，完全抑制NME7AB与PSMGFR肽结合不能用单一抗体或源自于仅一个结构域的肽来实现。这些抗体及其各自的免疫肽还抑制癌细胞生长(图12至图13)。这些抗体还抑制了由在NME7AB中生长癌细胞产生的非贴壁“漂浮”细胞的形成(图14)。如图中可见，通过用B3肽免疫产生的多克隆抗体使转移性漂浮细胞的数量减少了95％，表明结合B3肽的抗NME7抗体在抑制癌症转移方面最有效。类似地，抗体抑制转移标记物CXCR4的表达(图15A)。另外，B3抗体在抑制CXCR4表达方面最有效；标记为NME7 FL(NME7漂浮细胞)的条形示出了CXCR4增加了70倍，而B3抗体61减少到20倍(标记为NME7+61FL的条形)。此外，当T47D癌细胞在NME7AB或2i中生长时，免疫肽本身抑制了CXCR4和其他转移标记物上调。
这只是选择能产生抑制NME7和NME7种类的癌功能的抗体的肽的一个实例。人NME1、人NME7、人NME7-X1和与人NME1或NME7具有高序列同源性的细菌NME蛋白之间的序列比对鉴定了五个同源性区域。肽A1、A2、B1、B2和B3都产生抑制癌症生长或它们向转移状态转变的抗体这一事实意味着衍生出这些肽的五个区域是NME7中对于其在促进癌症方面的功能很重要的区域。来自这些区域的其他肽也将产生抗NME7抗体，从而将抑制癌症生长和转移，并且因此是有效的抗癌治疗剂。由肽A1、A2、B1、B2和B3产生的抗体被证明可抑制癌症生长并抑制向更具转移性的状态转变。通过用相同或相似的肽进行免疫产生的单克隆抗体以及随后对单克隆进行测试将会鉴定出在人源化或本领域技术人员已知的其他工程改造之后将施用于患者以治疗或预防癌症的抗体。
在一个特定实验中，将通过用肽A1、A2、B1、B2和B3进行免疫产生的抗体以及免疫肽本身加入培养中的癌细胞，看看加入抗体或免疫肽是否将会抑制癌细胞生长。在低浓度和单独加入时，抗体以及免疫肽抑制癌细胞生长(图12是一个实例)。然而，当以更高浓度加入或组合时，抗体以及免疫肽强烈抑制癌细胞生长(图13)。免疫肽A1、A2、B1、B2和B3的相应人NME7氨基酸编号分别是具有SEQ ID NO:82或147的人全长NME7的127-142、181-191、263-282、287-301、343-371。
为了清楚起见，当讨论NME7的残基编号时，它们是指SEQ ID NO:82或147中所示的NME7的残基编号。
癌症生长抑制实验中使用的抗体和图12中所示的抗体之一是通过用对应于NME7(SEQ ID NO:82或147)的氨基酸100-376的NME7肽进行免疫而产生的。为了产生更高亲和力和特异性的抗NME7抗体，遵循以下步骤：用含有人NME7氨基酸100-376的肽使动物免疫，然后：1)取消选择结合人NME1的那些抗体；2)选择抑制NME7AB、2i或诱导癌细胞向更具转移性的状态转变的其他NME的那些抗体；3)选择抑制癌细胞生长的那些抗体；4)选择抑制MUC1*阳性癌细胞生长的那些抗体；5)选择抑制NME7AB或NME7-X1与MUC1*胞外结构域结合，实质上抑制与PSMGFR肽结合的那些抗体；和/或6)选择结合图9中所列出的一种或多种肽，即A1、A2、B1、B2或B3肽的那些抗体。
由较长肽产生的较高亲和力单克隆抗体或单克隆抗体可能是更有效的抗体治疗剂。或者，向患者施用抗NME7、抗NME7AB或抗NME7-X1抗体的组合以增加功效。
抗NME7抗体抑制癌细胞向转移性癌细胞转变。
抗NME7抗体抑制癌细胞转变为转移性癌细胞，也称为癌症干细胞(CSC)或肿瘤起始细胞(TIC)。回想一下，我们已经证明了在存在NME7AB的情况下培养多种癌细胞会导致它们从常规癌细胞转变为转移性CSC或TIC。因此，结合NME7、NME7AB或NME7-X1的抗体将抑制癌细胞进展到更具转移性的状态。
当在存在使干细胞恢复到更初始状态的剂的情况下培养时，癌细胞向更具转移性的状态转化。我们已经证明了在NME7AB、人NME1二聚体、细菌NME1二聚体或MEK和GSK3-β抑制剂(称为“2i”)中培养癌细胞会导致细胞更具转移性。随着细胞向更具转移性的状态转变，它们变得不贴壁或不太贴壁，并浮出培养板。这些漂浮细胞“漂浮物”与贴壁细胞分开收集，并且被证明：a)表达更高水平的转移基因；和b)当以极低拷贝数异种移植到小鼠中时产生肿瘤。RT-PCR测量特异性转移标记物如乳腺癌的CXCR4、前列腺癌的CHD1和其他多能干细胞标记物(如OCT4、SOX2、NANOG、KLF4等等)在NME7AB中培养的癌细胞中显著过度表达，并且在变得非贴壁的细胞(这里和图中称为“漂浮物”)中最过度表达。
在一个实例中，将通过用NME7衍生肽A1、A2、B1、B2和B3以及免疫肽本身进行免疫而产生的NME7AB特异性抗体与NME7AB或2i一起加入培养基中，以确定它们是否抑制常规癌细胞向转移性癌症干细胞转变。将抗体和肽分别与引起转移性转化的剂(在这种情况下，是NME7AB或2i抑制剂PD0325901和CHIR99021)一起加入。NME7AB和2i分别用于诱导癌细胞转化到更具侵袭性的转移状态。使用2i，这样就不能辩称加入培养基中的抗体仅仅强化了所有的NME7AB，因此致病物实际上不存在(实施例10)。
在实验进行时，由两名科学家独立地记录目视观察结果(图14)。最引人注目的观察结果是所述抗体和肽显著减少了漂浮细胞的数量，这是所述抗体和肽抑制向转移性癌细胞转化的第一标志。具体来说，用B3肽免疫而产生抗体的细胞几乎不产生任何漂浮细胞。从漂浮细胞、贴壁细胞和对照癌细胞中提取mRNA。测量指示细胞活力和生长的mRNA的量。用抗体处理的细胞具有少得多的mRNA，表明活分裂细胞较少(图16)，这证实了抗NME7AB抗体抑制癌细胞生长以及它们向更具转移性的状态转变。使用RT-PCR测量转移标记物(包括CXCR4)的表达水平。用抗NME7抗体处理大大减少了转移标记物如CXCR4的量，表明抗NME7抗体或肽抑制向转移性癌症转变(图15A至图15C)。这些结果证明，结合NME7AB的抗体可以施用于患者以治疗或预防转移性癌症。
NME7AB或NME7-X1衍生的肽竞争性地抑制完整NME7AB和NME7-X1的结合，并且是抗癌剂。
在本发明的另一个方面，用于治疗或预防癌症的治疗剂是衍生自NME7序列的肽，将它们施用于患者以治疗或预防癌症。在一个方面，将NME7衍生肽施用于患者，使得应当比整个NME7短且不能赋予NME7致癌活性的肽结合至NME7的靶标并竞争性地抑制完整NME7与其靶标的相互作用，其中这类相互作用促进癌症。由于NME7AB完全能够赋予致癌活性，因此优选NME7AB的序列作为较短肽的来源，其中必须确认肽本身不能促进癌性生长或者其他致瘤或致癌活性。在一个优选实施方案中，向患者施用一种或多种具有NME7AB的一部分的序列并且长度优选为约12-56个氨基酸的肽。为了增加半衰期，肽可以是肽模拟物，诸如具有非天然骨架或D型氨基酸或L型的肽。在又一种情况下，抗癌治疗剂是肽或肽模拟物，其中肽具有与NME7、NME7AB或NME7-X1或其靶标MUC1*胞外结构域(其包含PSMGFR肽，本文在一些情况下也称为“FLR”)的至少一部分高度同源的序列。
图6至图9提供了据预测可抑制NME7与其同源靶标结合的优选氨基酸序列的列表。在一个更优选的实施方案中，被选择用于施用于患有癌症或有患癌症风险的患者的肽是因为它们结合NME7结合伴侣并且它们本身不赋予致瘤活性才被选择。在一个更优选的实施方案中，NME7结合伴侣是MUC1*的胞外结构域。在一个更优选的实施方案中，NME7结合伴侣是PSMGFR肽。
术语“赋予致瘤活性或致癌活性”意指肽本身不能支持或促进癌症生长。测试衍生自NME7的一种或多种肽是否可以促进肿瘤发生的另一种方式是测试所述肽是否可以支持人干细胞的多能生长。支持多能人干细胞生长的NME蛋白质和肽也支持癌症生长。在又一种方法中，如果肽可能导致体细胞恢复到不太成熟的状态，则取消选择它们。
NME7AB片段抑制癌细胞生长和癌细胞向更具转移性的状态转变。作为证明，单独(图12)或组合(图13)加入NME7肽A1、A2、B1、B2和B3抑制了癌细胞生长。此外，NME7肽A1、A2、B1、B2和B3抑制了癌细胞向更具转移性的状态转变(图15)。
因此，通过用对NME7具特异性且对NME7AB或NME7-X1具特异性的肽进行免疫而产生的抗体将阻断NME7种类的癌性作用，并且将成为有效的抗癌剂。类似地，这些结果表明对NME7具特异性且对NME7AB或NME7-X1具特异性的肽将阻断NME7种类的癌性作用。在本发明的一个方面，肽选自图6中所示的列表。在本发明的一个方面，肽选自图7中所示的列表。在本发明的一个方面，肽选自图8中所示的列表。在本发明的又一个方面，肽选自图9中所示的列表。这些抗体可能通过免疫产生，或者可能通过其他手段产生或选择，则因其结合NME7、NME7AB、NME7-X1或NME7衍生肽，包括但不限于NME7衍生肽A1(SEQ ID NO:141)、A2(SEQ IDNO:142)、B1(SEQ ID NO:143)、B2(SEQ ID NO:144)或B3(SEQ ID NO:145)的能力而被选择。此类抗体可以是多克隆的、单克隆的、双特异性的、二价的、单价的、单链的、scFv、人或人源化的，或者可以是抗体模拟物，诸如存在结合特异性靶标的识别区域的蛋白质支架。
用于治疗或预防癌症的抗NME7抗体可以通过本领域技术人员已知的标准方法产生，其中那些方法用于产生识别NME7、NME7AB或NME7AB的较短形式的抗体或抗体样分子，其中不存在形成N末端的额外10-25个氨基酸。此类抗体可以是人的或人源化的。此类抗体可以是多克隆的、单克隆的、双特异性的、二价的、单价的、单链的、scFv、人或人源化的，或者可以是抗体模拟物，诸如存在结合特异性靶标的识别区域的蛋白质支架。
通过用NME7衍生肽A1(SEQ ID NO:141)、A2(SEQ ID NO:142)、B1(SEQ ID NO:143)、B2(SEQ ID NO:144)或B3(SEQ ID NO:145)免疫生成的抗NME7抗体或结合A1、A2、B1、B2或B3肽的抗体是结合NME7AB和NME7-X1但抗拒结合对于一些健康细胞的功能来说可能需要的NME1的抗体。此类抗体抑制NME7AB或NME7-X1与其靶受体MUC1*结合。结合A1、A2、B1、B2或B3肽的抗体是可以施用于被诊断患有癌症或转移或者有癌症或转移风险的患者的抗体。此类抗体可以是人的或人源化的。此类抗体可以是多克隆的、单克隆的、双特异性的、二价的、单价的、单链的、scFv，或者可以是抗体模拟物，诸如存在结合特异性靶标的识别区域的蛋白质支架。
通过用B3肽或结合B3肽的抗体进行免疫而产生的抗NME7抗体对识别NME7AB和NME7-X1尤其具有特异性。此类抗体在抑制NME7AB或NME7-X1与其靶受体MUC1*结合方面也非常有效。结合B3肽的抗体在预防、抑制和逆转癌症或癌症转移方面也格外有效。此类抗体可以是人的或人源化的。此类抗体可以是多克隆的、单克隆的、双特异性的、二价的、单价的、单链的、scFv，或者可以是抗体模拟物，诸如存在结合特异性靶标的识别区域的蛋白质支架。
注意，在用B3肽免疫的兔子中产生的多克隆抗体#61抑制癌细胞向癌症干细胞转化，正如抗体#61阻断转移标记物CXCR4上调所证明(图15)。
衍生自NME7的B3肽(SEQ ID NO:145)在14位具有半胱氨酸，这使抗NME7抗体的产生复杂化。我们使半胱氨酸14突变为丝氨酸以制备AIFGKTKIQNAVHSTDLPEDGLLEVQYFF(SEQID NO:169)，并使动物免疫以产生抗NME7单克隆抗体。所得抗体结合天然B3序列以及B3Cys14Ser肽。产生了七(7)种高亲和力特异性单克隆抗体：8F9A5A1、8F9A4A3、5F3A5D4、5D9E2B11、5D9E10E4、5D9G2C4和8H5H5G4。然而，序列比对显示只有三(3)个独特序列抗体：8F9A5A1、8F9A4A3和5F3A5D4，如下所示。
重链比对
轻链比对
单克隆抗体5D9E2B11、5D9E10E4、5D9G2C4和8H5H5G4都具有与5F3A5D4(也称为5D4)相同的序列。这里，当我们提及抗体5F3A5D4，又名5D4时，应当理解它还适用于5D9E2B11、5D9E10E4、5D9G2C4和8H5H5G4。如图24和图25中可见，抗NME7抗体8F9A5A1、8F9A4A3和5F3A5D4均结合NME7AB但不结合NME1。这很重要，因为NME7的A结构域与正常细胞功能所需要的NME1具有高同源性。对于抗癌治疗剂或抗转移治疗剂，必须抑制NME7AB而不是NME1。
图26、图27和图28示出了这些抗NME7抗体还能够破坏NME7AB与MUC1*PSMGFR肽和N-10PSMGFR肽的结合。如可见，没有完全从MUC1*肽置换NME7AB。然而，回想一下，NME7AB包括一个A结构域和一个B结构域，各个结构域都能够结合MUC1*。这些抗体被设计成破坏B结构域与MUC1*的结合；NME7AB的A结构域将仍然能够结合板表面上的MUC1*肽。对于可用治疗剂，抗体将只需要破坏一个结构域与MUC1*的结合，为此将阻断配体诱导的二聚和MUC1*生长因子受体的激活。结合NME7 B3肽或B3Cys14Ser肽(SEQ ID NO:169)的抗体或抗体模拟物是可以施用于被诊断患有癌症或转移或者有癌症或转移风险的患者的抗体。
本领域内众所周知，很难在动物模型中使癌细胞转移。据估计，在人肿瘤中，只有约100,000分之一或甚至1,000,000分之一的癌细胞能够脱离肿瘤并植入其他处以启动转移[Al-Hajj等人，2003]。一些研究人员报告，注射到免疫受损小鼠体内的T47D乳腺癌细胞将在约12周之后转移[Harrell等人，2006]。其他研究人员报告，AsPC-1胰腺癌细胞将在约4周之后转移[Suzuki等人，2013]。
这里，我们示出了在含有重组NME7AB作为唯一生长因子的无血清培养基中生长10天的T47D乳腺癌细胞。据观察，当在NME7AB中生长时，约25％癌细胞开始漂浮、停止分裂但仍然是活的。PCR测量表明，这些“漂浮”细胞大大上调了乳腺癌转移因子CXCR4的表达。
在本文呈现的一些图中，这些漂浮细胞被称为癌症干细胞(CSC)。将免疫受损雌性nu/nu小鼠植入90天释放雌激素丸。将500,000个T47D-wt细胞或10,000个T47D-CSC(癌症干细胞)注射到nu/nu小鼠的尾静脉(i.v.)、皮下(s.c.)或腹膜内(i.p.)。对这些癌细胞进行工程改造以表达荧光素酶。为了观察肿瘤或癌细胞，给动物注射荧光素，然后10分钟后在IVIS仪器上观察。如图33A至图33B的IVIS测量可见，到第6天，注射到尾静脉中的500,000个T47D-wt细胞没有示出活癌细胞或癌细胞植入的迹象。
与此形成鲜明对比的是，注射到尾静脉中的10,000个T47D-CSC已经转移。在第6天IVIS测量之前，给T47D-CSC小鼠注射32nM重组NME7AB。第二天，给两只CSC小鼠中的一只注射抗NME7单克隆抗体8F9A5A1、8F9A4A3和5F3A5D4的混合液，体积为200uL，浓度对应于15mg/kg。几乎同时注射NME7AB和抗NME7抗体可能使抗体的作用无效。图34示出了到第10天，经过治疗的小鼠几乎完全转移。如图中可见，选择用于治疗的小鼠比相应的T47D-CSC小鼠具有更大转移性。
在第10天，给该动物再次注射抗NME7抗体。第12天的IVIS测量(图35)表明抗体治疗过的小鼠开始清除转移灶。到第14天(图36)，未治疗过的小鼠已经死于肆虐的转移，而治疗过的小鼠已经清除了转移。图37示出了注射了500,000个T47D-wt细胞的小鼠和注射了T47D-CSC且接受了抗NME7治疗的小鼠的IVIS测量的时程，直到第17天暂停抗体治疗。如可见，在第17天，仍有一小簇癌细胞，到第19天时已经长得更大。到第21天，转移灶已经扩散，并且恢复抗体治疗。如图所示，在恢复抗NME7抗体治疗之后，该动物清除了所有转移灶，并且没有表现出健康状况不佳的迹象。
图38示出了皮下或腹膜内注射的动物的IVIS时程。皮下或腹膜内注射CSC的动物的抗体注射还皮下或腹膜内注射了抗NME7抗体。在这些动物中，抗体注射在第17天停止并且没有恢复。图39至图40示出了通过用B3肽免疫产生的多克隆抗NME7抗体可染色晚期癌症和转移性癌症，但不能染色正常组织或低等级癌症，其中只有100,000分之一或1,000,000分之一癌细胞是转移性癌细胞。综上所述，这些数据表明，向被诊断患有癌症或有患癌症风险的患者施用抗NME7抗体8F9A5A1、8F9A4A3和5F3A5D4或8F9A5A1、或8F9A4A3或5F3A5D4将预防、抑制癌症转移的形成或逆转癌症转移。
除了用抗NME7AB抗体的混合液治疗转移性动物以外，我们还单独施用了单克隆抗NME7AB抗体，并且证明了它们能够预防以及逆转癌症转移。在一个示范中，将每只重约20g的雌性nu/nu小鼠在8-10周龄之间植入90天雌激素释放丸。通过在补充有生长因子NME7AB的无血清培养基中培养10-15天，使癌细胞具转移性。贴壁细胞和漂浮细胞均显示转移标记物上调，并且在动物中能够在4-7天内转移。在这种情况下，在体外培养的第11天收集漂浮细胞并注射到测试动物的尾静脉中。为了测试预防模型，在注射转移性癌细胞之前24小时，向一组动物的尾静脉中注射15mg/kg抗NME7AB抗体8F9A4A3，并且此后大约每48小时注射相同的剂量。图42A至图42F示出了雌性nu/nu小鼠的照片，它们经尾静脉内注射10,000个荧光素酶阳性T47D转移性乳腺癌干细胞并且用抗NME7AB抗体4A3(又称8F9A4A3)治疗。为了对癌细胞进行成像，经腹膜内注射荧光素酶底物荧光素，10分钟后在IVIS仪器中拍照。图42A至图42C示出了动物面向下的IVIS照片。图42D至图42F示出了动物面向上的IVIS照片。图42A和图42D示出了注射磷酸盐缓冲盐水溶液的对照动物。图42B和图42E示出了一种预防模型，其中在注射转移性癌细胞前24小时给动物注射抗NME7AB抗体4A3，然后大约每隔一天注射，在22天内总共进行12次抗体注射。图42C和图42F示出了一种逆转模型，其中在注射转移性癌细胞后24小时给动物注射抗NME7AB抗体4A3，然后大约每隔一天注射，在20天内总共进行11次抗体注射。如图中可见，抗NME7AB抗体8F9A4A3可以预防以及逆转已建立的转移。
还在转移预防模型中测试了抗NME7AB抗体5A1和5D4，并显示大大抑制了癌症转移。图43A至图43F示出了每只重约20g的雌性nu/nu小鼠的照片，它们经尾静脉内注射10,000个荧光素酶阳性T47D转移性乳腺癌干细胞并且用抗NME7AB抗体5A1(又称8F9A5A1)和5D4(又称5F3A5D4)治疗。为了对癌细胞进行成像，经腹膜内注射荧光素酶底物荧光素，10分钟后在IVIS仪器中拍照。图43A至图43C示出了动物面向下的IVIS照片。图43D至图43F示出了动物面向上的IVIS照片。图43A和图43D示出了注射磷酸盐缓冲盐水溶液的对照动物。图43B、图43E、图43C和图43F示出了一种预防模型，其中在注射转移性癌细胞前24小时给动物注射15mg/kg抗NME7AB抗体，然后大约每隔一天注射，在22天内总共进行12次抗体注射。在第24天或第27天拍摄照片。具体来说，在第27天拍摄用抗体5A1治疗过的组中的小鼠#1，而在第24天拍摄小鼠#2和#3，因为动物在第26天死亡。
还在转移逆转模型中测试了抗NME7AB抗体5A1和5D4，并显示大大抑制了已建立的癌症转移。在这个实验中，在第0天以32nM最终浓度向动物尾静脉中注射与NME7AB混合的10,000个T47D转移性癌细胞。此外，在第3天和第4天，给动物注射两次更多的NME7AB，我们的实验已经证明了这使得转移更难以逆转。在第7天进行第一次抗体注射。因为各测试动物的转移程度有些不同，因此我们想确定转移性癌细胞的明显清除是由于抗NME7AB治疗所致。因此，我们用交替的高剂量和低剂量治疗动物。如图44中清楚可见，高剂量抗NME7AB使得转移清除，如果没有完全根除，则转移会复发，甚至在较低剂量下还会增加。这个实验表明，所有三种测试抗NME7AB抗体5A1、4A3和5D4都能够结合NME7-B3肽，以浓度依赖性方式抑制癌症转移。图44A至图44D示出了以32nM最终浓度经尾静脉内注射与NME7AB混合的10,000个荧光素酶阳性T47D转移性乳腺癌干细胞的雌性nu/nu小鼠的照片。然后向动物尾静脉中注射32nMNME7AB，然后用个别抗NME7AB抗体治疗。图44A示出了注射磷酸盐缓冲盐水溶液的对照动物。图44B示出了用抗NME7AB单克隆抗体8F9A5A1治疗的动物。图44C示出了用抗NME7AB单克隆抗体8F9A4A3治疗的动物。图44D示出了用抗NME7AB单克隆抗体5F3A5D4治疗的动物。绿色箭头表示指定时期内的低抗体剂量(5-7mg/kg)，而红色箭头表示高剂量(15mg/kg)。如图中可见，当抗体以15mg/kg施用时，转移明显清除。
除了证明本发明的抗NME7AB抗体可以抑制转移以外，我们还测试了它们对从原发肿瘤转移的影响，这将更接近地模拟癌症转移的生理学。我们通过在含有NME7AB的基本无血清培养基中培养癌细胞10-15天来产生T47D转移性乳腺癌细胞，也称为癌症干细胞(CSC)。然后将这些T47D CSC皮下植入NSG小鼠的右侧腹，其中已经植入了90天雌激素释放丸。植入的癌细胞是荧光素酶阳性的，因此在注射荧光素酶底物荧光素之后，癌细胞发出光子，并且可以在IVIS仪器中拍照以测量和定位植入的癌细胞。图45A至图45B示出了在第0天经皮下向右侧腹注射与NME7AB混合至最终浓度32nM然后与基质胶1:1vol:vol混合的10,000个荧光素酶阳性T47D转移性乳腺癌干细胞的雌性nu/nu小鼠的照片。第0天至第6天允许肿瘤移植物进展。然后通过尾静脉注射抗NME7AB抗体对动物进行静脉内治疗。给对照动物注射PBS。图45A示出了对照动物的IVIS照片。图45B示出了经尾静脉内注射抗NME7AB抗体5A1、4A3和5D4的混合液达到15mg/kg总浓度的动物的IVIS照片。在第7天和第18天之间施用抗体或PBS 4次。如图中可见，抗NME7AB抗体治疗的动物与对照组相比显示较少转移(全身的蓝色点)。在治疗组中，5只动物中有2只具有比对照组中的那些更大的原发肿瘤。这可能是因为抗NME7AB抗体阻止了癌细胞扩散，因此它们仍然集中在原发肿瘤中。在本实验中，在注射癌细胞之前进行的PCR分析表明，与NME7AB一起培养11天之后，T47D乳腺癌细胞的CXCR4上调了109倍，OCT4上调了2倍，NANOG上调了3.5倍，而且MUC1上调了2.7倍。
在另一个实验中，我们测试了本发明的抗NME7AB抗体对从原发性肿瘤转移到乳腺癌通常会转移到的器官的影响。乳腺癌通常依次转移到肝、肺、骨和脑。我们通过在含有NME7AB的基本无血清培养基中培养11天来产生T47D转移性乳腺癌细胞。然后将这些T47DCSC皮下植入NSG小鼠的右侧腹，其中已经植入了90天雌激素释放丸。图46A至图46P示出了在第0天经皮下向右侧腹注射与NME7AB混合至最终浓度32nM然后与基质胶1:1vol:vol混合的10,000个荧光素酶阳性T47D转移性乳腺癌干细胞的雌性nu/nu小鼠的照片。第0天至第6天允许肿瘤移植物进展。然后通过尾静脉注射抗NME7AB抗体对动物进行静脉内治疗。给对照动物注射PBS。第38天，将动物处死并收集肝脏，然后通过IVIS进行分析以检测已经转移至肝脏的癌细胞。图46A至图46B示出了仅注射PBS的对照动物的全身IVIS照片。图46C至图46D示出了注射抗NME7AB抗体5A1的对照动物的全身IVIS照片。图46E至图46F示出了注射抗NME7AB抗体4A3的对照动物的全身IVIS照片。图46G至图46H示出了注射抗NME7AB抗体5D4的对照动物的全身IVIS照片。图46A、图46C、图46E和图46G是在任何治疗前第7天拍摄的IVIS照片。图46B、图46D、图46F和图46H是在抗NME7AB抗体治疗或模拟治疗后第31天拍摄的IVIS照片。如图中可见，PBS对照组的动物在全身IVIS照片中显示出转移(蓝点)，而用抗NME7AB抗体治疗的动物则没有。图46I至图46P示出了处死后从动物收集的肝脏和肺的照片和IVIS照片。图46I、图46K、图46M和图46O是常规照片。图46J、图46L、图46N和图46P是IVIS照片，示出了已经转移到那里的癌细胞。如图中可见，抗NME7AB抗体大大抑制了向乳腺癌转移的主要部位肝脏的转移。图46Q是通过IVIS仪器针对从对照动物与治疗的动物收集的肝脏发出和计数的测量光子的条形图。如插入的IVIS测量图中可见，当细胞被注射到尾静脉中时，抑制向肝脏转移遵循对转移的抑制顺序，这也与能够破坏NME7AB-MUC1*相互作用方面的效力顺序相匹配。
我们对许多癌细胞系进行了免疫荧光成像，以确定培养的癌细胞系是否表达NME7AB。如图47A至图47F和图48A至图48I清楚显示，我们测试的各个MUC1阳性癌细胞系呈NME7AB阳性并且其结合是膜性的，这与NME7AB由癌细胞分泌且因此它结合至MUC1*的胞外域胞外结构域一致。图47A至图47F示出了免疫荧光实验的照片，其中针对NME7AB的存在对各种癌细胞系进行染色。图47A示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的T47D乳腺癌细胞。图47B示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的ZR-75-1乳腺癌细胞(又称1500s)。图47C示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的H1975非小细胞肺癌细胞。图47D示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的H292非小细胞肺癌细胞。图47E示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的HPAFII胰腺癌细胞。图47F示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的DU145前列腺癌细胞。如图中可见，我们测试的所有癌细胞系都显示出NME7AB的强膜染色。这些实验中使用的单克隆抗体是5D4。同时，使用NME7AB抗体5A1和4A3将相同的细胞系染色并产生了相同的结果。
图48A至图48I示出了免疫荧光实验的照片，其中针对NME7AB的存在对各种肺癌细胞系进行染色。图48A至图48C示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的H1975非小细胞肺癌细胞，即腺癌。图48A是DAPI和抗NME7AB染色的叠加。图48B示出了单独的抗NME7AB染色。图48C是DAPI和抗NME7AB染色的叠加的放大视图。图48D至图48F示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的H292非小细胞肺癌细胞，即粘液表皮样肺癌。图48D是DAPI和抗NME7AB染色的叠加。图48E示出了单独的抗NME7AB染色。图48F是DAPI和抗NME7AB染色的叠加的放大视图。图48G至图48I示出了用不同浓度的抗NME7AB抗体5D4染色的H358非小细胞肺癌细胞，即转移性细支气管肺泡癌。图48G是DAPI和抗NME7AB染色的叠加。图48H示出了单独的抗NME7AB染色。图48I是DAPI和抗NME7AB染色的叠加的放大视图。
此外，在含有NME7AB的无血清培养基中培养这些细胞系甚至进一步增加了它们的干细胞和转移标记物的表达。具体来说，非贴壁的细胞在这里称为漂浮物，其干细胞和转移标记物的表达甚至高于其贴壁对应物。图49A至图49I示出了在NME7AB中培养之前和之后癌细胞系乳腺T47D、肺H1975、肺H358和胰腺HPAFII的PCR图。图49A测量了乳腺转移标记物CXCR4。图49B测量了干细胞标记物OCT4。图49C测量了转移标记物ALDH1。图49D测量了干细胞标记物SOX2。图49E测量了干细胞标记物NANOG。图49F测量了标记物CDH1，又称E-钙粘蛋白。图49G测量了转移标记物CD133。图49H测量了干细胞标记物ZEB2。图49I测量了干细胞、癌症和转移标记物MUC1。漂浮细胞又称肿瘤球，能够独立地贴壁生长，并显示出比贴壁细胞更高的转移标记物。注射癌症干细胞的动物是注射NME7AB生长的漂浮细胞的动物。如图中可见，在NME7AB中培养后，转移标记物、干细胞标记物或上皮间质转化(EMT)标记物升高，表明转变至更强转移性状态。图50示出了经尾静脉内注射10,000个与NME7AB一起培养10-12天之后的H358肺癌亲本细胞或H358细胞的NSG小鼠的第6天IVIS照片。如图中可见，在NME7AB中生长的NCI-H358肺癌细胞与据报告本身是转移细胞的亲本细胞相比大大提高了转移潜能。6天内NCI-H358 NME7AB转移性癌症干细胞从仅10,000个细胞转移的功能性增加与图49一致，表明了H358细胞在NME7AB中培养之后大大增加了转移标记物的表达。
图51示出了在二聚NM23-H1(又称NME1)或NME7AB中培养2代或3代前后MUC1阴性前列腺癌细胞系PC3的PCR图。该图示出了干细胞、癌细胞以及转移标记物的倍数差异。如图中可见，在NME1或NME7AB中重复培养诱导干细胞、癌症和转移标记物上调，而且还使MUC1表达上调了5至8倍。
总的来说，这些数据已经证明了缺乏DM10结构域的NME7是由癌细胞分泌并结合至缺乏串联重复结构域的MUC1胞外结构域，因此NME7使MUC1*胞外结构域二聚，由此导致癌细胞生长增加和癌细胞转移潜能增加。有理由认为，破坏NME7AB和MUC1*胞外结构域之间的相互作用的抗体将抑制癌细胞生长并且将抑制癌症转移。这里，我们已经证明了抑制NME7AB和MUC1*胞外结构域之间的相互作用的抗NME7AB抗体实际上确实抑制了癌细胞生长和癌症转移。因此就可以将抗NME7AB抗体施用于被诊断有癌症或转移或者有癌症或转移风险的患者，以治疗或预防癌症。
因为NME1在所有细胞的细胞质中都有表达并且如果被敲除则可能是致命的，而且重要的是NME1 A结构域与NME7 A结构域具有高序列同源性，因此用于治疗用途的抗NME7AB抗体结合NME7AB或NME7-X1但不结合NME1是至关重要的。在本发明的一个方面，对治疗用途最佳的抗体因其结合NME7AB或NME7-X1所特有的且不存在于NME1序列中的肽的能力而被选择。图6至图9列出了NME7AB独特的肽。
在一个优选实施方案中，适合施用于患者以治疗或预防癌症或癌症转移的抗体选自结合NME7 B3肽的抗体组。在一个优选实施方案中，适合施用于患者以治疗或预防癌症或癌症转移的抗体选自结合NME7 B3肽、结合NME7AB但不结合NME1的抗体组。适用于治疗或预防癌症或癌症转移的治疗用途的抗体的实例包括抗NME7抗体5A1、4A3和5D4，这里，所述抗体已经在体外和体内显示了这种抗癌活性和抗转移活性。这些只是实例，如本文所述产生和如本文所述选择的其他抗体将具有相同的抗癌和抗转移活性。此类抗体可以是完整抗体或其片段，包括scFv或抗体模拟物，其中将抗体的可变结构域并入模拟抗体的蛋白质支架中。抗体可以是人或非人物种，包括鼠、骆驼、美洲驼、人或人源化的，并且可以是单克隆、多克隆、scFv或其片段。
用于治疗或预防癌症或转移的抗NME7抗体可以许多不同的治疗形式使用。举例来说，本文所述的任何抗体或其片段都可以作为独立的抗体或抗体片段施用于患者，或者连接至毒素如抗体药物缀合物(ADC)，或并入双特异性抗体中或并入BiTE(双特异性T细胞接合剂)，或并入嵌合抗原受体(CAR)中，或者经工程改造以便由还表达CAR的细胞表达。细胞可以是免疫细胞、T细胞、NK细胞或者随后可以分化成T细胞或NK细胞的干细胞或祖细胞。
本文所述的任何抗体或其片段都可以用作诊断试剂以探测体液、细胞、组织或身体样本是否存在NME7AB或NME7-X1，这将是癌症或癌症易感性的指标。用于诊断用途的抗体可以连接到成像剂、核酸标签，可以属于包括骆驼在内的任何物种，并且可以在体外、体内或手术中用于全身应用或体液，例如血液、细胞或组织。
治疗可用或诊断可用的抗NME7抗体的选择标准取决于将并入抗体的治疗剂或诊断剂的形式或形态。如果抗体或抗体片段将作为用于治疗或预防癌症或癌症转移的独立的剂施用于患者，则所述抗体因其以下能力而被选择：i)结合NME7AB或NME7-X1，但不结合NME1；ii)结合PSMGFR肽；iii)结合N-10肽，以及iv)破坏NME7AB或NME7-X1与MUC1*胞外结构域之间的相互作用或者NME7AB或NME7-X1与N-10肽之间的相互作用。所述抗体还可能因其结合NME7 B3肽的能力而被选择。这种治疗形式还涵盖已经过工程改造以表达CAR和分泌的抗NME7抗体的细胞。
其他形态需要抗NME7抗体的其他选择标准。如果抗NME7抗体将要并入ADC中，则ADC必须被靶细胞内在化以触发杀死靶细胞。回想一下，NME7AB或NME7-X1将与MUC1*的胞外结构域结合。如果抗体破坏了NME与MUC1*胞外结构域的结合，那么毒素缀合的抗体将不会被内在化，并且细胞也不会被杀死。同样，如果抗NME7抗体将要并入CAR或BiTE中，则不能破坏NME7AB或NME7-X1之间的相互作用，否则免疫细胞将不再能够将其杀伤剂导向癌细胞。如果抗NME7抗体将要用作诊断试剂，则不能破坏NME7AB或NME7-X1之间的相互作用，否则抗体和相关标记将会被冲走。因此，对于ADC、CAR T或CAR-NK、BiTE或诊断应用，抗NME7抗体因其以下能力而被选择：i)结合NME7AB或NME7-X1，但不结合NME1；ii)结合PSMGFR肽；iii)结合N-10肽，以及iv)结合NME7AB或NME7-X1而不破坏与MUC1*胞外结构域之间的相互作用或者NME7AB或NME7-X1与N-10肽之间的相互作用。所述抗体还可能因其结合NME7 B3肽的能力而被选择。
在本发明的一个方面，细胞经过工程改造以表达本发明的抗NME7AB抗体或其片段。所述细胞可以是免疫细胞，诸如T细胞或NK细胞，或者它可以是干细胞或祖细胞，它可以分化成更成熟的免疫细胞，诸如T细胞或NK细胞。在一个优选实施方案中，经过工程改造以表达抗NME7AB抗体的细胞还被工程改造以表达嵌合抗原受体(CAR)。在一个优选实施方案中，CAR识别肿瘤相关抗原。在一个优选实施方案中，CAR靶向MUC1*。在一个更优选实施方案中，CAR通过抗MUC1*抗体MNC2针对肿瘤。在本发明的另一个方面，经过工程改造以表达CAR的细胞还被工程改造以诱导性表达抗NME7抗体。在一个实施例中，将编码抗NME7AB抗体的核酸插入Foxp3增强子或启动子中。在另一个实施例中，所述抗NME7AB抗体在NFAT诱导系统中。在一个方面，NFAT诱导系统并入了插入在抗NME7AB抗体序列上游的NFATc1反应元件。它们可以插入IL-2启动子、Foxp3增强子或启动子或者其他合适的启动子或增强子中。
在本发明的另一个方面，将NME7AB或NME7-X1所特有的肽并入对人进行免疫或疫苗接种以对抗癌症或癌症转移的实体中。在一个优选实施方案中，所述肽包括全部或部分NME7 B3肽，后者可以是具有Cys-14-Ser突变的NME7 B3肽。
本发明的另一个方面涉及一种在宿主动物中产生抗NME7AB抗体的方法，其中用NME7 B3肽使动物免疫。在一个优选实施方案中，NME7 B3肽的半胱氨酸14突变成丝氨酸(SEQ ID NO:169)以避免抑制NME7特异性抗体产生的二硫键形成。
本发明的另一个方面涉及一种产生具有增强的转移潜能的细胞的方法，包括将所述细胞与NME7AB或NME7-X1一起培养。然后，这些细胞可以用于许多药物发现方面。
本发明的另一个方面涉及一种经工程改造以表达NME7AB或NME7-X1的细胞。NME7AB或NME7-X1可以是人类序列。它们的表达可能是可诱导的。在一个方面，细胞是卵，然后使其发育成动物，该动物可能是能够表达人NME7AB或NME7-X1的转基因动物。
NME7结合MUC1*生长因子受体的胞外结构域并使其二聚。组织研究表明，MUC1*随着肿瘤分级和转移增加而增加。这里，我们证明了NME7表达随着肿瘤分级和转移增加而增加(图39至图41)。这里，我们已经证明了抑制NME7和MUC1*相互作用的抗体抑制肿瘤生长和转移。
其他NME家族成员可能结合MUC1*生长因子受体的胞外结构域并使其二聚。举例来说，我们已经证明了NME1、NME2和NME6可以作为二聚体存在，而且它们结合MUC1*胞外结构域并使其二聚化。NME7AB和NME7-X1有两个结构域，该两个结构域可以结合MUC1*胞外结构域，从而使呈单体形式的它们二聚并激活MUC1*生长因子受体。我们现在已经证明了抗NME7抗体抑制癌症和癌症转移。同样，结合这些其他NME蛋白的抗体或抗体模拟物可以是抗癌或抗转移治疗剂，其可以施用于被诊断患有癌症或转移或有癌症或转移风险的患者。在本发明的一个方面，可以治疗性地用于治疗癌症或转移的抗体是结合NME1、NME2、NME3、NME4、NME5、NME6、NME7、NME8、NME9或NME10的抗体。在本发明的一个方面，治疗性抗体或抗体模拟物抑制NME蛋白与其同源生长因子受体的结合。在本发明的一个方面，治疗性抗体或抗体模拟物抑制NME蛋白与MUC1*胞外结构域的相互作用。在本发明的另一个方面，治疗性抗体或抗体模拟物结合衍生自NME1、NME2、NME3、NME4、NME5、NME6、NME7、NME8、NME9或NME10的肽，其中所述肽与NME7A1、A2、B1、B2或B3肽同源。
以下是序列比对，示出了NME7和其他NME家族成员之间的同源性和同一性比对。加下划线或加下划线且加粗的序列对应于NME7肽A1(SEQ ID NO:141)、A2(SEQ ID NO:142)、B1(SEQ ID NO:143)、B2(SEQ ID NO:144)和B3(SEQ ID NO:145)。
二磷酸核苷激酶7同种型a[智人](Hu_7)
>NME2理论pI/Mw:8.52/17298.04
总体/总体(N-W)评分：171；155aa重叠(1-131:1-152)中26.5％同一性(56.8％相似)
总体/总体(N-W)评分：104；156aa重叠(1-134:1-152)中24.4％同一性(51.3％相似)
>NME3理论pI/Mw:5.96/19088.97
/>
>NME4理论pI/Mw:10.30/20658.59
133aa重叠(1-131:56-185)中29.3％同一性(68.4％相似)
132aa重叠(3-134:40-167)中28.8％同一性(56.8％相似)
>NME5理论pI/Mw:6.08/29296.23
131aa重叠(1-131:13-143)中44.3％同一性(74.8％相似)
132aa重叠(3-134:15-143)中28.0％同一性(58.3％相似)
>NME6理论pI/Mw:7.81/22003.16
133aa重叠(3-131:22-153)中37.6％同一性(68.4％相似)
133aa重叠(3-134:22-153)中29.3％同一性(57.9％相似)
>NME8理论pI/Mw:4.90/67269.94
/>
133aa重叠(1-131:316-448)中36.1％同一性(69.2％相似)
沃特曼-埃格特(Waterman-Eggert)得分:269；85.9比特；E(1)<1.1e-21
沃特曼-埃格特得分:119；40.4比特；E(1)<5.3e-08
65aa重叠(3-65:156-220)中33.8％同一性(73.8％相似)
116aa重叠(3-118:453-566)中33.6％同一性(65.5％相似)
沃特曼-埃格特得分:128；41.3比特；E(1)<2.9e-08
116aa重叠(20-134:334-448)中23.3％同一性(60.3％相似)
沃特曼-埃格特得分:76；26.4比特；E(1)<0.00088
111aa重叠(6-105:159-268)中23.4％同一性(46.8％相似)
/>
>NME9
MLSSKGLTVVDVYQGWCGPCKPVVSLFQKMRIEVGLDLLHFALAEADRLDVLEKYRGKCE
PTFLFYAIKDEALSDEDECVSHGKNNGEDEDMVSSERTCTLAIIKPDAVAHGKTDEIIMK
IQEAGFEILTNEERTMTEAEVRLFYQHKAGESPSSVRHRNALQCRPWKPGQRRC(SEQ ID NO:231)
46aa重叠(3-46:100-145)中41.3％同一性(67.4％相似)
沃特曼-埃格特得分:30；13.5比特；E(1)<0.85
14aa重叠(69-82:100-113)中28.6％同一性(71.4％相似)
沃特曼-埃格特得分:29；13.2比特；E(1)<0.91
31aa重叠(12-42:121-149)中25.8％同一性(74.2％相似)
53aa重叠(1-53:98-150)中39.6％同一性(69.8％相似)
>NME10 NP_008846.2蛋白XRP2[智人]
MGCFFSKRRKADKESRPENEEERPKQYSWDQREKVDPKDYMFSGLKDETVGRLPGTVAGQQFLIQDCENC
NIYIFDHSATVTIDDCTNCIIFLGPVKGSVFFRNCRDCKCTLACQQFRVRDCRKLEVFLCCATQPIIESS
SNIKFGCFQWYYPELAFQFKDAGLSIFNNTWSNIHDFTPVSGELNWSLLPEDAVVQDYVPIPTTEELKAV
RVSTEANRSIVPISRGQRQKSSDESCLVVLFAGDYTIANARKLIDEMVGKGFFLVQTKEVSMKAEDAQRV
FREKAPDFLPLLNKGPVIALEFNGDGAVEVCQLIVNEIFNGTKMFVSESKETASGDVDSFYNFADIQMGI(SEQ ID NO:238)
68aa重叠(11-78:246-308)中23.5％同一性(66.2％相似)
沃特曼-埃格特得分:35；15.1比特；E(1)<0.73
45aa重叠(66-108:200-244)中28.9％同一性(57.8％相似)
沃特曼-埃格特得分:33；14.4比特；E(1)<0.87
75aa重叠(7-80:35-109)中14.7％同一性(52.0％相似)
沃特曼-埃格特得分:45；17.5比特；E(1)<0.22
51aa重叠(4-50:130-180)中21.6％同一性(58.8％相似)
举例来说，可以将结合NME7同源肽(“同源肽”)，特别是与A1、A2、B1、B2或B3肽同源的抗体或抗体模拟物施用于被诊断患有癌症或癌症转移或有癌症或癌症转移风险的患者。
A1、A2、B1、B2或B3肽的同源肽
A1、A2、B1、B2或B3肽的同源肽可以包括但不限于以下：
NME2A1
(氨基酸)
RASEEHLKQHYIDLKD(SEQ ID NO:247)
NME2A2
(氨基酸)
PADSKPGT(SEQ ID NO:248)
NME2B1
(氨基酸)
QKGFRLVAMKFLRASEEHLK(SEQ ID NO:249)
NME2B2
(氨基酸)
IDLKDRPFPGLVKY(SEQ ID NO:250)
NME2B3
(氨基酸)
GDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWF(SEQ ID NO:251)
NME3A1
(氨基酸)
QASEELLREHYVELRE(SEQ ID NO:252)
NME3A1
(氨基酸)
PGDATPGT(SEQ ID NO:253)
NME3B1
(氨基酸)
RKGFKLVALKLVQASEELLR(SEQ ID NO:254)
NME3B2
(氨基酸)
VELRERPFYSRLVKY(SEQ ID NO:255)
NME3B3
(氨基酸)
GDFCVEVGKNVIHGSDSVESAQREIALWF(SEQ ID NO:256)
NME4A1
(氨基酸)
QAPESVLAEHYQDLRR(SEQ ID NO:257)
NME4A2
(氨基酸)
SAEAAPGT(SEQ ID NO:258)
NME4B1
(氨基酸)
RRGFTLVGMKMLQAPESVLA(SEQ ID NO:259)
NME4B2
(氨基酸)
QDLRRKPFYPALIRY(SEQ ID NO:260)
NME4B3
(氨基酸)
GDFSVHISRNVIHASDSVEGAQREIQLWF(SEQ ID NO:261)
NME5A1
(氨基酸)
RLSPEQCSNFYVEKYG(SEQ ID NO:262)
NME5A2
(氨基酸)
SLVAKETHPDS(SEQ ID NO:263)
NME5B1
(氨基酸)
RSGFTIVQRRKLRLSPEQCS(SEQ ID NO:264)
NME5B2
(氨基酸)
VEKYGKMFFPNLTAY(SEQ ID NO:265)
NME5B3
(氨基酸)
AIYGTDDLRNALHGSNDFAAAEREIRFMF(SEQ ID NO:266)
NME6A1
(氨基酸)
LWRKEDCQRFYREHEG(SEQ ID NO:267)
NME6A2
(氨基酸)
VFRARHVAPDS(SEQ ID NO:268)
NME6B1
(氨基酸)
SNKFLIVRMRELLWRKEDCQ(SEQ ID NO:269)
NME6B2
(氨基酸)
REHEGRFFYQRLVEF(SEQ ID NO:270)
NME6B3
(氨基酸)
GSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFF(SEQ ID NO:271)
NME8A1
(氨基酸)
VLSEKEAQALCKEYEN(SEQ ID NO:272)
NME8A2
(氨基酸)
VEEAIEYFPES(SEQ ID NO:273)
NME8A3
(氨基酸)
FLTPEQIEKIYPKVTG(SEQ ID NO:274)
NME8A4
(氨基酸)
PEEAKLLSPDS(SEQ ID NO:275)
NME8A5
(氨基酸)
VLTEEQVVNFYSRIAD(SEQ ID NO:276)
NME8B1
(氨基酸)
EAGFDLTQVKKMFLTPEQIE(SEQ ID NO:277)
NME8B2
(氨基酸)
PKVTGKDFYKDLLEM(SEQ ID NO:278)
NME8B3
(氨基酸)
AQFGISKLKNIVH(SEQ ID NO:279)
NME8B4
(氨基酸)
DEDFKILEQRQVVLSEKEAQ(SEQ ID NO:280)
NME8B5
(氨基酸)
KEYENEDYFNKLIEN(SEQ ID NO:281)
NME8B6
(氨基酸)
AQFAMDSLPVNQLYGSDSLETAEREIQHFF(SEQ ID NO:282)
NME8B7
(氨基酸)
KAGFIIEAEHKTVLTEEQVV(SEQ ID NO:283)
NME8B8
(氨基酸)
SRIADQCDFEEFVSF(SEQ ID NO:284)
NME9A1
(氨基酸)
TMTEAEVRLFY(SEQ ID NO:285)
NME9B1
(氨基酸)
EAGFEILTNEERTMTEAEVR(SEQ ID NO:286)
NME10A1
(氨基酸)
SMKAEDAQRVFREK(SEQ ID NO:287)
NME10A2
(氨基酸)
GQRQKSSDES(SEQ ID NO:288)
NME10A3
(氨基酸)
IQDCENCNIYIFDHSA(SEQ ID NO:289)
NME10B1
ELAFQFKDAGLSIFNNTWSNIH(SEQ ID NO:290)
在一些情况下，通过移动框架或延伸NME7肽，可以使衍生自其他NME蛋白的肽与NME7 A1、A2、B1、B2或B3肽更同源，从而使延伸的肽与产生抑制癌症或癌症转移的抗体的NME7肽更同源。作为另一个实例，可以将结合NME7同源延伸肽(“延伸肽”)的抗体或抗体模拟物施用于被诊断患有癌症或癌症转移或有癌症或癌症转移风险的患者。
A1、A2、B1、B2或B3肽的同源延伸肽
A1、A2、B1、B2或B3肽的呈延伸肽形式的同源肽可以包括但不限于以下：
NME2A1
(氨基酸)
RASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGL(SEQ ID NO:291)
NME2A2
(氨基酸)
LGETNPADSKPGTIRGDF(SEQ ID NO:292)
NME2B1
(氨基酸)
GLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHY(SEQ ID NO:293)
NME2B2
(氨基酸)
YIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAM(SEQ ID NO:294)
NME2B3
(氨基酸)
PGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWF(SEQ ID NO:295)
NME3A1
(氨基酸)
LKLVQASEELLREHYVELRERPFYSRL(SEQ ID NO:296)
NME3A1
(氨基酸)
LIGATDPGDATPGTIRGDF(SEQ ID NO:297)
NME3B1
(氨基酸)
LVGEIVRRFERKGFKLVALKLVQASEELLRE(SEQ ID NO:298)
NME3B2
(氨基酸)
EHY-VELRERPFYSRLVKYMGSGPVVAM(SEQ ID NO:299)
NME3B3
(氨基酸)
PGTIRGDFCVEVGKNVIHGSDSVESAQREIALWF(SEQ ID NO:300)
NME4A1
(氨基酸)
GFTLVGMKMLQAPESVLAEHYQDLRRKPF(SEQ ID NO:301)
NME4A2
(氨基酸)
GHTDSAEAAPGTIRGDF(SEQ ID NO:302)
NME4B1
(氨基酸)
LVGDVIQRFERRGFTLVGMKMLQAPESVLAEHY(SEQ ID NO:303)
NME4B2
(氨基酸)
EHYQDLRRKPFYPALIRYMSSGPVVAM(SEQ ID NO:304)
NME4B3
(氨基酸)
PGTIRGDFSVHISRNVIHASDS VEGAQREIQLWF(SEQ ID NO:305)
NME5A1
(氨基酸)
GFTIVQRRKLRLSPEQCSNFYVEKYGKMFF(SEQ ID NO:306)
NME5A2
(氨基酸)
LLGPNNSLVAKETHPDSLRAIYGTD(SEQ ID NO:307)
NME5B1
(氨基酸)
IQDIILRSGFTIVQRRKLRLSPEQCSNFY(SEQ ID NO:308)
NME5B2
(氨基酸)
FYVEKYGKMFFPNLTAYMSSGPLVAM(SEQ ID NO:309)
NME5B3
(氨基酸)
PDSLRAIYGTDDLRNALHGSNDFAAAEREIRFMF(SEQ ID NO:310)
NME6A1
(氨基酸)
FLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRL(SEQ ID NO:311)
NME6A2
(氨基酸)
LMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFG(SEQ ID NO:312)
NME6B1
(氨基酸)
ILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFY(SEQ ID NO:313)
NME6B2
(氨基酸)
FYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRA(SEQ ID NO:314)
NME6B3
(氨基酸)
ARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFF(SEQ ID NO:315)
NME8A1
(氨基酸)
FKILEQRQVVLSEKEAQALCKEYENEDYFNKLI(SEQ ID NO:316)
NME8A2
(氨基酸)
WKQLLGPRTVEEAIEYFPESLCAQFAMD(SEQ ID NO:317)
NME8A3
(氨基酸)
AGFDLTQVKKMFLTPEQIEKIYPKVTGKDFYKDL(SEQ ID NO:318)
NME8A4
(氨基酸)
EWRRLMGPTDPEEAKLLSPDSIRAQFG(SEQ ID NO:319)
NME8A5
(氨基酸)
KAGFIIEAEHKTVLTEEQVVNFYSRIADQCDFEE(SEQ ID NO:320)
NME8B1
(氨基酸)
ILKIVKEAGFDLTQVKKMFLTPEQIEKIY(SEQ ID NO:321)
NME8B2
(氨基酸)
YPKVTGKDFYKDLLEMLSVGP(SEQ ID NO:322)
NME8B3
(氨基酸)
DPEEAKLLSPDSIRAQFGISKLKNIVH(SEQ ID NO:323)
NME8B4
(氨基酸)
LRIIKDEDFKILEQRQVVLSEKEAQ(SEQ ID NO:324)
NME8B5
(氨基酸)
KEYENE-DYFNKLIENMTSGPSLA(SEQ ID NO:325)
NME8B6
(氨基酸)
PESLCAQFAMDSLPVNQLYGSDSLETAEREIQHFF(SEQ ID NO:326)
NME8B7
(氨基酸)
IKRKITKAGFIIEAEHKTVLTEEQVVNFY(SEQ ID NO:327)
NME8B8
(氨基酸)
FYSRIADQCDFEEFVSFMTSG(SEQ ID NO:328)
NME9A1
(氨基酸)
AGFEILTNEERTMTEAEVRLFY(SEQ ID NO:329)
NME9B1
(氨基酸)
IIMKIQEAGFEILTNEERTMTEAEVRLFY(SEQ ID NO:330)
NME10A1
(氨基酸)
GFFLVQTKEVSMKAEDAQRVFREKAP(SEQ ID NO:331)
NME10A2
(氨基酸)
EANRSIVPISRGQRQKSSDESCLVVLFAGD(SEQ ID NO:332)
NME10A3
(氨基酸)
IQDCENCNIYIFDHSA(SEQ ID NO:333)
NME10B1
ELAFQFKDAGLSIFNNTWSNIHDFTPVDCT(SEQ ID NO:334)
一些NME蛋白发挥正常细胞生长或发育所必需的功能。举例来说，NME1被认为是正常细胞功能所需要的。其他NME蛋白具有催化结构域，其功能是正常细胞或组织中所需要的。在这些情况下，可以基于治疗抗体结合所靶向的癌症相关NME但不结合非靶向的NME的能力来选择治疗性抗体。举例来说，这里介绍的抗NME7抗体8F9A5A1、8F9A4A3和5F3A5D4因其结合NME7AB但不结合NME1的能力而被选择；基于它们抑制癌症和癌症转移的能力对它们进行进一步选择。
在本发明的另一个方面，将抗NME7抗体、抗体片段(例如scFv)或抗体模拟物片段并入经工程改造以便在免疫细胞中表达的嵌合抗原受体(CAR)中。免疫细胞可以经过工程改造以表达抗NME7 CAR、抗MUC1*CAR或两者。所述CAR之一可以从诱导型启动子中表达。或者，可以对免疫细胞进行工程改造以表达CAR，诸如抗MUC1*CAR和诱导型抗NME7抗体或抗体片段。在某些情况下，诱导型启动子可能含有NFAT反应元件。在一个方面，这些经工程改造的种类在T细胞、NK细胞或树突细胞中表达。免疫细胞可以从患者或供体获得。在某些情况下，使诸如MHC、检查点抑制剂或检查点抑制剂受体等免疫分子突变或切除，例如使用CrisPR或CrisPR类技术。在另一个方面，通过Talens、Sleeping Beauty、CrisPR或CrisPR样技术在患者或供体衍生的免疫细胞中对ITAM分子、Fos或Jun进行突变或基因切除。
在本发明的一个方面，用于CAR T形式的抗NME7抗体或抗体模拟物选自对NME7具有特异性但不破坏NME7与MUC1*胞外结构域的结合的抗体或抗体模拟物群组。以这种方式，使CAR T靶向肿瘤的抗NME7抗体或抗体模拟物将不会仅仅从受体摘取配体，因此T细胞将不能够将颗粒酶B注入靶癌细胞中。此类抗体或抗体模拟物是通过用NME7肽(诸如NME7肽A1、A2、B1、B2或B3)使动物免疫而产生，或者根据它们结合NME7肽A1、A2、B1、B2或B3的能力进行选择。可以筛检抗体或抗体模拟物特异性结合NME7但不结合NME1或NME2的能力，以及它们不能破坏NME7与MUC1*胞外结构域之间的结合的能力。举例来说，在ELISA设置中，PSMGFR肽被固定到表面。允许标记过的NME7AB结合至表面固定的MUC1*胞外结构域，并且在存在或不存在测试抗体或抗体模拟物的情况下测量NME7AB标记的检测。在本发明的一个方面，选择不减少NME7AB与表面固定的MUC1*胞外结构域肽之间的结合的抗体作为并入CAR中并且经工程改造以便在免疫细胞中表达，然后施用于患者以治疗或预防癌症或癌症转移的抗体。
在本发明的一个方面，将抗NME7抗体或其片段施用于被诊断患有癌症或癌症转移或有发生癌症或癌症转移风险的患者。在一个方面，抗NME7抗体或抗体片段结合上文特别在“A1、A2、B1、B2或B3肽的同源肽”和“A1、A2、B1、B2或B3肽的同源延伸肽”部分下讨论的NME肽。
在另一个方面，抗体、抗体片段或抗体模拟物结合选自A1、A2、B1、B2或B3(SEQ IDNO:141-145)的NME7衍生肽。在又一个方面，抗体、抗体片段或抗体模拟物结合包含大部分或全部B3肽的NME7肽。在本发明的一个方面，抗NME7抗体、抗体片段或抗体模拟物包含源自如下所示的抗NME7抗体8F9A4A3(SEQ ID NO:1001-1015)、8F9A5A1(SEQ ID NO:1016–1030)或8H5H5G4(SEQ ID NO:1031–1045)的可变结构域的序列。
抗NME7 B3肽单克隆抗体
小鼠8F9A4A3重链可变区序列
(DNA)
Gtccagctgcaacagtctggacctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgcaagacttctggaaacacattcactgaatacaccatgcactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaggttttaatcctaacaatggtgttactaactacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggattctgcagtctattactgtgcaagacggtactaccatagtctctacgtgttttactttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca(SEQ IDNO:335)
(氨基酸)
VQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGNTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGFNPNNGVTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYHSLYVFYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:1001)
人IGHV1-24*01V区序列(最接近匹配hu抗体序列)
(DNA)
Caggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggtttccggatacaccctcactgaattatccatgcactgggtgcgacaggctcctggaaaagggcttgagtggatgggaggttttgatcctgaagatggtgaaacaatctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccgaggacacatctacagacacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcaaca(SEQ ID NO:336)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT(SEQ ID NO:1002)
人(最接近匹配hu抗体序列)
IGHJ4*01J区序列
(DNA)
tactttgactactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctca(SEQ ID NO:337)
(氨基酸)
YFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1003)
人源化重链可变序列(SEQ ID NO:1001+SEQ ID NO:1002+SEQ ID NO:1003)
人源化8F9A4A3重链可变区序列
(DNA)
caggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggtttccggaaacacattcactgaatacaccatgcactgggtgcgacaggctcctggaaaagggcttgagtggatgggaggttttaatcctaacaatggtgttactaactacaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccgaggacacatctacagacacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcaagacggtactaccatagtctctacgtgttttactttgactactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctca(SEQ IDNO:338)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGNTFTEYTMHWVRQAPGKGLEWMGGFNPNNGVTNYNQKFKGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRYYHSLYVFYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1004)
人源化重链可变序列(1004的密码子优化版本)
人源化8F9A4A3重链可变区序列(密码子优化)
(DNA)
caggttcagctggttcagtctggcgccgaagtgaagaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggtgtccggaaataccttcaccgagtacaccatgcactgggtccgacaggcccctggcaaaggacttgaatggatgggcggcttcaaccccaacaacggcgtgaccaactacaaccagaaattcaagggccgcgtgaccatgaccgaggacacaagcacagacaccgcctacatggaactgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaaggtactaccacagcctgtacgtgttctacttcgactactggggccagggcaccctggtcacagtttcttct(SEQ IDNO:339)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGNTFTEYTMHWVRQAPGKGLEWMGGFNPNNGVTNYNQKFKGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRYYHSLYVFYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1005)
人源化重链可变序列(“修饰的”SEQ ID NO:1005序列，其中修饰意指被认为对结合或结构至关重要的某些氨基酸已经被恢复为小鼠序列)。
修饰的人源化8F9A4A3重链可变区序列
(DNA)
caggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggtttccggaaacacattcactgaatacaccatgcactgggtgcgacaggctcctggaaaagggcttgagtggattggaggttttaatcctaacaatggtgttactaactacaaccagaagttcaagggcaaagtcaccctgaccgtggacacatctagcagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcaagacggtactaccatagtctctacgtgttttactttgactactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctca(SEQ IDNO:340)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGNTFTEYTMHWVRQAPGKGLEWIGGFNPNNGVTNYNQKFKGKVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRYYHSLYVFYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1006)
人源化重链可变序列(密码子优化的SEQ ID NO:1006)
修饰的人源化8F9A4A3重链可变区序列(密码子优化)
(DNA)
caggttcagctggttcagtctggcgccgaagtgaagaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggtgtccggaaataccttcaccgagtacaccatgcactgggtccgacaggcccctggcaaaggactggaatggatcggcggcttcaaccccaacaacggcgtgaccaactacaaccagaaattcaagggcaaagtgaccctgaccgtggacaccagcagcagcacagcctacatggaactgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaaggtactaccacagcctgtacgtgttctacttcgactactggggccagggcaccctggtcacagtttcttct(SEQ IDNO:341)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGNTFTEYTMHWVRQAPGKGLEWIGGFNPNNGVTNYNQKFKGKVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRYYHSLYVFYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1007)
小鼠8F9A4A3轻链可变区序列
(DNA)
gaaacaactgtgacccagtctccagcatccctgtccatggctataggagaaaaagtcaccatcagatgcataaccagcactgatattgatgatgatatgaactggtaccagcagaagccaggggaacctcctaagctccttatttcagaaggcaatactcttcgtcctggagtcccatcccgattctccagcagtggctatggtacagattttgtttttacaattgaaaacatgctctcagaagatgttgcagattactactgtttgcaaagtgataacttgcctctcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaacgg(SEQ ID NO:342)
(氨基酸)
ETTVTQSPASLSMAIGEKVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKLLISEGNTLRPGVPSRFSSSGYGTDFVFTIENMLSEDVADYYCLQSDNLPLTFGSGTKLEIKR(SEQ ID NO:1008)
人(最接近匹配hu抗体序列)
IGKV5-2*01V区序列
(DNA)
gaaacgacactcacgcagtctccagcattcatgtcagcgactccaggagacaaagtcaacatctcctgcaaagccagccaagacattgatgatgatatgaactggtaccaacagaaaccaggagaagctgctattttcattattcaagaagctactactctcgttcctggaatcccacctcgattcagtggcagcgggtatggaacagattttaccctcacaattaataacatagaatctgaggatgctgcatattacttctgt(SEQ ID NO:343)
(氨基酸)
ETTLTQSPAFMSATPGDKVNISCKASQDIDDDMNWYQQKPGEAAIFIIQEATTLVPGIPPRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFC(SEQ ID NO:1009)
人(最接近匹配hu抗体序列)
IGKJ4*02J区序列
(DNA)
ctcacgttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa(SEQ ID NO:344)
(氨基酸)
LTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:1010)
人源化轻链可变序列(SEQ ID NO:1008+SEQ ID NO:1009+SEQ ID NO:1)
人源化8F9A4A3轻链可变区序列
(DNA)
gaaacgacactcacgcagtctccagcattcatgtcagcgactccaggagacaaagtcaacatctcctgcataaccagcactgatattgatgatgatatgaactggtaccaacagaaaccaggagaagctgctattttcattattcaagaaggcaatactcttcgtcctggaatcccacctcgattcagtggcagcgggtatggaacagattttaccctcacaattaataacatagaatctgaggatgctgcatattacttctgtttgcaaagtgataacttgcctctcacgttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgg(SEQ ID NO:345)
(氨基酸)
ETTLTQSPAFMSATPGDKVNISCITSTDIDDDMNWYQQKPGEAAIFIIQEGNTLRPGIPPRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCLQSDNLPLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1011)
人源化轻链可变序列(SEQ ID NO:1011的密码子优化版本)
人源化8F9A4A3轻链可变区序列(密码子优化)
(DNA)
Gagacaaccctgacacagagccctgccttcatgtctgccacacctggcgacaaagtgaacatcagctgcatcaccagcaccgacatcgacgacgacatgaactggtatcagcagaagcctggcgaggccgccatcttcatcatccaagagggcaacacactgcggcctggcatccctcctagattttctggcagcggctacggcaccgacttcaccctgaccatcaacaacatcgagagcgaggacgccgcctactacttctgcctgcaaagcgacaacctgcctctgacctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcgg(SEQ ID NO:346)
(氨基酸)
ETTLTQSPAFMSATPGDKVNISCITSTDIDDDMNWYQQKPGEAAIFIIQEGNTLRPGIPPRFSGSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCLQSDNLPLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1012)
人源化轻链可变序列(“修饰的”SEQ ID NO:1012序列，其中修饰意指被认为对结合或结构至关重要的某些氨基酸已经被恢复为小鼠序列)。
修饰的人源化8F9A4A3轻链可变区序列
(DNA)
gaaacgacagtgacgcagtctccagcattcatgtcagcgactccaggagacaaagtcaccatctcctgcataaccagcactgatattgatgatgatatgaactggtaccaacagaaaccaggagaagctgctattctgctgattagcgaaggcaatactcttcgtcctggaatcccacctcgattcagtagcagcgggtatggaacagattttaccctcacaattaataacatagaatctgaggatgctgcatattacttctgtttgcaaagtgataacttgcctctcacgttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgg(SEQ ID NO:347)
(氨基酸)
ETTVTQSPAFMSATPGDKVTISCITSTDIDDDMNWYQQKPGEAAILLISEGNTLRPGIPPRFSSSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCLQSDNLPLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1013)
人源化轻链可变序列(密码子优化的SEQ ID NO:1013)
修饰的人源化8F9A4A3轻链可变区序列(密码子优化)
(DNA)
gagacaaccgtgacacagagccctgccttcatgtctgccacacctggcgacaaagtgaccatcagctgcatcaccagcaccgacatcgacgacgacatgaactggtatcagcagaagcctggcgaggccgccatcctgcttatctctgagggaaacacactgcggcctggcatccctcctagattttccagcagcggctacggcaccgacttcaccctgaccatcaacaacatcgagagcgaggacgccgcctactacttctgcctgcaaagcgacaacctgcctctgacctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcgg(SEQ ID NO:348)
(氨基酸)
ETTVTQSPAFMSATPGDKVTISCITSTDIDDDMNWYQQKPGEAAILLISEGNTLRPGIPPRFSSSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCLQSDNLPLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1014)
通过柔性接头连接的人源化重链和轻链。
修饰的人源化8F9A4A3序列(密码子优化)
(DNA)
Caggttcagctggttcagtctggcgccgaagtgaagaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggtgtccggaaataccttcaccgagtacaccatgcactgggtccgacaggcccctggcaaaggactggaatggatcggcggcttcaaccccaacaacggcgtgaccaactacaaccagaaattcaagggcaaagtgaccctgaccgtggacaccagcagcagcacagcctacatggaactgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaaggtactaccacagcctgtacgtgttctacttcgactactggggccagggcaccctggtcacagtttcttctggcggtggcggaagcggaggcggtggctccggtggcggaggcagcgaaacgacagtgacgcagtctccagcattcatgtcagcgactccaggagacaaagtcaccatctcctgcataaccagcactgatattgatgatgatatgaactggtaccaacagaaaccaggagaagctgctattctgctgattagcgaaggcaatactcttcgtcctggaatcccacctcgattcagtagcagcgggtatggaacagattttaccctcacaattaataacatagaatctgaggatgctgcatattacttctgtttgcaaagtgataacttgcctctcacgttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgg(SEQ ID NO:349)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGNTFTEYTMHWVRQAPGKGLEWIGGFNPNNGVTNYNQKFKGKVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRYYHSLYVFYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSETTVTQSPAFMSATPGDKVTISCITSTDIDDDMNWYQQKPGEAAILLISEGNTLRPGIPPRFSSSGYGTDFTLTINNIESEDAAYYFCLQSDNLPLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1015)
8F9A5A1重链可变区序列
(DNA)
atccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccaacatatgttgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccaccactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacacgtctacatatttctgtgcaagattgagggggatacgaccgggtcccttggcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca(SEQ ID NO:350)
(氨基酸)
IQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYVDDFKGRFAFSLETSATTAYLQINNLKNEDTSTYFCARLRGIRPGPLAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:1016)
IGHV7-81*01V区序列
(DNA)
caggtgcagctggtgcagtctggccatgaggtgaagcagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacagtttcaccacctatggtatgaattgggtgccacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggttcaacacctacactgggaacccaacatatgcccagggcttcacaggacggtttgtcttctccatggacacctctgccagcacagcatacctgcagatcagcagcctaaaggctgaggacatggccatgtattactgtgcgaga(SEQ ID NO:351)
(氨基酸)
QVQLVQSGHEVKQPGASVKVSCKASGYSFTTYGMNWVPQAPGQGLEWMGWFNTYTGNPTYAQGFTGRFVFSMDTSASTAYLQISSLKAEDMAMYYCAR(SEQ ID NO:1017)
IGHJ4*03J区序列
(DNA)
tactttgactactggggccaagggaccctggtcaccgtctcctca(SEQ ID NO:352)
(氨基酸)
YFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1018)
SEQ ID NO:1019
人源化8F9A5A1重链可变区序列
(DNA)
Caggtgcagctggtgcagtctggccatgaggtgaagcagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaaactatggaatgaactgggtgccacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggataaacacctacactggagagccaacatatgttgatgacttcaagggacggtttgtcttctccatggacacctctgccagcacagcatacctgcagatcagcagcctaaaggctgaggacatggccatgtattactgtgcaagattgagggggatacgaccgggtcccttggcttactggggccaagggaccctggtcaccgtctcctca(SEQ ID NO:353)
(氨基酸)
QVQLVQSGHEVKQPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVPQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYVDDFKGRFVFSMDTSASTAYLQISSLKAEDMAMYYCARLRGIRPGPLAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1019)
人源化8F9A5A1重链可变区序列(密码子优化)
(DNA)
caggttcagctggtgcagtctggccacgaagtgaaacagcctggcgcctctgtgaaggtgtcctgtaaagccagcggctacacctttaccaactacggcatgaactgggtgccccaggctcctggacaaggcttggaatggatgggctggatcaacacctacaccggcgagcctacctacgtggacgacttcaagggcagattcgtgttcagcatggacaccagcgccagcacagcctacctgcagatcagctctctgaaggccgaggatatggccatgtactactgcgccagactgagaggcatcagacctggacctctggcctattggggacagggcacactggtcacagtgtcctct(SEQ ID NO:354)
(氨基酸)
QVQLVQSGHEVKQPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVPQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYVDDFKGRFVFSMDTSASTAYLQISSLKAEDMAMYYCARLRGIRPGPLAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1020)
修饰的人源化8F9A5A1重链可变区序列
(DNA)
cagatccagctggtgcagtctggccccgaggtgaagcagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggataaacacctacactggagagccaacatatgttgatgacttcaagggacggtttgccttctccatggacacctctgccagcacagcatacctgcagatcagcagcctaaaggctgaggacaccgccacctattactgtgcaagattgagggggatacgaccgggtcccttggcttactggggccaagggaccctggtcaccgtctcctca(SEQ ID NO:355)
(氨基酸)
QIQLVQSGPEVKQPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYVDDFKGRFAFSMDTSASTAYLQISSLKAEDTATYYCARLRGIRPGPLAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1021)
修饰的人源化8F9A5A1重链可变区序列(密码子优化)
(DNA)
cagattcagctggtgcagtctggccccgaagtgaaacaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctacacctttaccaactacggcatgaactgggtcaagcaggcccctggacaaggcctggaatggatgggctggatcaacacctacaccggcgagcctacctacgtggacgacttcaagggcagattcgccttcagcatggacaccagcgccagcacagcctacctgcagatcagctctctgaaggccgaggacaccgccacctactactgtgccagactgagaggcatcagacccggacctctggcctattggggacagggaacactggtcaccgtgtcctct(SEQ ID NO:356)
(氨基酸)
QIQLVQSGPEVKQPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYVDDFKGRFAFSMDTSASTAYLQISSLKAEDTATYYCARLRGIRPGPLAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1022)
8F9A5A1轻链可变区序列
(DNA)
gaaattttgctcacccagtctccagcaatcatagctgcatctcctggggagaaggtcaccatcacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaaaccaggatcctcccccaaaatatggatttatggtatatccaacctggcttctggagttcctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacatctttctctttcacaatcaacagcatggaggctgaagatgttgccacttattactgtcagcaaaggagtagttacccacccacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgg(SEQ ID NO:357)
(氨基酸)
EILLTQSPAIIAASPGEKVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGSSPKIWIYGISNLASGVPARFSGSGSGTSFSFTINSMEAEDVATYYCQQRSSYPPTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:1023)
IGKV3D-15*02V区序列
(DNA)
gaaatagtgatgatgcagtctccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcaacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccaccagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcaccatcagcagcctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtataataac(SEQ ID NO:358)
(氨基酸)
EIVMMQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNN(SEQ ID NO:1024)
IGKJ4*02J区序列
(DNA)
ctcacgttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa(SEQ ID NO:359)
(氨基酸)
LTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:1025)
人源化8F9A5A1轻链可变区序列
(DNA)
gaaatagtgatgatgcagtctccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtatatccaacctggcttctggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcaccatcagcagcctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcaaaggagtagttacccacccacgttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgg(SEQ ID NO:360)
(氨基酸)
EIVMMQSPATLSVSPGERATLSCSASSSVSYMNWYQQKPGQAPRLLIYGISNLASGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQRSSYPPTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1026)
人源化8F9A5A1轻链可变区序列(密码子优化)
(DNA)
gagatcgtgatgatgcagagccccgccacactgagtgtgtctccaggcgaaagagccacactgtcctgtagcgccagcagcagcgtgtcctacatgaactggtatcagcagaagcccggacaggcccctagactgctgatctacggcatcagcaatctggccagcggcatccctgccagattttctggctctggctccggcaccgagttcaccctgacaatctctagcctgcagagcgaggacttcgccgtgtactactgccagcagagaagcagctaccctcctacctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcgg(SEQ ID NO:361)
(氨基酸)
EIVMMQSPATLSVSPGERATLSCSASSSVSYMNWYQQKPGQAPRLLIYGISNLASGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQRSSYPPTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1027)
修饰的人源化8F9A5A1轻链可变区序列
(DNA)
gaaatagtgctgacccagtctccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctctggatctatggtatatccaacctggcttctggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacaagcttcagcctcaccatcagcagcctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcaaaggagtagttacccacccacgttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgg(SEQ ID NO:362)
(氨基酸)
EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCSASSSVSYMNWYQQKPGQAPRLWIYGISNLASGIPARFSGSGSGTSFSLTISSLQSEDFAVYYCQQRSSYPPTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1028)
修饰的人源化8F9A5A1轻链可变区序列(密码子优化)
(DNA)
gagatcgtgctgacacagtctcccgccacactgagtgtgtctccaggcgaaagagccacactgtcctgtagcgccagcagcagcgtgtcctacatgaactggtatcagcagaagcccggacaggcccctagactgtggatctacggcatcagcaatctggccagcggcatccctgccagattttctggctctggctccggcaccagcttcagcctgacaatcagcagcctgcagagcgaggacttcgccgtgtactactgccagcagagaagcagctaccctcctacctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcgg(SEQ ID NO:363)
(氨基酸)
EIVLTQSPATLSVSPGERATLSCSASSSVSYMNWYQQKPGQAPRLWIYGISNLASGIPARFSGSGSGTSFSLTISSLQSEDFAVYYCQQRSSYPPTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1029)
修饰的人源化8F9A5A1 scFV序列(密码子优化)
(DNA)
Cagattcagctggtgcagtctggccccgaagtgaaacaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggccagcggctacacctttaccaactacggcatgaactgggtcaagcaggcccctggacaaggcctggaatggatgggctggatcaacacctacaccggcgagcctacctacgtggacgacttcaagggcagattcgccttcagcatggacaccagcgccagcacagcctacctgcagatcagctctctgaaggccgaggacaccgccacctactactgtgccagactgagaggcatcagacccggacctctggcctattggggacagggaacactggtcaccgtgtcctctggcggtggcggaagcggaggcggtggctccggtggcggaggcagcgagatcgtgctgacacagtctcccgccacactgagtgtgtctccaggcgaaagagccacactgtcctgtagcgccagcagcagcgtgtcctacatgaactggtatcagcagaagcccggacaggcccctagactgtggatctacggcatcagcaatctggccagcggcatccctgccagattttctggctctggctccggcaccagcttcagcctgacaatcagcagcctgcagagcgaggacttcgccgtgtactactgccagcagagaagcagctaccctcctacctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcgg(SEQ ID NO:364)
(氨基酸)
QIQLVQSGPEVKQPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYVDDFKGRFAFSMDTSASTAYLQISSLKAEDTATYYCARLRGIRPGPLAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSVSPGERATLSCSASSSVSYMNWYQQKPGQAPRLWIYGISNLASGIPARFSGSGSGTSFSLTISSLQSEDFAVYYCQQRSSYPPTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1030)
8H5H5G4重链可变区序列
(DNA)
gtccagctgcaacagtctggacctgatctggtgaagcctgggacttcagtgaagatatcctgtaagacttctggaaacacattcactgaatacaccatgcactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaggttttaatcctaacaatggtgttactaactacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggattctgcagtctattactgtgcaagacgttactaccatagtacctacgtgttctactttgactcctggggccaaggcaccactctcacagtctcctca(SEQ IDNO:365)
(氨基酸)
VQLQQSGPDLVKPGTSVKISCKTSGNTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGFNPNNGVTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYHSTYVFYFDSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:1031)
IGHV1-24*01V区序列
(DNA)
caggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggtttccggatacaccctcactgaattatccatgcactgggtgcgacaggctcctggaaaagggcttgagtggatgggaggttttgatcctgaagatggtgaaacaatctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccgaggacacatctacagacacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcaaca(SEQ ID NO:366)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT(SEQ ID NO:1032)
IGHJ4*03J区序列
(DNA)
tactttgactactggggccaagggaccctggtcaccgtctcctca(SEQ ID NO:367)
(氨基酸)
YFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1033)
人源化8H5H5G4重链可变区序列
(DNA)
caggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggtttccggaaacacattcactgaatacaccatgcacTgggtgcgacaggctcctggaaaagggcttgagtggatgggaggttttaatcctaacaatggtgttactaactacaaccagaagttcaagggcAgagtcaccatgaccgaggacacatctacagacacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtGcaagacgttactaccatagtacctacgtgttctactttgactcctggggccaagggaccctggtcaccgtctcctca(SEQ IDNO:368)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGNTFTEYTMHWVRQAPGKGLEWMGGFNPNNGVTNYNQKFKGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRYYHSTYVFYFDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1034)
人源化8H5H5G4重链可变区序列(密码子优化)
(DNA)
caggttcagctggttcagtctggcgccgaagtgaagaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggtgtccggaaataccttcaccgagtacaccatgcactgggtccgacaggcccctggcaaaggacttgaatggatgggcggcttcaaccccaacaacggcgtgaccaactacaaccagaaattcaagggccgcgtgaccatgaccgaggacacaagcacagacaccgcctacatggaactgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaaggtactaccacagcacctacgtgttctacttcgacagctggggccagggcacactggtcacagtttcttct(SEQ IDNO:369)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGNTFTEYTMHWVRQAPGKGLEWMGGFNPNNGVTNYNQKFKGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRYYHSTYVFYFDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1035)
修饰的人源化8H5H5G4重链可变区序列
(DNA)
caggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggtttccggaaacacattcactgaatacaccatgcactgggtgcgacaggctcctggaaaagggcttgagtggatcggaggttttaatcctaacaatggtgttactaactacaaccagaagttcaagggcaaggtcaccctgaccgtggacacatctagcagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcaagacgttactaccatagtacctacgtgttctactttgactcctggggccaagggaccctggtcaccgtctcctca(SEQ IDNO:370)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGNTFTEYTMHWVRQAPGKGLEWIGGFNPNNGVTNYNQKFKGKVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRYYHSTYVFYFDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1036)
修饰的人源化8H5H5G4重链可变区序列(密码子优化)
(DNA)
caggttcagctggttcagtctggcgccgaagtgaagaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggtgtccggaaataccttcaccgagtacaccatgcactgggtccgacaggcccctggcaaaggactggaatggatcggcggcttcaaccccaacaacggcgtgaccaactacaaccagaaattcaagggcaaagtgaccctgaccgtggacaccagcagcagcacagcctacatggaactgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaaggtactaccacagcacctacgtgttctacttcgacagctggggccagggcacactggtcacagtttcttct(SEQ IDNO:371)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGNTFTEYTMHWVRQAPGKGLEWIGGFNPNNGVTNYNQKFKGKVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRYYHSTYVFYFDSWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:1037)
8H5H5G4轻链可变区序列
(DNA)
gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagtgcaagtcagggcattagcaattatttaaactggtttcagcagaaaccagatggaactattaagctcctgatctattacacatcaagtttacattcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgggacagattattctctcaccatcagtaatgtggaacctgaagatattgccacttactattgtcagcagtatagtaagcttccttacacgttcggaggggggaccaagctggagataaaacgg(SEQ ID NO:372)
(氨基酸)
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWFQQKPDGTIKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNVEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:1038)
IGKV1-27*01V区序列
(DNA)
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcgagtcagggcattagcaattatttagcctggtatcagcagaaaccagggaaagttcctaagctcctgatctatgctgcatccactttgcaatcaggggtcccatctcggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagatgttgcaacttattactgtcaaaagtataacagtgcccct(SEQ ID NO:373)
(氨基酸)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAP(SEQ ID NO:1039)
IGKJ4*02J区序列
(DNA)
ctcacgttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa(SEQ ID NO:374)
(氨基酸)
LTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:1040)
人源化8H5H5G4轻链可变区序列
(DNA)
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgcagtgcaagtcagggcattagcaattatttaaacTggtatcagcagaaaccagggaaagttcctaagctcctgatctattacacatcaagtttacattcaggggtcccatctcggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagatgttgcaacttattactgtcagcagtatagtaagcttccttacacgttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgg(SEQ ID NO:375)
(氨基酸)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQKPGKVPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSKLPYTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1041)
人源化8H5H5G4轻链可变区序列(密码子优化)
(DNA)
gacatccagatgacacagagccctagcagcctgtctgccagcgtgggagacagagtgaccatcacatgtagcgccagccagggcatcagcaactacctgaactggtatcagcagaaacccggcaaggtgcccaagctgctgatctactacaccagcagcctgcacagcggcgtgccaagcagattttctggcagcggctctggcaccgacttcaccctgaccatatctagcctgcagcctgaggacgtggccacctactactgtcagcagtacagcaagctgccctacacctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcgg(SEQ ID NO:376)
(氨基酸)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQKPGKVPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYSKLPYTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1042)
修饰的人源化8H5H5G4轻链可变区序列
(DNA)
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgcagtgcaagtcagggcattagcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagggaaagttcctaagctcctgatctattacacatcaagtttacattcaggggtcccatctcggttcagtggcagtggatctgggacagattacactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagatgttgcaacttattactgtcagcagtatagtaagcttccttacacgttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgg(SEQ ID NO:377)
(氨基酸)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQKPGKVPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQQYSKLPYTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1043)
修饰的人源化8H5H5G4轻链可变区序列(密码子优化)
(DNA)
gacatccagatgacacagagccctagcagcctgtctgccagcgtgggagacagagtgaccatcacatgtagcgccagccagggcatcagcaactacctgaactggtatcagcagaaacccggcaaggtgcccaagctgctgatctactacaccagcagcctgcacagcggcgtgccaagcagattttctggcagcggctctggcaccgactacaccctgaccatatctagcctgcagcctgaggacgtggccacctactactgtcagcagtacagcaagctgccctacacctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcgg(SEQ ID NO:378)
(氨基酸)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQKPGKVPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQQYSKLPYTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1044)
修饰的人源化8H5H5G4 scFV序列(密码子优化)
(DNA)
Caggttcagctggttcagtctggcgccgaagtgaagaaacctggcgcctctgtgaaggtgtcctgcaaggtgtccggaaataccttcaccgagtacaccatgcactgggtccgacaggcccctggcaaaggactggaatggatcggcggcttcaaccccaacaacggcgtgaccaactacaaccagaaattcaagggcaaagtgaccctgaccgtggacaccagcagcagcacagcctacatggaactgagcagcctgagaagcgaggacaccgccgtgtactactgcgccagaaggtactaccacagcacctacgtgttctacttcgacagctggggccagggcacactggtcacagtttcttctggcggtggcggaagcggaggcggtggctccggtggcggaggcagcgacatccagatgacacagagccctagcagcctgtctgccagcgtgggagacagagtgaccatcacatgtagcgccagccagggcatcagcaactacctgaactggtatcagcagaaacccggcaaggtgcccaagctgctgatctactacaccagcagcctgcacagcggcgtgccaagcagattttctggcagcggctctggcaccgactacaccctgaccatatctagcctgcagcctgaggacgtggccacctactactgtcagcagtacagcaagctgccctacacctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcgg(SEQ ID NO:379)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGNTFTEYTMHWVRQAPGKGLEWIGGFNPNNGVTNYNQKFKGKVTLTVDTSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRYYHSTYVFYFDSWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQGISNYLNWYQQKPGKVPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQQYSKLPYTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1045)
人IgG1重链恒定区序列：(用于制备全长抗体-与κ或λ恒定区配对；2个质粒，一起表达)
(DNA)
gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacagtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(SEQ ID NO:380)
(氨基酸)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:1046)
人IgG2重链恒定区序列：(用于制备全长抗体-与κ或λ恒定区配对；2个质粒，一起表达)
(DNA)
gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatag(SEQ ID NO:381)
(氨基酸)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:1047)
人κ轻链恒定区序列：
(DNA)
aggacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(SEQ ID NO:382)
(氨基酸)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:1048)
人λ轻链恒定区序列：
(DNA)
ggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatag(SEQ ID NO:383)
(氨基酸)
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO:1049)
人IgG1 Fc区序列：(与scFv融合以进行同型二聚)
(DNA)
gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga(SEQ ID NO:384)
(氨基酸)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO:1050)
人IgG2 Fc区序列：
(DNA)
gagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatag(SEQ ID NO:385)
(氨基酸)
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK*(SEQ ID NO:1051)
在本发明的另一个方面，将经工程改造以表达CAR的免疫细胞施用于被诊断患有癌症或癌症转移或者处于发生癌症或癌症转移风险下的患者，其中还对免疫细胞进行工程改造以表达抗NME7抗体或抗体片段，它可以从诱导型启动子表达。在一个方面，CAR由抗MUC1*抗体片段引导。在一种情况下，CAR是huMNC2-CAR44。在一个方面，抗NME7抗体或抗体片段结合“A1、A2、B1、B2或B3肽的同源肽”和“A1、A2、B1、B2或B3肽的同源延伸肽”部分下列出的NME肽。在另一个方面，抗体或抗体片段结合选自A1、A2、B1、B2或B3(SEQ ID NO:141-145)的NME7衍生肽。在又一个方面，抗体、抗体片段或抗体模拟物结合包含B3肽的NME7肽。在本发明的一个方面，抗NME7抗体、抗体片段或抗体模拟物包含源自抗NME7抗体8F9A4A3(SEQ ID NO:1001–1015)、8F9A5A1(SEQ ID NO:1016–1030)或8H5H5G4(SEQ ID NO:1031–1045)的可变结构域的序列。
此类抗体可以是人的或人源化的。此类抗体可以是多克隆的、单克隆的、双特异性的、二价的、单价的、单链的、scFv，或者可以是抗体模拟物，诸如存在结合特异性靶标的识别区域的蛋白质支架。如本领域技术人员所理解，抗体可以是非人来源的、人的或人源化的。用于使抗体人源化的方法包括使所有或一些小鼠可变区与最接近匹配人抗体序列的V区和J区融合，例如，如SEQ ID NO:1001-1045所列出的序列中所示。还可以制造完整抗体，而不是单链构建体。举例来说，重链可变小鼠序列与人V区和J区融合，然后与IgG1、IgG2或IgG3的人重链恒定区融合。同样，轻链可变小鼠序列与人V区和J区融合，然后与IgG1、IgG2或IgG3的人κ或λ恒定区融合。质粒一起表达并缔合以形成完全抗体(SEQ ID NO:1047-1051)。
在本发明的另一个方面，小分子是因其抑制NME7、NME7AB或NME7-X1的致瘤作用的能力而被选择的抗癌剂。举例来说，高通量筛检鉴定了可治疗癌症的小分子。在多孔板中，将小分子单独加入到在含有NME7AB的培养基中培养癌细胞的孔中。如果小分子减少了变成漂浮物的细胞的量和/或减少了转移标记物(如CXCR4、CHD1或多能干细胞标记物)的表达，则该小分子是抗癌药物候选物。鉴定作为抗癌剂的小分子的另一种方法是选择那些结合NME7、NME7AB或NME7-X1或者抑制NME7种类表达的小分子。又一种高通量筛检是选择抑制NME7AB与MUC1*胞外结构域的PSMGFR肽结合的小分子，而且那些小分子将是抗癌剂。
NME7AB和NME7-X1的序列的不同仅在于NME7-X1缺失了NME7AB所具有的一些N末端序列。实验表明，存在一种与NME7AB近乎相同的天然存在的NME7种类，我们称其为NME7AB样种类。结合NME7-X1的抗体还可能结合模拟NME7AB的天然存在的种类，除非存在构象差异，这样就可以区分抗体。因此，如果需要抑制NME7-X1而不抑制NME7AB样种类，或相反，则可以使用siRNA、反义核酸或基因编辑技术来抑制一种而不抑制另一种的表达。
在一种情况下，抗癌治疗剂是直接或间接抑制NME7、NME7-X1或NME7AB样种类的特异性表达的核酸。此类核酸可以是直接抑制NME7种类的siRNA、RNAi、反义核酸等等。在本发明的另一个方面，核酸可以间接地抑制NME7种类，例如通过改变调控它的分子的表达。例如，超级增强子BRD4抑制NME7的表达。因此，用于治疗或预防癌症的有效治疗剂是增加BRD4表达的剂。一种有效治疗剂可能是增加BRD4辅因子JMJD6表达的剂。
衍生自NME7AB或NME7-X1或整个蛋白质的肽用于在动物体内产生抗NME7或抗NME7-X1抗体，我们已经证明了所述抗体抑制癌症生长并抑制癌细胞向转移性癌细胞转变。同样，可以将NME7衍生肽施用于人，使得它们产生能治疗或预防癌症或者抑制癌细胞向转移性癌细胞转变的抗体。将NME7肽或蛋白质作为一种疫苗施用于人，以刺激接受者产生抗NME7、抗NME7AB或抗NME7-X1抗体。图12和图13中所示的结果表明，用一组源自NME7、尤其是NME7-X1或NME7AB序列的肽使人免疫可能是一种比用单一肽进行免疫更有效的疫苗。所述肽或蛋白质还可以与本领域技术人员已知的载体蛋白质或其他佐剂缀合以辅助刺激免疫反应。
优选位于DM10结构域外的NME7肽来产生用于治疗或预防癌症的抗体。可施用于患者以预防癌症或转移的肽含有图6至图9中列出的肽序列。A1、A2、B1、B2和B3是产生结合NME7AB和NME7-X1的抗体的肽的实例，并且被施用于患者以治疗或预防癌症。本发明不限于具有如NME7或NME7-X1中天然存在的精确序列的肽。如本领域技术人员已知的，取代肽序列的几个氨基酸仍能产生特异性识别天然蛋白质序列的抗体。不希望本发明受限于本文证明能抑制癌症生长或抑制常规癌细胞向转移性癌细胞转变的肽。这里用于鉴定肽A1、A2、B1、B2和B3的方法还可以用于鉴定与本文所示的肽同样或更加有效的其他肽序列。
包含人NME7AB或NME7-X1的部分或者包含结合NME7AB或NME7-X1的抗体片段的嵌合抗原受体分子是抗癌治疗剂，并施用于患者以治疗或预防癌症或癌症转移。
在一种情况下，使用称为CAR(嵌合抗原受体)技术或CAR T技术的技术使抗NME7抗体的识别单元或可变区与T细胞分子融合。可以用于治疗性地治疗或预防癌症的抗体或其片段的突出特征是鉴定识别NME7并防止其与促进癌症的靶标相互作用的抗体样可变区。在一种情况下，靶标是MUC1*的PSMGFR区。
抗体、抗体片段或单链抗体可以工程改造成嵌合分子，包括嵌合抗原受体，也称为CAR，然后将所述分子转染或转导到如T细胞等免疫系统细胞中，并施用于患者。人源化抗体或抗体片段，通常是scFv，包含CAR胞外结构域的大部分。使抗体片段生物化学融合至免疫系统信号传导分子如作为跨膜域的CD8，和胞质信号传导基序如T细胞受体信号传导分子，也称为激活域，或共刺激域，包括但不限于CD3-ζ、CD28、41bb、OX40。可以将CAR转染到T细胞或其他细胞、优选免疫系统细胞中，并施用于患者。这里，我们描述了CAR，其中细胞外部分含有抗NME7、抗NME7AB或抗NME7-X1抗体、抗体片段或单链、scFv抗体片段。在一个优选实施方案中，抗体或抗体片段是人的或人源化的。
有效抗NME7或抗NME7-X1抗体或片段将能够结合天然NME7、NME7AB或NME7-X1。在实践中，通过用NME7、NME7AB或NME7-X1衍生肽对动物进行免疫来产生亲本抗体，由此对CAR的胞外结构域进行工程改造。在本发明的一个方面，免疫肽包括NME7氨基酸1-376。在本发明的一个方面，免疫肽包括NME7氨基酸92-376。在本发明的另一个方面，免疫肽包括NME7氨基酸125-376。在本发明的又一个方面，免疫肽由图6至图8中列出的序列组成。在本发明的另一个方面，免疫肽由图9中列出的序列组成。或者，亲本抗体或抗体片段选自抗体文库或抗体库，它们可以是天然的、合成的或任一种的片段，其中它们因结合NME7、NME7AB或NME7-X1、图6至图8中列出的肽或图9中列出的肽的能力而被选择。
CAR的靶向部分无需是抗体或抗体片段。这里，我们描述了一种CAR，其中胞外结构域含有NME7片段。将NME7衍生肽工程改造至不同种类的CAR中，其中胞外结构域的靶向部分是蛋白质片段或肽，而不是抗体或抗体片段。将肽CAR转染或转导至免疫系统细胞、通常T细胞中。NME7片段或NME7衍生肽因其结合其同源结合伴侣的能力而被选择，但应当不能呈完整NME7、NME7AB或NME7-X1形式发挥功能并赋予致瘤活性。使NME7片段或NME7衍生肽生物化学融合至免疫系统信号传导分子如作为跨膜域的CD8，和胞质信号传导基序如T细胞受体信号传导分子，也称为激活域，或共刺激域，包括但不限于CD3-ζ、CD28、41bb、OX40。
在本发明的一个方面，NME7片段是NME7 NDPK B结构域的大部分或全部。在本发明的另一个方面，NME7片段是含有一个或多个图6至图9中列出的肽序列的NME7肽。实验表明，对于使用NME7或者NME7、NME7AB或NME7-X1片段作为针对经工程改造的免疫细胞治疗剂的嵌合抗原受体(CAR)的靶向部分的策略，NME7AB或NME7-X1的相当大的片段将比更短的肽，例如长度少于15个氨基酸的肽更有效。或者，可以将各自带有不同的NME7AB衍生肽的一组CAR共同转染或转导到免疫系统细胞中，并施用于患者以治疗或预防癌症。图12至图13中所示的实验支持了这种方法的有效性。
将在其胞外结构域中含有NME7片段的CAR转染或转导到免疫系统细胞、通常是T细胞中，并施用于患者以治疗或预防癌症。在一个方面，癌症是MUC1*阳性癌症。在另一个方面，癌症是转移性癌症。
抑制切割NME7的酶的剂可用于治疗或预防癌症。一些形式的NME7被隔离在细胞内且因此不会从细胞中分泌出来，因此它们可以作为促进癌症的生长因子。全长NME7是42kDa。然而，我们发现约33kDa NME7种类缺乏DM10结构域并且似乎与我们产生的重组NME7AB基本相同，由癌细胞和干细胞分泌。这种约33kDa NME7种类和另一种约25kDa NME7种类可能是切割产物，它们将会被抑制NME7切割的剂消除。
检测到患者样品中NME7或被我们称为NME7AB样种类的约33kDa NME7种类或NME7-X1的水平升高可诊断存在癌症或其进展至更具侵袭性或转移性的状态。本发明人已经发现，早期初始干细胞和癌细胞、尤其MUC1*阳性癌细胞，表达大量缺乏DM10结构域的约33kDaNME7和NME7-X1。
NME7-X1最近在蛋白质数据库中被列为NME7的理论替代同种型，然而，它从未在组织或细胞中被检测到。我们设计了通过PCR区分NME7-X1和NME7的引物。通过PCR在一组细胞中测量人NME7、NME7a、NME7b和NME7-X1的表达水平，包括成纤维细胞、人胚胎干细胞、人iPS细胞、T47D人乳腺癌细胞、DU145人前列腺癌细胞、PC3人前列腺癌细胞、HEK295人胎肝细胞和其他人干细胞系。NME7在癌细胞中的表达水平高于干细胞中。具体来说，与在成纤维细胞或干细胞中的表达相比，NME7-X1在前列腺癌细胞中的表达为10倍而在乳腺癌细胞中的表达为3倍。NME7-X1在HEK293胎肝细胞中的表达为它在成纤维细胞或干细胞中的表达的约5倍，因此预测NME7-X1在肝癌中升高。NME7b在前列腺癌细胞中的表达为干细胞中的17至25倍。
在患者样品中检测到NME7种类水平升高将是患者患有癌症或有患癌症风险的指标。NME7种类的水平可以通过PCR、杂交方案、循环探针技术、FISH、免疫细胞化学、IHC、蛋白质印迹、免疫沉淀、夹心测定、ELISA测定等来测量或评估。患者样品可以是体液样品、血液样品、乳汁、尿液、细胞、液体活检物、活检物等等。在被诊断患有癌症的患者中，NME7种类水平升高是转移潜力增加的指标。NME7-X1水平升高是前列腺癌的指标。本发明的抗体用于检测和区分NME7种类，并用作诊断工具。
由于成体细胞和组织不表达显著水平的NME7或分泌NME7，因此诊断癌症或诊断更具侵袭性或转移性形式或向更具侵袭性形式的转变的有效方式是测量来自患者、来自细胞或组织的集合体或者来自经培养的细胞的样品中NME7的水平，并与健康样品中的NME7水平相比较或者与已知在健康成人细胞或组织中存在的NME7水平相比较。NME7水平增加指示存在癌症、存在转移性癌症或开始转移。NME7水平升高还表明MUC1*阳性癌症。针对NME7的存在测定的样品可以是一组细胞，所述细胞可能是培养的细胞系或来自患者、体液、血液样品、组织样本或活检样本的细胞。因此，将检测癌症的存在或癌症进展的诊断测定包括以下步骤：1)从患有癌症或有患癌症风险的患者获得样品；2)对所述样品进行能够检测或测量NME7的水平或NME7编码核酸的水平的测定；3)将测试样品中测得的NME7蛋白或NME7编码核酸的水平与对照患者或对照细胞中的水平进行比较；4)确定NME7或NME7编码核酸的水平与对照组相比升高；以及5)如果与测试进行比较的对照来自先前被诊断患有癌症的供体，则得出测试样品的供体患有癌症或具有癌症进展的结论。
在此测定中，与测试样品进行比较的对照样品可以是非癌细胞、经培养的细胞、来自健康供体的样品、来自供体的非癌样品或来自测试样品的供体的样品，其中对照样品是在先前的时间点从供体取得的。此类样品的来源可以是从针对癌症的存在或进展测试的患者取得的任何样本，包括体液、脑脊液、骨髓样品、血液、组织、细胞、活检组织或细胞、源自患者细胞的经培养的细胞等。与测试样品进行比较的样品的来源可以是体液、脑脊液、骨髓样品、血液、组织、细胞、活检组织或细胞，或者可源自健康供体或测试患者的培养细胞，其中样品是在先前的时间点采集的。与测试样品进行比较的测得水平可以来自先前记录的数据，并且被编辑成列表以便与测试样品进行比较。
治疗诊断学
然后用抑制NME7表达、抑制NME7切割或抑制NME7与其靶标结合的治疗剂治疗被诊断为NME7蛋白或NME7编码核酸水平升高的患者，其中这种相互作用促进癌症。NME7或NME7切割产物的一个重要靶标是MUC1*。NME7结合MUC1*胞外结构域并使其二聚。因此，被诊断为NME7水平升高的患者将受益于利用抑制NME7的治疗剂和/或抑制胞外结构域包括部分或全部PSMGFR序列的MUC1切割形式二聚的治疗剂进行的治疗。因此，评估癌症治疗的适用性和施用有效量的治疗剂用于治疗或预防癌症将由以下步骤组成：1)从疑似患有癌症或有患癌症的风险或有发展转移性癌症的风险的患者获得样品；2)测量NME7或其切割产物或NME7编码核酸的量，其中所测量的水平显著高于在对照样品中测量的那些水平；3)确定所述患者患有癌症或已发展为更具侵袭性或转移性的癌症；4)向所述患者施用有效量的抑制NME7表达、抑制NME7切割或抑制NME7与其靶标结合的治疗剂和/或向所述患者施用有效量的抑制MUC1表达、抑制MUC1切割成成MUC1*或抑制MUC1*与其靶标结合的治疗剂。在一个优选实施方案中，抑制NME7与其靶标结合的治疗剂抑制其与MUC1*的相互作用。在一个更优选实施方案中，它抑制其与基本上由PSMGFR序列构成的MUC1*胞外结构域的相互作用。在一个优选实施方案中，抑制MUC1*与其靶标结合的治疗剂抑制MUC1*与NME7之间的相互作用。在一个更优选实施方案中，抑制MUC1*与NME7之间的相互作用的治疗剂抑制了MUC1*与基本上由NME7AB序列构成的NME7部分的结合。
化学修饰的肽
多肽或抗体治疗剂可能存在循环半衰期短和蛋白水解降解以及溶解度低问题。为了改善本发明生物药物的药代动力学和药效学性质，可采用诸如操纵氨基酸序列的方法来降低或增加免疫原性并减少蛋白水解切割；可进行肽与免疫球蛋白和血清蛋白(如白蛋白)的融合或缀合；还可将生物药物如本发明的肽和抗体掺入到药物递送媒介物中以用于保护和缓释；并且还考虑了与天然或合成聚合物缀合。具体来说，对于合成聚合物缀合，还考虑了聚乙二醇化或酰化，如N-酰化、S-酰化等。
核酸构建体
还提供了包含如本文所述的本发明的核酸分子的表达载体，其中所述核酸分子可操作地连接至表达控制序列。还提供了用于产生多肽的宿主-载体系统，所述系统包含本发明的表达载体，所述表达载体已被引入到适合于表达所述多肽的宿主细胞中。合适的宿主细胞可以是细菌细胞(如大肠杆菌)、酵母细胞(如巴斯德毕赤酵母)、昆虫细胞(如草地贪夜蛾)，或哺乳动物细胞(如COS、HEK或CHO细胞)。
本发明还提供了产生本发明多肽的方法，其通过使本文所述的宿主-载体系统的细胞在允许产生所述多肽条件下生长以及回收如此产生的所述多肽来实现。可用于实施本发明的多肽可通过使其在原核或真核表达系统中表达来制备。
可使用许多方法来使重组基因表达并且可使用许多方法来纯化所述多肽。可将所述基因亚克隆到诸如但不限于pZErO的细菌表达载体中。
可通过允许随后形成稳定的生物活性蛋白质的任何技术来纯化所述多肽。例如，但不作为限制，可将因子作为可溶性蛋白质或作为包涵体从细胞中回收，可通过8M盐酸胍和透析将它们从包涵体中定量提取。为了进一步纯化所述因子，可使用许多纯化方法，包括但不限于常规离子交换色谱、亲和色谱、异糖色谱(different sugar chromatography)、疏水相互作用色谱、反相色谱或凝胶过滤。
当用于本文时，多肽包括功能等效分子，其中用氨基酸残基取代序列内的残基，从而导致沉默或保守变化。举例来说，序列内的一个或多个氨基酸残基可以被充当功能等效物的具有类似极性的另一个氨基酸取代，由此导致沉默或保守改变。用于所述序列内的氨基酸的取代物可选自所述氨基酸所属的类的其它成员。举例来说，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。潜在糖基化氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸和天冬酰胺。还包括在本发明范围内的是表现出相同或相似生物活性的蛋白质或其片段或衍生物，以及在翻译过程中或翻译后被差异地修饰(例如通过糖基化、蛋白水解切割、连接至抗体分子或其他细胞配体等被差异地修饰)的衍生物。
本领域技术人员已知的用于将DNA片段插入到载体中的任何方法都可用于使用适当的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列构建编码本发明多肽的表达载体。这些方法可包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组(基因重组)。编码本发明多肽的核酸序列的表达可由第二核酸序列调控，以使得所述多肽在用重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，本文所述的多肽的表达可由本领域已知的任何启动子/增强子元件控制。可用于控制所述多肽的表达的启动子包括但不限于如Squinto等人，(1991,Cell 65:1-20)中描述的长末端重复序列；SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon,1981,Nature 290:304-310)；CMV启动子；M-MuLV 5’末端重复序列，包含在劳斯肉瘤病毒的3'长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等人，1980,Cell 22:787-797)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:144-1445)；金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等人，1982,Nature 296:39-42)；原核表达载体，如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727-3731)；或tac启动子(DeBoer等人，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25)，还参见“Useful proteins from recombinantbacteria”,Scientific American,1980,242:74-94；来自酵母或其他真菌的启动子元件，如Gal 4启动子、ADH(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子和以下动物转录控制区，它们表现出组织特异性并且已用于转基因动物中：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人，1984,Cell 38:639-646；Ornitz等人,1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409；MacDonald,1987,Hepatology7:425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan,1985,Nature 315:115-122)；在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，1984,Cell 38:647-658；Adames等人，1985,Nature 318:533-538；Alexander等人，1987,Mol.Cell.Biol.7:1436-1444)；在睾丸、乳腺、淋巴样和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等人，1986,Cell 45:485-495)；在肝脏中有活性的仙台病毒、慢病毒、白蛋白基因控制区(Pinkert等人，1987,Genes and Devel.1:268-276)；在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人，1985,Mol.Cell.Biol.5:1639-1648；Hammer等人,1987,Science 235:53-58)；在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人,1987,Genes and Devel.1:161-171)；在骨髓细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区(Mogram等人,1985,Nature 315:338-340；Kollias等人,1986,Cell 46:89-94)；在大脑中的少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等人，1987,Cell 48:703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Shani,1985,Nature 314:283-286)；以及在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等人，1986,Science 234:1372-1378)。
因此，根据本发明，包含编码如本文所述的多肽的核酸的能够在细菌或真核宿主中复制的表达载体被用于转染宿主并由此指导此种核酸的表达以产生多肽，所述多肽然后可以生物活性形式回收。如本文所用，生物活性形式包括能够结合至相关受体并引起分化功能并且/或者影响表达所述受体的细胞的表型的形式。
含有核酸插入物的表达载体可通过但不限于至少三种通用途径来鉴定：(a)DNA-DNA杂交，(b)“标记物”基因功能的存在或不存在，以及(c)插入序列的表达。在第一种途径中，插入在表达载体中的外来核酸的存在可使用包含与插入的核酸序列同源的序列的探针通过DNA-DNA杂交来检测。在第二种途径中，重组载体/宿主系统可基于由外来核酸序列在载体中的插入而引起的某些“标记物”基因功能(例如，胸苷激酶活性，对抗生素的抗性、转化表型、杆状病毒中的闭塞体(occlusion body)形成等)的存在或不存在来鉴定和选择。例如，如果将efl核酸序列插入到载体的标记物基因序列内，则可通过标记物基因功能的不存在来鉴定含有插入物的重组体。在第三种途径中，重组表达载体可通过测定由重组构建体表达的外来核酸产物来鉴定。此类测定可基于，例如，目标核酸产物的物理或功能性质，例如，通过配体与受体或其部分的结合(所述受体或其部分可用例如可检测的抗体或其部分标记)或者与针对目标蛋白质或其部分产生的抗体的结合。
多肽(特别是本发明的修饰的多肽)可以在宿主细胞中瞬时、组成型或永久表达。
可以使用本领域技术人员已知的方法来确定可用于治疗本申请中指示的疾病或病症的有效剂量(参见例如，Fingl等人，The Pharmacological Basis of Therapeutics,Goodman和Gilman编,Macmillan Publishing Co,New York,第1-46页(1975)。根据本发明使用的药物组合物包含在药理学上可接受的液体、固体或半固体载体中的上述多肽，所述多肽连接至载体或靶向分子(例如，抗体、激素、生长因子等)；以及/或者在体内施用前掺入到脂质体、微胶囊和控释制备物中的上述多肽。例如，所述药物组合物可包含在水溶液，如无菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液或右旋糖溶液中的多肽。替代地，活性剂可包含在固体(例如蜡)或半固体(例如凝胶状)制剂中，所述制剂可被植入到需要这种治疗的患者内。施用途径可以是本领域已知的任何施用模式，包括但不限于静脉内、鞘内、皮下、子宫内、通过注射到受累组织中、动脉内、鼻内、经口，或经由植入装置施用。
施用可使本发明的活性剂分布于全身或局部区域。例如，在一些涉及神经系统远端区域的疾患中，可能需要静脉内或鞘内施用剂。在一些情况下，可将含有活性剂的植入物放置在病变区域内或附近。合适的植入物包括但不限于明胶海绵、蜡、喷雾器(spray)或基于微粒的植入物。
本发明还提供了这样的药物组合物，其包含在药理学上可接受的媒介物中的本文所述的多肽。所述组合物可全身或局部施用。可以使用本领域中已知的任何合适的施用模式，包括但不限于静脉内、鞘内、动脉内、鼻内、经口、皮下、腹膜内或通过局部注射或手术植入。还提供了缓释制剂。
基因疗法
基因疗法是指通过向受试者施用已表达或可表达的核酸来执行的疗法。在本发明的此实施方案中，核酸产生其编码的介导治疗效果的蛋白质。
可以根据本发明使用本领域中可利用的任何基因疗法方法。下面描述了示例性方法。
对于基因疗法方法的一般综述，参见Goldspiel等人，Clinical Pharmacy 12:488-505(1993)；Wu和Wu,Biotherapy 3:87-95(1991)；Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993)；Mulligan,Science 260:926-932(1993)；以及Morgan和Anderson,Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993)；May,TIBTECH 11(5):155-215(1993)。可以使用的重组DNA技术领域中公知的方法描述于Ausubel等(编),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993)；和Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)中。
核酸向患者中的递送可以是直接递送，在这种情况下，将所述患者直接暴露于核酸或携带核酸的载体中；或间接递送，在这种情况下，首先使用核酸在体外对细胞进行转化，然后将细胞移植到患者中。这两种途径分别被称为体内或离体基因疗法。
在具体实施方案中，直接体内施用核酸序列，在体内它们将被表达从而产生编码的产物。这可通过本领域中已知的多种方法中的任一种来完成，例如通过将它们构建为适当核酸表达载体的一部分并且对它们进行施用从而使得其成为细胞内的，例如，通过使用缺陷型或减毒型逆转录病毒或其他病毒载体感染，或通过裸DNA的直接注射，或用脂质体或细胞表面受体或转染剂包被，包封在脂质体、微粒或微胶囊中，或通过将其连接至已知能进入细胞核的肽而施用，通过将其连接至经受受体介导的内吞作用的配体而施用(参见例如Wu和Wu,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))(其可用于靶向特异性地表达所述受体的细胞类型)等。在另一个实施方案中，可形成核酸-配体复合物，其中所述配体包含促融合(fusogenic)病毒肽以破坏内体，从而使得所述核酸能够避免溶酶体降解。在又一个实施方案中，通过靶向特异性受体，可在体内靶向核酸以用于细胞特异性摄取和表达。替代地，可通过同源重组将核酸引入细胞内并且掺入在宿主细胞DNA内用于表达(Koller和Smithies,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:8932-8935(1989)；Zijlstra等人，Nature 342:435-438(1989))。
在一个具体实施方案中，使用了含有编码所述多肽的核酸序列的病毒载体。将欲用于基因疗法的编码所述多肽的核酸序列克隆至一个或多个使所述基因容易递送至患者中的载体中。慢病毒载体(如逆转录病毒载体)以及其他载体(如腺病毒载体和腺相关病毒)是可使用的病毒载体的实例。逆转录病毒载体含有正确包装病毒基因组和整合到宿主细胞DNA中所必需的组分。
腺病毒是用于将基因递送至呼吸道上皮细胞中的特别有吸引力的媒介物，因为它们自然感染呼吸道上皮细胞，并在那里引起轻微疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶标是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感不分裂细胞的优点。此外，腺相关病毒(AAV)也已被提议用于基因疗法。
基因疗法的另一途径涉及通过此类诸如电穿孔、脂质转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染的方法将基因转移到组织培养物中的细胞中。通常，转移方法包括将可选择标记物转移到细胞中。然后对细胞进行选择，以便分离出已摄取且正表达所转移的基因的那些细胞。然后将那些细胞递送到患者中。
在此实施方案中，在体内施用所得重组细胞之前将核酸引入到细胞中。此种引入可通过本领域已知的任何方法进行，所述方法包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含有核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。用于将外来基因引入到细胞中的许多技术是本领域已知的，并且可根据本发明使用，条件是接受者细胞的必要发育和生理功能不被破坏。所述技术应该能将核酸稳定地转移到细胞中，从而使得所述核酸可由所述细胞表达，并且优选地可由其细胞子代遗传和表达。
可向其中引入核酸用于基因疗法目的的细胞涵盖任何所需的、可获得的细胞类型，并且包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞诸如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；例如，如从骨髓、脐带血、外周血、胎肝等获得的各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞。
在一个优选实施方案中，用于基因疗法的细胞是患者的自体细胞。
在使用重组细胞执行基因疗法的实施方案中，将编码所述多肽的核酸序列引入到所述细胞中，由此使得它们可由所述细胞或其子代表达，并且然后体内施用所述重组细胞以获得治疗效果。在一个具体实施方案中，使用了干细胞或祖细胞。根据本发明的此实施方案，可潜在使用在体外分离和维持的任何干细胞和/或祖细胞。
在一个具体实施方案中，将出于基因疗法目的引入的核酸包含可操作地连接到编码区的诱导型启动子，由此使得核酸的表达可通过控制适当的转录诱导物的存在或不存在来控制。
治疗性组合物
治疗性化合物的制剂是本领域公知的，并且可以方便地参考Remington'sPharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,USA。例如，可以每天每千克体重施用约0.05ng至约20mg。可以调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，可以每日施用数个分次剂量，或可以如治疗情况的紧急程度所指示按比例减少所述剂量。活性化合物可以方便的方式，如通过经口、静脉内(在可溶于水的情况下)、肌肉内、皮下、鼻内、眼内、真皮内或栓剂途径或植入(例如使用缓释分子经由腹膜内途径，或者使用体外致敏并过继转移至接受者中的细胞，例如单核细胞或树突状细胞)施用。根据施用途径，肽可能需要被包覆于用于保护其免遭酶、酸或其它可能使所述成分失活的自然条件的影响的材料中。
例如，肽的低亲脂性将会使得它们能够在胃肠道中被能够切割肽键的酶破坏，在胃中被酸水解所破坏。为了通过非肠胃外施用方式施用肽，将所述肽用阻止其失活的材料包覆，或者将所述肽与阻止其失活的材料一起施用。例如，可将肽在佐剂中施用，与酶抑制剂共同施用或在脂质体中施用。本文考虑的佐剂包括间苯二酚、非离子表面活性剂如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟代磷酸(DEP)和特斯乐(trasylol)。脂质体包括水包油包水CGF乳液以及常规脂质体。
活性化合物还可以肠胃外或腹膜内施用。还可以在甘油液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备分散体。在普通储存和使用条件下，这些制备物含有用于阻止微生物生长的防腐剂。
适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液(在可溶于水的情况下)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有的情况下，所述形式必须是无菌的并且必须具有达到容易注射的程度的流动性。它在制造和储存条件下必须稳定，且必须能抵御诸如细菌和真菌的微生物的污染作用。载体可以是含有以下各项的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适合的混合物，以及植物油。可以例如通过使用包衣(如卵磷脂)、在分散体情况下通过维持所需颗粒大小，以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。对微生物作用的阻止可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
通过将所需量的活性化合物与以上列举的各种其他成分(根据需要)掺入到适当溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般来说，通过将各种无菌活性成分掺入到含有基本分散介质和来自以上列举的所需其他成分的无菌媒介物中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该真空干燥和冷冻干燥技术产生活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何另外所需成分的粉末。
当肽如上所述的那样被适当地保护时，活性化合物可以例如与惰性稀释剂一起或与可同化的可食用载体一起口服施用，或者其可以被包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者其可以被压制成片剂，或者其可以直接与饮食的食物一起掺在一起。对于口服治疗性施用，活性化合物可与赋形剂掺在一起并且可以呈可摄入片剂、口含片剂(buccal tablet)、锭剂、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用。此类组合物和制备物应含有至少1重量％的活性化合物。占所述组合物和制备物的百分比当然可以改变，并且可以方便地在单位重量的约5％至约80％之间。此类治疗有用的组合物中的活性化合物的量使得将获得适合的剂量。制备优选的根据本发明的组合物或制备物，以使得经口剂量单位形式含有介于约0.1μg与2000mg之间的活性化合物。
所述片剂、丸剂、胶囊等还可能含有以下：粘合剂，如黄蓍树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；以及甜味剂，如可添加蔗糖、乳糖或糖精；或调味剂，如胡椒薄荷、冬青油或樱桃香精。当单位剂型是胶囊时，除上述类型的材料之外，它可含有液体运载体。可能存在作为包衣或者用于以其他方式修饰剂量单位的物理形式的各种其他材料。例如，可以用虫胶、糖或两者包覆片剂、丸剂或胶囊。糖浆或酏剂可以含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂(如樱桃或橙调味剂)。当然，在制备任何单位剂型中使用的任何材料应当是药用纯的并且在所使用的量下基本上无毒。此外，可将活性化合物掺入到持续释放制备物和制剂中。
递送系统
多种递送系统是已知的并且可以用于施用本发明的化合物，例如封装于脂质体、微粒、微胶囊、能够表达所述化合物的重组细胞、受体介导的内吞、核酸作为逆转录病毒或其他载体的一部分的构建等。引入方法包括但不限于真皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、眼内、硬膜外和经口途径。所述化合物或组合物可以通过任何方便的途径，例如通过输注或快速浓注、通过经由上皮或皮肤粘膜内层(mucocutaneous lining)(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收来施用，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。此外，可能需要通过包括脑室内和鞘内注射在内的任何合适的途径将本发明的药物化合物或组合物引入到中枢神经系统；脑室内注射可用例如附接至储器(如Ommaya储器)的脑室内导管来促进。还可以例如通过使用吸入器或喷雾器，以及含有雾化剂的制剂来执行肺部施用。
在一个具体实施方案中，可能希望将本发明的药物化合物或组合物局部施用至需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于以下方式来实现：在外科手术期间局部输注；局部施涂，例如在外科手术之后与伤口敷料联合；通过注射；借助于导管；借助于栓剂；或借助于植入物，所述植入物是多孔、非多孔或凝胶状材料，包括膜(如硅橡胶膜)或纤维。优选地，当施用包括本发明的抗体或肽在内的蛋白质时，必须注意使用不吸收蛋白质的材料。在另一个实施方案中，所述化合物或组合物可在囊泡，特别是脂质体中递送。在又一个实施方案中，所述化合物或组合物可以在受控释放系统中递送。在一个实施方案中，可使用泵。在另一个实施方案中，可使用聚合物材料。在又一个实施方案中，受控释放系统可被放置成接近治疗靶标，因此只需要全身剂量的一部分。
独立文本的序列表
关于除a、g、c、t以外的核苷酸符号的使用，它们遵循WIPO标准ST.25附录2表1中所示的规约，其中k代表t或g；n代表a、c、t或g；m代表a或c；r代表a或g；s代表c或g；w代表a或t，且y代表c或t。
MTPGTQSPFF LLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSAT QRSSVPSSTE KNAVSMTSSVLSSHSPGSGS STTQGQDVTL APATEPASGS AATWGQDVTS VPVTRPALGS TTPPAHDVTS APDNKPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGSTAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDNRPALGS TAPPVHNVTS ASGSASGSASTLVHNGTSAR ATTTPASKST PFSIPSHHSD TPTTLASHST KTDASSTHHS SVPPLTSSNH STSPQLSTGVSFFFLSFHIS NLQFNSSLED PSTDYYQELQ RDISEMFLQI YKQGGFLGLS NIKFRPGSVV VQLTLAFREGTINVHDVETQ FNQYKTEAAS RYNLTISDVS VSDVPFPFSA QSGAGVPGWG IALLVLVCVL VALAIVYLIALAVCQCRRKN YGQLDIFPAR DTYHPMSEYP TYHTHGRYVP PSSTDRSPYE KVSAGNGGSS LSYTNPAVAA
ASANL(SEQ ID NO:1)描述了全长MUC1受体(粘蛋白1前体，Genbank登录号：P15941)。
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT(SEQ ID NO:2)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTA(SEQ ID NO:3)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLT VVTG(SEQ ID NO:4)
SEQ ID NO:2、3和4描述了用于将MUC1受体和截短同种型引导至细胞膜表面的N末端MUC-1信号传导序列。如SEQ ID NO:2、3和4中的变体所指明，在C末端可能不存在最多3个氨基酸残基。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO:5)描述了一种截短的MUC1受体同种型，在其N末端具有nat-PSMGFR，并且包括全长MUC1受体的跨膜和胞质序列。
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6)描述了MUC1生长因子受体的天然一级序列(nat-PSMGFR，即“PSMGFR”的一个实例)的胞外结构域：
TINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:7)描述了MUC1生长因子受体天然一级序列(nat-PSMGFR，即“PSMGFR”的一个实例)的胞外结构域，其在SEQID NO:6)的N末端具有单一氨基酸缺失：
GTINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:8)描述了具有增强稳定性的MUC1生长因子受体的天然一级序列的“SPY”功能变体(var-PSMGFR，即“PSMGFR”的一个实例)的胞外结构域：
TINVHDVETQFNQYKTEAASPYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:9)描述了具有增强稳定性的MUC1生长因子受体的天然一级序列的“SPY”功能变体(var-PSMGFR，即“PSMGFR”的一个实例)的胞外结构域，其在SEQ ID NO:8)的C末端具有单一氨基酸缺失。
tgtcagtgccgccgaaagaactacgggcagctggacatctttccagcccgggatacctaccatcctatgagcgagtaccccacctaccacacccatgggcgctatgtgccccctagcagtaccgatcgtagcccctatgagaaggtttctgcaggtaacggtggcagcagcctctcttacacaaacccagcagtggcagccgcttctgccaacttg(SEQID NO:10)描述了MUC1胞质结构域核苷酸序列。
CQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO:11)描述了MUC1胞质结构域氨基酸序列。
gagatcctgagacaatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggtatgttgaatacactatattcagtacattttgttaataggagagcaatgtttattttcttgatgtactttatgtatagaaaataa(SEQ ID NO:12)描述了NME7核苷酸序列(NME7：GENBANK登录号AB209049)。
DPETMNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGMLNTLYSVHFVNRRAMFIFLMYFMYRK(SEQ ID NO:13)描述了NME7氨基酸序列(NME7：GENBANK登录号AB209049)。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQ ID NO:14)描述了NM23-H1核苷酸序列(NM23-H1：GENBANK登录号AF487339)。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(SEQ ID NO:15)NM23-H1描述了氨基酸序列(NM23-H1：GENBANK登录号AF487339)。
atggtgctactgtctactttagggatcgtctttcaaggcgaggggcctcctatctcaagctgtgatacaggaaccatggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcggtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQ ID NO:16)描述了NM23-H1 S120G突变体核苷酸序列(NM23-H1：GENBANK登录号AF487339)。
MVLLSTLGIVFQGEGPPISSCDTGTMANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGGDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE(SEQ ID NO:17)描述了NM23-H1 S120G突变体氨基酸序列(NM23-H1：GENBANK登录号AF487339)。
atggccaacctggagcgcaccttcatcgccatcaagccggacggcgtgcagcgcggcctggtgggcgagatcatcaagcgcttcgagcagaagggattccgcctcgtggccatgaagttcctccgggcctctgaagaacacctgaagcagcactacattgacctgaaagaccgaccattcttccctgggctggtgaagtacatgaactcagggccggttgtggccatggtctgggaggggctgaacgtggtgaagacaggccgagtgatgcttggggagaccaatccagcagattcaaagccaggcaccattcgtggggacttctgcattcaggttggcaggaacatcattcatggcagtgattcagtaaaaagtgctgaaaaagaaatcagcctatggtttaagcctgaagaactggttgactacaagtcttgtgctcatgactgggtctatgaataa(SEQ ID NO:18)描述了NM23-H2核苷酸序列(NM23-H2:GENBANK登录号AK313448)。
MANLERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVAMKFLRASEEHLKQHYIDLKDRPFFPGLVKYMNSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVKSAEKEISLWFKPEELVDYKSCAHDWVYE(SEQ ID NO:19)描述了NM23-H2氨基酸序列(NM23-H2：GENBANK登录号AK313448)。
经优化以供大肠杆菌表达的人NM23-H7-2序列：
(DNA)
atgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQ ID NO:20)
(氨基酸)
MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ ID NO:21)
人NME7-A：
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(SEQ ID NO:22)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQ ID NO:23)
人NME7-A1：
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga(SEQID NO:24)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQ ID NO:25)
人NME7-A2：
(DNA)
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgtttttttga(SEQ IDNO:26)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQ ID NO:27)
人NME7-A3：
(DNA)
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttacttga(SEQ ID NO:28)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQ ID NO:29)
人NME7-B：
(DNA)
atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(SEQ ID NO:30)
(氨基酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ IDNO:31)
人NME7-B1：
(DNA)
atgaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(SEQ ID NO:32)
(氨基酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN—(SEQ ID NO:33)
人NME7-B2：
(DNA)
atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(SEQ ID NO:34)
(氨基酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ ID NO:35)
人NME7-B3：
(DNA)
atgccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(SEQ ID NO:36)
(氨基酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN--(SEQ ID NO:37)
人NME7-AB，又称NME7AB：
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattagtga(SEQ ID NO:38)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN--(SEQ IDNO:39)
人NME7-AB1：
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttctga(SEQ ID NO:40)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ ID NO:41)
经优化以供大肠杆菌表达的人NME7-A序列：
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga(SEQ ID NO:42)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQ ID NO:43)
经优化以供大肠杆菌表达的人NME7-A1序列：
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga(SEQID NO:44)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQ ID NO:45)
经优化以供大肠杆菌表达的人NME7-A2序列：
(DNA)
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttctga(SEQ IDNO:46)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFF-(SEQ ID NO:47)
经优化以供大肠杆菌表达的人NME7-A3序列：
(DNA)
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttacctga(SEQ ID NO:48)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFT-(SEQ ID NO:49)
经优化以供大肠杆菌表达的人NME7-B序列：
(DNA)
atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(SEQ ID NO:50)
(氨基酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ IDNO:51)
经优化以供大肠杆菌表达的人NME7-B1序列：
(DNA)
atgaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQ ID NO:52)
(氨基酸)
MNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQID NO:53)
经优化以供大肠杆菌表达的人NME7-B2序列：
(DNA)
atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(SEQ ID NO:54)
(氨基酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ ID NO:55)
经优化以供大肠杆菌表达的人NME7-B3序列：
(DNA)
atgccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQ ID NO:56)
(氨基酸)
MPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ ID NO:57)
经优化以供大肠杆菌表达的人NME7-AB，又称NME7AB序列：
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataattga(SEQ ID NO:58)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ IDNO:59)
经优化以供大肠杆菌表达的人NME7-AB1，又称NME7AB1序列：
(DNA)
Atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttctga(SEQ ID NO:60)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF-(SEQ ID NO:61)
小鼠NME6
(DNA)
Atgacctccatcttgcgaagtccccaagctcttcagctcacactagccctgatcaagcctgatgcagttgcccacccactgatcctggaggctgttcatcagcagattctgagcaacaagttcctcattgtacgaacgagggaactgcagtggaagctggaggactgccggaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagcggctggtggagttcatgacaagtgggccaatccgagcctatatccttgcccacaaagatgccatccaactttggaggacactgatgggacccaccagagtatttcgagcacgctatatagccccagattcaattcgtggaagtttgggcctcactgacacccgaaatactacccatggctcagactccgtggtttccgccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaggaaccccagctgcggtgtggtcctgtgcactacagtccagaggaaggtatccactgtgcagctgaaacaggaggccacaaacaacctaacaaaacctag(SEQ ID NO:62)
(氨基酸)
MTSILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRTRELQWKLEDCRRFYREHEGRFFYQRLVEFMTSGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARYIAPDSIRGSLGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVHYSPEEGIHCAAETGGHKQPNKT-(SEQ ID NO:63)
人NME6：
(DNA)
Atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(SEQ ID NO:64)
(氨基酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQ ID NO:65)
人NME6 1：
(DNA)
Atgacccagaatctggggagtgagatggcctcaatcttgcgaagccctcaggctctccagctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga(SEQ ID NO:66)
(氨基酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQ ID NO:67)
人NME6 2：
(DNA)
Atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtga(SEQ ID NO:68)
(氨基酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQ ID NO:69)
人NME6 3：
(DNA)
Atgctcactctagccctgatcaagcctgacgcagtcgcccatccactgattctggaggctgttcatcagcagattctaagcaacaagttcctgattgtacgaatgagagaactactgtggagaaaggaagattgccagaggttttaccgagagcatgaagggcgttttttctatcagaggctggtggagttcatggccagcgggccaatccgagcctacatccttgcccacaaggatgccatccagctctggaggacgctcatgggacccaccagagtgttccgagcacgccatgtggccccagattctatccgtgggagtttcggcctcactgacacccgcaacaccacccatggttcggactctgtggtttcagccagcagagagattgcagccttcttccctgacttcagtgaacagcgctggtatgaggaggaagagccccagttgcgctgtggccctgtgtgctatagcccagagggaggtgtccactatgtagctggaacaggaggcctaggaccagcctga(SEQ ID NO:70)
(氨基酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQ ID NO:71)
经优化以供大肠杆菌表达的人NME6序列：
(DNA)
Atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga(SEQ ID NO:72)
(氨基酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQ ID NO:73)
经优化以供大肠杆菌表达的人NME6 1序列：
(DNA)
Atgacgcaaaatctgggctcggaaatggcaagtatcctgcgctccccgcaagcactgcaactgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga(SEQ ID NO:74)
(氨基酸)
MTQNLGSEMASILRSPQALQLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQ ID NO:75)
经优化以供大肠杆菌表达的人NME6 2序列：
(DNA)
Atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctga(SEQ ID NO:76)
(氨基酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPV-(SEQ ID NO:77)
经优化以供大肠杆菌表达的人NME6 3序列：
(DNA)
Atgctgaccctggctctgatcaaaccggacgctgttgctcatccgctgattctggaagcggtccaccagcaaattctgagcaacaaatttctgatcgtgcgtatgcgcgaactgctgtggcgtaaagaagattgccagcgtttttatcgcgaacatgaaggccgtttcttttatcaacgcctggttgaattcatggcctctggtccgattcgcgcatatatcctggctcacaaagatgcgattcagctgtggcgtaccctgatgggtccgacgcgcgtctttcgtgcacgtcatgtggcaccggactcaatccgtggctcgttcggtctgaccgatacgcgcaataccacgcacggtagcgactctgttgttagtgcgtcccgtgaaatcgcggcctttttcccggacttctccgaacagcgttggtacgaagaagaagaaccgcaactgcgctgtggcccggtctgttattctccggaaggtggtgtccattatgtggcgggcacgggtggtctgggtccggcatga(SEQ ID NO:78)
(氨基酸)
MLTLALIKPDAVAHPLILEAVHQQILSNKFLIVRMRELLWRKEDCQRFYREHEGRFFYQRLVEFMASGPIRAYILAHKDAIQLWRTLMGPTRVFRARHVAPDSIRGSFGLTDTRNTTHGSDSVVSASREIAAFFPDFSEQRWYEEEEPQLRCGPVCYSPEGGVHYVAGTGGLGPA-(SEQ ID NO:79)
OriGene-NME7-1全长序列
(DNA)
gacgttgtatacgactcctatagggcggccgggaattcgtcgactggatccggtaccgaggagatctgccgccgcgatcgccatgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttctctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataatacgcgtacgcggccgctcgagcagaaactcatctcagaagaggatctggcagcaaatgatatcctggattacaaggatgacgacgataaggtttaa(SEQ ID NO:80)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDNTRTRRLEQKLISEEDLAANDILDYKDDDDKV(SEQ ID NO:81)
Abnova NME7-1全长序列
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO:82)
Abnova部分NME7-B
(氨基酸)
DRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKIL(SEQ ID NO:83)
组氨酸标签
(ctcgag)caccaccaccaccaccactga(SEQ ID NO:84)
Strept II标签
(accggt)tggagccatcctcagttcgaaaagtaatga(SEQ ID NO:85)
N-10肽：
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:86)
C-10肽：
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(SEQ ID NO:87)
LALIKPDA(SEQ ID NO:88)
MMMLSRKEALDFHVDHQS(SEQ ID NO:89)
ALDFHVDHQS(SEQ ID NO:90)
EILRDDAICEWKRL(SEQ ID NO:91)
FNELIQFITTGP(SEQ ID NO:92)
RDDAICEW(SEQ ID NO:93)
SGVARTDASESIRALFGTDGIRNAA(SEQ ID NO:94)
ELFFPSSGG(SEQ ID NO:95)
KFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMA(SEQ ID NO:96)
LMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVT(SEQ ID NO:97)
EFYEVYKGVVTEYHD(SEQ ID NO:98)
EIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNA(SEQ ID NO:99)
YSGPCVAM(SEQ ID NO:100)
FREFCGP(SEQ ID NO:101)
VHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO:102)
IQNAVHCTD(SEQ ID NO:103)
TDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO:104)
PEDGLLEVQYFFK(SEQ ID NO:105)
EIINKAGFTITK(SEQ ID NO:106)
MLSRKEALDFHVDHQS(SEQ ID NO:107)
NELIQFITT(SEQ ID NO:108)
EILRDDAICEWKRL(SEQ ID NO:109)
SGVARTDASESIRALFGTDGI(SEQ ID NO:110)
SGVARTDASES(SEQ ID NO:111)
ALFGTDGI(SEQ ID NO:112)
NCTCCIVKPHAVSE(SEQ ID NO:113)
LGKILMAIRDA(SEQ ID NO:114)
EISAMQMFNMDRVNVE(SEQ ID NO:115)
EVYKGVVT(SEQ ID NO:116)
EYHDMVTE(SEQ ID NO:117)
EFCGPADPEIARHLR(SEQ ID NO:118)
AIFGKTKIQNAV(SEQ ID NO:119)
LPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO:120)
GPDSFASAAREMELFFP(SEQ ID NO:121)
源自人NME7的免疫肽
ICEWKRL(SEQ ID NO:122)
LGKILMAIRDA(SEQ ID NO:123)
HAVSEGLLGK(SEQ ID NO:124)
VTEMYSGP(SEQ ID NO:125)
NATKTFREF(SEQ ID NO:126)
AIRDAGFEI(SEQ ID NO:127)
AICEWKRLLGPAN(SEQ ID NO:128)
DHQSRPFF(SEQ ID NO:129)
AICEWKRLLGPAN(SEQ ID NO:130)
VDHQSRPF(SEQ ID NO:131)
PDSFAS(SEQ ID NO:132)
KAGEIIEIINKAGFTITK(SEQ ID NO:133)
源自人NME1的免疫肽
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFE(SEQ ID NO:134)
VDLKDRPF(SEQ ID NO:135)
HGSDSVESAEKEIGLWF(SEQ ID NO:136)
ERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFE(SEQ ID NO:137)
VDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLN(SEQ ID NO:138)
NIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELV(SEQ ID NO:139)
KPDGVQRGLVGEII(SEQ ID NO:140)
源自人NME7但不结合NME1的免疫肽
MLSRKEALDFHVDHQS(SEQ ID NO:141)肽A1
SGVARTDASES(SEQ ID NO:142)肽A2
DAGFEISAMQMFNMDRVNVE(SEQ ID NO:143)肽B1
EVYKGVVTEYHDMVTE(SEQ ID NO:144)肽B2
AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(SEQ ID NO:145)肽B3
人NME7 a
(DNA)
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattag(SEQ ID NO:146)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO:147)
人NME7 b：
(DNA)
atgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattag(SEQ ID NO:148)
(氨基酸)
MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO:149)
人NME7-AB，又称NME7AB
(DNA)
atggaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattag(SEQ ID NO:150)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN(SEQ ID NO:151)
人NME7-X1
(DNA)
atgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattag(SEQ ID NO:152)
(氨基酸)
MMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN*(SEQ ID NO:153)
人NME7 a(经优化以供大肠杆菌表达)
(DNA)
atgaatcactccgaacgctttgtttttatcgccgaatggtatgacccgaatgcttccctgctgcgccgctacgaactgctgttttatccgggcgatggtagcgtggaaatgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataat(SEQID NO:154)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDNTG(SEQ ID NO:155)
人NME7 b(经优化以供大肠杆菌表达)
(DNA)
atgcatgacgttaaaaatcaccgtacctttctgaaacgcacgaaatatgataatctgcatctggaagacctgtttattggcaacaaagtcaatgtgttctctcgtcagctggtgctgatcgattatggcgaccagtacaccgcgcgtcaactgggtagtcgcaaagaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataat(SEQ ID NO:156)
(氨基酸)
MHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDNTG(SEQ ID NO:157)
人NME7-AB，又称NME7AB(经优化以供大肠杆菌表达)
(DNA)
atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataat(SEQ ID NO:158)
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDNTG(SEQ IDNO:159)
人NME7-X1(经优化以供大肠杆菌表达)
(DNA)
atgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataat(SEQ ID NO:160)
(氨基酸)
MMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDNTG(SEQ ID NO:161)
NME7的DM10结构域
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRK(SEQ ID NO:162)
PSMGFR肽的片段或变异
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ ID NO:163)；
PSMGFR肽的片段或变异
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ ID NO:164)；
PSMGFR肽的片段或变异
VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQY(SEQ ID NO:165)；
PSMGFR肽的片段或变异
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTIN(SEQ ID NO:166)；
PSMGFR肽的片段或变异
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTE(SEQ ID NO:167)；
PSMGFR肽的片段或变异
VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVP(SEQ ID NO:168)。
NME7B肽3(B结构域)的残基14处的Cys突变为Ser：
AIFGKTKIQNAVHSTDLPEDGLLEVQYFF(SEQ ID NO:169)
N-10肽
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:170)
C-10肽
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(SEQ ID NO:171)
实施例
实施例1-基本无血清基质(“MM”)的组分(500ml)
400ml DME/F12/GlutaMAX I(Invitrogen#10565-018)
100ml Knockout血清替代物(KO-SR，Invitrogen#10828-028)
5ml 100x MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen#11140-050)
0.9ml(0.1mM)β-巯基乙醇(55mM储备液，Invitrogen#21985-023。
实施例2-产生蛋白质构建体
为了产生重组NME7，首先制造构建体以制造能有效表达并且呈可溶形式的重组NME7。第一种方法是制造将编码天然NME7(a)或具有N末端缺失的替代剪接变体NME7(b)的构建体。在某些情况下，所述构建体带有组氨酸标签或链霉素标签以辅助纯化。NME7-a、全长NME7在大肠杆菌中表达不佳，而NME7-b在大肠杆菌中根本不表达。然而，制造了一种缺失DM10序列并且NME7基本上包含计算分子量为33kDa的NDPK A和B结构域的新颖构建体。
这种新颖NME7AB在大肠杆菌中充分表达，并且呈可溶性蛋白形式存在。NME7AB首先在NTA-Ni柱上纯化，然后在Sephadex 200柱上通过尺寸排阻色谱(FPLC)进一步纯化。收集级分并通过SDS-PAGE测试以鉴定具有最高和最纯NME7AB表达的级分。将最纯的合并级分的FPLC迹线合并。然后对纯化的NME7AB蛋白进行测试，并且证明它完全支持人干细胞生长，并进一步使它们恢复到最初始的X灭活前状态。纯化的NME7AB还被证明可以加速癌细胞生长。
实施例3-ELISA测定表明NME7AB同时结合两种MUC1*胞外结构域肽
结果如图1所示。使用Imject Maleimide活性BSA试剂盒(Thermo Fisher)使带有C末端半胱氨酸的PSMGFR肽(PSMGFR-Cys)与BSA共价偶联。PSMGFR-Cys偶联的BSA在0.1M碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH 9.6中稀释至10ug/mL，并将50uL加入到96孔平板的每个孔中。在4℃下孵育过夜后，用PBS-T将平板洗涤两次，并加入3％BSA溶液以阻断孔上的剩余结合位点。在室温下1小时之后，用PBS-T和NME7将平板洗涤两次，稀释在PBS-T+1％BSA中，以不同的浓度加入。在室温下1小时之后，用PBS-T和抗NM23-H7(B-9，Santa Cruz Biotechnology)将平板洗涤3次，稀释在PBS-T+1％BSA中，以1/500稀释度加入。在室温下1小时之后，用PBS-T和山羊抗小鼠-HRP将平板洗涤3次，稀释在PBS-T+1％BSA中，以1/3333稀释度加入。在室温下1小时之后，用PBS-T将平板洗涤3次并使用ABTS溶液(Pierce)在415nm下测量NME7结合。
ELISA MUC1*二聚：使用NME7结合方案，并且NME7是以11.6ug/mL使用。
在室温下1小时之后，用PBS-T和His标签化PSMGFR肽(PSMGFR-His)或生物素化PSMGFR肽(PSMGFR-生物素)将平板洗涤3次，稀释在PBS-T+1％BSA中，以不同的浓度加入。在室温下1小时之后，用PBS-T和抗His标签-HRP(Abcam)或链霉亲和素-HRP(Pierce)将平板洗涤3次，稀释在PBS-T+1％BSA中，以1/5000浓度加入。在室温下1小时之后，用PBS-T将平板洗涤3次，并且使用ABTS溶液(Pierce)在415nm下测量PSMGFR肽与已经与另一种PSMGFR肽(其不能通过抗His抗体或通过链霉亲和素传导信号)偶联的BSA结合的NME7的结合。
实施例4-人重组NME7AB的功能测试
为了测试重组NME7AB维持多能性和抑制分化的能力，产生了NME7的可溶性变体NME7AB并进行了纯化。按照制造商的指导，使人干细胞(iPS目录号SC101a-1，SystemBiosciences)在4ng/ml bFGF中在一层小鼠成纤维细胞滋养细胞上生长四代。然后将这些源干细胞平铺到已经包被有12.5ug/孔的单克隆抗MUC1*抗体MN-C3的6孔细胞培养板(VitaTM，Thermo Fisher)中。细胞是以300,000个细胞/孔的密度平铺。基础培养基是基本干细胞培养基，由以下组成：400ml DME/F12/GlutaMAX I(Invitrogen#10565-018)、100mlKnockout血清替代物(KO-SR，Invitrogen#10828-028)、5ml 100x MEM非必需氨基酸溶液(Invitrogen#11140-050)和0.9ml(0.1mM)β-巯基乙醇(55mM储备液，Invitrogen#21985-023)。基础培养基可以是任何培养基。在一个优选实施方案中，基础培养基不含其他生长因子和细胞因子。向基础培养基中加入8nM NME7AB或8nM NM23-H1，重新折叠并纯化为稳定二聚体。每48小时更换培养基，并且由于加速生长，因此必须在接种后第3天收集并传代。当干细胞在NM23-H1二聚体中或在NME7单体中生长时，实现了相当的多能干细胞生长。
NME7和NM23-H1(NME1)二聚体都能多能生长，即使在100％汇合时也没有分化。如照片中可见，NME7细胞比在NM23-H1二聚体中生长的细胞生长得更快。第一次收集时的细胞计数验证了NME7中的培养物产生的细胞为NM23-H1二聚体中的培养物的1.4倍。典型多能标记物的ICC染色证实了NME7AB完全支持人干细胞生长、多能性并抵抗分化。
约30-33kDa的NME7种类可能是一种替代剪接同种型或翻译后修饰，诸如切割，这可能使得能够从细胞分泌。
实施例5-通过在使干细胞恢复到更初始状态的条件下培养细胞来诱导癌细胞向转移性癌细胞转变
通常在含有血清的培养基如RPMI中培养癌细胞。我们发现在存在使干细胞恢复到更初始状态的试剂的情况下培养癌细胞会使癌细胞转变到更易转移的状态。
我们证明了NME7AB、人NME1二聚体、细菌NME1二聚体、NME7-X1和“2i”抑制剂各自能够将常规癌细胞转化为转移性癌细胞，也称为癌症干细胞“CSC”或肿瘤起始细胞“TIC”。2i是给与研究人员发现的两种生化抑制剂的名称，它们使人干细胞恢复到更初始的状态。2i是MEK和GSK3-β抑制剂PD0325901和CHIR99021，将它们加入到培养基中，分别达到约1mM和3mM的最终浓度。
NME7AB和NME7-X1在加入到不同批次的基本培养基时最终浓度为约4nM，以使癌细胞转化为转移细胞，但在约1nM到16nM范围内的较低和较高浓度也能很好地发挥作用。人或细菌NME1二聚体以最终浓度4nM至32nM使用，这些实验中通常使用16nM，其中人NME带有S120G突变。如果使用野生型，则可能需要较低浓度。预期这些确切浓度并不重要。重要的是NME1蛋白是二聚体，并且发生这种情况的浓度范围在低纳摩尔范围内，但某些突变允许更高的浓度以便保持呈二聚体形式。
同样，NME7蛋白的浓度可能会有所不同。NME7AB和NME7-X1是单体，并且用于将癌细胞转化为转移细胞的浓度应当允许蛋白质保持呈单体形式。已经提出了各种分子标记物作为转移癌细胞的指标。不同的癌症类型可能有不同的分子被上调。举例来说，受体CXCR4在转移性乳腺癌中被上调，而E-钙粘蛋白，也称为CHD1，在转移性前列腺癌中被上调更多。
除了这些特异性转移标记物以外，典型多能性标记物如OCT4、SOX2、NANOG和KLF4也会随着癌症变成转移性的而被上调。可以通过PCR测定起始癌细胞和后来的转移癌细胞，以测量这些基因的表达水平。
图2示出了在含有NME7AB的培养基中培养的T47D乳腺癌细胞的RT-PCR测量图。加入rho I激酶抑制剂ROCi、ROCKi或Ri以防止转化过的细胞从平板浮出。针对亲本细胞和NME7AB培养的细胞，测量了各种转移标记物以及多能干细胞标记物的表达水平。结果表明，与接受ROCi的细胞相比，漂浮细胞表达更高量的转移标记物和多能标记物。我们推断这是因为那些测量值是未发生转化的细胞和发生了转化但ROCi使它们保持贴壁的细胞的平均值。这在图中清楚可见，其中“-Ri”意指未接受ROCi的贴壁细胞，因此未与漂浮的高度转移性细胞混合。
当在含有NM23(又名NME1或NME7AB)的培养基中培养时，前列腺癌细胞也会向更具转移性的状态转变。这里，我们证明了对于迄今测试的每个细胞系，在NME7AB、人NME1二聚体或与人类具有高序列同源性的细菌NME中培养诱导了向更具转移性的状态转变。
图4示出了在含有2i抑制剂、NME7AB或两者的培养基中培养的乳腺癌细胞的转移标记物和多能标记物的表达水平的RT-PCR测量图。可见2i抑制剂也能够诱导癌细胞向更具转移性的状态转变。卵巢癌细胞系SK-OV3、OV-90、胰腺癌细胞系CAPAN-2和PANC-1、乳腺癌细胞系MDA-MB在NME7AB和或2i抑制剂中培养时都呈现了从贴壁到非贴壁的形态转变。
图20示出了在NME7AB中培养72或144小时的各种癌细胞系的转移标记物或多能标记物的RT-PCR测量图。图20A示出了当在NME7AB中培养时，SK-OV3细胞增加了转移标记物CHD1、SOX2和NME7-X1的表达。图20B示出了在NME7AB中培养之后，OV-90细胞增加了转移标记物CXCR4和NME7-X1的表达。
实施例6-证明在NME7中培养的癌细胞变为转移性的
癌细胞群是否具转移性的功能测试将在免疫受损的小鼠体内植入极低数量(例如200个)的细胞并观察它们是否会发展成肿瘤。通常需要5至6百万个癌细胞才能在免疫受损的小鼠中形成肿瘤。我们证明了仅仅50个NME诱导的转移性癌细胞就在小鼠体内形成了肿瘤。此外，在整个测试期间注射人NME7AB、NME1或NME7-X1的小鼠发生了远端转移。
在标准RPMI培养基中培养T47D人乳腺癌细胞14天，每48小时更换培养基，并在约75％汇合时通过了胰蛋白酶消化。然后将细胞平铺到6孔板中，并在补充有4nM NME7AB的基本干细胞培养基(见实施例1)中培养。每48小时更换培养基。到约第4天，一些细胞从表面脱离并漂浮。小心地更换培养基以保留“漂浮物”，因为这些是具有最高转移潜能的细胞，如通过RT-PCR测量转移标记物所证明。在第7天或第8天，收集漂浮物并计数。保留样品以用于RT-PCR测量。测量的关键标记物是CXCR4，它在NME7AB中短暂培养之后被上调了40-200倍。
将新收集的漂浮转移细胞异种移植到已经植入了90天缓释雌激素丸的雌性nu/nu无胸腺小鼠的侧腹。漂浮细胞各自以10,000、1,000、100或50个细胞进行异种移植。每组6只小鼠有一半还在原始植入部位附近每天注射32nM NME7AB。还向小鼠植入6百万、10,000或100个在不含NME7AB的RPMI培养基中培养的亲本T47D细胞作为对照组。即使在仅仅植入了50个细胞时，植入NME7诱导的漂浮细胞的小鼠也会出现肿瘤。植入了漂浮细胞并且每天接受NME7AB注射的小鼠还在不同的器官中出现了远端肿瘤或远端转移。在植入NME7AB培养的癌细胞之后注射人NME7AB的12只小鼠中有11只(92％)在注射部位出现了肿瘤。在植入之后未注射人NME7AB的12只小鼠中只有7只(58％)出现了肿瘤。有肿瘤并注射了人NME7AB的11只小鼠中有9只或82％在远离注射部位处出现了多个肿瘤。未注射NME7AB的小鼠无一出现多发可见肿瘤。
处死之后，RT-PCR和蛋白质印迹表明注射了NME7AB的小鼠身上的远端肿块的确是人乳腺肿瘤。对其器官的类似分析表明，除了远端肿块以外，小鼠还随机转移到肝和肺，具有植入的人乳腺癌细胞的人乳腺癌特征。正如预期的那样，只有植入了6百万个细胞的小鼠长出了肿瘤。
进行了几个类似上述实验的实验，结果基本相同。在各个实验中，有24或52只小鼠，包括所有适当的对照物。
实施例7-因其序列为NME7、A1、A2、B1、B2和B3所特有的而被选择的肽抑制了NME7种类与MUC1*胞外结构域肽的结合。
选择NME7肽作为用于抗体产生的免疫剂。NME7肽A1、A2、B1、B2和B3(图9)是使用在人NME1、人NME7和几种与人NME1或人NME7同源的细菌NME之间进行序列比对的过程选择的。鉴定了五个具有高序列同源性的区域。然而，为了防止选择会产生抑制人NME1以及人NME7的抗体的肽，我们选择了与同源区域相邻的NME7序列，其中那些肽具有与人NME1不同的序列。我们进行了ELISA测定，以查看肽本身是否可以结合至表面上的合成MUC1*肽并抑制人NME7或人NME1结合至固定的肽(图11)。图11示出了所述肽抑制了NME7和NME1与固定的PSMGFR肽的结合。回想一下，NME7 A结构域和B结构域各自都可以结合PSMGFR肽。因此，完全抑制NME7AB与PSMGFR肽结合不能用单一抗体或源自于仅一个结构域的肽来实现。这证明了衍生所述肽的那些区域是与MUC1*相互作用的区域，并且将产生会结合至NME7的那些区域并抑制其与MUC1*受体结合的抗体。
在另一个实验中，将游离肽A1、A2、B1、B2和B3加入到培养中的癌细胞，这些癌细胞正通过在NME7AB或2i中培养而向更具转移性的状态转变。图14示出了当癌细胞在NME7AB或2i抑制剂中生长时的科学家观测表，并且表明游离肽抑制了从贴壁细胞到漂浮物的形态变化，对于乳腺癌细胞而言，这与转移标记物、尤其是CXCR4的表达增加直接相关。RT-PCR测量证实了NME7AB肽抑制了转移标记物CXCR4的表达的增加。
图15示出了在NME7AB或2i抑制剂(各自将癌细胞转化至更具转移性的状态)中生长的T47D乳腺癌细胞中的CXCR4表达的RT-PCR测量图，以及NME7衍生肽A1、A2、B1、B2和B3对转移性转化的抑制作用。图32示出了图15中用于对CXCR4进行RT-PCR测量的样品中的记录RNA水平以及CXCR4表达以及对照管家基因的阈值循环数的表格。
实施例8-抗NME7抗体特异性结合人NME7但不结合人NME1
进行标准ELISA测定以确定我们通过用NME7AB肽A1、A2、B1、B2和B3免疫产生的NME7抗体是否会特异性结合至NME7AB，但不结合至人NME1，因为它具有健康功能并且用抗体阻断它可能对人类有害。图24至图25的ELISA表明由肽A1、A2、B1、B2和B3产生的所有NME7抗体都结合至人NME7AB(图24)但不结合至人NME1(图25)。用于产生这些抗体的肽对NME7AB和NME7-X1都是通用的。此测定表明由肽A1、A2、B1、B2和B3产生的抗体特异性结合至NME7AB，并通过延伸结合至NME7-X1。
NME7A肽1(A结构域)：MLSRKEALDFHVDHQS(SEQ ID NO:141)
NME7A肽2(A结构域)：SGVARTDASES(SEQ ID NO:142)
NME7B肽1(B结构域)：DAGFEISAMQMFNMDRVNVE(SEQ ID NO:143)
NME7B肽2(B结构域)：EVYKGVVTEYHDMVTE(SEQ ID NO:144)
NME7B肽3(B结构域)：AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(SEQ ID NO:145)
实施例9-抗NME7特异性抗体和产生它们的肽抑制癌细胞生长
用NME7肽A1、A2、B1、B2和B3使兔子免疫，并且在免疫肽已经缀合的柱上产生、收集和纯化抗体。将T47D乳腺癌细胞平铺，并根据ATCC方案在补充有血清的RPMI培养基中培养。以图12中所示的浓度加入用肽A1、A2、B1、B2和B3免疫而产生的抗体。还将免疫肽A1、A2、B1、B2和B3以及MUC1*的PSMGFR胞外结构域肽(这里是“FLR”)分别加入到生长的T47D乳腺癌细胞。加入紫杉醇和E6抗MUC1*Fab作为对照物。图12的图示出了所产生的抗体以及游离肽有效地抑制了癌细胞生长。注意与使用紫杉醇进行抑制的比较，紫杉醇是一视同仁地杀死健康细胞和癌细胞的化疗剂。此外，为了比较，示出了使用从氨基酸100到376的大段NME7产生的多克隆抗体。尽管这种抗体是一种有效的癌症生长抑制剂，但它可能具有非特异性作用，因为它可以结合至NME1和NME7。
在一个类似的实验中，将用肽A1、A2、B1、B2和B3免疫产生的抗体的组合以及肽本身以指定的浓度加入到生长的癌细胞中。图13中示出的细胞生长图表明抗体和肽的组合有效地抑制了癌细胞生长。在这两个实验中，细胞是MUC1*阳性乳腺癌细胞。
实施例10-抗NME7抗体抑制癌细胞向转移性癌细胞转变
当在存在使干细胞恢复到更初始状态的剂的情况下培养时，癌细胞向更具转移性的状态转化。我们已经证明了在NME7AB、人NME1二聚体、细菌NME1二聚体或MEK和GSK3-β抑制剂(称为“2i”)中培养癌细胞会导致细胞更具转移性。随着细胞向更具转移性的状态转变，它们变得不贴壁并浮出培养板。这些漂浮细胞“漂浮物”与贴壁细胞分开收集，并且被证明：a)表达更高水平的转移基因；和b)当异种移植到小鼠中时，所述漂浮细胞能够在以极低数目植入时产生肿瘤。RT-PCR测量特异性转移标记物如乳腺癌中的CXCR4、前列腺癌中的CHD1和其他多能干细胞标记物(如OCT4、SOX2、NANOG、KLF4、c-Myc等等)在NME7AB中培养的癌细胞中显著过度表达，并且在变得非贴壁的细胞(这里和图中称为“漂浮物”)中最过度表达。
这里，我们证明了通过用NME7衍生肽A1、A2、B1、B2和B3以及所述肽本身免疫而产生的NME7特异性抗体抑制了从癌细胞向转移性癌细胞转变。在这些实验中的第一个实验中，测试了通过用A1、A2、B1、B2和B3免疫产生的抗体抑制由在NME7AB中或在2i抑制剂中培养T47D乳腺癌细胞而诱导的转移性转变的能力。最引人注目的观察结果是所述抗体和肽显著减少了漂浮细胞的数量，这是所述抗体和肽已经抑制了向转移性癌细胞转化的第一标志。具体来说，用B3肽免疫而产生抗体的细胞几乎不产生任何漂浮细胞。
图14示出了各个抗体相对于未接受任何抗体处理的对照孔的可见漂浮细胞百分比的记录观测结果。从漂浮细胞和贴壁细胞提取mRNA。使用RT-PCR测量转移标记物(包括CXCR4)的表达水平。用抗NME7抗体处理大大减少了转移标记物如CXCR4的量，表明所述抗体抑制向转移性癌症转变。(见图15)。值得注意的是，通过用肽B3免疫而产生的抗体(又名抗体#61)基本上完全抑制了向更具转移性的状态转变。图15B示出了单独用NME7AB肽A1、A2、B1、B2和B3处理的乳腺癌细胞能够有效地抑制通过在含有2i抑制剂的培养基中培养细胞诱导的向更具转移性的状态转变。肽B3和它产生的抗体#61一样特别有效。图15C示出了相同的图，但Y轴被扩展以表明对转移标记物的肽抑制。测量指示细胞活力和生长的mRNA的量。用抗体处理的细胞具有少得多的mRNA，表明除了抑制向更具转移性的状态转变以外，抗NME7AB抗体还抑制癌细胞生长。图16示出了图15A所示的抑制实验的回收RNA量的表。
实施例11-用NME7衍生肽A1、A2、B1、B2和B3产生的抗NME7抗体鉴定了使用任何市售抗体都无法检测到的新颖NME7种类。
如本领域技术人员已知，一些抗体识别靶蛋白的线性部分并且可以用于蛋白质印迹测定，而其他抗体识别非线性构象基序并且可以用于下拉或免疫沉淀测定。在本申请之前，不知道存在切割NME7或同种型NME7-X1。使用提交时市售的抗体表明现有抗体无法特异性检测这些重要的NME7种类。B9(Santa Cruz Biotechnology)是针对NME7氨基酸100-376产生的单克隆抗体。图19D至图19F示出了它仅能检测全长42kDa NME7。另一种市售抗体H278是针对NME7氨基酸100-376产生的兔多克隆抗体，其包括非NME7独有的氨基酸序列。图19D至图19F示出了此抗体还染色17kDa NME1，以及全长NME7和其他似乎对NME7AB无特异性的谱带。
通过用NME7AB肽A1、A2、B1、B2或B3免疫产生的NME7抗体鉴定了新的NME7种类，包括全长42kDa蛋白，可能是切割产物或替代同种型的约33kDa NME7种类，可能是切割产物或替代同种型的约30kDa NME7种类，其中所述约30kDa种类似乎是NME7-X1。图19A至图19C示出了由肽A1、B1和B3产生的抗体在多种癌细胞系，包括T47D乳腺癌细胞、PC3和DU145前列腺癌细胞、HEK293胎肝细胞以及白血病细胞IM-9、K562和MV411中鉴定了NME7、NME7AB和NME7-X1的分泌形式。
实施例12–抗NME7抗体的产生
使用具有NME7 B3区序列的合成肽AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFC使兔子免疫。用NME7肽B3免疫产生的抗体抑制MUC1*阳性癌细胞生长，而且还抑制癌症干细胞形成，癌症干细胞以转移标记物上调为特征，能够非贴壁依赖性地生长，并且在动物中由仅仅200个细胞就能形成肿瘤，而常规癌细胞通常需要植入约4百万个细胞才能实现肿瘤植入。
在某些情况下，NME7 B3肽是用C14A或C14V突变制造。此序列更加可再现地产生抗NME7抗体。
根据标准方法，通过使用NME7 B3、具有C14A突变的B3或具有C14V突变的B3进行免疫在小鼠中产生单克隆抗体。所列出的抗体是因其能够结合NME7、NME7-X1、NME7AB，但重要的是不结合被认为是某些正常细胞功能所需要的NME1而被选择。这些抗体还结合NME7衍生肽B3、具有C14A突变的B3和具有C14V突变的B3。
实验示出了这些抗NME7抗体抑制NME7与MUC1*细胞外结构域结合，但不阻断NME1与MUC1*细胞外结构域肽结合。此外，所述抗体抑制了癌症干细胞形成。
单克隆抗体8F9A4A3
重链可变区序列
H-1,8,9,10,11
gtccagctgcaacagtctggacctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgcaagacttctggaaacacattcactgaatacaccatgcactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaggttttaatcctaacaatggtgttactaactacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggattctgcagtctattactgtgcaagacggtactaccatagtctctacgtgttttactttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca(SEQ IDNO:386)
翻译的蛋白质，其中带下划线的序列是互补决定区(CDR)：
VQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGNTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGFNPNNGVTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYHSLYVFYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:387)
重链可变区CDR1：
NTFTEYTMH(SEQ ID NO:388)
重链可变区CDR2：
GFNPNNGVTNYNQKFKG(SEQ ID NO:389)
重链可变区CDR3：
RYYHSLYVFYFDY(SEQ ID NO:390)
轻链可变区序列
K-3,4,9,10,11
gaaacaactgtgacccagtctccagcatccctgtccatggctataggagaaaaagtcaccatcagatgcataaccagcactgatattgatgatgatatgaactggtaccagcagaagccaggggaacctcctaagctccttatttcagaaggcaatactcttcgtcctggagtcccatcccgattctccagcagtggctatggtacagattttgtttttacaattgaaaacatgctctcagaagatgttgcagattactactgtttgcaaagtgataacttgcctctcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaacgg(SEQ ID NO:391)
翻译的蛋白质，其中带下划线的序列是互补决定区(CDR)：
ETTVTQSPASLSMAIGEKVTIRCITSTDIDDDMNWYQQKPGEPPKLLISEGNTLRPGVPSRFSSSGYGTDFVFTIENMLSEDVADYYCLQSDNLPLTFGSGTKLEIKR(SEQ ID NO:392)
轻链可变区CDR 1：
ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO:393)
轻链可变区CDR2：
EGNTLRP(SEQ ID NO:394)
轻链可变区CDR3：
LQSDNLPLT(SEQ ID NO:395)
单克隆抗体5D9E2B11
重链可变区序列
H-1,4,7,8,12
gtccagctgcaacagtctggacctgatctggtgaagcctgggacttcagtgaagatatcctgtaagacttctggaaacacattcactgaatacaccatgcactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaggttttaatcctaacaatggtgttactaactacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggattctgcagtctattactgtgcaagacgttactaccatagtacctacgtgttctactttgactcctggggccaaggcaccactctcacagtctcctca(SEQ IDNO:396)
翻译的蛋白质，其中带下划线的序列是互补决定区(CDR)：
VQLQQSGPDLVKPGTSVKISCKTSGNTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGFNPNNGVTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYHSTYVFYFDSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:397)
重链可变区CDR1：
NTFTEYTMH(SEQ ID NO:398)
重链可变区CDR2：
GFNPNNGVTNYNQKFKG(SEQ ID NO:399)
重链可变区CDR3：
RYYHSTYVFYFDS(SEQ ID NO:400)
轻链可变区序列
K-3,4,5,6,12
gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagtgcaagtcagggcattagcaattatttaaactggtttcagcagaaaccagatggaactattaagctcctgatctattacacatcaagtttacattcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgggacagattattctctcaccatcagtaatgtggaacctgaagatattgccacttactattgtcagcagtatagtaagcttccttacacgttcggaggggggaccaagctggagataaaacgg(SEQ ID NO:401)
翻译的蛋白质：
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翻译的蛋白质，其中带下划线的序列是互补决定区(CDR)：
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轻链可变区CDR 1：
SASQGISNYLN(SEQ ID NO:404)
轻链可变区CDR2：
YTSSLHS(SEQ ID NO:405)
轻链可变区CDR3：
QQYSKLPYT(SEQ ID NO:406)
单克隆抗体5D9E10E4
重链可变区序列
H-2,4,7,10,12
gtccagctgcaacagtctggacctgatctggtgaagcctgggacttcagtgaagatatcctgtaagacttctggaaacacattcactgaatacaccatgcactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaggttttaatcctaacaatggtgttactaactacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggattctgcagtctattactgtgcaagacgttactaccatagtacctacgtgttctactttgactcctggggccaaggcaccactctcacagtctcctca(SEQ IDNO:407)
翻译的蛋白质，其中带下划线的序列是互补决定区(CDR)：
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重链可变区CDR1：
NTFTEYTMH(SEQ ID NO:409)
重链可变区CDR2：
GFNPNNGVTNYNQKFKG(SEQ ID NO:410)
重链可变区CDR3：
RYYHSTYVFYFDS(SEQ ID NO:411)
轻链可变区序列
K-2,6,8,14,15
gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagtgcaagtcagggcattagcaattatttaaactggtttcagcagaaaccagatggaactattaagctcctgatctattacacatcaagtttacattcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgggacagattattctctcaccatcagtaatgtggaacctgaagatattgccacttactattgtcagcagtatagtaagcttccttacacgttcggaggggggaccaagctggagataaaacgg(SEQ ID NO:412)
翻译的蛋白质，其中带下划线的序列是互补决定区(CDR)：
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轻链可变区CDR 1：
SASQGISNYLN(SEQ ID NO:414)
轻链可变区CDR2：
YTSSLHS(SEQ ID NO:415)
轻链可变区CDR3：
QQYSKLPYT(SEQ ID NO:416)
单克隆抗体5D9G2C4
重链可变区序列
H-4,9,10,11,13
gtccagctgcaacagtctggacctgatctggtgaagcctgggacttcagtgaagatatcctgtaagacttctggaaacacattcactgaatacaccatgcactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaggttttaatcctaacaatggtgttactaactacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggattctgcagtctattactgtgcaagacgttactaccatagtacctacgtgttctactttgactcctggggccaaggcaccactctcacagtctcctca(SEQ IDNO:417)
翻译的蛋白质，其中带下划线的序列是互补决定区(CDR)：
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重链可变区CDR1：
NTFTEYTMH(SEQ ID NO:419)
重链可变区CDR2：
GFNPNNGVTNYNQKFKG(SEQ ID NO:420)
重链可变区CDR3：
RYYHSTYVFYFDS(SEQ ID NO:421)
轻链可变区序列
K-4,6,7,8,10
gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagtgcaagtcagggcattagcaattatttaaactggtttcagcagaaaccagatggaactattaagctcctgatctattacacatcaagtttacattcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgggacagattattctctcaccatcagtaatgtggaacctgaagatattgccacttactattgtcagcagtatagtaagcttccttacacgttcggaggggggaccaagctggagataaaacgg(SEQ ID NO:422)
翻译的蛋白质，其中带下划线的序列是互补决定区(CDR)：
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轻链可变区CDR 1：
SASQGISNYLN(SEQ ID NO:424)
轻链可变区CDR2：
YTSSLHS(SEQ ID NO:425)
轻链可变区CDR3：
QQYSKLPYT(SEQ ID NO:426)
单克隆抗体5F3A5D4
重链可变区序列
H-2,3,4,13,15
gtccagctgcaacagtctggacctgatctggtgaagcctgggacttcagtgaagatatcctgtaagacttctggaaacacattcactgaatacaccatgcactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaggttttaatcctaacaatggtgttactaactacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggattctgcagtctattactgtgcaagacgttactaccatagtacctacgtgttctactttgactcctggggccaaggcaccactctcacagtctcctca(SEQ IDNO:427)
翻译的蛋白质，其中带下划线的序列是互补决定区(CDR)：
VQLQQSGPDLVKPGTSVKISCKTSGNTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGFNPNNGVTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYHSTYVFYFDSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:428)
重链可变区CDR1：
NTFTEYTMH(SEQ ID NO:429)
重链可变区CDR2：
GFNPNNGVTNYNQKFKG(SEQ ID NO:430)
重链可变区CDR3：
RYYHSTYVFYFDS(SEQ ID NO:431)
轻链可变区序列
K-1,2,3,4,9
gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagtgcaagtcagggcattagcaattatttaaactggtttcagcagaaaccagatggaactattaagctcctgatctattacacatcaagtttacattcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgggacagattattctctcaccatcagtaatgtggaacctgaagatattgccacttactattgtcagcagtatagtaagcttccttacacgttcggaggggggaccaagctggagataaaacgg(SEQ ID NO:432)
翻译的蛋白质，其中带下划线的序列是互补决定区(CDR)：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWFQQKPDGTIKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNVEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:433)
轻链可变区CDR 1：
SASQGISNYLN(SEQ ID NO:434)
轻链可变区CDR2：
YTSSLHS(SEQ ID NO:435)
轻链可变区CDR3：
QQYSKLPYT(SEQ ID NO:436)
单克隆抗体8F9A5A1
重链可变区序列
H-3,4,6,10,11
atccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctgggtataccttcacaaactatggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctacactggagagccaacatatgttgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccaccactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacacgtctacatatttctgtgcaagattgagggggatacgaccgggtcccttggcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca(SEQ ID NO:437)
翻译的蛋白质，其中带下划线的序列是互补决定区(CDR)：
IQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYVDDFKGRFAFSLETSATTAYLQINNLKNEDTSTYFCARLRGIRPGPLAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:438)
重链可变区CDR1：
YTFTNYGMN(SEQ ID NO:439)
重链可变区CDR2：
WINTYTGEPTYVDDFKG(SEQ ID NO:440)
重链可变区CDR3：
LRGIRPGPLAY(SEQ ID NO:441)
轻链可变区序列
K-1,2,3,4,5
gaaattttgctcacccagtctccagcaatcatagctgcatctcctggggagaaggtcaccatcacctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgaactggtaccagcagaaaccaggatcctcccccaaaatatggatttatggtatatccaacctggcttctggagttcctgctcgcttcagtggcagtgggtctgggacatctttctctttcacaatcaacagcatggaggctgaagatgttgccacttattactgtcagcaaaggagtagttacccacccacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgg(SEQ ID NO:442)
翻译的蛋白质，其中带下划线的序列是互补决定区(CDR)：
EILLTQSPAIIAASPGEKVTITCSASSSVSYMNWYQQKPGSSPKIWIYGISNLASGVPARFSGSGSGTSFSFTINSMEAEDVATYYCQQRSSYPPTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:443)
轻链可变区CDR 1：
SASSSVSYMN(SEQ ID NO:444)
轻链可变区CDR2：
GISNLAS(SEQ ID NO:445)
轻链可变区CDR3：
QQRSSYPPT(SEQ ID NO:446)
单克隆抗体8H5H5G4
重链可变区序列
H-1,3,5,6,10
gtccagctgcaacagtctggacctgatctggtgaagcctgggacttcagtgaagatatcctgtaagacttctggaaacacattcactgaatacaccatgcactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggaggttttaatcctaacaatggtgttactaactacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggattctgcagtctattactgtgcaagacgttactaccatagtacctacgtgttctactttgactcctggggccaaggcaccactctcacagtctcctca(SEQ IDNO:447)
翻译的蛋白质，其中带下划线的序列是互补决定区(CDR)：
VQLQQSGPDLVKPGTSVKISCKTSGNTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGFNPNNGVTNYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARRYYHSTYVFYFDSWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:448)
重链可变区CDR1：
NTFTEYTMH(SEQ ID NO:449)
重链可变区CDR2：
GFNPNNGVTNYNQKFKG(SEQ ID NO:450)
重链可变区CDR3：
RYYHSTYVFYFDS(SEQ ID NO:451)
轻链可变区序列
K-2,5,8,9,15
gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagtgcaagtcagggcattagcaattatttaaactggtttcagcagaaaccagatggaactattaagctcctgatctattacacatcaagtttacattcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgggacagattattctctcaccatcagtaatgtggaacctgaagatattgccacttactattgtcagcagtatagtaagcttccttacacgttcggaggggggaccaagctggagataaaacgg(SEQ ID NO:452)
翻译的蛋白质，其中带下划线的序列是互补决定区(CDR)：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWFQQKPDGTIKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNVEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:453)
轻链可变区CDR 1：
SASQGISNYLN(SEQ ID NO:454)
轻链可变区CDR2：
YTSSLHS(SEQ ID NO:455)
轻链可变区CDR3：
QQYSKLPYT(SEQ ID NO:456)
本文中引用的所有参考文献以引用的方式整体并入。
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*****
本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或者能够确定本文具体描述的发明的具体实施方案的很多等效方案。此类等效方案意图涵盖在以下权利要求的范围内。

Claims (39)

1.一种NME7特异性单克隆抗体或其片段，其结合SEQ ID NO:145或SEQ ID NO:169的NME7 B3肽，
其中所述单克隆抗体是5A1、4A3或5D4，
其中所述5A1单克隆抗体包括：
重链可变区中的氨基酸序列，包括以下：
CDR1区中的YTFTNYGMN(SEQ ID NO:439)；
CDR2区中的WINTYTGEPTYVDDFKG(SEQ ID NO:440)；和
CDR3区中的LRGIRPGPLAY(SEQ ID NO:441)；以及
轻链可变区中的氨基酸序列，包括以下：
CDR1区中的SASSSVSYMN(SEQ ID NO:444)；
CDR2区中的GISNLAS(SEQ ID NO:445)；和
CDR3区中的QQRSSYPPT(SEQ ID NO:446)；
其中所述4A3单克隆抗体包括：
重链可变区中的氨基酸序列，包括以下：
CDR1区中的NTFTEYTMH(SEQ ID NO:388)；
CDR2区中的GFNPNNGVTNYNQKFKG(SEQ ID NO:389)；和
CDR3区中的RYYHSLYVFYFDY(SEQ ID NO:390)；以及
轻链可变区中的氨基酸序列，包括以下：
CDR1区中的ITSTDIDDDMN(SEQ ID NO:393)；
CDR2区中的EGNTLRP(SEQ ID NO:394)；和
CDR3区中的LQSDNLPLT(SEQ ID NO:395)；
其中所述5D4单克隆抗体包括：
重链可变区中的氨基酸序列，包括以下：
CDR1区中的NTFTEYTMH(SEQ ID NO:429)；
CDR2区中的GFNPNNGVTNYNQKFKG(SEQ ID NO:430)；和
CDR3区中的RYYHSTYVFYFDS(SEQ ID NO:431)；以及
轻链可变区中的氨基酸序列，包括以下：
CDR1区中的SASQGISNYLN(SEQ ID NO:434)；
CDR2区中的YTSSLHS(SEQ ID NO:435)；和
CDR3区中的QQYSKLPYT(SEQ ID NO:436)。
2.如权利要求1所述的抗体，所述抗体是二价的、单价的、Fab或单链可变片段抗体(scFv)。
3.如权利要求1所述的抗体，所述抗体连接至抗体药物缀合物。
4.如权利要求3所述的抗体，其中所述抗体药物缀合物包括毒素或原毒素。
5.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码如权利要求1所述的单克隆抗体。
6.一种分离的杂交瘤，所述分离的杂交瘤表达如权利要求1所述的单克隆抗体。
7.如权利要求1所述的抗体，所述抗体特异性地结合NME7AB或NME7-X1，但不结合NME1。
8.如权利要求1所述的抗体，所述抗体破坏了NME7AB和MUC1*胞外结构域之间或NME7-X1和MUC1*胞外结构域之间的相互作用。
9.如权利要求1所述的抗体，所述抗体破坏了NME7AB和PSMGFR之间或NME7-X1和PSMGFR之间的结合。
10.如权利要求1所述的抗体，所述抗体破坏了NME7AB和N-10肽(SEQ ID NO:170)之间或NME7-X1和所述N-10肽之间的结合。
11.如权利要求1所述的抗体，所述抗体不破坏NME7AB和C-10肽(SEQ ID NO:171)之间或NME7-X1和所述C-10肽之间的结合。
12.如权利要求10所述的抗体，所述抗体不破坏NME7AB和C-10肽(SEQ ID NO:171)之间或NME7-X1和所述C-10肽之间的结合。
13.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是5A1。
14.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是4A3。
15.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是5D4。
16.如权利要求1所述的抗体，所述抗体是人的、人源化的或工程改造的抗体模拟物。
17.如权利要求1所述的抗体，所述抗体是非人的。
18.如权利要求17所述的抗体，所述抗体是鼠的或骆驼的。
19.包含如权利要求1至权利要求15中任一项所述的抗体的组合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。
20.包含如权利要求1至权利要求15中任一项所述的抗体的组合物在制备用于预防或治疗癌症转移的药物中的用途。
21.包含如权利要求1至权利要求15中任一项所述的抗体的组合物在制备用于诊断癌症或癌症转移的药物中的用途，其中来自患者的样本中存在与所述抗体的阳性结合表明所述患者存在癌症或癌症转移。
22.如权利要求21所述的用途，其中所述抗体如权利要求7所述。
23.如权利要求21所述的用途，其中所述抗体连接至成像剂。
24.如权利要求21所述的用途，其中所述患者样本是血液、体液、组织、循环细胞、体外的、体内的，包括手术中的。
25.一种细胞系，所述细胞系经工程改造以表达如权利要求1所述的NME7特异性单克隆抗体或其片段。
26.一种经工程改造以表达如权利要求1所述的NME7特异性单克隆抗体或其片段的细胞，其中所述细胞是免疫细胞或造血干细胞或祖细胞，并且其中所述造血干细胞或祖细胞可以分化成更成熟的免疫细胞。
27.如权利要求26所述的细胞，其中所述更成熟的免疫细胞是T细胞或NK细胞。
28.如权利要求26所述的细胞，其中所述细胞是造血干细胞或祖细胞。
29.如权利要求28所述的细胞，其中所述造血干细胞或祖细胞随后分化成T细胞。
30.如权利要求26所述的细胞，所述细胞包含识别肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体(CAR)。
31.如权利要求26所述的细胞，其中所述NME7特异性单克隆抗体的表达是可诱导的。
32.如权利要求26所述的细胞，其中所述细胞包括编码所述NME7特异性单克隆抗体的核酸和Foxp3增强子或启动子。
33.如权利要求26所述的细胞，其中所述细胞包括在NFAT可诱导系统中的编码所述NME7特异性单克隆抗体的核酸。
34.如权利要求33所述的细胞，其中所述NFAT可诱导系统包括NFATc1反应元件并且还包括被插入在编码所述NME7特异性单克隆抗体的核酸的上游的Foxp3增强子或启动子区域。
35.如权利要求25所述的细胞系，其中所述NME7特异性单克隆抗体或其片段结合所述NME7 B3肽，或者破坏NME7AB或NME7-X1与MUC1*胞外结构域的PSMGFR肽的结合。
36.根据权利要求26所述的细胞，所述细胞包括表达识别肿瘤相关抗原的CAR和抗NME7抗体。
37.如权利要求36所述的细胞，其中所述肿瘤相关抗原是MUC1*。
38.一种BiTE，其包含如权利要求1至15中任一项所述的抗体。
39.一种产生NME7特异性单克隆抗体的方法，其中使NME7 B3肽中的半胱氨酸残基突变以避免二硫键形成。
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