KR100748920B1 - 단백분해 항체의 유도제 및 억제제를 동정하는 방법,조성물 및 이들의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 공유 반응성 항원 유사체(CRAA)에 관한 것이다. 본 발명의 항원은 특정 의학적 질환과 연관한 예정 항원에 특이적인 촉매성 항체의 생산을 자극 하는 데에 사용가능하다. 이 항원 유사체는 또한 특정 자가면역 질환 뿐아니라 특정 림프 증식성 질환에서 내인적으로 생성되는 촉매성 항체를 우세하게 불활성화시키는 데 사용가능하다.

Description

단백분해 항체의 유도제 및 억제제를 동정하는 방법, 조성물 및 이들의 용도{METHODS FOR IDENTIFYING INDUCERS AND INHIBITORS OF PROTEOLYTIC ANTIBODIES, COMPOSITIONS AND THEIR USES}

본 발명은 면역학, 분자 생물학 및 의약 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 신규한 촉매성 항체(catalytic antibodies) 및 이의 억제제의 제조를 자극하기 위한 신규 방법 및 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 생식 세포 계열 유전자로부터 발현되는 자연발생의 촉매성 항체를 동정 및 분리하는 방법을 제공한다. 마지막으로, 본 발명은 촉매성 항체의 생성을 자극하고(또는) 이 항체의 활성을 비가역적으로 억제하는 공유 반응성 항원 유사체를 합성하는 방법을 제공한다.

본 발명이 속하는 당해 기술 분야의 상태를 보다 상세하게 설명하기 위하여 여러 공보들을 각괄호 중의 번호로 표시하면서 본 명세서에 참고 인용하였다. 이 공보들의 각각의 개시 내용은 본 명세서에 참고 인용하였다.

혈관작용성 장 펩티드(VIP)가 천식 환자 유래의 Ab에 의해 절단된다는 관찰은 Ab가 펩티다제 활성이 있다는 최초의 발견이다[1,2]. 이러한 관찰은 스즈키 등[3]에 의해서도 별도로 재현되었다. 하지만, 자가항체의 촉매작용은 VIP의 촉매작용에 의해서만 제한되지는 않는다. 하시모토의 갑상선염에서의 자가항체는 티로글로불린의 절단을 촉매한다[4]. 자가항체의 촉매작용에 대한 또 다른 증거가 낭창환자 유래의 Ab에 의한 DNase 활성에 대한 보고를 통해 제공되었다[5,6]. 자가면역 질환에서 촉매성 Ab가 합성된다는 선입견은 자가면역 질환에 대한 유전자적 소인이 있는 마우스 균주가, 전이 상태 유사체로 면역화시 응답 반응하는 대조용 마우스 균주와 비교하였을 때 에스터라제 Ab를 고농도로 생성한다는 관찰을 통해 입증되었다[7].

비촉매적 Ab와 마찬가지로, 펩티다제 Ab는 VL 및 VH 도메인에 있는 잔기들의 접촉을 통해 고특이성으로 Ag와 결합할 수 있다. 정제된 H 및 L 서브유닛은 양친 Ab 보다는 낮은 친화성이지만 Ag와 각각 결합할 수 있는 것으로 알려져 있다. Ab-Ag 복합체의 X선 결정학은 VL 및 VH 도메인이 모두 Ag와의 결합에 관련이 있음을 보여준다[8]. 두 V 도메인의 정확한 기여도는 각 Ab-Ag 복합체마다 다르지만, VH 도메인의 기여도가 다소 높다. 그 이유는 CDRH3이 CDRL3에 비하여 서열이 보다 길고 보다 가변적인 경향이 있기 때문이다.

폴리펩티드 Ag는 먼저 펩티다제 Ab와 먼저 복합체를 형성한 후 1 이상의 펩티드 결합이 절단되게 된다. 절단하기 바로 전에 항체의 촉매 잔기와 접촉되면 전이 상태에서 펩티드 결합이 형성된다. 펩티드 결합을 가수분해하는 작용은 VL 도메인에 존재하는 것으로 보인다. 이와 같은 결론은 다발성 골수종 환자 유래의 모노클로널 L쇄, 폴리클로널 자가항체 L쇄 및 이들의 재조합 VL 도메인에 의한 VIP의 절단 및 VIP로 면역화시 유발되는 재조합 L쇄에 근거한 것이다. VIP에 대한 폴리클로널 및 모노클로널 Ab의 H쇄는 VIP에 결합할 수는 있지만, 촉매 활성은 나타내지 않는다[9]. 그럼에도 불구하고, VH 도메인은 펩티다제 활성에 "원격 조정"을 통해 영향을 미칠 수 있다. 그 이유는 절단 부위에서 떨어진 부위에서 VIP에 결합하여, 촉매적 항VIP VL 도메인을 VH 도메인에 결합시켜 만든 F_v 작제물의 펩티다제 활성으로 확인되듯이 결합 부위의 형태에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. VIP 결합 친화성 및 촉매 효율의 정도를 통해 평가되는 바와 같이, 항VIP VH 도메인은 유리한 영향을 미치고, 관련이 없는 VH 도메인은 촉매 활성에 유해한 영향을 미친다. 제안된 바와 같이 촉매적 Ab 중에 나타나는 촉매 준부위와 항원 결합 준부위의 분리 존재는 Ab가 일반적으로 폴리펩티드 기질의 15개 내지 22개 아미노산을 수용할 수 있는 대형 결합 부위를 포함하고[8], 절단 부위와는 별도의 기질 영역이 Ab에 의해 인식된다는 데이터와 일치한다. 즉, VH 도메인은 촉매 부위의 특이성을 조절하는 수단을 제공한다.

L쇄의 분자 모델링은 이것의 Asp1, Ser27a 및 His93이 적당하게 부위하여 촉매성 3인조로서 작용한다는 것을 암시하였다[10]. 부위 지시성 돌연변이 유발을 통해 Ser27a, His93 또는 Asp1을 Ala 잔기로 치환시키면 VIP의 가수분해가 >90% 감소되었다[12]. 야생형 단백질의 촉매 활성은 세린 프로테아제 억제제인 디이소프로필플루오로포스페이트(DFP)에 의해 선택적으로 억제되었지만, Ser27a 돌연변이체의 잔존 할성은 DFP에 대해 내성적이었다. VIP에 대한 야생형 L쇄의 K_m(130 nM)은 Ser27a, His93 및 Asp1의 돌연변이에 의해 영향을 받지 않았다. 이와 반대로, L쇄의 연장된 활성 부위를 형성하는 잔기(Ser26, H27d/Asp28)에서의 돌연변이유발은 K_m 값의 증가(10배) 및 전도율의 증가(10배)를 초래하였다. 이와 같은 결과는 바닥 상태(ground state) 안정성의 감소로부터 나타나는 것으로 설명할 수 있다. 결과적으로 얻어지는 △G'_cat의 감소는 전도율의 증가를 초래한다. 따라서, L쇄에 의한 촉매작용에 관여하는 2가지 종류의 잔기가 확인되었다. 즉, Ser27a와 His93은 촉매작용에 필수적이지만 VIP의 바닥 상태와의 초기 고친화성 복합체화에는 큰 역할을 하지 않는다. Ser26과 His27d/Asp28은 VIP 바닥 상태 결합에 관여하고 전도율을 간접적으로 제한한다. 도 1을 참조하라.

VIPase L쇄는 세린 프로테아제에 의한 펩티드 결합 절단 동안 나타나는 바와 같이 공유 아실-L쇄 중간체의 형성을 암시하듯이 반응 초기 단계에 폭발적 속도론을 나타내었다. 형광 강도는 기질 Pro-Phe-Arg-MCA와 L쇄를 혼합한 후 시간의 함수로서 모니터하였다. 형광성은 공유 중간체의 형성에 따라 즉시 증가하였고, 안정 속도에 도달함에 따라 보다 느리게 증가하였다. 활성 부위의 수는 표준 아미노메틸쿠마린의 형광성 수율과 비교하여 폭발의 정도로부터 산정하였다. 촉매 부위의 농도는 114 nM로 추정되었다. 이것은 브래드포드법으로 추정되는 L쇄 농도(125 nM)의 약 90%를 나타낸다.

항VIP VL 도메인 중의 촉매 잔기(Ser27a, His93, Asp1)는 이것의 생식 세포 계열 VL 도메인 대응부에도 존재한다(생식 세포 계열 VL 유전자의 GenBank 수탁 번호, Z72384). 항VIP VL 도메인은 이것의 생식 세포 계열 서열과 비교하였을 때 4개 아미노산의 치환체를 포함한다. 즉, His27d:Asp, Thr28e:Ser, Ile34:Asn 및 Gln96:Trp이다. 이와 같은 4개의 돌연변이를 전술한 바와 같이 도입시켜 항VIP L 쇄의 생식 세포 계열 형태의 단백질을 작제하였다[12]. 정제된 생식 세포 계열 단백질은 성숙 L쇄보다 약 3.5배 낮은 농도에서 Pro-Phe-Arg-MCA 기질의 절단시 검측되는 바와 같은 촉매 활성을 나타내었다(330±23 FU/0.4 μM L쇄/20분; 기질 농도 50 μM). 이 데이터는 체세포적으로 변이된 잔기에 의한 원격 효과가 촉매 활성의 발현에 필수적이 아님을 암시한다.

본 발명은 촉매성 항체 및 이의 단편의 생성을 자극하기 위한 신규 조성물 및 방법을 제공한다. 소정의 질병 관련 항원에 대하여 특이성이 있는 촉매성 항체는 임상용으로 중요한 치료 도구이다. 또한, 본 발명은 비제한적으로 감염 질환, 자가면역 질환 및 종양 질환을 비롯하여 각종 의학적 질환 및 질병 치료용의 자연 발생의 촉매성 항체를 동정, 분리 및 정제하는 방법을 제공한다. 또한, 이러한 촉매성 항체는 수의학, 산업적, 임상적 연구 및 피부학 분야에 이용되기도 한다.

발명의 개요

본 발명의 일 양태에 따르면, 병원성 과정 및 종양 과정에 관여하는 항원 등을 비롯하여 소정의 표적 항원에 대한 촉매성 항체의 생성을 자극하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 공유 반응성 항원 유사체(Covalently reactive antigen analog; CRAA)는 각종 질환, 예컨대 자가면역 질환, 미생물 질환, 림프증식성 질환 및 암의 치료에 치료적 가치가 있는 촉매성 항체의 생성을 자극하는 것으로 나타난다. 본 발명의 촉매성 항체는 특정 의학적 질환, 예컨대 패혈증, 전신성 염증 질환 및 급성 호흡곤란증 등을 예방하기 위하여 예방용으로 사용할 수 있다.

본 발명의 공유 반응성 항원 유사체(CRAA)는 3가지 필수 인자를 포함하며, 화학식 X1-Y-E-X2로 표시된다. E는 특정 아미노산의 친핵성 측쇄와 공유 반응하는 것으로 디자인된 친전자성 반응 중심이고, Y는 P1 부위(반응 중심의 N-말단측에 있는 제1 아미노산)에 있는 염기성 잔기(Arg 또는 Lys)이며, X1 및 X2는 반응 중심의 N-말단 및 C-말단측에 존재하는 3 내지 10개의 인접 아미노산을 포함한다. 그 결과 얻어지는 CRAA는 (a) 특정 세린 프로테아제 형태의 촉매성 항체의 생식 세포 계열 유전자가 암호화하는 화학적 반응성 세린 잔기(뿐만 아니라 생식 세포 계열 유전자의 체세포 서열 다양화를 통해 화학적 반응성을 요구하는 Thr 및 Cys와 같은 잔기)에 결합하고, (b) 생식 세포 계열 암호화된 촉매 부위의 염기성 잔기 절단 특이성에 주요 역할을 하는 양하전성 Asp/Glu 잔기와 같이 구조체를 결합시키기 위해 이온쌍 및 비공유 힘을 이용하며, (c) 이온쌍 및 비공유 힘을 통해 복수의 아미노산에서 항체 결합 부위를 결합시키기 위하여 함께 작용하는 각 구조 인자의 신규 조합을 나타낸다.

본 발명의 일 양태로, 질병이 있는 생체에 CRAA를 투여하여 특정 촉매성 항체의 생성을 자극하는 방법을 제공한다. 이 촉매성 항체를 그 다음 정제한다. 이와 같이 정제된 항체는 소정의 질환과 관련있는 항원을 불활성화시키기에 충분한 양으로 그 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여된다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 촉매성 항체 생성을 더욱 자극하기 위하여 종래의 전이 상태 유사체(TSA)의 면역원성 양과 함께 CRAA의 면역원성 양을 투여하는 방법 및 조성물을 개시한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 내인적 발현성 촉매성 항체의 존재와 관련된 병리학적 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 비정상적 병리 상태로는 림프증식성 질환 뿐만 아니라 특정 자가면역 질환이 있다. 이 방법은 이러한 병리학적 질환이 있는 환자에게 내인적으로 생성된 촉매성 항체에 비가역적으로 결합할 수 있는 공유 반응성 항원 유사체를 포함하는 약학 제제를 항체 활성을 억제하기에 충분한 양으로 투여하여 병리적 상태를 경감시키는 단계를 포함한다. 이 구체예에서, CRAA는 이 CRAA의 면역원성을 최소화하기 위하여 최소 B 에피토프만을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 내인적으로 생성된 촉매성 항체의 존재와 관련있는 병리적 상태를 치료하기 위한 약학 제제가 제공된다. 이 약학 제제는 생물학적 화합성 매질 중에 CRAA를 포함한다. 내인적으로 생성된 촉매성 항체는 CRAA에 노출되면 비가역적으로 결합하여 불활성화된다. 이 제제는 촉매성 항체의 활성을 억제하기에 충분한 양으로 투여한다.

본 발명의 또 다른 양태로, 촉매성 항체 제제로 환자를 수동 면역화시키는 방법을 제공한다. 촉매성 항체는 환자에게 주입되어 표적 질환 관련 항원을 불활성화시킨다. 대안 구체예에서, 환자가 바람직하지 않은 부작용을 나타낸다면, 상기 환자에게 면역화 CRAA를 투여하여 상기 주입된 촉매성 항체의 활성을 비가역적으로 불활성화시킬 수 있다. 이러한 구체예에서의 CRAA의 면역원성은 최소 면역원성 B 세포 에피토프를 내포하게 되면 감소될 수 있다. 이 CRAA에서는 T 세포 보편적 에피토프가 삭제될 수도 있다.

또 다른 구체예로서, 본 발명의 촉매성 항체는 p53에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드와 동시투여될 수 있다. 이러한 복합 요법은 암 치료에 효과적인 것으로 입증된다.

또 다른 양태로, 본 발명의 CRAA를 CRAA-아쥬반트 복합체(CRAA-adjuvants complex)로서 면역화될 환자에게 투여하면 환자의 능동 면역이 얻어진다. 또한, CRAA-아쥬반트 복합체를 4주 간격으로 2회 이상 연속 추가 항원자극 주사로 투여할 수도 있다. 이 절차 이후, 환자의 혈청은 예방적 촉매성 항체의 존재에 대하여 평가될 수 있다.

본 발명의 방법 및 CRAA는 소정의 표적 항원에 특이적인 촉매성 항체를 자극하기 위한 통상적인 화합물 및 방법에 비하여 현저한 잇점을 제공한다. 따라서, 본 발명의 개시된 화합물 및 방법은 질환 치료에 중요한 임상 시약을 제공한다.

도 1은 기질의 바닥 상태(△G_s) 및 전이 상태(△G_TS)의 안정화에 관여하는 항체 촉매작용의 자유 에너지 다이아그램이다. △G^* _uncat 및 △G^* _cat 는 각각 미촉매 반응 및 촉매 반응의 활성화 에너지에 해당된다. K_m은 바닥 상태 안정화(△G_s) 정도의 함수이다. Kcat/Km은 촉매-기질 바닥 상태 복합체에 상대적인 전이 상태 안정화 정도의 함수이다.

도 2는 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 단백질의 도메인 구조를 나타내는 모식도이다. 리간드, 도메인 III에서 주로 발견되는 리간드 결합 영역, TM(경막 도메인); CY(시스테인 고농도 도메인) 및 SP(시그널 펩티드).

도 3은 항EGFR 촉매성 항체를 제조하기 위하여 제안된 클로닝 전략의 모식도이다.

도 4는 CRAA-EGFR 펩티드 구조를 도시한 것이다.

도 5는 중첩 신장에 의한 Fv 작제를 묘사한 다이아그램이다.

도 6은 세린 프로테아제 반응성 플루오로포스페이트 전이 상태 유사체의 고정화 모식도이다. (a) 트리에틸아민, CH2C12; (b) 물, THF; (c) DAST; (d) 글루타르산 무수물, 피리딘; (e) DCC, DMAP, 트리에틸아민, 플루오레세인.

도 7은 gp120 구조의 모식도이다. V, 가변 영역; PND, 주요 중화 결정인자; 화살표, 본 발명의 방법에 의해 생성된 촉매성 항체가 표적으로 하는 절단 부위.

도 8은 친핵성 세린 잔기와 DFP 반응의 모식도이다.

도 9는 바이오틴(상부 구조)에 접합된 디이소프로필플루오로포스페이트 에스테르에 의한 L쇄 펩티다제 활성의 비가역적 억제를 도시한 막대 그래프이다. 클론 U19(1 μM) 유래의 L쇄를 억제제와 30분 동안 항온처리하였다. 미결합된 억제제는 겔 여과로 제거하였다. 펩티다제 활성은 방사능표지된 VIP 기질과 20 nM L 쇄를 사용하여 측정하였다. 데이터는 억제제 예비처리 없이 겔 여과시킨 L쇄의 활성(약 15,000 cpm)에 상대적인 억제율%로서 나타내었다.

도 10은 본 발명에 사용하기 위하여 고찰된 면역원 구조의 일예를 도시한 것이다. 이 박스는 표적화된 절단 부위(Lys432-Ala433) 주위의 구조를 도시한 것이다. 인접 잔기는 3개의 면역원에서 동일하다. 아미노산 수는 전길이 gp120의 것이다.

도 11은 낭창 환자 유래의 IgG 50 nM(레인 2, 좌측 패널) 및 MRL/lpr 마우스 유래의 L쇄 11nM(레인 2, 우측 패널)과 함께 항온처리된 ¹²⁵I-gp120(100 nM)의 가수분해를 도시한 비환원성 겔의 자동방사능사진이다. 좌측 및 우측 패널에서의 레인 1은 HIV-1 양성 검체 유래의 비촉매성 IgG 및 BALB/c 마우스 유래의 L쇄와 함께 항온처리된 기질의 동등양을 도시한 것이다. 37 ℃에서 2 시간 동안 항온처리한다.

도 12는 DFP(10 μM)의 존재 및 부재하에 낭창 환자의 IgG(50 nM)와 함께 1 시간 동안 항온처리된 ¹²⁵I-gp120의 항체 촉매화된 절단을 도시한 그래프이다. (B) 각종 균주의 ¹²⁵I-gp120을 L쇄 Lay2(1 μM)와 함께 2 시간 동안 항온처리하였다.

도 13은 L쇄 Lay2(20 μM)(레인 2)에 의한 미표지된 gp120(11 μM; SF2, Chiron)의 가수분해를 나타낸 환원성 SDS-겔의 면역블롯이다.

도 14는 세린 프로테아제에 의한 펩티드 결합의 절단 동안 형성된 추정상의 아실-효소 전이 상태의 모식도이다. 아실 효소 복합체(우측 구조)는 공격성 물 분자로 탈아실화하였다.

도 15는 TNFα에 대한 촉매성 항체를 유인하기 위하여 디자인된 예시적 CRAA이다.

도 16은 IL-1β에 대한 촉매성 항체를 유인하기 위하여 디자인된 예시적 CRAA이다.

도 17은 IL1-β에 대한 촉매성 항체를 유인하기 위하여 디자인된 예시적 CRAA이다. 이 CRAA에서 친전자성 반응 중심은 붕소산염 분자를 포함한다.

도 18은 p53 매개의 시그널링에 관여하는 세포 분자의 모식도이다.

도 19a 및 도 19b는 임상적 전망을 나타내는 통상적인 모노클로널 항체가 표적으로 하는 항원 목록을 도시한 것이다. 이러한 항원은 본 발명의 촉매성 항체에 적합한 표적이다.

발명의 상세한 설명

소정의 특이성이 있는 촉매성 항체의 합성을 면역계에 의하여 자극하는 방법을 개시한다. 본 발명의 일 구체예로서, 정선된 펩티드 항원에 대하여 촉매성 항체를 생성하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 또 다른 구체예로서, 암 및 기타 질환의 치료를 위한 수동 면역요법 양식에 유용한 조성물 및 방법을 제공한다. 또한, TNFα 및 ILβ1이 주요 역할을 하는 질환의 치료용 촉매성 항체 역시 본 발명에 사용하기 위하여 고찰하고 있다.

이러한 질환으로는, 허혈 및 재관류 손상, 패혈증, SIRS, 급성 호흡 곤란증, 류마티스양 관절염, 염증성 장 질환, 다발성 경화증 및 향신경성 통증이 있다.

본 발명의 또 다른 구체예로서, 소정의 바이러스 또는 병원성 항원에 대한 촉매적 Ab 생성을 유인하는 예방접종 프로토콜을 개시한다. 개시된 공유 반응성 항원 유사체는 우선적으로 촉매성 항체의 생성을 자극한다. 이러한 항체는 표적 항원에 대한 촉매 작용을 보유하여 항원을 영구적으로 불활성화시키는, 감염에 대한 우수한 보호작용을 제공한다. 또한, 항원에 가역적이며 화학량론적으로 결합하는 비촉매적 Ab와 비교하였을 때 단일 촉매성 Ab 분자는 재사용되어 복수의 항원 분자를 불활성화시킬 수 있다.

TSA에 의한 면역화[1]는 전이 상태에 결합하여 반응의 활성화 에너지 장벽을 저하시킬 수 있는 Ab를 유도하기 위한 수단으로서 제안되었다. 일반적으로 사용되는 포스포네이트 유사체는 사면체형 인 원자 및 이 인에 결합된 음하전을 띤 산소 원자를 포함한다. 펩티드 결합 절단시의 전이 상태의 형성은 절단 부위에 있는 삼각형 탄소 원자의 사면체 상태로의 전환 및 카르보닐 기의 산소에 의한 음하전의 획득을 포함하는 것으로 생각된다. 따라서, 종래의 포스포네이트 TSA는 전이상태의 사면체형 형태 및 옥시음이온 구조에 결합할 수 있는 Ab의 합성을 유도할 수 있다. 하지만, 이들 TSA에 대한 Ab는 비교적 바람직하지 않은 아실 전이 반응을 가속화시킬 수 있는 반면, 펩티드 결합 절단을 효과적으로 촉매할 수 없다. 최근, 포스핀산염 TSA에 대한 항체는 안정한 1차 아미드를 서서히 절단하는 것으로 보고되었다[11]. 항포스핀산염 Ab는 보다 일반적인 항포스포네이트 Ab와 비교하였을 때 절단 용이한 결합에 있는 아미드 질소에 대한 양성자의 우수한 전이를 제공하는 것이 가능하다.

대부분의 효소학자들은 포스포네이트 TSA가 전이 상태 모방체로서 불량하고 다수의 전이 상태가 관여하고 있기 때문에 효과적인 촉매성 Ab를 유인하지 못한다고 주장한다. 효소는 활성화된 아미노산 측쇄를 사용하여 펩티드 결합 절단을 촉매할 수 있다. 예를 들어, Ser 히드록실 기는 Ser, His 및 Asp 잔기의 분자내 수소 결합된 네트웍의 형성으로 인한 공유 촉매 작용을 매개하는 활성 및 향상된 친핵성을 필요로 한다. 포스포네이트 유사체는 친핵성 반응 중심에 결합하는데 필요한 구조 인자를 포함하지 않는다. 따라서, Ab내 공유 촉매작용 활성의 유도는 종래의 포스포네이트 TSA를 사용하여 얻을 수 없다. 또한, 이러한 TSA는 Ab내에 존재하는 생식 세포 계열 암호된 세린 프로테아제 부위를 이용하지 않는다.

촉매성 Ab의 친핵성 세린 잔기와 반응할 수 있는 친전자성 CRAA의 제조 방법도 개시한다. 이 신규 항원 유사체는 항체 라이브러리로부터 촉매를 선택하는데에도 사용될 수 있다. 이 방법은 또한 EGFR과 같은 각 표적 항원에 특이적인 항체를 합성하기 위하여 세린 프로테아제 부위를 이용하는 데도 사용가능하다. 이것은 전술한 친전자성 CRAA로 면역화시 얻어질 수 있다. 이러한 CRAA는 세포 표면에 생식 세포 계열 암호화된 세린 프로테아제 부위를 발현시키는 B 세포의 클론 선택을 촉진한다. 또한, 예컨대 EGFR에 대한 특이성은 공유 반응성 항원 유사체 구조에 인접해 있는 EGFR 유래의 적당한 항원성 에피토프를 병입시켜 얻을 수 있다.

촉매성 Ab 합성에 대해서는 자가면역 질환에서 상세히 보고하고 있다[2,4]. 또한, 면역계는 HIV 단백질 gp120의 절단을 비롯하여 외인성 항원의 절단을 촉매하는 Ab를 생성할 수 있다. 하지만, 바이러스 감염된 환자는 gp120에 대한 촉매성 Ab 반응을 일으키지 않는다. 본 명세서에서 논의하고 있는 HIV CRAA는 HIV에 대한 예방적 촉매성 항체를 합성시키는 면역계를 만든다. 이러한 시도를 지지하는 데이터가 본 명세서에 제시된다. gp120은 다음과 같은 점에서 표적 항원으로서 선택하였다. (a) gp120이 숙주 세포의 생산적 감염을 위한 HIV-1의 필수 구성성분인 점, (b) 바이러스 표면 단백질로서, gp120이 Ab에 쉽게 접근할 수 있는 점, (c) 특정 항-gp120 Ab가 HIV 감염을 저지하는 것으로 확인된 점.

촉매 VL 유전자는 본 발명의 CRAA로 면역화시, HIV 특이적 촉매성 Ab의 합성을 위해 보충될 수 있다. 이 유사체는 친핵성의 생식 세포 계열 암호화된 촉매 부위에 결합하여, 촉매성 Ab를 생성하는 B 세포의 클론 팽창을 우선적으로 자극할 수 있다. 필요한 경우, 포스포네이트 TSA는 CRAA와 결합하여 친핵성 화학적 반응성 외에도 옥시음이온 공동을 포함하는 촉매성 항체를 유도할 수 있다.

CD4 결합에 관여하는 gp120의 모델 B 세포 에피토프(잔기 421-436)를 포함하는 세린 프로테아제 유사 촉매의 주요 구조 인자와 반응성인 CRAA를 합성한다. 당해 기술 분야에 공지된 절차를 사용하여 상기 B 에피토프 및 이의 CRAA로 자가면역 및 비자가면역 마우스를 면역화시킨다. 또한, 이 CRAA에는 T 헬퍼 에피토프를 포함시킬 수도 있다. 친핵성 세린 잔기, 옥시음이온 공동 형성 잔기, 절단용이한 결합의 사면체 기하형태와의 형태 상보성, 및 기질내 인접 잔기의 인식과 같은 세린 프로테아제 촉매작용에 기여하는 것으로 공지된 각각의 구조적 특징은 B 에피토프 잔기가 인접해있는 음하전성 포스포네이트 또는 친전자성 사면체형 포스포네이트 에스테르와 같은 특징을 TSA 중에 병입시키므로써 유도된 항체에 보충된다.

본 발명의 CRAA 및 그 결과 얻어지는 촉매성 항체는 3 이상의 주요 용도에 사용된다. 제1 용도는 특정 질환에 대하여 디자인된 CRAA로 인간이나 동물을 면역화하여 그 검체 중에서 촉매성 항체를 생성하는 것에 관한 것이다. 이와 같이 생성된 촉매성 항체는 그 다음 환자에게 투여되면 표적 항원부를 불활성화시킬 수 있다. 이러한 시나리오에서 환자가 부작용을 나타낸다면 촉매성 항체를 비가역적으로 불활성화시키기 위하여 면역화 CRAA를 투여할 수 있다. 이 구체예의 경우에, CRAA 는 면역원성을 최소화하기 위하여 B 세포 에피토프만으로 합성할 수 있다.

제2 용도로서, 예방적 면역성 상태를 형성시키기 위하여 특정 병리적 상태에 대하여 환자를 능동 면역시키기 위한 목적으로 환자에게 CRAA를 투여할 수 있다. 이 경우 CRAA는 CRAA-아쥬반트 복합체로서 투여될 수 있다.

마지막으로, 본 발명의 CRAA는 자가면역 질환 또는 다발성 골수종과 같은 질환과 관련있는 촉매성 항체를 발현하고 있는 환자에게 투여될 수 있다. 이 CRAA는 존재하는 항체와 특이적으로 반응하도록 디자인할 수 있다. 촉매 기능을 억제하면 질병 상태가 경감되어야만 한다. 즉, 이 CRAA는 최소 면역원성 B 세포 에피토프만을 포함하도록 디자인한다.

이하 기재되는 상세한 설명은 본 발명을 실시하기 위한 바람직한 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 소정 질환의 항원에 대한 촉매성 항체의 생성을 자극하여 CRAA를 선택 및 제조하는 방법, 및 CRAA 또는 촉매성 항체를 생체내 투여하는 방법에 대하여 설명한다.

I. CRAA의 선택 및 제조

본 발명의 공유 반응성 항원 유사체를 통상적인 유기 합성 도식에 따라 제조한다. 본 발명의 신규 CRAA는 CRAA의 목적 용도와 절단에 대해 표적이 되는 특정 펩티드 항원과 관련된 단백질 유래의 펩티드 잔기가 인접한 친전자성 중심을 포함한다.

적합한 인접 아미노산 서열의 선택은 절단의 표적이 된 특정 펩티드 항원에 따라 달라진다. 예를 들어, 바이러스 외피 단백질, 특정 시토킨 및 종양 관련 항원 은 많은 다양한 에피토프를 포함한다. 이들 대부분은 종래의 모노클로널 Ab를 기본으로 하는 방법을 사용하여 지도화하였다. 이러한 정보는 소정의 표적 항원에 대한 촉매 활성이 있는 촉매성 항체의 유도인자 뿐만 아니라 촉매성 항체 억제제로서 유용한 효과적인 공유 반응성 항원 유사체의 디자인을 용이하게 한다.

반응 중심에 인접한 아미노산은 질병에 큰 역할을 하거나 질병시 자가항체를 만드는 소정 폴리펩티드 중의 표적화된 에피토프의 서열을 나타낸다.

CRAA의 구조적 특징은 미성숙 생식 세포 계열 암호화된 항체 뿐만 아니라 표적화된 에피토프를 인식하도록 구체화된 성숙 항체에 대한 특이적인 공유 결합을 할 수 있도록 만든다. 또한, 클론 선택론 주의에 기초하여, 촉매성 항체를 암호화하는 생식 세포 계열 유전자를 보충하도록 CRAA를 만들어 표적 에피토프에 대하여 지향성인 성숙 항체를 합성한다.

표적이 되는 폴리펩티드로는 가용성 리간드 및 이 리간드에 대한 막 결합된 수용체가 있다.

또한, 미생물 단백질도 본 발명의 항체에 의한 촉매작용의 표적이 되기도 한다. 그 예로는, gp120, gp160, Lex1 억제인자, gag, pol, B형 간염 표면 항원, 박테리아 외독소(디프테리아 독소, C.테타니 독소, C.보툴리넘 독소, 백일해 독소)가 있으나, 이것에 국한되는 것은 아니다.

종양 항원 역시 치료용으로 유용한 CRAA에 포함된다. 그 예로는, EGF, TGFα, p53 생성물, 전립선 특이적 항원, 암배아성 항원, 프로락틴, 인간 융모막 고나도트로핀, c-myc, c-fos, c-jun, p-당단백질, 다중약물 내성 관련 단백질, 메탈로 프로테이나제 및 혈관신생 인자가 있으나, 이것에 국한되는 것은 아니다.

종양 항원에 대한 수용체 역시 항체 매개의 촉매작용에 대한 표적이 되기도 한다. 그 예로는, EGFR, EGFR 돌연변이체, HER-2, 프로락틴 수용체 및 스테로이드 수용체가 있다.

염증 매개인자 역시 촉매작용의 표적이다. 이 군에 속하는 분자의 예로는, TNF, IL-1베타, IL-4 뿐만 아니라 이의 동족 수용체도 있다.

기존의 촉매성 항체는 자가면역 질환 및 림프증식성 질환에서 관찰된다. 이러한 촉매성 항체의 유해 작용은 환자에게 CRAA를 투여하므로써 억제된다. VIP, Arg-바소프레신, 티로글로불린, 갑상선 퍼옥시다제, IL-1, IL-2, 인터페론, 프로테이나제-3, 글루타메이트 탈카르복실화제에 대하여 특이성이 있는 항체 서브유닛과 공유 상호작용하는, 약한 면역원성이 되도록 디자인된 CRAA를 투여할 수 있다.

선택성을 최대화하기 위하여, 인접 펩티드 서열에 절단의 표적이 되는 에피토프를 포함시킨다. 예를 들어, 본 발명의 CRAA에는 표피 증식 인자 수용체에 존재하는 에피토프를 포함시킬 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예로서, HIV gp120에 존재하는 에피토프를 CRAA에 포함시킨다. HIV 감염 치료용 CRAA의 일예는 CRAA의 면역원성을 최대화하기 위하여 B 세포 에피토프 및 T 세포 에피토프를 모두 포함한다. 본 명세서에 예시된 기타 CRAA로는 TNF 및 IL-1β에 대한 촉매성 항체를 생성하기에 적합한 것을 포함한다.

II. CRAA의 투여

본 명세서에 예시된 CRAA는 일반적으로 약학 제제로서 환자에게 투여된다. 본 명세서에 사용된 "환자"라는 용어는 인간 또는 동물 검체를 의미한다.

본 발명의 CRAA를 포함하는 약학 제제는 편리하게는 물, 완충 식염수, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 디메틸 설포사이드(DMSO), 오일, 세정제, 현탁화제 또는 이의 적합한 혼합물 등의 적합한 매질과 함께 투여하기 위하여 조제한다. 선택된 매질 중에 존재하는 CRAA의 농도는 CRAA의 기타 성질 뿐만 아니라 매질의 소수성 또는 친수성 성질에 따라 달라진다. 용해도의 한계는 당업자라면 용이하게 결정할 수 있을 것이다.

본 명세서에 사용된, "생물학적 허용성 매질"이라는 용어는 전술한 문단에서 예시하였듯이 약학 제제의 바람직한 투여 경로에 적당한 모든 용매, 분산 매질 등을 포함한다. 이러한 매질의 약학적 활성 물질에 대한 사용은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 지금까지 알려진 모든 매질 또는 제제는 투여되는 CRAA와 비상용성이지만 않다면 본 발명의 약학 제제에 사용될 수 있다.

종래의 면역화 방법은 촉매성 Ab 합성을 유도하는데 사용될 수 있다. 면역원은 3회의 복강내 주사와 1회의 정맥내 주사(각각 펩티드 약 100 ㎍씩)로 투여될 수 있다. 마지막 면역은 정맥내 투여로 실시한다. RIBI는 동물 연구에 사용되는 것이다. 인간용인 경우, 아쥬반트로서 명반을 사용한다. 명반은 인체용으로 승인된 것으로, 본 발명에서 제안된 바와 유사한 B-T 에피토프에 대하여 Ab 합성을 자극하는 것으로 이미 밝혀져 있다. RIBI는 프로인트 완전 아쥬반트의 저독성 대체물로서, 다양한 Ag에 대한 우수한 Ab 반응을 용이하게 재현시킨다. 2가지 아쥬반트에 대한 분석은 백신에 대한 Ab 반응의 질과 정도가 B 상의 아쥬반트에 의해 보충된 시토킨 및 TH 아집단의 효과를 통해 아쥬반트에 의해 영향을 받을 수 있다.

CRAA는 정맥내 주사를 통해 혈류로 비경구 투여되거나, 경피 주사, 근육내 주사 또는 복강내 주사에 의해 비경구 투여될 수 있다. 비경구 주사용 약학 제제는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 분자를 투여하기 위한 방법으로서 비경구 주사를 선택한다면, 충분한 양의 분자가 표적 세포에 도달하여 생물학적 효과를 발휘하도록 단계들을 선택한다.

약학 제제는 투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위하여 투여량 단위 형태로 조제한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 투여량 단위 형태란 치료를 받는 환자에게 적당한 물리적으로 분리된 약학 제제 단위를 의미한다. 각 투여량은 선택된 약학적 담체와 더불어 바람직한 효과를 생성하도록 계산된 활성 성분의 양을 포함해야 한다. 적당한 투여량 단위를 측정하는 절차는 당해 기술 분야에 공지되어 있다.

CRAA를 포함하는 약학 제제는 적당한 간격, 예컨대 병리적 증상이 감소 또는 경감될 때까지 1일 2회씩 투여한 다음, 투여량을 유지 농도로 감소시킬 수 있다. 특정 경우에 적당한 간격은 일반적으로 치료해야 하는 환자의 병원성 상태 및 질환에 따라 달라진다.

III. 촉매성 항체의 투여

본원에 기재된 촉매성 항체는 일반적으로 약학 제제로서 환자에게 투여한다.

본 발명의 촉매성 항체를 포함하는 약학 제제는 물, 완충 염수, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 디메틸 설폭사이드(DMSO), 오일, 세제, 현탁제 또는 이들의 적합한 혼합물과 같은 허용 매질 와 함께 투여할 수 있도록 편리하게 제형화된다. 선택된 매질내 촉매성 항체의 농도는 매질의 소수성 또는 친수성 특성 뿐만 아니라 촉매성 항체의 기타 성질에 의해 좌우된다. 용해도 한계는 당업자에 의해 용이하게 측정될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "생물학적 허용 매질"란 상기 예시한 바와 같이 약학 제제의 바람직한 투여 경로에 적합할 수 있는 모든 용매, 분산매 등을 포함한다. 약학적 활성 물질에 그러한 매질을 사용하는 것은 당해 분야에 공지되어 있다. 임의의 통상의 매질 또는 반응제가 투여되는 촉매성 항체와 비혼화성인 경우를 제외하고, 약학 제제에 그 사용을 고려한다.

본 발명의 촉매성 항체를 투여할 때는 통상의 수동 면역 방법을 이용한다. 바람직한 양태에서는 항체를 환자의 정맥내로 주입한다. 특정 의학적 질환의 치료를 위해서는, 충분한 양의 분자가 그 표적 세포에 도달하여 생물학적 효과를 나타낼 수 있도록 하는 조치들을 취해야 한다. 분자 또는 이들이 전달되는 약학 제제의 친유성은 분자들이 그 표적 부위에 도달할 수 있도록 증가될 수 있어야 한다. 또한, 본 발명의 촉매성 항체는 충분한 수의 분자가 표적 세포에 도달할 수 있도록 세포 표적형 담체에 전달될 수 있어야 한다. 본 발명의 촉매성 항체를 항체 매립 리포좀 내로 캡슐화하는 단계를 포함하는, 치료용 분자의 친수성을 증가시키고 그 분자를 표적화하는 방법은 당해 분야에 알려져 있다.

본 발명의 대상인 촉매성 항체는 항체 단편으로 또는 전체 항체로 사용하거나, 재조합 분자 내로 혼입시키거나 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 담체에 접합시킬 수 있다. 또한, 그러한 단편 또는 전체 항체는 모두 전술한 바와 같이 세포막을 가로질러 상기 항체 또는 단편을 전달할 수 있는 담체에 결합시킬 수 있다. 이 유형의 담체로는 문헌[Cruikshank 등, the Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology, 1997년 3월]에 기재된 것들이 있으나, 이에 국한되지 않는다.

약학 제제는 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 제형으로 제형화한다. 본 명세서에 사용된 투여 단위 제형이란 치료를 받고 있는 환자에게 적합한 약학 제제의 물리적으로 분리된 단위를 말한다. 각 투여량은 선별된 약학 담체와 함께 목적하는 효과를 산출하는 것으로 계산된 활성 성분의 양을 함유하여야 한다. 적합한 투여 단위를 측정하는 절차는 당업자에게 널리 알려져 있다. 예컨대, 인간의 동계 IgG의 반감기는 약 20일이다. 이 기간에 걸쳐서, 60,480개의 Ag 분자는 대사 회전속도(turnover) 2.1/분(파지 디스플레이 라이브러리[14]로부터 분리된 인간 항-VIP L 쇄의 대사 회전속도임)으로 항체 한 분자에 의해 절단된다. 그러므로, 펩티다제 항체는 화학량론적 가역 결합 분자보다 상당히 더 강력한 항원 중화 활성을 발현할 수 있는 것을 알 수 있다. 본원에서 논의한 항체 경쇄는 그 항원 결합 친화도, 항원에 견고하게 결합하지만 최선의 대사 회전속도로 촉매를 선별하지는 못하는 절차에 기초하여 선택된다는 것을 알아야 한다. CRAA에 의한 면역화에 의해 생성되고 적합한 선별 방법으로 분리되는 항체는 본원에 개시하는 바와 같이 상당히 더 큰 대사 회전속도를 나타낸다. 그러한 촉매성 항체를 사용하여 상응하는 비촉매성 항체의 상당히 더 낮은 용량으로 질병을 치료할 수 있다.

촉매성 항체를 포함하는 약학 제제는 약리학적 징후가 감소 또는 경감되어, 그 후에 투여량을 유지 레벨로 감소시킬 수 있을 때까지 적합한 간격으로, 예컨대, 1주에 2회 투여할 수 있다. 특정 경우에 적합한 간격은 통상 환자에게서 치료하고자 하는 상태 및 병원 상태에 의해 좌우된다.

CRAA는 허용 가능한 예방제 또는 치료제에 대한 표준의 기준을 충족시키는 수동 또는 능동 면역요법용으로 촉매성 항체를 생성시키는 것을 선택한다: (1) 촉매성 항체에 의한 표적 펩티드 항원의 절단은 표적 펩티드 항원을 기능적으로 활성화하거나 또는 기능적으로 불활성화함으로써 병리학적 과정에서 유익한 변화를 초래하며; (2) CRAA에 의한 면역화에 의해 상기 촉매성 항체를 투여하거나 체내에 그 항체의 축적을 유도하면, 얻어지는 임상적 이점이 앤디 부작용과 관련된 이환율을 능가하도록 양호한 치료 지수를 산출한다. 그러한 기준이 예방제 또는 치료제의 허용성에 대해 얼마나 잘 정립되어 있는지에 대한 논의는 당해 분야에 통상 존재하는 것으로, 문헌[Guide to Clinical Trials, Bert Spilker, Raven Press, 뉴욕, 1991]과 같은 텍스트에서 확인할 수 있다.

본 발명의 실시에 적합한 예방용 또는 치료용 표적 펩티드 항원의 부류는 시토킨, 성장 인자, 시토킨 및 성장 인자 수용체, 성장 인자 수용체에 의해 개시되는 자극의 전도에 관여하는 단백질, 응고 인자, 인테크린, 항원 수용체, 효소, 특히 세포 프로그램(분화, 증식 및 계획된 세포 사망) 제어에 관여하는 것들과 같은 전사 조절자, 상기 세포 프로그램의 기타 유도자, 항암제, 미생물 및 비루스 펩티드 항원을 방출할 수 있는 세포 펌프 등이 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니다.

특정 표적 분자의 기능을 억제하는 작용을 하는 통상의 모노클론 항체는 생 물공학 및 제약 회사에 의해 임상용으로 개발 중에 있는 가장 통상적인 유형의 치료제에 속한다. 이들 항체 중 일부는 상당한 임상적 전망을 나타내 왔으며, 따라서, 동일한 분자 기능 단위의 일부인 임의의 노출된 펩티드 표적 항원은 본 발명의 대상인 촉매성 항체에 대한 잠재적 표적으로 특히 적합한 것으로 나타났다. 본 발명에서 고려되는 촉매성 항체는 이들이 단 하나에 대해 다수의 표적 분자에게 영향을 끼칠 수 있는 능력으로 인해 및 그 결과 치료비의 급격한 감소로 인해 그러한 통상의 모노클론 항체에 대한 주요한 개선을 달성한다. 상기 표적화된 항원내 펩티드 결합의 이용성은 일정 범위의 펩티드 결합을 절단할 수 있는 촉매성 경쇄 및 단백질 분해 효소에 노출시킨 다음 절단을 입증하는 방법(이에 국한하지 않음)과 같이 당해 분야에 잘 정립되어 있는 방법으로 측정할 수 있다.

임상적 전망 및 상응하는 의학적 징후를 나타내는 통상의 모노클론 항체가 표적으로 하는 항원 중의 일부 목록은 도 19a 및 19b에 도시되어 있다.

따라서, 공유 반응성 항원 유사체를 제공하는 것과 그것을 제조하는 방법이 본 발명의 목적인데, 상기 유사체는 1) 본 발명의 소정의 항원에 특이적인 촉매성 항체의 생성을 자극할 수 있고/있거나, 2) 자동 면역 질병 및 특정 림프 증식성 질환과 관련된 촉매성 항체의 촉매 작용을 비가역적으로 억제할 수 있다. 추가의 목적은 항원 및 그 상응하는 항체의 제조 방법 및 이들 항체를 유익한 치료제로서 사용하는 방법을 제공하는 것에 있다.

실시예 IA

종양 면역 요법용 촉매성 항체

암의 치료에 적합한 촉매성 항체(항체)의 제조 방법을 본 실시예에서 설명한다. 그러한 항체는 표적 항원의 절단이 영구적으로 불활성화되어 버려야 하기를 초래하기 때문에 촉매 기능에 의해 암 치료의 우수한 대체 면역 요법을 제공한다. 또한, 단일 항체 분자는 다수의 항원 분자를 불활성화하는 데 재사용할 수 있다. 이에 비해, 비촉매성 항체는 항원에 화학량론적으로 결합하고, 결합은 가역적이다. 복합체로부터 해리될 때, 항원은 그 생물학적 기능을 회복할 수 있다.

종양 관련 항원인 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 효소 활성을 가진 항체의 생산을 자극하기에 적합한 한 가지 예의 항원의 합성에 이용된다. 펩티다제 항체에 관한 종래의 연구로부터 다음 사항이 밝혀졌다: 1) 특정 항체가 개개의 펩티드 항원에 결합하는 능력을 펩티드 결합 절단 활성화 결부시킬 수 있고; 2) 펩티다제 부위는 비-항체 세린 프로테아제의 활성 부위와 구조적으로 유사하다. 상기 부위는 VL 도메인에 부위하며, 생식 세포 계열 V 도메인 유전자(들)에 의해 암호화되고; 3) 펩티다제 항체의 합성은 자동 면역 질병에서 증가된 레벨로 일어난다.

EGFR은 세포 분화 및 유사 분열에 필수적인 신호의 전도에 중요한 역할을 한다(도 2 참조). 또한, EGFR을 통해 전도되는 신호는 종양 침입성 및 형질전환에 관련되어 왔다. EGF 수용체에 대한 EGF 또는 TGFα의 결합은 수용체 티로신 키나제 및 자가 인산화 활성을 자극한다. 수용체 활성화에 의해 증가된 세포 증식을 초래하는 다단계의 세포내 현상이 유도된다.

EGFR 유전자의 과발현은 선암, 폐의 인상 세포암, 유방암, 결장 부인과 암, 방광암, 신경교종, 간세포암, 췌장암 및 전립선암을 비롯한 다수의 종양과 관련되어 왔다. 일부 종양에서의 과발현은 EGFR 유전자 증폭이 원인인 것으로 생각되어 왔다[15].

EGFR은 정상 조직과 비교하여 종양에서 훨씬 더 높은 레벨로 발현되기 때문에 적합한 종양 항원이다. 결국, EGFR에 대한 항체는 항종양 시약으로 적합한 후보이다. EGFR에 대한 다수의 모노클론 항체(M항체)는 EGFR과의 결합에 대해 서로 경쟁하지 않는 수용체의 특이 에피토프에 대해 형성되어 왔다[예컨대, 16]. Mendelsohn 및 공동 연구자들은 면역원으로서 인간 A431 표피형 암 세포로부터 EGF 수용체 단백질을 사용하여 형성된 마우스 항체를 개시하였다. EGF가 EGFR에 결합하는 것을 억제하는 M항체는 또한 무손상 세포 또는 용해된 막 및 외래 펩티드 기질을 사용하여 분석하는 EGF-자극 티로신 단백질 키나제 활성을 억제하였다. 또한, 상기 M항체는 조직 배양에서 A431 세포의 증식을 억제한 반면에, EGF가 EGFR에 결합하는 것을 차단할 수 없는 M항체는 세포 증식에 미치는 효과가 없었다. 또 다른 연구에서는 항-EGF 수용체 M항체의투여가 무흉선 마우스에서 A431 세포에 의한 종양 형성을 억제할 수 있는 것으로 나타났다. 상이한 아이소타입의 M항체는 마우스에서 종양 증식을 억제하는 것으로 나타났는데, 이는 불변 도메인 효과기 기능이 아마도 관찰된 항증식 활성에는 중요하지 않음을 시사하는 것이다. 충분한 항체 양이 투여되는 경우, 생체내에서의 종양 증식이 완전히 억제다른 것으로 관찰되었다. 지속되는 종양이 EGFR을 계속해서 발현시키는 것은 거의 없었는데, 이는 그 생존이 세포의 항체에의 불충분한 노출로 인한 것임을 암시하는 것이다[17].

면역원으로서 유방암 세포주를 사용하여, Modjtahedi 등[16]은 EGFR에 대해 몇 가지 M항체를 생성시켰는데, 이들 중 일부는 EGFR에 의한 성장 인자의 결합을 차단하였고, 인간의 인상 암세포주의 증식을 억제하였다. 면역원으로서 고레벨의 EGFR을 형질발현하는 정제된 EGF 수용체 또는 세포를 사용하여 여러 가지 추가 EGFR-특이 M항체가 제조되었다[18]. 악성 신경교종[19,20], 머리 및 목의 암과 폐암의 치료에 대한 항-EGFR 항체의 1단계 임상 시험이 진행 중에 있다.

데이터는 EGFR에의 EGF 결합을 차단할 수 있는 항체를 EGFR 발현 종양의 면역 요법에 효과적인 제제의 개발에 이용할 수 있다. EGFR 발현과, 계획된 세포 사망(고사)에서 최우선적으로 중요한 역할을 하는 단백질인 BCL-2의 레벨 사이에는 역 상관 관계가 관찰되었다. 특정 조건 하에 EGFR에 의한 리간드 결합은 c-myc 유도 고사로부터 종양 세포를 보호하는 것으로 나타났다. 돌연변이 EGFR 디스플레이 감소된 고사를 이용하여 신경교아종 세포를 형질감염시켰다[21]. 그러므로, 원칙적으로, EGFR에 대한 항체는 종양 세포에서 고사를 유도할 수도 있다. 이 가능성이 유효하다면, EGFR 항체에 의한 치료 후에 고사 경로를 통해 완전한 종양 회귀 가능성은 강화된다.

EGFR을 절단할 수 있는 항체는 다음과 같은 이유로 그 비촉매성 항체에 비해 우수한 면역 효법제를 포함한다: (a) 적합한 펩티드 결합에서의 EGFR의 절단은 생물학적 활성의 영구적인 상실을 초래하는 반면에, 비촉매성 항체에 의한 EGFR 결합은 가역적일 수 있고, 항체의 분리는 EGFR의 생물학적 기능을 재생시키며; (b) 단일의 촉매 분자는 다중 기질 분자를 절단할 수 있는 반면에, 비촉매성 항체는 화학 량론적으로만 작용할 수 있다.

촉매성 항체의 제조를 위한 3 가지 방법을 본원에 개시한다. 첫 번째 방법은 펩티다제 활성을 가진 클로닝된 항체 경쇄를 이용하는 것이다. 종래의 연구에서는 VL 도메인에 소재하는 비특이적 펩티다제 활성이 VH 도메인의 항원 결합 특이성에 의해 유도될 수 있는 것으로 제안되었다. EGFR 결합 VH 도메인에 연결된 이용 가능한 VL 도메인으로 이루어진 하이브리드 Fv 작제물이 생성된다. 적합한 발현계에서의 합성 및 발현 후에, Fv 작제물은 특이 EGFR 절단 활성에 대해 평가한다.

두 번째의 클로닝 방법은 자동 면역 질병에서 발현되는 특정 항체가 생식 세포 계열 VL 유전자가 암호화하는 세린 프로테아제 촉매 부위를 이용한다는 관찰에 기초한다. 자동 면역 질병 배경을 가진 마우스는 EGFR 발현 세포로 면역화한다. 면역화 후에, 촉매성 Fv 도메인은 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리된다. 생식 세포 계열이 암호화하는 촉매 활성을 EGFR에 대해 체세포적으로 획득되는 특이성과 결합시키는 촉매는 친핵성 세린 잔기와 반응성이 있는 공유 반응성의 항원 유사체(CRAA)에의 결합 이후에 EGFR의 세포외 도메인에의 결합에 의해 선별한다.

세 번째 방법은 면역계가 EGFR에 대한 항체의 합성을 위해 생식 세포 계열이 암호화하는 촉매 부위를 이용하지 않을 수 없다는 가설에 기초한다. 마우스는 촉매성 항체 합성을 우선적으로자극할 수 있는 EGFR 펩티드의 친전자성 CRAA로 면역화한다. 그렇게 생성된 항체 촉매는 당업자에게 알려진 다양한 방법을 사용하여 생체 내에서 EGFR-발현 인간 세포중의 종양 유발성에 미치는 그 억제 효과, 즉 EGF-자극 EGFR 자가 인산화의 억제 및 종양 세포 증식의 억제에 대해 평가한다.

본원에 개시한 조성물 및 방법은 암 면역요법에 적합한 항체를 절단하는 특이적이고 촉매적으로 유효한 EGFR의 제조를 용이하게 한다. 도 3은 수행되는 연구를 요약한 것이다. 종래의 연구에서는 특정 Ag, 즉 VIP, 티로글로불린 및 gp120의 절단을 촉매할 수 있는 항체의 분리의 용이성을 정립하였다. 상기 연구에서 얻어진 정보를 본 발명에 적용하여 EGFR에 대한 촉매성 항체를 제조하는 본원에 개시된 방법을 얻었다.

하기의 재료 및 방법은 본 발명의 실시를 용이하게 위해 제시한 것이다.

재료 및 방법

면역화
6 마리의 MRL/lpr 마우스를 전술한 바와 같은 EGFR 발현 세포로 과면역시켰다. 간략히 언급하면, 약 10⁷개 A431 세포는 조직 배양 플라스크의 트립신화에 의해 회수하고, PBS에 재현탁시키며, RIBI 아쥬반트에서 마우스에게 복강내로 투여하였다. 약 5x10⁶개 세포를 사용한 3회 추가 투여 면역화를 10일 간격으로 수행하였다. 고레벨의 항체 역가에 도달하지 못하면, 표피 성장 인자 수용체의 가용성 세포외 도메인(exEGFR)(25 ㎍)으로 추가 주사액을 투여하였다. 면역계가 촉매성 항체를 생성하도록 하기 위해서는, 6 마리의 MRL/lpr 마우스를 상기 방식에 따라 RIPI 중에서 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)(50 ㎍ 단백질)에 접합된 TSA-EGFR로 복강내 과면역시켰다. 10일 간격으로 후방 안와 혈관총으로부터 혈액을 얻었다.

exEGFR의 발현 및 정제
EGFR의 세포외 도메인(exEGFR, EGFR의 잔기 1~621로 구성됨)을 전술한 바와 같이 바쿨로비루스 발현계로부터 정제하였다[22]. exEGFR의 발현은 Sf9 곤충 세포에서 수행되는데, 이 세포는 배양 상청액으로 exEGFR 약 2 ㎎/㎖를 분비한다[22]. 2 단계의 이온 교환 크로마토그래피 절차에 의해 정제하면. SDS-PAGE로 측정할 때 약 95%의 균질도로 단백질을 회수할 수 있다[22].

EGFR-CRAA 펩티드의 제조 및 정제
CRAA는 3개의 기본 요소로 구성된다: EGFR 잔기 294~303에 의해 N 말단측에 및 EGFR 잔기 304~310에 의해 C 말단측에 인접된 친전자성 포스포네이트 에스테르. 도 4 참조. 친전자성은 인 원자 상에 소재하고, 항체에 존재하는 친핵성 세린 잔기를 포착하기 위한 것이다. 그러한 CRAA의 합성을 위한 기본 합성 반응식은 개시되어 있다[23]. 간략히 언급하면, 리신(EGFR 잔기 303)의 동배체를 보유하는 포스피네이트는 적합한 인접 펩티드 서열에 부착되어 있다. 동배체는 차아인산의 디페닐메틸아민염 및 6-아미노헥산알로부터 제조한 다음, 산내 디페닐메틸기를 제거한다[24]. 필요한 인접 펩티드는 EGFR 잔기 304-310에 상응하는 펩티드가 N 말단 리신 대신에 2-히드록시-6-아미노헥사논산을 보유하는 것을 제외하고는 통상의 고상 펩티드 합성으로 제조한다. 측쇄 보호된 펩티드는 고전적인 용해상 펩티드 합성 방법으로 포스피네이트 구조에 부착시킨다. 포스피네이트 구조는 페놀과의 산화적 커플링에 의해 포스포네이트 페닐 에스테드로 전환된다. 측쇄 보호된 CRAA-EGFR 펩티드의 N 말단은 글루타르알데히드법으로 KLH에 커플링한다. 반응 혼합물은 겔 여과에 의해 분리하고, 저분자량 분획내 잔류 비접합 펩티드는 과염소산으로 완전히 분해한 후에 무기 인에 대해 분석한다. 이는 접합 효율을 측정 가능하게 한다.

exEGFR 및 EGFR-CRAA ELISA
exEGFR 또는 CRAA-EGFR(100 ng/㎖)는 PVC 96 웰 평판 상에 코팅하고, 과량의 단백질 결합 부위는 5% 알부민으로 차단하며, 고정화된 항원에 적절히 희석된 혈청 항체가 결합하는 지를 측정하였다. 반응 정도는 퍼옥시다제에 표지된 염소 항-마우스 IgG로 처리하여 측정하였다. 대조군은 면역전 혈청과 항온처리하고, 과량의 가용성 경쟁인자 exEGFR과 항온처리한 것을 포함한다. 클로닝된 Fv 작제물에 의한 exEGFR 및 CRAA-EGFR 결합을 측정하는 절차는 반응을 퍼옥시다제에 표지된 마우스 항-c-myc 항체(재조합 단백질이 10개 잔기의 c-myc 태그를 보유함) 및 항-마우스 IgG로 처리하여 가시화한 것을 제외하고는 상기한 바와 본질적으로 동일하였다.

Fv 제조
종래의 공개 문헌[10, 14, 25]에 기재된 방법을 특별히 변형시켜 아래에 요약한 바와 같이 적용한다. 도 5 역시 참조. Fv cDNA 라이브러리의 작제는 다음과 같이 행한다: 전체 RNA는 RNase 오염을 최소화하면서 면역화된 마우스의 비장세포로부터 표준 방법으로 제조하였다. VL cDNA(잔기 1~113) 및 VH cDNA(잔기 1~123)의 라이브러리는 역전사 효소 및 적합한 VL 또는 VH 전방 프라이머를 사용하여 RNA 주형으로부터 생성시키는데, 상기 프라이머는 각각 벡터 내로의 클로닝을 위한 SfiI 제한효소 부위 및 펩티드 링커를 암호화하는 안티센스 서열을 보유한다. cDNA는 도 5에 도시한 바와 같이 Taq, dNTP 및 적합한 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 역방 프라이머는 FR1 영역에서 보존된 N-말단 아미노산을 암호화하는 서열에 기초한다. 제한된 축퇴성이 프라이머에 도입되어 밀접하게 관련된 V-유전자 계통군(예컨대, κ군 2, 3, 6)을 증폭시켰다. 6개의 후방 VL 프라이머, 8개의 VH 후방 프라이머, 1개의 VL 전방 프라이머 및 2개의 VH 전방 프라이머가 필요하다. 전방 프라이머는 V 도메인의 3' 말단에 가까운 불변 영역 서열에 어닐링되도록 고안하였다[26]. VH 및 VL 역방 프라이머는 링커를 암호화하는 센스 서열 및 클로닝을 위한 NotI 부위를 보유한다. 링커는 14-잔기의 가요성 펩티드이다. SfiI 및 NotI 부위는 제한 분해 단계에서 라이브러리 다양성의 상실을 최소화하는 드문 절단체이다. PCR의 완료 이후에, 정확한 크기의 증폭된 cDNA 밴드는 아가로스 겔로부터 절단하고, 제네클린 II(BIO 101)를 사용하여 추출한 다음, EtBr 형광(λem 590 ㎚, λex 302 ㎚)에 의해 정량 분석하였다. VL 및 VH cDNA 종은 중첩 연장, 즉 링커 센스 및 안티센스 서열의 어닐링 및 Taq에 의한 두 가닥의 충전에 의해 연결하였다. 개개의 cDNA 종은 연결 반응의 수행 전에 아가로스 겔 전기영동 및 위자드 키트(프로메가)에 의해 정제하였다.

클로닝 및 파지 디스플레이
다음, 라이브러리는 파지미드 벡터 pCANT항체his₆ 내로 클로닝하였다[27]. 상기 벡터는 다음의 서열 요소, 즉 제한 부위, 신호 펩티드, 유전자3 구조 펩티드, 삽입체와 유전자3 사이의 정지 코돈(앰버), c-myc 펩티드 태그, 폴리(his)₆, IPTG-유도성 lac 프로모터 및 암피실린 내성 유전자를 보유한다. 앰버 코돈은 숙주 균주에 따라 파지 표면에 p3-융합 단백질로서 가용성 V 도메인의 분비 또는 그 발현을 일으킨다(HB2151 세포는 정지 신호로 앰버를 인지하고, TG1 세포는 Glu로서 앰버를 인지함). cDNA 및 벡터는 SfiI 및 NotI으로 순차적으로 분해한 다음 T4 DNA 리가제를 사용하여 결찰하였다. 숙주 세포는 전기사출에 의해 형질전환시키고, 클론은 카나마이신 중에서 선별하고, 개개의 콜로니중 삽입체의 존재는 삽입체 상류 및 하류의 벡터에 부위한 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 확인하여 0.7 kb의 EtBr-염색 밴드를 산출하였다. 헬퍼 파지(VCSM13)를 첨가하면 TG1 세포 배양으로부터 파지 입자를 포장할 수 있다. 배양 상청액 중의 입자는 4% PEG로 2회 침전시켜 후술하는 선별 절차에 사용하기 위한 파지를 생성시킨다.

EGFR 결합 Fv의 선별
exEGFR은 PBS 중에 약 5 ㎍/㎖의 농도로 폴리스티렌 평판 상에 코팅하였다. 비결합 단백질의 제거 및 비특이적 단백질 결합 부위의 포화 후에, 평판을 파지 제제물과 항온 배양하였다. 비결합 파지는 광범위 세척에 의해 제거하고, 결합된 파지 입자는 pH 3.0의 완충제를 사용하여 용출시켰다.

촉매성 VL 도메인 및 하이브리드 Fv 라이브러리
하이브리드 Fv 라이브러리는 비면역화된 마우스로부터 분리한 촉매 활성을 보유하는 것으로 이미 정립된 VL 도메인(클론 U24[15])을 EGFR-결합 Fv 라이브러리로부터의 VH 도메인에 결합시켜서 제조하였다. VL 도메인 cDNA는 전방 프라이머가 벡터 내로의 직접 클로닝용 NotI 부위를 보유하는 것을 제외하고는 상기와 같이 PCR로 재증폭시켰다. VH 도메인은 전방 프라이머가 링커 안티센스 서열을 보유하는 것을 제외하고는 상기한 VH 프라이머를 사용하여 EGFR 결합 Fv cDNA 라이브러리로부터 재증폭시켰다. VL/VH 연결체는 상기한 바와 같다.

가용성 Fv 발현 및 정제
선택된 클론에서 얻은 파지미드 DNA는 HB2151 세포에서 증식시켰다. 세포형질 추출물은 재조합 단백질을 2~10 ㎎/ℓ을 함유하였다. 크로마토그래피는 Ni-세파로스(퀴아젠) 상에서 수행하였다. 비결합 단백질은 0.5 M NaCl 완충액으로 제거하였다. 재조합 항체는 pH 5에서 또는 이미다졸로 용출시켰다. 제2 라운드의 금속 친화도 크로마토그래피는 순수한 재조합 단백질을 제공하는데, 이는 SDS-전기영동, 등전점 전기이동, 모노-Q 크로마토그래피 및 N-말단 아미노산 서열 분석법으로 평가하였다. 정제된 단백질의 각 회분은 겔 여과(슈퍼로스 12 칼럼)으로 및 고정화된 항-c-myc 항체[14]로 면역침전시켜 분석하여 촉매 활성이 항체 단편에 속하는지를 확인하였다. 크로마토그래피 절차는 구배 FPLC 시스템을 사용하여 수행하였다. 아미노산 서열 결정은 네브라스카 대학교 메디컬 센터의 단백질 구조 핵 설비에 의해 전기영동 겔의 블롯을 사용하여 수행하였다.

촉매 선별 시약
친핵성 세린 잔기와 공유 반응할 수 있는 두 화합물을 제조하였다. 첫 번째 화합물인 플루오로포스페이트(FP) 이중 작용성 시약은 종래의 연구에서 항체의 촉매 활성을 억제하는 것으로 나타난 세린 프로테아제 억제제 DFP와 유사하다. 물에서의 DFP의 불량한 안정성으로 인해, 파지 흡착용 고체 지지체에의 그 직접적인 부착은 비실용적이다. 비오틴 유사 친화도 태그에 접합된 FP기를 함유하는 이중 작용성 시약을 이용하는데, 이는 아비딘 코팅된 고형 상에 접합체를 고정화시킨다. FP 에스테르는 N-히드록시숙신이미드(NHS-LC 비오틴 II, 피어스 케미컬 캄파니 (1), 도 6)로 활성화시킨 비오틴과 반응시키는데, 이 비오틴은 또한 긴 스페이서를 도입하여 입체 간섭 효과를 최소화한다. 합성은 포스페이트 디에스테르 (2)를 NHS-LC 비오틴 II(1)로 에스테르화하여 진행한다. 화합물 2는 디클로로이소프로필 포스페이트로 4-트리이소프로필실릴옥시-2-부탄올을 인산화한 다음, 가수분해하고 모노클로로포스페이트 중간체를 탈보호시켜 얻는다. 플루오로포스페이트(3)로의 전환은 최종 단계에서 디에틸아미노설퍼릴 트리플루오라이드(DAST)로처리하여 수행한다. 시약 3은 디옥산 또는 기타 유기 용매 중에서 유지하여 가능한 자가 반응성을 완화시킨다. 유기 용액의 분취물을 파지를 함유하는 수용액으로 이전하여 유효 농도 0.1 내지 0.5 mM의 시약 3을 얻었다. 시약 3의 화학적 자가 반응성이 실제 이용에 있어 너무 심각한 상황에서는 비오틴의 대체제로서 플루오레세인 태그를 고려하였다. 플루오레세인은 플루오로포스페이트와 혼화성이어야 하는 카르복실 에스테르 및 페놀 OH를 보유한다. 플루오레세인은 포스페이트 유도체 4(화합물 2를 글루타르 무수물로 처리하여 얻을 수 있음)로 아실화하여 그 아닐린기에의 아미드 연결체를 형성한다. 화합물 5를 얻기 위한 인의 플루오르화는 DAST로 처리하여 얻는다. 도 6 참조.

펩티드 알데히드 매트릭스는 또한 세린 프로테아제 부위를 포착하는 수단으로서 제조된다. 시판되는 아르기닌 함유 리간드 안티페인 (N-[N-카르보닐-Arg-Val-Arg-al]-Phe)는 카르보디이미드로 활성화하고, Phe 잔기의 카르복실기를 통해 AH-세파로스 4B(파마시아)의 아미노 잔기에 공유적으로 연결한다. 합성 방법은 통상적이며, 파마시아에 의해 상세히 설명되어 있다.

촉매성 Fv 선별
Fv 파지 라이브러리는 상기 고정화된 세린 프로테아제 포착 시약을 통과시킨다. 비결합 파지는 광범위한 세척에 의해 제거한다. 결합된 파지의 용출은 0.1M 글리신-HCl(pH 2.2)로 수행하는데, 이 용출제는 비오틴-아비딘 및 플루오레세인-항플루오레세인 상호작용을 파괴하기에 충분하다. 용출은 또한 0.1~1M 히드록실아민을 사용하여 수행하여 포스페이트-세린 연결을 분리할 수 있다. 펩티드 알데히드 매트릭스의 용출은 약산 완충제(pH4.5)로 수행하는데, 이는 헤미아세탈 부가물을 분해시키는 경향이 있다. 세린 프로테아제 결합 매트릭스로부터 회수된 파지 입자는 TG1 세포에서의 증식에 의해 증폭된 다음, EGFR 결합 Fv의 선별에 대해 전술한 고정화된 exEGFR에의 결합에 대해 선별하였다.

촉매 활성에 대한 스크리닝
Fv 단편은 exEGFR, CRAA-EGFR 펩티드 및 비특이적 펩티다제 기질, Pro-Phe-Arg-메틸쿠마린아미드(MCA)의 절단에 대해 스크리닝하였다. 그 금속 결합능에 기초하여 다수의 항체 클론을 신속 정제하기 위한 프로토콜이 개발되었다. 박테리아 상청액을 니트로셀룰로스 필터가 장착된 96-웰 평판에서 Ni-세파로스와 항온처리하고, 비결합 재료는 중성 pH 완충제로 세척하여 제거하며, 결합된 V 도메인은 pH 5의 완충제를 사용하여 캐치 평판 내로 용출시켰다. 밀리포어 멀티스크린 장치는 신속 처리를 가능하게 한다. 용출물을 중화시키고, Pro-Phe-Arg-MCA(500 μM), [¹²⁵I]exEGFR 또는 [¹²⁵I]EGFR(tyr, 294-310)(약 30,000 cpm)을 첨가하였다. 평판 판독기(λex 360 ㎚, λem 470 ㎚; 아미노메틸쿠마린과의 아미드 결합 연결의 절단에 의해 형광성이 증가됨)를 사용하여 펩티드-MCA 기질의 가수분해를 측정하였다. 펩티드-MCA 기질은 시판된다. EGFR(tyr, 294-310)은 ¹²⁵I로 방사성 표지할 수 있도록 N 말단에 부위시킨 티로신 잔기를 가진 EGFR의 잔기 294-310에 상응하는 19개 잔기의 합성 펩티드이다. 유리 ¹²⁵I의 제거는 1회용 겔 여과 칼럼 상에서 또는 역상 HPLC 칼럼 상에서 각각 이루어진다. exEGFR 절단은 PHAST 시스템(파마시아)을 사용하는 비환원성 SDS-전기영동(4~15% 겔)을 실시한 다음, 코닥 XAR 필름을 사용한 자동 방사선 사진 분석 및 프로그램 이미지를 사용한 정량적 스캐닝에 의해 측정하였다. 반응은 105 kD 밴드의 고갈 및 보다 작은 방사성 단편의 출현으로서 확인하였다. X 선 필름의 선형 반응 범위내에 있는 밴드를 정량 분석하는 데에만 주의를 기울여야 한다. 10% 트리클로로아세트산에서 가용성으로 되는 방사성을 측정하여 [¹²⁵I]EGFR(tyr, 294-310)의 절단을 측정하였다. TCA 침전 절차는 VIP 절단을 측정하기 위한 종래의 절차와 유사하였다[3]. 이 방법은 C-18 칼럼 상에서의 RP-HPLC와 비교하여 확인하였다. 난점에 직면하게 되면, 25% PAGE 겔 상에서의 전기영동을 수행하여 VIP에 대해 전술한 대로 무손상 펩티드와그 단편을 식별하였다[28]. 대조군은 cDNA 삽입체 또는 비촉매성 Fv를 암호화하는 cDNA가 없는 벡터를 사용하여 형질전환시킨 박테리아로부터 얻은 용출물이다. 문헌[25]에 기재된 항-c-myc 항체를 사용한 도트-블로팅에 의해 재조합 단백질을 정량 분석할 수 있다.

EGF 결합 억제에 대한 스크리닝
선택된 클론을 종래 공개된 방법[15, 18]을 사용하여 96 웰 평판에서 ¹²⁵I-표지된 EGF가 A431 세포에 결합하는 효과에 대해 스크리닝하였다. 세포(1 x 10⁵ 세포/웰)를 웰에 도말하고 고상의 ¹²⁵I 표지된 EGF(아머샴)에 부착시키고, Fv 용액을 첨가하며(약 1nM), 반응 혼합물을 60분 동안 항온배양하고, 웰을 얼음이 결합된 완충제에서3회 세척한 다음, 웰을 결합된 ¹²⁵I-표지된 EGFR에 대해 계수하였다. 대조군은 Fv의 부재 하에 및 과량의 경쟁인자 exEGFR의 존재 하에 수행된 결합 분석물을 포함한다.

촉매성의 평가

면역 블로팅 절단 분석을 수행하여 절단 반응이 exEGFR의 방사성 표지화와 관련된 구조물로 인한 것이 아님을 확인하였다. 약 1 ㎍의 정제된 exEGFR을 적절한 시간 동안 촉매로처리한 다음, SDS-PAGE로 처리하였다. 겔을 니트로셀룰로스 상에 블로팅하고, 폴리클론 토끼 항-exEGFR로 염색한 다음, 항-토끼 IgG-퍼옥시다제로 염색하였다. 면역 염색성 무손상 exEGFR의 고갈 및 면역 염색성 exEGFR 단편의 출현은 exEGFR 절단을 나타낸다.

반응속도론
증가량의 비표지된 exEGFR과 혼합된 방사성 표지된 exEGFR의 항체-촉매화된 가수분해된 대한 초기 속도는 SDS-전기영동 및 자동 방사선 사진 분석법으로 나타나는 밴드 강도에 기초하여 계산하였다. exEGFR 절단 속도는 무손상 기질 밴드의 강도로부터 측정하고, 개개 반응의 속도는 각 생성물 밴드의 강도로부터 측정하였다. 반응속도 상수(K_m, k_cat)는 미카엘리스-멘텐 식{v=(V_maxㆍ[S])/K_m+[S])}에 부합되는 속도 데이터로부터 계산하였다. 반응속도 연구는 기질로서 단일의 펩티드 결합만이 절단된 펩티드인 합성 exEGFR 펩티드를 사용하여 수행하였다. 그러한 기질의 사용으로 다수의 동시 반응과 관련된 복잡성이 제거된다. 그러한 기질의 가수분해의 반응 속도는 역상 HPLC를 이용하여 생성물을 분리하는 것을 제외하고는, 전술한 바와 동일하게 측정하였다. 정량 분석은 214 ㎚에서 관찰된 생성물 피크 아래의 면적을 측정하여 수행하였다.

절단 부위
항체에 의해 절단되는 펩티드 결합을 확인하기 위해, 전기 영동적으로 순수한 exEGFR을 생성 단편 약 100 pmole을 생성시키기에 충분한 기간 동안 촉매와 항온 처리하고, 단편들을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리한 다음, PVDF막 상에 블로팅하고, 고정된 단백질을 UNMC 단백질 구조 핵 설비에서 N-말단 에드먼 분해에 의해 서열 분석하였다. 대조군은 불활성 Fv로 항온처리한 exEGFR 및 Fv가 없이 항온처리한 exEGFR을 포함한다. 각 단편의 5개 이상의 N-말단 잔기를 확인하여 절단 부위를 명백하게 할당할 수 있도록 확인하였다. 필요에 따라, 즉 N-말단이 차단되는 경우는 트립신 분해 지도화 및 생성 단편을 확인하기 위한 F항체-질량 분광 분석법을 고려하였다.

기질 특이성
exEGFR과 함께 다음 기질의 절단을 시험하였다: (a) ¹²⁵I-라이소자임; (b) ¹²⁵I-티로글로불린; (c) ¹²⁵I-IgG; (d) ¹²⁵I-VIP; 및 (e) 다양한 펩티드-MCA 접합체. 상기 기질의 가수분해를 분석하기 위한 프로토콜이 적당하다. 혈청으로부터 얻은 정제된 인간 티로글로불린, 암탉 라이소자임(시그마) 및 인간 IgG를 클로르아민-T 방법으로 ¹²⁵I-로 표지하고, 겔 여과에 의해 정제한다[2, 4]. 방사성 표지된 단백질을 항체와 항온 처리한 다음, 반응 혼합물을 전기영동하였다. 자동 방사선 분석법에 의해 생성물을 보다 작은 크기의 밴드(무손상 티로글로불린 (단량체), 라이소자임 및 IgG: 각각 330 kd, 15 kD 및 150 kD)로서 시각적으로 확인하였다. VIP 절단은 TCA에서 가용성으로 되는 방사능의 양으로서 또는 RP-HPLC 분리에 의해 측정하였다[2]. 하전된 아미노산(Arg, Lys, Asp), 무하전된 아미노산(Leu, Ala) 및 부피가 큰 아미노산(Phe)에 연결된 MCA를 함유하는 기질의 절단을 형광 분석으로 측정하였다.

EGFR 펩티드의 공유 반응성 항원 유사체로 면역화된 마우스로부터 특이적 EGFR 절단 촉매의 분리

전술한 바와 같이, 촉매성 항체 합성은 자가면역 질환에서 증가한다. 고 효율의 촉매를 유도하기 위해서, 면역계는 EGFR 펩티드의 공유 반응성 항원 유사체인 CRAA로 면역화시켜 추가로 항원투여한다(CRAA-EGFR). 이 항원 유사체는, EGFR 특이적 촉매 항체의 합성을 위해 생식 세포 계열 V 유전자가 암호화하는 부위의 회복을 증가시키도록 고안된다. 또한, CRAA-EGFR은 신체 수단, 즉 V/D/J 재배열 및 체강 초돌연변이로 형성된 임의의 세린 프로테아제 유사 촉매 부위에 대해 선별한다.

CRAA-EGFR의 주요 구조적 특징은, (a) 촉매성 항체에서 친핵성 세린 잔기를 결합시킬 수 있는 4면체 친전자성 인 원자; 및 (b) 염기성 잔기의 C 말단 측면에 있는 절단을 위해 특정화시킨 촉매적 부위를 결합시킬 수 있는 인 원자의 N-말단 측면에서의 리신 잔기; 및 (c) EGFR의 잔기 294-310의 서열에 상응하는, CRAA 구조의 N 말단 및 C 말단상의 각각 10개 및 7개의 아미노산이다.

인 원자는 EGFR 중 잔기 303 및 304에 결합한 절단 용이한 펩티드 결합 탄소 원자의 유사체로서 작용한다. 도 4에 도시된 바와 같은 페닐에스테르 구조에서, 절단 용이한 결합 탄소 원자가 친핵성 세린 잔기와 반응하는데 필요한 부분적 양전하를 보유하는 것과 같이 인 원자는 부분적 양전하를 획득한다. 펩티드 O-페닐포스포네이트는 활성 부위 세린 잔기의 산소 원자와 공유 결합을 형성함으로써 각종 세린 프로테아제를 비가역적으로 불활성화시킬 수 있는 것으로 이미 문헌에 개시되어 있 다[29]. Sampson 및 Bartlett[23]는 인 원자에서 페닐 에스테르를 만들고 포스포네이트 에스테르에 인접하여 펩티드 서열을 결합시키는 화학적 합성 프로토콜을 설정하였다.

전술한 CRAA-EGFR은 에스테라제 항체를 상승시키기 위해서 적용한 기존의 포스포네이트 TSA와 다르다[13]. 종래의 포스포네이트 TSA는 인에 부착된 음이온 산소를 포함하여, 촉매에서 발견되는 산소 음이온 홀을 결합시킬 수 있다. 그러나, 포스포네이트 TSA는 촉매 부위에서 친핵성 세린 잔기와 반응하지 않는다.

염기성 잔기는 항체 중 생식 세포 계열이 암호화하는 염기성 잔기 특이적 촉매 부위의 존재를 이용하기 위해서 CRAA-EGFR의 P1 부위에서 도입한다. 포스포네이트 페닐에스테르 구조와 함께 염기성 잔기의 존재는 촉매 부위에 대한 단단한 결합을 촉진하여, CRAA-EGFR이 촉매 부위를 합성하는 B 세포의 클론 증식을 선택적으로 자극하는 능력을 촉진한다.

EGFR 잔기 294-310을 CRAA-EGFR에 도입하여 비특이적 촉매 활성과 대립되는 것으로서 EGFR-특이적 촉매 활성을 갖는 항체의 합성을 촉진한다. 이 에피토프는 EGFR의 도메인 III의 성분이기 때문에 선택되는데, EGF 결합 부위를 구성하는 잔기의 주요 기여자이다[30]. 도 4 참조. 또한, 이 서열의 N 말단 영역에서의 삽입 돌연변이 유발은 EGF 결합을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 전술한 바와 같이, EGF 결합 부위는 비인접 잔기로 구성된다. 따라서, 부위 303-304에서의 목적하는 절단에 의해 유발되는 형태 파괴는 간접적으로 EGFR의 기능을 손상시킬 수 있다.

Fv 파지 디스플레이 라이브러리는 CRAA-EGFR로 초면역화시킨 MRL/lpr 마우스로부터 제조한다. CRAA-EGFR을 결합시킬 수 있는 고 친화성 혈청 항체의 존재를 ELISA로 측정하여, 마우스가 격렬한 항체 반응을 나타냄을 확인한다. Fv 라이브러리 제조 및 선별은 전술한 바와 거의 같지만[25], 단 파지의 선별은 고정된 CRAA-EGFR을 사용하여 수행한다. 촉매 활성에 대한 스크리닝은 전술한 바와 같이 수행한다. 기질은 N 말단에 티로신 잔기를 함유하는 18개의 잔기 펩티드와 그 뒤에 EGFR의 부위 294-310에 상응하는 17개 잔기이다. 티로신 잔기는 목적하는 절단 부위와 멀리 떨어져 있어 Fv 인식에 대한 간섭을 최소화한다. 또한, EGFR 외부 절단에 대한 스크리닝은 기능 EGFR 단백질에서 제시된 바와 같이 잔기 294-310의 구조 에피토프를 사용하여 수행한다.

CRAA-EGFR에 대한 촉매의 결합 친화도는 ELISA로 측정한다. CRAA-EGFR의 농도를 증가시켜 EGFR(294-310) 절단의 억제를 측정한다. CRAA-EGFR은 경쟁적인 별개 기질로서 작용하며, 이의 Ki 값은 결합 분석으로부터 추정된 Kd 값과 유사하다.

EGFR(294-310) 및 EGFR 외부의 절단으로 형성된 생성물 단편을 확인하여, 절단 부위(들)를 추론한다. 촉매 활성의 회복이 CRAA-EGFR에서 페닐포스포네이트 에스테르 구조로 인해 주로 발생하는 경우, 양 기질은 펩티드 결합 연결 잔기 303 및 304(Lys-Lys 결합)에서 주로 절단된다. 전술한 바와 같이, 항원 특이적 촉매는 바닥 상태의 항원으로 면역화시켜 합성할 수 있다. 따라서, 303-304 결합 외에 펩티드 결합에서 EGFR(294-310)을 절단할 수 있는 촉매도 확인해야 한다. 절단에 대한 가능한 표적은, 면역전 레퍼토리에 존재하는 생식 세포 계열 암호화된 활성이 염기성 잔기를 인식하는 바와 같이, Arg300-Lys301 결합에서 발견된다.

전술한 방법은 잔기 303-304에서 EGFR을 인식하고 절단하여, EGF 결합 활성의 상실을 유도하는 일련의 고 친화도, 고 대사회전 촉매 항체를 제공한다. 면역원에서 EGFR 잔기 294-310을 포함하면 EGFR에 대한 고 친화도 항체를 회복할 수 있다. 페닐포스포네이트 에스테르 구조를 포함하면 구조적으로 최적화된 세린 프로테아제 촉매 부위를 갖는 항체의 클론 선별을 유도한다. 따라서, MRL/lpr 마우스에서 형성된 것보다 우수한 촉매를 본원에 요약한 EGFR-CRAA 방법을 수행하여 합성한다.

생체내에서 생분포(biodistribution) 및 항종양 효과

생체내에서 생분포 및 성장 효과를 평가하기 위해서, 인간 종양을 보유한 무흉선 마우스를, 각종 약물, 독소 및 항체의 항 종양 효과 및 종양 국소화를 연구하기 위한 모델로서 사용하였다.

종양 보유 마우스에서 비촉매적 Fv 작제물과 함께 6가지의 가장 유망한 촉매 Fv 작제물의 생분포를 비교한다. 표적 항원에 결합하여 절단하는 ¹²⁵I-방사능표지된 Fv 작제물의 능력을 예비 연구에서 입증한다. Fv 작제물의 조직 대 혈액의 비율과 종양 대 혈액 비율을 계산한다. 영상화 연구를 수행하여 Fv 제제의 종양 특이성을 추가로 평가한다. Fv 작제물의 촉매적 기능이 존재하면 종양 세포의 표면으로부터의 해리 증가를 유도하는데, 그 이유는 표적 항원의 생성물 단편이 온전한 항원에 비하여 약하게 촉매와 결합하기 때문이다. 그 결과, 비촉매적 Fv와 비교하여 종양:혈액 비율이 낮다. 한편, Fv의 종양 세포내로의 내면화 속도가 매우 빠른 경우, 촉매적 기능은 Fv의 생분포 패턴에 영향을 미치지 않는다. 종양 절편의 자가방사선 사진으로 Fv 작제물이 종양 세포내로 내면화되는 정도를 측정한다.

비촉매적 Fv 및 비관련 FV와 함께 바람직한 생분포 프로필을 갖는 표적 항원 절단 촉매를, 무흉선 마우스내 종양 세포의 증식을 억제하는 능력에 대해 평가한다. 종양이 형성되는 시간(잠복기), 종양을 형성하는 마우스의 수 및 종양 크기를 기록한다. 종양 증식은 세포 증식 및 세포 사멸의 상대 속도로 결정한다. 세포 사멸에 있어서 고사 및 괴사는 다른 과정이다. EGFR은 고사적 세포 사멸의 중요한 조절 인자로 생각된다. 촉매적 Fv 작제물을 이용한 처리 결과 종양을 완전히 퇴화시킬 수 있는데, 그 이유는 세포에는 EGFR에 의한 고사의 음성 조절이 없기 때문이다. 동물로부터 회수한 종양의 항냉 절편을, 증식 및 고사의 마커, 즉 ki-67, bcl2 및 bax에 대해 면역조직학적 방법으로 검사한다. ki-67은 세포 주기를 통해 존재하는 증식 관련 항원이며, 종양 세포군의 증식 분획 부분을 평가하는데 있어서 믿을 만한 마커이다. bcl-2 및 bax 마커는 세포가 고사를 통해서 사멸을 진행하도록 예정되었는지 여부를 평가하는 것을 보조한다.

요약하면, 본 발명의 촉매성 항체는 신생물 형성 질병의 치료에 대한 유용한 치료 시약을 제공한다.

실시예 IB

조합된 화학치료 프로토콜에서 촉매성 항체 및 안티센스 p53의 투여

세포의 게놈이 손상되었을 때, 세포가 스스로 복원을 시도할 것인지 또는 계획된 세포 사멸을 진행할 것인지를 결정하는 세포내 적절한 메카니즘이 있다. 증식 세포가 효과적으로 게놈 복원을 진행하기 위해서, 주기를 이탈해야 한다. 이는, 증식 세포가 딸세포로 되기 보다는 게놈 손상을 복원할 시간을 허여하는 소위 말하는 "세포 주기 검사점"으로 달성된다.

도 18은 게놈 손상에 대한 2가지 가능한 세포의 반응 중 하나 또는 다른 하나를 유도하는데 있어서 보통(야생형) p53의 중추적 역할을 도시한 것이다. 게놈이 손상되면 p53의 발현이 증가되고, 따라서 손상에 대한 특이적 세포 반응을 산출하는 각종 기타 사건을 일으킨다.

이들 관계를 기초로, 세포막을 통해서 항체 또는 항체 단편을 얻는데 제공되는 방법과 함께 사용되고 본 발명에 따라 제조된 p53 올리고뉴클레오티드 또는 p53 촉매성 항체와 같은 p53 기능을 억제하는 일부 제제는, 사건이 자연발생적인지에 따라 계획된 세포 사멸을 차단하고 세포주기 검사점의 활성화를 방지할 것임을 합리적으로 예측할 수 있다. p53의 상류 또는 하류에서 작용하는 억제제를 사용하여 이들 세포 반응을 차단하고자 하는 시도는 관련된 인자의 다양성 때문에 문제가 있다. 도 18.

이들 중요한 사실로부터 p53 올리고뉴클레오티드 및 촉매성 항체를 제안된 치료 용도로 이용하여 암, 허혈성 재관류 손상 및 패혈성 쇼크/SIRS를 치료할 수 있다는 과학적 근거를 설정하였다.

세포 메카니즘의 설명

세포 분열 과정에서, 3가지 기본적인 과정이 조화되어 임의의 관련 착오를 복원한다. 3가지 기본 과정으로는 (1) 중심체가 복제된 다음 분리되어야 한다; (2) 유사 분열 방추가 형성되고, 염색체에 결합되어, 후기에서 신장 및 자매 염색 분체 분리를 준비한다; (3) DNA는 복제되고 염색체는 응축된 다음 세포의 대향면으로 유 사 분열 방추가 분리되어, 곧 딸세포가 된다.

천연 프로세스 과정에서 초래된 임의의 손상을 비롯하여 게놈에 대한 가능한 손상 또는 임의의 손상을 검출하는 경우, 검사점으로 세포 분열을 중단하는 감독 시스템이 적절하다. Hartwell 및 Weinhert는 다음과 같이 세포 주기 검사점을 조작 측면에서 규정한다: 세포 주기 사건 B의 발생이 그 이전의 세포 주기 사건 A의 완료에 좌우되는 경우, 그 의존성을 경감시키는 기능 상실 돌연변이를 발견할 수 있다면 그 의존성은 검사점으로 인한 것이다.

이 조작상의 정의는 효모 세포의 연구에서 활발히 입증되어 3가지 검사점, 즉 DNA 손상, 방추 및 방추 극체(중심체와 동일) 검사점에 대해 설명되어 있다. DNA 손상 검사점은 손상이 검출되는 경우 세포 주기의 3가지 상이한 부위에서 작용하여 증식을 정지시킨다. 그 3가지 검사점은 G1/S 및 G2/M 전이점과, S기를 통해 진행을 모니터하는 또 다른 검사점이다. 유전자 연구 결과 효모에서 다수의 검사점 성분을 확인하였지만, 관련 단백질은 기능적으로 다형질발현성인 것으로 판명되어 원인 및 결과 관계를 간단히 입증하기가 어렵다. 예컨대 Paulovich 등(1997)이 지적한 바와 같이, DNA 손상 검사점에 필요한 유전자는 DNA 복원, 계획된 세포 사멸 및 전사 조절에 관련되어 있다. 효모 연구 결과로부터 상동성 성분이 발견되는 포유류 세포에 대해서도 추정하였다(Hartwell 등, 1994).

하나의 검사점에서 세포 주기 정지에 필요한 다수의 유전자는 상이한 2 과정 중 하나 또는 2 과정 모두에서 필요하다. 예를 들어, p53은 모두 3가지 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다(Cross 등, 1995; Fukasawa 등, 1996; Levine 1997). DNA 손상에 반응하여 G1/S 전이에서 세포 주기 정지를 유발하는데 있어서 p53이 중요한 역할을 당담한다는 것은 Kastan 및 그의 동료(1991)가 처음 입증하였으며, 그 이후 널리 조사되었다. Kastan의 그룹은 야생형 p53(엑손 5 내지 9를 서열 결정하여 정상으로 확인되었음)을 발현하는 것으로 보이는 인간 ML-1 골수아세포 백혈병 세포주를 검사하였다. 정상 세포에서 그러한 바와 같이, 이들 백혈병 세포를 비치사량의 γ-조사 또는 액티노마이신 D로 처리하면 G1/S 및 G2/M 정지를 유발하였다. ML-1 세포에서, G1/S 정지는 세포 주기 정지를 진행하는 p53 레벨에서 일시적인 3∼5배 증가와 관련이 있다. 카페인 처리는 p53 발현 유도 및 G1/S 세포 주기 정지를 차단하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 p53이 DNA 손상에 반응하여 G1/S 정지에 있어 중요한 역할을 함을 제시하는 것이다. 이러한 가설을 뒷받침해 주듯, 야생형 p53이 결핍된 세포는 γ-조사후에 G1/S 정지를 나타내지 않았다.

후속 연구에서, Kastan 그룹은 고체 종양 세포주를 사용하여 이들의 가설을 강화하였다(Kuerbitz 등, 1992). p53 발현이 결핍된 암세포주에서 유도성 프로모터의 제어하에 야생형 p53 발현을 도입하면, 세포가 γ-조사후에 G1/S 세포 주기 정지를 진행하게 된다. 또한, DNA 가닥 파괴를 유발하는 제제는 p53 및 주기 정지를 유도하지만, DNA 내로 단순히 혼입되는 항대사제와 같은 제제는 그렇지 않다는 것을 추가로 발견하였다(Nelson & Kastan 1994).

Kastan의 그룹 및 기타 연구진들의 연구 결과, 의학적으로 중요한 제제군은 DNA 가닥 파괴를 유발하여 p53 의존성 과정의 활성화를 초래하는 반응성 산소 종(ROS)을 유발할 수 있음을 명백히 하였다. 이들 제제는 각종 항암 치료제, 예컨 대 이온화 방사선 조사 및 독소루비신과 산화질소를 비롯한 천연 매개체를 포함한다.

무력한 p53 유전자를 갖는 마우스로부터 취한 세포에 대한, 일부 항암 화학치료제를 비롯한 유사 분열 방추 억제제의 효과를 연구하였다. 처리 후에, 염색체 분리를 종결하지 않고 다회의 DNA 합성 라운드를 진행한 결과로서 세포는 4배수체 또는 8배수체가 되었다. 대조적으로, 정상 마우스 세포는 처리 후에 G2/M 세포 주기 정지를 진행하였다. 방추 억제제의 부재하에 p53 무력화 마우스로부터 유래한 세포의 50%는 7회 계대배양에 의해 4배수체가 되었으나, 정상 마우스의 경우는 그렇지 않았다. p53 무력화 마우스의 조직을 검사하여 4배수체 세포의 존재를 확인하였는데, 이는 이들 마우스 유래의 세포를 이용한 시험관내 연구에서 얻은 결과가 배양 인공물이 아님을 입증하는 것이다. 이들 관찰 결과는 p53의 상실 또는 불활성화와 4배수체 또는 이수배체간의 상관관계를 나타내는 초기 보고를 확인하는 것이다.

유사하게, Fuksaswa 등(1996)은 p53 무력화 마우스에서 유래한 세포는 비정상적인 수의 중심체를 생성한다는 것을 입증하였다. 이는 동일한 기간 동안 온전한 p53을 보유한 마우스 유래의 세포가 2배수체로 남아 있아 있을 때, p53 무력화 마우스 유래의 배양된 세포는 배양물에서 증가적으로 이수배체가 되는 이유를 설명하는 것으로 보인다. Brown 등(1994)은 p53이 배양된 세포에서 분리된 중심체로 동시 정제된다는 것을 발견하였는데, 이는 이들 기관을 조절하는데 있어서 p53에 대한 가능한 직접적인 역할을 제시하는 것이다.

도 18에 도시된 바와 같이, p21은 게놈 손상에 반응하는 p53 의존성 세포 주기 정지의 주요 매개자이다. p21은 증식 세포 핵 항원(PCNA) 뿐 아니라 다수의 시클린 및 시클린 의존성 키나아제(cdk) 복합체에 결합한다. p21의 정상 레벨은, 세포 주기 진행에 필수적인 시클린-cdk 복합체 형성에 필요한 것으로 보인다(E1-Deiry 등, 1993). 그러나, p53 활성화로부터 생긴 p21의 증가된 레벨은 이들 복합체의 기능 및 PCNA를 저해하여 세포 주기 진행을 차단한다. 최소한 일부 상황에서, 게놈 손상에 반응하는 p53에 의해 상향 조절된 또 다른 유전자인 GADD45는 G1/S 전이점에서 세포 주기 정지를 개시할 수 있다(Marhin 등, 1997).

대안적으로, 게놈 손상은 세포 주기 정지 및 복원 대신에 계획된 세포 사멸의 p53 의존적 유도를 초래할 수 있다. 예를 들어 Clarke 등(1993)은 p53 유전자가 결실된 구조적으로 동형접합체인 마우스로부터 취한 흉선세포는 γ-조사 또는 에토포시드에 의한 계획된 세포 사멸의 유도에 대해 내성이 있지만, 글루코코르티코이드 또는 칼슘에 의한 계획된 세포 사멸의 유도에 대해서는 내성이 없다는 것을 확인하였다. p53 결실된 이형접합체 마우스는 DNA 가닥 파괴를 유발하는 제제에는 비교적 내성이 있으나, 동형접합체 마우스보다는 그 내성 정도가 약하다. 대조적으로, 온전한 p53을 보유한 마우스에서 유래한 흉선세포는 이들 모든 처리에 반응하여 계획된 세포 사멸을 진행하였다.

야생형 p53을 발현하지 않는 암세포는 종종 단백질의 발현이 실험적으로 도입되는 경우에 계획된 세포 사멸을 진행하는 것으로 밝혀졌다. 이는 어떻게 p53이 계획된 세포 사멸을 유도할 수 있는지에 대한 메카니즘 측면에서의 해명을 얻고자 하는 시도에서 모델 시스템을 제공한다. 그러나, 야생형 p53 기능을 제거하여 결과적으로 내인성 야생형 p53 기능 분석용 모델을 형성하기 위해 실험적으로 구조적 발현된 야생형 p53을 보유하는 세포주를 사용하면 잘못된 결과를 초래할 수 있다.

Johnson 등(1996)은 ROS가 p53 의존성 계획된 세포 사멸의 하류 매개자로서 기능할 수 있음을 처음으로 입증하였다. 이들은 강력한 프로모터의 제어하에 인간 p53 cDNA를 보유하는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 배양된 인간 또는 래트 평활근 세포(SMC)에서 인간 야생형 p53을 고레벨로 생성하였다. p53은 동일한 레벨로 2종의 세포형을 발현하였지만, 인간 세포에서만 계획된 세포 사멸을 유도하였다. 감염 8일내, p53을 과발현하는 거의 모든 인간 SMC는 사멸된 것으로 밝혀졌다. 동력학 연구에서는 p53 보유 바이러스로 감염 4시간 후에, SMC 중 p53 및 ROS의 레벨이 증가하였다고 개시되어 있다. 3가지 비관련 항산화제는 ROS 생성을 차단하지만 p53 과발현은 차단하지 않으며, 계획된 세포 사멸의 유도를 차단하는 것으로 확인되었다. p53의 증가된 발현은 최소한 일부 정상 세포 유형에서 계획된 세포 사멸을 유도하는데 충분하며, ROS는 이 유도의 하류 매개자라는 결론을 내렸다.

Vogelstein의 그룹(Polyak 등, 1997)은 아데노바이러스 벡터를 사용하여 불활성 내인성 p53 유전자를 갖는 인간 DLD-1 결장암 세포에서 야생형 p53의 발현을 유발시켰다. 바이러스로 감염된지 16시간 후, 그리고 계획된 세포 사멸의 증후가 있기 8시간 전에 이들 세포로부터 RNA를 정제하였다. 세포 mRNA군을 정량적으로 평가할 수 있는 SAGE 기술을 사용하여 분석하였다. 대략 8,000개의 형질전환체가 확인되었다. 이들 중에서, 14개의 형질전환체는 p53을 발현하는 세포가 현저하였으며(10배 이상), 26개는 상당히 풍부하였다. 14개의 최대로 유도된 유전자 중 13개가 확인되었으며, 일부는 세포의 산화환원 상태에 영향을 주는 단백질을 암호화하는 것으로 밝혀졌다.

이 그룹에서는 p53이 ROS의 생성을 자극함으로써 계획된 세포 사멸을 유도한다는 가설을 세웠다. 세포내 ROS 레벨을 측정하는 형광 프로브를 사용하여, 조사자들은 p53 보유 바이러스로 감염시킨 후에 ROS 생성이 유도되며 ROS의 레벨은 계획된 세포 사멸이 진행됨에 따라 계속 증가된다는 것을 발견하였다. 강력한 산화제 메나디온 또는 과산화수소로 DLD-1 세포를 처리하면, 14개의 유전자 중 하나, 즉 p21의 발현만을 유도하는데, 이는 이들 유전자의 군이 ROS 발현의 결과로서 단순히 유도되는 것이 아님을 입증하는 것이다. 이들 유전자는 인도메타신 또는 세라미드로 세포를 처리해도 유도되지 않는데, 이들 2종의 제제는 p53 발현의 부재하에 계획된 세포 사멸을 유도할 수 있다.

시간 경과 실험은 p53이 산화환원 제어 유전자을 전사적으로 활성화시키는 과정에서 미토콘드리아의 산화적 손상을 초래하고, 따라서 세포 사멸을 일으키는 ROS 생성을 유발하는 일련의 사건을 제안하였다. 특정 약리 제제로 이들 각 단계를 억제하여 연속적인 사건 사이에서 원인 및 효과 관계를 입증하였다.

이들 발견은 DLD-1 세포에서 p53 유도성 계획된 세포 사멸에 대한 다음 3 단계 모델을 제안한다: (1) p53은 산화환원효소를 포함하는 특정 유전자 서브세트를 전사적으로 활성화시킨다; (2) 유도된 단백질은 총체적으로 ROS 레벨에 있어서의 증가를 유발한다; (3) ROS는 미토콘드리아를 손상시켜, 칼슘 및 기타 성분의 누출 을 유발한다. 이들 성분은 계획된 세포 사멸의 종결 사건과 일관되게 관련된 ICE 유사 효소계의 구성원을 자극한다.

게놈 손상에 반응하는 야생형 p53에 의해 전사적으로 상향조절되는 유전자는 상이한 세포 종류에서 일부 다양성이 있는 것으로 보인다. 이들 중 2종은 Bax 및 GADD45인데, Bax는 때로는 계획된 세포 사멸의 p53 의존적 유도에 관련된 것으로 확인된 BCL-2 계열의 구성원이고, GADD45는 PCNA에 결합하여 세포 주기 검사점 정지를 유발할 수 있는 생성물이다. 예를 들어, McCurrach 등(1997)은 1차 섬유아세포에서 Bax가 화학 치료에 의해 유도되는 야생형 P53 의존적인 계획된 세포 사멸의 효과기 중 하나라는 것을 밝혀내었다. 이 연구에서, 야생형 p53은 Bax를 전사적으로 활성화시킴을 알아내었다. 그러나 Bax 및 GADD45는 Polyak 등(1997)의 전술한 연구에서 야생형 p53에 의해 유도되는 것을 밝혀진 유전자가 아니다. 화학 치료에 의해 유발되는 세포 손상에 반응하여 계획된 세포 사멸을 유도하는데 있어서 Bax의 잠재적인 중요성은 Strobel 등(1996)의 연구에서 입증되었다. 이 그룹은 Bax cDNA를 보유하는 벡터를, 기능적 p53이 결핍된 SW626 난소암 세포주내로 형질감염시켰다. 형질감염체에서는 대조군 세포와 비교하여 Bax 발현이 평균 10배 증가하였다. 화학치료 처리 후에 계획된 세포 사멸의 유도를 위한 역치는, 화학치료제가 파클리탁셀, 빈크리스틴 또는 독소루비신인 경우에는 Bax 형질전환체에서 실질적으로 감소하였지만, 화학치료제가 카르보플라틴, 에토포시드 또는 히드록시우레아인 경우에는 그렇지 않았다.

야생형 p53을 발현하고, 독소루비신 처리 후에 증식 정지 또는 계획된 세포 사멸을 진행하는 암세포주와 관련된 추가의 연구에서, p53의 도입 후에 DLD-1 세포에서 고도로 유도되는 동일한 14개의 유전자의 대부분이 세포 주기 정지를 유발하는 약물의 낮은 용량에서, 그리고 계획된 세포 사멸을 유발하는 고용량에서 상향조절됨을 확인하였다(Polyak 등, 1997). 그는, 세포가 세포 주기 정지 또는 계획된 세포 사멸을 진행하는지 여부를 결정하는데 있어서 중요한 인자는 그 세포가 산화적 응력에 대처하는 능력이라고 추측하였다. 즉, 산화적 응력을 다루는 능력이 낮은 세포는 계획된 세포 사멸을 진행하고, 내성이 더 큰 세포는 주기 정지를 진행한다는 것이다.

세포가 경험하는 산화적 응력 레벨은 게놈 손상 후에 세포 주기 정지 및 복원보다는 p53 의존적인 계획된 세포 사멸을 진행하는 경향과 양의 상관관계가 있었다. Lotem 등(1996)은 골수종 백혈병 세포에서 이들 현상에 대한 산화적 응력 및 시토킨의 영향을 연구하였다. 항산화제 및 일부 시토킨은 세포독성 화합물이 유도하는 계획된 세포 사멸에 대한 이들 세포의 협동적 보호를 나타내었다. 그러나, 과산화수소 처리로 산화적 응력을 증가시키면 세포 사멸 계획 발생이 증대되고, 계획된 세포 사멸을 예방하는데 필요한 보호적 시토킨 처리의 레벨이 증가되었다.

살리실레이트는 응력 반응과 관련된 전사 인자 및 단백질 키나아제의 활성화를 억제하는 것으로 알려져 있다. Chernov 및 Stark(1997)는 살리실레이트가 톡소루비신 및 방사선 조사 처리 후에 DNA에 결합하여 야생형 p53을 가역적으로 억제하고, 따라서 p21 전사 및 계획된 세포 사멸을 유도하는 p53의 능력을 억제한다는 것을 발견하였다. 살리실레이트를 DNA 손상 60 시간 내에 세척해내면, 억제된 p53 의 존성 서건이 계속되어 완료될 수 있다.

일부 환경에서 야생형 p53이 게놈 손상 후에 세포 주기 정지 또는 계획된 세포 사멸을 유도하는지 여부에 영향을 주는 인자는 c-myc이다. Saito 및 Ogawa(1995)는 래트 간세포 암종 세포주인 FAA-HTC1을 연구하여, 이 세포주가 구조적으로 c-myc를 발현하지만 p53은 발현하지 않는다는 것을 연구하였다. 이들 세포에서의 c-myc 발현은 안티센스 L CHK2HR올리고뉴클레오티드가 효과적으로 억제하였다. 야생형 p53 발현은 야생형 p53 cDNA를 보유하는 덱사메타손 유도성 발현 벡터로 이들 세포를 형질감염시켜 달성할 수 있다. 이 결과는 야생형 p53이 동일한 세포에서 c-myc의 상태에 따라서 세포 주기 정지의 유도자로서 또는 계획된 세포 사멸의 유도자로서 작용할 수 있다는 것을 보여주었다. 야생형 p53 발현은 세포의 일부에서 계획된 세포 사멸의 유도를 초래하지만, 생존 세포의 증식을 억제하지는 않았다. c-myc 발현이 억제되는 경우, 야생형 p53 발현은 세포 증식의 억제를 유발하지만, 계획된 세포 사멸을 유도하지는 않았다. 조절되지 않은 c-myc의 발현은 계획된 세포 사멸을 유도할 수 있는 것으로 다른 연구진들에 의해 밝혀졌다(Evan 등, 1992; Hoang 등, 1994; Lotem 및 Sachs, 1993).

추가의 연구 결과 일부 환경에서 야생형 p53은 기타 유전자의 발현을 먼저 유발하지 않고 계획된 세포 사멸을 유도할 수 있다는 것이 확인되었다.이들 상황에서, 야생형 p53 의존형 계획된 사멸은 액티노마이신 D 또는 시클로헥시미드의 존재하에 발생하는데, 이들 제제는 각각 RNA 및 단백질 합성을 차단한다(Caelles 등, 1994). 예를 들어, p53이 DNA에 결합하는데 필요한 말단 p53 아미노산 잔기가 결핍 된 p53 발현 벡터를 Hela 세포내로 도입하면 p53 의존형 계획된 세포 사멸을 일으키는 것으로 확인되었다(Haupt 등, 1995). 이 관찰 결과는 전사 중 p53의 비관련성이 적절한 변명없이 가정되었지만, 그러나 p53이 전사에 영향을 줄 수 있는 유일한 방법은 유전자의 조절 성분에 직접 결합하는 것 뿐 이라는 것을 제안한다. 이들 발견 및 유사 발견(S항체batini 등, 1995)은 p53이 전사에 영향을 미치지 않고 계획된 세포 사멸을 유도할 수 있다는 입론을 지지하는데 사용하였다.

따라서, 야생형 p53은 유전자의 특정 세트를 전사적으로 활성화시키거나, 직접 단백질-단백질 상호작용에 의해, 또는 이들 방법을 조합하여 계획된 세포 사멸을 유도할 수 있다. 그러나, 계획된 세포 사멸의 유도는 야생형 p53의 발현을 꼭 필요로 하는 것은 아니다. 이는 p53 무력화 마우스가 정상적으로 발육한다는 관찰 결과와 야생형 p53이 결핍된 세포가 유도되어 계획된 세포 사멸을 진행할 수 있다는 사실로부터 명백하다(Clarke 등, 1993).

도 18에 도시된 바와 같이, 계획된 세포 사멸을 개시할 수 있는 여러 경로는 결국 인터루킨 1-베타-전환 효소(ICE 유사) 계열을 포함하는 공통 종료기를 이용한다. 이 효소 계열은 현재 11종의 구성원을 포함하는 것으로 알려져 있으며, 이를 3 아과, 즉 ICE, CPP32 및 카스파제라고도 불리우는 Ich-1 아과로 나눌 수 있다(Boldin 등, 1996; Chinnaiyan 등, 1996; Duan 등, 1996a 및 1996b; Fernandes-Alnemeri 등, 1996; Lin & Benchimol, 1995; Lippke 등, 1996; Muzio 등, 1996; Wang 등, 1996). 예를 들어, S항체batini 등(1997)은 특별히 p53 의존적인 계획된 세포 사멸의 발생에 있어서 ICE 계열 효소의 역할을 연구하였다. 이들은 ICE 유사 프로테아제 CPP32의 펩티드 억제제가 세포에서 야생형 p53을 실험적으로 발현함으로써 유도된 어린 래트 신장 세포주에서 세포 사멸 계획을 억제함을 입증하였다.

야생형 p53은 계획된 세포 사멸을 유발하는 ICE 계열 효소의 능력을 강화시킬 수 있는 것으로 보인다(Jung & Yuan, 1997). 예를 들어, COS-1 세포에서 야생형 p53 기능을 불활성화시키면, 이들 세포가 ICE 유사 효소에 대한 cDNA를 보유한 발현 벡터로 형질감염된 경우 세포가 계획된 세포 사멸을 진행하지 못하게 하지만, 정상 COS-1 세포로 형질감염시키면 사멸 계획을 진행시킨다. ICE 유사 효소 또는 온도 민감성 p53 돌연변이를 보유하는 발현 벡터를 불활성의 내인성 야생형 p53이 있는 COS-1 세포내로 형질감염시켰다. 야생형 p53의 기능을 위해 허용가능한 온도에서, ICE 유사 효소가 계획된 세포 사멸을 유발하는 능력은 상당히 증대된다. 추가의 실험으로부터 야생형 p53이 효소에 의한 계획된 세포 사멸의 유도를 강화시키는 능력은 Bax에 의해 매개됨을 확인하였다.

암치료용 OL(1)p53

임상적 용도에 있어서 모든 암치료는 용량 의존 방식으로 계획된 세포 사멸을 유도하여 암세포를 죽인다. 일부 경우, 이 계획의 유도는 야생형 p53 의존적인 것으로 밝혀졌다. 저 용량에서, 게놈 손상을 유발하는 여러 제제는 야생형 p53을 갖는 세포에서 검사점을 유도한다. 검사점은 일시적으로 세포 증식을 정지시켜, 손상된 세포가 복원될 시간을 제공한다.

OL(1)p53의 개발과 관련되지 않은 연구진들의 최근 연구에서, 야생형 p53 발 현을 억제하면 온전한 야생형 p53 의존성 세포 주기 검사점을 갖는 비교가능한 암세포에 대한 여러 항암 치료의 사멸 효과를 증가시킬 수 있는 이유에 대한 이론적 근거를 제공한다. 세포 주기 검사점이 치료 후에 게놈에 대한 손상과 관련되게 하는데 실패하면 암 세포는 계획된 세포 사멸의 유도를 초래하는 유사 분열의 부재하에 DNA를 계속 복제한다. 치료학적으로 중요한 결과는, 차단된 검사점에서 항암 치료는 암세포를 죽이는데 더욱 더 효과적이 된다는 것이다.

일부 연구에서, 검사점의 속박이 야생형 p53 또는 하류 효과기 중 하나, 특히 p21의 발현을 유전자적으로 무력하게 함으로써 예방된다는 것이다. 이들 중단의 비가역적 특성으로부터, 야생형 p53은 이들 환경에서 계획된 세포 사멸의 유도에 필요하지 않은 것이 명백하다. 기타 실험에서, 메틸크산틴 유도체, 예컨대 펜톡시필린 또는 단백질 키나제 C 억제제인 UCN-01(7-히드록시스타우로스포린)은 모두 G2 검사점 기능을 억제하며, 항암제에 대한 암세포의 민감성을 추가로 증대시키는 야생형 p53 경로를 중단시키는 제제와 상승작용을 하는 것으로 확인되었다.

야생형 p53의 역활과 양립하여, p53 올리고뉴클레오티드 및 OL(1)p53은 특히 게놈 손상제가 암세포를 죽이는 능력을 상승작용 방식으로 증가시킨다. 또한, 암세포에 대한 최대 치사 효과를 유발하기 위한 최적 용량에서, OL(1)p53 및 항암제의 조합은 시험된 정상 세포 종류를 사멸시키지 않았다.

OL(1) p53 또는 천연 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드와 같은 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 세포에 결합하면, 시클로옥시게나제 의존형 메카니즘으로 유리 산소 라디칼의 생성을 증가시키는 세포를 유도한다. 이 효과는 환원 된 산소 장력에서보다 20%(대기) 산소에서 수행된 보통 세포 배양물에서 더욱 확연하다. 이들 유리 라디칼은 게놈 손상을 유발할 수 있으며, 이 현상은 왜 OL(1)p53이 암 화학치료제와 같은 게놈 손상을 유발할 수 있는 화합물을 첨가하지 않고 보통 조직 배양물에서 암세포를 죽일 수 있는지, 그리고 왜 OL(1)p53이 게놈 손상제를 첨가하지 않으면 경우 신체에서 발견되는 것과 유사한 산소 레벨에서 배양된 암세포를 죽이지 않는지에 대한 이유를 설명할 수 있다. OL(1)p53과 같은 올리고뉴클레오티드로 예비처리된 암세포는 p53 올리고뉴클레오티드의 부재하에 세포에 대한 독성이 아닌 용량의 게놈 손상제로 사멸시킬 수 있다. 아마도 이러한 상승 작용은, 온전한 p53 기능이 있는 세포보다 타협성 야생형 p53 기능이 있는 암세포를 처리하는데 사용된 경우, 더욱 효과적인 펜톡시필린 또는 UCN-01과 같은 G2 억제제에 의해 추가로 증진될 수 있다.

포스포로티오에이티는 DNA 유사체이기 때문에, DNA에 대한 친화도가 있는 암 화학치료제는 포스포로티오에이트에 결합할 가능성이 있다. 이 개념은, 미토크산트론에는 강하게 결합하지만 이다루비신 또는 다우노루비신에는 결합하지 않는 것으로 보이는 OL(1)p53을 사용하여 검사하였다. 미토크산트론과 올리고뉴클레오티드간의 상호작용은 야생형 p53을 발현하지 않는 암세포에 대한 화학치료제의 독성 효과를 실질적으로 감소시켰다.

올리고뉴클레오티드-약물 상호작용의 또 다른 연구에서, 황과 반응하는 것으로 알려진 아세타미노펜의 생활성 대사물질은 OL(1)p53을 비롯한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 결합하는 것으로 확인되었다. 이 상호작용은 OL(1)p53을 불활성화시킬 수 있으며, 추가의 임상 실험 전에 측정해야 한다.

붉은 털 원숭이를 비롯한 일부 종에서 수행된 약리학 및 독성학 연구는 전신 치료제로서 사용하기 바람직한 약리역학적 특성을 가지며, 올리고뉴클레오티드는 예측된 치료 레벨보다 높은 용량 레벨에서도 비독성이라는 것을 입증하였다. 서열 결정 및 세포 배양 연구는 OL(1)p53이 인간 세포에서와 같이 원숭이 세포에서 p53 발현을 억제함을 제안한다. 그러나, 올리고뉴클레오티드는 하등 동물에서 취한 세포 또는 조직에 대한 임의의 특이적 효과를 갖지 않는다.

단일 제제로서 OL(1)p53의 I기 임상 실험을 급성 골수성 백혈병 또는 골수이형성 증후군이 있는 환자에서 수행하였다. 올리고뉴클레오티드는 10일 동안 연속 주입하여 제공하였으며, 결과는 올리고뉴클레오티드가 예측된 용량 범위에서 비독성이므로 치료 레벨을 산출할 수 있음을 제시한다. 완전한 반응은 관찰되지 않았다.

OL(1)p53 투여 개시전, 주입 과정의 각종 시점에서 환자로부터 취한 악성 세포는 20% 산소하에서 배양시켰다. 미치료 환자로부터 취한 말초 백혈병 아세포와 비교하여, OL(1)p53 주입 개시 후에 취한 세포는 환자내로 주입된 OL(1)p53의 양의 함수로서 더욱 급속하게 사멸되었다. 유사하게, 백혈병 또는 골수이형증 환자로부터 얻은 골수를 장기간 배양한 결과 공여체내로 주입된 OL(1)p53의 양의 함수로서 악성 세포를 형성하는 능력이 실질적으로 감소됨을 입증하였다. 이 억제는 효과가 가역적이라는 임의의 증거 없이 수 개월동안 지속되었다.

OL(1)p53 임상 실험 결과는 올리고뉴클레오티드가 환자내에서 활성이 되도록 게놈 손상 항암제와 함께 사용해야 함을 강력히 제안하는 실험 데이타와 일치하는 것이다. 실험시 환자로부터 취한 세포를 사용한 세포 배양 데이타의 해석은 이러한 가설과도 일치한다. 암세포가 20% 산소하에서 배양물내에 존재하는 경우, 올리고뉴클레오티드는 이들 세포가 게놈 손상제로 작용하는 ROS를 생성하도록 유도하였다.

상기 논의로부터, 예를 들어, p53 올리고뉴클레오티드로 p53 발현을 차단하면 (1) 복원을 시도할 시간을 제공하는 세포 주기 정지, 및 (2) p53 의존성 계획된 세포 사멸의 방지를 초래할 수 있다. 여러 암 치료법이 게놈 손상을 유발할 수 있기 때문에, 이들 치료법은 야생형 p53을 발현하는 암세포내에서 야생형 p53의 유도를 유발할 것으로 예측할 수 있다. 실제로 x선 조사, 토포이소머라제 억제제, 알킬화제, 안트라시클린, 방추독 및 일부 항대사제는 모두 p53 의존성 세포 주기 정지를 형성하는 것으로 알려져있다(Cross 등, 1995; Kastan 등, 1991; Linke 등, 1996; Tishler 등, 1995). 야생형 p53의 유도 억제는 손상된 게놈을 복제시키고, 기능 부전 세포를 생성하며, 또한 계획된 세포 사멸을 유도함으로써 증식 암세포에 대한 항암 치료의 독성을 증가시킨다.

이들 쟁점을 설명하는 일련의 공개문헌은 존 홉킨스 및 유니버시티 오브 펜실베니아에서 함께 연구하는 조사자들의 실험실에서 얻을 수 있다(MaDonald 등, 1996; Waldman 등, 1996 및 1997). p21에서만 차이가 있는 동질유전자 인간 결장암 세포주를 이들 연구에 사용하였다. p21-/- 세포는 상동성 재조합을 이용하여 p21+/+ 세포로부터 생성하였다. 보통, 게놈 손상에 의해 p53이 유도되면 p21 유전자에 직접 결합시 전사 인자로서 작용하는 p53에 의해 p21 유도가 초래된다. 그 다 음 새로 합성된 p21은 세포 주기 진행에 필요한 단백질에 결합하여, 이의 기능을 차단한다.

이들 연구(McDonald 등, 1996)에서는 먼저 p21-/- HCT116 인간 결장 암세포가 p21+/+ HCT116 세포에 비하여 DNA 복원 결함을 갖는지 여부를 결정하려는 시도를 하였다(HCT116 클론은 야생형 p53을 보유한다). p21-결핍 클론은 클론원성 생존 분석으로 판단시 p21을 발현하는 세포보다 2∼3배 이상 UV 손상에 민감한 것으로 밝혀졌다. 또한, p21-/- 암세포에서는 온전한 p21 기능을 갖는 세포와 비교하여 돌연변이에 의한 hprt 유전자 불활성화의 지표인 6-TG-내성 콜로니를 자발적으로 발생시키는 빈도가 2∼3 배 증가되었다. 이들 데이타는 p21 기능 상실이 세포가 DNA 손상을 복원하는 능력 감소와 관련되어 있음을 제시한다.

추가로 이러한 개념을 시험하기 위해서, 조사자들은 발현 벡터를 p21+/+ 또는 -/- HCT116 인간 결장 암세포내로 형질감염시켰다. 벡터는 시토메갈로바이러스 수용체에 의해 유도되는 베타-갈락토시다제 cDNA로 구성되며, UV 조사 또는 시스-백금 항암제를 사용하여 형질감염시키기 전에 의도적으로 손상시켰다. p21이 결핍된 HCT116 세포는 p21+/+ HCT116 세포와 비교하여 손상된 발현 벡터의 복원 효과가 3배 내지 5배 떨어지는 것으로 밝혀졌다. p21 cDNA를 보유하는 발현 벡터를 p21-/- HCT116 세포내로 형질감염시키면 복원 능력이 2∼3배 증가하였다. PCNA로 p21 상호작용을 억제하고, 따라서 DNA 손상에 반응하여 세포 주기 정지를 방지하는 제제는 DNA 손상을 유발하는 고전적인 항암제와 상승적인 세포 독성 상호작용을 나타낼 수 있다는 결론을 내렸다.

후속 연구에서, 조사자들은 p21+/+ 및 -/- HCT116 세포에 대한 일부 게놈 손상제의 효과를 검사하였다(Waldman 등, 1996). 제제로는 암 치료 독소루비신, 에토포시드 및 γ선 조사와 토포이소머라제-1 억제제 캄프토테칸이 있다. 각각의 제제는 p21+/+ 세포가 연장된 세포 주기 정지를 진행하지만 세포 사멸을 진행하지는 않는 농도에서 계획된 세포 사멸을 유도하여 처리 90시간 내에 p21-/- 세포의 배양물을 완전히 죽일 수 있는 것으로 확인되었다. p21-/- 세포의 분석 결과, 처리 후에 세포는 G2에서 간단히 차단하지만 G1에서는 차단하지 않으며, 유사 분열의 부재하에 다회의 DNA 합성 라운드를 개시하고, 비정상 핵 형태를 갖는 생성 고이배체 세포는 결과적으로 계획된 세포 사멸을 진행한다는 것을 보여주었다.

유사한 실험 세트는 HCT116 주와 달리 변형된 p53을 갖고 이배체에서 HCT116 주와 유사한 DLD-1 인간 결장암 세포주를 사용하여 수행하였다. 연구진들은 p53 돌연변이 세포가 DNA 손상 후에 p21을 발현하지 않으며, 기능적으로 p21-/- 세포와 동일하다고 추론하였다. 예측한 바대로, DLD-1 세포는 독소루비신 또는 γ-조사로 처리한 후에 p21을 거의 발현하지 않았으며, 계획된 세포 사멸이 종료된 HCT116주에서와 같이 거의 동일한 형태학적/생리학적 세트의 발생을 초래하는 검사점 결함을 입증하였다.

돌연변이 p53을 보유한 이수(異數)배수체 인간 결장암 세포주를 사용하여 이들 실험을 수행하면, 이들 세포주 중 2 세포주를 DNA 손상제로 처리한 효과는 계획된 세포 사멸을 초래하는 사건과 동일한 패턴을 따르는 것으로 밝혀졌다. 제3의 세포주에서, 선재성 이수배수체는 세포 사멸 전에 DNA 함량의 상당한 증가에 관하여 확고한 결론을 제지하기에 충분히 명백하였다. Waldman 등은 "상세한 분석으로 계획된 세포 사멸이 DNA 손상 후에 유사 분열 및 S기간의 비커플링에 의해 명백하게 유도된다는 것이 입증되었다. 응집성 정지를 진행하는 대신에, p21 의존성 검사점이 없는 세포는 유사분열의 부재하에 DNA 합성 라운드를 계속 진행하여, 다배수체 및 계획된 세포 사멸이 최고에 달하였다"라고 결론내렸다(p 1034).

그러나, 저자들은 실험으로 입증되는 중요점을 논평하지 못했다. 일부 공개 문헌에서는 야생형 p53을 보유하는 세포내에서, 여러 항암 치료에 의해 유도되는 계획된 세포 사멸은 p53 의존적이라고 제시한다(Dronehower 등, 1992; Lowe 등, 1993; Symonds 등, 1994). 또한, 야생형 p53을 보유한 일부 암세포는 돌연변이된 p53을 보유한 유사한 세포보다 화학치료에 더욱 감수성이 있을 수 있다(Aas 등, 1996; Lowe 등, 1993a 및 1993b). HCT116 p21-/- 세포에서와 같이 돌연변이된 p53을 보유한 3종의 상이한 결장암 세포주가 계획된 세포 사멸의 유도를 초래하는 유사한 일련의 사건을 진행한다는 발견은 유사 분열의 부재하에 손상된 DNA의 복제 결과로서 계획된 세포 사멸이 야생형 p53 비의존성임을 제안한다.

HCT116 연구에서는 p53/p21 의존성 세포 주기 정지를 중단시키면, p21+/+인 계획된 세포 사멸이 HCR116에 대해 필요한 것보다 낮은 용량에서 p21-/- 세포중에서 유도되기 때문에 항암 치료에 의한 계획된 세포 사멸 유도에 대한 역치를 낮게 할 수 있다는 것을 입증하였다. p21+/+ 및 p21-/- HCT116 세포가 야생형 p53을 발현하기 때문에, 이러한 유도는 p53 의존성이다. p53 의존성 계획된 세포 사멸 메카니즘을 기초로 하는 경우, DNA 또는 게놈 손상이 계획된 세포 사멸을 유도하는 역 치 레벨은 야생형 p53을 발현하는 암세포에서 더 낮다. 그러나, 야생형 p53의 부재하에, p53 의존성 계획된 세포 사멸의 유도에 대한 손상 레벨 역치는 더욱 높다.

OL(1)p53은 p53의 발현을 일시적으로 억제하기 때문에, 올리고뉴클레오티드와 통상적인 치료법으로 암세포를 처리하면 p53이 억제되는 시간 동안 세포 주기 검사점의 중단과 p53 발현 회복 후에 p53 의존성 계획된 세포 사멸을 유발할 수 있다. 따라서, OL(1)p53은 p53 또는 p21 유전자 무력화와 관련하여 기술된 방법보다 항암 치료에 대한 야생형 p53을 발현하는 감수성 암세포에서 더욱 효과적이어야 한다.

일련의 논문 중 제3 논문에서 제공된 실험은 세포 주기 검사점의 억제가 면역타협성 동물에서 증식되는 HCT116 인간 결장암 세포의 γ조사 감도를 증가시키는지를 결정하도록 고안하였다(Waldman 등, 1997). 이종이식편 종양은 세포주의 p21+/+ 및 p21 -/- 서브클론으로부터 만들었다. 처리하지 않은 상태에서, p21+/+ 및 p21-/- 종양은 거의 동일한 비율로 증식하였다. 대략 50 mm²의 종양을 갖는 군당 12∼17 마리의 동물을 7.5 또는 15 Gy의 국소 γ조사로 처리하고, 2주 단위로 측정하였다. p21 +/+ 종양이 있는 동물을 방사능 조사하면 치료되지 않고, 모든 p21 +/+ 종양은 치료후 수일 동안 계속 증식하였다. 대조적으로, 18∼38%의 p21 -/- 종양(p<0.01 Chi-square 시험)은 검출가능한 종양이 존재하지 않는 것이 치유라고 규정한 경우 용량의 함수로서 γ선 조사로 치유되었다. 치유되지 않은 p21 -/- 종양은 치료 후 실질적인 용량 의존형의 크기 감소를 나타내었다.

이 연구의 제2 목적은 표적 세포의 p53 및/또는 p21 상태에 의해 영향을 받 는 항암 치료를 평가하는데 있어서 클론원성 생존 분석값을 측정하는 것이었다. γ선 조사 후 생존하는 클론의 수는 소수이지만, HCT116의 p21 +/+ 및 p21 -/-서브클론과 비교하면 거의 동일하다는 것을 발견하였다. 콜로니의 수가 작으면 각각 세포 주기 정지 및 계획된 세포 사멸을 유도하였다. p21 +/+ 세포의 경우 생존 콜로니간의 영역은 생세포로 구성되지만, p21 -/-의 경우는 그렇지 않다. 조사자들은 살아있는 p21 +/+ 세포가 클론원성 세포의 증식을 지지하는데 중요한 것으로 알려진 공급 세포층과 같이 작용함을 지적하였다. 또한, 이들은 처리 p21 +/+ 종양에서 공급층의 존재와 생체내 공급 세포군의 결핍은 동물 데이타를 설명할 수 있다고 주장하였다.

또 다른 그룹은 야생형 p53 및/또는 p21 파괴가 일부 항암 화학 치료제 및 이온화 방사능에 대한 항암 세포의 감수성에 미치는 영향을 또한 검사하였다(Fan 등, 1995 및 1997). 모두 야생형 p53을 보유하는 MCF-7 인간 유방암 세포 또는 HCT116 결장암 세포를 인간 파필로마 바이러스 유형-16 E6 유전자(MCF-7/E6 또는 HCT116/E6) 또는 우성 p53 돌연변이(MCF-7/mu-p53)로 형질감염시켜 야생형 p53의 기능을 중단시켰다. 클론원성 생존 분석을 이용하여, 야생형 p53 기능이 억제된 모두 3개의 서브클론과 HCT116 p21-/- 세포는 온전한 야생형 p53 또는 p21 기능을 갖는 상응하는 세포에서보다 시스플라틴 및 머스타드질소에 대한 감수성이 상당히 큰 것으로 확인되었다.

파괴된 야생형 p53 또는 p21 기능을 갖는 모두 4개의 서브클론은 온전한 야생형 p53 또는 p21 기능을 갖는 상응하는 세포와 비교하여 형질감염된 시스플라틴 손상된 CAT 리포터 유전자를 복원하는 능력에 결합이 있는 것으로 확인되었다. 결과적으로, 조사자들은 G1 검사점 대조군, 뉴클레오티드 절제 복원, 또는 양자의 결핍에 대한 이들 세포의 시스플라틴 감수성 증가를 설명하였다.

존 홉킨스 그룹에서와 같이, Fan의 그룹에서는 이온화 방사능을 게놈 손상제로서 사용한 경우 온전한 야생형 p53 또는 p21 기능을 갖는 세포들과 이를 갖지 않는 세포들간의 클론원성 생존 분석에서 상당한 차이를 관찰하지 못했다. 그러나, 존 홉킨스 조사팀이 해명한 분석의 결점을 인식하지는 못하였다.

머리 및 목 암에 걸린 환자에서 취한 20개의 인간 인상 세포 암세포주의 p53 상태와 방사능감수성의 검사는 Servomaa 등(1996)이 수행하였다. P53 돌연변이 및/또는 결실은 15종의 세포주에서 발견되었다. "평균 불활성화 용량"(AUC)은 방사능 처리 후에 4주 동안 평가한 클론원성 생존 분석을 사용하여 측정하였다. 결과는 돌연변이된 p53을 보유한 세포주나 p53이 없는 세포주의 경우 1.82±0.24 Gy이고, 야생형 p53을 보유한 세포주의 경우에는 2.23±0.15였다(P<0.01). 연구진들은 p53이 발현되지 않는 세포주가 가장 방사능감수성이 있다고 결론내렸다.

메틸크산틴 유도체인 펜톡시필린은 G2 검사점 억제제인 것으로 밝혀졌다(Russell 등, 1996). 일부 기타 특성으로 인하여 각종 질병이 있는 환자에게 제공된 화합물은 비교적 비독성이며, 적혈구 유연성을 증가시키는 능력을 포함한다(Ciocon 등, 1997). 펜톡시필린은 온전한 야생형 p53 및 p21을 보유한 대조군 세포의 감수성을 변경시키지 않고 중단된 야생형 p53 기능 또는 p21 결핍 암세포주를 죽이는데 있어서 시스플라틴과 상승작용을 나타내었다(Pan 등, 1995). 또한, 약 물은 야생형 p53 기능을 손상시킨 세포에서 G2 검사점을 억제하는데 휠씬 효과적인 것으로 밝혀졌다.

Russell 등(1996)은 HPV 유형 16 유래의 E6 유전자를 형질도입시켜 인간 A549 폐 아데노암 세포주에서 p53 기능을 불활성화시켰다. 클론원성 생존 분석을 이용하여, 연구진들은 펜톡시필린 및 신규 메틸크산틴인 리소필린이 대조군과 비교하여 γ선 조사에 대한 E6 형질도입된 암세포의 감수성을 15배 증가시킨다는 것을 발견하였다. 이들 제제는 G2 세포 주기 정지를 유도하는 방사능의 능력을 차단하는 것으로 보이며, 리소필린은 G1 정지도 차단하는 것으로 밝혀졌다.

UCN-01(7-히드록시스타우로스포린)은 G2 검사점을 차단할 수도 있는 단백질 키나제 C 억제제이다. 이는 설치류에서 성장하는 인간 종양에 대한 항신생물 활성을 나타내며, 현재 암치료를 위한 임상 실험 중이다(Pollack 등, 1996). Wang 등(1996)은, 이들 제제가 HPV E6 유전자를 보유하는 발현 벡터의 형질감염으로 불활성화된 p53 또는 야생형 p53이 있는 MCF-7 유방암 세포의 시스플라틴에 대한 감수성에 영향을 미치는 능력을 시험하였다. 약물 감수성은 클론원성 생존 분석 및 MTT 분석으로 측정하였으며, 기능성 야생형 p53이 있는 세포와 비교하여 온전한 야생형 p53 기능이 부족한 세포에서 UCN-01로 처리하면 약물 감수성이 현저히 개선되는 것으로 확인되었다. 펜톡시필린을 포함하는 연구에서와 같이, UCN-01은 온전한 기능을 갖는 세포에서보다 야생형 p53 기능이 제거된 세포에서 게놈 손상에 의해 유도되는 G2 정지를 차단하는데 휠씬 효과적인 것으로 밝혀졌다.

유사하게, Shao 등(1997)은 야생형 p53 기능이 온전한 동일한 세포와 비교 하여 실험 조작 결과로서 야생형 p53 기능이 결핍된 HCT116 결장암 세포주 및 MCF-7 유방암 세포주에 대한 게놈 손상제의 세포독성 효과를 증가시키는데 UCN-01이 훨씬 더 효과적임을 입증하였다.

카페인은 시험관내 G2 세포 주기 정지를 차단하며, p34cdc2 키나아제를 활성화시켜 작동하는 것으로 보인다. Yao(1996a)는 카페인 처리가 방사능 유도된 계획된 세포 사멸에 대한 야생형 p53 기능이 결핍된 종양 세포를 선택적으로 감작시킴을 입증하였다. 따라서, 일부 암의 경우 OL(1)p53과 G2 검사점 억제제의 사용이 OL(1)p53을 단독으로 사용한 것보다 상당히 더 큰 정도로 종래의 항암 치료의 유용한 효과를 증가시키는 것으로 보인다.

미소관 활성제는 통상적으로 G2 정지를 유발하는 세포 주기 검사점을 유도한다. 일부 연구에서, G2 활성제에 대한 세포의 반응에 영향을 주는 역할을 하는 야생형 p53과 연루되어 있다(Fan 등, 1995; Powell 등, 1995; Russell 등, 1995). 이들 발견으로 Tishler 등(1995)은 암 화학치료제 탁솔, 빈블라스틴 및 노코다졸이 악성전 배야 마우스 NIH-3T3 세포주에서 야생형 p53 의존성 과정을 유도하는 능력을 검사하였다. 모두 3개의 미소관 활성제는 G2 세포 주기 정지를 유발하고, p53 DNA 결합을 증가시켰다. 빈블라스틴 및 노코다졸만이 p21 전사시 증가를 유발하는 것으로 확인되었다.

Wahl 등(1996)은 탁솔에 대한 섬유아세포의 감수성에 야생형 p53 기능 중단이 미치는 효과를 관찰함으로써 이들 연구를 확장하였다. 야생형 p53의 기능은 HPV E6 유전자 또는 SV40 T 항원 유전자를 보유하는 발현 벡터로 형질감염시켜 정상 인 간 섬유아세포에서 파괴시켰다. 섬유아세포는 정상 마우스 및 p53 무력화 마우스로부터 취하였다. 어떤 유형으로부터 취한 세포내 손상된 p53 기능도 대조군과 비교하여 탁솔 세포독성의 7∼9배 증가와 상관관계가 있었다. 탁솔은 p53 상태와 무관하게 계획된 세포 사멸을 유도하여 세포를 죽이는 것으로 밝혀졌다. 탁솔 처리 후 생존한 온전한 p53을 보유하는 세포는 증가된 레벨의 p21을 나타내었으며, 세포 주기 정지를 진행하였다.

게놈 손상과 반응하여, 야생형 p53은 p21 외에 제2 유전자 GADD45를 유도하는데, 이 유전자는 PCNA에 대한 효과를 억제하여 세포 주기 검사점을 유도하는 기능을 한다. Smith 등(1996)은 안티센스 벡터로 형질감염시켜 야생형 p53을 발현하는 RKO 인간 결장암 세포주에서 GADD45 발현을 차단하였다. GADD45 레벨을 감소시켜 시스플라틴 처리 및 UV 조사의 사멸 효과에 대해 암세포를 감작시켰다. 또한, GADD45가 억제된 세포는 UV 손상된 리포터 플라스미드 및 예정되지 않은 DNA 합성 실험을 사용하여 판단시 DNA 손상을 복원하는 능력을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 야생형 p53의 기능이 파괴된 각종 유전자를 보유하는 발현 벡터를 RKO 세포내로 형질감염시켰다. p53 기능을 억제하면 GADD45 발현을 억제하는 것과 동일한 DNA복원에 대한 효과를 갖는다.

일반적으로 p21 세포 주기 검사점에서와 동일한 유도 효과를 생성할 수 있는 1 이상의 추가의 p53 조절된 유전자, GADD45가 존재하면 p53이 게놈 손상제에 의한 검사점 유도를 차단하는 p21보다 더 우수한 표적이 되게 한다.

본 발명에 따라서, 통상적인 모노클론 항체 또는 바람직하게는 p53올리고뉴 클레오티드(예, OL(1)p53) 및/또는 기타 세포 주기 검사점 억제제(예, UCN-01, p21 올리고뉴클레오티드 또는 p27 올리고뉴클레오티드)와 함께 사용된 본 발명에 따라 형성된 촉매 항체와 같은 EGFR 또는 HER2의 억제제는 EGFR 및/또는 HER2를 발현하는 암종 처리에 대한 종래의 화학 치료법과 함께 사용하는데 특히 적절하다.

Mendelson 및 그의 연구진들은 EGFR 기능을, 예컨대 모노클론 항체로 차단하면 p53 및 p21 또는 p27/KIP1의 발현 증가를 유발하여, 세포 주기 검사점을 유도한다는 것을 확인하였다(Wu 등, 1996; Peng 등, 1996). 올리고뉴클레오티드 또는 촉매성 항체와 같은 p53, p21 또는 p27 억제제와 EGFR 억제제의 조합된 사용은 세포 주기 정지를 방지하고, 게놈 손상을 유발할 수 있는 종래의 암치료와 함께 사용되는 경우 특히 EGFR 억제제의 항암 효과를 증가시킨다.

또한, p53 올리고뉴클레오티드, 예컨대 OL(1)p53을 사용하면 기타 EGFR 억제제의 억제 효과를 보조할 수 있는데, 그 이유는 p53이 EGFR 유전자를 전사적으로 활성화시키기 때문이다(Ludes-Meyers 등, 1996; Sheikh 등, 1997).

(C) EGFR 촉매성 항체 및 OL(1) p53을 이용한 환자의 조합 치료

치료 계획은 다음 측면을 포함한다. (1) 암 시료를 취하여 p53 유전자의 돌연변이 상태를 측정한다. (2) 환자에게 대략 5일 동안 올리고뉴클레오티드를 시간당 0.1 ㎎/kg으로 주입하고, 항체의 대사회전 속도에 따라 1∼50 ㎎ 범위의 용량에서 EGFR 촉매성 항체를 정맥내로 환괴 주사한다. (3) 종래의 화학 치료는 올리고뉴클레오티드를 주입한지 24시간 후에 개시한다. 선택된 화학치료제(들)는 OL(1)p53에 결합하지 않고 게놈 손상을 유발할 수 있는 것이다. 이를 위한 적절한 올리고뉴 클레오티드는 본원에서 참고로 인용한 미국 특허 제5,654,415호에 개시되어 있다.

실시예 II

HIV에 대한 백신화에서의 촉매성 항체

gp120에서 유도된 모델 B 세포 에피토프 및 T 헬퍼 에피토프로 구성된 AIDS 치료에 유용한 백신 작제물이 본원에 개시되어 있다. B세포 에피토프의 CRAA는 촉매성 항체를 유발하도록 고안된다. 예시적 B 세포 에피토프는 CD 결합 부위로부터 유도되는데, 이는 일반적으로 상이한 HIV-1 균주에서 보존된다. gp120의 CD 결합 부위는 적절한 표적인데, 그 이유는 기타 여러 에피토프와는 달리 천연 바이러스 표면에서 항체에 접근하기 쉽기 때문이다[31]. CD4 결합 부위는 구조 결정인자로 알려져있다.

본 발명에서, CD40 결합 부위의 특정 부분(전체 CD4 결합 부위에 대립되는 것으로서)을 인식하는 촉매성 항체 제제를 개시하고 있다. 촉매성 항체에 대한 적절한 표적인 gp120(또는 기타 HIV 단백질)에서 추가의 펩티드 에피토프를 동정한다. gp120의 절단은 생물학적 활성의 상실을 수반하는 단백질 구조에 있어서 전체 변화를 초래할 수 있기 때문에, 일부 gp120 펩티드 에피토프는 숙주 세포에 대한 HIV-1 결합 또는 세포내 성분과 HIV-1의 상호작용에 직접적으로 관여하지 않는 경우에도 촉매성 항체의 적절한 표적일 수 있다. 이들 및 기타 표적은 본 발명의 범위내에 있다.

항체 합성에 대한 T 세포의 도움은 잠재적으로 MHC 다형성으로 인해 상이한 개체에 제한된다. 본 발명에서, 규명된 유전자 배경을 갖는 마우스 균주를 B-T 에 피토프 접합체에 반응하는 촉매적 면역성을 유도하기 위한 모델로서 사용한다. 각종 MHC 클래스 II 대립 유전자가 무차별하게 인식하는 "보편적인" T-헬퍼 에피토프를 이용한다. 이러한 방법의 또 다른 잇점은 인간 임상 실험에 쉽게 적용할 수 있다는 것이다.

HIV-1의 엔벨로프 당단백질은 단일 160 kD 전구체로서 합성한다. 이 단백질은 세포 프로테아제로 Arg511-Ala512 결합을 절단하여 gp120 및 통합 막 단백질 gp41을 생성한다. gp120의 생물학적 활성은 HIV-1에 의한 숙주 세포의 초기 결합, 바이러스의 증식과 비감염 뉴런 및 기타 세포에 대한 독성 효과에 있어서 중요한 성분이다. 숙주 세포에서 gp120의 구조적 에피토프가 CD4 수용체에 결합하는 것이 HIV-1 감염의 제1 단계이다. 이 에피토프를 구성하는 개개 아미노산은 제2(C2), 제3(C3) 및 제4(C4) 보존된 gp120 분절에 부위하는 것으로 보인다[12]. 이들은 gp120 잔기 256, 257, 368-370, 412-427 및 457이다. 도 7 참조. CD4 결합 부위에 결합하는 모노클론 항체가 개시되어 있다[32]. CD4 결합 부위는 구조적 에피토프이기 때문에, 에피토프의 구성성분이 아닌 이격된 잔기는 CD4를 결합시키는 능력을 유지하는데 중요할 수 있다.

기타 숙주 세포 단백질과 gp120의 상호작용은 바이러스 증식에 필수적이다. 예를 들어, 칼모듈린에 의한 gp120의 결합은 칼모듈린 길항물질의 억제 효과에 의해 나타나는 바와 같이 HIV-1 감염도와 관련이 있다. gp120의 V1 및 V2 영역 사이에 부위하는 Asp180은 바이러스 복제에 중요하다[33]. 유사하게, V3 루프는 감염도에 필수적일 수 있다[34]. 따라서, CD4 결합 부위를 구성하는 것들 외에 gp120 중 구조 결정인자는 바이러스 게놈 복제, 외피 단백질 합성, 및 바이러스 입자 패키징에 필수적인 것이 명백하다.

gp120의 트립신 처리는 신경 독성 효과를 차단한다. 트립신으로 HIV-1 입자를 처리하면, 마스트 세포 트립타제 또는 인자 Xa는 감염도를 약화시킨다. 잔기 269-270 또는 432-433에서 gp120을 절단하면 CD4 결합 능력을 파괴시키는 반면, 잔기 64-65, 144-145, 166-167, 172-173 또는 315-316에서 절단시키면 CD4 결합에 영향을 미치지 않는다[35]. 한편, 세포 프로테아제로 gp120의 V3 루프에 부위한 Arg315-Ala316 펩티드 결합을 절단시키는 것은 생산적 바이러스 감염에 필수적인 것으로 생각된다. 숙주 세포 표면에서 발현되는 디펩티딜펩티다제(CD26)는 Arg315-Ala316에서의 절단을 담당하는 것으로 제안되고 있다. 이 절단 부위는 보호성 항체가 쉽게 합성되는 V3 gp120 루프의 성분인 주요 중화 결정인자(PND)에 부위한다. PND에 대한 항체 결합은 숙주 세포 프로테아제에 의한 gp120의 절단을 차단하여, HIV 중화를 산출한다는 가설을 세웠다. PND는 CD4에 의한 HIV 결합에 있어서 직접적인 역할을 한다는 증거는 없지만, HIV 공동수용체에 의한 결합에 있어서 PND의 관련성이 제안되었다.

B 세포에 의한 효과적인 항체 합성은 T 헬퍼 세포의 회복에 부분적으로 좌우되는데, 일단 감작되면 부속 분자, 예컨대 T 헬퍼 세포상의 CD4와 B 세포 상의 B7을 통해 매개되는 직접 접촉에 의해 필요한 자극성 시토킨을 분비하고 B 세포를 활성화시킨다. Ag-특이적 T 세포의 회복은 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 프로세싱된 Ag 에피토프의 복합체의 T 세포 수용체(TRC)에 의한 인식을 통해 발생한다.

펩티드계 백신은 숙주가 항체를 합성하는데 대항하여 B 세포 에피토프에 T 세포 에피토프를 공유 결합시켜 제형화한다. T 에피토프는 항원 공여 세포의 표면에 MHC 클래스 II 분자를 결합시키고, B-T 에피토프의 MHC 클래스 II 복합체는 TCR에 의해 결합된다. 이계 교배시킨 종에서 상이한 개체는 T 세포에 대한 Ag 표시와 관련된 MHC 클래스 II 대립 유전자를 발현한다(I-E 및 I-K 유전자좌). 이상적으로, 펩티드 백신은 MHC 제한이 없어야 한다. 즉, Ag 표시와 관련된 MHC 클래스 II 변형과 무관하게 강력한 항체 반응을 일으켜야 한다.

MHC 클래스 II 분자, 즉 TCR과 Ag 에피토프간의 상호작용은 매우 무차별적이다. 따라서, 일부 펩티드는 보편적인 T 에피토프로서 작용할 수 있다. 즉 이들 펩티드는 상이한 MHC 클래스 II 대립 유전자를 효율적으로 결합시킬 수 있다. 또한, 상이한 종류의 TCR의 레벨에서 펩티드의 인식에 대한 명백한 제한은 없다. 이러한 펩티드는 본원에 개시된 바와 같이, 보호적 항체 반응을 유발하여 HIV를 중화시키도록 고안된 백신의 적절한 T 에피토프 성분이다.

전술한 바와 같이, 일부 항체는 단백질 항원에서 펩티드를 결합시키고 펩티드 결합을 절단한다. 최근 연구 결과, L쇄의 V 도메인을 암호화하는 일부 생식 세포 계열 유전자는 이 촉매적 활성을 발현할 수 있는 것으로 제안되었다. 비교적 비특이적인 펩티다제 활성(다반응성 활성으로 명명)을 갖는 항체 및 L쇄는 비면역화된 인간 및 동물에서 설명되어 있다[36]. 또한, 돌연변이 유발에 의해 확인된 VIPase L쇄의 촉매적 잔기는 생식 세포 계열 VL 유전자가 암호화한다. 펩티드 활성은 펩티드 항원과 면역 반응 후에 발생하는 항체의 체내 다양화 과정에서 개선될 수 있다. 촉매적 효과가 큰 일부 VIPase L쇄는 생식 세포 계열 유전자 대응부와 비교하여 고도로 돌연변이 된 것으로 관찰되었다[14]. 적절한 VH 도메인을 촉매적 VL 도메인과 쌍을 이루게 하면 개선된 촉매적 효과를 초래하는 것으로 알려져 있다[28]. 또한, 자가면역 질환 환자로부터 분리한 폴리클론 촉매성 항체는 자가 항원에 대한 높은 친화도를 나타내는데[1,4,5], 이는 항체가 체내 돌연변이 및 클론 선별을 수행한다는 전형적인 증후이다.

자가면역 질환에서 촉매성 항체의 존재는 촉매 합성에 관한 유전적 소인으로 인한 것일 수 있으며, 특정 생식 세포 계열 V 유전자의 선택적 발현에 의해 또는 항체 V 도메인의 체내 서열 다양화 과정에서 촉매적 부위의 형성 증가에 의해 발생할 수 있다. 자가면역 질환이 상이한 V유전자의 편중된 사용과 관련된다는 관찰 결과는 문헌에 잘 설명되어 있다. 항체 발현과 관련된 기타 유전자는 자가면역 질환에서 촉매적 활성 레벨에 기여할 수 있다. MRL/lpr 마우스는 우수한 촉매성 항체의 생산자인 것으로 알려져 있다[7]. 마우스 종에서, Fas 고사 유전자의 돌연변이는 T 및 B 세포를 증식시키고 낭창 유사 질병을 발현시키는 것으로 생각된다.

신속한 펩티드 결합 절단 활성을 갖는 gp120에 대한 특이성을 조합한 항체의 합성을 유도할 수 있는 면역원내 적절한 구조를 도입함으로써, AIDS 치료용 면역치료제를 형성한다.

자가항체의 티로글로블린에 대한 촉매적 활성과 합성 프로테아제 기질을 절단할 수 있는 각종 L쇄의 촉매적 활성은, 활성화된 세린 잔기와 공유적으로 반응하는 디이소프로필플루오로포스페이트(DFP)로 억제한다. 도 8 및 도 9 참조.

VIP에 대한 촉매성 항체는 촉매적 서브유닛과 구조적 및 기능적으로 구별되는 항원 결합 서브부위을 포함한다. 항VIP L쇄에서, 화학적 촉매작용을 담당하는 잔기(Ser27a, His93)에서의 돌연변이 유발은 대사회전의 감소를 생성하지만, K_m의 최소 변화를 산출하는데, 이는 전이 상태 안정화를 담당하는 잔기가 기질 바닥 상태 인식에 기여하지 않음을 제시하는 것이다. 공간적으로 촉매적 서브부위와 떨어진 잔기에서 돌연변이를 유발하면, 예측한 대로 기질 바닥 상태에 대한 결합력을 상실하고(K_m 증가), 대사 회전이 다시 증가된다. 따라서, 초기 고 친화 결합 및 화학적 절단 단계를 담당하는 잔기는 동일하지 않다.

전이 상태 유사체(TSA) 및 공유 반응성 항원 유사체(CRAA)에 대한 항체

TSA를 이용한 면역화[37, 13, 38]는 전이 상태에 결합하는 항체를 유도하여 반응에 대한 활성화 에너지 장벽을 낮추는 수단으로서 제안되었다. 전술한 바와 같이, 공통적으로 사용되는 포스포네이트 유사체는 4면체 인 원자와 그 인 원자에 결합된 음으로 하전된 산소 원자를 포함한다. 펩티드 결합 절단의 전이 상태의 형성은 절단 부위에서의 삼각형 탄소 원자를 4면체 상태로 전환시키는 단계, 카르보닐기의 산소에 의해 음전하를 획득하는 단계를 포함하는 것으로 생각된다. 따라서, 포스포네이트 TSA는 산소음이온 구조 및 전이 상태의 4면체 구조를 결합시킬 수 있는 항체의 합성을 유도할 수 있다. 그러나, 이들 TSA에 대한 항체는 상대적으로 불필요한 아실 전달 반응을 가속화시키지만 펩티드 결합 절단을 촉매하는 것으로 보고된 것은 없었다. 포스피네이트 TSA에 대한 항체는 안정한 1차 아미드를 서서히 절단시키는 것으로 최근 보고되었다[11]. 항포스피네이트 항체는, 더욱 일반적인 항포스포네이트 항체와 비교하여 양성자를 절단 용이한 결합에서 아미드 질소에 전달할 수 있으며, 이는 아마도 더 우수한 촉매적 활성을 설명해 주는 것 같다.

본 실시예에서, 본 발명자들의 CRAA 고안은 다음 가설에 대해 예측한다: (1) 효소에서와 같이 항체에 의한 촉매반응은, 펩티드 결합 절단을 촉매하는 데 화학적으로 활성화된 아미노산의 참여를 필요로 한다. (예를 들어, 세린 프로테아제에서 Ser 히드록실기는 Ser, His 및 Asp 잔기간의 분자내, 수소 결합망을 형성하여 공유결합 촉매 반응을 매개하는 능력 및 친핵 특성을 획득한다.); (b) 다중 구조 성분은 촉매가 인식하여 충분한 전이 상태 안정화를 달성한다. 포스포네이트 TSA 구조는 친핵성 촉매 부위를 결합시키는데 필요한 요소, 또는 S1 인접 잔기 인식 부위에 관여하는 촉매내 부위를 포함하지 않기 때문에 촉매성 항체의 유도에 대한 불완전한 면역원으로 보인다. 본 발명의 항원 유사체는 염기 인접 잔기 및 사면체 반응 중심을 인식하는 능력과 함께 공유결합 촉매적 능력을 갖는 항체의 합성을 유도한다. 생식 세포 계열이 암호화하는 항체내 세린 프로테아제 부위에 결합하도록 고안된 CRAA에 의해 유도된 전술한 종류의 촉매성 항체의 합성이 본원에 개시되어 있다. 촉매성 항체에서 친핵성 세린 잔기와 반응할 수 있는 친전자성 CRAA가 제조된다. 이들 신규 CRAA는 면역원으로서 사용되어, gp120-특이적 항체의 합성에 대한 세린 프로테아제 부위를 이용하게 한다. 전술한 CRAA로 면역화시키면 생식 세포 계열이 암호화하는 촉매 부위를 발현하는 B 세포의 클론 선별을 촉진한다. 또한, gp120에 대한 특이성은 CRAA 구조의 측면에 gp120의 적절한 항원성 에피토프를 혼 입하여 유지한다. 도 10 참조.

종래의 포스포네이트 TSA 구조는, 그 자체가 불충분한 면역원이더라도 유용할 수 있음을 인지해야 한다. 포스포네이트 TSA내 P1 부위에 염기성 잔기를 혼입하면 촉매성 항체 합성을 유도하는 것을 보조할 수 있는 데, 그 이유는 전이 상태에서 반응 중심의 안정화가 인접 잔기 인식과 함께 발생할 수 있기 때문이다. 또한, 이종 면역화는, 포스포네이트 에스테르 CRAA로 면역화시킨 뒤 포스포네이트 TSA로 면역화시키는데, 산소음이온 안정화 부위 뿐 아니라 공유 결합 촉매적 부위를 형성한다. 이들 기능을 조합한 항체 부위는 전술한 메카니즘 중 어느 하나만을 이용하는 것보다 촉매적으로 휠씬 강력할 것이다. 따라서, TSA 및 CRAA를 환자에게 동시투여하는 방법도 본 발명의 범위에 포함된다.

자가면역 질환은 유효 항원 특이적인 촉매성 항체의 생성과 관련되어 있다. gp120을 결합시킬 수 있고 gp120을 절단할 수 있는 항체가 낭창 환자에게서 확인되었다. 또한, 낭창형 마우스(MRL/lpr 종)로부터 분리된 L쇄는 gp120을 절단한다.

17명의 HIV-1 양성 환자와 10명의 낭창 환자에서 유래한 단백질 G-세파로스[41]에 대한 친화 크로마토그래피로 정제된 IgG 시료를 ¹²⁵I-gp120을 절단하는 능력에 대해 분석하였다. 전기사출법으로 순수한 gp120의 방사능 표지(IIIB, AIDS 리서치 및 기준 시약 프로그램, NIH)는 클로라민-T 방법으로 하고, 겔 여과로 ¹²⁵I-gp120을 정제하였다. 120 kD에서 방사능표지된 gp120의 단일 밴드가 SDS-PAGE 및 자동방사능 사진으로 관찰되었다. 17개의 HIV-1 양성 IgG 시료 중 16개의 시료가 gp120 절단 활성을 갖지 않았으며, 1개의 시료만이 가까스로 검출가능한 활성을 나타내었다. 비교하여, 10개의 낭창 IgG 시료 중 3개의 시료는 쉽게 검출가능한 gp120 절단을 나타내었다. 도 11 참조. IgG 시료에 의한 ¹²⁵I-알부민의 가수분해는 명백하지 않으며, 이는 관찰된 gp120 가수분해가 비특이적 현상이 아님을 제안하는 것이다. 별도의 실험에서, L쇄는 gp120 절단 낭창 IgG 시료 중 하나와 MRL/lpr 마우스의 혈청 IgG로부터 정제하였다. 이는 인간 모노클론 및 폴리클론 IgG로부터 L쇄를 절단하는 VIP를 분리하기 위한 전술한 프로토콜을 사용하여 IgG의 환원 및 알킬화와 EPLC 겔 여과로 수행하였다[9,28]. 낭창 환자 및 MRL/lpr 마우스로부터 유래한 L쇄 피크에 상응하는 분획물(25 kD)에서 ¹²⁵I-gp120 절단 활성이 명백하다. FPLC 컬럼에서 회수한 L쇄의 정체는 전술한 바와 같은 SDS-PAGE 및 면역블롯팅으로 확인하였다[28]. HIV-1 양성 IgG 및 BALB/c IgG에서 유래한 유사한 L쇄 분획물은 gp120 절단 활성을 나타내지 않았다. 낭창 L쇄, MRL/lpr L쇄 및 트립신에 의한 ¹²⁵I-gp120 절단의 특이적 활성은 (온전한 gp120 밴드 영역에 있어서 감소율, 즉 임의의 유닛/촉매 nM/항온 처리 시간으로서 표시되는 경우)각각 31, 307 및 204였다. 촉매 아군은 L쇄의 소분획을 구성하는 것으로 보이는데, 이는 촉매적 L쇄의 진정한 특이적 활성이 상기 인용된 값보다 커야 함을 의미한다는 점에 주의해야 한다.

세린 프로테아제 억제제(0.3 mM 디이소프로필플루오로포스페이트)의 존재하에, 낭창 환자에서 유래한 IgG에 의한 gp120 절단은 거의 완전히 억제되었다(도 12A). 비교하여, 메탈로프로테아제, 시스테인 프로테아제 및 산 프로테아제의 억제제(EDTA, 요오도아세트아미드, 펩스타틴 A)는 반응에 대한 효과가 없었다.

L쇄 촉매화된 gp120 절단에 대한 추가의 증거는 활성을 갖는 모노클론 L쇄의 확인으로부터 나온다. 29개의 모노클론 L쇄는 다발성 골수종을 갖는 환자로부터 정제하였으며, 이들 L쇄의 3개의 재조합 VL 도메인, VIP 가수분해된 활성을 갖는 재조합 L쇄[10] 및 폴리클론 항VIP 항체[2]를 ¹²⁵I-gp를 가수분해하는 능력에 대해 스크리닝하였다. gp120 가수분해 활성을 갖는 다발성 골수종 환자에서 유래한 하나의 모노클론 L쇄를 확인하였다(Lay2). 남아있는 항체 시료는 활성이 없었다. L쇄 단백질 피크로 겔 여과 컬럼으로부터 gp120 가수분해 활성을 동시용출시켰다. Lay2에 의한 거의 동일한 절단은 생물학적 완충액 및 영양 배지(PBS, HBSS 및 RPMI640)에서 관찰되었다. 질량이 대략 80 kD, 50 kD 정도의 점, 20 kD 및 <6 kD인 4개의 방사능 표지된 gp120 절단 생성물은 비환원성 전기영동으로 명백하였다. 80 kD 밴드는 환원 조건하에서 크기의 감소를 추가로 진행하였는데, 이는 이황화 결합된 단편을 함유함을 제시하는 것이다. 동일한 생성물 프로필은 HIV-1 균주 IIIB, SF2 및 MN에서 유도된 ¹²⁵I-gp120 제제를 사용하여 관찰하였다(도 12B). 낭창 IgG와 같이, L쇄의 활성은 세린 프로테아제 억제제 DFP에 의해 억제되었지만, 기타 종류의 프로테아제의 억제제에 의해서는 억제되지 않았다.

절단 반응물이 gp120의 방사능요오드화와 관련된 인공 산물이 아님을 확인하 기 위해서, 비표지된 단백질 절단을 연구하였다(도 13). 절단 생성물은 단백질의 단백질 분해 파손 생성물을 인식하는 것으로 알려져있는 항gp120 항체를 이용한 환원성 SDS-전기영동의 면역블롯팅으로 확인하였다[35]. 증가된 L쇄 농도에서 gp120의 가수분해가 증가되는 것은 명백하며, 이는 120 kD 기질 밴드의 강도 감소로 추정된다. 이는 80 kD 및 기타 절단 생성물의 축적을 증가시켜 수행하였다. 환원 조건하에서 분석된 비표지된 gp120 및 방사능표지된 gp120의 절단 프로필은 동일하였지만, 개개 밴드의 강도는 상이하였으며, 2종의 기질의 검출에 사용되는 방법(면역블롯팅 대 Tyr 잔기에서의 ¹²⁵I-표지 후 자가 방사선 사진)을 반영하는 것 같다.

20 nM L쇄 및 증가하는 gp120 농도(10∼300 nM)에서 측정되는 절단 반응의 초기 속도는 포화시킬 수 있었다(겉보기 K_m 값은 30 nM; V_MAX 0.06 nmol gp120/nmol Lay2/시). K_m값(nM)은 비교적 고친화도 결합을 나타낸다. 병렬 분석된 트립신 촉매화된 gp120 절단은 최대 1 μM의 농도에서 비포화성이었는데, 이는 저친화도 인식을 제안하는 것이다. VIP는 L쇄에 의한 ¹²⁵I-gp120의 절단을 억제하였다(VIP의 Ki, 620 nM). Lay2 L쇄는 K_m이 144 nM인 방사능 표지된 VIP를 가수분해하였다[40]. 따라서, VIP는 gp120보다 약 5∼21배 덜 강하게 L쇄를 결합시키는 것으로 보인다. 상동성의 짧은 영역은 촉매와 폴리펩티드의 반응성의 기초가 되는 gp120 및 VIP사이에서 확인하였다.

HIV 감염에 대해 보호할 수 있는 특이적이고 효과적인 촉매성 항체의 합성을 유발하는 펩티드 유사 제제의 합성 방법들이 제공된다. 초기 연구는 생식 세포 계열이 암호화하는 항체의 다반응성 촉매 활성을 gp120 펩티드의 세린 반응성 CRAA로 마우스를 면역화시켜 회복 및 개선시킬 수 있음을 제안하였다. 촉매성 항체 반응의 유발은 비촉매성 항체 반응과 비교하여 HIV-1 감염에 대한 우수한 보호를 제공해야 한다.

하기 합성 면역원을 제조하고 평가한다.

A) 합성 면역원

a) 파상풍 독소(잔기 830-844)에서 유래한 T헬퍼 에피토프에 접합된 gp120(잔기 421-436)의 B 세포 에피토프의 포스포네이트 전이 상태 유사체(TSA);

b) B-T 에피토프의 포스포네이트 에스테르 CRAA; 및

c) B-T 에피토프로부터 유래한 비변형 펩티드.

(B) (A)에서 유래한 3개의 면역원으로 비자가면역 마우스(종 B10.BR) 및 자가면역 마우스(MRL/lpr)를 면역화시키고, 혈청으로부터 정제된 IgG의 다음 활성을 연구하였다.

(a) 포스포네이트 B-T 에피토프, 포스포네이트 에스테르 B-T 에피토프 및 비변형된 B-T 에피토프의 결합 및 절단;

(b) 단량체 전길이 gp120의 결합 및 절단; 및

(c) 천연 세포 표면 결합 gp120의 결합 및 절단.

면역원

HIV에 대한 촉매 항체를 유발할 수 있는 원형 백신은 1) B 세포를 고 치환도 항체로 만들 수 있는 에피토프(B 에피토프); 2) MHC 클래스 II 항원에 의해 결합되고 T 세포에 제공되는 에피토프(T 에피토프); 및 3) 펩티드 결합 절단 과정에서 형성된 전이 상태의 구조적 모방체를 포함하며, 전이 상태를 안정화시켜 절단 반응을 촉진할 수 있는 항체의 합성을 유발하고자 한다.

B 에피토프 성분

gp120의 절단 후에 감염도는, 감염 과정에서 중요한 역할을 하는 gp120의 에피토프에 부위하는 펩티드 결합을 절단시키는 촉매를 유도하여 상실시킬 수 있다. gp120 단편의 구조가 모단백질에 비하여 "전체적으로" 변경될 수 있기 때문에, 생물학적으로 중요한 결정인자로부터 이격된 결합에서 gp120을 절단하면 gp120 기능 상실을 초래할 수 있음에 주목한다. 바이러스 감염도를 중화시키는 확률은 중화 항체의 공지된 표적인 에피토프를 인식하도록 항체를 유도하여 증가시킬 수 있다. CD4 결합 부위의 절단은 하기 원인에 대해 HIV 중화를 달성하는 유인적 메카니즘이다: CD4-gp120 결합은 숙주 세포내로 HIV 유입시 필수 단계이다; 트립신에 의한 432-433 결합에서 CD4 결합의 절단은 gp120이 CD4를 결합하는 능력을 차단하는 것으로 알려져 있다; CD4 결합 부위에 대한 항체는 HIV 감염을 억제하는 것으로 알려져 있다; HIV 표면에서 발현되는 천연 gp120에 대한 CD4 결합 부위는 환경에 노출된다(천연 gp120 올리고머에 매립된 단량체 gp120의 기타 수개의 에피토프와는 반대로)[32]; CD4 결합 부위는 상이한 아형의 HIV-1에서 잘 보존된다. gp120 잔기 421-436으로 구성된 선형 펩티드 서열은 본 계획에서 면역원의 B 에피토프 성분으로서 선택되었다(KQIINMWQEVGKAMYA; 도 10). 돌연변이 유발 연구는 gp120의 이 영 역이 CD4 결합에 중요한 기여를 함을 제시한다.

전이 상태 유사체(TSA) 성분 및 공유 반응성 항원 유사체 성분

상기 전이 상태가 바닥 상태보다 더욱 안정화될 경우 촉매 반응이 일어난다. 본 발명에 있어서, 항원 유사체는 항체가 바닥 상태의 항원과 결합하는 능력을 보유할 경우, 촉매 기능을 보충해 주는 역할을 한다. 전자의 특성은 다수의 폴리펩티드를 비특이적으로 절단하는 항체와는 달리, gp120 특이적 촉매를 얻는데에 필요한 성질이다. 표적화된 펩티드 결합에 인접하는 gp120 펩티드 서열을 도입시킬 경우 gp120에 대한 특이성이 부여된다. 세린 단백질 분해효소 유사 촉매성 항체들에 의한 펩티드 결합 절단의 전이 상태를 안정화시키는 데에 기여하는 주요 구조적 특성을 도 14에 나타내었으며, 여기에는 다음과 같은 경우들이 포함될 수 있다 : (a) 끊어지기 쉬운(scissible) 펩티드 결합에 전이 상태로 형성되었으며, 상기 촉매내 세린 잔기와 결합할 수 있는 4면체인 친전자성 탄소; (b) 상기 촉매내에서 Asn, Gln 또는 Arg과 같은 잔기들과 이온 결합함으로써 안정화될 수 있는, 상기 탄소에 형성된 산소 음이온 구조(소위, 산소 음이온 홀이라 칭함); 및 (c) 항체내 촉매 부위내에 또는 이와 인접하여 부위하는 Asp 또는 Glu과 같은 산성 잔기와 이온 결합함으로써 일어날 수 있다는 인지 능력을 갖는, 끊어지기 쉬운 펩티드 결합의 N-말단 측면상의 염기성 잔기. 촉매 작용중에 결합 형성 및 파열 과정에 직접적으로 관여하는 것은 아니지만, 인접하는 잔기의 양 전하성 측쇄는 전이 상태에서 바닥 상태와는 상이한 공간적 부위를 점유할 수 있다는 것을 주목해야 한다. 이는 상기 끊어지기 쉬운 펩티드 결합의 부분 이중 결합 특성이 전이 상태가 형성됨에 따라서 상실되어, 상기 결합의 주위를 회전할 수 있으며 이로써 원거리에 부위하는 그룹의 부위가 변하기 때문에 가능하다. 이와 같은 전이 상태의 원거리 공간의 변화에 대한 가능성은 끊어지기 쉬운 결합에서의 sp2(바닥 상태) 및 sp3(전이 상태) 원자배열의 펩티드 기질을 컴퓨터로 모형화시킴으로써 추론할 수 있다.

삭제

포스포네이트 유사체 및 포스포네이트 에스테르 유사체를 포함하는 TSA 및 CRAA를 각각 평가한다. 상기 양 경우에 있어서, 4면체의 인 원자는 gp120내 432번 잔기 및 433번 잔기를 연결시키는 끊어지기 쉬운 펩티드 결합 탄소 원자의 유사체로서 사용된다. 도 10에 나타낸 페닐에스테르 원자배열에서, 인 원자는 부분적으로 양전하를 필요로 하는데, 이는 마치 끊어지기 쉬운 결합의 탄소 원자가 친핵성 세린 잔기들과 반응하는 데에 요구되는 양전하를 부분적으로 띄고 있는 것과 같다. 펩티드 O-페닐포스포네이트는 세린 잔기의 활성 부위의 산소 원자와 공유 결합을 형성함으로써 다수의 세린 단백질 분해효소를 비가역적으로 비활성화시킬 수 있다고 이미 기술한 바 있다[29]. Sampton 및 Bartlett외 다수[23, 24]는 인 원자에 페닐 에스테르를 형성시키고 상기 포스포네이트 에스테르에 인접하는 펩티드 서열을 부착시키는데에 필요한 화학 합성법을 개발하였다.

12개의 아미노산과 4개의 아미노산이 각각 gp120의 421-436번 잔기의 서열에 해당하는 TSA/CRAA 구조의 N 말단 및 C 말단 측면에 존재한다. 염기성 잔기는 항체내 생식 세포 계열에 의해 암호화된, 염기성 잔기 특이적 촉매화 부위를 촉진시키기 위해서 CRAA-gp120의 P1 부위에 결합된다. 포스포네이트 페닐에스테르 구조 와 함께, 상기 염기성 잔기는 촉매화 부위와 강하게 결합하는 것을 촉진시켜주며 이로써 상기 CRAA-gp120은 촉매화 부위를 합성하는 B 세포 클론의 증식을 선택적으로 자극시키는 능력을 촉진시켜 준다.

에스테라제 항체 형성을 증가시키기 위하여 사용되는 이전의 포스포네이트 TSA와 B 에피토프의 포스포네이트 에스테르 CRAA는 구조적으로 구별된다는 사실을 주목해야 한다[13, 38]. 종래의 포스포네이트 TSA는 인에 부착된 산소 음이온을 함유하는데, 이로써 이 포스포네이트 TSA는 촉매내에서 발견되는 산소 음이온 홀에 결합될 수 있다. 그러나, 상기 포스포네이트 TSA는 촉매화 부위내의 친핵성 세린 잔기와 반응할 수 없다. 보고된 바에 의하면, Phe-Ile 펩티드 결합의 포스포네이트 TSA는 아미다제 촉매성 항체 형성을 유도시키지 않는다고 한다[41].

상술한 포스포네이트 에스테르 유사체는 다음과 같은 이유에서 B 에피토프의 포스포네이트 TSA와 비교된다 :(a) 이상에서 언급된 연구 논문에 기술된 면역원은 P1 부위에 염기성 잔기를 포함하지 않았는데, 이는 펩티다제 항체를 합성하기 위한 생식 세포계 촉매를 보충하는 작용을 한다; 그리고 (b) 포스페이트 유사체만으로 면역화시키는 것은 펩티다제 항체 합성을 유발시키는데에 충분하지 않을 수 있는 반면에, 포스포네이트 및 포스포네이트 에스테르 유사체로 이종 면역화시키는 것은 양호한 펩티다제 항체 응답을 유발시키는데, 이는 상기 이종 면역화가 산소 음이온 홀(포스포네이트 면역화) 및 친핵성 세린 잔기(포스포네이트 에스테르 면역화)에 대한 선택에 관여할 수 있기 때문이다. 상기 gp120 포스포네이트 및 포스포네이트 에스테르 면역원을 사용하는 이러한 공동 면역화는 본 발명의 범주내에 포함된다.

T 에피토프 성분
항 gp120 항체 합성에 T 세포의 도움을 보충시키기 위하여, 테타누스 독소의 830-844번 잔기에 해당하는 15개의 아미노산 펩티드(QYIKANSKFIGITEL)는 상기 B 에피토프의 N 말단 측면에 배치되어야 한다. 백신 구조물내 T 에피토프가 존재하면 상기 B 에피토프가 큰 담체 단백질과 접합할필요가 없다. 몇몇 선행 연구 결과에 의하면, T 에피토프 및 B 에피토프를 포함하는 비교적 짧은 길이의 선형 펩티드는 B 에피토프에 대한 항체의 합성을 효과적으로 유발시킬 수 있는 것으로 입증되었다[42]. 본 발명에서 사용될 테타누스 독소의 T 에피토프는 다양한 클래스Ⅱ 대립 형질을 발현시키는 숙주내에서 T 에피토프로서 사용되는 것으로 공지되어 있으며, 따라서 이를 "보편적(universal)" T 에피토프로 규정하였다[43]. 뿐만 아니라, 상기 T 에피토프와 연결된 gp120 B 에피토프는 항 gp120 항체 합성을 유도시키는 것으로 기술되어 있다. 상기 T 에피토프의 "보편성"은 비록 인간 연구로부터 추론되었지만, 이를 마우스까지 확장시킬 수 있을 것으로 보이는데, 왜냐하면 클래스Ⅱ 제한은 계통 발생학적으로 보존되는 경향을 나타내기 때문이다. 인간과 마우스 사이에 존재할 수 있는 이러한 차이점과는 상관없이, 본 발명에서 이용될 마우스 종은 항체 합성(A^kE^k 할로타입)에 대하여 T 세포의 도움을 보충하는 데에 관여하는 클래스Ⅱ 대립 형질과 매치되는데, 이로써 특징적인 T 헬퍼를 보충함으로써 촉매성 항체 응답에 변이를 일으킬 수 있는 가능성을 없앤다.

면역원의 조립
N 말단은 테타누스 독소의 830-844번 잔기로, 그리고 C 말단은 gp120의 421-436번 잔기로 구성된 31개 잔기의 바닥 상태 B-T 구조물(지정된 비변형성 B-T 에피토프)의 합성은 종래의 고체상 합성법에 따라 Applied Biosystems 합성기상에서 수행된다. 질량 분광법 및 ¹H 및 ¹³CNMR로써 상기 구조물의 구조들이 확인된다.

B-T 에피토프의 TSA 및 CRAA는 표적화된 절단 부위에 포스포네이트 에스테르 구조 및 포스포네이트 구조를 포함한다. 상기 물질들은 신규의 시약이지만, 이들을 합성 문제를 제기해서는 안된다.

표준 유기 화학 기술들은 예전부터 TSA 및 다른 형태의 효소 억제제를 합성하는 데에 활용되어 왔다[23, 24].

합성 공정을 개략적으로 나타내면 다음과 같다. 리신의 포스피네이트 이소스테르는 하이포아인산의 디페닐메틸아민염 및 6-벤질카바마토헥사날로부터 제조된 후 산에 존재하는 디페닐메틸 기를 제거한다. 필요로 하는 인접 펩티드(gp120의 421-431번 잔기; gp120의 432-436번 잔기로부터 확장된 테타누스 독소의 830-844번 잔기)는 종래의 고체상 합성법에 의하여 제조되는데, 이때 C 말단 단편에 해당하는 펩티드가 N 말단에 리신 대신에 2-히드록시-6-카르보벤질옥시아미노헥사논산을 포함한다는 것을 제외하고는 종래의 방법과 동일하다. 기타의 염기성 측쇄는 카르보벤질옥시기로 보호되며 산성 측쇄는 벤질 에스테르기로 보호된다. 보호된 펩티드는 고전적인 용액 상 펩티드 합성 방법에 의하여 포스피네이트 리신 이소스테르에 부착된다. 최종적인 펩티드 포스포네이트 페닐 에스테르 구조는 포스피네이트를 페놀과 산화적으로 커플화시킴으로써 제조된다. 이와 동일한 합성 공정은 아세토니트릴내에서 비스(트리메틸실릴)아세트아미드로 처리한후 AG-X-50 이온 교환 수지상에서 수성 트리에틸아민, 카본 테트라클로리드 및 리튬 교환시켜 포스피네이트를 포스포네이트 모노에스테르로 전환시킴으로써 포스폰산 제조에 사용된다[23; 공정 h 및 I]. 질량 분광법 및 NMR에 의하여 상기 구조들을 확인할 수 있다.

마우스의 면역화

4개의 면역원 구조물, BR10.BR 및 MRL/1pr에 응답하는 항체에 대한 연구가 두 종의 마우스에 대하여 수행된다. 면역화는 이하의 물질들을 사용하여 수행될 것이다 :

a. B-T 에피토프(테타누스 독소의 830-844번 잔기와 연결된 gp120의 421-436 잔기).

b. Lys432 잔기에서의 B-T 에피토프의 포스포네이트 유사체(TSA).

c. Lys432 잔기에서의 B-T 에피토프의 포스포네이트 에스테르 유사체(CRAA).

d. 포스포네이트 에스테르 유사체 후속 B-T 에피토프의 포스포네이트 유사체(TSA+CRAA; 이종성 면역화)

항체 합성을 유도시키기 위하여 종래의 면역화 방법이 사용된다. 3회에 걸친 복강내 주사 방법 및 1회에 걸친 정맥내 주사 방법(각각 100 ㎍의 펩티드)에 의하여 면역원이 투여된다. 최종적인 면역화는 정맥내에서 이루어지게 된다. 2개의 아쥬반트가 테스트된다 : RIBI 및 명반. 명반은 인간에 사용할 목적으로 허가된 것이며 본 발명에 제시된 바와 유사하게 B-T 에피토프에 대한 항체의 합성을 유발시키는 것으로 이미 밝혀진 바 있다. RIBI는 Freund의 완전 아쥬번트의 대체물로서 독성이 낮은 물질이며, 다수의 항원에 대한 양호한 항체 응답을 재생 가능하도록 촉진시킨다. 혈청은 면역화 과정중 5회의 시점에서 마우스로부터 얻은 퇴행성 순환계(retroorbital) 망상 조직의 혈액으로부터 제조된다. 구조 및 기능 연구를 위한 Fv 파아지 발현 라이브러리를 위하여 지라 세포를 얻은 후 처리하였다. B 세포 성장 및 클론 선별시 아쥬반트에 의하여 보충된 시토킨 및 TH 하위 군집의 영향으로, 백신에 대한 항체 응답의 질과 양은 아쥬반트에 의하여 영향을 받을 수 있기 때문에 2개의 아쥬반트에 대한 분석법이 유용하다[44]. 그러므로, 각 그룹당 5마리의 동물들로 구성된 전체 16개 그룹의 마우스가 연구될 것이다(4개의 면역원×2종의 마우스×2개의 아쥬반트).

친화도가 낮으며, 항원 비특이적인 펩티다제 항체는 미리 면역화시킨 저장성 개체내에 이미 존재한다. 비특이적 단백질 분해효소 활성을 암호화하는 생식 세포 계열 유전자를 항체 합성을 위하여 보충시켰다고 가정하면, CRAA에 의한 면역화는 gp120 특이적 촉매 항체를 합성시킨다. 촉매 부위를 암호화하는 생식 세포 계열 유전자를 효과적으로 보충할 수 있으며 또한 상기 촉매 부위를 성숙시켜 면역 응답시 각각의 항원에 특이적으로 만든다는 사실이 시사하는 바와 같이, 자가면역 질환을 앓고 있는 인간 및 마우스는 항원 특이적 촉매 항체를 다량으로 생산하는 생산자이다. MRL/1pr 마우스는 유전적으로 자가면역 질환을 앓는 경향이 있으며, 또한 높은 수준으로 촉매 항체를 생산할 수 있는 것으로 관찰된 바 있다. 뿐만 아니라, 미리 면역화시킨 MRL 마우스의 혈청으로부터 얻은 L 사슬은 gp120 절단 활성을 발현시킨다. 그러므로, 공지된 면역원으로 MRL/1pr 마우스를 면역화시켜 형성된 항체들의 하위 세트는 gp120 특이적 촉매 활성을 발현시키는 데에 관여할 수 있다. 낭창 환자에서 발견된 gp120 결합 항체는 부분적으로는 공지된 면역원에 포함된 gp120 B 에피토프에 대하여 유도성이다[39]. BR10.BR 마우스 종은 자가면역 질환을 앓지 않는 경향이 있다. 상기 종으로부터 나타난 결과는 공지된 면역원이 건강한 면역 시스템에서 gp120에 대한 촉매적 면역성을 자극시키는 능력을 반영한다. BR10.BR 마우스 및 MRL/1pr 마우스는 항체 합성에서 T 세포를 제한시키는 클래스Ⅱ 부위(A^kE^k)에 동일한 할로타입을 갖는데, 이는 상기 두 종류 사이의 촉매성 항체의 활성 차이가 상기 클래스Ⅱ 제한에 의한 것이 아니라는 것을 확증해 준다.

항체 결합 활성

CRAA에 대응하여 합성된 항체들은 펩티드 결합 절단 반응의 바닥 상태보다 더욱 양호하게 전이 상태와 결합해야 하는데, 이로써 촉매 반응이 일어난다. 항체가 CRAA/TSA에 결합하는 세기는 항체 촉매 활성의 예측 인자로서 사용된다. 뿐만 아니라, 면역원내 B 에피토프가 면역원 및 전체 길이 gp120에서의 형태와 거의 동일하게 존재하면, 상기 항체들은 또한 전체 길이 단백질과도 결합한다. 마지막으로, 상기 에피토프가 바이러스 표면상에 올리고머의 형태로 존재하는 것으로 알려진 천연 gp120에서와 같이 노출되면, 상기 항체들은 또한 올리고머 gp120 구조에 결합하게 된다.

비변형된 B-T 에피토프 및 TSA B-T 에피토프 및 CRAA B-T 에피토프:

B-T 에피토프의 3가지 형태, 즉 비변형성, 포스포네이트 및 포스포네이트 에스테르 형태는 ELISA에 의해 비교한다. 결합 세기의 정확한 값은 고체상으로서 비변형된 에피토프(약 50㎍/㎖)를, 그리고 가용성 경쟁자로서 비변형된, 포스포네이트 및 포스포네이트 에스테르 B-T 에피토프로 피복된 ELISA 플레이트를 사용하는 경쟁 검정법(competition assay)(IC50 값으로서)에 의해서 평가된다. 결합 여부는 퍼옥시다제를 항 마우스 IgG와 커플화시킨후 기질을 가해줌으로써(O-페닐렌 디아민 및 과산화수소)측정될 수 있다. 폴리클로날성 제제물이 연구될 경우, 결합 곡선은 간단한 S자형 결합 등온 곡선으로부터 파생될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 각각의 리간드에 대한 IC50 값은 항체들의 평균 결합 친화도에 대한 유효한 지수로서 사용된다.

다음의 관계는 촉매 속도의 가속화를 예측하는데에 사용될 수 있다 :

Ki/Kd=k_cat/k_uncat

상기 식중, Ki 및 Kd는 각각 TSA 및 비변형성 B-T 에피토프의 평형 해리 상수이며, k_cat 및 k_uncat는 각각 촉매화된 반응 및 촉매화되지 않은 반응에 대한 1순위 속도 상수이다. 상기 등식에서 IC50값은 치환되어 속도의 가속화를 예측할 수 있으나, 연구될 IgG 시료이 상이한 항체들의 혼합물이기 때문에 예측값은 몇몇 항체 활성의 평균값이 된다. 결합 검정법은 디이소프로필플루오로포스페이트(DFP)의 존재하 4℃에서 수행되며 펩티드 절단으로 인한 결합 파라미터를 측정하여 상쇄값을 최소화시킨다. 선행 연구법에 따르면, 공지된 세린 단백질 분해 효소 억제제인 DFP는 항체의 촉매 활성을 균일하게 억제시키는 것으로 관찰되었다. 반응 온도를 저하시키면 촉매 반응의 속도도 감소된다. 촉매화 검정법으로부터 측정된 Km값은 결합 세기의 지표로서의 IC50의 유효성을 획인하는데에 도움을 줄 것이라는 것을 숙지해야 한다.

용액 상 검정법은 결합 여부 측정에 오류를 일으키지 않는 고체상에서의 항원 "카펫팅(carpeting)"으로 결합 활성 효과를 확인하도록 수행된다. 상기 용액 상 검정법은 ¹²⁵I 방사능 표지된 B-T 에피토프를 사용하여 수행된다. 상기 펩티드의 방사능 표지는 이미 기술한 바 있는 클로르아민-T 방법을 사용하여 수행된다[2]. [상기 B-T 에피토프는 gp120의 435번 잔기에 해당하는 하나의 Tyr을 포함한다]. 항체- 항원 복합체는 단백질 G-세파로즈를 사용하여 트랩핑될 것이며 그 결합 여부는 γ-분광계에서 방사능을 측정함으로써 확인된다. 이전과 미찬가지로, 결합 여부는 다양한 농도의 TSA/CRAA 경쟁자를 통하여 연구될 것인데, 이로써 비변형성 에피토프 및 이의 TSA/CRAA와의 결합 세기를 측정할 수 있다.

정제된 gp120 및 세포 표면 발현된 gp120

표적화된 B 에피토프가 단백질의 전체 길이 올리고머 형태인 항체에 접근할 수 있는지 여부를 측정하기 위하여 정제된 gp120 및 세포 표면 gp120에 의한 항체의 결합 여부가 측정된다. 포유 동물 세포주에서 발현된 재조합 gp120은 HIV 감염된 세포의 글리코실화 패턴과 유사한 단백질의 글리코실화 패턴을 확인하는데에 사용된다. 고체상에 피복된 gp120을 사용하는 경쟁적 ELISA는 상기 항체들의 정확한 결합 세기를 측정하는데 사용된다. 연구할 경쟁자 리간드는 전체 길이의 gp120 및 항체들이 유도될 3개의 B-T 에피토프(포스포네이트 TSA, 포스포네이트 에스테르 CRAA 및 비변형된 B-T 에피토프)이다. 합성 면역원 및 전체 길이의 gp120의 상대적 활성은 경쟁자 리간드의 IC50값(정확한 Ki)으로부터 측정된다. 전체 길이의 gp120 및 비변형된 B-T 에피토프에 대한 IC50값이 거의 균등하다는 사실은 표적화된 B 에피토프가 2개의 분자내에 거의 동일한 형태로 존재한다는 사실을 시사하는 것이다. 전체 길이의 gp120에 비하여 B-T 에피토프의 포스포네이트 또는 포스포네이트 에스테르에 항체가 더욱 강하게 결합하는 사실을 나타내는 관찰 결과는 상기 항체가 촉매 활성을 나타낼 수 있다는 것을 시사하는 것이다. 상기한 바와 같이, 방사능 표지된 gp120을 사용하는 용액 상 검정법은 리간드 고정에 의하여 결합 활성이 증가되는 것과 같은, ELISA에 의한 인공적인 효과를 수반하지 않음을 확인하기 위하여 수행된다.

H9 T 세포주의 HIV-1 감염된 세포들은 그들의 표면상에 gp120을 발현시킨다. 대부분의 세포 표면 gp120은 착생형 바이러스 입자의 형태를 모의한다. 상기 세포 표면 gp120은 바이러스 입자 표면에서의 gp120의 응집 상태와 유사한 올리고머 상태로 존재하는 것으로 생각된다. 그러므로, 세포 표면 발현형 gp120과 항체의 반응은 항체가 바이러스 입자 결합형 gp120을 인지하는 능력을 나타내기 위하여 수행되고 있다.

본 발명에 있어서, NIH AIDS 저장성 개체로부터 얻은 H9 세포는 5%의 CO₂하 RPMI/10% FCS에서 성장한다. 상기 세포들(10⁶/㎖)을 37℃에서 2시간 동안 HIV-1 균주 MN(AIDS 저장성 개체)를 함유하는 배양 상등액으로 감염시켰다. 상기 세포들을 세척시킨 후, 약 1주일동안 배양시켰다. 1mM의 DFP 존재하 둥근 바닥 96웰 플레이트에서 4℃, 4-6시간 동안 적당한 수의 원형 세포를 배양시킨후, 상기 세포들을 세 척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고, 퍼옥시다제가 결합된 토끼 항 마우스IgG과 함께 다시 배양하였으며, 상기 반응을 과산화수소 및 o-페닐렌디아민으로 진행시켜 ELISA 판독기를 사용하여 490nm에서의 흡광도를 정량함으로써 다양한 범위의 IgG의 결합 농도를 측정하였다. 대조군은 세포 표면 gp120과 반응을 하는 것으로 공지된 예비 면역성 IgG(preimmune IgG) 및 항체(NIH AIDS 저장성 개체로부터 수득가능)를 포함한다. 상기 세포들에 결합하는 항체는 또한 기술된 바와 같이 결합형 항 gp120 항체를 검출하기 위하여 형광성 2차 항체를 사용하는 유동성 세포계수측정법으로 연구될 수 있다. 이와 같은 방법은 항체 결합 비율 및 해리 비율을 측정함으로써 정확한 항체 결합 친화성을 측정할 수 있다.

경쟁 실험은 B-T 에피토프 구조물 또는 가용성의 전체 길이 gp120이 상기 세포에 항체를 결합시키는 경쟁적 리간드로서 작용 가능하도록 수행된다. 이전 단락에서 기술된 경쟁 연구법에서와 같이, B-T 에피토프의 IC50값은 항체가 B 에피토프에 결합하는 상대적 세기를 측정한다. 항체에 의한 gp120의 절단을 최소화시키기 위하여, 4℃에서 배양을 수행시킨다. 항체 촉매화 반응에 효과적인 억제제로서 작용하는 디이소프로필플루오로포스페이트는 또한 상기 배양물에 포함될 수 있다. 세포 생존율은 트리판 블루 제외 실험에 따라서 결합 반응의 마지막 시점에서 측정될 것인데, 이로써 상기 억제제( 및 기타 실험 조건)는 상기 gp120의 올리고머 구조를 파괴시킬 가능성이 있는 세포의 완전한 모습을 파괴시키지 않는다는 사실을 확인할 수 있다.

촉매 활성에 대한 스크리닝

단백질 G 세파로즈상에서 친화성 크로마토그래피에 의하여 혈청으로부터 정제된 IgG는 기질로서 비변형된 B-T 에피토프를 사용함으로써 촉매 활성에 대하여 스크리닝된다. 초기 스크리닝 검정법은 10μM의 기질과 0.25μM의 IgG를 1-2시간 동안 배양시킴으로써 수행된다. 분당 0.1회 이하씩 적당하게 회전시키면 생생성물은 약 3μM의 농도(초기 기질 농도의 30%)까지 축적된다. 상기 반응 혼합물은 역위상 HPLC(reversed-phase HPLC)에 의하여 214nm에서 검출함으로써 분석될 것이다(트리플루오로아세트산/아세트로니트릴 구배). 생성물 농도는 생성물이 나타내는 최상점의 아래 지역으로부터 측정된다. 대조군은 예비 면역화 IgG를 포함한다.

모든 IgG 시료들은 또한 전체 길이 gp120을 절단하여 스크리닝된다. ¹²⁵I-gp120이 기질이 된다. 클로르아민-T 방법에 의하여 gp120(CHO 세포에서 발현된 재조합 MN)을 방사능으로 표지시켰으며, 이후 분해성 FPLC에 의하여 전기 영동적으로 상동성인 ¹²⁵I-gp120을 수득하였다. SDS 전기영동 및 방사능 측정법을 적용시키면 생성물 밴드를 눈으로 확인할 수 있다. 신속하게 시료을 다룰 수 있는 방법이 기술되어 있다. 매일 약 50개의 IgG 시료를 활성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 표지되지 않은 gp120을 기질로 사용함으로써 상기 절단 반응은 상기 방사능 표지법과 관련된 인공적인 결과가 아니라는 사실을 확인할 수 있다. 이때, gp120의 다양한 단백질 분해 단편을 인지할 수 있는 항 gp120 항체로 상기 반응 혼합물의 SDS-PAGE 겔을 면역 블럿화시키는 방법이 적용된다.

촉매로서 사용된 IgG는 SDS-PAGE에 의하여 정제된다. 변성 조건(6M의 구아니 디늄 클로라이드)하에서 겔 여과법으로 제조된 F항체 분획 및 IgG가 촉매 활성을 보유한다는 사실로써 촉매 활성은 상기한 바와 같이 항체에 의한다는 사실을 확인할 수 있다[36].

본 검정법이 수행된 결과 인간 혈청이 존재할 경우 및 존재하지 않을 경우 단백질 분해효소 억제제가 촉매 항체 활성의 영향을 받은 혈청에서 발견되는지 여부가 평가될 수 있다. 예비적 연구 결과, 혈청은 낭창 혈청으로부터 정제된 항체에 의하여 gp120 또는 티로글로불린이 절단되지 않는 것으로 관찰되었다. 이러한 결과를 기초로 하였을때, 혈청 억제제 생성 항체들은 마우스에도 존재할 것으로 생각된다.

절단 부위 특이성
비변형된 B-T 에피토프 및 전체 길이 gp120을 절단하여 얻은 생성물 단편들이 동정될 것인데, 이로써 절단 부위를 추론할 수 있다. 전술한 바와 같이(1,2), N 말단 아미노산 시퀀싱 및 F항체 질량 분광법을 통하여, HPLC에 의하여 분리된 B-T 에피토프 단편들의 절단 부위들이 동정된다. 전체 길이 gp120 기질의 경우, 반응 생성물은 SDS 전기영동에 의하여 PDVF상에서 블럿화될 것이며, 상기 블럿화된 폴리펩타이드는 N 말단 시퀀싱되어 gp120 서열과 비교됨으로써 그의 절단 부위가 동정될 수 있다. 대조군은 예비 면역 마우스로부터 얻은 IgG를 포함한다.

트립신은 양성 대조군으로서 포함된다. 트립신은 Lys 또는 Arg 잔기에 의하여 인접하는 B-T 에피토프의 펩타이드 결합을 여러 부위에서, 즉 B 에피토프의 421-422번 잔기 및 432-433번 잔기와 T 에피토프의 833-834번 잔기 및 837-838번 잔기에서 절단시킬 것으로 예상된다. 이와는 대조적으로, 포스포네이트 또는 페닐포스포네이트 에스테르 구조의 존재로 인하여 항체의 촉매 활성을 보충하면,상기 결합은 주로 Lys432-Ala433 펩타이드 결합 부위에서 IgG에 의하여 절단된다. 이와 다른 결과가 관찰될 수도 있다. 항원 특이적 촉매는 바닥 상태의 항원으로 면역화시킴으로써 합성될 수 있다. 그러므로 예비 면역 저장성 개체에 존재하는 생식 세포 계열 암호화된 활성이 항원 에피토프의 전체 구조에 상관 없이 염기성 잔기를 인지할 수 있기 때문에, 432-433번 결합 이외의 펩타이드 결합 부위에서 기질을 절단할 수 있는 촉매가 발견될 수 있다[36, 40]. 432-433번 잔기에서 바람직하게 발생하는 절단 반응의 정도는 촉매 부위를 보충하는데에 있어서의 포스포네이트/페닐포스포네이트 에스테르 구조의 중요성을 시사하는 것이다. 이와 유사하게, 전체 길이 gp120의 절단이 421-436번 잔기내에 부위하는 펩타이드 결합에 한정되는 정도는 gp120에 특이적인 활성을 보충하는데 있어서의 상기 펩타이드 에피토프의 중요성을 시사하는 것이다.

기질 특이성

본 연구는 항체 촉매의 치료제로서의 용도를 평가하기 위하여 수행된다. 다수의 펩타이드 및 단백질 기질이 연구된다. 몇몇 방사능 표지된 폴리펩타이드들은 기질 특이적 거동을 연구하는데에 유용하다 : (a)¹²⁵I-알부민 ; (b)¹²⁵I-티로글로불린 ; (c)¹²⁵I-VIP; 및 (d) ¹²⁵I-IgG.

전기 영동 및 방사선 사진술에 의하여 눈으로 확인된 질량이 낮은 밴드의 출 현에 의하여 상기 단백질이 가수 분해 되었음을 알 수 있다. VIP 가수 분해 여부는 원형 펩타이드를 트리클로로아세트산으로 침전시키거나 또는 역위상 HPLC에 의하여 측정될 수 있다[2]. 랜덤하게 선택된 폴리펩타이드의 더욱 큰 패널(n>10; 예를 드어, 카세인, 콜라겐등과 같이 시판중인 폴리펩타이드)도 또한 억제 검정법으로 관찰될 것인데, 즉 상기 폴리펩타이드들이 촉매에 의하여 ¹²⁵I-gp120 가수분해를 억제시키는 능력에 의하여 검정된다. 상기 반응의 억제 여부는 120KD의 gp120 밴드의 소모가 감소된 결과에 의하여 파악된다.

반응 속도론

정확한 속도 상수 및 촉매 효율(k_CAT/k_m)을 측정하기 위하여 반응 속도 연구가 수행된다. 비변형된 B-T 에피토프 및 전체 길이의 gp120이 기질로서 사용된다. 상기 반응 속도 상수는 다양한 기질 농도에서 수행된 검정법으로부터 측정된다. 상기 혈청이 상기 에피토프와 결합 가능한 비촉매성 항체와 혼합된 촉매성 항체를 포함하면, 바인더는 상기 에피토프가 촉매화 물질에 의하여 절단되는 것으로부터 보호할 수 있다. 이들 2개의 풀(pool_사이에서 분화시키기 위하여, 상기 혈청 IgG는 촉매성 항체 및 비촉매성 항체와 결합할 수 있는 고정된 억제제상으로 흡착된다. 이러한 억제제들이 유용하다. 이러한 억제제들은 gp120 에피토프를 포함하지 않기 때문에, 이들은 상기 gp120 B-T 에피토프로 면역화시킴으로써 유도된 비촉매성 항체들과 결합하지 않는다. 바이오틴이 상기 억제제에 부착되어 아비딘 피복된 플레이트를 사용하여 고정될 수 있다. 과량의 고정화된 억제제로 면역화된 마우스로부 터 얻은 혈청 IgG를 배양시킨후, 상등액을 비변형성 B-T 에피토프와의 결합 여부에 대하여 ELISA로 분석시킨다. 결합이 일어나지 않았음은 상기 에피토프에 대한 비촉매성 항체가 상당한 양으로 존재하지 않음을 시사하는 것이다. 뿐만 아니라, 결합된 항체들은 pH 9 이상이며, 항체 및 억제제 사이의 공유 결합을 절단할 수 있는 히드록실아민으로 용리될 수 있다. 상기 B-T 에피토프에 대한 비촉매성 항체에 결함이 발생할 것으로 보이는, 용리된 항체들은 동역학적 파라미터에 대해서 분석될 수 있다.

Km값이 nM 또는 그 이하라는 사실은 고친화성 항원 결합 활성을 나타내는 것이다.

2개의 기질에 대한 Km 및 kcat값이 동등하다는 사실은 합성 면역원에 부위하는 421-436번 잔기가 gp120의 형태와 유사한 형태를 취한다는 사실을 시사하는 것이다. 정확한 속도 상수값에 있어서, IgG 제제물은 폴리클로날성 항체 제제물을 사용하여 이전에 관찰한 결과보다 더욱 신속한 대사 회전 속도를 나타낼 것인데, 왜냐하면 본 발명의 면역원은 상기 면역화과정중 촉매 부위를 보충하고 개선시키도록 디자인되기 때문이다.

상기 에피토프의 포스포네이트 및 포스포네이트 에스테르에 의한 비변형된 B-T 에피토프의 IgG 촉매성 절단의 억제 여부도 또한 평가된다. 가수 분해가 감소된 사실은 상기 포스포네이트 및 포스포네이트 에스테르 펩타이드가 상기 B-T 에피토프 결합의 경쟁적 억제제가고/또는 대체성 기질로서 사용됨을 시사하는 것이다. 억제 현상이 관찰되면, K₁값이 측정되어 B-T 에피토프와 IgG 및 이들의 TSA/CRAA의 상대적인 반응성을 평가하게 된다. 상기 TSA/CRAA가 기질로서 사용되는지의 여부를 측정하기 위하여, 단백질 생성물을 RP-HPLC 분리시키고 아미노산 시퀀싱에 의한 펩타이드 생성물을 동정하여 이들이 IgG에 의하여 절단되었는지 여부를 연구한다. 만일 상기 촉매가 다수의 펩타이드 결합을 여러군데에서 랜덤하게 절단할 수 있으면, 상기 TSA/CRAA 펩타이드는 상기 촉매에 의하여 절단될 수 있다. 한편, 상기 항체가 Lys432-Ala433 결합의 외부를 절단하면, TSA/CRAA는 상기 부위에 절단할 수 없는 펩티드 결합의 유사체를 포함하기 때문에 이들 TSA/CRAA는 기질로서 사용되지 않는다.

세포 표면 발현성 gp120의 절단

촉매 항체 활성이 생물학적으로 적당한 형태, 즉 바이러스 입자의 결합형 올리고머 gp120으로 유도된다는 사실을 확인하기 위하여, 세포 표면에 발현된 합성 방사능 표지성 gp120이 기질로서 사용된다. HIV 감염된 H9 세포들을 ³⁵S 표지된 메티오닌(Met 결핍 배지)에서 생장시키면 gp120이 방사능으로 표지된다. 상기 세포들은 예비 면역된 마우스 및 면역화된 마우스로부터 수득된 다양한 범위의 농도의 IgG 분획으로 처리된다. 세포 추출물은 연성 세제(0.1% Triton-X-100)를 사용하여 제조되는데, 이는 방사능 표지된 gp120을 상청액으로 방출시키기에 충분하다. 상기 gp120(및 이의 단편)은 단백질의 다양한 트립형 단편에 결합하는 것으로 공지되어 있는 유용한 토끼 항 gp120 항체를 사용하여 상기 세포 추출물로부터 면역 침강될 것이다[35]. 상기 반응 생성물을 정제하는데에 SDS 전기 영동법이 사용된다. 상기 원형 gp120 밴드가 사라지고 질량이 낮은 단편이 나타나는 것으로 보아, 세포 표면 결합형 gp120이 절단되었음을 알 수 있다. 대조군은 면역화시키지 않은 토끼 IgG로 면역 침전된 세포 추출물을 포함할 것인데, 이때 방사능은 검출되지 않는다. 항 gp120 항체를 사용한 면역 블럿화는 상기 면역 침강된 물질에 gp120 단편이 존재한다는 것을 확인시켜주는 것이다.

항체가 HIV-1의 표면에 발현된 gp120의 형태를 인지한다는 확인 실험이 또한 수행된다. 이때 기질로서는 설탕 농도 구배로 정제된 MN 바이러스 제제물(Advanced Biotechnologies社)이 사용된다. 이후 상기 바이러스를 상기 항체와 함께 배양시킨후, gp120은 세포 표면 발현형 gp120의 경우에서와 같이 gp120 절단 단편에 결합하는 것으로 공지된 항 gp120 항체로 세제 추출법, 전기 영동 및 면역 블럿화를 수행하여 절단되는 것으로 관찰된다.

gp120내 표적화된 에피토프가 CD4 결합 부위의 일부분이며 상기 단백질 표면에 발현되는 것으로 추측되기 때문에(상기 단백질의 내부에 파묻혀 있는 것과는 대조적으로), B-T 에피토프 면역원에 의한 면역화는 전체 길이의 가용성 및 세포 표면 발현성 gp120에 결합하는 항체들을 도출해 낼 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 표적화된 에피토프는 상이한 HIV 균주들내에서 보존적이다. 그러므로, 활성이 광범위한 항체들이 합성될 것으로 예상된다

자가면역화되지 않은 마우스로부터 얻은 예비 면역화된 IgG는 gp120내 표적화된 에피토프의 절단을 촉매화시키는 능력이 결여되어 있다. 이와 유사하게, 비변형성 B-T 에피토프로 면역화된 비자가면역성 마우스로부터 얻은 IgG는 gp120 절단 활성을 거의 나타내지 않는다.

자가면역성 마우스로부터 얻은 예비 면역화된 IgG는 낮은 gp120 절단 활성을 나타낼 것이나, 상기 활성은 gp120에 매우 특이적이다. 자가면역성 마우스를 비변형성 B-T 에피토프로 면역화시킴으로써 gp120에 특이적인 촉매 활성을 가질것으로 보이지만, 면역원의 구조로 판단하건대 촉매 대사 회전 속도는 개선되지 않는 것으로 예상된다. 이와는 대조적으로, 상기 B-T 에피토프 TSA 및 CRAA는 바닥 상태의 gp120과 펩타이드 결합 절단 반응의 전이 상태에 결합하는 능력과 관련된 항체 합성 반응을 촉진시키도록 디자인된다. 그러므로, 상기 TSA 및 CRAA 면역화는 고친화도로 gp120과 결합하며(낮은 Km 및 Kd값) 대사 회전 속도는 급속한(정확한 Kcat) 항체 합성을 도출시킬 것으로 예상된다. 뿐만 아니라, B-T 에피토프의 유사체로 자가면역성 마우스를 면역화시킴으로써 예비 면역화된 상태에서 볼 수 있는 불규칙적인 촉매 활성을 특정화시켜 표적화된 gp120 에피토프(잔기 421-436)를 인지할 수 있도록 만든다.

B10.BR 마우스(비자가면역성 마우스)를 TSA 및 CRAA로 면역화시킴으로써 비자가면역 상태에서의 촉매성 항체 합성을 제한하는 억제 기작을 압도할 수 있다. 상기 실험의 목적은 숙주의 상태가 자가면역 상태이건 비자가면역 상태이건 간에, 숙주를 감염으로부터 보호해 주는 백신을 개발하는 것이므로, 상기 실험은 HIV 백신을 개발하는 데에 적합하다.

상기 B-T 에피토프의 포스포네이트 에스테르는 포스포네이트 B-T 에피토프에서보다 더욱 강력한 촉매활성을 나타낼 것으로 보여지는데, 왜냐하면 전자의 면역원은 친핵성 Ser/Thr 잔기를 함유하는 항체를 합성하는 B 세포의 클론 증식을 촉진 시킬 것이기 때문인데, 이는 생식 세포 계열 VL 유전자에 의해 암호화된 기존의 촉매 부위의 특징이다. 한편, 상기 포스포네이트 B-T 에피토프는 전이 상태의 산화 카르보닐상에서 음전하의 발생을 안정화시키는 산소 음이온 홀(서브틸리신의 Asn255와 같은)을 포함하는 항체를 보충하도록 디자인된다. 산소 음이온 안정화가 생식 세포 계열 암호화 촉매에 의한 촉매 작용에 영향력이 있다는 사실을 입증할 만한 증거는 존재하지 않는다. 그러나, V 지역 체세포 다양화 기작(과잉 돌연변이(hypermutation), V-J/V-D-J 재조합 및 VL/VH 쌍형성 다양화)은 촉매 부위를 새로이 진화시킬 수 있는 유력한 기작이다. 생식 세포 계열 친핵성 부위와 체세포 분화된 산소 음이온 홀을 결합시키는 항체의 개발은 유용하다. 이러한 친핵성, 산소 음이온 안정화 부위는 비항체성 세린 단백질 분해효소에 의한 효과적 촉매 작용에 대하여 영향력을 갖는다. 제시된 이종 면역화, 즉 항체 합성이 포스포네이트 B-T 에피토프 및 포스포네이트 B-T 에피토프에 의하여 순차적으로 유도되는 경우, 대사 회전 속도가 높은 gp120 특이적 촉매의 합성을 촉진시킨다. 상기 이종성 면역화는 또한 포스포네이트 에스테르의 공유적, 친핵 반응성에 의하여 친핵성 부위를 암호화하는 항체 생식 세포 계열 유전자를 보충시켜, 면역 응답 과정중 산소음이온 안정화 구조의 체세포를 분화시킨다.

포스포네이트 B-T 에피토프 TSA 및 포스포네이트 B-T 에스테르 에피토프 CRAA에 의하여 유발된 항체의 중화 활성과 비변형성 B-T 에피토프에 의하여 추정되는 항 gp120 항체의 HIV 중화 활성의 비교

CD4에 gp120이 결합하면 HIV-1에 의한 세포 감염이 개시된다. 결합 부위는 gp120의 CD4 결합 지역에 부위하며 상기 결합의 트립신에 의한 절단은 CD4에 의한 용액 상 gp120 결합을 억제하는 것으로 이미 밝힌 바에 따르면, gp120을 432-433번 결합에서 절단시키면 세포에 HIV-1이 결합되는 것을 효과적으로 차단할 것이다[35].

항체
대조군 B-T 에피토프 구성물(비변형성 펩타이드), 포스포네이트 B-T 에피토프(TSA), 포스포네이트 B-T 에피토프(CRAA) 및 상기 포스포네이트 및 포스포네이트 에스테르 B-T 에피토프의 조합(TSA+CRAA)으로 면역화시키는 과정중 여러 시점의 마우스로부터 얻은 정제된 IgG 시료이 비교된다. 상기 모든 면역화 과정으로부터 얻은 과면역성 IgG는 고친화성 gp120이 결합 가능하다. 상기 촉매 활성은 2가지 종의 마우스를 TSA/CRAA 면역화시킴으로써 얻은 IgG에 존재하는 것으로 예상된다.

HIV-1 중화
우선, 면역화의 다양한 시점의 단계에 있는 모든 마우스로부터 얻은 결합된 IgG 시료는 표준적인 실험실 균주(HIV-1 MN)를 사용하는 특성화가 잘 되었으며, 정량적인, T 세포주 검정법에서 스크리닝된다. 상기 면역화 과정의 마지막 단계에서 얻은 과면역성 IgG를 사용하여 추가의 연구가 수행된다. 대조군은 IgG의 비특이적 독성 효과의 가능성을 배제하기 위하여 HIV-1를 첨가하지 않은 상태로 IgG와 배양된 세포를 포함한다. 상기 IgG 시료은 첫번째 세포형으로서 혈액 유도성 PHA 활성화된 림프구를 그리고 두번째 세포형으로서 혈액 유도성 대식 세포를 사용하여 분석된다. 단일의 이원성 자극 1차 분리 물질인 HIV-1 ADA는 1차 세포 검정법에 사용되는 바이러스 분리 물질이다. 상기와 같이 두가지 형태의 세포를 사용하는 이유는 상이한 세포형 및 바이러스형에 특이적인 특정 에피토프에 존재할 수 있는 임의의 중화/불활성화의 활성을 간과하지 않도록 하기 위해서이다. 인자의 수가 분리주로부터 얻은 실험실 균주의 중화에 미묘한 차이를 나타내는데에 유력한 영향을 미친다는 사실은 이전의 연구 결과에 의하여 자명해진 사실이다. 중화 활성을 나타내는 항체 시료들은 이들의 V3 및 CD4 억제성 인간 모노클로날에 대한 영향에 대해서 직접적으로 비교될 것이며 또한 HIV-1 양성 인간 폴리클로날성 혈청을 우수하게 특징화시킨다. 뿐만 아니라, 이들 항체들은 다수의 1차 세포 형태에서의 광범위한 항원성 하위 형태/분기형에 대한 작용 단계, 작용 기작, 가역성 및 중화 활성의 범위에 대해서 추가로 평가된다.

시험될 IgG는 비촉매성 항 gp120(비변형성 B-T 에피토프로 면역화된 비자가면역성 마우스로부터 얻은 것) 및 촉매성 항 gp120 IgG 제제물(예를 들어, B-T 에피토프의 TSA/CRAA로 면역화된 마우스로부터 얻은 것)을 포함한다. gp120내 표적화된 B 에피토프는 CD4 결합에 필수적이므로, 본 발명의 IgG 제제물내의 비촉매성 항체들 조차도 HIV-1의 중화를 억제할 것으로 예상된다. 상기 항체들의 충분한 역가가 유도되었다고 가정하면, 마우스의 각 실험군으로부터 얻은 과면역화된 IgG는 HIV-1의 감염능을 억제할 수 있다.

촉매성 Fv 구조물 및 하나의 비촉매성 Fv 구조물의 동종 제제물은 HIV-1 중화 활성에 대하여 비교된다. 이로부터 폴리클로날성 IgG 연구로부터 얻어진 결과를 확인할 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 Fv 구조물은 Fc 도메인이 결여되어 있기 때문에, 보체 결합 및 Fc 수용체 결합과 같은 현상들은 일어나지 않는다. 그러므로 이와 같은 현상으로 인하여 증진된 HIV-1(enhanced HIV-1)에 의한 감염이 발생되지 않음을 상기 Fv 구조물을 사용함으로써 확인할 수 있다.

촉매성 항체들의 주요 이점은 이들이 비촉매성 항체들에 비하여 항체들을 더욱 강하게 그리고 비가역적으로 중화시킬 수 있다는 점이다. 본 발명에 있어서, 촉매성 IgG 시료들은 비촉매성 IgG 시료보다 낮은 몇몇 농도에서 잠재적인 HIV-1 중화 현상을 나타낸다. 촉매에 의하여 표적화된 에피토프는 gp120의 CD4 결합 부위의 성분이다. 뿐만 아니라, 트립신에 의하여 표적화된 결합(Lys432-Ala433)이 절단되면 CD4에 gp120이 결합하는 것을 차단하게 된다는 것이 밝혀진 바 있다. 상기 CD4 결합 부위는 HIV-1의 상이한 균주 및 하위 형태들간에 보존되는 성향이 있다. 그러므로, 본 발명의 항 gp120 촉매는 HIV 감염과 같은 감염성 질병 치료에 유익한 치료 도구를 제공한다.

실시예 III
허혈성 재관류 손상 및 패혈증성 쇼크/SIRS Larry I에서의 CRAA 및 촉매성 항체의 용도(본 절에 대한 참고 자료로서 제시)

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허혈성 재관류 손상은 조직에 공급되는 혈액이 장기간 방해되어(허혈) 반송될 때(재관류) 발생되는 질병이다. 상기와 같은 형태의 손상은 손상된 조직에 혈류를 반송시키는 치료법 수행 이후에 심장 마비 및 뇌졸증 환자 모두에 악영향을 준다. 허혈, 구체적으로 재관류는 프로그래밍된 세포 사멸을 유도시킴으로써 염증성 응답 및 손상을 일으키는 임의의 인자인 조직으로 방출되는 것과 관련된 것이다.

패혈증성 쇼크(septic shock) 및 전신 염증성 응답 징후(Systemic Inflammatory Response Syndrome;SIRS)는 궁극적으로는 허파로부터 시작되는 예측 가능한 순서로 발생하는 혈액의 역동적 변화(hemodynamic change), 염증 및 주요 기관을 파괴시키는 현상을 포함하는, 태아에서 종종 볼 수 있는 증상을 일컫는 용어이다. 상기 패혈증성 쇼크 징후는 근본적으로는 오로지 그램 음성 세균 감염 및 내독소의 영향과 관련되지만, 결과적으로는 사고 결과 발생되는 조직의 과도 손상과 같은, 다수의 기타 의학적 문제점들은 감염이 발생하지 않는 SIRS에서와 동일한 증상을 개시하는 것으로 알려져 있다. 상기 양 증상에서 관찰되는 다수의 기관 손상은 프로그래밍된 세포의 사멸과 매우 밀접한 관계를 가지며 주로 상기 세포 사멸에 의하여 발생된다.

허혈 재관류 손상

이러한 이상 형상에서 프로그래밍된 세포 사멸을 유도시키는 4개의 주요 가용성 인자들은 인터루킨 1 베타(IL-1) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF)를 유도하고 또한 유도되기도 하는 반응성 산소 종(ROS) 및 질산(과산화아질산염-->히드록시 ROS)이다.

허혈 재관류 손상 및 패혈증성 쇼크/SIRS에 프로그래밍된 세포 사멸이 관여하는 것으로 보아, 이상에 언급된 가용성 인자들이 의료 비상 사태의 양 경우에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각되며 이는 병리 생리학적 유사성을 뒷받침해 주는 것이다.

본 발명의 신규의 CRAA는 허혈 재관류 손상, 패혈증성 쇼크/SIRS 및 급성 호흡기 이상 증상(ARDS) 치료 및 류마치스성 관절연과 같은 기타 염증성 이상 치료 그리고 신경 장애 치료를 위하여 IL-1 및 TNF를 절단하는 촉매성 항체를 개발하는데에 사용될 수 있다.

허혈 재관류 손상

허혈 조직에 혈류를 신속하게 복귀시키는 것은 산소 및 영양 공급이 중단되 결과로 발생하는 세포 손상의 진행을 정지시키는 데에 중요한 역할을 한다. 역설적으로, 허혈 조직에 혈류를 재구성시키는 것은 추가의 조직 손상을 초래한다. 예를 들어, 내장의 허혈 상태를 4시간 동안 지속시킨 경우는 결과적으로 3시간 동안 허혈 상태를 지속시키고 1시간 동안 재관류 상태를 유지시킨 경우보다 손상이 적다는 사실이 실험적으로 증명된 바 있다[47, 48]. 전체의 조직 손상에 대하여 상기 재관류 상태가 갖는 중요성은 허혈 상태에서 개시되는 치료학적 조정 현상은 재관류가 시작될 때 개시되는 현상과 같이 효과적이라는 것을 나타내는 다수의 연구를 통하여 밝혀져 왔다[49, 50, 51, 52]. 허혈 손상를 받은 조직은 곧 프로그래밍된 세포 사멸을 수행하는 세포 지역에 의하여 포위된 괴사성 세포 사멸 지역을 나타낸다[53, 54, 55].

허혈 조직은 손상를 나타내는 재관류시 산소 분자에 노출되어야 한다는 사실은 이미 잘 알려진 사실이다[56-61].

허혈 및 재관류 손상의 병인론을 설명해주는 몇가지 기작들이 가설화되어 있으나 대부분의 관심은 ROS에 집중되어 있다. ROS란 1개, 2개 또는 3개의 전자들 각각에 의하여 환원된 수퍼옥시드, 과산화수소 및 히드록시기를 포함하는 음전하를 띄는 산소 분자로부터 유도된 임의의 화합물을 일컫는다.

허혈 및 재관류 손상에 있어서, 이하의 사항들을 포함하는 다수의 증거에는 ROS가 포함된다 :1) 전자 스핀 공명 및 스핀 트랩핑[62, 63] 및 니트로블루 테트라졸리움 환원, 화학 발광 및 살리실레이트 트랩핑에 의하여 허혈 조직에서 ROS가 생산되는 것이 감지된다. 2) 허혈 재관류 손상의 부재하 조직을 ROS에 노출시키면 국소 비혈 재관류 손상 자체와 유사한 병인성 변화를 유발시킨다. 3) ROS를 화학적으로 제거하고 ROS 생성을 제한시키는 제제로 처리하면 허혈 재관류 손상로 인한 손상을 상당히 감소시킨다[68, 69].

허혈증의 초기 영향중의 하나는 발병 조직에 ATP가 고갈되는 것인데, 이로써 세포막이 이온을 투과시킬 수 있도록 함과 동시에 칼슘의 격리를 비효율적으로 만들어 준다. 결과적으로 세포질 칼슘이 증가하게 되면 칼슘 의존성 포스포리파제 및 단백질 분해 효소의 활성이 촉진되며 그 결과 생성된 중요한 생성물은 크산틴 탈수소효소를 크산틴 산화효소로 전환시킨다[70]. 크산틴 산화 효소는 기관지 세포 및 내피 세포에서 발견되며, ROS 수퍼옥시드를 생성시킴과 아울러, 과산화수소를 직간접적으로 생성시킨다. 크산틴 산화효소를 억제시키면 허혈증 재관류 손상에 의하여 유발된 손상을 감소시킨다는 사실은 병인성에 기여하는 효소가 ROS를 생성시키는 사실을 뒷받침해 주는 것이다.

포스파티딜에탄올아민의 감소, 인지질의 분해 및 유리 지방산의 해리는 허혈증 조직에서 발생된다. 재관류가 시작될 때 구체적으로 아라키돈산과 같은 유리 지방산이 신속하게 이용되는데, 이로써 지방 산화효소 경로 및 시클로 산화효소 경로 가 촉진되어 ROS를 생성시킨다. 시클로 산화효소 억제제는 허혈증 재관류 손상로 인한 조직 손상을 감소시키는데에 유용하다.

산화질소는 내피 조직에 의하여 계속적으로 방출되는 매우 반응성이 활발한 화학종이다[71]. 이는 미소 순환계가 혈관 확장 및 혈관 불투과성을 활발히 나타내도록 만들어주며 내피 세포에 혈소판 및 백혈구가 부착되는 것을 방지한다. 이는 본질적으로 활성인 내피 합성 효소에 의하여 L-아르기닌으로부터 효소적으로 합성되며 또한 N^G-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르(L-NAME)와 같은 L-아르기닌 유사체에 의하여 생성을 억제할 수 있다. 관상 맥관 구조에서 L-NAME과 같은 억제제로 산화 질소 생성을 억제시키면 혈관 수축에 의한 심근 허혈증을 유발시킬 수 있다[72]. 그러나, 산화 질소 합성 억제제가 실질적으로 허혈 재관류 손상와 관련된 조직 손상의 정도를 감소시킬 수 있다는 증거가 실실적으로 존재한다[73, 74].

산화 질소 합성 효소의 유도형은 허혈증 재관류 손상시 상기 분자의 수준을 증가시키는 데에 영향력을 갖는다. 유도 인자로서는 허혈 고열 발생시 염증성 시토킨, 향정신성 아미노산, 및 혈류 관련 혈관 확장을 포함한다. Noiri외 다수는 유도성 산화질소 합성 효소 유전자의 안티센스 올리고 표적화 전사물은 상기 유전자들의 발현을 감소시킬 수 있다고 기술하였다[75]. 전신에 투여될 경우, 상기 올리고는 신장에 의하여 흡수되며 실험적으로 래트의 신장에 허혈증을 발생시킴으로써 유발되는 신장의 손상을 상당히 감소시켰다.

산화질소는 수퍼옥시드 음이온과 결합되어 독성의 유리기인 과산화아질산염을 생성시키며, 그 결과 허혈 재관류 손상의 주요 인자로서 생각되는 ROS, 히드록 시기를 생성시킨다[74]. 산소 분자를 수퍼옥시드로 환원시키는 반응은 미토콘드리아 운반 시스템의 모든 호기적 호흡 세포에서 일어난다.

산화질소는 또한 다수의 생리적 및 실험적 환경하에서 프로그래밍된 세포 사멸을 유도하는 것으로 보인다. 높은 수준의 산화질소 생성을 활성화시키면 병원체 및 종양 세포를 침략하는데에 있어서 제일선의 방어막을 형성시키도록 돕는다.

허혈증 재관류 손상 영역에 ROS가 방출되는 경우에는 염증성 백혈구를 유도시키는데, 이후 추가로 방출된 ROS를 포함하는 세포 독성이 축적되어 조직 손상을 일으킬 수 있는 것이다. 다수의 연구를 수행한 결과, 1) 허혈증 재관류 손상 영역으로의 백혈구의 축적, 및 2) 순환성 호중구의 소모 또는 호중구 활성화를 방지하는 제제의 사용이 종종 허혈증 재관류 손상와 관련된 조직 손상을 감소시킬 수 있다는 사실이 밝혀졌다.

프로그래밍된 세포 사멸의 최종 상태는 ICE 군에 속하는 효소 세트를 포함한다. 상기 몇몇 효소들을 억제시킬 수 있는 펩타이드는 설치류에 있어서 일시적 중앙 대뇌 동맥 폐색 현상을 원인으로 하는 허혈성 뇌 손상을 감소시키며 결과적으로 행동 결합을 상당 수준 개선시키는 것으로 보인다[76]. 후자의 관찰 결과는 허혈성 신경 조직의 기능 회복이 세포 사멸 프로그램이 완결되는 것을 막아주는 치료를 수반할 수 있다는 사실을 말해주는 것이다. 허혈 이후 재관류 손상이 발생하는 경우에서 기능 회복의 정도가 더욱 크다는 사실을 추정할 수 있다.

프로그래밍된 세포 사멸은 허혈 재관류 손상에 의하여 손상을 받은 조직에 편재하는 특징이라는 사실이 다수의 연구에 의하여 밝혀졌다[53, 54, 55].

유도성 산화질소 합성 효소의 유도 수준은 래트 심장 세포의 프로그래밍된 사멸과 양의 상관 관계가 있음이 Sz항체olcs외 다수에 의하여 밝혀진 바 있다[77]. 심장 조직은 심장 동종 이식편 거부의 모델로서 Lewis에서 Wistar-Furth 래트로 이식되는 반면에, 대조군로서는 Lewis에서 Lewis로의 이식편이 사용되었다. 프로그래밍된 세포 사멸을 진행시키는 심장 근세포의 수는 이식후 3일 내지 5일 경과후 월등히 증가되었다. 5일 경과시 동종 이식편은 친연성 이식편에 비해서 근세포, 즉 프로그래밍된 세포 사멸을 진행시키는 내피 및 대식 세포가 월등히 증가하였다. 유도성 산화질소 합성 효소 mRNA, 단백질 및 효소 활성의 발현은 심장 근세포의 프로그래밍된 세포 사멸과 함께 시간 및 정도와 비례하여 증가하는 것으로 보인다. 유도성 산화질소 생성이 증가된 영역 역시 니트로티로신을 발현시키는 것으로 밝혀 졌는데, 이는 곧 과산화질산염 형성의 지표가 된다.

다수의 증거에 의하여 인터루킨-1 베타(IL-1) 및 종양 괴사 인자 알파(TNF)는 허혈 재관류 손상를 진행시키는 데에 중요한 역할을 담당한다는 사실이 뒷받침되었다.

양자의 후염증성 시토킨의 생성 현상은 일련의 단핵구/대식 세포의 활성화와 관련되는 것으로 보이는데, 이는 크산틴 산화효소 유도성 산소기를 활성화시킴으로써 발생한다.

IL-1은 1940년대에 발견된 것으로서 동물에 주사되었을때 최초로 열을 발생시키는 것으로 간주되었다. 1970년대 초반, IL-1은 호중구증다증을 포함하는 동물에 주입되었는데, 항미생물 응답이 고조되었고, 간의 악성 반응물의 합성이 증가되었으며, 콜로니 자극 인자를 유도시킬 때 다수의 기타 생물학적 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 뿐만 아니라 배양액내 유사분열 물질에 대한 T 세포 응답을 촉진시키고 아쥬반트로서 작용을 하는 것으로도 밝혀졌다.

클로닝 연구법은 IL-1이 IL-1 알파, IL-1 베타 및 IL-1ra로 구성된 3원성군을 설명해준다. 처음의 2개는 아고니스트이며 나머지 하나는 안타고니스트이다. IL-1 알파는 IL-1 베타가 시토킨으로서 방출되고 본문에서 언급된 바와 같은 형태일때 세포막상에 집중화(localization)된다. 이것은 절단되어야 활성화될 수 있는 전구체로서 합성된다. 상기 효소들중 가장 특이한 것은 프로그래밍된 세포 사멸의 최종 상태에서 활성을 나타내는 효소의 무리와 밀접하게 관련된 인터루킨-1 베타 전환 효소(Interleukin-1 beta Converting Enzyme;ICE)이다.

IL-1 발현은 망막, 간, 골격근 및 내장에서의 허혈 재관류 손상가 발생하는 영역에서 설명되고 있다. IL-1 및 TNF의 발현은 뇌와 심장의 경우에서 유사하게 설명된다. Hera외 다수에 의하여 사용된[76] 설치류 모델에서, IL-1 발현은 중앙 대뇌 동맥을 가역적으로 실험에 의하여 폐색시킨후 30-60분 경과시 최상점에 도달하였으며 그후 다시 감소되었다. 래트의 신장 근세포를 IL-1으로 처리하면 산화질소 합성효소의 전사가 유발되었으며 단백질 키나제 A 의존성 경로에 의하여 효소의 발현이 증가되었다. IL-1은 또한 뇌 내피 세포에서 상기 효소 합성을 유도시키는 것으로 보인다. 이와 유사하게 IL-1 및 TNF는 심장 및 간의 산화질소 합성 효소의 합성을 유도시키는 것으로 보인다. 전술된 바와 같이, ROS는 유전자를 손상시켜 프로그래밍된 사멸을 진행시킬 수 있는 p53의 발현을 유도한다.

IL-1은 또한 IL-6과 같은 기타의 후염증성 시토킨(inflammatory cytokine)의 발현을 유도시킨다. 어떤 경우에는 TNF의 효능을 매개할 수도 있는 전사 인자 NF-kB에 의하여 상기 유도가 매개된다. IL-1 및 TNF 사이 및 IL-1 및 IL-6 사이에서 종종 관찰되는 상승 작용은 부분적으로는 상기 3가지 시토킨 모두에 응답하는 세포 군집내 시그널 전달 경로가 상당히 중복되어 있다는 사실에 기초하여 설명될 수 있다.

간 허혈성 재관류 손상가 진행되고 있는 래트에 IL-1ra처리하였을 경우는 TNF생성, 조직 손상 및 사멸을 감소시키는 것으로 보인다[78]. 허혈은 래트의 간에 있는 좌측엽 및 중앙엽의 혈관을 90분 동안 겸자시켜주었을 때 유도되었다. 첫 세트의 실험에서, IL-1ra을 허혈이 유도되기 이전 5분 동안 전신에 투여하였는데, 이때 TNF의 수준은 재관류가 시작된 이후의 여러 시점에서 측정되었다. 허혈이 시작된지 4시간 30분이 경과하였을 때 실험을 종료시킨 대조군 동물에서는 양 조직의 TNF 수준은 재관류가 계속 진행됨에 따라서 증가하는 것으로 관찰되었다. 이와는 대조적으로, IL-1ra처리시에는 양 조직에서의 TNF 수준은 감소되었다. 해부학적 관찰에 따르면 IL-1ra를 처리한 경우에는 실질적으로 대조군에 비해서 간 손상이 적었다.

두번째 세트의 실험에서는, 허혈이 종결된 이후 처리되지 않은 간의 우측엽 및 미상엽을 제거하였다. IL-1ra로 처리된 개체의 사멸률은 30%에 달하는 것에 비하여 대조군 동물의 사멸률은 80%에 달하였다.

이와 유사한 연구에서는, IL-1ra 처리 및 자연 발생적 IL-1ra 처리는 래트의 뇌조직이 허혈 재관류 손상 유발성 손상을 입지 않도록 보호해 주었다.

상기 뇌의 허혈 재관류 손상에 있어서의 TNF의 역할이 관찰되었다. 첫 세트의 실험에서, TNF의 다양한 복용량을 중앙 대뇌 동맥이 폐색되기 이전 80분 또는 160분 동안(일시적) 또는 본 실험 종료후 24시간 경과시까지(영구적) 래트의 대뇌 내부 혈관에 투여하였다. 어떤 그룹에서는 TNF를 주사하기 30분전에 TNF 중화 항체를 투여하였다. 외인성 TNF를 투여하였을 경우는 영구적 폐색 현상에 의하여 초기의 크기가 상당히 복용량 의존적으로 증가(32%)하였다. TNF를 높은 복용량(25pmol)으로 처리하였을 경우는 상기 두가지 경우의 일시적 폐색 그룹의 크기를 초기의 크기보다 각각 100% 및 34% 증가시켰다. 상기와 같은 외인성 TNF 항체의 모든 효과는 TNF 항체로 예비적으로 처리된 동물에서는 찾아볼 수 없었다.

다른 세트의 실험에서, 내인성 TNF를 차단시키는 효과는 영구적 폐색후 3시간 또는 6시간 경과시 또는 30분 이전에 투여된 중화 항체 또는 가용성 TNF 수용체(sTNF-RI)로 상기 TNF 기능을 차단시킴으로써 평가되었다. 폐색 이전 또는 이후에 TNF 기능을 차단시킴으로써 억제제 복용량 의존성인 원래의 크기는 26% 이하로 감소되었다.

TNF는 부분적으로 허혈 재관류 손상의 재관류 상태와 관련이 있는 간 손상을 매개한다. 간 TNF 생성은 ROS를 방출시키는 발병 부위에서의 호중구 격리 및 활성화에 영향력을 가졌다.

중화 TNF 항체로 수동 면역화되면 이와같은 병인성 효과를 상당히 억제시킬 수 있었다. 또한 배양된 간세포에 투여된 TNF는 동시에 처리된 ROS의 독성을 강화 시킨다는 사실이 밝혀진바 있다. 이와 유사하게, 중화 TNF 항체는 래트 모델에서 상부 장간막 동맥이 45분동안 폐색되어 급성 허혈 재관류 손상이 유발된 이후 심장 혈관의 기능을 감소시키고 생존률을 증가시킨다는 것이 밝혀졌다.

패혈증성 쇼크/SIRS

병인학과는 별도로, 허혈 재관류 손상 및 패혈증성 쇼크/SIRS에서 발생하는 기본적인 병리학적 효과는 매우 유사하지만, 전자의 경우에 있어서의 병상은 국부적인 반면에 후자의 경우에 있어서의 병상은 전신적으로서, 허파로부터 시작되는 다수의 기관이 파괴되는 것을 종결시킬 수 있다. 양 그룹에서 상기 이상 현상을 나타내는 주요 인자는 ROS, 산화질소, IL-1, TNF 및 프로그래밍된 세포의 사멸이다.

이 분야에서의 대부분의 실험 연구법에 있어서, 상기 증상은 세균 또는 세균 생성물을 사용함으로써, 유도되기 쉽기 때문에 패혈증성 쇼크가 수반된다. 환자에서 패혈증성 쇼크/SIRS와 관련된 연구법에서 밝혀진 병리학적 변화는 상기 증상이 후염증성 매개체의 캐스캐이드식 작용에 의하여 진행된다는 사실을 설명한다. 일반적으로 상기 캐스캐이드는 대식 세포 및 기타 염증성 세포에 의하여 처음 방출되는 IL-1 및 TNF에 의하여 개시된다. IL-1은 또한 IL-1에 대한 수용체가 존재하는 기타 다양한 세포 형태 및 대부분의 세포 개체에 의하여 생성된다. IL-1 생성은 ROS 및 TNF 및 ROS 생성을 촉진시키는 시토킨들에 의하여 촉진되는 것으로 보인다. 패혈증성 쇼크에서, IL-1 및 TNF는 내독소 및 기타 세균 독소의 작용에 의하여 생성된다. ROS와 함께 상기 2가지 인자가 고도로 발현되는 경우는 IL-6, IL-8, 감마 인터페론, 프로스타글란딘 I₂, 트롬복산 A, 프로스타글란딘 E₂, 변형성 생장 인자 베타, 혈소판 활성화 인자, 브래디키닌, 안지오텐신 및 혈관작용성 내부 펩티드를 포함하는 다수의 2차 매개체가 과다하게 생산된다. 이들 인자들은 병인성 심장 혈관 변화, 혈액의 역동적 변화 및 응집등 상기 증상과 관련된 기타의 변화를 초래한다.

TNF가 과다 생산되면 쇼크와 죽음을 초래한다고 입증되었을때, 상기 TNF는 패혈증성 쇼크/SIR 징후과 관련된 제1 시토킨이었다. IL-1이 이와 유사하게 독성인 것으로 밝혀진 직후 TNF가 투여되었을 때 그 독성은 배가되었다. 비치사량만큼의 TNF 및 IL-1이 결합되었을 때, 동물에서 치명적인 쇼크를 유발시켰다.

염증성 손상를 입었을때, IL-1에 의해서 순환계내에 나타나는 제1의 시토킨은 TNF이다. 예를 들어, 내독소가 주사된 지원 개체에 있어서의 TNF 수준은 손상 발생후 60-90분 경과시 정점에 도달하였으며 3시간 경과하였을 쯤에는 다시 기준치로 복귀되었다. IL-1 수준은 치료후 3-4일 경과시 안정 수준에 도달하였다. 이와 같은 일반적인 관찰 결과 및 TNF가 IL-1 생성을 유도시킬 수 있다는 고찰은 상기 TNF가 상기 패혈증성 쇼크/SIR 징후를 유발시키는 최초의 시토킨인 반면에, IL-1은 상기 징후를 지속시키는 데에 관여한다는 사실을 뒷받침한다.

TNF 및 IL-1 생성 여부를 측정하는데에 있어서, 혈청의 IL-6 수준을 측정하는 것은 상기 시토킨을 직접 측정하는 것보다 더욱 좋은 측정법으로서 제시되어 오고 있다. 순환계내의 IL-6 수준은 종종 외상, 패혈증 및 패혈증성 쇼크/SIRS 환자의 질병의 심각성과 직접적으로 상관되어 있다. 그러나 IL-1 및 TNF와는 달리, IL-6를 투여한 경우는 염증 또는 패혈증성 쇼크/SIRS를 유발시키지 않았으며 IL-6의 억제제는 상기 징후의 치명적 효과를 방지한다.

추가의 증거는 상기 매개체가 상기 징후 유발에 중요한 역할을 한다는 사실을 뒷받침 해준다. 예를 들어, Casey외 다수[77]는 패혈증성 쇼크에 관련된 다수의 인자들 및 97명의 환자들에 나타나는 결과 사이의 상관 관계를 관찰하였는데, 이들중 57명은 패혈증성 쇼크가 심하게 발생하였거나 또는 심각한 패혈증성 쇼크/SIRS의 초기 지표인 혈압 강하 현상을 나타내었다. 상기 환자 그룹에 있어서의 생존률은 54%였다. 가장 강력한 양의 상관성을 나타낸 것은 원형질 IL-6의 수준 및 사멸률 사이의 관계였으며 두번째로 강력한 것은 IL-1 수준과의 관계였다. 통상적으로 IL-1은 정상의 개체에서는 감지할 수 없었다(<40pg/ml). TNF, 내독소 수준 및 사멸과의 상관성은 존재하지 않았다. TNF와의 상관성이 존재하지 않음은 상기 시토킨이 상기 인자의 캐스캐이드의 최초 단계에서 생성되며 반감기(half-life)가 짧다는 사실에 기인한다. 그러나, 상승된 TNF 수준은 그램 양성 패혈증의 존재와 상관성이 있었다.

패혈증성 쇼크/SIRS와 관련된 후염증성 시토킨, 구체적으로 TNF는 응고 현상 및 ROS가 방출됨으로 인하여 호중구를 활성화시키는 보체 캐스캐이드를 활성화시킨다. 산화질소 합성 효소는 내피 세포 및 염증 세포내 IL-1 및 TNF에 의해서 유도된다. 활성화된 호중구는 산화 질소와 반응하여 매우 독성이 강한 히드록시 ROS형성을 억제하도록 과산화질산염을 생성시키는 수퍼옥시드 이온을 형성하는 소위 호흡성 파열 현상(respiratory burst)에 있어서 산소를 소모한다. ROS, 특히 수퍼옥시드는 이것이 자가 증식 과정중에 있는 원형질 전구체와 반응할 경우 주화성 인자를 생성시킨다.

패혈증성 쇼크/SIRS 환자들은 바람직하게는 상기 징후 발생에서 ROS의 중요성을 확인시켜 주는 항산화제 처리에 대하여 응답한다. 예를 들어, 4개의 항산화제가 조합하여 처리된 이후의 폐혈증 관련 급성 호흡기 장애 징후(ARDS) 환자에서 사멸률이 눈에 띄게 감소되는 것을 볼 수 있다. ARDS란 패혈증성 쇼크/SIRS의 최종 상태를 특징화시키는 다수의 기관 손상 중 첫번째 증상인 허파 손상과 관련된 병리 현상을 의미한다. 이와 유사하게, 항산화제 n 아세틸 시스테인이 투여된 ARDS 환자에 대한 다른 연구 결과, 폐혈관 내성, 심장 아웃풋 및 산소 운반의 변화를 포함하는 허파 및 심장의 기능이 개선되었음을 나타내었다.

패혈증성 쇼크/SIRS를 상기 사실들 및 추가의 데이터들을 기초로 하여 연구되어 온 기작을 근거로 하여 이해하는 것은 상기 징후가 TNF 및 IL-1 생성을 차단시키는 제제에 의하여 예방될 수 있었다는 사실을 제시해 준다. IL-1 중화 항체들은 동물 모델에서 패혈증성 쇼크 징후를 개선시키는 것으로 밝혀진 바 있다. 그러나, 재조합 IL-1ra를 투여하는 것은 패혈증성 쇼크/SIRS 동물 모델에 있어서 IL-1 기능을 억제하는 것으로서 자주 사용되는 방법이다[78].

예를 들어, 토끼를 적당량의 IL-1ra로 처리함과 동시에 일반적인 치사량의 내독소를 처리한 경우 혈압은 약간 내려갔거나 또는 일시적으로 저혈압을 나타내었으며 조직으로의 호중구 침투율도 감소하였다. IL-1ra는 또한 래트가 케이.뉴모니아에(K.Pneumoniae)에 감염되어 사멸하는 것과 이.콜라이(E.Coli) 유발성 복강염이 발병하는 것을 방지하는 것으로 알려져 있다.

비비에서 발생하는 치명적인 이.콜라이 유발 패혈증성 쇼크를 약화시키기 위 한 IL-1ra의 침투 능력에 대해서 연구되어 왔다. IL-1이 통상의 경우보다 10³-10⁴ 배 많이 투여될 경우 이것은 시토킨의 초기 생성에 아무런 영향을 미치지 않았으나, IL-1ra는 지속적인 IL-1 응답을 차단시켰는데 그 결과, 상기 IL-1ra 투여후 24시간 경과시의 개체들은 생존률이 100%에 달하였으며 위약 처리된 대조군은 생존률이 43%에 불과하였다.

TNF 중화 항체 및 가용성 TNF 수용체가 동물이 패혈증성 쇼크를 일으킬 수 있는 내독소와 같은 세균 독소가 치명적으로 주입되는 것을 막아줄 수 있다는 다수의 연구 결과가 보고되고 있다. 그러나, 효과를 높이기 위하여, 상기 처리는 내독소 또는 세균 주입 이전 또는 주입시에 수행되어야 한다.

패혈증성 쇼크의 초기 단계에 있어서의 TNF의 역할은 또한 TNF-1 수용체가 사멸된 마우스를 사용하여 관찰되어 왔다. 상기 마우스들은 정상적인 마우스에서 치명적인 패혈증성 쇼크 징후를 유발시키는 복용량의 TNF에 응답하지 않는 것으로 밝혀졌다. 상기 사멸은 또한 D-갈락토사민 및 간에 의한 대사 경로를 차단시킴으로써 동물이 독소에 감작하는 것을 방지하는 제제를 미리 처리하였을 경우, 일반적으로 치명적인 복용량의 내독소에 응답하지 않았다. 내독소에 의하여 유도된 TNF의 원형질내 수준의 관점에서 정상의 마우스와 사멸 개체들간 차이는 존재하지 않았다. 내독소를 거의 치사량에 가깝게 투여하였을 경우, 순환계에 방출된 IL-6의 수준은 대조군에 비하여 사멸된 마우스에서 더욱 극적으로 감소되는 것으로 나타났다. 마지막으로, 사멸된 마우스로부터 얻은 대식 세포는 유도성 산화질소 합성 효소 경로에 의하여 산화질소를 생성시키는 능력을 심각할 정도로 제한하는 것으로 나타났다. 이와는 대조적으로, IL-6가 결여된 마우스는 이와 같은 결함을 나타내지 않았다.

패혈증성 쇼크 치료용으로 6개의 상이한 회사에 의하여 개발중에 있는 6개의 TNF 안타고니스트가 한꺼번에 Ⅱ-Ⅲ 단계의 임상 실험중에 있다. 이들 억제제중 4개는 중화 항체이며 나머지 2개는 가용성 재조합 TNF 수용체가다. 이들 생성물 모두는 상기 징후에 실제로 처리해 주더라도 별 차이를 나타내지 않는다. 그러나, 중화 항체를 포함하는 TNF 안타고니스트는 이것이 임상 실험에서 류마치스 관절염 치료용으로서 기대되기 때문에 상기 환자에서는 실질적으로 효능을 나타내지는 않는다.

명백하게는, 최근 10년간 패혈증성 쇼크/SIRS에 대한 신규의 치료제를 개발하려는 시도가 이루어졌으나 실패하여 다수의 실망을 가져왔다. Prutti외 다수[78]는 다수의 연구자들에 의해서 제시된 시토킨 억제제 사용이 실패를 초래하는 여러가지 이유에 대하여 요약한 바 있다. 아마도 성공에 대한 최대의 장애물은 현존하는 시토킨 억제제의 소비량과 관련있을 것이다. 이들의 고소비량은 이들이 예방학적으로 사용되는 것을 방해한다. 예를 들어, Puritt외 다수에 의하여 지적된 바와 같이[78], 원형질내에서의 치료 농도를 10-15㎍/㎖으로 유지시키기 위해서는 IL-1ra을 부패균이 환자 체내에 존재하고 있는 동안 매일 약 2.5g씩 1.5-2.0 mg/kg/hr의 농도로 투여해야 한다.

결과적으로, IL-1 또는 TNF 억제제가 투여된 환자는 이미 징후를 보인다. 그러나 상기 징후에 대한 병인성을 이해하는 것은 IL-1, 구체적으로 TNF 기능이 상기 징후를 진행시키는데에 주요 역할을 하는 후염증성 시토킨을 과다하게 방출시키는 캐스캐이드를 개시하는 것을 차단함에 틀림 없다는 것을 설명해 준다. 더욱이, 패혈증성 쇼크/SIR 징후를 유발시키는 염증성 손상이 발생되기 이전에 또는 발생됨과 동시에 유효량의 IL-1 및 TNF가 투여되어야 한다는 사실을 동물 연구를 통하여 설득력 있게 밝힌 바 있다.

Synergen Inc.의 Ⅱ단계 실험 결과를 예로 들면, IL-1ra는 환자가 연구에 적합한 상태에 있다고 판단된 이후 평균 9시간 경과시 투여되었다[79]. 결과적으로, 상기 실험에 투입된 다수의 환자들은 IL-1ra 침투가 개시되기 24시간 이상 이전에 패혈증 응답을 진행시켰다. 그러므로 다수의 환자에 있어서, 후염증성 캐스캐이드는 IL-1 기능이 개시되는 것을 억제하려는 시도가 행해질 때까지 양호하게 진행되었다.

IL-1ra 임상 실험에서의 양성 응답은 또한 28일 내내 유발된 사멸 시료을 사용함으로써 불명료해 질 수 있다. Ⅱ단계 및 처음 Ⅲ단계 실험 데이터는 처리후 3-7일 경과시 IL-1ra가 침투를 개시할때 가장 크 효과를 수득할 수 있다는 사실을 나타낸다[78]. 결과의 생존 곡선은 평행한 형태를 나타낸다. 이와 같은 고찰은 IL-1ra의 반감기가 매우 짧다는 사실을 반영한다. 예를 들어, 패혈성 요인을 갖고 있는 영장류에서 IL-1ra의 베타상 반감기는 약 21분이다. 이와 유사하게, IL-1 및 TNF는 수분내지 수시간 경과후 측정된다. 따라서 IL-1ra 침투 이후 첫주 경과후 사멸률은 본 치료의 가치를 평가하는데에 적당하지 않다는 사실은 당연한 일이다.

그러나 IL-1ra 임상 실험으로 발생하는 다른 문제점은 시토킨의 원형질내 농 도를 기초로 하는 시토킨 억제제의 복용량을 결정하는데에서 초래될 수 있다. 왜냐하면 상기 시토킨들의 국부 조직 농도가 원형질내에 존재하는 경우보다 더욱 높을 수 있기 때문이다. 예를 들어, ARDS 환자의 허파내 IL-1의 농도는 15ng/ml이었던 반면에, 원형질내 농도는 100pg/ml 이하였다.

그러므로 패혈증성 쇼크/SIRS 데이터 및 상기 징후에 대한 현재의 이해 상태는 (1) 위험한 상태의 환자에 예방학적으로 투여되기에 충분할 정도로 저렴한 IL-1 및 TNF를 억제할 수 있으며; 그리고 (2) 상기 징후와 관련된 사멸 현상을 초래하는 기관 손상에 대한 주요 공헌 인자인 프로그래밍된 세포 사멸을 방지할 수 있는 신규의 치료법 개발을 뒷받침해준다.

따라서, CRAA는 TNF 및 IL-1에 특이적인 촉매성 항체의 면역 생산을 촉진시킬 것이라고 본원에 기술되어 있다. 상기 항체들은 기타의 공지된 모노클로날성 항체 투여를 기초로 하는 면역 치료용으로 이미 개발되어 있는 방법들을 사용하여 투여될 수 있다. 본 발명의 항체들은 촉매적으로 작용하기 때문에, 복용량은 가역적으로 그리고 화학양론적으로 결합된 항체보다 더욱 낮을 것이다. 그러므로, 상기 징후 발병의 위험이 있는 환자들을 예방학적으로 치료하는데에 드는 비용은 상당히 감소된다. TNFα에 대한 촉매성 항체를 추론하는 표준적인 CRAA를 도15에 나타내었다. IL-1β에 대한 촉매성 항체를 추론하는 표준적인 CRAA를 도16 및 도17에 나타내었다. 보로네이트 친전자성 중심을 도 17에 나타내었다.

실시예 IV

본 발명의 촉매성 항체를 이용하는 수동 면역화

모노클로날 항체 투여가 임상학적으로 유용함을 제공하는 의학에는 다수의 분야가 존재한다. 기관 이식 분야에 있어서, T 세포 수용체에 결합하는 MoAb(OKT3)가 생체내 T 세포를 제거시키는데에 사용되어 오고 있다. 뿐만 아니라, MoAb는 다소 성공적으로 숙주 질병에서의 이식편을 치료하는데에 사용된다. 임상 실험을 통하여 다발성 경화증 치료시 T 세포의 하위세트를 제거시키는 항 CD4 MoAb의 능력을 평가하는 방법을 확립하였다.

따라서, 모노클로날 항체의 투여 방법은 당 업계의 통상적인 숙련자인 임상학자들에게 널리 공지되어 있다. 표준적인 방법 및 복용 계획, 화학 요법만의 또는 종양 유전자 HER2에 대한 재조합 MoAb와의 조합 투여에 대한 랜덤화되고, 조절된 연구 방법도 단계 III에 제공되어 있다. 상기 연구에서 인간에 적합하도록 재조합된 MoAb Her2 암(arm)은 0일 경과시(MoAb Her2 투여한 첫날, 또는 대조군 그룹의 환자에 랜덤화시킨 날) 4mg/kg의 정맥 투여 복용량으로 처리되었으며, 이후의 연구시에는 매주 2mg/kg의 정맥 투여 복용량으로 처리되었다. 임상적 평가 방법, 즉 (적당하다면) 징후 유발성 물리적 관찰 및 실험실 시험에 따른 각 연구에 있어서 모든 환자들이 모니터된다. 통상적인 종양 평가 방법은 상기 연구 기간중 전술된 간격에 있는 모든 환자들에 대해서 수행된다. 모든 역효과도 기록된다.

본 발명의 촉매성 항체의 투여는 상기 HER2 모노클로날 항체에 대해서 수행된다. HER2 연구 수행에 있어서, 침투 이후 환자들은 투여된 촉매성 항체의 효능을 측정하기 위하여 평가된다.

만일 전술한 바와 같이 투여된 촉매성 항체가 환자에 바람직하지 않은 부작 용을 일으키면, 면역화된 CRAA는 상기 촉매성 항체의 작용을 공유적으로 억제하도록 투여된다.

실시예 V

본 발명의 CRAAS를 사용한 능동 면역화

이전에 개발된 방법을 사용하여 바람직한 항원에 대한 보호 항체의 응답을 유도하도록 디자인된 백신으로 능동적 면역화를 수행시켰다[82, 83]. 예를 들어, 명반과 같은 적당한 아쥬반트 제형과 혼합된 CRAA는 항체를 최대로 합성하도록 최적화된 복용량으로(체중 1㎏당 100-1000㎍) 근육내에 투여될 수 있으며, 혈청내 촉매성 항체의 농도가 안정수준에 도달할 때까지 4주 간격으로 2회 또는 3회 촉발적으로 주입물을 투여하였다. 백신화가 공격성 유기체 또는 암 세포에 노출될 경우 항체를 생성시키도록 자극될 수 있는 특이적이며, 수명이 긴 기억 세포를 생산하게 될 것이므로, 지난 수년 동안 보호적 면역성은 이와 같이 발생되는 것으로 예상되었다. 촉매성 항체의 농도를 결정하는 설명 및 방법은 실시예Ⅰ 및 실시예 Ⅱ에 제시되어 있다. 대부분의 항원에 대한 항체 합성 응답은 T 세포 의존적이기 때문에, 실시예 Ⅱ에 기술된 gp120의 경우와 같이, 적당한 T 세포 에피토프가 펩티드 합성에 의해서 면역원에 결합될 수 있다. 이와는 달리, 키홀 림펫 헤모시아닌과 같은 담체는 Lys의 측쇄 아미노기 또는 Cys 측쇄 설파히드릴기를 커플화시켜 필요한 경우 항체의 응답을 최대화시킴으로써 상기 CRAA에 접합될 수 있다.

[참고문헌]

본 발명의 바람직한 구체화 및 실시예에 대해 기술하긴 하였지만 본 발명은 이러한 구체화에 한정되는 것은 아니다. 후술되는 청구범위에서 정의한 본 발명의 영역 및 정신을 벗어나지 않은 범주에서 여러가지 변경이 가능하다.

<110> UNIVERSITY OF NEBRASKA BOARD OF REGENTS <120> METHODS FOR IDENTIFYING INDUCERS AND INHIBITORS OF PROTEOLYTIC AN TIBODIES, COMPOSITIONS AND THEIR USES <130> 6 <150> PCT/US 1999/06325 <151> 1999-03-23 <160> 10 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 1 Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Clostridium tetani <400> 2 Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu 1 5 10 15 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Cys Glu Gly Pro Cys Arg 1 5 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 5 Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly 1 5 10 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 6 Ala Met Tyr Ala <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 7 Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 8 Asp Asn Gln Leu Val Val Pro 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 9 Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapience <400> 10 Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu 1 5

Claims (22)

1. 하기 구조식을 포함하는 공유 반응성 항원 유사체(Covalently reactive antigen analog; CRAA):

   X1-Y-E-X2

   상기 구조식에서,

   X1 및 X2는 반응 중심의 아미노 말단 측 및 카르복시 말단 측 상에 3개 내지 10개의 아미노산을 포함하는 펩티드 서열이며, 이때 상기 펩티드 서열은 표적 단백질의 에피토프이고;

   Y는 양전하 아미노산 잔기이며;

   E는 포스포네이트 부분 또는 보로네이트 부분으로 구성되는 군에서 선택되는 친전자성 반응 중심이다.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, Y는 리신, 아르기닌, 또는 이들의 유사체로 구성된 군에서 선택되는 것인 공유 반응성 항원 유사체.
4. 제1항에 있어서, 상기 펩티드 에피토프는 종양괴사 인자, 표피 성장 인자 수용체, 인터류킨-1, gp120, gp160, gag, pol, B형 간염 표면 항원, 세균성 외독소, EGF, TGFα, p53, 전립선 특이적 항원, 암배아성 항원, 프로락틴, 인간 융모막 생식선 자극 호르몬, c-myc, c-fos, c-jun, 표피 성장 인자 수용체, HER-2, 프로락틴 수용체, 스테로이드 수용체, 및 IL-4로 구성된 군에서 선택되는 단백질중에 존재하는 에피토프인 공유 반응성 항원 유사체.
5. 제1항에 있어서, 상기 CRAA에서 식중 X1이 Met-Glu-Glu-Asp-Gly-Val-Arg-Lys-Cys이고, Y가 Lys이며, E가 포스포네이트 에스테르이고, X2가 Cys-Glu-Gly-Pro-Cys-Arg인, 표피 성장 인자 수용체에 대한 촉매성 항체 생산을 유발하는 것인 공유 반응성 항원 유사체.
6. 제1항에 있어서, 상기 CRAA에서 식중 X1이 Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Glu-Val-Gly이고, Y가 Lys이며, E가 포스포네이트 에스테르이며, X2가 Ala-Met-Tyr-Ala인, gp120에 대한 촉매성 항체 생산을 유발하는 것인 공유 반응성 항원 유사체.
7. 제1항에 있어서, 상기 CRAA에서 식중 X1이 Leu-Ala-Asn-Gly-Val-Glu-Leu이고, Y가 Lys이며, E가 포스포네이트 에스테르이고, X2가 Asp-Asn-Gln-Leu-Val-Val-Pro인, TNFα에 대한 촉매성 항체 생산을 유발하는 것인 공유 반응성 항원 유사체.
8. 제1항에 있어서, 상기 CRAA에서 식중 X1이 Pro-Lys-Lys-Lys-Met-Glu-Lys이고, Y가 Lys이며, E가 포스포네이트 에스테르이며, X2가 Phe-Val-Phe-Asn-Lys-Ile-Glu인, IL-1β에 대한 촉매성 항체 생산을 유발하는 것인 공유 반응성 항원 유사체.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 촉매 활성을 갖는 항체 생산을 자극하는 방법으로서,

    (a) 제1항의 공유 반응성 항원 유사체(CRAA)의 면역원량을 인간을 제외한 피험체에게 투여하는 단계;

    (b) 효과적인 항체 생산이 이루어질 때까지 단계 (a)를 필요한 만큼 반복하는 단계; 및

    (c) 상기 항체를 분리하고 정제하는 단계

    를 포함하는 방법.
15. 삭제
16. 제14항에 있어서, 전이 상태 유사체(TSA)의 면역원량을 상기 공유 반응성 항원 유사체(CRAA)와 함께 공동 투여하는 것인 촉매성 항체의 생산을 자극하는 방법.
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 제1항의 공유 반응성 항원 유사체(CRAA) 및 생물학적으로 상용성인 매질을 포함하는, 자가면역질환, 미생물 질환, 림프 증식성 질환, 암, 패혈증성 쇼크, 전신성 염증 질환, 및 급성 호흡 장애 증후군을 치료하기 위한 약학 제제.

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