KR100707315B1 - 세포주기의 ｇ2/ｍ 상전이에 필수적인 ｈｉｖ-1 ｖｐｒ에대한 세포 수용체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 실질적으로 순수한 인간 Vpr 상호작용 단백질 (hVIP), 및 이의 단편에 관한 것이다. 또한 hVIP, 또는 이의 단편을 코드화하는 분리된 핵산 분자; hVIP, 또는 이의 단편을 코드화하는 핵산 분자에 대한 핵산 프로브 및 프라이머; hVIP를 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 한 부분에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드 분자; hVIP를 코드화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터; hVIP를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터; hVIP를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포; hVIP를 코드화하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 치료법 벡터; hVIP 상의 에피토프에 결합하는 분리된 항체; 제약학적으로 허용되는 담체 및 hVIP의 한 부분에 상보적인 핵산 분자를 포함하는 제약 조성물; hVIP를 만드는 방법; 및 hVIP를 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 한 부분에 상보적인 hVIP 올리고뉴클레오티드의 발현을 억제하는 방법이 개시된다.
본 발명은 시험 화합물의 존재하에 인간 Vpr 상호작용 단백질 (hVIP) 또는 Vpr과 상호작용하는 것으로 알려진 이의 단편을 Vpr 또는 hVIP와 상호작용하는 것으로 알려진 이의 단편과 접촉시키는 단계, 및 시험 화합물의 존재하에서의 hVIP 또는 이의 단편의 Vpr 또는 이의 단편에 대한 친화도를 시험 화합물의 부재하에서의 hVIP 또는 이의 단편의 Vpr 또는 이의 단편에 대한 친화도와 비교하는 단계를 포함하는 항-HIV 화합물의 동정 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 hVIP를 코딩하 는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 트랜스제닉 비-인간 포유류를 제공한다.
인간 Vpr 상호작용 단백질 (hVIP), 핵산 분자, 재조합 발현 벡터, 뉴클레오티드 서열.
Description
도면의 간단한 설명
도 1A는 hVIP cDNA가 첫번째 인-프레임 (In-frame) 초기화 코돈으로부터 번역된 단일의 긴 ORF를 함유하는 것을 나타낸다. 디펩티드 류신 및 이소류신 모티프 (motif) 및 리피트에 밑줄이 그어져 있다. 도 1B 및 1C는 32P-표식 hVIP 단편으로 프로브된 다양한 인간 기관으로부터의 폴리 (A)+ RNA 및 CEM, RD 및 PBMCs로부터의 RNA의 노던 블롯 (Northern blot)을 나타낸다. 도 1D는 면역 침전 분석에 의해 검출된 hVIP 발현을 나타낸다. hVIP cDNA가 6His 포유류 발현 벡터 pcDNA3.His (인비트로겐, Invitrogen)으로 표지된 항-Xpress 에피토프와 함께 인-프레임으로 융합되었다.
도 2는 공면역 침전 분석에 의해 시험관내에서 hVIP의 HIV-1 Vpr과의 상호작용을 나타낸다. 마아커 단백질의 상대적 이동성은 크기를 킬로달톤으로 왼쪽에 표시된다.
도 3은 간접적인 면역 형광 분석에 의한 hVIP 및 Vpr의 세포내 분포 및 공편 재를 나타낸다. 패널 a-d는 hVIP 또는 HIV-1 Vpr 발현 벡터로 트랜스펙션되고, 상기 기술된 바대로 면역 형광법에 대해 고정되며 (마할린감 등, Virology, 1995, 212, 331-339), 항-Vpr (패널 a 및 c) 및 항-Xpress 항체 (패널 b 및 d)로 프로브되었고, 또한 Vpr에 대한 플루오레신-결합 염소 항-토끼 항체 또는 hVIP에 대한 염소 항-쥐 2차 항체로 염색된, HeLa 세포를 나타낸다. 패널 a 및 b는 벡터 트랜스펙션되었고; 패널 c는 Vpr, 및 패널 d는 hVIP로 트랜스펙션되었다. 패널 e-h는 hVIP 및 Vpr의 공편재화를 나타낸다. 패널 e는 위상 대조 필드 (field)를 나타내고; 패널 f는 로다민 특이적 Vpr 형광을 나타내고; 패널 g는 플루오레신 특이적 hVIP 형광을 나타내고; 또한 패널 h는 로다민 및 플루오레신의 착색화가 노란색을 나타내는 이중 노출을 나타낸다.
도 4A 및 4B는 hVIP의 HIV-1 Vpr 돌연변이와의 공편재 및 상호작용을 나타낸다. 도 4A는 돌연변이 Vpr 분자가 상기 기술된 바대로 오버랩 PCR에 의해 생성되었음을 나타낸다 (마할린감 등, Virology, 1995, 212, 331-339; 및 호 등, Gene, 1989, 77, 51-59). 도 4B는 간접적인 면역 형광법에 의해 분석된 상이한 Vpr 돌연변이와의 hVIP의 세포내 분포를 나타낸다.
도 5A 및 5B1 내지 5B4는 안티센스 hVIP가 세포 증식을 억제함을 나타낸다. 도 5A는 Vpr, HVIP 센스, 및 안티센스 발현 벡터로 트랜스펙션된 인간 배아적 랍도마이오사르코마 (RD) 세포를 나타내고, 이 세포들은 2 μg/ml 퓨로마이신을 함유하는 DMEM 배지에 보존됨했다. 세포들은 니콘 위상 대조 현미경을 사용하여 5 내지 7일후에 촬영되었다. 패널 a는 조절 벡터 pBabepuro를 나타내고; 패널 b는 Vpr을 나타내고; 패널 c는 hVIP 센스를 나타내고; 또한 패널 d는 hVIP 안티센스를 나타낸다. 도 5B1 내지 5B4는 트랜스펙션된 RD 세포가 프로피디움 요다이드로 염색되었고 상기 기술된 바대로 유동 세포 분석법에 사용되었음을 나타낸다 (마할린감 등, DNA Cell Biol., 1997, 16, 137-153). Vpr 및 HVIP 안티센스를 표현하는 RD 세포는 4n DNA 함량으로 세포 주기의 G2/M 상에서 정지한다.
본 발명은 인간 Vpr 상호작용 단백질 (hVIP)의 동정 및 클로닝, 이를 만들고 사용하는 방법, 및 세포주기에서 이들의 활성을 억제하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
R로 지칭되는 HIV-1내 작은 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)이 15 킬로달톤의 단백질을 코드화한다는 논증 이후 바이러스성 단백질 R (Vpr)의 기능에 관해서는 상대적으로 거의 보고되지 않았다. 웡-스탈 (Wong-Staal) 등의 문헌 [AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1987, 3, 33-39]. vpr 오픈 리딩 프레임은 모든 HIV-1 및 HIV-2의 게놈 및 모두는 아니라도, 대부분의 유인원의 면역 결핍 바이러스 (SIV) 게놈내에 보존된다. Vpr은 생체내에서 면역성이고 모두는 아니라도 대부분의 HIV+ 개체들은 진핵 세포적으로 생성된 Vpr 단백질과 반응할 수 있는 항체를 만든다.
HIV 감염으로부터 AIDS까지의 진행은, 이것이 감염한 CD4+ T 임파구 및 대식 세포를 포함하는 세포에 대한 HIV의 효과에 의해 대부분 결정된다. 한편, 세포 활성화, 분화 및 증식은 T 세포 및 대식 세포에서 HIV 감염 및 복제를 순서대로 조절하는 것으로 생각된다. 갈로 등, Science, 1984, 224, 500; 레비 등, Science, 1984, 225, 840; 잭 등, Science, 1988, 240, 1026; 그리핀 등, Nature, 1988, 339, 70; 발렌틴 등, J. AIDS, 1991, 4, 751; 리치 등, J. Clin . Invest., 1992, 89, 176; 및 슈이테메이커 등, J. Virol ., 1992, 66, 1354. HIV 및 그외 렌티바이러스 (lentiviruses)는 비증식성의 종국적으로 분화된 대식 세포 및 성장-정지된 T 임파구에서 복제할 수 있으므로, 세포 분열 자체는 필요하지 않을 수 있다. 로즈 등, Am. Rev. Respir . Dis ., 1986, 143, 850; 살라후딘 등, Blood, 1986, 68, 281; 및 리 등, J. Virol ., 1993, 67, 3969. HIV를 포함한 렌티바이러스가 비증식성 세포, 특히 대식 세포에서 복제하는 능력은 레트로바이러스 사이에서 유일한 것으로 여겨지고, 몇개의 렌티바이러스가 vpr-유사 유전자를 함유하는 것이 중요할 수 있다. 마이어스 등, AIDS Res. Hum. Retrovir ., 1992, 8, 373. 골수성 세포계의 HIV 감염은 더욱 분화된 표현형을 초래할 수 있고 HIV 복제에 필요한 NF-KB와 같은 인자의 발현을 증가시킬 수 있다. 럴스톤 등, J. Exp . Med ., 1991, 175, 751; 챤탈 페티트 등, J. Clin . Invest., 1987, 79, 1883.
Vpr 단백질의 기능에 대한 대부분의 증거는, vpr 유전자에서 돌연변이를 갖는 HIV 균주의 활성을 보고하는 몇개의 연구로부터 온다. 비록 다른 문헌들에서는 돌연변이된 vpr 유전자가 복제에 대한 효과를 가지 않는 것으로 보고되었다 하더라도 (데데라 등, Virol., 1989, 63, 3205-3208), vpr 유전자에서 돌연변이는 주요 CD4+ T 임파구 및 전환된 T 세포계에서 HIV-1, HIV-2 및 SIV의 복제 및 세포병원성의 감소를 초래한다는 것이 보고되었다 (오가와 등, J. Virol ., 1989, 63, 4110-4114; 시바타 등, J. Med . Primatol., 1990a, 19, 217-225; 시바타 등, J. Virol., 1990b, 64, 742-747 및 웨스터벨트 등, J. Virol., 1992, 66, 3925). 흥미롭게도, vpr에 대해 돌연변이된 HIV-2는 주요 단핵 세포/대식 세포를 감염시킬 수 없는 것으로 보고되었다. 하토리 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 1990, 87, 8080-8084. Vpr이 전사를 트랜스활성화 (transactivation) 할 수 있는 기전은 알려지지 않았고 간접적일 수 있다 하더라도, HIV에 의한 HIV 롱 터미널 리피트 및 이형 프로모터의 트랜스활성화는 vpr-음성 HIV-1에 비해 야생형에서 약 3배 증가된다. 코헨 등, J. acquir. Immune Defic . Syndr ., 1990b, 3, 11-18. 프로모터 활성 및 바이러스 감염성에 대한 Vpr의 효과들 간의 관계는 명백하지 않다. Vpr 단백질은 바이러스 입자로 혼입되고, 이 발견은 Vpr이 바이러스 침투 및 탈외피에 이어 감염 초기에 작용하고, Vpr이 감염의 확립에 중요한 세포 조절 기전과 상호작용할 수 있다는 명제를 이끌어 내었다. 코헨 등, J. Virol ., 1991a, 64, 3097-3099; 유 등, J. Virol., 1990, 64, 5688-5693; 유안 등, AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1990, 6, 1265-1271.
HIV-1의 vpr 유전자는 시험관내 중간 분화의 종양계에서 세포 성장 억제 및 분화를 유도하는 것으로 나타났다. 레비 등, Cell, 1993. 72, 541. Vpr 단백질이 바이러스 입자내에서 유래하기 때문에, Vpr은 생산적 감염을 확립하는 역할을 할 수 있다. 또한, 상호관련 가능성이 있는 몇몇 중요한 기능들이 HIV-1 Vpr에 대하여 밝혀졌다. 이들은 역전사 복합체의 비-분열 세포의 핵으로의 유입, 세포 분화, G2/M 상에서의 세포 주기 정지, 및 HIV-1 복제의 증가를 포함한다.
HIV-1 Vpr은 바이러스의 통합전 복합체를 비-분열 세포의 핵내로 유입하는 데 필요하고 (하인진거 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 1994, 91, 7311-7315; 및 플레쳐 등, EMBO ., 1996, 15, 6155-6165), 이는 단핵 세포계에서 바이러스의 복제를 증가시킨다 (발로타 등, J. Virol., 1993, 67, 4409-4414; 발리에트 등, Virology, 1994, 200, 623-631; 및 코너 등, Virology, 1995, 206, 935-944). Vpr은 핵에 국한되고, 세포 분화를 유도하여 결과적으로 세포 주기의 G2/M 상에서 세포를 정지시킨다. 루 등, J. Virol ., 1993, 67, 6542-6550; 마할린감 등, Virology, 1995, 212, 331-339; 디마르지오 등, J. Virol., 1995, 69, 7909-7916; 레비 등, Cell, 1993, 72, 541-550; 로젤 등, J. Virol ., 1995, 69, 882-888; 조웨트 등, J. Virol ., 1995, 69, 6304-6313; 마할린감 등, DNA Cell Biol ., 1997, 16, 137-153. 돌연변이 분석은 이 96 개의 아미노산 Vpr 단백질의 기능이 적합한 세포 보조인자(들)와의 상호작용을 통해 매개된다는 사실을 암시한다. 자오 등, J. Biol. Chem ., 199, 269, 15577-15582; 라파엘리 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 1995, 92, 3621-3625; 헤 등, J. Virol ., 1995, 69, 6705-6711; 레 등, J. Virol ., 1995, 69, 6859-6864.
HIV 복제를 억제하는 신규 화합물을 동정할 필요가 있다. 구체적으로, Vpr에 의해 매개된 특별한 분자 신호를 방해함으로써 복제를 감소시키는 안전하고 효과적인 화합물을 찾을 필요가 있다. 그밖에, 세포 주기 캐스케이드의 필수적인 성분인 Vpr이 상호작용하는 보조인자를 방해하는 안전하고 효과적인 화합물을 찾을 필요가 있다. 더욱이, 보조인자를 동정하고 세포 주기를 변조하는 방법에서 이를 표적으로 할 필요가 있다. 과증식 세포와 같이 그의 증식이 바람직하지 않은 세포의 G2에서 M 상까지의 세포 주기의 진행을 억제하기 위한 화합물 및 방법도 필요하다.
발명의 요약
본 발명에서, 이스트 (yeast) 2-하이브리드 (hybrid) 분석은 Vpr과 상호작용하는 특정한 세포 보조인자를 동정하기 위한 노력으로 이용되었다. Vpr 리간드에 필수적인 기준을 만족시키고, 동일한 유전자로부터 유래된 중복되는 상보적 DNA를 포함하는 3개의 클론이 분리되었다. 이 cDNA에 의해 코드화된 단백질은 hVIP로 표시되었다. 다양한 Vpr 돌연변이는 세포 주기를 정지시키고 다른 인간 세포계에서 hVIP와 함께 위치하는 능력에 대하여 테스트되었다. 세포 증식의 억제 및 Vpr 돌연변이와 hVIP가 함께 위치하는 것 사이에 직접적 상관관계가 있음이 밝혀졌다. 세포 주기에 있어서 hVIP 발현의 억제는 G2/M 상에서 세포를 정지시킨다. hVIP는 G2로부터 M 상으로의 전이에 필요하고 따라서 세포 주기 캐스케이드의 필수 성분이다.
본 발명은 실질적으로 순수한 hVIP, 및 이의 단편에 관한 것이다.
본 발명은 hVIP 또는 이의 단편을 코드화하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 hVIP, 또는 이의 단편을 코드화하는 핵산 분자에 대한 핵산 프로브 및 프라이머 (primer)에 관한 것이다.
본 발명은 hVIP를 코드화하는 뉴클레오티드 서열의 한 부분에 대하여 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성되는 올리고뉴클레오티드 분자에 관한 것이다.
본 발명은 hVIP를 코드화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 (vector)에 관한 것이다.
본 발명은 hVIP를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 hVIP를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 hVIP를 코드화하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 치료 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 hVIP 상의 에피토프 (epitope)에 결합하는 분리된 항체에 관한 것이다.
본 발명은 제약학적으로 허용되는 담체 및 hVIP의 한 부분에 대해 상보적인 핵산을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 hVIP를 만드는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 hVIP를 코드화하는 뉴클레오티드의 한 부분에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드로 인간 Vpr 상호작용 단백질의 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위한 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편에 관한 것이다.
본 발명은 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위한 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위한 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편을 코드화하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명은 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위한 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편을 코드화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위한 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위한 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위한 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편을 코드화하는 핵산 분자를 포함하는 유전자 치료 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위한 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편을 만드는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 세포의 G/M 전이를 예방하거나 억제하기 위해 세포를 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편, 또는 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위해 세포에 의해 발현되는 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편을 코드화하는 뉴클레오티드 서열과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포의 G2에서 M으로의 전이를 억제하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 시험 화합물 존재하에서 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위해 hVIP와 상호작용하는 Vpr 또는 Vpr의 단편과 상호작용하는 것으로 알려진 hVIP 및 HIV의 단편과 접촉시키고, 시험 화합물 부재하에서 hVIP 또는 이의 단편의 Vpr 또는 이의 단편과의 친화도를 hVIP 또는 그의 단편과의 친화도와 비교하는 단계를 포함하는, 항-HIV 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다.
신규한 인간 vpr-결합 단백질, 인간 Vpr 상호작용 단백질 (hVIP)가, 발견되었다. 이 단백질은 핵에 편재하고 세포 주기 캐스케이드의 필수 성분으로서의 기능을 한다. Vpr에 의한 G2/M 상에서의 세포 주기 정지의 유도 및 hVIP의 세포내 편재화의 핵 패턴에서 핵주위 패턴으로의 변화 간의 관계가 입증되었다. 따라서, hVIP는 Vpr의 세포 보조 인자이고, 이들의 특이적인 상호작용이 Vpr의 세포 주기 정지 활성에 필수적인 것 같다. 그래서, hVIP의 억제는 세포 분열을 억제할 것이다.
수많은 질병이 세포 주기 조절의 손실 및 결과적으로 조절되지 않은 세포 분열을 특징으로 한다. 조절되지 않은 세포 증식은 건선, 증생 및 그외 질병 뿐만 아니라 모든 종류의 암 및 세포 증식을 특징으로 하는 장애의 1차적 특징이다. 따라서, hVIP 활성 억제에 의해 세포 분열을 차단하는 능력은, 조절되지 않는 세포 증식에 의해 특징화된 질병과 장애, 및 HIV를 앓는 개체들을 치료하는 수단을 제공한다. 세포 주기에서의 역할을 하는 hVIP의 발견은, 억제제가 동정 및/또는 설계될 수 있는 약물 표적을 제공한다. 이러한 억제제는 세포 분열을 억제하기에 유용하고, 이는 항암 또는 항-HIV 의약품을 위한 구체적인 전략이 된다.
hVIP는 정제되었고; 단백질을 포함하는 복합체가 분리되었으며; 단백질에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마가 생성될 수 있고; 이 단백질을 코드화하는 cDNA가 분리, 서열화되었으며, 이후 숙주 세포로 도입되어 재조합적으로 단백질을 발현하는 발현 벡터를 포함하는 벡터로 혼입되었다. hVIP에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자가 생성되었다.
hVIP의 발견은 특이적 억제제를 설계하고 발견하는 수단을 제공한다. 본 발명에 따르면, hVIP는 특이적 억제제를 위한 화합물을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 억제제는 항암 및 항-HIV 제제로서 유용하다. 정제된 hVIP 및 hVIP를 포함하는 복합체는, 이들 단백질 및 복합체가 시험 화합물 존재하에서 활성인지 아닌 지를 결정하는 의약품 스크리닝에 사용될 수 있다. 시험 화합물은 복합체를 분리시키고 복합체의 형성을 억제하는 화합물을 동정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
hVIP를 코드화하는 분리된 cDNA는 hVIP의 재조합 생산에서 출발 물질로서 유 용하다. cDNA는 발현 벡터를 포함하는 벡터로 혼입되고, 벡터는 숙주 세포로 도입되어 이후 재조합적으로 단백질을 발현한다. 핵산 분자 및 이의 단편, 특히 게놈 서열은 유전자 재배열을 검색하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 프로브는, 예를 들면, 제한 단편 길이 다형태성 분석 및 형광 현장 혼성화 분석에서 유용하다. hVIP를 코드화하는 cDNA의 단편에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는, 각각 mRNA의 번역을 억제하고 유전자 서열을 증폭시키는 안티센스 분자 및 프라이머로서 사용될 수 있다.
hVIP는 서열 1에 나타낸 cDNA에 의해 코드화되고 서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. hVIP는 천연 원료로부터 분리될 수 있고, 재조합 DNA 방법에 의해 생산되거나 표준 단백질 합성 기술에 의해 합성될 수 있다. 완전한 길이의 hVIP의 단편이 1996년 1월 29일 제출된 특허 출원 제 08/593,695호에 기술되고, 이는 참고자료에 의해 여기에 혼입된다.
서열 1에 개시된 뉴클레오티드 서열 정보를 사용하여 설계된 프로브 및 프라이머를 사용하여, 표준 기술 및 쉽게 이용 가능한 출발 물질로써, hVIP를 코드화하는 핵산 분자가 cDNA 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 본 발명은 hVIP를 코드화하는 뉴클레티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 서열 2, 또는 이의 단편의 아미노산 서열을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 hVIP를 코드화하는 핵산 분자로 구성된다. 몇몇 실시 양태에서, 핵산 분자는 서열 1에서 코딩 서열을 구성하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 몇몇 실시 양태에서, 핵산 분자는 서열 1에서 지정된 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 본 발명의 분리된 핵산 분자는, 본 발명의 단백질을 제조하기 위한 구조물 및 재조합 발현 시스템을 제조하기에 유용하다.
cDNA 라이브러리는 잘 알려진 기술에 의해 생성될 수 있다. 여기 기술된 뉴클레오티드 서열의 하나를 함유하는 cDNA 클론은, 서열 1에 개시된 뉴클레오티드 서열의 적어도 한 부분을 포함하는 프로브 또는 프라이머를 사용하여 동정될 수 있다. 프로브 또는 프라이머는 적어도 16개의 뉴클레오티드를 갖고, 바람직하게는 적어도 24개의 뉴클레오티드를 갖는다. 프로브 또는 프라이머는 표준 혼성화 기술을 사용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용된다. 선택적으로, 출발 물질로서 게놈 클론이 인간 세포로부터 게놈 DNA를 사용하여 분리될 수 있다.
본 발명은 적어도 10개의 뉴클레오티드인 서열 1의 단편과 동일하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 몇몇 실시 양태에서, 분리된 핵산 분자는 적어도 10개의 뉴클레오티드인 서열 1의 단편과 동일하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열을 구성한다. 몇몇 실시 양태에서, 분리된 핵산 분자는 15-150개의 뉴클레오티드인 서열 1의 단편과 동일하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 구성한다. 몇몇 실시 양태에서, 분리된 핵산 분자는 15-30개의 뉴클레오티드인 뉴클레오티드의 단편과 동일하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 구성한다. 적어도 10개의 뉴클레오티드인 서열 1의 단편과 동일하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하거나 구성하는 분리된 핵산 분자는 서열 1을 갖는 유전자 및 cDNA 서열을 동정하기 위한 프로브로서 유용하다. 서열 1을 갖는 유전자 및 cDNA를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머, 및 유전자 및 cDNA의 전사 및 번역을 각각 억제하기 위한 안티센스 분자는, 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 hVIP를 코드화한다.
hVIP를 코드화하는 cDNA는 샘플로부터의 cDNA가 전기 영동 겔상에서 분리되고 hVIP 프로브가 이러한 프로브에 혼성화하는 밴드를 동정하기 위해 사용되는 전기 영동 분석에서 분자 마아커로서 사용될 수 있다. 특히, 서열 1 또는 이의 부분은 샘플로부터의 cDNA가 전기 영동 겔상에서 분리되고 hVIP 특이 프로브가 이들에 혼성화하는 밴드를 동정하기 위해 사용되는 전기 영동 분석에서 분자 마아커로서 사용될 수 있고, 이는 밴드가 프로브의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가짐을 나타내 준다. 크기 마아커로서 제공된 분리된 핵산 분자는 프로브에 혼성화하는 것으로 알려진 양성 밴드로서 나타날 것이고, 그리하여 hVIP를 코드화하는 cDNA의 크기에 표준점으로서 사용될 수 있다. 이러한 분석에 유용한 전기 영동 겔은 참고자료에 의해 여기에 혼입된 문헌 [샘브룩 등, Molecular Cloning a Laboratory Manual, 제 2판, 콜드 스프링 하버 프레스 (1989)]에 기술된 바대로, 표준 폴리아크릴아미드 겔을 포함한다.
서열 1에서 뉴클레오티드 서열은 hVIP의 독특한 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화하는 프로브, 프라이머 및 상보적 분자를 설계하기 위해 사용될 수 있다. hVIP를 코드화하는 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화하는 프로브, 프라이머 및 상보적 분자는 이 기술 분야에서 통상적인 기술을 가진 사람들에 의해 보통 설계될 수 있다.
본 발명은 또한 hVIP를 동정하기 위해 올리고뉴클레오티드 혼성화 방법을 수행하기 위해 프로브로서 유용한 표식된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 본 발명은 hVIP의 독특한 뉴클레오티드 서열에 표식되고 혼성화될 수 있는 프로브를 포함한다. 본 발명의 표식된 프로브는 방사성 표식된 뉴클레오티드로 표식되거나, 그렇지 않으면 쉽게 이용 가능한 비방사성 검출 시스템에 의해 검출 가능하다. 몇몇 바람직한 실시 양태에서, 프로브는 10 내지 100개의 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 바람직한 실시 양태에서, 프로브는 10 내지 50개의 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 바람직한 실시 양태에서, 프로브는 12 내지 20개의 뉴클레오티드로 구성된 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 프로브는 바람직하게는 hVIP의 독특한 뉴클레오티드 서열의 단편과 완전히 동일하거나 상보적인 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 몇몇 실시 양태에서, 표시된 프로브는 hVIP 유전자가 존재하는 염색체를 결정하기 위해 사용된다. 이러한 표식된 프로브는 일부 또는 모든 서열 1을 포함한다.
hVIP를 코드화하는 cDNA는 핵산 서열을 증폭하기 위한 PCR 프라이머를 설계하기 위해 사용될 수 있다. PCR 기술은 이 기술 분야에서 통상적인 기술을 가진 사람들에게 일상적으로 실시되고 진단학에 있어서 이의 용도는 잘 알려지고 수용되어 있다. PCR 기술을 실용하기 위한 방법이 참고자료에 의해 여기에 혼입된 문헌 ["PCR 프로토콜: 방법 및 응용에 대한 안내", 이니스, 엠.에이. 등 편집, 아카데믹 프레스, 인크., 샌디에고, 캘리포니아 (1990)]에 개시된다. PCR 기술의 응용은 참고자료에 의해 여기에 혼입된 문헌 ["중합효소 사슬 반응", 엘리히, 에이취.에이. 등 편집, 콜드 스프링 하버 프레스, 콜드 스프링 하버, 뉴욕 (1989)]에 개시된다. 몇몇 단순한 규칙이 유효한 프라이머의 설계를 돕는다. 전형적인 프라이머는 50% 내지 60% g+c 조성을 갖는 18-28개의 뉴클레오티드 길이이다. 전체 프라이머는 바람직하게는 그것이 혼성화해야 하는 서열에 상보적이다. 바람직하게는, 프라이머는 100 염기쌍 내지 2000 염기쌍의 PCR 생성물을 만든다. 그러나, 50 염기쌍 내지 10 kb 이상의 생성물을 만드는 것이 가능하다.
PCR 기술은 핵산 분자에 존재하는 서열에 혼성화하는 5' 및 3' 프라이머를 제공하고, 상보적인 DNA 스트랜드를 생산하기 위해 유리 뉴클레오티드로 프라이머 사이의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 염기를 채우는 유리 뉴클레오티드 및 효소를 추가로 제공함으로써, 다수의 뉴클레오티드 서열 카피를 신속하게 생성할 수 있게 한다. 효소는 프라이머에 인접한 상보적 서열을 채울 것이다. 5' 프라이머 및 3' 프라이머 모두 핵산의 동일한 단편의 상보적 스트랜드상의 뉴클레오티드 서열에 혼성화한다면, 특정한 이중-스트랜드 생성물의 기하급수적 증폭이 초래된다. 오직 단일 프라이머만이 핵산 분자에 혼성화하면, 선형의 증폭으로 다양한 길이의 단일-스트랜드 생성물이 생산된다.
본 발명은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 hVIP를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 또는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 여기서 사용된, "재조합 발현 벡터" 라는 용어는 플라스미드, 파아지, 바이러스 입자, 또는 적합한 숙주로 도입될 때 hVIP를 코드화하는 코딩 서열의 발현을 지시하기 위해 필요한 유전자 요소를 함유하는 그외 벡터를 의미한다.
이 기술 분야에서 통상적인 기술을 가진 사람은 hVIP를 코드화하는 핵산 분자를 분리하고 이것을 표준 기술 및 쉽게 이용 가능한 출발 물질을 사용하여 발현 벡터로 삽입할 수 있다. 코딩 서열은 필요한 조절 서열에 조작 가능하게 연결된다. 발현 벡터는 잘 알려져 있고 쉽게 이용 가능하다. 발현 벡터의 예는 플라스미드, 파아지, 바이러스 벡터 및 숙주 세포를 변형시키고 코딩 서열의 발현을 촉진시키기에 유용한 기구를 함유하는 핵산 분자 또는 그외 핵산 분자들을 포함한다. 몇몇 실시 양태에서, 재조합 발현 벡터는 서열 1에 지정된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 hVIP를 표현하는 숙주를 변형시키는 데 유용하다.
본 발명은 서열 1을 포함하는 hVIP를 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 몇몇 실시 양태에서, 숙주 세포는 서열 1를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 단백질 생산을 위해 잘 알려진 재조합 발현 시스템에 사용하기 위한 숙주 세포는 잘 알려져 있고 쉽게 이용 가능하다. 숙주 세포의 예는 이. 콜라이 (E. coli )와 같은 박테리아 세포, 에스 . 세레비지애 (S. cerevisiae )와 같은 이스트 세포, 에스 . 프루지페르다 (S. frugiperda )와 같은 곤충 세포, 비-인간 포유류 조직 배양 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 HeLa 세포와 같은 인간 조직 배양 세포를 포함한다.
몇몇 실시 양태에서, 예를 들면, 이 기술 분야에서 통상적인 기술을 가진 사람은, 잘 알려진 기술을 사용하여, 잘 알려진 발현 시스템에 사용하기 위해 DNA 분자를 상업적으로 이용가능한 발현 벡터로 삽입할 수 있다. 예를 들면, 상업적으로 이용 가능한 플라스미드 pSE420 (인비트로겐, 샌 디에고, 캘리포니아)은 이 콜라이 (E. coli )에서 hVIP의 생산을 위해 사용될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 플라스미드 pYES2 (인비트로겐, 샌 디에고, 캘리포니아)는, 예를 들면, 이스트의 균주인 에스 . 세레비지애 (S. cerevisiae )에서 생산을 위해 사용될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 MAXBAC™ 완전 배큘로바이러스 발현 시스템 (인비트로겐, 샌 디에고, 캘리포니아)는, 예를 들면, 곤충 세포에서의 생산을 위해 사용될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 플라스미드 pcDNA 1 또는 pcDNA 3 (인비트로겐, 샌 디에고, 캘리포니아)는, 예를 들면, 중국 햄스터 난소 세포와 같은 포유류 세포에서의 생산을 위해 사용될 수 있다. 이 기술 분야에서 통상적인 기술을 가진 사람은 이들 상업적 발현 벡터 및 시스템 또는 일상적인 기술 및 쉽게 이용 가능한 출발 물질을 사용하여 hVIP를 생산하는 그외의 것들을 사용할 수 있다. (참조, 샘브룩 등, 분자 클로닝 실험실 매뉴얼, 제 2판, 콜드 스프링 하버 프레스 (1989), 참고자료에 의해 여기에 혼입됨) 그래서, 바람직한 단백질은 원핵 및 진핵 시스템 모두에서 제조될 수 있고, 단백질의 다양하게 가공된 형태의 단백질이 생산된다.
이 기술 분야에서 통상적인 기술을 가진 사람은 그외 상업적으로 이용 가능한 발현 벡터 및 시스템을 사용할 수 있거나, 또는 잘 알려진 방법 및 쉽게 이용 가능한 출발 물질을 사용하여 벡터를 생산할 수 있다. 프로모터 및 폴리아데닐화 신호, 및 바람직하게는 인헨서와 같은, 필요한 조절 서열을 함유하는 발현 시스템은, 쉽게 이용 가능하고 이 기술 분야에서 다양한 숙주에 대해 알려져 있다. 참조, 예를 들면, 샘브룩 등, 분자 클로닝 실험실 설명서, 제 2판, 콜드 스프링 하버 프레스 (1989).
hVIP를 코드화하는 DNA를 포함하는 발현 벡터는, 적합한 숙주를 형질전환시키기 위해 사용되고 외부 DNA의 발현이 일어나는 조건하에서 배양되고 보존된다. 그리하여 생산된 본 발명의 단백질은, 적합하고 이 기술 분야에서 숙련자들에게 잘 알려진 바대로 세포를 용해시키거나 또는 배양 배지로부터 회수된다. 이 기술 분야에서 통상적인 기술을 가진 사람은, 잘 알려진 기술을 사용하여 이러한 발현 시스템을 사용하여 생산된 hVIP를 분리할 수 있다. 상기 기술된 바대로 hVIP에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 천연 원료로부터 hVIP를 정제하는 방법은, 재조합 DNA 방법학에 의해 생산된 hVIP를 정제하는 것에 동일하게 적용될 수 있다.
유전 구조물의 예는 구조물이 트랜스펙션된 세포계에서 기능하는 프로모터에 조작 가능하게 연결된 hVIP 코딩 서열을 포함한다. 구성 프로모터의 예는 사이토메갈로 바이러스 또는 SV40으로부터의 프로모터를 포함한다. 유도 프로모터의 예는 쥐 유방 백혈병 바이러스 또는 메탈로티오네인 프로모터를 포함한다. 이 기술 분야에서 통상적인 기술을 가진 사람들은, 쉽게 이용 가능한 출발 물질로부터 hVIP를 코드화하는 DNA를 갖는 세포를 트랜스펙션시키기에 유용한 유전 구조물을 쉽게 생산할 수 있다. 이러한 유전자 구조물은 hVIP의 생산에 유용하다.
재조합 기술에 의해 hVIP를 생산하는 것에 덧붙여, 자동화 펩티드 합성기는 또한 hVIP를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술은 이 기술 분야에서 통상적인 기술을 가진 사람들에게 잘 알려져 있고 유도체가 DNA-코드화 단백질 생산에서 제공되지 않는 치환을 가질 때 유용하다.
hVIP를 코드화하는 핵산 분자는 재조합 바이러스 발현 벡터 또는 그외 적합한 전달 수단과 같은, 다양한 전달 성분 중 어느 하나를 사용하여, 적합한 숙주 세포에서의 이들의 도입 및 발현에 영향을 미치기 위해 전달될 수 있다. 일반적으로, 바이러스 벡터는 재조합 아데노바이러스 및 재조합 백시니아 바이러스와 같은 DNA 바이러스, 또는 재조합 레트로바이러스와 같은 RNA 바이러스일 수 있다. 그외 재조합 벡터는 세포를 감염시키고 재조합 유전자를 발현할 수 있는 재조합 원핵 생물을 포함한다. 재조합 벡터에 덧붙여, 그외 전달 성분은 또한 리포좀, 트랜스페린-매개 트랜스펙션 및 그외 수용체-매개 수단에서의 캡슐화와 같이 관찰된다. 본 발명은 이러한 다른 형태의 발현 벡터 및 동등한 기능을 제공하고 이 기술 분야에서 이후에 알려진 그외 적합한 전달 수단을 포함하는 것이 의도된다.
본 발명의 바람직한 실시 양태에서, DNA는 아데노바이러스에 의해 감응 숙주 세포로 전달된다. 이 기술 분야에서 숙련된 사람은 이러한 수단에 의해 숙주 세포로 DNA를 전달하는 이 기술을 쉽게 이해할 것이다. 비록 본 발명이 바람직하게는 아데노바이러스를 포함하더라도, 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 임의의 바이러스를 포함하는 것이 의도된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시 양태에서, RNA는 레트로바이러스에 의해 감응 숙주 세포로 전달된다. 이 기술 분야에서 숙련된 사람은 이러한 수단에 의해 숙주 세포로 RNA를 전달하는 이 기술을 쉽게 이해할 것이다. RNA에 의해 코드화된 단백질을 발현하기 위한 레트로바이러스는 본 발명에서 포함되도록 의도된다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 핵산은 폴레이트 수용체 수단을 통해 전 달된다. 숙주 세포로 전달될 핵산 서열은 폴리리신에 연결되고, 복합체는 폴레이트 수용체의 수단에 의해 종양 세포로 전달된다. 1992년 4월 28일 로우 등에게 허여된 미국 특허 제 5,108,921호는, 참고자료에 의해 여기에 혼입되고, 이러한 전달 성분을 기술한다.
본 발명은 또한 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 hVIP를 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함하는 트랜스제닉 (transgenic) 비-인간 포유류에 관한 것이다. 재조합 단백질을 생산하기에 유용한 트랜스제닉 비-인간 포유류는, 트랜스제닉 동물을 생성시키기 위해 필요한 발현 벡터 및 기술과 같이 잘 알려져 있다. 일반적으로, 트랜스제닉 동물은 hVIP를 코드화하는 뉴클레오티드 서열이 유방 세포 특이 프로모터에 조작 가능하게 연결되어 코딩 서열이 오직 유방 세포에서만 발현되고, 그렇게 발현된 재조합 단백질이 동물의 젖으로부터 회수되는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 몇몇 실시 양태에서, hVIP를 코드화하는 코딩 서열은 서열 1이다.
본 발명의 몇몇 실시 양태에서, 트랜스제닉 비-인간 동물이 생성된다. 본 발명에 따른 트랜스제닉 동물은 가슴 특이적 프로모터의 조절 컨트롤하에서 서열 1을 함유한다. 1989년 10월 10일 와그너에게 허여된 미국 특허 제 4,873,191호 및 1988년 4월 12일 레더에게 허여된 미국 특허 제 4,736,866호 (이들 둘다는 참고자료에 의해 여기에 혼입됨)에 개시된 것들과 같은 표준 방법을 사용하여, 이 기술 분야에서 통상적인 기술을 가진 사람은 hVIP를 생산하는 트랜스제닉 동물을 생산할 수 있다. 바람직한 동물은 설치류, 특히 염소, 래트, 및 쥐이다.
본 발명은 또한 hVIP 핵산 분자에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 hVIP의 발현을 억제하는 방법에 관한 것이다. 올리고뉴클레오티드는 특정한 핵산 분자와의 특이적 혼성화에 충분히 영향을 주는 동일성 및 수의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 보통 "mRNA에 상보적인"으로서 기술된다. 올리고뉴클레오티드는 또한 게놈내 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 올리고뉴클레오티드는 보통 연구 시약 및 진단제로서 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 동물 및 사람의 질병 상태의 치료에서 치료적 부분으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 안티센스 올리고뉴클레오티드를 위한 바람직한 유전자내 위치는, 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 번역 개시 또는 종결 코돈을 포함하는 부위이다. 그외 목적 부위는 5' 비번역 부위 (5'UTR) 및 3' 비번역 부위 (3'UTR)를 포함한다. mRNA 스플라이스 위치가 또한 바람직한 목적 부위일 수 있다. 일단 목적 위치가 정해지면, 올리고뉴클레오티드는 목적 부위에 충분히 상보적인, 즉, 충분한 특이성을 가지고 충분히 잘 혼성화되어 바람직한 효과를 주도록 선택된다.
본 발명에 따라, "올리고뉴클레오티드"는 리보핵산 또는 데옥시리보핵산의 올리고머(들) 또는 폴리머(들)를 의미한다. 이 용어는 유사하게 작용하는 비-천연적으로 발생하는 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라, 천연적으로 발생하는 핵염기, 당 및 공유 당 간 (골격) 결합을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 흔히 예를 들면, 증진된 세포 흡수, 목적 핵산에 대한 증진된 친화도 및 뉴클레아제 존재하에서의 증가된 안정성과 같은 바람직한 성질 때문에 바람직하다.
바람직한 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포트리에스터, 및 메틸 포스포네이트를 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 또한 2'-OH, 할로겐, 및 알킬을 포함하는 한개 이상의 치환된 당 잔기를 함유할 수 있고, 이에 국한되지 않는다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 핵염기 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 여기서 사용된, "변형되지 않은" 또는 "천연의" 핵염기는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 핵염기는 예를 들면, 하이포잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘, 2-아미노아데닌 등을 포함한다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 약 8 내지 약 150개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드가 바람직하게는 약 8 내지 약 100개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드가 바람직하게는 약 8 내지 약 50개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드가 바람직하게는 약 8 내지 약 30개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드는 약 12 내지 25개의 뉴클레오티드를 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 진단제, 치료제로서 및 연구 시약 및 키트로서 이용될 수 있다. 치료제에 대하여, hVIP의 발현을 조절함으로써 치료될 수 있는 질병 또는 장애를 갖는 것으로 여겨지는 동물, 바람직하게는 인간이 본 발명에 따를 올리고뉴클레오티드의 투여로 치료된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 적합한 제약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체에 유효량의 올리고뉴클레오티드를 첨가함으로써, 제약 조성물에 이용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 용도 및 본 발명의 방법은 예방학적으로 또한 유용할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 세포 또는 조직 샘플에서 hVIP-특이 핵산의 존재에 대한 진단제로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 방사능 표식된 올리고뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 키나제로 5' 말단에 32P를 표식함으로써 제조될 수 있다. 샘브룩 등, 분자 클로닝: 실험실 매뉴얼, 콜드 스프링 하버 레버러토리, 1989, 제 2권, 페이지.10.59. 방사능 표식된 올리고뉴클레오티드는 이후 hVIP mRNA를 함유하는 것으로 여겨지는 세포 또는 조직 샘플과 접촉되고, 샘플은 결합되지 않은 올리고뉴클레오티드를 제거하기 위해 세척된다. 샘플에 남아 있는 방사능은 결합된 올리고뉴클레오티드가 존재함을 나타내고, 이는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 핵산이 존재함을 나타내며, 섬광 계수기 또는 그외 일상적인 수단을 사용하여 정량화 될 수 있다. 따라서, 이들 단백질을 코드화하는 핵산의 발현이 검출된다.
본 발명의 방사능 표식된 올리고뉴클레오티드는 연구, 진단 또는 치료적 목적을 위한 hVIP의 편재, 분포 및 정량화를 결정하기 위해 조직의 자가 방사선술을 수행하기 위해 또한 사용될 수 있다. 이러한 연구에서, 조직 단면이 방사능 표식된 올리고뉴클레오티드로 처리되고 상기 기술된 바대로 세척된 다음, 일상적인 자가 방사선술에 따라 사진 에멀젼에 노출된다. 현상될 때 에멀젼은, hVIP 유전자를 발현하는 부위 상에 은 입자의 상을 만든다. 은 입자의 정량화로 hVIP 단백질을 코드화하는 mRNA 분자의 발현이 검출되고, 이 부분들에 올리고뉴클레오티드의 표적화가 가능하다.
올리고뉴클레오티드 또는 이를 생산하는 벡터는, 제약 조성물로 제형화될 수 있다. 본 발명에 따른 제약 조성물은 핵산 분자와 함께 전달 성분을 포함하며, 또한 제약학적으로 허용되는 담체 또는 비히클, 예를 들면, 식염수를 포함한다. 핵산의 성공적 전달이 가능한 임의의 배지가 사용될 수 있다. 이 기술 분야에서 숙련된 사람은 본 발명에서 사용될 수 있는 다수의 제약학적으로 허용되는 배지를 쉽게 이해할 것이다. 적합한 제약학적 담체는 이 분야에서 표준 참고 도서인, 에이. 오솔의, 레밍턴'스 파마수티컬 사이언스에 기술되고, 이는 참고자료에 의해 여기에 혼입된다.
국소적 투여를 위한 제형은 경피 패취, 연고, 로션, 크림, 겔, 점액제, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 제약학적 담체, 수성, 분말 또는 오일 기제, 농축화제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 경구 투여를 위한 조성물은 분말 또는 과립, 물 또는 비-수성 용매에서의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 사쉐트 (sachets) 또는 정제를 포함한다. 농축화제, 향신제, 희석제, 에멀젼화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 비경구, 정맥내, 수막강내 또는 심실내 투여는 완충액, 희석제 및 그외 적합한 첨가제를 또한 포함하고 바람직하게는 멸균 및 발열 물질이 없는 멸균 수용액을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 정맥내 투여에 적합한 제약 조성물은 멸균이고 발열 물질이 없다.
본 발명의 제약 조성물은 포유 동물의 몸에서 활성 제제가 제제의 작용 위치 에 도달하도록 해주는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지와 치료되는 부분에 따라 수 많은 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 국소적 (눈, 질, 항문, 비강내, 경피), 또는 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내 적하, 피하, 복막내 또는 근육내 주사, 예를 들어, 흡입 또는 취입에 의한 폐 투여, 또는 수막강내 또는 심실내 투여를 포함한다.
투여량은 특정 제제의 약역학적 특성, 및 투여 형태 및 경로; 나이, 건강, 및 수급자의 체중; 증상의 성질 및 정도, 병행 치료의 종류, 치료의 빈도, 및 목적하는 효과와 같이 알려진 인자에 따라 다양하다. 치료적 조성물의 제형 및 이들의 순차적인 투여는 이 기술 분야의 숙련자의 기술내에 있는 것으로 여겨진다.
hVIP에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마, 및 항체 자체는, hVIP 및 hVIP를 포함하는 단백질 복합체의 분리 및 정제에 유용하다. 덧붙여, 항체는 hVIP 활성의 특이 억제제이다. hVIP에 특이적으로 결합하는 항체는 잘 알려진 기술 및 쉽게 이용 가능한 출발 물질을 사용하여 천연 원료로부터 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 항체는 또한 재조합 DNA 방법에 의해 단백질을 생산할 때 존재하는 물질로부터 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다.
여기서 사용된, "항체" 라는 용어는 완전하고, 손상 없는 항체, 및 Fab 단편 및 F(ab)2 단편을 의미한다. 완전하고, 손상 없는 항체는 쥐의 모노클로날 (monoclonal) 항체, 키메릭 (chimeric) 항체 및 인간화된 항체와 같은 모노클로날 항체를 포함한다. 몇몇 실시 양태에서, 항체는 서열 2의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 에피토프에 결합하는 항체는 친화성 크로마토그래피와 같은 잘 알려진 기술을 사용하여 천연원 및 재조합 발현 시스템으로부터의 단백질을 분리하고 정제하는 데 유용하다. 이러한 항체는 샘플에서 이러한 단백질의 존재를 검출하고 세포가 단백질을 발현하고 있는지를 결정하는 것에 유용하다.
항체의 생산 및 완전하고, 손상 없는 항체, Fab 단편 및 F(ab)2 단편의 단백질 구조 및 이러한 분자를 코드화하는 유전자 서열의 구성은 잘 알려져 있고, 예를 들면, 문헌 [할로우, 이. 및 디. 레인 (1988) 항체: 실험실 설명서, 콜드 스프링 하버 레버러토리, 콜드 스프링 하버, 뉴욕]에 기술되며, 이는 참고자료에 의해 여기에 혼입된다. 간단히, 예를 들면, hVIP, 또는 이의 면역성 단편이, 쥐에 주입된다. 쥐의 비장을 제거하고, 비장 세포를 분리하여 불멸화된 쥐 세포와 함께 융합한다. 하이브리드 세포, 또는 하이브리도마를 배양하고, 항체를 분비하는 세포를 선택한다. 항체를 분석하고, hVIP에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀지면, 이들을 생산하는 하이브리도마는 항체의 지속적인 공급을 생산하기 위해 배양된다.
본 발명은 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위한 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편에 관한 것이다. Vpr은 세포 주기를 정지시키는 능력을 갖는 것으로 알려져 있다. 세포 주기의 정지와 관련하여 Vpr이 상호작용하는 세포 단백질 hVIP의 발견은, 세포 주기를 정지시키는 능력을 유지하는 Vpr 및 Vpr의 단편에 의해 hVIP를 표적화하는 것을 제공한다. 일부 실시 태양에 따르면, 단편 또한 핵에 편 재화되는 능력을 가진다.
Vpr의 아미노산 서열은 1993년 12월 15일 제출된 미국 특허 출원 제 08/167,608호에 개시되고, 이는 참고자료에 의해 여기에 혼입된다. 본 발명에 따라, 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위한 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편을 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 특이적으로 상호작용하여 세포 주기를 정지시키는 부위를 동정하기 위한 Vpr 단백질 맵핑 (mapping) 실험으로부터의 데이타는 1997년 8월 14일 제출된 임시 출원 제 60/055,754호에 기술되고, 이는 참고자료에 의해 여기에 혼입된다.
Vpr의 단편은 hVIP와 상호작용하여 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하는 는 것으로 동정될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시 양태는 적어도 3개의 아미노산을 포함하고 hVIP와 결합하는 Vpr의 단편이다. 몇몇 실시 양태에서, Vpr의 단편은 50개 미만의 아미노산이다. 몇몇 실시 양태에서, Vpr의 단편은 25개 미만의 아미노산이다. 몇몇 실시 양태에서, Vpr의 단편은 20개 미만의 아미노산이다. 몇몇 실시 양태에서, Vpr의 단편은 15개 미만의 아미노산이다. 몇몇 실시 양태에서, Vpr의 단편은 13개 미만의 아미노산이다. 몇몇 실시 양태에서, Vpr의 단편은 10개 미만의 아미노산이다. 몇몇 실시 양태에서, Vpr의 단편은 8개 미만의 아미노산이다. 몇몇 실시 양태에서, Vpr의 단편은 5개 미만의 아미노산이다.
본 발명의 몇몇 실시양태는 적어도 3개의 아미노산을 포함하고 hVIP와 결합하는 Vpr의 단편을 포함하는 펩티드이다. 몇몇 실시 양태에서, 펩티드는 25개 미만의 아미노산이다. 몇몇 실시 양태에서, 펩티드는 25개 미만의 아미노산인 Vpr의 단편을 포함한다. 몇몇 실시 양태에서, 펩티드는 20개 미만의 아미노산인 Vpr의 단편을 포함한다. 몇몇 실시 양태에서, 펩티드는 15개 미만의 아미노산인 Vpr의 단편을 포함한다. 몇몇 실시 양태에서, 펩티드는 10개 미만의 아미노산인 Vpr의 단편을 포함한다. 몇몇 실시 양태에서, 펩티드는 8개 미만의 아미노산인 Vpr의 단편을 포함한다. 몇몇 실시 양태에서, 펩티드는 5개 미만의 아미노산인 Vpr의 단편을 포함한다. 몇몇 실시 양태에서, 펩티드는 4개 미만의 아미노산인 Vpr의 단편을 포함한다.
몇몇 실시 양태에서, 본 발명의 화합물은 20개 이하의 아미노산이고; 적어도 3개 아미노산이고 hVIP와 결합하는 Vpr의 단편으로 구성되거나 또는 이를 포함하고; 세포 주기를 정지에 유용하다. 본 발명의 펩티드는 20개 이하, 바람직하게는 10-15개 이하의 아미노산으로 구성된 아미노산 서열을 포함한다. 여기서 사용된, "화합물" 이란 용어는 적어도 몇몇 비-펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 포함하는 펩티드 및 비-펩티드를 포함하는 분자를 의미하고, 이에 국한되지 않는다. 여기서 사용된 "펩티드" 라는 용어는 천연 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 서브유닛로부터 형성된 폴리펩티드를 의미한다. "아미노산" 이란 용어는 천연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 의미하고 천연적으로 발생하는 펩티드와 유사한 부분을 갖지만 비-천연적으로 발생하는 부분도 갖는 잔기를 의미한다. 그래서, 펩티드는 변형된 아미노산 또는 연결을 가질 수 있다. 펩티드는 또한 본 발명의 사상과 일치하는 그외 변화를 포함할 수 있다. 이러한 펩티드는 구조적으로 교체할 수 있지만 천연 펩티드와 구조적으로는 다른 것으로서 가장 잘 기술된 다. 여기서 사용된, "화합물들" 및 "펩티드들" 이란 용어는 교체할 수 있다.
Vpr 단편의 아미노산 서열의 보존적 치환이 고찰된다. 여기서 사용된, "보존적 치환" 이란 용어는 유사한 구조적 및/또는 전하 특성을 공유하는 다른 잔기들로 Vpr 잔기를 아미노산 치환하는 것을 의미한다. 이 기술 분야에서 통상적인 기술을 갖는 사람들은 잘 알려진 보존적 기를 바탕으로 아미노산에 대한 보존적 치환으로 vpr 단편을 쉽게 설계할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시 양태의 펩티드는 적어도 약 3개 내지 약 20개까지의 길이의 아미노산일 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시 양태에서, 본 발명의 펩티드는 약 5개 내지 약 15개 길이의 아미노산이다. 본 발명의 바람직한 실시 양태에서, 본 발명의 펩티드는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 19개 길이의 아미노산이다. 펩티드가 가능한 한 작은 것이 바람직하다.
본 발명의 펩티드에서, 펩티드의 적어도 3개의 아미노산은 Vpr 단편이다. Vpr로부터 유도된 부분이 펩티드의 아미노산 서열의 적어도 10%를 구성하는 것이 바람직하다. 몇몇 실시 양태에서, 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열의 약 20-25% 보다 큰 부분이 Vpr로부터 유도된 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 30-40%이며, 50% 보다 큰 것이 더욱 바람직하다. 몇몇 실시 양태에서, 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열에서 Vpr 유도 부분의 비율은 약 60% 또는 약 75% 이상이다.
본 발명의 합성된 펩티드는 vpr에서 나타나는 이들 부분의 기하학을 모방하기 위해 원형화될 수 있다. 원형화 (circularization)는 시스테인 잔기 사이의 디설파이드 결합에 의해 촉진될 수 있다. 시스테인 잔기는 vpr로부터 유도된 펩티드 의 부분을 플랭크 (flank)하는 펩티드상의 위치에 포함될 수 있다. vpr로부터 유도된 펩티드 부분내의 시스테인 잔기는 삭제될 수 있고(또는), 이러한 잔기를 포함하는 디설파이드 브릿지의 형성을 제거하기 위해 보존적으로 치환될 수 있다. 선택적으로, 펩티드를 원형화하는 그외 수단들이 또한 잘 알려져 있다. 펩티드는 아미노 및 카르복시 말단에서 또는 인접한 곳과 같은 펩티드의 아미노산 잔기 사이에, 아미드 결합과 같은 공유 결합에 의해 원형화될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시 양태에서, 펩티드는 15개 이하의 아미노산으로 구성되며 원형화되거나, 그렇지 않으면 N- 및 C-말단 시스테인으로부터 생기는 디설파이드 결합에 의해 입체 구조적으로 제한된다.
본 발명의 펩티드는 하기 알려진 기술 중 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다. 편리하게는, 펩티드는 참고자료에 의해 여기에 혼입된 J. Am. Chem . Soc ., 15:2149-2154 (1963)에 메리필드가 최초로 기술한 고체-상 합성 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 그외 펩티드 합성 기술은 예를 들면, 참고자료에 의해 여기에 혼입된 문헌 [엠. 보단츠키 등, (1976) 펩티드 합성, 존 윌리 & 선즈, 제 2판]; 참고자료에 의해 여기에 혼입된 문헌 [켄트 앤 클락-루이스, 생물학 및 의학에서의 합성 펩티드, 페이지 295-358, 알리탈로, 케이 등 편집, 사이언스 퍼블리셔즈, (암스텔담, 1985)]; 뿐만 아니라 이 기술 분야에서 숙련된 사람들에게 알려진 그외 참고 문헌에서 찾을 수 있다. 펩티드 합성 기술의 요약은 참고자료에 의해 여기에 혼입된 문헌 [제이. 스튜어트 및 제이.디. 영, 고체 상 펩티드 신텔리아, 피어스 케미컬 컴퍼니, 록포드, 일리노이 (1984)]에서 발견할 수 있다. 용액 방법에 의한 펩 티드의 합성이 또한, 참고자료에 의해 여기에 혼입된 문헌 [단백질, II권, 제 3판, 페이지 105-237, 뉴라스, 에이취. 등 편집, 아카데믹 프레스, 뉴욕, 뉴욕 (1976)]에 기술된 바대로 사용될 수 있다. 이러한 합성에서 사용하기 위한 적합한 보호기는 상기 서적, 및 참고자료에 의해 여기에 혼입된 문헌 [제이.에푸.더블유. 맥코미, 유기 화학에서의 보호기, 프레넘 프레스, 뉴욕, 뉴욕 (1973)]에서 발견할 것이다.
일반적으로, 이들 합성 방법은 성장하는 펩티드 사슬에 한개 이상의 아미노산 잔기 또는 적합한 보호된 아미노산 잔기를 순차적으로 첨가하는 것을 포함한다. 정상적으로, 제 1 아미노산 잔기의 아미노 또는 카르복실기는 적합한, 선택적으로 제거 가능한 보호기에 의해 보호된다. 반응성 측면기를 함유하는 아미노산에 대해서는 리신과 같이 상이한, 선택적으로 제거 가능한 보호기가 사용된다.
예로서 고체 상 합성을 사용하여, 보호된 또는 유도된 아미노산은 이의 보호되지 않은 카르복실 또는 아미노기를 통하여 불활성 고체 지지판에 부착된다. 아미노 또는 카르복실기의 보호기는 이후 선택적으로 제거되고, 적합하게 보호된 상보적 (아미노 또는 카르복실) 기를 갖는 서열의 다음 아미노산이 혼합되어 고체 지지판에 이미 부착된 잔기와 반응된다. 아미노 또는 카르복실기의 보호기는 이후 새롭게 첨가된 아미노산 잔기로부터 제거되고, 다음 아미노산 (적합하게 보호된)이 이후 첨가된다. 모든 바람직한 아미노산이 적합한 서열로 연결된 이후, 임의의 잔류 말단 및 측면기 보호기 (및 고체 지지판)는 최종 펩티드를 제공하기 위해 순차적으로 또는 동시에 제거된다. 본 발명의 펩티드는 벤질화되거나 또는 메틸벤질화 된 아미노산이 없는 것이 바람직하다. 이러한 보호기 잔기는 합성의 경로에서 사용될 수 있지만, 펩티드가 사용되기 전에 제거된다. 다른 곳에서 기술된 바대로, 입체 구조를 억제하는 분자내 연결을 형성하기 위해 추가의 반응들이 필요할 수 있다.
펩티드는 이들이 hVIP에 결합하는지 및 세포 주기를 정지시키는지를 결정하기 위해, 하기 방법들에 의해 테스트될 수 있다. hVIP에 결합하고 세포 주기를 정지시키는 이들 펩티드는, 암과 같은 바람직하지 않은 세포 증식을 특징으로 하는 상태, 질병 및 장애의 치료에 유용하다.
본 발명은 본 발명의 화합물 및 제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 제약 조성물은 선택된 투여 형태에 따라 선택된 조성으로 이 기술 분야에서 통상적인 기술을 가진 사람에 의해 제형화 될 수 있다. 적합한 제약학 담체는 이 분야에서 표준 참고 서적인, 에이. 오솔의 레밍턴'스 파마수티칼 사이언스에 기술된다. 본 발명의 방법을 수행함에 있어서, 본 발명의 펩티드는 단독으로 또는 다른 진단제, 치료 또는 첨가제와 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 첨가제는 향료, 착색제, 안정제, 농축화 물질, 삼투압제 및 항생제와 같은 부형제를 포함한다. 이러한 물질을 시험관내에서의 펩티드의 용도, 보관 중 조성물의 안정성, 또는 최적의 효과를 얻기 위해 중요한 그외 성질을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따른 정맥내 투여에 적합한 제약 조성물은 멸균이고 발열 물질이 없다. 상기 기술된 제약 조성물은 출발 물질로서 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위한 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편을 사용하여, 본 발명에 따라 제조될 수 있다.
비경구 투여를 위하여, 본 발명의 펩티드는, 예를 들면, 제약학적으로 허용되는 비경구 비히클과 결합된 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결 건조 분말로서 제형화될 수 있다. 이러한 비히클의 예는 물, 식염수, 링거 용액, 덱스트로스 용액, 및 5% 인간 혈청 알부민이다. 리포좀 및 고형 오일과 같은 비수성 비히클이 또한 사용될 수 있다. 비히클 또는 동결 건조 분말은 등장성 (예를 들면, 소듐 클로라이드, 만니톨) 및 화학적 안정성 (예를 들면, 완충액 및 보존제)을 유지하는 첨가제를 함유할 수 있다. 제형은 보통 사용되는 기술에 의해 멸균될 수 있다. 예를 들면, 주사에 의한 투여에 적합한 비경구 조성물은 0.9% 염화나트륨 용액에 1.5 중량%의 활성 성분을 용해시킴으로써 제조된다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 단일 투약 또는 복합 투약으로서 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 개별적인 치료제 또는 그외 치료제와 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 치료는 통상적인 치료법과 혼용될 수 있고, 이는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 활성 제제가 목적 세포에 도달하도록 해주는 수단에 의해 투여될 수 있다. 펩티드가 경구로 투여될 때 소화될 수 있으므로, 비경구 투여, 즉, 정맥내, 피하, 경피, 근육내 투여가, 흡수를 최적화하기 위해 보통 사용될 것이다. 정맥내 투여는 주입 펌프의 보조로 이루어질 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 에멀젼으로 제형화될 수 있다. 선택적으로, 이들은 비강내 또는 흡입 투여를 위해 에어로졸 의약품으로 제형화될 수 있다. 몇 경우에, 국소적 투여가 바람직할 수 있다.
투여되는 용량은 약역학적 특성; 투여 모드 및 경로; 증상의 성질 및 정도; 병행 치료의 종류; 및 치료 빈도와 같은 인자에 따라 다양하다. 보통, 펩티드의 용량은 체중 50 킬로그램당 약 1 내지 3000 밀리그램; 바람직하게는 체중 50 킬로그램당 10 내지 1000 밀리그램; 더욱 바람직하게는 체중 50 킬로그램당 25 내지 800 밀리그램일 수 있다. 보통 8 내지 800 밀리그램이 하루에 한 사람에게 1 내지 6회 분할 용량으로 또는 바람직한 결과를 얻기에 효과적인 서방형으로 투여된다.
치료될 질병 또는 장애에 따라, 본 발명의 제약 조성물은 가장 효과적으로 제형화되고 투여될 수 있다. 투여 형태는 이 기술 분야의 숙련자에게 본 개시를 봄으로써 명백할 것이다.
본 발명은 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위한 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편을 코드화하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 단편을 코드화하는 DNA 분자는 분리되거나 합성될 수 있고, 유전자 치료 프로토콜에서 제약 제제로 전달될 수 있는 유전자 치료 벡터로서 단백질의 생산에 유용한 발현 벡터와 같은 벡터로 클로닝될 수있다. 단백질 생산 용도에서, 표준 재조합 DNA 방법 및 상기 기술된 것들과 같은 출발 물질을 사용하여, 발현 벡터는 배양되고 단백질이 분리되는 적합한 숙주 세포로 삽입된다. 유전자 치료 용도에서, DNA는 정지가 요구되는 세포로 DNA를 도입하기 위해 선택된 벡터로 삽입된다.
세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위한 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편, 또는 이들을 코드화하는 DNA 분자는, 세포가 G2로부터 M으로 전이하는 것을 억제하는 방법에 사용될 수 있다. 이 방법은 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위해 세포를 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편, 또는 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하기 위해 세포에 의해 발현되는 hVIP와 상호작용하는 Vpr의 단편을 코드화하는 뉴클레오티드 서열과 접촉하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 과증식성 질병 및 일부 자가면역 질병과 같이 증식이 바람직하지 않은 세포를 특징으로 하는 질병을 갖는 환자를 치료하기에 유용하다. 바람직하지 않은 면역 반응과 관련된 과증식성 세포 또는 증식성 세포의 분열은 정지되거나 억제될 수 있고, 따라서 이러한 바람직하지 않은 세포의 수를 감소시키고 이에 의해 환자에게 치료적 잇점이 나타난다.
본 발명의 또 다른 면은 항-HIV 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 이러한 면에 따라, Vpr과 상호작용하는 것으로 알려진 hVIP 또는 hVIP의 단편은, hVIP와 상호작용하여 세포의 G2/M 전이를 예방하거나 억제하는 Vpr 또는 Vpr의 단편과 시험 화합물 존재하에서 접촉된다. Vpr 또는 이의 단편에 대한 hVIP 또는 이의 단편의 친화도가 측정되고, 시험 화합물 부재하에서 Vpr 또는 이의 단편에 대한 hVIP 또는 이의 단편의 친화도와 비교된다. hVIP에 대한 Vpr의 결합을 파괴할 수 있는 화합물은, 항-HIV 화합물로서 유용할 수 있다. 이 의약품 스크린 분석에서 양성 조절의 예는 Vpr에 비해 hVIP에 경쟁적으로 결합하는 항-hVIP 항체일 것이다. 이 의약품 스크린 분석에서 양성 조절의 또 다른 예는 hVIP에 대해 Vpr에 경쟁적으로 결합하는 항-Vpr 항체일 것이다. 이러한 항체는 hVIP/Vpr 상호작용을 방해하는 알려진 화합물로서 유용하다. Vpr 및 hVIP의 알려진 양이 결합에 적합한 조건하에서 혼합될 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시 양태에서, 시험 화합물의 바람직한 농도는 1 μM 내지 500 μM 이다. 바람직한 농도는 10 μM 내지 100 μM 이다. 몇몇 바람직한 실시 양태에서, 시험 화합물의 연속 희석액을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되고, 이는 어떤 식으로도 본 발명을 제한하는 것이 의도되지 않는다.
실시예
1:
hVIP
의
클로닝
1023 bp 오픈 리딩 프레임을 함유하는 완전한 길이의 1.35 kb cDNA를 분리하기 위해, 이스트 2-하이브리드 스크리닝 및 5' RACE를 사용했다. hVIP의 전체 cDNA 서열은 서열 1에 제시했고, 이에 의해 코드화된 아미노산 서열은 서열 2에 제시했다. 서열 3은 비번역 서열을 포함하는 선택적인 cDNA 서열을 함유한다. 서열 3에 의해 코드화된 아미노산 서열은 서열 4에 제시했다. 데이터 뱅크에 의한 완전한 hVIP 아미노산 서열은 어떠한 알려진 서열과도 유의한 유사성을 나타내지 않았다. 9개의 디펩티드 류신-이소류신 모티프 및 몇몇 류신-이소류신 리피트가 hVIP의 아미노산 서열에서 발견되었다. 일반적으로, 이러한 류신-이소류신 리피트가 단백질-단백질 상호작용을 매개하는 것으로 여겨진다. 스즈키 등, Proc . Natl . Acad. Sci. USA, 1990, 92, 3794-3798; 및 드래퍼 등, Mol . Cell. Biol ., 1994, 14, 4522-4531. hVIP cDNA는 프로브로서 hVIP cDNA를 사용한, 몇몇 인간 기관으로부터의 폴리(A)+ 및 CEM, PBMCs, 및 인간 랍도마이오사르코마 세포계 (RD)로부터의 RNA를 함유하는 노던 블롯에서 검출된 크기에 상응하는 대략 1.35 kb이다 (도 1B 및 1C 참조). 이 다양한 발현 패턴은 단순히 HIV에 대한 세포 표적에서만이 아니라 다양한 세포계의 생물학에서 hVIP에 대한 역할을 암시한다.
실시예
2:
hVIP
단백질의 제조
hVIP의 생물학은 완전한 길이의 hVIP cDNA를 항-Xpress 에피토프 표식된 6His 포유류 발현 벡터, pcDNA3.His와 인-프레임으로 융합함으로써 조사했다. hVIP cDNA는 상대적 분자 질량이 39,000 (Mr 39k)인 폴리펩티드를 발현하는데, 모노클로날 항-Xpress 에피토프 항체를 사용하여 면역침전법으로 검출했다 (도 1D 참조). HeLa 세포는 hVIP 발현 벡터로 트랜스펙션했고, 이후 35S 단백질 표식 믹스 (NEN)로 표식했으며, hVIP는 항-Xpress 항체를 사용하여 면역 침전했고 SDS15%-PAGE 상에서 분석했다. 이스트 2 하이브리드 분석에 의해 제안된 바대로 Vpr 및 hVIP 사이의 물리적 상호작용의 존재를 입증하고자, 우리는 Vpr이 시험관내에서 hVIP와 복합체를 형성할 것인지를 보기 위해 관찰하였다. 이를 위해, 우리는 동량의 35S 표식된 시험관내 번역된 hVIP를 35S 표식된 Vpr 및(또는) HIV-1 p55gag 전구체 다중 단백질 (대조군으로서)과 혼합하였다. 적합한 혼합물은 이들의 상대적 항혈청과 인큐베이션했고, 이들의 상호작용은 공면역침전법으로 분석했다. 도 2는 Vpr 및 hVIP 모두가 항-Vpr 항혈청에 의해 공면역 침전되었음을 보여준다. 동량의 35S 표식된 시험관내 번역된 hVIP는, 30분 동안 결합 완충액에서 HIV-1 Vpr 및 p55gag 전구체 다중 단백질과 함께 얼음상에서 인큐베이션했다. 단백질 복합체는 항-Vpr, 항-Xpress 또는 항-p24 항체와 함께 면역 침전되었고, 이후 SDS 15%-PAGE를 실시했다. hVIP 단백질은 항-p24 항체에 의해 p55gag와 함께 공면역 침전하지 않았으나, 항-Vpr 항혈청에 의해 Vpr과 함께 특이적으로 공면역 침전하였다. p55gag에 대한 폴리클로날 항혈청은 hVIP를 면역 침전시키지 않았다. 흥미롭게도, p55gag 및 hVIP에 의해 면역 침전된 항-Vpr 항혈청은 두 리간드에 대해 Vpr 상에 경쟁이 없고 특징적인 결합 위치가 있음을 암시한다. 이들 데이터는 hVIP 및 Vpr의 특이적 상호작용이 시험관내에서 반복될 수 있고 이 상호작용이 직접적임을 보여준다.
실시예
3:
hVIP
의
편재화
hVIP는 반점 염색 패턴으로 핵에 편재되고, Vpr은 핵의 주변에 편재된다. hVIP 및 HIV-1 Vpr 발현 벡터로 코트랜스펙션한 HeLa 세포를 이후 면역 형광법을 위해 고정했다. 고정된 세포는 항-토끼 폴리클로날 1차 항체로 프로브했고 이어서 Vpr에 대한 로다민-결합 염소 항-토끼 2차 항체로 염색했다. 세포는 모노클로날 항-Xpress 항체로 프로브했고 이어서 hVIP에 대한 형광-결합 염소 항-쥐 2차 항체로 프로브했다.
사실상 모든 종류의 발현된 hVIP는 반점 염색 패턴을 형성하면서 핵에 편재된다 (도 3, 패널 d 참조). 반대로, Vpr은 핵의 주변에 편재된다 (도 3, 패널 c 참조). 우리는 이후 hVIP 및 Vpr 염색이 코트랜스펙션된 세포의 핵에 공편재할 것인 지를 보기 위해 관찰하였다. 토끼 폴리클로날 Vpr 항체 및 항-Xpress 에피토프 모노클로날 항체로의 2가지 색 면역 염색이 수행했다. 이들 분석은 Vpr 및 hVIP의 공발현이 반점 핵 패턴으로부터 핵주위 패턴으로의 hVIP의 분포를 강하게 변형시켰다는 것을 나타내었다 (도 3, 패널 g 참조). hVIP 및 Vpr의 현저한 공편재가 Vpr의 존재하에 핵의 주변에서 관찰했다 (도 3, 패널 f 참조). 야생형 Vpr과의 공발현에 의해 유도된 hVIP의 세포내 편재에 있어서의 변화는, 돌연변이 Vpr 분자 (도 4B 참조) 또는 HIV-1 p55gag 전구체 다중 단백질 (데이타는 나타내지 않음)을 코드화하는 발현 벡터로의 코트랜스펙션으로는 변형되지 않는 점이 특징이었다. 이는 HIV-1 Vpr이 hVIP와 상호작용하고 hVIP의 세포내 분포를 변형시켜 hVIP 및 Vpr이 물리적으로 생체내에서 상호작용한다는 사실을 암시한다.
실시예
4:
Vpr
과
hVIP
의 상호작용
hVIP와의 상호작용 및 세포 주기 정지에 필요한 Vpr의 부위를 동정하기 위해, 우리는 상기 기술된 바대로 오버랩 PCR에 의해 상이한 돌연변이 Vpr 분자를 생성했다. 마할린감 등, Virology, 1995, 212, 331-339. hVIP와 Vpr 돌연변이의 편재 및 세로 주기 정지 사이의 상호관계를 평가했다. HeLa 세포는 상이한 Vpr 돌연변이 (A30L, α L-A, A59p, L67S, H71C, G75A, 및 C76S) 및 hVIP 발현 플라스미드로 코트랜스펙션했고 이들의 세포내 편재를 연구했다. 트랜스펙션된 세포를 고정시키고 상기 기술된 바대로 염색하여 발현을 검출하기 위해 형광 및 로다민 파장 여과기로 시각화했고 Vpr 돌연변이의 세포 주기 억제 활성은 유동 세포 분석법에 의해 결정했다. 도 4A 및 4B는 Vpr 돌연변이 A30L, A59P, L67S, H71C, G75A, 및 C76S가 hVIP의 세포내 분포를 변형시키지 않고 (도 4A 및 4B 참조) 세포 증식도 억제시키지 않는 것을 보여준다 (도 4A 참조). hVIP는 Vpr 돌연변이 α L-A와 함께 공발현될 때 원형질에 편재했다. 흥미롭게도, 이 돌연변이는 야생형 Vpr의 세포 주기 정지 기능을 유지시키고 hVIP의 핵 유입을 막아주었다 (도 4B 참조). 이들 데이터는 카르복시 말단에 있는 아미노산 잔기가 Vpr 및 hVIP 사이의 상호작용 및 세포 주기 정지에 있어서 hVIP의 세포내 편재를 변형시키는 것에 필수적임을 명백히 보여준다.
실시예
5:
hVIP
및 세포 주기
hVIP가 세포 분열의 G2로부터 M 상으로의 전이에 필수적임을 확인하기 위해, 안티센스 hVIP 및 대조 발현 벡터 pBabepuro (퓨로마이신 내성을 제공하는 벡터)를 구성했다. 안티센스 hVIP는 안티센스 분자의 생산을 위한, 완전한 길이의 hVIP 뉴클레오티드 서열을 함유하였다. RD 세포는 Vpr, hVIP 센스, 및 안티센스 발현 벡터로 트랜스펙션했고, 퓨로마이신으로 선택했다. 도 5A 및 5B1 내지 5B4는 Vpr 및 hVIP 안티센스 트랜스펙션된 플레이트에서의 세포 수의 현저한 감소를 나타내고, Vpr 및 안티센스 hVIP를 발현하는 세포가 세포 주기의 G2/M 상에서 차단되었음을 보여준다 (도 5B1 내지 5B4 참조). HeLa, MCF-7, 및 SW480을 포함하는 몇 개의 다양한 인간 종양 세포계에서도 유사한 결과를 얻었다. 세포 주기에서, G2로부터 M으로의 전이는 사이클린-의존 키나제 p34cdc2 및 사이클린 B 복합체에 의해 조절된다. 노버리 등, Biochem . Biophys . Acta, 1989, 989, 85-89; 머레이, Nature, 1992, 359, 599-604. G2 후반에, p34cdc는 아미노산 잔기 Thr14 및 Thr15에서 탈인산화된다. 이는 복합체를 활성화하여, M 상의 복잡한 현상들에 포함된 몇 개의 세 포 기질을 인산화한다. hVIP는 M 상의 개시에 필요한 필수적인 세포 인자이다. hVIP가 사이클린 B 또는 p34cdc 또는 세포주기 캐스케이드의 그외 구성요소와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는지를 결정하기 위해서는 추가의 연구가 필요할 것이다.
실시예
6: 이스트 2
하이브리드
상호작용 분석
완전한 길이의 HIV-1 Vpr을 GAL-4 DNA 결합 도메인 이스트 발현 벡터 pGBT9 (클론테크)와 인-프레임으로 융합했다. GAL-4 활성화 도메인 표지된 PBL cDNA 라이브러리 (클론테크) 및 미끼로서 사용된 GAL-4 Vpr 구조물을 사용하여, 2 하이브리드 스크린을 수행했다. 배양 플레이트상에서 선택 4일후, 이중 형질 전환체를 여과지 (VWR)로 옮기고, 제조자의 프로토콜 (클론테크)에 따라 β-gal 발현을 분석했다. 3개의 클론을 회수했고, 모두 아미노산 31에서 시작하는 hVIP의 카르복실-말단 부분을 함유하였다. 5'RACE는 취급 설명서 (뵈링거 맨하임)에 따라, CEM 및 HeLa 세포로부터의 총 RNA를 사용하여 hVIP 유전자 단편의 5'' 말단을 분리하기 위해 수행했다. 모든 분자 클론은 디데옥시 사슬 종료 방법 (유나이티드 스테이츠 바이오케미컬) 및 앰플리태그 (퍼킨 앨머)를 사용하는 자동화 시퀀싱 방법을 사용하여 시퀀싱했다.
실시예
7: RNA 및 단백질 발현
다중 조직 노던 블롯은 클론테크로부터 구매했고, 전체 RNA를 CEM, RD, 및 PBMCs로부터 분리했다. 블롯은 내부 1009bp EcoRI hVIP cDNA 단편으로부터 제조된 무작위-프라임된 32P dCTP 표식 프로브로 프로브했다. T7 RNA 중합 효소 (vFT7-3)에 기초한 발현 시스템은, 조직 배양 세포에서 hVIP의 발현을 분석하기 위해 사용했다. 마할린감 등, Virology, 1995, 212, 331-339; 및 Mol . Cell. Biol ., 1987, 7, 2538-2544. hVIP cDNA를 항-Xpress 항체 에피토프 표지된 6His 포유류 발현 벡터 pCDNA3.His (인비트로겐)와 인-프레임으로 융합했고, 발현 연구를 위해 사용했다. HeLa 세포를 vFT7-3로 감염시켰고, 리포펙틴 (Lipofectin, GIBCO-BRL)을 사용하여 hVIP 발현 플라스미드로 트랜스펙션했다. 밤새 트랜스펙션한 후, 세포를 2시간 동안 35S 발현 단백질 표식 믹스 (NEN)로 표식했고, hVIP는 모노클로날 항-발현 항체를 사용하여 면역 침전시켜, SDS 15%-PAGE를 실시했다.
실시예
8:
공면역
침전 분석
동량의 시험관내 번역된 hVIP, HIV-1 Vpr, 및 p55 Gag 전구체 다중 단백질을 혼합하여, 25 mM HEPES (pH 7.9), 150 mM KCl, 0.1% NP40, 5% 글리세롤, 0.5 mM 디티오트레이톨, 0.4 mM 페닐 메틸 설포닐 플루오라이드를 함유하는 결합 완충액 중에 4 oC에서 30분 동안 배양했다. 각각의 항체들을 150 ml 결합 완충액과 함께 각 튜브에 첨가하고, 4 oC에서 90분 동안 인큐베이션했다. 단백질 A 세파로스 (5 mg/튜브)를 모든 튜브에 첨가했고, 이후 회전 진탕기에서 4 oC, 90분 동안 인큐베이션했다. 비드 (beads)를 이후 결합 완충액으로 세번 세척했다. 면역 침전된 단백질 복합체는 세파로스 비드로부터 용출했고, SDS 15%-PAGE를 실시했다. 겔은 상기 기 술된 바대로 형광사진법으로 처리했다. 마할린감 등, DNA Cell Biol., 1997, 16, 137-153.
실시예
9: 세포 주기 분석
HeLa 또는 RD 세포를 야생형 또는 돌연변이 Vpr 및 hVIP 센스, 또는 pBabepuro (퓨로마이신 내성을 발현하는 벡터)를 갖는 안티센스 발현 벡터로 트랜스펙션했다. 이틀 후, 트랜스펙션되지 않은 세포를 제거하기 위해 퓨로마이신을 2 μg/ml의 농도로 첨가했다. 유동 세포 분석법으로 DNA 함량을 분석하기 위해, 트랜스펙션 후 5 내지 7일 이후 트랜스펙션된 세포를 프로피디움 요다이드로 염색했다.
실시예
10: 간접적 면역
형광법
HeLa 세포를 Vpr 또는 hVIP 발현 벡터 단독으로 또는 조합하여 트랜스펙션했다. 상기 기술된 바대로 표시한 1차 항체 다음에 FITC (뵈링거 만하임) 또는 로다민 (시그마) 결합 2차 항체로, 고정된 HeLa 세포를 면역 형광 염색했다. 마할린감 등, Virology, 1995, 212, 331-339. 간접적 면역 형광법은 토끼 항-Vpr (1:50)로 또는 쥐 항-Xpress 모노클로날 (1:100) (인비트로겐) 단독으로 또는 조합하여 수행했다. 이는 이후 로다민 결합 염소 항-토끼 IgG (1:75) 또는 FITC-결합 염소 항-쥐 IgG (1:100), 또는 둘다로 염색했다.
본 발명에서, 이스트 (yeast) 2-하이브리드 (hybrid) 분석은 Vpr과 상호작용하는 특정한 세포 보조인자를 동정하기 위한 노력으로 이용되었다. Vpr 리간드에 필수적인 기준을 만족시키고, 동일한 유전자로부터 유래된 중복되는 상보적 DNA를 포함하는 3개의 클론이 분리되었다. 이 cDNA에 의해 코드화된 단백질은 hVIP로 표시되었다. 다양한 Vpr 돌연변이는 세포 주기를 정지시키고 다른 인간 세포계에서 hVIP와 함께 위치하는 능력에 대하여 테스트되었다. 세포 증식의 억제 및 Vpr 돌연변이와 hVIP가 함께 위치하는 것 사이에 직접적 상관관계가 있음이 밝혀졌다. 세포 주기에 있어서 hVIP 발현의 억제는 G2/M 상에서 세포를 정지시킨다. hVIP는 G2로부터 M 상으로의 전이에 필요하고 따라서 세포 주기 캐스케이드의 필수 성분이다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (21)
- Vpr의 아미노산 30-76번으로 구성된, Vpr의 hVIP(human Vpr Interacting Protein; 인간 Vpr 상호작용 단백질; 서열 2)-결합 단편 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 건선, 증생, HIV 관련 질환 또는 암 치료용 제약 조성물.
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- 시험 화합물의 존재하에서 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 Vpr 상호작용 단백질 (hVIP), 또는 hVIP의 아미노산 31번 내지 카르복시 말단 부분으로 구성된, Vpr과 상호작용하는 것으로 알려진 이의 단편을, Vpr, 또는 Vpr의 아미노산 30-76번으로 구성된, hVIP와 상호작용하는 것으로 알려진 이의 단편과 접촉시키는 단계, 및상기 시험 화합물의 존재하에서의 상기 hVIP 또는 이의 단편의 상기 Vpr 또는 이의 단편에 대한 친화도를, 상기 시험 화합물의 부재하에서의 상기 hVIP 또는 이의 단편의 상기 Vpr 또는 이의 단편에 대한 친화도와 비교하는 단계(여기서, 상기 시험 화합물의 존재하에서의 친화도 감소는 상기 시험 화합물이 항-HIV 화합물임을 지시함)를 포함하는 항-HIV 화합물의 동정 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 시험 화합물이 항체인 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 항체가 항-hVIP(항-인간 Vpr 상호작용 단백질) 항체인 방법.
- 제 4항에 있어서, 상기 항체가 항-Vpr 항체인 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 시험 화합물이 올리고뉴클레오티드인 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 1의 적어도 10개의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 1의 10-150개의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 것인 방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 1의 18-28개의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 것인 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 시험 화합물의 농도가 1μM 내지 500μM인 방법.
- 제 12항에 있어서, 상기 농도가 10μM 내지 100μM인 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 인간 Vpr 상호작용 단백질 (hVIP), 또는 Vpr과 상호작용하는 것으로 알려진 이의 상기 단편을 일련의 시험 화합물 희석액의 존재하에서 Vpr, 또는 hVIP와 상호작용하는 것으로 알려진 이의 상기 단편과 접촉시키는 방법.
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