ES2313780T3 - Procedimientos para identificar inductores e inhibidores de anticuerpos proteoliticos, composiciones y sus usos. - Google Patents

Abstract

Un análogo de antígeno reactivo de manera covalente (CRAA), que comprende la siguiente fórmula estructural: X1 - Y - E - X2 en la que X1 y X2 son secuencias peptídicas que comprenden de tres a diez aminoácidos en el lado amino terminal y el lado carboxi terminal del centro de reacción, en el que las secuencias peptídicas son de un epítopo de una proteína asociada a enfermedad; Y es un residuo aminoácido cargado positivamente seleccionado del grupo constituido por lisina, arginina o sus análogos, y E es un centro de reacción electrófilo seleccionado del grupo constituido por un resto fosfonato o un resto boronato.

Description

Procedimientos para identificar inductores e inhibidores de anticuerpos proteolíticos, composiciones y sus usos.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a los campos de la inmunología, la biología molecular y la medicina. Más específicamente, la invención proporciona composiciones para estimular la producción de anticuerpos catalíticos nuevos e inhibidores de los mismos. Las composiciones de la invención pueden usarse en procedimientos para identificar y aislar anticuerpos que se presentan en la naturaleza expresados a partir de genes de líneas germinales. En este documento se describen procedimientos para sintetizar análogos antigénicos reactivos de manera covalente que estimulan la producción de anticuerpos catalíticos y/o inhiben de manera irreversible su actividad.

Antecedentes de la invención

En esta solicitud se hace referencia a varias publicaciones por medio de números entre corchete para describir se manera más completa el estado de la técnica a la que pertenece esta invención.

La observación de que el péptido intestinal vasoactivo (VIP) es escindido por Ac de pacientes con asma proporcionó evidencias tempranas de que los Ac pueden poseer actividad peptidasa [1,2]. Esta observación ha sido reproducida de manera independiente por Suzuki y col. [3]. La catálisis por autoanticuerpos no está restringida a la catálisis del VIP. Los autoanticuerpos en la tiroiditis de Hashimoto catalizan la escisión de la tiroglobulina [4]. Se han proporcionado más evidencias de catálisis por anticuerpos en informes de actividad ADNasa en Ac de pacientes con lupus [5,6]. La tendencia hacia la síntesis de Ac catalíticos en la enfermedad autoinmune está soportada por las observaciones de que cepas de ratones con una predisposición genética a sufrir enfermedad autoinmune producen Ac esterasa en niveles superiores comparado con las cepas control de ratones en respuesta a la inmunización con un análogo en estado de transición [7].

Al igual que los Ac no catalíticos, los Ac peptidasa son capaces de unir Ag con alta especificidad mediada por contactos en los residuos de los dominios VL y VH. Se sabe que las subunidades H y L purificadas son independientemente capaces de unir Ag, aunque con menor afinidad que el Ac original. La cristalografía de rayos X de complejos Ac-Ag ha mostrado que los dominios VL y VH están ambos involucrados en la unión del Ag [8]. La contribución precisa de los dos dominios V varía en complejos Ac-Ag individuales, pero el dominio VH puede contribuir en un nivel algo mayor, porque CDRH3 tiende a ser más largo y más variable en secuencia comparado con CDRL3.

El complejado inicial de un Ag polipeptídico por un Ac peptidasa es seguido por la escisión de uno o más enlaces peptídicos. Justo antes de la escisión, se establecen contactos con los residuos catalíticos del anticuerpo con el enlace peptídico en el estado de transición. La capacidad para hidrolizar enlaces peptídicos parece residir en el dominio VL. Esta conclusión se basa en la escisión de VIP por cadenas L de autoanticuerpos policlonales, cadenas L monoclonales aisladas de pacientes con mieloma múltiple y sus dominios VL recombinantes, y cadenas L recombinantes surgidas por inmunización con VIP. Las cadenas H de Ac policlonales y monoclonales para VIP son capaces de unir VIP pero están desprovistas de la actividad catalítica [9]. El dominio VH puede de cualquier manera influenciar la actividad peptidasa por "control remoto", porque al unirse a VIP de manera distante del sitio de escisión, puede influir en la conformación del sitio de unión como se muestra por la actividad peptidasa de construcciones de F_{V} compuestas del dominio VL anti-VIP unido a su dominio VH. El dominio VH anti-VIP ejerció efectos beneficiosos y un dominio VH irrelevante ejerció efectos perjudiciales sobre la actividad catalítica, según se evaluó por medio de los valores de afinidad de unión a VIP y eficacia catalítica. La existencia propuesta de diferentes subsitios catalíticos y de unión al antígeno en los Ac catalíticos es coherente con los datos de que los Ac por lo general contienen sitios de combinación largos, capaces de acomodar 15-22 aminoácidos de sustratos polipeptídicos [8], y que las regiones del sustrato distantes del sitio de escisión son reconocidas por los Ac. Por consiguiente, el dominio VH ofrece un medio para controlar la especificidad del sitio catalítico.

El modelado molecular de la cadena L sugirió que sus Asp1, Ser27a y His 93 están posicionados adecuadamente para servir como la triada catalítica [10]. La hidrólisis de VI se redujo en >90% por la sustitución de residuos Ser27a, His93 o Asp1 por Ala por medio de mutagénesis dirigida al sitio [12]. La actividad catalítica de la proteína de tipo salvaje se inhibió selectivamente por medio de diisopropilfluorofosfato (DFP), un inhibidor de serina proteasas, pero la actividad residual del mutante Ser27a fue refractaria al DFP. La K_{m} de la cadena L de tipo salvaje para VIP (130 nM) no se vio afectada por las mutaciones en Ser27a, His93 y Asp1. En contraste, la mutagénesis en los residuos que forman la extensión del sitio activo de la cadena L (Ser26, H27d/Asp28) produjo aumentos en los valores de K_{m} (de unas 10 veces) y aumentos en el recambio (en unas 10 veces). Estos resultados pueden explicarse por el surgimiento de estabilización disminuida del estado base. La consiguiente disminución de \DeltaG^{+}cat produce un aumento en el recambio. Por consiguiente, se han identificado dos tipos de residuos que participan en la catálisis por la cadena L. Ser27a y His93 son esenciales para la catálisis pero no para la formación inicial de complejos de alta afinidad con el estado base de VIP. Ser26 y His27d/Asp28 participan en la unión del estado base de VIP y limitan el recambio de manera indirecta. Véase Figura 1.

La cadena L de VIPasa mostró una cinética explosiva en la fase temprana de la reacción, que sugiere la formación de un intermedio covalente acilo-cadena L, como se presenta durante la escisión del enlace peptídico por medio de serina proteasas. La intensidad de fluorescencia se controló en función del tiempo tras mezclar la cadena L con el sustrato Pro-Phe-Arg-MCA. Hubo un aumento inmediato en la fluorescencia, correspondiente a la formación del intermedio covalente, seguido por un aumento más lento, correspondiente al establecimiento de la tasa de equilibrio. El número de sitios activos se computó a partir de la magnitud de la explosión en comparación con el rendimiento de fluorescencia de aminometilcoumarina convencional. La concentración de sitios catalíticos se estimó en 114 nM, que representan aproximadamente el 90% de la concentración de cadena L estimada por el método de Bradford (125 nM).

Los residuos catalíticos (Ser27a, His93, Asp1) en el dominio VL de anti-VIP están también presentes en su dominio equivalente VL de línea germinal (número de acceso de GenBank del gen VL de línea germinal, Z72384). El domino VL de anti-VIP contiene 4 reemplazos de aminoácidos comparado con su secuencia de línea germinal. Estos son His27d:Asp, Thr28e:Ser, Ile34:Asn y Gln96:Trp. La proteína de configuración germinal de la cadena L de anti-VIP se construyó introduciendo las 4 mutaciones requeridas según se describió anteriormente [12]. La proteína de línea germinal purificada expresó actividad catalítica según se detectó por la escisión del sustrato Pro-Phe-Arg-MCA en un nivel aproximadamente 3,5 veces inferior al de la cadena L madura (330\pm23 UF/0,4 \muM cadena L/20 minutos; concentración del sustrato 50 \muM). Los datos sugieren que los efectos remotos por los residuos mutados somáticamente no son esenciales para la expresión de la actividad catalítica.

Los inhibidores de enzimas tales como la trombina se han enseñado en referencias tales como Hiratake y col. (Biosci. Biotech. Biochem. (1997) 61:211-218), Kettner y col. (J. Biol. Chem. (1990) 265:18289-18297), Fastrez y col. (Tetrahedron Lett. (1989) 30:6861-6864) y Oleksyszyn y col. (J. Med. Chem. (1994) 37:226-231). Hiratake y col. describen compuestos que comprenden un resto ácido fosfínico unido a un grupo alquilo neutro y a continuación un péptido en cualquier lado del resto ácido fosfínico. Kettner y col. proporcionan compuestos que comprenden un resto boroarginina unido a un péptido en una dirección unilateral. Fastrez y col. enseñan un compuesto que comprende una lisina seguida por un resto fosfonato unido a un grupo fenilo. Por último, Oleksyszyn y col. describen compuestos que comprenden un resto fosfonato unido a un grupo amindinofenilglicina, que se describe como un análogo de la arginina, y un péptido de dos aminoácidos de longitud en una dirección unilateral.

La presente invención proporciona composiciones nuevas para estimular la producción de anticuerpos catalíticos y fragmentos de los mismos. Los anticuerpos catalíticos con especificidad para determinados antígenos asociados a enfermedades proporcionan herramientas terapéuticas valiosas para uso clínico. En este documento se describen procedimientos para identificar, aislar y purificar anticuerpos catalíticos que se presentan naturalmente para el tratamiento de una diversidad de enfermedades y trastornos médicos, incluidos pero no limitados a enfermedades infecciosas, autoinmunes y neoplásicas. Tales anticuerpos catalíticos tendrán también aplicaciones en los campos de investigación en medicina veterinaria, industria y clínica y en dermatología.

Resumen de la invención

Según un aspecto de la invención, en este documento se proporcionan composiciones para estimular la producción de anticuerpos catalíticos para antígenos diana predeterminados, incluidos pero no limitados a los implicados en procesos patogénicos y neoplásicos. Existen análogos de antígenos reactivos de manera covalente (CRAA) descritos que estimulan la producción de anticuerpos catalíticos con valor terapéutico en el tratamiento de una diversidad de afecciones médicas, incluidos trastornos de autoinmunidad, enfermedades microbianas, trastornos linfoproliferativos y cáncer. Los anticuerpos catalíticos de la invención pueden también usarse de manera profiláctica para prevenir ciertos trastornos médicos, incluidos pero no limitados a choque séptico, enfermedad inflamatoria sistémica y síndrome de insuficiencia respiratoria aguda.

Los análogos de antígenos reactivos de manera covalente, (CRAA) de la presente invención están definidos en la reivindicación 1 y contienen tres elementos esenciales y tienen la siguiente fórmula: X1-Y-E-X2 E es un centro de reacción electrófilo diseñado para reaccionar de manera covalente con cadenas laterales nucleófilas de ciertos aminoácidos; Y es un residuo básico (Arg o Lys) en la posición P1 (primer aminoácido en el extremo N terminal del centro de reacción); y X1 y X2 comprenden tres a diez aminoácidos vecinos en el extremo N terminal y C terminal del centro de reacción. El CRAA resultante representa una combinación nueva de elementos estructurales individuales que actúan en combinación para (a) unir residuos serina químicamente reactivos codificados por los genes de la línea germinal para ciertos tipos de serina proteasas de anticuerpos catalíticos (así como residuos tales como Thr y Cys que pueden adquirir su reactividad química por medio de diversificación somática de secuencias de los genes de la línea germinal); (b) utilizar fuerzas de par iónico y no covalentes para unir estructuras tales como residuos Asp/Glu cargados positivamente que son responsables de la especificidad de escisión de residuos básicos de los sitios catalíticos codificados de la línea germinal; y (c) unir sitios de combinación de anticuerpos en múltiples aminoácidos por medio de fuerzas de par iónico y no covalentes.

Los CRAA de la invención se administran a un organismo vivo bajo condiciones en las que los CRAA estimulan la producción de anticuerpos catalíticos específicos. A continuación se purifican los anticuerpos catalíticos. Los anticuerpos purificados de esta manera se administran a continuación a un paciente que necesite tal tratamiento en una cantidad suficiente para inactivar antígenos asociados con un trastorno médico predeterminado.

Se describen procedimientos y composiciones para administrar cantidades inmunogénicas de CRAA combinados con una cantidad inmunogénica de un análogo de estado de transición (TSA) convencional para estimular además la producción de anticuerpos catalíticos.

Los CRAA de la presente invención pueden usarse en un procedimiento para tratar una afección patológica relacionada con la presencia de anticuerpos catalíticos expresados de manera endógena. Los ejemplos de tales afecciones patológicas anormales son ciertas enfermedades autoinmunes así como trastornos linfoproliferativos. El procedimiento comprende administrar a un paciente que tenga una de tales afecciones patológicas una preparación farmacéutica que comprenda un análogo de antígeno covalentemente reactivo capaz de unir de manera irreversible los anticuerpos catalíticos producidos de manera endógena, en una cantidad suficiente para inhibir la actividad de los anticuerpos, aliviando de esta manera la afección patológica. En esta forma de realización, el CRAA contiene un epítopo B mínimo sólo para minimizar la inmunogenicidad del CRAA.

Según otro aspecto de la invención, se proporciona una preparación farmacéutica para tratar una afección patológica relacionada con la presencia de anticuerpos catalíticos producidos de manera endógena. Esta preparación farmacéutica comprende un CRAA en un medio biológicamente compatible. Los anticuerpos catalíticos producidos de manera endógena se unen irreversiblemente y se inactivan tras la exposición a los CRAA. La preparación se administra en una cantidad suficiente para inhibir la actividad de los anticuerpos catalíticos.

Descritos en este documento se proporcionan procedimientos para inmunizar de manera pasiva a un paciente con una preparación de anticuerpos catalíticos. Los anticuerpos catalíticos se administran por infusión en un paciente que actúan para inactivar antígenos diana asociados a enfermedades. En una forma de realización alternativa, si el paciente experimenta efectos laterales indeseados, la actividad de los anticuerpos catalíticos administrados puede inactivarse de manera irreversible al administrar el CRAA inmunizante a dicho paciente. Una vez más, la inmunogenicidad del CRAA en esta forma de realización se reducirá por la inclusión de un epítopo de célula B mínimamente inmunogénico. En este CRAA se omitirá un epítopo universal de célula T.

En otra forma de realización alternativa, los anticuerpos catalíticos de la invención pueden administrarse conjuntamente con oligonucleótidos antisentido para p53. Tal terapia combinada podría probar eficacia en el tratamiento del cáncer.

La inmunización activa de pacientes se logra administrando los CRAA de la invención en un complejo CRAA-adyuvante a un paciente a inmunizar. Se administrarán también al menos 2 inyecciones de estímulo posteriores del complejo CRAA-adyuvante en intervalos de 4 semanas. Tras este procedimiento, se evaluará la presencia de anticuerpos catalíticos profilácticos en el suero del paciente.

Los CRAA de la presente invención proporcionan notables ventajas sobre los compuestos y procedimientos actualmente disponibles para estimular los anticuerpos catalíticos específicos para antígenos diana predeterminados. Por consiguiente, los compuestos descritos de la invención proporcionan reactivos clínicos valiosos para el tratamiento de enfermedades.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama de energía libre para catálisis de anticuerpos que incluye estabilización del estado base del sustrato (\DeltaG_{s}) y el estado de transición (\DeltaG_{TS}). \DeltaG^{+}_{no \ cat} y \DeltaG^{+}_{cat} corresponden a las energías de activación para las reacciones no catalizadas y catalizadas, respectivamente. Km es una función del grado de estabilización del estado base (\DeltaG_{s}). Kcat/Km es una función del grado de estabilización del estado de transición con relación al complejo catalizador-sustrato en estado base.

La Figura 2 es una representación esquemática de la estructura del dominio de la proteína del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Ligando, región de unión al ligando principalmente en el dominio III; TM; dominio transmembranario; CYs, dominios ricos en cisteína; y SP, péptido señal.

La Figura 3 es un diagrama esquemático de las estrategias de clonación propuestas para preparar anticuerpos catalíticos anti-EGFR.

La Figura 4 representa la estructura del CRAA-péptido de EGFR.

La Figura 5 es un diagrama que representa la construcción de Fv por extensión superpuesta.

La Figura 6 muestra un diagrama esquemático de la inmovilización de un análogo de fluorofosfato reactivo para serina proteasa en estado de transición. (a) trietilamina, CH2Cl2; (b) agua, THF; (c) DAST; (d) anhídrido glutárico, piridina; (e) DCC, DMAP, trietilamina, fluoresceína.

La Figura 7 muestra una representación esquemática de la estructura de gp120. V, regiones variables; PND, determinante neutralizante principal; flecha, sitio de escisión marcado por anticuerpos catalíticos generados usando los procedimientos de la presente invención.

La Figura 8 es una representación esquemática de la reacción de DFP con residuos serina nucleófilos.

La Figura 9 es un gráfico de barras que muestra la inhibición irreversible de la actividad peptidasa de cadena L por éster de diisopropilfluorofosfato conjugado a biotina (estructura superior). La cadena L del clon U19 (1 \muM) se incubó durante 30 minutos con el inhibidor. Se eliminaron los inhibidores no unidos por filtración a través de gel. La actividad peptidasa se midió a una concentración de cadena L de 20 nM con sustrato VIP radiomarcado. Los datos están expresados como % de inhibición con relación a la actividad de la cadena L sometida a filtración a través de gel sin pretratamiento de inhibidor (aproximadamente 15.000 cpm).

La Figura 10 representa estructuras de inmunógenos ejemplares contempladas para uso en la presente invención. La caja muestra la estructura alrededor de los sitios de escisión marcados (Lys432-Ala433). Los residuos vecinos son idénticos en los tres inmunógenos. Los números de los aminoácidos son los de gp120 de longitud completa.

La Figura 11 es un autorradiograma de un gel no reductor que muestra la hidrólisis de 125I-gp120 (100 nM) incubada con IgG 50 nM de un paciente con lupus (carril 2, panel izquierdo) y cadenas L 11 nM de ratones MRL/lpr (carril 2, panel derecho). El carril 1 en los paneles izquierdo y derecho muestra cantidades equivalentes de un sustrato incubado con IgG no catalítica de un sujeto positivo para VIH-1 y cadenas L de ratones BALB/c. Incubación, 2 horas a 37ºC.

La Figura 12 es un gráfico que muestra la escisión catalizada por anticuerpos de ^{125}I-gp120 incubada durante 1 hora con IgG de lupus (50 nM) sin y con DFP (10 \muM). (B) ^{125}I-gp120 de diversas cepas incubadas durante 2 horas con cadena L Lay2 (1\muM).

La Figura 13 es una inmunotransferencia de un gel de SDS reductor que muestra la hidrólisis de gp120 no marcada (11 \muM; SF2, Chiron) por cadena L Lay2 (20 \muM) (Carril 2).

La Figura 14 es un dibujo esquemático del estado de transición putativo de la formación de acilo-enzima durante la escisión del enlace peptídico por serina proteasas. El complejo acilo enzima (estructura derecha) se desacila por una molécula de agua atacante.

La Figura 15 es un CRAA ejemplar diseñado para provocar anticuerpos catalíticos para TNF\alpha.

La Figura 16 es un CRAA ejemplar diseñado para provocar anticuerpos catalíticos para IL-1\beta.

La Figura 17 es un CRAA ejemplar diseñado para provocar anticuerpos catalíticos para IL-1\beta. En este CRAA el centro de reacción electrófilo comprende una molécula de boronato.

La Figura 18 es un diagrama esquemático de las moléculas celulares que participan en los acontecimientos de señal mediados por p53.

Las Figuras 19A y 19B representan una lista de antígenos marcados por anticuerpos monoclonales convencionales que muestran promesas clínicas. Tales antígenos son dianas adecuadas para los anticuerpos catalíticos de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

Se describen procedimientos para estimular la síntesis de anticuerpos catalíticos de especificidad predeterminada por el sistema inmune. En una forma de realización de la invención se proporcionan composiciones y su uso para la generación de anticuerpos catalíticos para un antígeno peptídico de elección. En otra forma de realización, se proporcionan composiciones u su uso en procedimientos que son útiles en modalidades de inmunoterapia pasiva para el tratamiento del cáncer y otras afecciones médicas. Los anticuerpos catalíticos para el tratamiento de trastornos en los que TNF\alpha e IL\beta1 desempeñan un papel fundamental también están contemplados para uso en la presente invención.

11 de tales trastornos incluyen, pero no se limitan a, isquemia y lesión por reperfusión, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto, artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria, esclerosis múltiple y dolor neurotrófico.

Se describen protocolos de vacunación que provocan la producción de Ac catalíticos para antígenos virales o patogénicos predeterminados. Los análogos de antígenos reactivos de manera covalente descritos estimulan de preferencia la producción de anticuerpos catalíticos. Tales anticuerpos proporcionan protección superior contra infecciones por la presencia de acción catalítica contra las moléculas del antígeno diana en comparación con los Ac no catalíticos que unen el antígeno de manera reversible y estequiométrica.

La inmunización con TSA [1] ha sido propuesta como un medio para obtener Ac que pueden unir el estado de transición, y de esta manera disminuir la barrera de energía de activación para la reacción. Los análogos de fosfonato comúnmente usados contienen un átomo de fósforo tetraédrico y un átomo de oxígeno cargado negativamente unido al fósforo. Se cree que la formación del estado de transición de la escisión del enlace peptídico implica la conversión del átomo de carbono trigonal en el sitio de escisión al estado tetraédrico, y la adquisición de una caga negativa por el oxígeno del grupo carbonilo. Los TSA de fosfonato convencionales pueden inducir, por consiguiente, la síntesis de Ac capaces de unir la estructura oxianión y la configuración tetraédrica del estado de transición. Sin embargo, los Ac para estos TSA, aunque son capaces de acelerar comparativamente sin demandar reacciones de transferencia de acilo, no pueden catalizar eficazmente la escisión del enlace peptídico. Recientemente se ha informado un anticuerpo para un TSA de fosfinato que escinde lentamente una amida primaria estable [11]. Es posible que el Ac anti-fosfinato pueda permitir transferencia superior de un protón al nitrógeno de amida en el enlace débil a escindir, comparado con los Ac anti-fosfonato más comunes, que podría explicar su mejor actividad catalítica.

La mayoría de los enzimólogos sostienen que los TSA de fosfonato fracasan en provocar Ac catalíticos eficaces porque son imitaciones pobres del estado de transición, y porque están involucrados múltiples estados de transición. Las enzimas usadas activaron las cadenas laterales de los aminoácidos para catalizar la escisión del enlace peptídico. Por ejemplo, el grupo hidroxilo de Ser adquiere mayor nucleofilia y la capacidad para mediar la catálisis covalente por la formación de una red intramolecular con enlaces de hidrógeno de los residuos Ser, His y Asp. Los análogos de fosfonato no contienen elementos estructurales necesarios para unir el centro de reacción nucleófilo. La inducción de la catálisis covalente en Ac es por consiguiente imposible de realizar usando TSA de fosfonato convencionales. Además, estos TSA no explotan la existencia del sitio serina proteasa, codificado por la línea germinal en los Ac.

Se describen procedimientos para la preparación de CRAA electrófilos que son capaces de reaccionar con el residuo serina nucleófilo de los Ac catalíticos. Estos nuevos análogos de antígenos se aplicarán para seleccionar catalizadores de las bibliotecas de anticuerpos. La extensión lógica de esta estrategia es forzar la utilización de los sitios de serina proteasa para la síntesis de anticuerpos específicos para antígenos individuales, tales como el EGFR. Esto puede lograrse por medio de la inmunización con los CRAA electrófilos anteriormente mencionados. Tales CRAA promueven la selección clónica de células B que expresan los sitios de serina proteasa codificados por la línea germinal en su superficie celular. Además, la especificidad por EGFR, por ejemplo, se asegurará por medio de la incorporación de un epítopo antigénico adecuado de EGFR que estará vecino a la estructura análoga del antígeno reactivo de manera covalente.

La síntesis de Ac catalítico se ha documentado en la enfermedad autoinmune [2,4]. Además, el sistema inmune es capaz de producir Ac que catalizan la escisión de antígenos exógenos, incluida la escisión de la proteína gp120 de VIH. Sin embargo, los pacientes infectados con el virus no generan una respuesta de Ac catalítico para gp120. Los CRAA de VIH que se analizan en este documento forzarán al sistema inmune a sintetizar anticuerpos catalíticos protectores para VIH. En este documento se presentan datos que apoyan este enfoque. Se ha seleccionado gp120 como el antígeno diana por las siguientes razones: (a) Es un constituyente esencial de VIH-1 para la infección productiva de las células del huésped; (b) Como una proteína de superficie del virus, gp120 es fácilmente accesible para los Ac; y (c) Ciertos Ac anti-gp120 han mostrado frenar la infección por VIH.

Los genes del dominio VL catalizador pueden reclutarse para la síntesis de Ac catalíticos específicos de VIH, por inmunización con los CRAA de la presente invención. Los análogos son capaces de unirse al sitio catalítico, nucleófilo, codificado por la línea germinal y, por consiguiente, estimulan de preferencia la expansión clónica de células B que producen los Ac catalíticos. Cuando es necesario, pueden combinarse TSA de fosfonato con CRAA para inducir anticuerpos catalíticos que contienen un hueco de oxianión además de reactividad química nucleófila.

Se sintetizaran CRAA reactivos con los elementos estructurales fundamentales de catalizadores análogos a serina proteasa que contengan un epítopo modelo de células B de gp120 implicado en la unión de CD4 (residuos 421-436). Pueden inmunizarse ratones autoinmunes y no autoinmunes con el epítopo B y su CRAA usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. También se incorporará un epítopo de T ayudante en el CRAA. Las características estructurales individuales conocidas por contribuir en la catálisis de serina proteasa, es decir, un residuo nucleófilo de serina, residuos formadores de un hueco oxianión, complementariedad de forma con la geometría tetraédrica del enlace débil a escindir, y reconocimiento de residuos vecinos en el sustrato, serán reclutadas en los anticuerpos provocados al incorporar las siguientes características en los TSA: un éster de fosfonato tetraédrico, electrófilo o un fosfonato cargado negativamente con los residuos del epítopo B vecinos.

Los CRAA de la invención y los anticuerpos catalíticos resultantes tienen al menos tres aplicaciones importantes. La primera aplicación está dirigida a la generación de anticuerpos catalíticos en seres humanos o en animales tras la inmunización con CRAA diseñados para un trastorno médico particular. Los anticuerpos catalíticos generados de esta manera se administrarán posteriormente a pacientes para inactivar los restos de antígenos marcados. En este escenario, si el paciente experimentara efectos laterales adversos, podrán administrarse los CRAA inmunizantes para inactivar de manera irreversible el anticuerpo catalítico. Los CRAA en esta forma de realización se sintetizarán con un epítopo de célula B sólo para minimizar la inmunogenicidad.

En la segunda aplicación, los CRAA pueden administrarse a los pacientes con el objeto de inmunizar activamente al paciente contra una patología particular para generar un estado de inmunidad protectora. Estos CRAA podrían administrarse como un complejo CRAA-adyuvante.

Finalmente, los CRAA de la invención pueden administrarse a pacientes que estén actualmente expresando anticuerpos catalíticos con un trastorno médico tal como una enfermedad autoinmune o mieloma múltiple. Los CRAA pueden diseñarse con reactividad específica con los anticuerpos presentes. La inhibición de la función catalítica dará como resultado un alivio del estado de la enfermedad. Nuevamente, estos CRAA se diseñan para que contengan un epítopo de célula B sólo mínimamente inmunogénico.

La descripción detallada presentada describe los procedimientos de preferencia para practicar la presente invención. Se describen los procedimientos para seleccionar y preparar CRAA, estimular la producción de anticuerpos catalíticos para antígenos de enfermedades predeterminados, así como los procedimientos para administrar los CRAA o anticuerpos catalíticos in vivo.

I. Selección y Preparación de CRAA

Los análogos de antígenos reactivos de manera covalente de la invención se preparan usando esquemas convencionales de síntesis orgánica. Los CRAA nuevos de la invención contienen un centro electrófilo con residuos peptídicos vecinos derivados de proteínas asociadas con un antígeno peptídico particular para marcarlo para escisión y el uso proyectado del CRAA.

La selección de secuencias adecuadas de aminoácidos vecinas depende del antígeno peptídico particular marcado para escisión. Por ejemplo, las proteínas de recubrimiento viral, ciertas citocinas y antígenos asociados a tumores contienen muchos epítopos diferentes. Muchos de estos han sido mapeados usando procedimientos convencionales basados en Ac monoclonales. Este conocimiento facilita el diseño de análogos de antígenos reactivos de manera covalente útiles como inhibidores de anticuerpos catalíticos así como inductores de anticuerpos catalíticos con actividad catalítica contra antígenos marcados predeterminados.

Los aminoácidos vecinos al centro de reacción representan la secuencia del epítopo marcado en polipéptidos definidos que desempeñan un papel en la enfermedad, o contra los que se generan autoanticuerpos en la enfermedad.

Las características estructurales de los CRAA se proyectan para permitir la unión específica y covalente a los anticuerpos inmaduros, codificados por la línea germinal así como a los anticuerpos maduros especializados para reconocer el epítopo marcado. En base a los dogmas de la teoría de selección clónica, los CRAA también se proyectan para reclutar los genes de la línea germinal que codifican los anticuerpos catalíticos para la síntesis de anticuerpos maduros dirigidos hacia el epítopo marcado.

Los polipéptidos a marcar incluyen ligandos solubles y los receptores unidos a la membrana para estos ligandos.

También se proyecta marcar proteínas microbianas para catálisis por medio de los anticuerpos de la presente invención. Estas incluyen pero no se limitan a gp120, gp160, represor Lexl, gag, pol, antígeno de superficie de hepatitis B y exotoxinas bacterianas (toxina de difteria, toxina de C. tetani, toxina de C. botulinun, toxina pretussis).

Los antígenos neoplásicos también se incorporarán en los CRAA terapéuticamente beneficiosos. Estos incluyen, pero no se limitan a EGF, TFG\alpha, productos de p53, antígeno específico de la próstata, antígeno carcinoembrionario, prolactina, gonadotropina coriónica humana, glicoproteínas c-myc, c-fos, c-jun, p, proteínas asociadas a la resistencia a múltiples fármacos, metaloproteinasas y factores de angiogénesis.

Los receptores para antígenos neoplásicos también se marcarán para catálisis mediada por anticuerpos. Estos incluyen EGFR, mutantes de EGFR, HER-2, receptores de prolactina y receptores de esteroides.

Los mediadores inflamatorios son también dianas adecuadas para catálisis. Las moléculas ejemplares en este grupo incluyen TNF, IL-1beta, IL-4 así como sus receptores relacionados.

En enfermedades autoinmunes y en trastornos linfoproliferativos se encuentran anticuerpos catalíticos preexistentes. Las acciones perjudiciales de estos anticuerpos catalíticos serán inhibidas por medio de la administración de CRAA a los pacientes. Se administrarán CRAA diseñados para que sean débilmente inmunogénicos que interactuarán con de manera covalente con subunidades de anticuerpos con especificidad para VIP, Arg-vasopresina, tiroglobulina, peroxidasa tiroidea, IL-1, IL-2, interferones, proteinasa-3, glutamato decarboxilasa.

Para una máxima selectividad, las secuencias de péptidos vecinos comprenden un epítopo que está marcado para escisión. Por ejemplo, se incorpora un epítopo presente en el receptor del factor de crecimiento epidérmico en un CRAA de la presente invención. En otra forma de realización de la invención, se incorpora un epítopo presente en gp120 de VIH en un CRAA. Un CRAA ejemplo para el tratamiento de la infección por VIH comprende tanto un epítopo de célula B como un epítopo de célula T para maximizar la inmunogenicidad del CRAA. Otros CRAA ejemplificados en este documento incluyen los adecuados para generar anticuerpos catalíticos para TNF e IL-1\beta.

II. Administración de los CRAA

Los CRAA, según se describen en el presente documento, se administran por lo general a un paciente como una preparación farmacéutica. El término "paciente" según se usa en este documento se refiere a un ser humano o animal.

Las preparaciones farmacéuticas que comprendes los CRAA de la invención se formulan convenientemente para la administración con un medio aceptable tal como agua, solución salina tamponada, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares), sulfóxido de dimetilo (DMSO), aceites, detergentes, agentes de suspensión o mezclas adecuadas de los mismos. La concentración de CRAA en el medio elegido dependerá de la naturaleza hidrófoba o hidrófila del medio, así como de otras propiedades del CRAA. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente los límites de solubilidad.

Según se usa en este documento "medio biológicamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión y similares que puedan resultar adecuados para la ruta de administración deseada de la preparación farmacéutica, como se ejemplificó en el párrafo anterior. El uso de tal medio para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el CRAA a administrar, está contemplado su uso en la preparación farmacéutica.

Se aplicarán procedimientos de inmunización convencionales para inducir las síntesis de Ac catalíticos. Se administrarán tres inyecciones intraperitoneales y una intravenosa de los inmunógenos (aproximadamente 100 \mug de péptido cada una). La inmunización final se realizará por vía intravenosa. En los estudios en animales se usará RIBI. Para uso en seres humanos, se usará alum como adyuvante. Alum está aprobado para uso en seres humanos y ha mostrado previamente provocar la síntesis de Ac para un epítopo B-T similar a los propuestos en la presente invención. RIBI es un reemplazo de baja toxicidad para el Adyuvante Completo de Freund, y facilita de manera reproducible buenas respuestas de Ac para una diversidad de Ag. El análisis de dos adyuvantes es ventajoso porque la calidad y magnitud de respuestas de Ac para vacunas pueden estar influenciadas por los adyuvantes, a través de efectos de las citocinas y subpoblaciones de TH reclutadas por los adyuvantes en B.

Los CRAA pueden administrarse por vía parenteral por medio de inyección intravenosa en el torrente sanguíneo, o por vía subcutánea, inyección intramuscular o intraperitoneal. Las preparaciones farmacéuticas para inyección parenteral se conocen comúnmente en la técnica. Si se selecciona la inyección parenteral como un procedimiento para administrar las moléculas de la invención, deben llevarse a cabo etapas para asegurar que suficientes cantidades de las moléculas alcancen sus células diana para ejercer un efecto biológico.

La preparación farmacéutica se formula en forma de monodosis para facilitar la administración y para lograr una dosificación uniforme. Forma de monodosis, según se usa en este documento, se refiere a una unidad físicamente discreta de la preparación farmacéutica adecuada para el paciente sometido a tratamiento. Cada dosificación contendrá una cantidad de ingrediente activo calculada para producir el efecto deseado en asociación con un vehículo farmacéutico seleccionado. Los expertos en la técnica conocen los procedimientos para determinar la monodosis adecuada.

La preparación farmacéutica que comprende el CRAA puede administrarse en intervalos adecuados, por ejemplo, dos veces al día hasta que los síntomas patológicos se reducen o alivian, tras lo cual puede reducirse la dosificación hasta un nivel de mantenimiento. El intervalo adecuado en un caso particular dependerá normalmente de la afección y el estado patogénico que se intenta tratar en el paciente.

III. Administración de anticuerpos catalíticos

Los anticuerpos catalíticos descritos en este documento se administran generalmente a un paciente como una preparación farmacéutica.

La preparación farmacéutica que comprende los anticuerpos catalíticos de la invención se formula convenientemente para administración con un medio aceptable tal como agua, solución salina tamponada, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares), sulfóxido de dimetilo (DMSO), aceites, detergentes, agentes de suspensión o mezclas adecuadas de los mismos. La concentración de anticuerpos catalíticos en el medio elegido dependerá de la naturaleza hidrófoba o hidrófila del medio, así como de otras propiedades de los anticuerpos catalíticos. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente los límites de solubilidad.

Según se usa en este documento, "medio biológicamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión y similares que puedan resultar adecuados para la ruta de administración deseada de la preparación farmacéutica, como se ejemplificó en el párrafo anterior. El uso de tal medio para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el anticuerpo catalítico a administrar, está contemplado su uso en la preparación farmacéutica.

Se usarán los procedimientos de inmunización pasiva cuando se administren los anticuerpos catalíticos de la invención. En una forma de realización de preferencia, los Ac se administran al paciente por infusión intravenosa. Para el tratamiento de ciertos trastornos médicos, deben llevarse a cabo etapas para asegurar que suficientes cantidades de las moléculas alcancen sus células diana para ejercer un efecto biológico. Es posible que tenga que aumentarse la lipofilia de las moléculas, o de la preparación farmacéutica en la que se administran para que las moléculas puedan llevar a sus localizaciones diana. Además, los anticuerpos catalíticos de la invención pueden tener que administrarse en un vehículo dirigido a las células de manera que un número suficiente de moléculas alcanzarán las células diana. Los procedimientos para aumentar la lipofilia y para dirigir las moléculas terapéuticas, que incluyen el encapsulamiento de los anticuerpos catalíticos de la invención en liposomas provistos de anticuerpos, son conocidos en la técnica.

Los anticuerpos catalíticos que son el tema de la presente invención pueden usarse como fragmentos de anticuerpos o anticuerpos completos o pueden incorporarse en una molécula recombinante o conjugarse a un vehículo tal como polietilenglicol. Además cualquiera de tales fragmentos o anticuerpos completos pueden unirse a vehículos capaces de provocar la transferencia de dichos anticuerpos o fragmentos a través de las membranas celulares como se mencionó anteriormente. Los vehículos de este tipo incluyen pero no se limitan a los descritos (Cruikshank y col., en el Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology, marzo de 1997).

La preparación farmacéutica se formula en forma de monodosis para facilitar la administración y para lograr dosis uniformes. Forma de monodosis, según se usa en este documento, se refiere a una unidad físicamente discreta de la preparación farmacéutica adecuada para el paciente sometido a tratamiento. Cada dosificación contendrá una cantidad de ingrediente activo calculada para producir el efecto deseado en asociación con un vehículo farmacéutico seleccionado. Los expertos en la técnica conocen los procedimientos para determinar la monodosis adecuada. Por ejemplo, la semivida de IgG singénica en el ser humano es de aproximadamente 20 días. Durante este período, 60.480 moléculas de Ag serán escindidas por una molécula de un anticuerpo con un recambio de 2,1/minuto (que es el recambio de una cadena L de anti-VIP humano aislada de una biblioteca de presentación de fagos [14]. Puede observarse, por consiguiente, que los anticuerpos peptidasa pueden expresar actividad neutralizadora de antígenos considerablemente más potente que las moléculas que se unen estequiométricamente, de manera reversible. Nótese que las cadenas livianas de anticuerpos analizadas aquí se seleccionaron en base a su afinidad de unión al antígeno, un procedimiento que favorece la unión fuerte al antígeno, pero que no seleccionará los catalizadores con el mejor recambio. Los anticuerpos producidos por inmunización con CRAA y aislados por medio de procedimientos de selección adecuados, según se describe en este documento, expresarán un recambio considerablemente superior. Tales anticuerpos catalíticos pueden usarse para tratar la enfermedad con dosis sustancialmente más bajas que los anticuerpos no catalíticos
correspondientes.

La preparación farmacéutica que comprende los anticuerpos catalíticos puede administrarse en intervalos adecuados, por ejemplo, dos veces por semana hasta que los síntomas patológicos se reducen o alivian, tras lo cual puede reducirse la dosificación hasta un nivel de mantenimiento. El intervalo adecuado en un caso particular dependerá normalmente de la afección y el estado patogénico que se intenta tratar en el paciente.

Se seleccionarán los CRAA que generen anticuerpos catalíticos para inmunoterapia pasiva o activa que cumplan los criterios estándar para agentes profilácticos o terapéuticos: (1) La escisión del antígeno peptídico diana por el anticuerpo catalítico llevará a un cambio beneficioso en el proceso patológico al activar funcionalmente o al inactivar funcionalmente el antígeno peptídico diana; y (2) La administración de dichos anticuerpos catalíticos o la inducción de su producción en el cuerpo por medio de inmunización con un CRAA dará como resultado un índice terapéutico favorable de manera que el beneficio ganado sea mayor que la morbilidad asociada con los efectos laterales. Las discusiones sobre la forma en que se establecen tales criterios para aceptabilidad de agentes profilácticos o terapéuticos son comunes en la técnica y pueden encontrarse en textos tales como Guide to Clinical Trials por Bert Spilker, Raven Press, Nueva York, 1991.

Las categorías adecuadas de antígenos peptídicos diana profilácticos o terapéuticos para la práctica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, citocinas, factores de crecimiento, receptores de citocinas y de factores de crecimiento, enzimas, reguladores transcripcionales particularmente los implicados en el control del programa celular (diferenciación, proliferación y muerte celular programada), otros inductores de estos programas celulares, bombas celulares capaces de expulsar agentes anticancerosos, antígenos peptídicos microbianos y virales.

Los anticuerpos monoclonales convencionales que actúan para inhibir la función de moléculas diana particulares están entre los tipos más comunes de agentes terapéuticos bajo desarrollo para uso clínico por las compañías de biotecnología y farmacéuticas. Algunos de estos han mostrado promesas clínicas sustanciales y cualquier antígeno peptídico diana expuesto que sea parte de la misma unidad funcional molecular ha mostrado por consiguiente ser particularmente adecuado como dianas potenciales para los anticuerpos catalíticos que son el tema de la presente invención. Los anticuerpos catalíticos contemplados en la presente invención constituirán una mejora importante sobre los monoclonales convencionales por su capacidad para afectar a muchas moléculas diana frente a sólo una y por la disminución drástica en el coste del tratamiento. La disponibilidad de enlaces peptídicos dentro de estos antígenos marcados puede determinarse por medio de procedimientos bien establecidos en la técnica incluidos, pero no limitados a, la demostración de la escisión tras la exposición a enzimas proteolíticas y cadenas livianas catalíticas capaces de escindir una variedad de enlaces peptídicos.

En las Figuras 19A y 19B se muestra una lista de algunos de los antígenos marcados por anticuerpos monoclonales convencionales que muestran promesas clínicas y las correspondientes indicaciones médicas.

Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar un análogo de antígeno reactivo de manera covalente, y un procedimiento para producirlo, que sea capaz de 1) provocar la generación de anticuerpos catalíticos específicos para un antígeno predeterminado de la invención y/o 2) inhibir de manera irreversible la acción catalítica de los anticuerpos catalíticos asociados con enfermedades autoinmunes y ciertos trastornos linfoproliferativos. Otros objetos residen en proporcionar procedimientos para preparar antígenos y sus correspondientes anticuerpos, y en proporcionar ensayos y procedimientos para usar estos anticuerpos como agentes terapéuticos beneficiosos.

Ejemplo 1ª Anticuerpos catalíticos para inmunoterapia tumoral

En el presente ejemplo se describen procedimientos para producir anticuerpos catalíticos (Ac) adecuados para el tratamiento del cáncer. Tales anticuerpos ofrecen alternativas superiores de inmunoterapia para el tratamiento del cáncer gracias a la función catalítica, ya que la escisión del antígeno diana dará como resultado su inactivación permanente. Además, una única molécula de Ac puede reutilizarse para inactivar múltiples moléculas de antígeno. En comparación, los Ac no catalíticos unen los antígenos de manera estequiométrica, y la unión es reversible. Tras la disociación del complejo, el antígeno puede recuperar sus funciones biológicas.

Se utilizará el antígeno asociado a tumor, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), para la síntesis de un antígeno ejemplar adecuado para estimular la producción de anticuerpos con actividades enzimáticas. Trabajos previos sobre anticuerpos peptidasa han revelado lo siguiente: 1) ciertos Ac son capaces de combinar la capacidad para unir antígenos peptídicos individuales con una actividad de escisión de enlaces peptídicos; 2) el sitio peptidasa es estructuralmente similar al sitio activo de las serina proteasas no-AB. Este sitio está localizado en el dominio Vl y está codificado por un(os) gen(es) del dominio V de la línea germinal; y 3) la síntesis de los Ac peptidasa se produce a niveles aumentados en la enfermedad autoinmune.

EGFR tiene funciones vitales en la transducción de señales necesarias para la diferenciación celular y la mitosis. Véase Figura 2. Además, las señales transducidas a través de EGFR se han implicado en la invasividad y transformación tumorales. La unión de EGF o TGF\alpha al receptor de EGF estimula las actividades tirosina cinasa y de autofosforilación del receptor. La activación del receptor lleva a una cascada da acontecimientos intracelulares que culminan en la proliferación celular aumentada.

Se ha asociado a la sobreexpresión del gen de EGFR con una serie de neoplasias, incluidos adenocarcinoma y carcinoma de células escamosas del pulmón, carcinoma de mama, carcinoma de colon, ginecológico y de vejiga, glioma, carcinomas hepatocelular y pancreático y carcinomas de próstata. Se ha atribuido la sobreexpresión en algunos tumores a la amplificación del gen de EGFR [15].

EGFR es un antígeno tumoral adecuado, ya que es expresado en niveles mucho más elevados en tumores comparado con los tejidos normales. Por consiguiente, los Ac para EGFR son candidatos adecuados para reactivos antitumorales. Han surgido muchos anticuerpos monoclonales (AcMo) para EGFR para epítopos específicos del receptor que no compiten unos con otros por la unión de EGFR [por ejemplo, 16]. Mendelsohn y sus colaboradores han descrito AcM de ratón surgidos usando la proteína del receptor de EGF de células de carcinoma epidermoide A431 humano como el inmunógeno. Los AcM que inhiben la unión de EGF al EGFR también inhibieron la actividad tirosina proteincinasa estimulada por EGF que se ensayó usando células intactas o membranas solubilizadas y un sustrato peptídico exógeno. Además, estos AcM inhibieron la proliferación de células A431 en cultivos tisulares, mientras que aquellos incapaces de bloquear la unión de EGF a EGFR no tuvieron efecto en la proliferación celular. Otras investigaciones mostraron que la administración de AcM anti receptor de EGF puede inhibir la formación tumoral por células A431 en ratones atímicos. Se ha mostrado que AcM de diferentes isotipos inhiben el crecimiento tumoral en ratones, indicando que las funciones efectoras del dominio constante probablemente no son críticas en actividad antiproliferativa observada. Se observó la inhibición completa del crecimiento tumoral in vivo, a condición de que se administraran cantidades suficientes de Ac. Los pocos tumores que persisten siguen expresando EGFR, sugiriendo que su supervivencia se debe a la exposición inadecuada de las células a los Ac [17].

Usando una línea celular de carcinoma de mama como el inmunógeno, Modjtahedi y col., [16] generaron varios AcM contra EGFR, algunos de los cuales bloquearon la unión de factores de crecimiento por el EGFR e inhibieron el crecimiento de líneas celulares de carcinoma escamoso humano. Se han preparado otros varios AcM específicos de EGFR usando receptores de EGF purificados o células que expresan altos niveles de EGFR como los inmunógenos [18]. Actualmente están en curso ensayos clínicos en Fase 1 de Ac anti EGFR para el tratamiento de gliomas malignos [19, 20], cáncer de cabeza y cuello y cáncer de pulmón.

Los datos revelan que pueden utilizarse Ac capaces de interrumpir la unión de EGF al EGFR para desarrollar agentes eficaces para inmunoterapia de tumores que expresan EGFR. Se ha notado una correlación inversa entre la expresión de EGFR y los niveles de BCL-2, una proteína que desempeña una función importante en revertir la muerte celular programada (apoptosis). La unión de ligandos por el EGFR bajo ciertas condiciones ha mostrado proteger las células tumorales de la apoptosis inducida por c-myc. Las células de glioblastoma transfectadas con un EGFR mutante exigen apoptosis disminuida [21]. En principio, por consiguiente, los Ac para EGFR pueden ser capaces de inducir la apoptosis en células tumorales. Si esto es posiblemente válido, la posibilidad de regresión tumoral completa por medio de una vía apoptótica tras el tratamiento con Ac para EGFR será reforzada.

Los Ac capaces de escindir EGFR comprende agentes inmunoterapéuticos superiores comparados con sus análogos no catalíticos por las siguientes razones: (a) La escisión del EGFR en los enlaces peptídicos adecuados podría causar pérdida permanente de la actividad biológica, mientras que la unión de EGFR por un Ac no catalítico puede ser reversible, y la disociación del Ac regenerará las funciones biológicos del EGFR; y (b) una única molécula catalizadora puede escindir múltiples moléculas de sustrato, mientras que los Ac no catalíticos pueden actuar sólo de manera estequiométrica.

En este documento se describen tres estrategias para la preparación de Ac catalíticos. La primera estrategia saca provecho de la disponibilidad de cadenas livianas de Ac clonadas con actividad peptidasa. Estudios previos han sugerido que la actividad peptidasa no específica que reside en el dominio VL puede dirigirse por la especificidad de unión al antígeno del dominio VH. Se generarán construcciones híbridas de Fv compuestas de un dominio VL disponible unido al los dominios VH de unión al EGFR. Tras la síntesis y expresión en sistemas de expresión adecuados, se evaluará la actividad de escisión de EGFR específica de las construcciones Fv.

La segunda estrategia de clonación se basa en la observación de que ciertos Ac expresados en enfermedades autoinmunes utilizan sitios catalíticos serina proteasa codificados por genes VL de la línea germinal. Se inmunizarán ratones con enfermedad autoinmune de base con células que expresan EGFR. Tras la inmunización, se aislarán los dominios Fv catalíticos de una biblioteca de presentación de fagos. Se seleccionarán catalizadores que combinen la actividad catalítica codificada por la línea germinal con la especificidad por EGFR adquirida somáticamente por medio de la unión a análogos de antígenos reactivos de manera covalente (CRAA) reactivos con residuos serina nucleófilos, seguido por la unión al dominio extracelular de EGFR.

La tercera estrategia se basa en la hipótesis que el sistema inmune puede forzase para que utilice el sitio catalítico codificado por la línea germinal para sintetizar Ac para EGFR. Se inmunizarán ratones con un CRAA electrófilo de un péptido de EGFR capaz de estimular de preferencia la síntesis de Ac catalíticos. Se evaluarán los efectos inhibitorios de los catalizadores de Ac producidos de esta manera sobre la tumorigenicidad de una línea celular humana que expresa EGFR in vivo usando una diversidad de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, es decir, inhibición de la autofosforilación de EGFR estimulada por EGF y la inhibición del crecimiento de las células tumorales.

Las composiciones y los procedimientos descritos en este documento facilitan la preparación de anticuerpos de escisión de EGFR catalíticamente eficaces adecuados para la inmunoterapia del cáncer. La Figura 3 resume el enfoque a seguir. Estudios previos han establecido la viabilidad de aislar Ac capaces de catalizar la escisión de ciertos Ag, es decir, VIP, tiroglobulina y gp120. En la presente invención se ha aplicado información de estos estudios dando como resultado las estrategias descritas para preparar Ac catalíticos para EGFR.

Se proporcionan los siguientes materiales y procedimientos para facilitar la práctica de la presente invención.

Materiales y procedimientos

Inmmunización: Se hiperinmunizarán seis ratones MRL/lpr con células que expresan EGFR como se describió anteriormente. Brevemente, se recuperarán aproximadamente 10^{7} células A431 por tripsinización de matraces de cultivo tisular, se retomarán en PBS y se administrarán en adyuvante en RIBI a los ratones por vía intraperitoneal. Se realizarán tres inmunizaciones de estímulo usando aproximadamente 5 x 10^{6} células en intervalos de diez días. Si no se alcanzan valores elevados de Ac, se administrarán inyecciones de estímulo con el dominio celular soluble del receptor del factor de crecimiento epidérmico (exEGFR) (25 \mug). Para llevar al sistema inmune generar anticuerpos catalíticos se hiperinmunizarán seis ratones MRL/lpr por vía i.p. con TSA-EGFR conjugado con hemocianina de lapa (KLH) (50 \mug de proteína) en RIBI de acuerdo con el esquema anterior. Se obtendrá sangre del plexo retro orbital en intervalos de diez días. Expresión y purificación de exEGFR: Se purificará el dominio extracelular de EGFR (exEGFR, compuesto por residuos 1-621 de EGFR) de un sistema de expresión de baculovirus como se describió anteriormente [22]. La expresión del exEGFR se realiza en células Sf9 de insecto, que secretan aproximadamente 2 mg/ml del exEGFR en el sobrenadante del cultivo [22]. La purificación por un procedimiento de cromatografía de intercambio iónico en dos etapas, permite recuperar la proteína con una homogeneidad de aproximadamente 95%, según se determina por SDS-PAGE [22].

Preparación y purificación del péptido EGFR-CRAA: El CRAA está compuesto por tres elementos básicos: un éster de fosfonato electrófilo con los residuos 294-303 de EGFR vecinos en el lado N terminal y los residuos 304-310 de EGFR vecinos en el lado C terminal. Véase Figura 4. La electrofilia se encuentra en el átomo de fósforo y está proyectada para atrapar residuos serina nucleófilos presentes en los Ac. El esquema de síntesis básico para sintetizar tales CRAA se ha descrito [23]. Brevemente, se une un fosfinato que contiene isóstero de lisina (residuo 303 de EGFR) a la secuencia peptídica vecina adecuada. El isóstero se prepara a partir de sal difenilmetilamina del ácido hipofosforoso y 6-aminohexanal, seguido por la eliminación del grupo difenilmetilo en ácido [24]. Los péptidos vecinos necesarios se preparan por medio de síntesis peptídica en fase sólida convencional, excepto en que el péptido que corresponde a los residuos 304-310 de EGFR contiene ácido 2-hidroxi-6-aminohexanoico en lugar de la lisina N terminal. Se unirán péptidos con cadenas laterales protegidas a la estructura fosfinato por medio de procedimientos de síntesis peptídica de fase en solución clásicos. La estructura fosfinato se convertirá en el feniléster de fosfonato por acoplamiento oxidativo con fenol. El extremo N terminal del péptido CRAA-EFGR con cadena lateral protegida se acoplará a KLH por el procedimiento de glutaraldehído. La mezcla de reacción se separará por filtración a través de gel y se analizará la presencia de fósforo inorgánico del péptido no conjugado residual en las fracciones moleculares inferiores tras la digestión completa con ácido perclórico. Esto permitirá estimar la eficacia de conjugación.

ELISA para exEGFR y EGFR-CRAA: Se recubrirán placas de PVC de 96 pocillos con exEGFR o CRAA-EGFR (100 ng/ml), los sitios de unión de proteínas excedentes se bloquearán con albúmina al 5% y se medirá la unión de Ac séricos adecuadamente diluidos a los antígenos inmovilizados. El grado de la reacción se mide por el tratamiento con IgG de cabra anti-ratón marcada para peroxidasa. Los controles incluyen la incubación con suero preinmune y con exceso de exEGFR competidor soluble. El procedimiento para medir la unión de exEGFR y CRAA-exEGFR por las construcciones Fv clonadas es esencialmente como el anterior, excepto en que la reacción se visualiza por medio de tratamiento con Ac de ratón anti-c-myc (las proteínas recombinantes contienen una etiqueta c-myc de 10 residuos) e IgG anti-ratón marcada para peroxidasa.

Preparación de Fv: Se aplicarán los procedimientos descritos en las publicaciones anteriores [10, 14, 25] con ciertas adaptaciones, según se resume a continuación. Véase también Figura 5. La construcción de una biblioteca de ADNc de Fv se realizará de la siguiente manera: Se prepara ARN total por medio de procedimientos convencionales a partir de esplenocitos de ratones inmunizados mientras se minimiza la contaminación de ARNasa. Se producirán bibliotecas de ADNc de VL (residuos 1-113) y ADNc de VH (residuos 1-123) a partir del molde de ARN usando transcriptasa inversa y cebadores directos de VL o VHY adecuados, que contienen, respectivamente, un sitio de restricción SfiI para clonar en el vector y una secuencia complementario que codifica un péptido conector. El ADNc se amplifica por PCR usando Taq, dNTP y cebadores adecuados como se muestra en la Figura 5. Los cebadores inversos se basan en secuencias que codifican aminoácidos N-terminal conservados en las regiones FR1. Se ha introducido degeneración limitada en los cebadores para permitir la amplificación de familias de genes V muy relacionadas (por ejemplo, familias \kappa 2,3,6). Se necesitan 6 cebadores inversos de VL, 8 cebadores inversos de VH, 1 cebador directo de VL y dos cebadores directos de VH. Los cebadores directos se diseñan para hibridar con las secuencias de regiones constantes próximas al extremo 3' del dominio V [26]. Los cebadores inversos de VH y VL contienen un sitio NotI para clonación y una secuencia sentido que codifica el conector. El conector es un péptido flexible de 14 residuos. Los sitos SfiI y NotI son sitios de corte excepcionales, que minimizan la pérdida de diversidad de la biblioteca en la etapa de digestión por restricción. Tras completar la PCR, se cortan las bandas de ADNc amplificadas del tamaño correcto del gel de agarosa, se extraen usando Geneclean II (BIO 101) y se cuantifican por fluorescencia de EtBr (\lambdaem a 590 nm, \lambdaex a 302 nm). Las especies de ADNc de VL y VH se unen por extensión por solapamiento, es decir, hibridación de las secuencias sentido y antisentido del conector y completado de las dos hebras con Taq. Las especies de ADNc individuales se purifican por electroforesis en gel de agarosa y kits Wizard (Promega) previo a realizar la reacción de conexión.

Clonación y presentación de fagos: A continuación se clonará la biblioteca en el vector fagémido pCANTABhis_{6} [27]. El vector contiene los siguientes elementos de secuencia: sitios de restricción, un péptido señal, un péptido estructural gene3, un codón de terminación (ámbar) entre el inserto y gene3, una etiqueta péptido c-myc, poli(his)_{6},
un promotor lac inducible por IPTG y un gen de resistencia a la ampicilina. El codón ámbar permite la secreción de dominios V solubles o su expresión como proteínas de fusión p3 en la superficie del fago, según la cepa huésped (las células HB2151 reconocen al codón ámbar como una terminación y las células TG1 reconocen al ámbar como Glu). El ADNc y el vector se digieren de manera secuencial con SfiI y NotI seguido por unión usando ligasa de ADN T4. Las células huésped se transforman por electroporación, se seleccionan los clones en kanamicina y se confirma la presencia de insertos en colonias individuales por medio de PCR usando cebadores localizados en el vector secuencia arriba y secuencia abajo del inserto, que dan bandan teñidas con EtBr a 0,7 kb. La adición del fago ayudante (VCSM13) permite empaquetar las partículas de fagos desde los cultivos celulares TG1. Se precipitan dos veces las partículas en el sobrenadante del cultivo con PEG al 4%, dando el fago listo para los procedimientos de selección que se describen a continuación.

Selección de Fv de unión a EGFR: se recubrirán placas de poliestireno con exEGFR a una concentración de aproximadamente 5 \mug/ml en PBS. Tras eliminar la proteína sin unir y la saturación de los sitios no específicos de unión a proteínas, se incuban las placas con las preparaciones del fago. El fago sin unir se eliminará por lavados intensos y las partículas de fago unidas se eluirán usando un tampón de pH 3,0.

Dominio catalítico VL y biblioteca de Fv híbridos: Se prepararán las bibliotecas de Fv híbridos uniendo un dominio VL que ya se ha establecido que posee actividad catalítica (clon U24 [15]) aislado de un ratón no inmunizado con dominios VH de la biblioteca de Fv de unión a EGFR. El ADNc del dominio VL se amplificará nuevamente por PCR como anteriormente, excepto en que el cebador directo contendrá un sitio NotI para clonación directa en el vector. Los dominios VH se amplificarán nuevamente de la biblioteca de ADNc de Fv de unión a EGFR usando cebadores de VH descritos anteriormente, excepto en que el cebador directo contiene una secuencia complementaria del conector. La unión VL/VH será como se describió anteriormente.

Expresión y purificación de Fv soluble:

Se cultiva el ADN del fagémido de clones seleccionados en células HB2151. Los extractos periplásmicos contienen 2-10 mg/l de la proteína recombinante. La cromatografía es en Ni-Sepharose (Qiagen). Se eliminan las proteínas no unidas con un tampón de NaCl 0,5 M. Los anticuerpos recombinantes se eluyen a pH 5 o con imidazol. Una segunda cromatografía de afinidad de metales proporciona proteínas recombinantes puras, evaluadas por electroforesis en SDS, isoelectroenfoque, cromatografía Mono-Q y secuenciación de aminoácido N terminal. Cada lote de proteína purificada se analiza por filtración en gel (columna Superose 12) y por inmunoadsorción con Ac anti-c-myc inmovilizados [14] para confirmar que la actividad catalítica pertenece a los fragmentos de Ac. Los procedimientos cromatográficos se realizan usando un sistema FPLC en gradiente. La secuenciación de aminoácidos se realiza usando transferencias de geles de electroforesis por la Protein Structure Core Facility en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska.

Reactivos de selección del catalizador: Se prepararán dos componentes capaces de sufrir reacciones covalentes con residuos serina nucleófilos. El primer compuesto, un reactivo bifuncional fluorofosfato (FP), es similar al inhibidor de serina proteasa DFP que ha mostrado en estudios previos que inhibe las actividades catalíticas de los Ac. Por la pobre estabilidad del DFP en agua, su unión directa a un soporte sólido para adsorción de fagos no es práctica. Se usará un reactivo bifuncional que contiene un grupo FP conjugado a una etiqueta de afinidad como biotina que permitirá la inmovilización del conjugado en fase sólida recubierta con avidina. El éster de FP se hará reaccionar con biotina activada con N-hidroxisuccinimida (NHS-LC biotina II, Pierce Chemical Co., 1 en la Figura 6, que también introduce un espaciador más largo para minimizar los efectos de impedimento estérico. La síntesis continuará por esterificación del diéster de fosfato 2 con NHS-LC biotina II (1). El compuesto 2 se obtendrá por fosforilación de 4-triisopropilsililoxi-2-butanol con fosfato de dicloroisopropilo seguida por la hidrólisis y desprotección del intermedio monoclorofosfato. La conversión al fluorofosfato 3 se realizará en la etapa final por tratamiento con fluoruro de dietilaminosulfurilo (DAST). El reactivo 3 debe conservarse en dioxano u otro disolvente orgánico para mitigar la posible autorreactividad. Posteriormente se transferirá una alícuota de la disolución orgánica a una disolución acuosa que contiene el fago para dar una concentración efectiva de 0,1 hasta 0,5 mM de 3. En el caso de que la autorreactividad química del reactivo 3 sea muy importante para la aplicación práctica, se considerará una etiqueta de fluoresceína como una alternativa para la biotina. La fluoresceína contiene un OH fenólico y un éster carboxílico que deberían ser compatibles con el fluorofosfato. La fluoresceína se acilará con el derivado fosfato 4 (obtenible por medio del tratamiento de 2 con anhídrido glutárico) para formar un enlace amida para su grupo anilina. La fluoración en el fósforo para obtener 5 se realizará por medio del tratamiento con DAST. Véase Figura 6.

También se preparará una matriz de péptido aldehído como medio para atrapar los sitios de serina proteasa. El ligando que contiene arginal disponible comercialmente (N-[-N-carbonil-Arg-Val-Arg-al]-Phe) se activará con carbodiimida y se unirá de manera covalente por medio del grupo carboxilo del residuo Phe a los residuos amino de AH-Sepharose 4B (Pharmacia). Los procedimientos de síntesis son de rutina y han sido detallados por Pharmacia.

Selección de Fv catalítico: Se hará pasar la biblioteca de fagos Fv a través del reactivo de atrapamiento de serina proteasa inmovilizado descrito anteriormente. Se eliminarán los fagos no unidos por medio de lavado intenso. La elución del fago unido se realizará con glicina-HCl 0,1 M, pH 2,2, que es suficiente para interrumpir las interacciones biotina-avidina y fluoresceína-antifluoresceína. La elución también podría realizarse usando hidroxilamina 0,1-1 M para disociar el enlace fosfato-serina. La elución de la matriz péptido aldehído se realizará con tampón débilmente ácido (pH 4,5), que favorece la rotura del aducto hemiacetal. Las partículas de fagos recuperadas de la matriz de unión de serina proteasa se amplificarán por cultivo en células TG1 y a continuación se someterán a selección por unión a exEGFR inmovilizado como se describió anteriormente para la selección de Fv de unión a EGFR.

Selección para actividad catalítica: Se seleccionarán fragmentos Fv para escisión de exEGFR, el péptido CRAA-EGFR y un sustrato de peptidasa no específico, Pro-Phe-Arg-metilcoumarinamida (MCA). Se ha desarrollado un protocolo para purificar rápidamente grandes cantidades de clones de Ac basado en su capacidad de unión a metales. Se incuban los sobrenadantes bacterianos con Ni-Sepharose en placas de 96 pocillos montadas con un filtro de nitrocelulosa, el material no unido se elimina por medio de lavados con tampón de pH neutro y los dominios V unidos se eluyen en una placa de captura usando un tampón de pH 5. Un aparato Millipore Multiscreen permite el rápido procesamiento. Se neutraliza el eluato y se añaden Pro-Phe-Arg-MCA (500 \muM), [^{125}I] exEGFR o [^{125}I] EGFR (tyr, 294-310) (aproximadamente 30.000 cpm). La hidrólisis del sustrato péptido-MCA se determina usando un lector de placas (\lambdaex a 360 nm, \lambdaem a 470 nm; la escisión del enlace amida que une Arg a aminometilcoumarina produce fluorescencia aumentada). El sustrato péptido-MCA está disponible comercialmente. El EGFR (tyr, 294-310) es un péptido sintético de 19 residuos que corresponden a los residuos 294-310 de EGFR con un residuo tirosina posicionado en el extremo N terminal para permitir la radiomarcación con ^{125}I. La preparación de ^{125}I exEGFR y [^{125}I] EGFR (tyr, 294-310) se realiza por el procedimiento convencional de cloramina-T. La eliminación del ^{125}I es en un columna de filtración de gel desechable o en una columna de HPLC en fase inversa, respectivamente. La escisión de exEGFR se determina por electroforesis en SDS no reductora (geles al 4-15%) usando un sistema PHAST (Pharmacia) seguida por autorradiografía usando película XAR de Kodak y exploración cuantitativa de las áreas de las bandas usando el programa Image. La reacción será evidente por la depleción de la banda de 105 kD y la aparición de fragmentos radiactivos más pequeños. Se tiene la precaución de cuantificar sólo las bandas que se encuentran dentro del intervalo de respuesta lineal de la película de rayos X. La escisión del [^{125}I] EGFR (tyr, 294-310) se determinará midiendo la radiactividad presentada soluble en ácido tricloroacético al 10%. El procedimiento de precipitación con TCA es similar al descrito previamente para determinar la escisión de VIP [3]. El procedimiento se validará por comparación con HPLC en fase inversa en una columna C-18. Si se encuentran dificultades pueden realizarse electroforesis en geles PAGE al 25% para discriminar entre el péptido intacto y sus fragmentos, como se describió previamente para VIP [28]. Los controles serán eluatos de bacterias transformadas con el vector sin un inserto de ADNc o ADNc que codifique un Fv no catalítico. La transferencia en mancha con un Ac anti-c-myc como se describió en [25] permite la cuantificación de la proteína recombinante.

Selección para inhibición de unión de EGF: Los clones seleccionados se seleccionarán para su efecto en la unión de EGF marcado con ^{125}I a células A431 en placas de 96 pocillos usando los procedimientos publicados previamente por los autores de esta invención [15, 18]: Se plaquearán las células (1 x 10^{5} células/pocillo) en los pocillos y se las dejará adherir a la fase sólida, se añadirá EGF marcado con ^{125}I (Amersham) y las disoluciones de Fv (aproximadamente 1 nM), la mezcla de reacción se incubará durante 60 minutos, se lavarán los pocillos tres veces en tampón de unión helado y se contarán los pocillos para EGFR marcado con ^{125}I unido. Los controles incluirán ensayos de unión realizados en ausencia de Fv y en presencia de exceso de exEGFR competidor.

Evaluación de las propiedades catalíticas

Se realizará un ensayo de escisión por inmunotransferencia para confirmar que la reacción de escisión no se debe a artefactos asociados con la radiomarcación de exEGFR. Se trata aproximadamente 1 \mug de exEGFR purificado con el catalizador durante un período de tiempo adecuado seguido por SDS-PAGE. Se transfiere el gel a la nitrocelulosa y se tiñe con anti-exEGFR policlonal de conejo seguido por IgG anti conejo-peroxidasa. La depleción de exEGFR intacto inmunoteñido y la aparición de fragmentos de exEGFR inmunoteñidos indicará la escisión de exEGFR.

\newpage

Cinética: Se calculan las tasas iniciales para la hidrólisis catalizada por Ac de exEGFR mezclado con cantidades crecientes de exEGFR no marcado en base a las intensidades de las bandas observadas por electroforesis en SDS y autorradiografía. La velocidad de escisión de exEGFR se determina a partir de la intensidad de la banda de sustrato intacto, y las velocidades de las reacciones individuales, a partir de la intensidad de las bandas de cada producto. Las constantes cinéticas (K_{m}, k_{cat}) se calcularán a partir de los datos de tasas ajustados a la ecuación de Michaelis-Menten {v=(V_{máx}\cdot[S])/(K_{m}+[S])}. También se realizarán estudios cinéticos usando péptidos exEGFR sintéticos como el sustrato, un péptido en el que sólo se escinde un único enlace peptídico. El uso de tal sustrato se determinará como se describió anteriormente, excepto en que se usará HPLC en fase inversa para separar los productos. La cuantificación se realizará determinando el área bajo los picos del producto observados a 214 nm.

Sitios de escisión: Para identificar los enlaces peptídicos escindidos por los Ac, se incubará exEGFR electroforéticamente puro con el catalizador durante un período suficiente para producir aproximadamente 100 pmoles de fragmentos del producto, se separarán los fragmentos por electroforesis en gel de poliacrilamida, se transferirán a una membrana de PVDF y se secuenciarán las proteínas inmovilizadas por degradación N terminal de Edman en la UNMC Protein Structure Core Facility. Los controles incluirán exEGFR incubado con un Fv inactivo y exEGFR incubado sin Fv. Se identificarán al menos 5 residuos N terminales de cada fragmento para permitir asignar de manera inequívoca los sitos de escisión. Si es necesario, se considerarán el mapeo por digestión con tripsina y la espectrometría de masas-FAB para identificar los fragmentos resultantes, es decir, si el extremo N terminal está bloqueado.

Especificidad de sustrato: Junto con exEGFR, se probará la escisión de los siguientes sustratos: (a) ^{115}I-lisozima; (b)I-tiroglobulina; (c)I-IgG; (d) ^{125}I-VIP; y (e) diversos conjugados péptido-MCA. Los protocolos para ensayar la hidrólisis de estos sustratos están en su lugar. Se marcan la tiroglobulina humana purificada, la lisozima de gallina (Sigma) y la IgG humana de suero con ^{125}I por el procedimiento de cloramina-T y se purifican por filtración en gel [2,4]. Tras la incubación de las proteínas radiomarcadas con los Ac, se realiza la electroforesis de las mezclas de reacción. La autorradiografía permitirá visualizar los productos como bandas de tamaños más pequeños (masa de tiroglobulina intacta (monómero), lisozima e IgG: 330 kD, 15 kD y 150 kD, respectivamente). La escisión de VIP se mide como la cantidad de radiactividad presentada soluble en TCA o por separaciones por HPLC en fase inversa [2]. La escisión de los sustratos que contienen MCA unido a aminoácidos cargados (Arg, Lys, Asp), no cargados (Leu, Ala) y voluminosos (Phe) se mide por fluorimetría.

Aislamiento de catalizadores específicos de escisión de EGFR de ratones inmunizados con un análogo de antígeno reactivo de manera covalente de un péptido de EGFR

Como se mencionó anteriormente, la síntesis de Ac catalíticos está aumentada en las enfermedades autoinmunes. Para obtener catalizadores muy eficaces, el sistema inmune se estimulará además por medio de inmunización con un análogo de antígeno reactivo de manera covalente, CRAA, de un péptido de EGFR (CRAA-EGFR). Este análogo de antígeno se diseña para aumentar el reclutamiento del sitio codificado por el gen V de la línea germinal para la síntesis de Ac catalíticos específicos de EGFR. Además, el CRAA-EGFR también seleccionará sitios catalíticos análogos a proteasa formados por medios somáticos, es decir, reorganizaciones V/D/J y por hipermutación somática.

Las características estructurales fundamentales del CRAA-EGFR son: (a) el átomo de fósforo tetraédrico electrófilo capaz de unirse a residuos serina nucleófilos en Ac catalíticos; y (b) el residuo lisina en el lado N terminal del átomo de fósforo capaz de unirse a sitios catalíticos especializados para escisión en el lado C terminal de residuos básicos; y (c) diez y siete aminoácidos, respectivamente, en los lados N y C terminal de la estructura del CRAA, que corresponden a la secuencia de residuos 294-310 de EGFR.

El átomo de fósforo sirve como el análogo del átomo de carbono del enlace peptídico débil que conecta los residuos 303 y 304 en EGFR. En la configuración de feniléster mostrada en la Figura 4, el átomo de fósforo adquiere una carga positiva parcial, a la vez que el átomo de carbono del enlace débil lleva la carga positiva parcial requerida para esta reacción con los residuos serina nucleófilos. Se ha descrito anteriormente que los O-fenilfosfonatos peptídicos son capaces de inactivar de manera irreversible diversas serina proteasas al formar un enlace covalente con el átomo de oxígeno del sitio activo del residuo serina del sitio activo [29]. Sampson y Bartlett [23] han establecido el protocolo de síntesis química para preparar el fenil éster en el átomo de fósforo y para unir las secuencias peptídicas vecinas al éster de fosfonato.

Debe notarse que el CRAA-EGFR descrito anteriormente es diferente de los TSA de fosfonato aplicados para elevar los Ac esterasa [13]. Los TSA de fosfonato convencionales contienen un oxígeno aniónico unido al fósforo, que puede unirse al hueco de oxianión encontrado en el catalizador. Los TSA de fosfonato, sin embargo, no reaccionan con residuos serina nucleófilos en el sitio catalítico.

Se incorpora un residuo básico en la posición P1 del CRAA-EGFR para explotar la existencia del sitio catalítico específico de residuos básicos, codificado por la línea germinal en los Ac. La presencia del residuo básico, junto con la estructura feniléster de fosfonato, promueve la fuerte unión al sito catalítico y promueve de esta manera la capacidad del CRAA-EGFR para estimular selectivamente la proliferación clónica de las células B que sintetizan los sitios catalíticos.

Los residuos 294-310 de EGFR se incorporan en el CRAA-EGFR para promover la síntesis de Ac con actividad catalítica específica de EGFR, a diferencia de la actividad catalítica no específica. Se ha seleccionado este epítopo porque es un componente del dominio III de EGFR, que es el principal contribuyente de los residuos que constituyen el sitio de unión de EGF [30]. Véase Figura 4. Además, se describe que la mutagénesis de inserción en la región N terminal de esta secuencia da como resultado unión a EGFR reducida. Como se discutió anteriormente, el sitio de unión de EGF está compuesto por residuos no contiguos. Por consiguiente, las interrupciones conformacionales causadas por la escisión proyectada en la posición 303-304 podrían también dar como resultado indirectamente un deterioro de la función del EGFR.

Se prepararán bibliotecas de presentación de fagos Fv a partir de ratones MRL/lpr hiperinmunizados con el CRAA-EGFR. Se medirá la presencia de Ac séricos con elevada afinidad capaces de unirse al CRAA-EGFR por ELISA para confirmar que los ratones generan una respuesta de Ac vigorosa. La preparación y selección de bibliotecas de Fv será esencialmente como se describió [25] excepto en que la selección de fagos se llevará a cabo usando el CRAA-EGFR inmovilizado. La selección para actividad catalítica se realizará como se describió anteriormente en este documento. El sustrato será un péptido de 18 residuos que contiene un residuo tirosina en el extremo N terminal seguido por 17 residuos que corresponden a las posiciones 294-310 de EGFR. El residuo tirosina está localizado lejos del sitio de escisión proyectado para reducir al mínimo la interferencia con el reconocimiento de Fv. Además, la selección para escisión de exEGFR se realizará el epítopo conformacional de los residuos 294-310 como se presentan en la proteína EGFR funcional.

La afinidad de unión de los catalizadores para CRAA-EGFR se determinará por ELISA. Se determinará la inhibición de escisión de 294-310 al aumentar las concentraciones del CRAA-EGFR. El CRAA-EGFR servirá como un sustrato alternativo competitivo, con valores de Ki cercanos a los valores de Kd estimados a partir del ensayo de unión.

Se identificarán los fragmentos del producto generados por escisión de EGFR (294-310) y de exEGFR, que permitirán la deducción del (los) sitio(s) de escisión. Si el reclutamiento de la actividad catalítica se produce principalmente por la estructura éster de fenilfosfonato en el CRAA-EGFR, ambos sustratos deberían escindirse principalmente en el enlace peptídico que conecta los residuos 303 y 304 (enlace Lys-Lys). Como se analizó anteriormente, pueden sintetizarse catalizadores específicos de antígeno mediante inmunización con antígenos de estado base. Por consiguiente, también podrán identificarse catalizadores capaces de escindir EGFR (294-310) en enlaces peptídicos diferentes del enlace 303-304. Una posible diana para escisión se encuentra en el enlace Arg300-Lys301, ya que la actividad codificada por la línea germinal presente en el repertorio preinmune reconoce residuos básicos.

Los procedimientos descritos anteriormente proporcionan una serie de Ac catalíticos de alto recambio y elevada afinidad que reconocen y escinden EGFR en los residuos 303-304 e inducen la pérdida de la actividad de unión de EGF. La inclusión de los residuos 294-310 de EGFR en el inmunógeno asegura el reclutamiento de Ac de alta afinidad para EGFR. La inclusión de la estructura éster de fenilfosfonato induce la selección clónica de los Ac con un sitio catalítico serina proteasa estructuralmente optimizado. Por consiguiente, se sintetizarán catalizadores superiores a los generados en los ratones MRL/lpr por medio de la implementación de la estrategia de CRAA-EGFR resumida en este documento.

Biodistribución y efectos antitumorales in vivo

Para evaluar la biodistribución y los efectos de crecimiento in vivo, se usaron ratones atímicos con tumores humanos como un modelo para estudiar la localización tumoral y los efectos antitumorales de diversos fármacos, toxinas y Ac.

Se compararán la biodistribución de las seis construcciones de Fv catalíticas más prometedoras, junto con una construcción de Fv no catalítica en ratones con tumores. Se establecerá la capacidad de las construcciones de Fv radiomarcadas conI para unirse y escindir el antígeno diana en estudios preliminares. Se calcularán las proporciones tejido con respecto a sangre y tumor con respecto a sangre de las construcciones de Fv. Se realizarán estudios de imágenes para evaluar además la especificidad para el tumor de las preparaciones de Fv. La presencia de la función catalítica en las construcciones de Fv podría llevar a su mayor disociación de la superficie de las células tumorales, porque los fragmentos del producto del antígeno diana se unirán probablemente al catalizador de manera débil comparado con el antígeno intacto. Esto podría dar como resultado proporciones tumor:sangre inferiores para los catalizadores comparadas con el Fv no catalítico. Por otro lado, si la tasa de internalización del Fv en las células tumorales es muy rápida, la función catalítica puede no influir en el patrón de biodistribución del Fv. Se realizarán autorradiografías de secciones tumorales para determinar el grado en que las construcciones Fv están internalizadas por las células
tumorales.

Se evaluará la capacidad para inhibir el crecimiento de células tumorales en ratones atímicos de los catalizadores que escinden el antígeno diana con perfiles de biodistribución favorables, junto con un Fv no catalítico y un Fv irrelevante. Se tomará nota del tiempo hasta la formación del tumor (período latente), el número de ratones que desarrollan tumores y el tamaño de los tumores. El crecimiento tumoral se determina por las tasas relativas de proliferación celular y muerte celular. La apoptosis y la necrosis son los diferentes procesos en la muerte celular. Se cree que EGFR es un regulador importante de la muerte celular apoptótica. Es posible que el tratamiento con las construcciones de Fv catalíticas pueda dar lugar a la regresión completa del tumor, porque las células podrían liberarse de la regulación relativa de la apoptosis por EGFR. Se examinarán secciones criostáticas de los tumores recuperados de los animales por medio de procedimiento inmunohistoquímicos para marcadores de proliferación y apoptosis, es decir, ki-67, bcl-2 y bax. ki-67 es un antígeno asociado a la proliferación presente a través de todo el ciclo celular y es un marcador fiable para evaluar la fracción de crecimiento de una población de células tumorales. Los marcadores bcl-2 y bax ayudarán a evaluar si las células están destinadas a sufrir muerte por apoptosis.

En resumen, los anticuerpos catalíticos de la presente invención representan un reactivo terapéutico beneficioso para el tratamiento de enfermedades neoplásicas.

Ejemplo IB Administración de anticuerpos catalíticos y p53 antisentido en protocolos de quimioterapia combinada

Cuando una célula sufre daño en su genoma existen mecanismos presentes en la célula que determinarán si la célula intentará repararse a sí misma o si sufrirá muerte celular programada. Para que las células proliferativas lleven a cabo eficazmente la reparación genómica, deben salir del ciclo. Esto se alcanza por medio de los denominados "puntos de control del ciclo celular" que dan tiempo a las células proliferativas para reparar el daño genómico en lugar de pasarlos a las células hijas.

La Figura 18 ilustra el papel central de p53 normal (tipo salvaje) para inducir una o la otra de estas dos posibles respuestas de las células al daño genómico. El daño en el genoma lleva a una expresión aumentada de p53 que, a su vez, pone en marcha una diversidad de otros acontecimientos que producen la respuesta celular específica para este daño.

Basándose en estas relaciones, puede esperarse que ciertos agentes que inhiben la función de p53, tales como oligos p53 o anticuerpos catalíticos de p53 preparados según la presente invención y usados en combinación con un procedimiento que asegure que los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos atraviesen la membrana celular, bloqueen la muerte celular programada y eviten la activación de los puntos de control del ciclo celular dependiendo del acontecimiento que tenga lugar naturalmente. Los intentos para bloquear cualquiera de estas respuestas celulares usando inhibidores que actúan secuencia arriba o secuencia abajo de p53 son problemáticos por la multiplicidad de factores implicados, Figura 18.

Estas importantes realizaciones forman la base científica para los usos terapéuticos propuestos de oligos p53 y anticuerpos catalíticos para tratar el cáncer, el daño por isquemia-reperfusión y el choque séptico/SIRS.

Descripción de los mecanismos celulares

Durante la división celular deben coordinarse tres procesos fundamentales y debe repararse cualquier error asociado: (1) los centrosomas deben duplicarse y a continuación segregarse; (2) debe formarse el eje mitótico, debe unirse a los cromosomas y debe cebarse para elongación y separación de cromátidas hermanas en anafase; y (3) el ADN debe replicarse y los cromosomas deben condensarse y a continuación segregarse por el eje mitótico hacia lados opuestos de la célula que en breve se convertirán en células hijas.

Existe un sistema de vigilancia que interrumpe la división celular por medio de control cuando detecta daño o potencial daño al genoma, incluido cualquier daño producido durante los procesos naturales ya descritos. Hartwell y Weinhert definieron un punto de control del ciclo celular de acuerdo a su función de la siguiente manera: Cuando la ocurrencia de un acontecimiento B del ciclo celular depende de la finalización de un acontecimiento A previo del ciclo celular, esa dependencia se debe a un punto de control si puede encontrarse una mutación de pérdida de función que libere la dependencia.

Esta definición operacional se ha demostrado rigurosamente en estudios de células de levadura en las que se han descrito tres puntos de control: puntos de control de daños del ADN, cuerpo polar entre ejes (equivalente al centrosoma). El punto de control de daños del ADN actúa en tres posiciones diferentes en el ciclo celular para detener la proliferación cuando se detecta el daño: las transiciones G1/S y G2/M, y otras que controlan la progresión a través de S. Los estudios genéticos han identificado muchos de los componentes del punto de control en levaduras pero las proteínas involucradas han probado ser funcionalmente pleiotrópicas, dificultando la posibilidad de establecer relaciones simples de causa y efecto. Como señalaron Paulovich y col. (1997), por ejemplo, los genes necesarios para el punto de control de daños del ADN están también involucrados en la reparación del ADN, en la muerte celular programada y en la regulación transcripcional. Los resultados de los estudios con levaduras se extrapolaron posteriormente a células de mamíferos en las que se encontraron componentes homólogos (Harwell y col., 1994).

Muchos de los genes necesarios para detener el ciclo celular en un punto de control son también necesarios en uno o ambos de los otros dos. Se ha demostrado que p53, por ejemplo, desempeña una función fundamental en los tres (Cross y col., 1995; Fukasawa y col., 1996; Levine 1997). La función crítica de p53 para provocar la interrupción del ciclo celular en la transición G1/S en respuesta al daño del ADN fue demostrada en primer lugar por Kasta y sus colaboradores (1991) y desde entonces se ha investigado ampliamente. El grupo de Kastan examinó la línea celular de leucemia mieloblástica humana ML-1 que aparentemente expresa p53 de tipo salvaje (los exones 5 hasta 9 se secuenciaron y se demostró que eran normales). Como es cierto para las células normales, el tratamiento de estas células leucémicas con dosis no letales de irradiación \gamma o actinomicina D causaron interrupción de G1/S y G2/M. En las células ML-1, la interrupción en G1/S se asoció con un aumento transitorio de 3 a 5 veces en los niveles de p53 posteriores a la interrupción del ciclo celular. Se encontró que el tratamiento con cafeína bloquea tanto la inducción de la expresión de p53 como la interrupción del ciclo celular en G1/S, sugiriendo que p53 podría desempeñar un papel en la interrupción en G1/S en respuesta al daño del ADN. Manteniendo esta hipótesis, las células que carecen de p53 de tipo salvaje no mostraron una interrupción en G1/S tras la irradiación \gamma.

En un estudio posterior, el grupo de Kastan usó líneas celulares de tumores sólidos para reforzar su hipótesis (Kuerbitz y col., 1992). La introducción de la expresión de p53 de tipo salvaje bajo el control de un promotor inducible en una línea celular de cáncer carente de expresión de p53 permitió a las células sufrir una interrupción del ciclo celular en G1/S tras la irradiación \gamma. También se ha demostrado que los agentes que causan roturas en las hebras de ADN inducen p53 e interrupción del ciclo pero que los agentes tales como los antimetabolitos, que se incorporan de manera simple en el ADN, no lo hacen (Nelson y Kastan 1994).

El trabajo del grupo de Kastan y otros ha aclarado que un grupo de agentes médicamente importantes pueden causar la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) que dan lugar a la activación de procesos dependientes de p53 al causar roturas en las hebras de ADN. Estos agentes incluyen una diversidad de tratamientos anticancerosos tales como la radiación ionizante y doxorubicina, así como los mediadores naturales incluido el óxido nítrico.

Se han estudiado los efectos de los inhibidores del eje mitótico, incluidos ciertos agentes quimiterapéuticos para el cáncer, sobre células obtenidas de ratones con un knock out genético de p53. Tras el tratamiento, las células se volvieron tretraploides u octaploides como resultado de sufrir múltiples ciclos de síntesis de ADN sin completar la segregación de los cromosomas. En contraste, las células normales de ratón sufrieron una interrupción del ciclo celular en G2/M tras el tratamiento. En ausencia de inhibidores del eje, el 50% de las células de los ratones knock out para p53, pero no de los ratones normales, se volvieron tetraploides en el pasaje 7. El examen de los tejido de los ratones knock out para p53 también reveló la presencia de células tetraploides, demostrando que los resultados obtenidos en los estudios in vitro con células de estos ratones no eran un artefacto del cultivo. Estas observaciones confirman informes anteriores que muestran un correlación entre la pérdida o inactivación de p53 y tetraploidía o aneuploidía. De manera similar, Fukasaswa y col (1996) demostraron que las células de ratones knock out para p53 producen números anormales de centrómeros. Esto parece explicar porqué las células cultivadas de ratones knock out para p53 se vuelven marcadamente aneuploides en cultivo cuando, durante el mismo período de tiempo, las células de ratones intactos para p53 permanecen diploides. Brown y col (1994) encontraron que p53 se copurifica con los centrosomas aislados de células cultivadas, sugiriendo un posible papel directo de p53 en la regulación de estos
orgánulos.

Como se muestra en la Figura 18, p21 es un mediador fundamental de la interrupción del ciclo celular dependiente de p53 en respuesta al daño genómico. p21 se une a una serie de ciclinas y complejos cinasa dependientes de ciclina (cdk) así como al antígeno nuclear de la célula en proliferación (PCNA). Los niveles normales de p21 parecen ser necesarios para la formación de complejos ciclina-cdk que, a su ver, son necesarios para la progresión del ciclo celular (El-Deiry y col., 1993). Los niveles aumentados de p21 como resultado de la activación de p53, sin embargo, bloquean la progresión del ciclo celular al interferir con las funciones de estos complejos y con el PCNA. En al menos algunas situaciones, otro gen que es regulado positivamente por p53 en respuesta al daño genómico GADD45, también puede provocar la interrupción del ciclo celular en el punto de transición G1/S (Marhin y col., 1997).

Como alternativa, el daño genómico puede dar lugar a una inducción de la muerte celular programada dependiente de p53 en lugar de la interrupción del ciclo celular y la reparación. Clarke y col. (1903), por ejemplo, han mostrado que los timocitos tomados de ratones constitutivamente homocigotas para una deleción en el gen de p53 son resistentes a la inducción de la muerte celular programada por irradiación \gamma o por etopósido, pero no por glucocorticoides o calcio. Los ratones heterocigotas para la deleción de p53 también eran relativamente resistentes a los agentes que causan roturas de las hebras de ADN, pero en menor medida que los homocigotas. En contraste, los timocitos de ratones con p53 intacta sufrieron muerte celular programada en respuesta a todos estos tratamientos.

Con frecuencia se encuentra que las células cancerosas que no expresan p53 de tipo salvaje sufren muerte celular programada si se introduce experimentalmente la expresión de la proteína. Esto ha proporcionado un sistema modelo para intentos por arribar a una explicación mecánica de cómo p53 puede inducir la muerte celular programada. Debe recordarse sin embargo que el uso de las líneas celulares que han eliminado la función de p53 de tipo salvaje y posteriormente han tenido p53 de tipo salvaje expresada constitutivamente de manera experimental para crear un modelo para analizar las funciones endógenas de p53 de tipo salvaje pueden dar como resultado conclusiones engañosas.

Johnson y col. (1996) demostraron en primer lugar que las ROS pueden funcionar como mediadores secuencia abajo de la muerte celular programada dependiente de p53. Produjeron altos niveles de expresión de p53 humana de tipo salvaje en células de músculo liso (SMC) de rata o de ser humano cultivadas usando vectores adenovirales con ADNc de p53 humana bajo el control de un promotor fuerte. p53 se expresó en ambos tipos de células en niveles equivalentes, pero sólo en las células humanas se indujo la muerte celular programada. Dentro de los ocho días de la infección, se encontró que esencialmente todas las SMC humanas que sobreexpresaron p53 murieron. Los estudios cinéticos documentaron niveles aumentados de p53 y ROS en las SMC cuatro horas después de la infección con el virus que llevaba p53. Se mostró que tres antioxidantes no relacionados bloquearon la producción de ROS pero no la sobreexpresión de p53 y bloquearon la inducción de la muerte celular programada. Se concluyó que la expresión aumentada de p53 es suficiente para inducir la muerte celular programada en al menos algunos tipos de células normales, y que las ROS son un mediador secuencia abajo de esta inducción.

El grupo de Vogelstein (Polyak y col., 1997) usó un vector adenoviral para causar la expresión de p53 de tipo salvaje en células de cáncer de colon humano DLD-1 que tenían genes de p53 endógenos inactivos. Se purificó el ARN de estas células 16 horas tras la infección viral y 8 horas antes de que se presentaran evidencias de muerte celular programada. El análisis se realizó usando la técnica SAGE que permitió la evaluación cuantitativa de poblaciones de ARNm celular. Aproximadamente, se identificaron 8.000 transcriptos. De estos, 14 fueron marcadamente (más de 10 veces) y 26 fueron significativamente más abundantes en las células que expresaban p53. Se identificaron trece de los 14 genes más altamente inducidos y se encontró que varios codifican proteínas que afectan el estado redox de las células.

El grupo generó la hipótesis de que p53 podría inducir la muerte celular programada al estimular la producción de ROS. Usando una sonda fluorescente para medir los niveles de ROS intracelulares, los investigadores encontraron que la producción de ROS se indujo tras la infección con el virus que llevaba p53, y que los niveles de ROS siguieron aumentando a medida que progresaba la muerte celular programada. El tratamiento de las células DLD-1 con el potente oxidante menadiona o con peróxido de hidrógeno sólo indujo la expresión de uno de los 14 genes, p21, demostrando que este grupo de genes no era inducido simplemente como resultado de la expresión de ROS. Tampoco estaban inducidos estos genes como resultado del tratamiento de las células con indometacina o ceramida, dos agentes que pueden inducir la muerte celular programada en ausencia de expresión de p53.

El curso de los experimentos sugirió una secuencia de acontecimientos durante los que p53 activa de manera transcripcional genes que controlan redox, causando la producción de ROS que da como resultado daño oxidativo a las mitocondrias y, a su vez, muerte celular. La inhibición de cada una de estas etapas con agentes farmacológicamente específicos demostró una relación causa y efecto entre los acontecimientos secuenciales.

Estos hallazgos sugieren el siguiente modelo de tres etapas para la muerte celular programada inducida por p53 en células DLD-1: (1) p53 activa de manera transcripcional una subserie de genes que incluyen oxidorreductasas; (2) las proteínas inducidas causan de manera colectiva un aumento en los niveles de ROS; y (3) los ROS dañan a las mitocondrias, causando pérdida de calcio y otros componentes. Estos componentes estimulan a miembros de la familia de enzimas análogas a ICE que están involucradas de manera coherente en los acontecimientos terminales de la muerte celular programada.

Parece haber también alguna variabilidad entre los diferentes tipos celulares en términos de los genes que se regulan positivamente de manera transcripcional por p53 de tipo salvaje en respuesta al daño genómico. Dos de estos son Bax, un miembro de la familia BCL-2 que se ha demostrado que algunas veces está involucrado en la inducción de la muerte celular programada dependiente de p53, y GADD45, cuyo producto se une al PCNA y causa de esta manera una interrupción del punto de control del ciclo celular. McCurrach y col. (1997), por ejemplo encontraron que en fibroblastos primaros, Bax es uno de los efectores de la muerte celular programada dependiente de p53 de tipo salvaje inducida por quimioterapia. En este estudio, se encontró que p53 de tipo salvaje activa a Bax de manera transcripcional. Ni Bax ni GADD45, sin embargo, estaban entre los genes inducidos por p53 de tipo salvaje en los estudios discutidos anteriormente por Polyak y col. (1997). Se ha demostrado la importancia potencial de Bax en la inducción en la muerte celular programada en respuesta al daño celular causado por la quimioterapia en trabajos de Strobel y col. (1996). Este grupo transfectó un vector de expresión que llevaba el ADNc de Bax en la línea celular de cáncer de ovario SW626 que carece de p53 funcional. Los transfectantes mostraron una media de aumento de 10 veces en la expresión de Bax comparado con las células de control. El umbral para la inducción de la muerte celular programada tras el tratamiento de quimioterapia se redujo sustancialmente en los transfectantes de Bax cuando el agente quimioterapéutico era paclitaxel, vincristina o doxorubicina, pero no cuando el agente era carboplatino, etopósido o hidroxiurea.

Otros estudios que incluyen líneas celulares de cáncer que expresan p53 de tipo salvaje y sufren interrupción de la proliferación o muerte celular programada tras el tratamiento con doxorubicina, muestran que la mayoría de los mismos 14 genes que estaban muy inducidos en la células de DLD-1 tras la introducción de p53, estaban regulados positivamente con dosis bajas del fármaco, que causaron interrupción del ciclo celular, y con dosis más altas, que causaron muerte celular programada (Polyak y col., 1997). Los autores especularon que el factor crítico para determinar si una célula sufre interrupción del ciclo o muerte celular programada es la capacidad de tal célula de afrontar el estrés oxidativo. En otras palabras, las células con una baja capacidad para manejar el estrés oxidativo sufren muerte celular programada mientas que las células más resistentes sufren la interrupción del ciclo.

El nivel de estrés oxidativo que experimentan las células se ha correlacionado positivamente con su tendencia a sufrir muerte celular programada dependiente de p53 en lugar de la interrupción del ciclo celular y la reparación tras el daño genómico. Lotem y col. (1996) estudiaron los efectos del estrés oxidativo y las citocinas en estos fenómenos en células de leucemia mieloide. Los antioxidantes y ciertas citocinas exhibieron una protección cooperativa de estas células frente a la muerte celular programada inducida por compuestos citotóxicos. El aumento del estrés oxidativo con el tratamiento con peróxido de hidrógeno sin embargo, aumentó la presentación del programa de muerte celular y aumentó el nivel de tratamiento protector de citocinas necesarios para evitar la muerte celular programada. Se sabe que los salicilatos inhiben la activación de proteincinasas y factores de transcripción involucrados en las respuestas al estrés. Chernov y Stark (1997) encontraron que el salicilato inhibe de manera reversible a p53 de tipo salvaje de unirse al ADN y por consiguiente inhibe la capacidad de p53 para inducir la transcripción de p21 y la muerte celular programada tras el tratamiento con toxorubicina o radiación. Si se lava el salicilato dentro de las 60 horas del daño al ADN, los acontecimientos dependientes de p53 inhibidos son capaces de continuar hasta completarse.

Un factor que en ciertas circunstancias tienen influencia sobre si p53 de tipo salvaje induce interrupción del ciclo celular o muerte celular programada tras el daño genómico es c-myc. Saito y Ogawa (1995) estudiaron la línea celular de carcinoma hepatocelular de rata, FAA-HTC1, que expresa de manera constitutiva c-myc y no expresa p53. La expresión de c-myc en estas células fue eficazmente suprimida por un oligonucleótido antisentido L CHK2HR. La expresión de p53 de tipo salvaje se logró al transfectar un vector de expresión inducible por dexametasona que llevaba ADNc de p53 de tipo salvaje en estas células. Los resultados mostraron que p53 de tipo salvaje puede actuar en las mismas células como un inductor de la interrupción del ciclo celular o como un inductor de la muerte celular programada dependiendo del estado de c-myc. La expresión de p53 de tipo salvaje dio como resultado la inducción de la muerte celular programada en una porción de las células, pero no inhibió la proliferación de las células supervivientes. Al inhibir la expresión de c-myc la expresión de p53 de tipo salvaje causó una inhibición de la proliferación celular pero no indujo muerte celular programada. Otros han demostrado también que la expresión no regulada de c-myc es capaz de inducir la muerte celular programada (Evan y col., 1992; Hoang y col., 1994; Lotem y Sachs 1993).

Otros estudios han mostrado que p53 de tipo salvaje puede en ciertas circunstancias inducir la muerte celular programada sin causar primero la expresión de otros genes. En estas situaciones, la muerte celular programada dependiente de p53 de tipo salvaje se produce en presencia de actinomicina D o ciclohemida, que bloquean las síntesis de ARN y proteínas respectivamente (Caelles y col., 1994). Se ha mostrado que la introducción en células Hela de un vector de expresión de p53 que carece de los residuos aminoácidos terminales de p53 necesarios para unir p53 al ADN, por ejemplo, produce muerte celular programada dependiente de p53 (Haupt y col 1995). El hecho de que esta observación respalde la falta de implicación de p53 en la transcripción se asume sin justificación adecuada, sin embargo, el hecho de que la única manera en que p53 puede afectar la transcripción es por medio de la unión directa a los elementos reguladores de los mismos genes. Estos y otros hallazgos similares (Sabbatini y col., 1995) han sido usados para respaldar el argumento de que p53 puede inducir la muerte celular programada sin afectar la transcripción.

Por consiguiente, es probable que p53 de tipo salvaje pueda inducir la muerte celular programada por medio de la activación transcripcional de series específicas de genes, por medio de interacciones directas proteína-proteína o por medio de una combinación de estos procedimientos. La inducción de la muerte celular programada, sin embargo, no necesariamente requiere la expresión de p53 de tipo salvaje. Esto queda claro a partir de la observación de que los ratones knock out para p53 se desarrollan normalmente así como por el hecho de que las células que carecen de p53 de tipo salvaje pueden ser inducidas a sufrir muerte celular programada (Clarke y col., 1993).

Como se muestra en la Figura 18, las múltiples rutas que pueden iniciar la muerte celular programada convergen para utilizar una fase terminal común que involucra la familia de enzimas convertidoras de interleucina 1-beta (análogas a ICE). Se sabe actualmente que esta familia de enzimas contiene 11 miembros y puede dividirse en tres subfamilias: la ICE, CPP32, y la subfamilia Ich-1 llamadas caspasas (Boldin y col., 1996; Chinnaiyan y col., 1996; Duan y col., 1996a y 1996b; Fernandes-Alnemri y col., 1996; Lin y Benchimol 1995; Lippke y col., 1996; Muzio y col., 1996; Wang y col., 1996). Sabbatini y col. (1997), por ejemplo, estudiaron específicamente el papel de las enzimas de la familia ICE en la presentación de muerte celular programada dependiente de p53. Ellos demostraron que un inhibidor peptídico de la proteasa análoga a ICE CPP32 inhibió el programa de muerte celular en líneas celulares de riñón de ratas bebé inducida por la expresión experimental de p53 de tipo salvaje en estas células.

También parece que p53 de tipo salvaje puede potenciar la capacidad de las enzimas de la familia ICE para causar muerte celular programada (Jung y Yuan 1997). Por ejemplo, la inactivación de la función de p53 de tipo salvaje en células COS-1 las preserva de sufrir muerte celular programada cuando se las transfecta con un vector de expresión que lleva el ADNc para una enzima análoga a ICE, mientas que la transfección de células COS-1 normales causa que estas sufran el programa de muerte. Se transfectaron vectores de expresión que llevaban una enzima análoga a ICE o un mutante de p53 sensible a la temperatura en células COS-1 con p53 de tipo salvaje endógena inactiva. A la temperatura que permite la función de p53 de tipo salvaje, la capacidad de la enzima análoga a ICE para causar muerte celular programada aumentó significativamente. Otra experimentación mostró que la capacidad de p53 de tipo salvaje para potenciar la inducción de muerte celular programada por la enzima estaba mediada por Bax.

OL(1)p53 para el Tratamiento del Cáncer

Todos los tratamiento del cáncer en el uso clínico matan las células cancerosas al inducir la muerte celular programada de una manera dependiente de la dosis. En algunos casos se ha mostrado que la inducción de este programa es dependiente de p53 de tipo salvaje. En dosis más bajas, muchos agentes pueden causar que el daño genómico cause la inducción de un punto de control en las células con p53 de tipo salvaje. El punto de control interrumpe temporalmente la proliferación celular, proporcionando tiempo para que las células reparen el daño.

Estudios recientes por investigadores que no han estado involucrados en el desarrollo de OL(1)p53 proporcionan un fundamento del porqué la inhibición de la expresión de p53 de tipo salvaje puede potenciar el efecto de muerte celular de muchos tratamientos anticáncer en células de cáncer comparables con un punto de control del ciclo celular dependiente de p53 de tipo salvaje intacto. Las evidencias muestran que cuando el punto de control del ciclo celular fracasa en su engranaje tras el daño terapéutico al genoma, las células cancerosas continúan replicando su ADN en ausencia de mitosis dando lugar a la inducción de la muerte celular programada. El resultado terapéuticamente importante es que, en el contexto de un punto de control bloqueado, los tratamientos anticáncer se vuelven mucho más eficaces para matar células cancerosas.

En algunos estudios, se evitó el engranaje del punto de control produciendo genéticamente un knock out de la expresión de p53 de tipo salvaje o de uno de sus efectores secuencia abajo, en particular p21. Dada la naturaleza irreversible de estas interrupciones resulta claro, resulta claro que p53 de tipo salvaje no es necesaria para la inducción de la muerte celular programada bajo estas circunstancias. En otros experimentos, se mostró que los derivados de metilxantina tales como pentoxifilina o el inhibidor de proteincinasa C UCN-01 (7-hidroxistaurosporina), los que inhiben la función del punto de control G2, tienen sinergismo con los agentes que interrumpen la ruta de p53 de tipo salvaje y estimulan además la sensibilidad de las células cancerosas para los agentes anticancerosos.

De manera coherente con este papel de p53 de tipo salvaje, los oligos de p53 y OL(1)p53 en particular pueden estimular de manera sinérgica la capacidad de los agentes que dañan el genoma para matar células. Además, en las dosis óptimas para causar un efecto letal máximo sobre las células cancerosas, la combinación de OL(1)p53 y un agente anticáncer no mató los tipos celulares normales probados.

Cuando los oligos de fosforotioato tales como OL(1)p53 o los oligos de fosfodiéster naturales se unen a las células, inducen a las células a aumentar su producción de radicales libres de oxígeno por medio de un mecanismo dependiente de la ciclooxigenasa. El efecto es mucho más pronunciado en cultivos celulares convencionales realizados en oxígeno al 20% (atmosférico) que bajo presiones de oxígeno reducidas. Estos radicales libres pueden causar daño genómico y este fenómeno puede explicar porqué OL(1)p53 mata las células cancerosas en los cultivos de tejidos convencionales sin la necesidad de añadir un compuesto capaz de causar daño genómico, tal como un agente quimiterapéutico para el cáncer, y porqué OL(1)p53 no mata las células cancerosas cultivadas bajo niveles de oxígeno similares a los que se encuentran en el cuerpo a menos que se añada un agente que dañe el genoma. Las células cancerosas previamente tratadas con oligos tales como OL(1)p53 pueden destruirse con dosis de agentes que dañan el genoma que no son citotóxicas para las células en ausencia del oligo de p53. Presumiblemente este sinergismo puede potenciarse aún más por los inhibidores de G2, tales como pentoxifilina o UCN-01, que son más eficaces cuando se usan para tratar células cancerosas con función de p53 de tipo salvaje comprometida que aquellas con función de p53 intacta.

Como los fosforotioatos son análogos de ADN, es posible que los agentes quimioterapéuticos para el cáncer con afinidad para el ADN se unan a ellos. Este concepto se probó usando OL(1)p53, que se mostró que une fuertemente la mitoxantrona pero no la idarubicina o la daunorubicina. La interacción entre mitoxantrona y el oligo redujo sustancialmente los efectos tóxicos del agente quimioterapéutico sobre las células cancerosas que no expresaban p53 de tipo salvaje.

En otro estudio de interacciones oligo-fármaco, se mostró que los metabolitos bioactivos del acetaminofeno que se sabe que reaccionan con grupos azufre, se unen a los oligos de fosforotioato incluido OL(1)p53. Esta interacción puede inactivar el OL(1)p53 y debería determinarse previo a más pruebas clínicas.

Los estudios de farmacología y toxicología llevados a cabo en varias especies, incluidos monos Rhesus, demostraron que OL(1)p53 tiene propiedades farmacocinéticas favorables para su uso como un agente terapéutico sistémico y que el oligo no es tóxico aún en niveles de dosis muy superiores al nivel terapéutico esperado. Los estudios de secuenciación y cultivo celular sugieren que OL(1)p53 suprime la expresión de p53 en células de mono como también lo hace en células humanas. El oligo, sin embargo, no tiene efectos específicos sobre células o tejidos de animales inferiores.

Un ensayo clínico en Fase I de OL(1)p53 como un agente único se llevó a cabo en pacientes con leucemia mielógena aguda o con síndrome mielodisplástico. Se administró el oligo por infusión continua durante 10 días y los resultados mostraron que el oligo no resultó tóxico a través de un intervalo de dosis proyectado para dar niveles terapéuticos. No se observaron respuestas completas.

Se pusieron células malignas tomadas de los pacientes justo antes de comenzar la administración del OL(1)p53 y en diversos momentos durante la infusión en cultivo bajo oxígeno al 20%. En comparación con las células blásticas leucémicas periféricas de los pacientes sin tratamiento, aquellas tomadas tras el inicio de la infusión de OL(1)p53 murieron más rápidamente en función de la cantidad de OL(1)p53 administrada al paciente. De manera similar, los cultivos de médula ósea a largo plazo realizados de los pacientes con leucemia o mielodisplasia demostraron una capacidad sustancialmente reducida para generar células malignas en función de la cantidad de OL(1)p53 administrada al donante. Esta supresión se mantuvo durante muchos meses tras el tratamiento sin evidencias de que el efecto fuera reversible.

Los resultados de los ensayos clínicos de OL(1)p53 son coherentes con los datos de laboratorio que sugieren fuertemente que el oligo debe usarse en combinación con agentes anticancerosos que dañan el genoma para que sean activos en los pacientes. La interpretación de los datos de los cultivos celulares usando células de los pacientes en el ensayo es también coherente con esta hipótesis. Cuando se pusieron las células cancerosas en cultivo bajo oxígeno al 20%, el oligo indujo la producción de ROS por parte de estas células, que sirvió como el agente que produce daños en el genoma.

De la discusión anterior se desprende que el bloqueo de la expresión de p53, por ejemplo con un oligo de p53, puede dar como resultado la prevención de (1) la interrupción del ciclo celular, dando tiempo para un intento de reparación, y (2) muerte celular programada dependiente de p53. Dado que muchas terapias para el cáncer causan daño genómico, también puede esperarse que causen la inducción de p53 de tipo salvaje en aquellas células cancerosas que lo expresan. De hecho, se sabe que la irradiación X, los inhibidores de topoisomerasa, los agentes alquilantes, las antraciclinas, los venenos de ejes y ciertos antimetabolitos producen interrupción del ciclo celular dependiente de p53 (Cross y col., 1995; Kastan y col., 1991; Linke y col., 1996; Tishler y col., 1995). La inhibición de tal inducción de p53 de tipo salvaje aumentaría la toxicidad de estas terapias anticáncer para las células cancerosas proliferantes al permitir que el genoma dañado se replique, dando lugar a la producción de células disfuncionales e induciendo también la muerte celular programada.

Una serie de publicaciones que abordan este tema provienen de los laboratorios de investigadores colaboradores en Johns Hopkins y en la Universidad de Pensilvania (McDonald y col., 1996; Waldman y col., 1996 y 1997). En estos estudios se usaron líneas celulares de cáncer de colon humano, que diferían sólo en su estado de p21. Las células p21-/- se produjeron a partir de células p21+/+ usando recombinación homóloga. Normalmente, la inducción de p53 por daño genómico da lugar a la inducción de p21 por la acción de p53 como un factor de transcripción en la unión directa al gen de p21. A continuación p21 sintetizada nueva se une las proteínas necesarias para la progresión del ciclo celular y las bloquea, Figura 18.

El primero de estos estudios (McDonald y col., 1996) buscó determinar si las células de cáncer de colon HCT116 p21-/- tenían defectos de reparación del ADN al compararlas con células HCT116 p21+/+ (ambos clones de HCT116 tienen p53 de tipo salvaje). Se encontró que el clon deficiente en p21 fue dos a tres veces más sensible por UV que las células que expresaban p21 cuando se las evaluó por medio de ensayos clonogénicos de supervivencia. Además, las células cancerosas p21-/- tuvieron una frecuencia de dos a tres veces aumentada de surgimiento espontáneo de colonias resistentes a 6-TG indicativas de inactivación del gen hprt por mutación comparada con las células con función de p21 intacta. Estos datos sugieren que la pérdida de función de p21 está asociada con reducción en la capacidad de las células para reparar el daño del ADN.

Para probar más este concepto, los investigadores transfectaron un vector de expresión en células de cáncer de colon humano HCT116 p21+/+ o -/-. El vector estaba constituido por un ADNc de beta-galactosidasa dirigido por un informador de citomegalovirus, y se dañó a propósito previo a la transfección usando irradiación UV o un agente anticáncer de cis-platino. Se encontró que las células HCT116 carentes de p21 eran de tres a cinco veces más eficaces para reparar el vector de expresión dañado comparadas con las células HCT116 p21+/+. La transfección de un vector de expresión que lleva ADNc de p21 en las células HCT116 p21-/- aumentó su capacidad de reparación de dos a tres veces. Se concluyó que los agentes que inhiben la interacción de p21 con PCNA, y por lo consiguiente evitan la interrupción del ciclo celular en respuesta al daño del ADN, pueden tener interacciones citotóxicas sinérgicas con los agentes anticáncer clásicos que causan daños en el ADN.

En un estudio posterior, los investigadores examinaron los efectos de ciertos agentes que dañan el genoma sobre células HCT116 p21+/+ y -/- (Waldman y col., 1996). Los agentes incluyeron las terapias contra el cáncer doxorubicina, etopósido e irradiación \gamma así como el inhibidor de topoisomerasa-1 camptotecan. Se mostró que cada uno era capaz de matar completamente los cultivos de células p21-/- dentro de las 90 horas del tratamiento al inducir la muerte celular programada en concentraciones que causan que las células p21+/+ sufran una interrupción prolongada del ciclo celular pero no muerte celular. El análisis de las células p21-/- mostró que, tras el tratamiento, las células estaban brevemente bloqueadas en G2 pero no en G1 y a continuación comenzaron múltiples ciclos de síntesis de ADN en ausencia de mitosis, y que las células hiperdiploides resultantes con morfología nuclear anormal sufrieron posteriormente muerte celular programada.

Una serie de experimentos similares se llevó a cabo usando la línea celular de cáncer de colon humano DLD-1 que, a diferencia de la línea HCT116, tiene p53 mutado pero se asemeja a la línea HCT116 por ser diploide. Los autores pensaron que las células mutantes de p53 no expresarían p21 tras el daño del ADN y que serían equivalentes a las células p21-/-. Como se predijo, las células DLD-1 expresaron poco p21 tras el tratamiento con doxorubicina o irradiación \gamma y demostraron un defecto del punto de control que dio como resultado la presentación de esencialmente la misma serie de cambios morfológicos/fisiológicos que en la línea HCT116 que terminaron en la muerte celular programada.

Cuando se realizaron estos experimentos usando líneas celulares de cáncer de colon humano aneuploide con p53 mutante, se encontró que los efectos del tratamiento de dos de estas líneas con agentes que dañan el ADN seguían el mismo patrón de acontecimientos que llevaban a la muerte celular programada. En la tercera línea, la aneuploidía existente fue suficientemente pronunciada para inhibir cualquier conclusión firme a cerca de un aumento significativo en el contenido de ADN previo a la muerte celular. Waldman y col. concluyeron que "los análisis detallados demostraron que la muerte celular programada estaba aparentemente inducida por un desacoplamiento entre la mitosis y la fase S tras el daño del ADN. En lugar de sufrir una interrupción coherente, las células sin el punto de control dependiente de p21 continuaron sufriendo de síntesis de ADN en ausencia de mitosis, que culminaron en poliploidía y muerte celular programada" (página 1034).

Sin embargo, los autores no comentaron un punto importante demostrado por estos experimentos. Varias publicaciones indicaron que en las células con p53 de tipo salvaje, la muerte celular programada inducida por muchos agentes terapéuticos anticáncer es dependiente de p53 (Dronehower y col., 1992; Lowe y col., 1993; Symonds y col., 1994). Además, algunas células cancerosas con p53 de tipo salvaje pueden ser más sensibles a la quimioterapia que células similares con p53 mutado (Aas y col., 1996; Lowe y col., 1993a y 1993b). Al mismo tiempo el hallazgo de que tres líneas celulares de cáncer de colon diferentes con p53 mutado sufrieron una serie de acontecimientos similares que llevaron a la inducción de la muerte celular programada, como en las células HCT116 p21-/-, sugiere que la muerte celular programada como resultado de la replicación de ADN dañado en ausencia de mitosis es independiente de p53 de tipo salvaje.

Los estudios con HCT116 demostraron que la interrupción del freno del ciclo celular dependiente de p53/p21 puede dar lugar a una disminución del umbral de la inducción de muerte celular programada por los tratamientos anticáncer porque la muerte celular programada es inducida en las células p21-/- con dosis inferiores que las requeridas por las células HCT116 que son p21+/+-. Puesto que ambas células HCT116, las p21+/+ y las p21-/-, expresan p53 de tipo salvaje, esta inducción podría ser dependiente de p53. Si se basa en un mecanismo de muerte celular programada dependiente de p53, el nivel umbral en el que el daño genómico o del ADN induce la muerte celular programada sería inferior en las células cancerosas que expresan p53 de tipo salvaje. En ausencia de p53 de tipo salvaje, sin embargo, podría haber un umbral superior de nivel de daño para la inducción de muerte celular programada independiente de p53 de tipo salvaje.

Como OL(1)p53 inhibe transitoriamente la expresión de p53, el tratamiento de células cancerosas con este oligo más la terapia convencional pueden causar tanto una interrupción de los puntos de control del ciclo celular durante el tiempo en que está suprimida p53 como muerte celular programada dependiente de p53 tras la recuperación de la expresión de p53. Por consiguiente, OL(1)p53 será más eficaz para sensibilizar células cancerosas que expresan p53 de tipo salvaje para las terapias anticáncer que los enfoques ya descritos que incluyen knock out genéticos de p53 o p21.

Los experimentos presentados en la tercera monografía en esta serie se diseñaron para determinar si la inhibición de los puntos de control del ciclo celular aumentarían la sensibilidad a la irradiación \gamma de las células de cáncer de colon humano HCT116 cultivadas en animales inmunocomprometidos (Waldman y col., 1997). Se establecieron tumores de xenoinjertos de subclones de la línea celular p21+/+ y p21-/-. En ausencia de tratamiento, los tumores p21+/+ y p21-/- crecieron a velocidades prácticamente idénticas. A continuación se trataron doce de 17 animales por grupo con tumores de aproximadamente 50 mm^{2} con 7,5 o 15 Gy de irradiación \gamma y se midieron posteriormente cada dos semanas. La radiación de los animales con los tumores p21+/+ no dieron como resultado curaciones, y todos los tumores p21+/+ siguieron creciendo durante varios días tras el tratamiento. En contraste, el 18% y el 38% de los tumores p21-/- (P< 0,01 por la prueba de chi cuadrado) se curaron por la irradiación g en función de la dosis donde se definió la curación como ausencia de tumor detectable. Los tumores p21-/- que no se curaron mostraron disminuciones sustanciales en el tamaño dependientes de la dosis tras el tratamiento.

Un segundo objetivo de este estudio fue determinar el valor de los ensayos clonogénicos de supervivencia para evaluar terapias contra el cáncer influidas por el estado de p53 y/o p21 de las células diana. Se encontró que la cantidad de clones que sobrevivieron a la irradiación g fue baja en número, pero casi equivalente cuando se compararon los subclones de HCT116 p21+/+ y p21-/-. El bajo número de colonias se atribuyó a la interrupción del ciclo celular y a la muerte celular programada respectivamente. En el caso de las células p21+/+, pero en las p21-/-, el área entre las colonias supervivientes estaba constituida por una capa de células viables. Los investigadores puntualizaron que esta capa de células p21+/+ viables funcionaba como una capa de células de alimentación tal como se sabe resultan importantes para el soporte del crecimiento de células clonogénicas. Además argumentaron que la existencia de esta capa de alimentación en los tumores p21+/+ tratados y la falta de tal población de células de alimentación in vivo podrían explicar sus datos en animales.

Otro grupo también examinó los efectos de la disrupción de p53 de tipo salvaje y/o p21 en la sensibilidad de las células cancerosas para ciertos agentes quimioterapéuticos del cáncer y la radiación ionizante (Fan y col., 1995 y 1997). Se transfectaron células de cáncer de mama humano MCF-7 o células de cáncer de colon HCT116, ambas con p53 de tipo salvaje, con un gen E6 tipo 16 del virus de papiloma humano (MCF-7/E6 o HCT116/E6) o un mutante de p53 dominante (MCF-7/mu-p53) para interrumpir la función de p53 de tipo salvaje. Usando un ensayo clonogénico de supervivencia, se mostró que los tres subclones con función inhibida de p53 de tipo salvaje, así como las células HCT116 p21-/-, eran significativamente más sensibles al cisplatino y a la mostaza de nitrógeno que las correspondientes células con función de p53 de tipo salvaje o p21 intacta.

Se encontró que los cuatro subclones con función alterada de p21 o p53 de tipo salvaje eran deficientes en su capacidad para reparar los genes informadores CAT dañados por cisplatino transfectados cuando se comparó con las correspondientes células con función de p21 o p53 de tipo salvaje intacta. Por consiguiente, los investigadores atribuyeron la mayor sensibilidad para el cisplatino de estas células a los defectos en el control del punto de control de G1, a la reparación de la escisión de nucleótidos o a ambos.

Al igual que el grupo de Johns Hopkins, el grupo de Fan no observó una diferencia significativa en el ensayo clonogénico de supervivencia entre las células con función intacta de p21 o p53 de tipo salvaje y aquellas sin ella cuando se usó radiación ionizante como el agente de daño genómico. Sin embargo, aparentemente no estaban conscientes de los defectos de este ensayo como lo aclaró el equipo de investigación de Johns Hopkins.

Servomaa y col. (1996) llevaron a cabo un sondeo del estado de p53 y la radiosensibilidad de veinte líneas celulares de carcinoma humano de células escamosas tomadas de pacientes con cánceres de cabeza y cuello. Se encontraron mutaciones y/o deleciones de p53 en 15 de las líneas. La "dosis media de inactivación" (AUC) se determinó usando un ensayo clonogénico de supervivencia evaluado cuatro semanas tras el tratamiento de radiación. Los resultados fueron 1,82 \pm 0,24 Gy para las líneas con p53 mutado o ausente y 2,23 \pm 0,15 Gy para las líneas con p53 de tipo salvaje (P < 0,01). Los autores concluyeron que las líneas sin expresión de p53 eran las más radiosensibles.

Se encontró que el derivado de metilxantina pentoxifilina era un inhibidor del punto de control de G2 (Russell y col., 1996). Es un compuesto relativamente no tóxico que se administra a los pacientes con una diversidad de trastornos por alguna de sus otras propiedades, que incluyen la capacidad de aumentar la flexibilidad de los glóbulos rojos (Ciocon y col 1997). La pentoxifilina exhibió sinergismo con cisplatino para matar líneas celulares cancerosas con función interrumpida de p53 de tipo salvaje o deficiencia de p21 sin alterar la sensibilidad de las células control con p53 de tipo salvaje y p21 intactos (Pan y col., 1995). También se encontró que el fármaco es más eficaz para inhibir el punto de control de G2 en las células que tenían función de p53 de tipo salvaje comprometida.

Russel y col. (1996) inactivaron la función de p53 en la línea celular derivada de adenocarcinoma de pulmón humano A549 al transducir el gen E6 de HPV tipo 16. Usando un ensayo clonogénico de supervivencia, encontraron que tanto la pentoxifilina como una nueva metilxantina, lisofilina, causaron una sensibilización a la irradiación \gamma de 15 veces de las células cancerosas transducidas con E6 comparado con los controles. Se mostró que ambos agentes bloquean la capacidad de la radiación para inducir la interrupción del ciclo celular en G2, y se encontró que lisofilina también bloquea la interrupción en G1.

UCN-01 (7-hidroxistaurosporina) es un inhibidor de proteína cinasa C que puede también bloquear el punto de control de G2. Ha mostrado actividad antineoplásica contra tumores humanos crecidos en roedores y está actualmente en ensayo clínico para el tratamiento del cáncer (Pollack y col., 1996). Wang y col. (1996) probaron la capacidad de este agente para influir en la sensibilidad al cisplatino de las células de cáncer de mama MCF-7 con p53 de tipo salvaje o p53 inactivada por transfección de un vector de expresión que lleva el gen E6 de HPV. La sensibilidad al fármaco se midió usando ensayos clonogénicos de supervivencia y MTT y se mostró que la sensibilidad aumentó marcadamente por el tratamiento con UCN-01 en células carentes de función de p53 de tipo salvaje intacta al comparar con las células con p53 de tipo salvaje funcional. Al igual que para los estudios que incluyeron pentoxifilina, se encontró que UCN-01 es mucho más eficaz para bloquear la interrupción en G2 inducida por el daño genómico en células en las que la función de p53 de tipo salvaje se había eliminado que en aquellas con la función intacta.

De manera similar, Shao y col. (1997) demostraron que UCN-01 es mucho más eficaz para estimular los efectos citotóxicos de los agentes que dañan el genoma sobre las líneas celulares de cáncer de colon HCT116 y de cáncer de mama MCF-7 carentes de función de p53 de tipo salvaje como resultado de la manipulación experimental comparado con las mismas células en que la función está intacta.

La cafeína también bloquea la interrupción del ciclo celular en G2 in vitro, y parece actuar activando la p34cdc2 cinasa. Yao (1996a) demostró que el tratamiento con cafeína sensibiliza de manera selectiva las células tumorales deficientes en la función de p53 de tipo salvaje para la muerte celular programada inducida por radiación. Por consiguiente parece que para algunos cánceres, el uso de OL(1)p53 más un inhibidor del punto de control de G2 estimularían los efectos beneficiosos de la terapia anticáncer convencional en un mayor grado que OL(1)p53 solo.

Los agentes activos sobre los microtúbulos inducen un punto de control del ciclo celular que causa típicamente una interrupción en G2. Varios estudios han implicado a p53 de tipo salvaje como desempeñando un papel para influir en la respuesta de las células a los agentes activos en G2 (Fan y col., 1995; Powell y col., 1995; Russell y col., 1995). Estos hallazgos llevaron a Tishler y col. (1995) a examinar la capacidad de los agentes quimioterapéuticos para el cáncer taxol, vinblastina y nocodazol para inducir procesos dependientes de p53 de tipo salvaje en la línea celular NIH-3T3 premaligna embrionaria de ratón. Los tres agentes activos sobre los microtúbulos causaron interrupción del ciclo celular en G2 y aumentaron la unión p53-ADN. Se mostró que sólo vinblastina y nocodazol causan un aumento en la transcripción de p21.

Wahl y col. (1996) ampliaron estos estudios considerando los efectos de la interrupción de la función de p53 de tipo salvaje en la sensibilidad de los fibroblastos al taxol. Se alteró la función de p53 de tipo salvaje en fibroblastos humanos normales transfectándolos con vectores de expresión que llevaban el gen E6 de HPV o el gen del antígeno T de SV40. También se tomaron fibroblastos de ratones normales y de ratones knock out para p53. La función de p53 comprometida en las células de cualquiera de los tipos se correlacionó con un aumento de siete a nueve veces en la citotoxicidad al taxol en comparación con los controles. Se mostró que taxol mata las células al inducir la muerte celular programada independientemente de su estado de p53. Las células con p53 intacta que sobrevivieron al tratamiento con taxol mostraron niveles aumentados de p21 y sufrieron interrupción del ciclo celular.

En respuesta al daño genómico, p53 de tipo salvaje induce, además de p21, un segundo gen GADD45 que también funciona induciendo un punto de control del ciclo celular por medio de su efecto inhibidor sobre PCNA. Smith y col. (1996) bloquearon la expresión de GADD45 en la línea celular de cáncer de colon humano RKO que expresa p53 de tipo salvaje al transfectarla con un vector antisentido. La reducción de los niveles de GADD45 sensibilizó las células cancerosas al efecto mortal de la radiación UV y al tratamiento con cisplatino. Además, las células en las que estaba suprimido GADD45 mostraron una capacidad reducida para reparar el daño del ADN como lo evidencia el uso de plásmidos informadores dañados por UV y experimentos de síntesis de ADN no programada. También se transfectaron vectores de expresión que llevan una diversidad de genes que alteran la función de p53 de tipo salvaje en las células RKO. La supresión de la función de p53 tuvo el mismo efecto en la reparación de ADN que la supresión de GADD45.

La existencia de al menos otro gen regulado por p53, GADD45, que puede producir por lo general los mismos efectos inductores que los puntos de control del ciclo celular de p21 hacen de p53 una mejor diana que p21 para bloquear la inducción del punto de control por agentes que dañan el genoma.

Según la presente invención, los inhibidores de EGFR o HER2 tales como anticuerpos monoclonales convencionales o de preferencia anticuerpos catalíticos generados según la presente invención usados en combinación con oligos de p53 tales como OL(1)p53 y/u otros inhibidores de puntos de control del ciclo celular tales como UCN-01, oligos de p21 u oligos de p27 serán particularmente muy adecuados para uso en combinación con la quimioterapia convencional para el tratamiento de carcinomas que expresan EGFR y/o HER2.

Mendelsohn y sus colaboradores mostraron que el bloqueo de la función de EGFR, por ejemplo con un anticuerpo monoclonal, causa una expresión aumentada de p53 y p21 o p27/KIP1 que da lugar a la inducción de un punto de control del ciclo celular (Wu y col., 1996; Peng y col., 1996). El uso combinado de un inhibidor de EGFR con un inhibidor de p53, p21 o p27 tal como un oligonucleótido o un anticuerpo catalítico evitarán la interrupción del ciclo celular y estimularán el efecto anticanceroso del inhibidor de EGFR particularmente cuando se use en combinación con terapia convencional contra el cáncer capaz de causar daño genómico.

Además, el uso de un oligo de p53, tal como OL(1)p53, ayudará al efecto inhibidor de otros inhibidores de EGFR porque p53 activa de manera transcripcional el gen de EGFR (Ludes-Meyers y col., 1996, Sheikh y col., 1997).

(C) Tratamiento combinado de pacientes con anticuerpos catalíticos para EGFR y OL(1)p53

El programa de tratamiento incluirá los siguientes aspectos: (1) Se tomará una muestra del cáncer para determinar el estado mutacional del gen de p53. (2) Se administrará a los pacientes por medio de infusión 0,1 mg/kg/hora del oligo durante aproximadamente cinco días y recibirán una inyección intravenosa en bolo del anticuerpo catalítico para EGFR en el intervalo de 1-50 mg según la tasa de recambio del anticuerpo. (3) Se comenzará la quimioterapia convencional 24 horas después de empezar la infusión del oligo. El(los) agente(s) quimioterapéutico(s) seleccionado(s)
será(n) aquel(los) que no se une(n) a OL(1)p53 y que es(son) capaz(ces) de causar daño genómico. Los oligos adecuados para este uso están descritos en la Patente de EEUUU Nº 5.654.415.

Ejemplo II Anticuerpos catalíticos en la vacunación contra el VIH

En este documento se describe una construcción de vacuna útil en el tratamiento del SIDA compuesta por un epítopo modelo de célula B y un epítopo de T ayudante obtenidos a partir de pg120. Los CRAA del epítopo de célula B se diseñarán para provocar Ac catalíticos. Un epítopo de célula B ejemplar se obtiene del sitio de unión de CD4, que está por lo general conservado en diferentes cepas de VIH-1. El sitio de unión de CD4 de gp120 es una diana adecuada, además, porque a diferencia de muchos otros epítopos es accesible para los Ac en la superficie viral nativa [31]. Se sabe que el sitio de unión de CD4 es un determinante conformacional.

En la presente invención se describe la preparación de un Ac catalítico que reconoce una porción específica del sitio de unión de CD4 (a diferencia del sitio de unión de CD4 completo). También se identificarán otros epítopos peptídicos en gp120 (u otras proteínas de VIH) que podrían ser dianas adecuadas para los Ac catalíticos. Como la escisión de gp120 puede dar lugar a cambios globales en la conformación proteica, acompañados por pérdida de la actividad biológica, ciertos epítopos peptídicos de gp120 pueden ser dianas adecuadas para Ac catalíticos incluso si no participan directamente en la unión de VIH-1 a las células huésped o en las interacciones del VIH-1 con los componentes intracelulares. También se contemplan estas y otras dianas dentro del alcance de la presente
invención.

La ayuda de células T para la síntesis de Ac es potencialmente objeto de restricción en diferentes individuos por el polimorfismo del MHC. En la presente invención, se usarán cepas de ratón con base genética bien definida como modelos para provocar la inmunidad catalítica en respuesta a conjugados de epítopos B-T. Se utilizará un epítopo de T ayudante "universal" reconocido prematuramente por diversos alelos del MHC de clase II. Otro beneficio de este enfoque es que resulta fácilmente adaptable a los ensayos clínicos en seres humanos.

Las glicoproteínas de envoltura de VIH-1 se sintetizan como un único precursor de 160 kD, gp160. Esta proteína es escindida en el enlace Arg511-Ala512 por una proteasa celular, que produce gp120 y la proteína integral de membrana gp41. La actividad biológica de gp120 es un ingrediente fundamental en la unión inicial de las células huésped por el VIH-1, en la propagación del virus y sus efectos tóxicos sobre neuronas no infectadas y otras células. La unión de un epítopo conformacional de un gp120 a los receptores de CD4 en las células huésped es la primera etapa en la infección de VIH-1. Los aminoácidos individuales que constituyen este epítopo parecen estar localizados en el segundo (C2), tercero (C3) y cuarto (C4) segmentos conservados de gp120 [12]. Estos son los residuos 256, 257, 368-370,421-427 y 457 de gp120. Véase Figura 7. Se han descrito anticuerpos monoclonales que se unen al sitio de unión de CD4 [32]. Como el sitio de unión de CD4 es un epítopo conformacional, los residuos distantes que no son constituyentes del epítopo por sí mismos pueden ser importantes para mantener la capacidad para unirse a CD4.

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Las interacciones de gp120 con otras proteínas de la célula huésped son también esenciales para la propagación del virus. Por ejemplo, la unión de gp120 por la calmodulina puede estar involucrada en la infectividad del VIH-1, como lo revela el efecto inhibidor de los antagonistas de la calmodulina. Asp 180 que está localizado entre las regiones V1 y V2 de gp120 es crítico para la replicación viral [33]. De manera similar, el bucle V3 puede ser esencial para la infectividad [34]. Resulta claro, por consiguiente, que los determinantes estructurales en gp120 diferentes de aquellos que constituyen el sitio de unión de CD4 son necesarios para la replicación del genoma viral, para la síntesis de proteínas de cubierta y para el empaquetamiento de las partículas virales.

El tratamiento de gp120 con tripsina bloquea sus efectos neurotóxicos. El tratamiento de las partículas de VIH-1 con tripsina, triptasa de células cebadas o factor Xa atenúa su efectividad. La escisión de gp120 en los residuos 269-270 ó 432-433 destruye la capacidad de unión a CD4, mientras que la escisión en los residuos 64-65, 144-145, 166-167, 172-173 ó 315-316 no afecta la unión al CD4 [35]. Por otro lado, se cree que la escisión en el enlace peptídico Arg315-Ala316 localizado en el bucle V3 de gp120 por una proteasa celular es esencial para la infección viral productiva. Se ha propuesto una dipetidilpeptidasa expresada en la superficie de la célula huésped (CD26) como responsable de la escisión en Arg315-Ala 316. Este sitio de escisión está localizado en el determinante neutralizador principal (PND), que es un componente del bucle V3 de gp120 contra el que se han sintetizado fácilmente anticuerpos Ac protectores. Se ha propuesto la hipótesis de que los Ac que se unen al PND bloquean la escisión por medio de una proteasa de una célula huésped de gp120, dando como resultado la neutralización del VIH. No hay evidencias de que el PND desempeñe una función directa en la unión VIH por CD4, pero se ha sugerido su participación en la unión por los correceptores de VIH.

La síntesis eficaz de Ac por parte de las células B es dependiente en parte del reclutamiento de células T ayudantes, que, una vez sensibilizadas secretan las citocinas estimuladores necesarias y activan las células B por contacto directo mediado por moléculas accesorias, tales como CD4 en las células T ayudantes y B7 en las células B. El reclutamiento de células T específicas de Ag se produce a través del reconocimiento por el receptor de las células T (TCR) del complejo de un epítopo de Ag procesado unido a las moléculas del MHC de clase II.

Las vacunas basadas en péptidos se formulan uniendo de manera covalente un epítopo de célula T a un epítopo de célula B, contra los que el huésped sintetiza los Ac. El epítopo T se une a moléculas del MHC de clase II en la superficie de las células presentadoras de antígenos, y el complejo MHC de clase II de los epítopos B-T se une a continuación por el TCR. Diferentes individuos en una especie exogámica expresan diferentes alelos de MHC de clase II involucrados en la presentación del Ag a las células T (loci I-E e I-K). De manera ideal, una vacuna peptídica debería estar libre de restricciones del MHC, es decir, debería provocar una potente respuesta de Ac independientemente de las variaciones del MHC de clase II involucradas en la presentación del Ag.

Las interacciones entre las moléculas del MHC de clase II, el TCR y el epítopo del Ag son muy promiscuas. Por consiguiente, ciertos péptidos pueden servir como epítopos T universales, es decir, estos péptidos pueden unirse a los diferentes alelos del MHC de clase II de manera eficaz. Además, no existe restricción aparente de reconocimiento de los péptidos al nivel de los diferentes tipos de TCR. Tales péptidos son componentes adecuados de epítopos T en vacunas diseñadas para neutralizar el VIH a través de la provocación de una respuesta de Ac protectores, según se describe en la presente invención.

Como se mencionó anteriormente, ciertos Ac se unen y escinden enlaces peptídicos en antígenos proteicos. Estudios recientes sugieren que ciertos genes de línea germinal que codifican el dominio V de las cadenas L son capaces de expresar esta actividad catalítica. Se han descrito Ac y cadenas L con actividad peptidasa comparativamente no específica (denominada actividad polirreactiva) en seres humanos y en animales no inmunizados [36]. Además, los residuos catalíticos de una cadena L de VIPasa identificados por mutagénesis son codificados por un gen de VL de línea germinal. La actividad peptidasa también puede aumentarse durante el transcurso de la diversificación somática de los Ac que se produce tras la inmunización con antígenos peptídicos. Se ha observado que ciertas cadenas L de VIPasa con elevados niveles de eficacia catalítica están muy mutadas en comparación con sus análogos genéticos de línea germinal [14]. Se describe que el apareamiento de los dominios VH adecuados con un dominio VL catalítico da como resultado una mejora en la eficacia catalítica [28]. Además, Ac catalíticos policlonales aislados de pacientes con enfermedades autoinmunes exhiben afinidad elevada por sus autoantígenos [1,4,5], que es el signo clásico de que los Ac han sido sometidos a mutaciones somáticas y a selección clónica.

La presencia de Ac catalíticos en las enfermedades autoinmunes puede deberse a una predisposición genética hacia la síntesis de catalizadores, surgida por la expresión selectiva de genes V de línea germinal particulares o por la formación aumentada de sitios catalíticos durante la diversificación de secuencias somáticas de los dominios V de los Ac. La observación de que las enfermedades autoinmunes están asociadas con la predisposición de uso de genes V diferentes está bien establecida en la bibliografía. Otros genes importantes para la expresión de Ac pueden también contribuir con los niveles de actividad catalítica en enfermedades autoinmunes. Se sabe que el ratón MRL/1pr es un buen productor de Ac catalíticos [7]. En esta cepa de ratones, se cree que una mutación del gen de apoptosis Fas permite la proliferación de células T y B y la expresión de una enfermedad análoga al lupus.

Incorporando la estructura adecuada en los inmunógenos capaces de inducir la síntesis de Ac que combinen especificidad por gp120 con rápida actividad de escisión de enlaces peptídicos, se generará un agente inmunoterapéutico para el tratamiento de SIDA.

La actividad catalítica de los autoanticuerpos para tiroglobulina y de diversas cadenas L capaces de escindir sustratos sintéticos de proteasas se inhibe por el diisopropilfluorofosfato (DFP), que reacciona de manera covalente con residuos serina activados. Véase Figuras 8 y 9.

Los Ac catalíticos para VIP contienen un subsitio de unión al antígeno de alta afinidad que es estructural y funcionalmente diferente del subsitio catalítico. En la cadena L del anti-VIP, la mutagénesis en los residuos responsables de la catálisis química (ser27a, His93) produce reducciones del recambio (k_{cat}) pero mínimo cambio en K_{m}, sugiriendo que los residuos responsables de la estabilización del estado de transición no contribuyen en el reconocimiento del estado base del sustrato. La mutagénesis en los residuos espacialmente distantes del subsitio catalítico produjo pérdida de unión al estado base del sustrato (K_{m} aumentada) y también una ganancia en el recambio, según se predijo. Puede concluirse que, por consiguiente, los residuos responsables de la unión inicial de alta afinidad y de la etapa de escisión química no son los mismos.

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Anticuerpos para análogos de estado de transición (TSA) y análogos de antígenos reactivos de manera covalente (CRAA)

Se ha propuesto la inmunización con TSA [37, 13, 38] como un medio para obtener Ac que se unen al estado de transición, y por consiguiente disminuyen la barrera de energía de activación para la reacción. Como se describió anteriormente en este documento, los análogos de fosfonato comúnmente usados contienen un átomo de fósforo tetraédrico y un átomo de oxígeno cargado negativamente unido al fósforo. Se cree que la formación del estado de transición de la escisión del enlace peptídico implica la conversión del átomo de carbono trigonal en el sitio de escisión al estado tetraédrico y la adquisición de una carga negativa por el oxígeno del grupo carbonilo. El TSA de fosfonato puede inducir, por consiguiente, la síntesis de Ac capaces de unirse a la estructura oxianión y a la configuración tetraédrica del estado de transición. Sin embargo, no se ha informado que los Ac para estos TSA, aunque son capaces de acelerar comparativamente las reacciones de transferencia que no demandan acilo, catalicen la escisión del enlace peptídico. Se ha informado recientemente que un anticuerpo para un TSA de fosfinato escinde lentamente una amida primaria estable [11]. El Ac antifosfinato puede permitir la transferencia superior de un protón al nitrógeno de amida en el enlace débil, comparado con los Ac antifosfonato más comunes, que probablemente explica su mejor actividad catalítica.

En el presente ejemplo, se predica el diseño de CRAA de la invención en las siguientes hipótesis: (a) como en las enzimas, la catálisis por Ac requiere la participación de aminoácidos químicamente activados para catalizar la escisión del enlace peptídico. (Por ejemplo, el grupo hidroxilo de Ser en serina proteasas adquiere carácter nucleófilo y la capacidad para mediar la catálisis covalente por la formación de una red intramolecular de uniones hidrógeno entre los residuos Ser, His y Asp); y (b) los catalizadores reconocen múltiples elementos estructurales para alcanzar la estabilización eficaz del estado de transición. Aparentemente la estructura del TSA de fosfonato sola es un inmunógeno incompleto para la inducción de Ac catalíticos, porque esta estructura no contiene los elementos necesarios para unirse a los sitios catalíticos nucleófilos, o los sitios en los catalizadores responsables del sitio de reconocimiento de residuos vecinos a S1. Los análogos de antígeno de la presente invención inducen la síntesis de Ac con capacidad catalítica covalente, junto con la capacidad para reconocer residuos básicos vecinos y el centro de reacción tetraédrico. En este documento se describe la síntesis del tipo anteriormente mencionado de Ac catalíticos inducidos por CRAA diseñados para unirse al sitio serina proteasa, codificado por la línea germinal en los Ac. Se prepararán CRAA electrófilos capaces de reaccionar con el residuo serina nucleófilo en Ac catalíticos. Se usarán estos CRAA nuevos como inmunógenos, para forzar la utilización de los sitios de serina proteasa para la síntesis de los Ac específicos de gp120. La inmunización con los CRAA anteriormente mencionados promueve la selección clónica de células B que expresan los sitios catalíticos codificados por la línea germinal. Además, la especificidad por gp120 se asegurará al incorporar un epítopo antigénico adecuado de gp120 en los flancos de la estructura del CRAA. Véase
Figura 10.

Debe notarse que la estructura del TSA de fosfonato convencional puede también ser útil, incluso si es un inmunógeno insuficiente por sí mismo. La incorporación de un residuo básico en el sitio P1 en un TSA de fosfonato podría ayudar a inducir la síntesis de Ac catalíticos, porque puede producirse la estabilización del centro de reacción en el estado de transición en combinación con el reconocimiento de los residuos vecinos. Además, la inmunización heteróloga, en la que la inmunización con el CRAA del éster de fosfonato es seguida por la inmunización con el TSA de fosfonato, podría permitir el desarrollo del sitio catalítico covalente así como del sitio de estabilización del oxianión. Los sitios de Ac que combinan estas funciones serán catalíticamente más potentes que los que utilizan sólo uno de los mecanismos anteriormente mencionados.

La enfermedad autoinmune está asociada con la producción de potentes Ac catalíticos específicos de antígeno. Se han identificado Ac capaces de unir [39] y escindir gp120 en pacientes con lupus. Además, las cadenas L aisladas de ratones con predisposición al lupus (MRL/lpr) escinden gp120.

Se analizaron muestras de IgG purificadas por cromatografía de afinidad en proteína G-Sepharose [41] de 17 pacientes positivos para VIH-1 y 10 pacientes con lupus para su capacidad para escindir ^{125}I-gp120. La radiomarcación de gp120 electroforéticamente puro (IIIB, AIDS Research and Reference Reagent Program, NIH) se realizó por medio del procedimiento de cloramina-T, seguida por la purificación de ^{125}I-gp120 por filtración en gel. Se observó una única banda de gp120 radiomarcado en 120 kD por SDS-PAGE y autorradiografía. Dieciséis de 17 muestras de IgG positivas para VIH-1 estaban desprovistas de actividad de escisión de gp120, y una mostró actividad apenas detectable. En comparación, 3 de 10 muestras de IgG de lupus mostraron escisión de gp120 fácilmente detectable. Véase Figura 11. No hubo evidencias de hidrólisis de ^{125}I-albúmina por las muestras de IgG, sugiriendo que la hidrólisis de gp120 observada no se debe a un fenómeno inespecífico. En experimentos separados, se purificaron cadenas L de una de las muestras de IgG de lupus que escindieron gp120 y de IgG sérico de ratones MRL/lpr. Esto se realizó por reducción y alquilación de la IgG y filtración en gel FPLC, usando protocolos descritos previamente para el aislamiento de cadenas L que escinden VIP de IgG monoclonal y policlonal humano [9,28]. La actividad de escisión de ^{125}I-gp120 fue evidente en las fracciones correspondientes al pico de cadena L tanto del paciente de lupus como del ratón MRL/lpr (25 kD). La identidad de las cadenas L recuperadas de la columnas de FPLC se confirmó por SDS-PAGE e inmunotransferencia como se describió anteriormente [28]. Las fracciones similares de cadenas L de IgG positiva para VIH-1 e IgG de BALB/c no exhibieron la actividad de escisión de gp120. Las actividades específicas de escisión de ^{125}I-gp120 por las cadenas L de lupus, cadenas L de MRL/lpr y tripsina fueron (expresadas como la reducción en el área de la banda intacta de gp120 en unidades arbitrarias/catalizador en nM/tiempo de incubación en horas), 31, 307 y 204, respectivamente. Nótese que la subpoblación de catalizadores constituye probablemente una pequeña fracción de las cadenas L, implicando que la actividad específica verdadera de la cadena L catalítica debe ser mayor que el valor citado anteriormente.

En presencia de un inhibidor de serina proteasa (diisopropilfluorofosfato 0,3 mM), la escisión de gp120 por IgG de un paciente con lupus se inhibió esencialmente por completo (Figura 12A). En comparación, los inhibidores de metaloproteasas, cisteína proteasas y proteasas ácidas (EDTA, yodoacetamida, Pepstatina A) no tuvieron efecto en la reacción.

Se obtuvieron más pruebas para la escisión de gp120 catalizada por cadenas L a partir de la identificación de una cadena L monoclonal con esta actividad. Se seleccionaron veintinueve cadenas L purificadas de pacientes con mieloma múltiple, tres dominios VL recombinantes de estas cadenas L, una cadena L recombinante con actividad hidrolizante de VIP [10] y Ac anti VIP policlonales [2] para su capacidad para hidrolizar ^{125}I-gp120. Se identificó una cadena L monoclonal de un paciente con mieloma múltiple con actividad hidrolizante de gp120 (Lay2). Las restantes muestras de Ac estaban desprovistas de Ac. La actividad hidrolizante de gp120 eluyó conjuntamente desde una columna de filtración de gel con el pico de proteína de cadena L. Se observó escisión de gp120 prácticamente equivalente por Lay2 en tampones fisiológicos y medios nutritivos (PBS, HBSS y RPMI1640). Resultaron evidentes cuatro productos de escisión de gp120 radiomarcados de aproximadamente 80 kD de masa, una mancha de aproximadamente 50 kD, 20 kD y < 6 kD por electroforesis no reductora. Esta banda de 80 kD sufrió otra disminución de tamaño bajo condiciones reductoras, sugiriendo que contenía fragmentos con uniones disulfuro. Se observaron perfiles de productos idénticos usando preparaciones de ^{125}I-gp120 obtenidas de cepas IIIB, SF2 y MN de VIH-1 (Figura 12B). Al igual que la IgG del lupus, la actividad de la cadena L se inhibió por medio del inhibidor de serina proteasa DFP, pero no por los inhibidores de otros tipos de proteasas.

Para confirmar que la reacción de escisión no era un artefacto asociado con la radioyodinación de gp120, se estudió la escisión de la proteína sin marcar (Figura 13). Se identificaron los productos de escisión por inmunotransferencia de geles reductores de electroforesis en SDS con un anticuerpo anti-gp120 descrito previamente por reconocer los productos de corte proteolítico de la proteína [35]. El aumento de hidrólisis de gp120 resultó evidente con concentraciones crecientes de cadena L, estimado como la reducción en la intensidad de la banda de sustrato de 120 kD. Esto estuvo acompañado por aumento de acumulación de la banda de 80 kD y otros productos de escisión. Los perfiles de escisión de gp120 no marcada y gp120 marcada analizados bajo condiciones reductoras fueron idénticos, excepto en que las intensidades de las bandas individuales fueron diferentes, que probablemente es un reflejo de los procedimientos usados para la detección de los dos tipos de sustratos (inmunotinción frente a marcación con ^{125}I en los residuos Tyr seguida por autorradiografía).

Las velocidades iniciales de la reacción de escisión medidas a una concentración de cadena L de 20 mM y concentraciones crecientes de gp120 (10-300 nM) fueron saturables (valor de K_{m} aparente 30 nM; V_{máx} 0,06 nmol gp120/nmol Lay2/hora). El valor de K_{m} nM sugiere comparativamente unión de alta afinidad. La escisión de gp120 catalizada con tripsina analizada en paralelo resultó no saturable a concentraciones de hasta 1 \muM, sugiriendo reconocimiento de baja afinidad. VIP inhibió la escisión de ^{125}I-gp120 por la cadena L (K_{i} de VIP, 620 nM). La cadena de Lay2 también hidrolizó VIP radiomarcado con una K_{m} de 144 nM [40]. Por consiguiente, VIP parece unirse a la cadena L aproximadamente 5-21 veces menos fuerte que gp120. Se han identificado dos regiones cortas de homología entre gp120 y VIP, que podrían ser la base de la reactividad de ambos polipéptidos con el catalizador.

Se proporcionan procedimientos para la síntesis de formulaciones de péptidos que provocan la síntesis de Ac catalíticos específicos y eficaces capaces de proteger contra la infección por VIH. Estudios anteriores han sugerido que puede reclutarse actividad catalítica polirreactiva de Ac codificados por la línea germinal y pueden mejorarse por inmunización de ratas con el CRAA serina reactivo de un péptido gp120. La provocación de una respuesta de Ac catalíticos proporcionará protección superior contra la infección por VIH-1 comparado con una respuesta de Ac no catalíticos.

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Se prepararán y evaluarán los siguientes inmunógenos sintéticos:

(A) inmunógenos sintéticos

a)

el análogo de estado de transición (TSA) de fosfonato de un epítopo de célula B de gp120 (residuos 421-436) conjugado a un epítopo de T ayudante del toxoide del tétanos (residuos 830-844) [denominado epítopo B-T];

b)

el CRAA del éster fosfonato del epítopo B-T;

c)

la forma no modificada del péptido del epítopo B-T.

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(B) se inmunizan ratones no autoinmunes (cepa B10.BR) y ratones autoinmunes (MRL/lpr) con los tres inmunógenos de (A) y se estudian las actividades de IgG purificadas del suero:

a)

unión y escisión del epítopo B-T de fosfonato, el epítopo B-T del éster de fosfonato y el epítopo B-T sin modificar;

b)

unión y escisión del monómero gp120 de longitud total; y

c)

unión y escisión de gp120 unido a la superficie de células nativas.

Inmunógenos

La vacuna prototipo capaz de provocar anticuerpos catalíticos para VIH contiene: 1) un epítopo para el que las células B pueden producir anticuerpos de alta afinidad (epítopo B); 2) un epítopo que es unido por antígenos del MHC de clase II y presentado a las células T (epítopo T); y 3) un imitación estructural del estado de transición formado durante la escisión del enlace peptídico, que tiene la intención de provocar la síntesis de anticuerpos capaces de estabilizar el estado de transición y de esta manera catalizar la reacción de escisión.

Componente epítopo B: La pérdida de infectividad tras la escisión de gp120 puede alcanzarse dirigiendo al catalizador para que escinda un enlace peptídico localizado en un epítopo de gp120 que desempeña un papel importante en el proceso de infección. Nótese que la escisión de gp120 en un enlace distante de los determinantes biológicamente importantes puede dar lugar también a pérdida de la función de gp120, porque la conformación de los fragmentos de gp120 pueden alterarse "globalmente" con relación a la proteína original. La probabilidad de neutralizar la infectividad viral puede aumentarse dirigiendo el Ac para que reconozca un epítopo que sea una diana conocida de Ac neutralizantes. La escisión del sitio de unión de CD4 es un mecanismo atractivo para alcanzar la neutralización del VIH por las siguientes razones: la unión CD4-gp120 es una etapa esencial en la entrada del VIH en las células del huésped; se sabe que la escisión de la unión de CD4 en el enlace 432-433 por medio de tripsina bloquea la capacidad de gp120 para unirse a CD4; se sabe que los Ac para el sitio de unión de CD4 inhiben la infección por VIH; el sitio de unión de CD4 en gp120 nativa expresada en la superficie de VIH está expuesto al entorno (a diferencia de varios otros epítopos de gp120 monomérica que están inmersos en oligómeros de gp120 nativa) [32]; y el sitio de unión de CD4 está bastante conservado en diferentes subtipos de VIH-1. La secuencia peptídica lineal compuesta de los residuos 421-436 de gp120 se ha seleccionado como el componente epítopo B del inmunógeno en el presente proyecto (KQIINMWQEVGKAMYA; Figura 10). Los estudios de mutagénesis han mostrado que esta región de gp120 aporta importantes contribuciones en la unión de CD4.

Componente análogo del estado de transición y componente análogo de antígeno reactivo de manera covalente: La catálisis tiene lugar cuando el estado de transición se estabiliza más que el estado base. En la presente invención los análogos de antígeno actúan para reclutar función catalítica mientras mantienen la capacidad de los Ac para unirse al estado base del antígeno. La última propiedad es necesaria para obtener catalizadores específicos de gp120, a diferencia de los Ac que escinden diversos polipéptidos de manera inespecífica. La inclusión de las secuencias de péptidos de gp120 vecinas al enlace peptídico diana conferirá especificidad para gp120. Las características estructurales fundamentales responsables de la estabilización del estado de transición de la escisión del enlace peptídico por Ac catalíticos análogos a serina proteasa se muestran en la Figura 14 y pueden incluir: (a) El átomo de carbono tetraédrico, electrófilo formado en el estado de transición en el enlace peptídico débil, capaza de unir residuos serina nucleófilos en el catalizador; (b) La estructura oxianiónica formada en este carbono, que puede estabilizarse por par iónico con residuos como Asn, Gln o Arg en el catalizador (el denominado hueco de oxianión); y (c) El residuo básico en el lado N terminal del enlace peptídico débil, cuyo reconocimiento puede producirse por par iónico con residuos ácidos tales como Asp o Glu localizados dentro o próximos al sitio catalítico en los Ac. Nótese que la cadena lateral cargada positivamente del residuo vecino, aunque no está directamente involucrada en los procesos de formación y ruptura del enlace durante la catálisis, puede ocupar una posición espacial diferente en el estado de transición que en el estado base. Esto es posible porque el carácter parcial de doble enlace del enlace peptídico débil se perderá tras la formación del estado de transición, permitiendo la rotación alrededor de este enlace y los consiguientes cambios en las posiciones de los grupos remotos. La factibilidad de tales cambios espaciales remotos en el estado de transición se ha deducido por medio de modelos computacionales de un sustrato peptídico en las configuraciones sp2 (estado base) y sp3 (estado de transición) en los enlaces débiles.

Se evaluarán un TSA y un CRAA que comprenden un análogo de fosfonato y un análogo de éster de fosfonato, respectivamente. En ambos casos, el átomo de fósforo tetraédrico sirve como el análogo del átomo de carbono del enlace peptídico débil que conecta los residuos 432 y 433 en gp120. En la configuración del feniléster que se muestra en la Figura 10, el átomo de fósforo adquiere una carga positiva parcial, a la vez que el átomo de carbono del enlace débil lleva la carga positiva parcial necesaria para su reacción con los residuos serina nucleófilos. Anteriormente se ha descrito que los O-fenilfosfonatos peptídicos son capaces de inactivar de manera irreversible diversas serina proteasas al formar un enlace covalente con el átomo de oxígeno del residuo serina del sitio activo [29]. Sampson y Bartlett y otros [23, 24] han establecido la síntesis química necesaria para preparar el feniléster en el átomo de fósforo, y para unir las secuencias peptídicas vecinas al éster de fosfonato.

Están presentes doce y cuatro aminoácidos, respectivamente, en los lados N y C terminal de la estructura TSA/
CRAA, que corresponden a la secuencia de residuos 421-436 de gp120. Se ha incorporado un residuo básico en la posición P1 del CRAA-gp120 para explotar en los Ac la existencia del sitio catalítico específicos de residuos básicos, codificado por la línea germinal. La presencia del residuo básico, junto con la estructura feniléster de fosfonato, promueve la fuerte unión al sitio catalítico, y de esta manera promueve la capacidad del CRAA-gp120 para estimular selectivamente la proliferación clónica de células B que sintetizan los sitios catalíticos.

Debe notarse que el CRAA de éster de fosfonato anterior del epítopo B es estructuralmente distinto de los TSA de fosfonato anteriores aplicados para elevar los Ac esterasa [13, 38]. Los TSA de fosfonato convencionales contienen un oxígenos aniónico unido al fósforo, que puede unirse al hueco de oxianión que se encuentra en el catalizador. Los TSA de fosfonato, sin embargo, no pueden reaccionar con los residuos serina nucleófilos en el sitio catalítico. Según se informó, un TSA de fosfonato del enlace peptídico Phe-IIe no indujo la formación de Ac catalíticos de amidasa [41].

El análogo de éster de fosfonato descrito anteriormente será comparado con un TSA de fosfonato del epítopo B por la siguientes razones: (a) el inmunógeno descrito en los estudios mencionados anteriormente no contenía un residuo básico en la posición P1, que actuaría contra el reclutamiento de los catalizadores de línea germinal para la síntesis de Ac peptidasa; y (b) mientras que la inmunización con un análogo de fosfonato solo puede resultar insuficiente para provocar la síntesis de Ac peptidasa, la inmunización heteróloga con el fosfonato y los análogos de éster de fosfonato pueden dar lugar a una buena respuesta de Ac peptidasa, porque puede anticiparse la inmunización heteróloga para seleccionar el hueco de oxianión (inmunización con fosfonato) así como los residuos serina nucleófilos (inmunización con éster de fosfonato). Tal coinmunización usando los inmunógenos fosfonato de gp120 y éster de fosfonato están contempladas dentro del alcance de la presente invención.

Componente epítopo T: Para reclutar ayuda de células T para la síntesis de Ac anti gp120, se colocará un péptido de quince aminoácidos (QYIKANSKFIGITEL) que corresponden a los residuos 830-844 de la toxina del tétanos en el lado N terminal del epítopo B. La presencia del epítopo T en la construcción de vacuna elimina la necesidad de conjugar el epítopo B a una proteína vehículo grande. Varios estudios previos han mostrado que péptidos lineales comparativamente cortos que incluyen un epítopo T y un epítopo B son capaces de provocar síntesis de Ac eficaz para el epítopo B [42]. Se sabe que el epítopo T de la toxina del tétanos a usar en la presente invención sirve como un epítopo T en huéspedes que expresan alelos de clase II diversos, y se ha caracterizado, por consiguiente, como un epítopo T "universal" [43]. Además se describe que un epítopo B de gp120 unido a este epítopo T induce la síntesis de Ac anti-gp120. La "universalidad" del epítopo T, aunque se ha deducido de estudios en seres humanos, probablemente se extiende al ratón, porque las restricciones de clase II tienden a conservarse filogenéticamente. Independientemente de las posibles diferencias en este punto entre el hombre y el ratón, las cepas de ratón a utilizar en la presente invención se han hecho coincidir para los alelos de clase II involucrados en el reclutamiento de ayuda de células T para la síntesis de Ac (haplotipo A^{k}E^{k}), eliminando la inquietud de que el reclutamiento T ayudante diferencial pudiera contribuir a variaciones en las respuestas de Ac catalíticos.

Montaje de inmunógenos: La síntesis de los 31 residuos de estado base de la construcción B-T (denominada epítopo B-T sin modificar) compuesta por los residuos 830-844 de la toxina del tétanos en el extremo N terminal y los residuos 421-436 de gp120 en el extremo C terminal se realizará por síntesis convencional en fase sólida en un sintetizador de Applied Biosystems. Se realizará espectrometría de masas y RMN de ^{1}H y ^{13}C para confirmar las estructuras.

El TSA y el CRAA del epítopo B-T contendrán las estructuras fosfonato y éster de fosfonato en los sitios de escisión marcados. Estos son reactivos nuevos, pero su síntesis no debería presentar problemas. Se utilizarán técnicas de química orgánica convencionales utilizadas previamente para la síntesis de TSA y otros tipos de inhibidores de enzimas [23, 24].

El siguiente es un breve resumen del esquema sintético. Se preparará el isóstero fosfinato de lisina a partir de la sal difenilmetilamina del ácido hipofosforoso y 6-bencilcarbamatohexanal, seguido por la eliminación del grupo difenilmetilo en ácido. Los péptidos vecinos requeridos (residuos 830-844 del toxoide del tétanos extendidos con los residuos 421-431 de gp120; residuos 4732-436 de gp120) se preparan por medio de síntesis convencional en fase sólida, excepto en que el péptido que corresponde al fragmento C terminal contiene ácido 2-hidroxi-6-carbobenciloxiaminohexanoico en lugar de la lisina N terminal. Otras cadenas laterales básicas están protegidas con el grupo carbobenciloxi y las cadenas laterales ácidas están protegidas con un grupo benciléster. Los péptidos protegidos se unirán al isóstero fosfinato de lisina por medio de procedimientos clásicos de síntesis de péptidos en fase de disolución. La estructura final feniléster de fosfonato del péptido se preparará por acoplamiento oxidativo del fosfinato con fenol. Se usará el mismo esquema de síntesis usado para la preparación del ácido fosfónico convirtiendo el fosfinato en el monoéster de ácido fosfónico por medio del tratamiento con bis(trimetilsilil)acetamida en acetonitrilo seguido por trietilamina acuosa, tetracloruro de carbono e intercambio de litio en la resina de intercambio iónico AG-X-50 [23; esquemas h y l]. Para confirmar las estructuras se realizará espectrometría de masas y RNM.

Inmunización de ratones

Se estudiará la respuesta de Ac en dos cepas de ratones para 4 construcciones de inmunógenos, BR10.R y MRL/lpr. Las inmunizaciones se realizarán con:

a.

Epítopo B-T (residuos 421-436 de gp120 unidos a los residuos 830-844 de la toxina del tétanos).

b.

Análogo fosfonato del epítopo B-T en el residuo Lys432. (TSA)

c.

Análogo éster de fosfonato del epítopo B-T en el residuo Lys432. (CRAA)

d.

Análogo éster de fosfonato seguido por análogo fosfonato del epítopo B-T en el residuo Lys432. (TSA + CRAA; inmunización heteróloga).

Se aplicarán procedimiento convencionales de inmunización para inducir la síntesis de Ac. Se administrarán tres inyecciones intraperitoneales y una inyección intravenosa (aproximadamente 100 \mug de péptido cada una). La inmunización final se llevará a cabo por vía intravenosa. Se probarán dos adyuvantes: RIBI y alum. Alum está aprobado para uso en seres humanos y se ha mostrado anteriormente que provoca síntesis de Ac para un epítopo B-T similar a los propuestos en la presente invención. RIBI es un reemplazo de baja toxicidad para el Adyuvante Completo de Freund y facilita de manera reproducible buenas respuestas de Ac para una diversidad de Ag. Se prepararán sueros de muestras de sangre del plexo retroorbital obtenidas de los ratones en cinco puntos temporales durante el transcurso del programa de inmunización. Se recogerán esplenocitos y se procesarán para la preparación de bibliotecas de presentación de fagos Fv para estudios de función y estructura. El análisis de dos adyuvantes es ventajoso porque la calidad y magnitud de respuestas de Ac para vacunas pueden estar influenciadas por los adyuvantes, a través de efectos de las citocinas y subpoblaciones de TH reclutadas por los adyuvantes en el desarrollo y selección clónica de células B [44]. Por consiguiente, se estudiará un total de 16 grupos de ratones (4 inmunógenos x 2 cepas de ratones x 2 adyuvantes), cada uno compuesto por 5 animales.

En el repertorio preinmune ya están presentes anticuerpos peptidasa no específicos de antígeno, de baja afinidad. A condición de que el gen de línea germinal que codifica la actividad peptidasa no específica sea reclutado para la síntesis de Ac, la inmunización con los CRAA dará como resultado la síntesis de Ac catalíticos específicos de gp120. Los seres humanos y los ratones con enfermedades autoinmunes son productores prolíficos de Ac catalíticos específicos de Ag, sugiriendo que el sistema inmune enfermo recluta el gen de línea germinal que codifica el sitio catalítico y permite la maduración de los sitios catalíticos para convertirse en específicos para Ag individuales durante el transcurso de la respuesta inmune. La cepa de ratón MRL/lpr es genéticamente propensa a sufrir enfermedades autoinmunes, y se ha observado previamente que es capaz de producir altos niveles de anticuerpos catalíticos. Además las cadenas L del suero de ratones MRL preinmunes expresan actividad de escisión de gp120. Por consiguiente, puede anticiparse que una subserie de anticuerpos formados por inmunización de ratones MRL/lpr con los inmunógenos descritos expresarán actividad catalítica específica de gp120. Es importante que los Ac de unión a gp120 hallados en los pacientes con lupus están dirigidos, en parte, al epítopo B de gp120 incluido en los inmunógenos descritos [39]. La cepa de ratón BR10.BR no es propensa a sufrir enfermedades autoinmunes. Los resultados de esta cepa reflejarán la capacidad de los inmunógenos descritos para estimular la inmunidad catalítica para gp120 en el sistema inmune sano. Los ratones BR10.BR y los ratones MRL/lpr tienen idénticos haplotipos en el loci de clase II responsable de la restricción de células T de síntesis de Ac (A^{k}E^{k}), asegurando que cualquier diferencia en la síntesis de Ac catalíticos entre las dos cepas no se deberá a la restricción de clase II.

Actividad de unión de Ac

Los Ac sintetizados en respuesta al CRAA deberían unirse al estado de transición de la reacción de escisión del enlace peptídico mejor que al estado base, permitiendo que se produzca la catálisis. La fuerza de la unión de los Ac a los CRAA/TSA servirá como predictor de la actividad catalítica del Ac. Además, si el epítopo B en el inmunógeno existe en aproximadamente la misma conformación en el inmunógeno y la gp120 de longitud total, los Ac también se unirán a la proteína de longitud total. Finalmente, si el epítopo está expuesto como en la gp120 nativa que se sabe que existe en la forma de oligómeros en la superficie viral, los Ac deberían también unirse a la estructura de gp120 oligomérica.

Epítopo B-T no modificado y epítopo B-T de TSA y epítopo B-T de CRAA: Se comparará la unión de estas tres formas de epítopo B-T, es decir, la forma no modificada, fosfonato y éster de fosfonato, por ELISA. Se evaluarán los valores aparentes de fuerza de unión por medio de ensayos de competición (como valores CI50), usando placas de ELISA recubiertas con el epítopo B-T no modificado (aproximadamente 50 \mug/ml) como la fase sólida y el epítopo B-T no modificado, fosfonato y éster de fosfonato como el competidor soluble. La unión se medirá usando IgG anti ratón acoplada a peroxidasa seguida por la adición de los sustratos (o-fenilendiamina y peróxido de hidrógeno). Como se estudiarán preparaciones policlonales, las curvas de unión pueden desviarse de isotermas de unión sigmoidales simples. Los valores CI50 para los ligandos individuales servirán, no obstante, como indicadores válidos de la afinidad de unión promedio de los Ac.

Para predecir la aceleración de la velocidad catalítica podría aplicarse la siguiente relación: Ki/Kd = k_{cat}/k_{no \ cat}, donde Ki y Kd son las constantes de equilibrio de disociación del TSA y del epítopo B-T no modificado, respectivamente y k_{cat} y k_{no \ cat} son las constantes de velocidad de primer orden para las reacciones catalizada y no catalizada, respectivamente. Los valores de CI50 podrían sustituirse en esta ecuación para predecir la aceleración de la velocidad, pero el valor predicho será un promedio de la actividad de varios Ac, porque las muestras de IgG a estudiar son mezclas de diferentes Ac. Los ensayos de unión se realizarán a 4ºC en presencia de diisopropilfluorofosfato (DFP) para reducir al mínimo la interferencia con medición de los parámetros de unión por escisión del péptido. Se ha observado en estudios previos que DFP, un conocido inhibidor de serina proteasa, inhibe de manera uniforme la actividad catalítica de los Ac. La reducción de la temperatura de reacción reducirá la velocidad de la reacción catalítica. Nótese que los valores de Km estimados de los ensayos de catálisis ayudarán a confirmar la validez del CI50 como un indicador de fuerza de unión.

Se realizarán ensayos en fase de disolución para confirmar que los efectos de avidez debidos al "recubrimiento" de antígenos en la fase sólida no llevan a estimaciones de unión erróneas. Los ensayos en fase de disolución se llevarán a cabo usando el epítopo B-T radiomarcado con ^{125}I. La radiomarcación del péptido se realizará usando el procedimiento de cloramina-T descrito anteriormente [2]. [El epítopo B-T contiene un residuo Tyr, que corresponde al residuo 435 de gp120]. Se atraparán los complejos Ac-Ag usando proteína G-Sepharose y se determinará la unión por medio del conteo de la radiactividad en un espectrómetro \gamma. Como anteriormente, se estudiará la unión a diversas concentraciones de los competidores TSA/CRAA, permitiendo la estimación de la fuerza de unión del epítopo no modificado y sus TSA/CRAA.

gp120 purificada y gp120 expresada en la superficie celular: Se medirán los Ac unidos por gp120 purificada y gp120 de superficie celular para determinar si el epítopo B marcado es accesible para los Ac en la forma oligomérica de longitud total de la proteína. Se usará gp120 recombinante expresada en una línea celular de mamífero para asegurar que el patrón de glicosilación de la proteína es similar al de las células infectadas con VIH. Se realizarán ensayos de ELISA competitivo usando gp120 recubriendo una fase sólida para determinar las fuerzas de unión aparentes de los Ac. Los ligandos competidores a estudiar son gp120 de longitud total y los tres epítopos B-T para los que provocan los Ac (TSA de fosfonato, CRAA de éster de fosfonato y el epítopo B-T no modificado). Se estimará la reactividad relativa de los inmunógenos sintéticos y de la gp120 de longitud total a partir de los valores de CI50 (Ki aparente) de los ligandos competidores. Los valores casi equivalente de CI50 para la gp120 de longitud total y el epítopo B-T no modificado indicarán que el epítopo B marcado existe en una conformación casi equivalente en las dos moléculas. Las observaciones que indiquen unión más fuerte de los Ac al fosfonato o al éster de fosfonato del epítopo B-T comparado con gp120 de longitud total indicarán que los Ac pueden exhibir actividad catalítica. Como se describió anteriormente se realizarán ensayos en fase de disolución usando gp120 radiomarcada para confirmar la ausencia de artefactos de ELISA, tal como la avidez de unión aumentada por la inmovilización del ligando.

Las células infectadas con VIH-1 de la línea celular T H9 expresan gp120 en su superficie. La mayor parte de las gp120 de la superficie celular imitan la forma de partículas de virus adherentes. Se cree que gp120 de la superficie celular existe en un estado oligomérico similar al estado de agregación de la gp120 en la superficie de los viriones. Por consiguiente, se han llevado a cabo reacciones de Ac con gp120 expresada en la superficie celular para indicar la capacidad de los Ac para reconocer la gp120 unida al virión.

En la presente invención, se cultivarán células H9 obtenidas del Depósito de SIDA de NIH en RPMI/FCS al 10% en CO_{2} al 5%. Se infectan las células (10^{6}/ml) con el sobrenadante del cultivo que contiene la cepa MN de VIH-1 (Depósito de SIDA) durante 2 horas a 37ºC. Tras lavar, se cultivan las células durante aproximadamente 1 semana. Se determina la unión de diversas concentraciones de IgG (1 nM-1 \muM) por incubación con un número adecuado de células intactas durante 4-6 horas a 4ºC en placas de 96 pocillos de base redonda en presencia de DFP 1mM, seguida por el lavado de las células para eliminar los Ac no unidos, incubación con IgG anti ratón de conejo conjugada a peroxidasa, desarrollo de la reacción con peróxido de hidrógeno y o-fenilendiamina, y cuantificación de la densidad óptica a 490 nm usando un lector de ELISA. Los controles incluirán la IgG preinmune y un Ac que sea reactivo con gp120 de la superficie celular (disponible del Depósito de SIDA de NIH). También puede estudiarse la unión de los Ac a las células por medio de citometría de flujo, usando un segundo Ac fluorescente para la detección del Ac anti-gp120 unido según se describió [45]. Este procedimiento permite la determinación de la afinidad aparente de los Ac por estimación de las tasas de asociación y disociación de los Ac.

Se realizarán experimentos de competición en los que se permitirá a las construcciones de epítopo B-T o gp120 de longitud total soluble actuar como lingandos competidores para unión de Ac a las células. Al igual que en los estudios de competición descritos en el párrafo anterior los valores de CI50 de los epítopos B-T estimarán las fuerzas relativas de la unión de Ac al epítopo B. para reducir al mínimo la escisión de gp120 por los Ac las incubaciones se realizarán a 4ºC. En las incubaciones puede también incluirse diisopropilfluorofosfato, que es un inhibidor eficaz de catálisis de Ac. La viabilidad celular se estimará al final de la reacción de unión por medio de pruebas de exclusión con azul de tripán, para confirmar que el inhibidor (y otras condiciones experimentales) no alteran la integridad celular, que podría perturbar potencialmente la estructura oligomérica de la gp120.

Selección para actividad catalítica:

Se seleccionará IgG purificada del suero por cromatografía de afinidad sobre proteína G-Sepharose para actividad catalítica usando el epítopo B-T no modificado como el sustrato. Los ensayos de selección iniciales se realizarán a una concentración de sustrato de 10 \muM y a una concentración de IgG de 0,25 \muM con tiempos de incubación de 1-2 horas. Aún con un recambio aparente tan bajo como 0,1/min, los productos deberían acumularse hasta concentraciones de aproximadamente 3 \muM (30% de la concentración inicial del sustrato). Se analizarán las mezclas de reacción por medio de HPLC en fase inversa con detección a 214 nm (gradiente de ácido trifluoroacético/acetonitrilo). Se calcularán las concentraciones de productos a partir de las áreas bajo los picos de los productos. Los controles incluirán IgG preinmunización.

Todas las muestras de IgG se seleccionarán además para escisión de gp120 de longitud total. El sustrato será ^{125}I-gp120. La radiomarcación de gp120 (MN recombinante expresado en células CHO) es por medio del procedimiento de cloramina T seguido por FPLC resolutiva para obtener ^{125}I-gp120 electroforéticamente homogénea. Para visualizar las bandas de productos se aplicará electroforesis en SDS y autorradiografía. Se han descrito los procedimientos que permiten un manejo rápido de las muestras. Pueden seleccionarse aproximadamente 50 muestras de IgG para la actividad por día. Se usará gp120 sin marcar como sustrato para confirmar que la reacción de escisión no es un artefacto asociado con el procedimiento de radiomarcación. Para este objeto se aplicará inmunotransferencia de geles SDS-PAGE de las mezclas de reacción con un Ac anti-gp120 capaz de reconocer diversos fragmentos proteolíticos de gp120.

Se establecerá la pureza de la IgG usada como catalizador por medio de SDS-PAGE. La retención de la actividad catalítica en las fracciones Fab y en IgG preparada por filtración en gel bajo condiciones desnaturalizantes (cloruro de guanidinio 6M) confirmará que la actividad catalítica se debe a los Ac como se describió anteriormente [36].

Los ensayos se realizarán en ausencia y en presencia de suero humano para evaluar si los inhibidores de proteasas encontrados en el suero influyen en la actividad catalítica de los Ac. En estudios preliminares, se ha encontrado que el suero no tiene efecto sobre la escisión de gp120 o tiroglobulina por Ac aislados del suero de lupus. En base a estos resultados, también deberían estar presentes en ratones Ac séricos resistentes a inhibidores.

Especificidad del sitio de escisión: Se identificarán los fragmentos de productos generados por escisión del epítopo B-T sin modificar y de la gp120 de longitud total, permitiendo la deducción del(los) sitio(s) de escisión. Se someterán los fragmentos del epítopo B-T separados por HPLC a secuenciación de aminoácidos del extremo N terminal y espectrometría de masas FAB para identificar el(los) sitio(s) de escisión, como se describió anteriormente [1,2]. En el caso del sustrato gp120 de longitud total, los productos de reacción se separarán por electroforesis en SDS, se transferirán a PVDF y los polipéptidos transferidos se someterán a secuenciación N terminal, permitiendo la identificación de los sitios de escisión por comparación con la secuencia de gp120. Los controles incluirán IgG de ratones preinmunes.

Se incluirá tripsina como un control positivo. Puede esperarse que la tripsina escinda el epítopo B-T en múltiples enlaces peptídicos vecinos a un residuo Lys o Arg, es decir, en los residuos 421-422 y 432-433 en el epítopo B y en los residuos 833-834 y 837-838 en el epítopo T. En comparación, el reclutamiento de la actividad catalítica en los Ac por la presencia de la estructura fosfonato o éster de fosfonato, debería escindir el epítopo B-T principalmente en el enlace peptídico Lys432-Ala433 por IgG. Es posible que se observe un resultado alternativo. Los catalizadores específicos de Ag pueden sintetizarse por inmunización con antígenos de estado base. Por consiguiente, pueden encontrarse catalizadores capaces de escindir los sustratos en enlaces peptídicos diferentes del enlace 432-433, porque la actividad codificada por la línea germinal presente en el repertorio preinmune puede reconocer residuos básicos independientemente de la estructura general del epítopo del antígeno [36,40]. El grado en que se produzca la reacción de escisión de preferencia en los residuos 432-433 indicará la importancia de la estructura fosfonato/éster de fosfonato en el reclutamiento del sitio catalítico. De manera similar, el grado en que la escisión de gp120 de longitud total está confinada a los enlaces peptídicos localizados dentro de los residuos 421-436 indicará la importancia de este epítopo peptídico para reclutar la actividad catalítica que es específica para gp120.

Especificidad del sustrato: Estos estudios se realizarán para evaluar el uso terapéutico de los catalizadores de anticuerpos. Se estudiará la escisión de diversos sustratos peptídicos y proteicos. Existen varios polipéptidos radiomarcados disponibles para estudiar el perfil de especificidad de sustrato: (a) ^{125}I-albúmina; (b) ^{125}I-tiroglobulina; (c) ^{125}I-VIP; y (d) ^{125}I-IgG. La hidrólisis de las proteínas está indicada por la aparición de bandas de productos de masas inferiores visualizadas por electroforesis y autorradiografía. La hidrólisis de VIP se mide por precipitación del péptido intacto con ácido tricloroacético o por HPLC en fase inversa [2]. También se examinará un panel más grande de polipéptidos seleccionados aleatoriamente (n > 10; polipéptidos disponibles comercialmente, por ejemplo, caseína, colágeno, etc.) para ensayos de inhibición, es decir, su capacidad para inhibir la hidrólisis de ^{125}I-gp120 por el catalizador. La inhibición de la reacción está indicada por depleción reducida de la banda de gp120 de 120 kD.

Cinética: Se realizarán estudios para determinar la constante de velocidad aparente y la eficacia catalítica (k_{cat}/K_{m}). Se usarán como sustratos el epítopo B-T no modificado y gp120 de longitud total. Las constantes cinéticas se determinarán a partir de ensayos realizados con concentraciones variables de los sustratos. Si los sueros contienen Ac catalíticos mezclados con Ac no catalíticos capaces de unirse al epítopo, estos últimos pueden proteger al epítopo de la escisión por los catalizadores. Para diferenciar entre estas dos combinaciones, la IgG del suero se adsorberá en un inhibidor inmovilizado que pueda unirse a los Ac catalíticos pero no a los Ac no catalíticos. Tales inhibidores están disponibles. Como tales inhibidores no contienen un epítopo de gp120, no se unirán a los Ac no catalíticos inducidos por inmunización con el epítopo B-T de gp120. Se unirá biotina al inhibidor para permitir la inmovilización usando placas recubiertas con avidina. Tras la incubación de la IgG sérica de ratones inmunes con inhibidor inmovilizado en exceso, se analizará el sobrenadante por medio de ELISA para unión al epítopo B-T no modificado. Una ausencia de unión sugerirá que los Ac no catalíticos para el epítopo no están presentes en cantidades significativas. Además, los Ac unidos pueden eluirse con hidroxilamina, a pH 9 o superior, que puede escindir el enlace covalente entre los Ac y el inhibidor. Los Ac eluidos, que serán deficientes en Ac no catalíticos para el epítopo B-T, pueden analizarse a continuación para parámetros cinéticos.

Los valores de Km nanomolares o inferiores indicarán actividad de unión al antígeno de alta afinidad. Las observaciones de valores de Km y k_{cat} para los dos sustratos sugerirá que los residuos 421-436 localizados en el inmunógeno sintético adoptan una conformación similar a la de gp120. Teniendo en cuenta los valores de la constante de velocidad aparente, las preparaciones de IgG deberían exhibir un recambio más rápido que el observado previamente usando preparaciones de Ac policlonales, porque los inmunógenos de la invención se diseñan expresamente para promover el reclutamiento y mejorar los sitios catalíticos durante el transcurso del procedimiento de inmunización.

También se evaluará la inhibición de escisión catalizada por IgG del epítopo B-T no modificado por el fosfonato y el éster de fosfonato del epítopo. La hidrólisis reducida indicará que los péptidos de fosfonato y de éster de fosfonato son inhibidores competitivos de la unión del epítopo B-T y/o sirven como sustratos alternativos. Cuando se observa inhibición, se medirá el valor de K_{i} para evaluar la reactividad relativa de la IgG con el epítopo B-T y sus TSA/CRAA. Para determinar si los TSA/CRAA se usan como sustratos, se estudiará su escisión por la IgG por medio de separación de los péptidos del producto por RP-HPLC e identificación de los péptidos del producto por secuenciación de aminoácidos. Si los catalizadores son capaces de escindir múltiples enlaces peptídicos de manera promiscua, los péptidos TSA/CRAA pueden ser escindidos por los catalizadores. Por otra parte, si los Ac escinden exclusivamente en el enlace Lys432-Ala433, los CRAA no servirán como sustratos porque contienen análogos no escindibles del enlace peptídico en esta posición.

Escisión de gp120 expresada en la superficie celular: Para confirmar que la actividad de los anticuerpos catalíticos está dirigida a la forma biológicamente importante de la gp120, es decir, gp120 oligomérica unida al virión. Servirá como sustrato la gp120 expresada en la superficie celular radiomarcada biosintéticamente. La radiomarcación de gp120 se realizará cultivando células H9 infectadas con VIH en metionina marcada con ^{35}S (en medio deficiente en Met). Las células se tratarán con concentraciones variables de las fracciones de IgG de ratones preinmunes e inmunes. Se prepararán extractos celulares usando un detergente suave (Triton-X-100 al 0,1%), que debería ser suficiente para liberar la gp120 radiomarcada al sobrenadante. La gp120 (y sus fragmentos) se inmunoprecipitarán desde los extractos celulares usando un Ac anti-gp120 de conejo disponible, que se sabe que se une a diversos fragmentos trípticos de la proteína [35]. Se usará electroforesis en SDS para separar los productos de reacción. La desaparición de la banda de gp120 intacta y la aparición de fragmentos de masas inferiores indicará la escisión de gp120 unida a la superficie celular. Los controles incluirán la inmunoprecipitación de los extractos celulares con IgG de conejo no inmune, en cuyo caso no debería precipitar ninguna radioctividad. Se realizará inmunotransferencia de los geles con Ac anti-gp120 para confirmar que el material inmunoprecipitado representa fragmentos de gp120.

También se realizarán experimentos de confirmación de que los Ac reconocen la conformación de gp120 expresada en la superficie de VIH-1. Se usarán preparaciones de virus-MN purificadas en gradientes de densidad de sacarosa como el sustrato (disponible de Advanced Biotechnologies). Tras la incubación del virus con los Ac, se determinará la escisión de gp120 como se describió para gp120 expresada en la superficie celular, es decir, extracción con detergente, electroforesis e inmunotransferencia con el Ac anti-gp120 que se sabe que se une a fragmentos de escisión de gp120.

La inmunización con los inmunógenos del epítopo B-T provocará Ac que se unen a gp120 de superficie celular y soluble de longitud total, porque el epítopo marcado en gp120 es parte del sitio de unión de CD4, que puede asumirse que está expuesto en la superficie de la proteína (a diferencia de estar inmerso en el interior de la proteína). Además, el epítopo marcado está conservado en diferentes cepas de VIH. Por consiguiente, se espera la síntesis de Ac ampliamente reactivos.

La IgG preinmune de ratones autoinmunes puede exhibir escisión de gp120 de bajo nivel, pero la actividad no será altamente específica para gp120. La inmunización de ratones autoinmunes con el epítopo B-T no modificado dará la actividad catalítica específica para gp120, pero no pueden predecirse mejoras en el recambio catalítico a partir de la estructura del inmunógeno. En comparación, el TSA y el CRAA del epítopo B-T están diseñados para provocar la síntesis de Ac que combinan la capacidad de unirse al estado base de gp120 así como al estado de transición de la reacción de escisión del enlace peptídico. Por consiguiente, se prevé que las inmunizaciones con TSA y CRAA provoquen la síntesis de Ac que exhiban unión a gp120 con elevada afinidad (valores bajos de Km aparente y Kd) y exhiban rápido recambio (kcat aparente). Además, la inmunización de los ratones autoinmunes con los análogos del epítopo B-T dirigirá la actividad catalítica promiscua que se encuentra en el estado preinmune a una especializada para reconocer el epítopo de gp120 marcado (residuos 421-436).

La inmunización de ratones B10-BR (ratones no autoinmunes) con los TSA y CRAA superará los mecanismos supresores que limitan la síntesis de Ac catalíticos en el estado no autoinmune. Esta prueba es importante para desarrollar una vacuna para VIH, porque el objetivo es desarrollar vacunas que protejan contra la infección, independientemente del estado autoinmune o no autoinmune del huésped.

El éster de fosfonato del epítopo B-T provocará catalizadores más potentes que el fosfonato del epítopo B-T, porque el primer inmunógeno promoverá la expansión clónica de células B que sintetizan Ac que contienen residuos Ser/Thr nucleófilos, que es una característica de los sitios catalíticos preexistentes codificados por los genes VL de la línea germinal. El fosfonato del epítopo B-T, por otra parte, está diseñado para reclutar Ac que contienen un hueco de oxianión (tal como Asn255 en subtilisina) para estabilizar la carga negativa desarrollada en el oxígeno del carbonilo en el estado de transición. No se dispone de evidencias que prueben que la estabilización del oxianión sea responsable de la catálisis por los catalizadores codificados por la línea germinal. Nótese, sin embargo, que los mecanismos de diversificación somática de la región V (hipermutación, recombinación V-J/V-D-J y diversidad de apareamiento VL/VH) son mecanismos potentes capaces de provocar sitios catalíticos de novo. El desarrollo de Ac que combinan el sitio nucleófilo de la línea germinal y un hueco de oxianión desarrollado somáticamente es muy factible. Tales sitios nucleófilos, de estabilización del oxianión son responsables de la catálisis eficaz por serina proteasas no Ac. Las inmunizaciones heterólogas propuestas, en las que la síntesis de Ac se inducirá por inmunización secuencial con el éster fosfonato del epítopo B-T y el fosfonato del epítopo B-T provocarán la síntesis de catalizadores específicos de gp120, de elevado recambio. La inmunización heteróloga también reclutará el(los) gen(es) de Ac de línea germinal que codifican sitios nucleófilos por la reactividad electrófila, covalente del éster de fosfonato, seguido por el desarrollo somático de una estructura de estabilización del oxianión durante el transcurso de la respuesta inmune.

Comparación de la actividad neutralizadora de VIH-1 de anticuerpos anti-gp120 provocados por el epítopo B-T no modificado con las actividades neutralizadoras de Ac provocados por el TSA del fosfonato del epítopo B-T y el CRAA del éster de fosfonato del epítopo B-T

La unión de gp120 a CD4 inicia la infección de las células por el VIH-1. La escisión de gp120 en el enlace 432-433 bloqueará eficazmente la unión del VIH-1 por las células, porque el sitio de escisión está localizado en la región de unión de CD4 de gp120, y la escisión de este enlace por medio de tripsina ha mostrado anteriormente inhibir la unión de gp120 por CD4 en fase de disolución [35].

Ac: Se compararán muestras de IgG purificadas de ratón en diversos tiempos durante el transcurso de la inmunización con la construcción del epítopo B-T de control (péptido sin modificar), el fosfonato del epítopo B-T (TSA), el éster de fosfonato del epítopo B-T (CRAA), y la combinación del fosfonato y éster de fosfonato del epítopo B-T (TSA + CRAA). La IgG hiperinmune de todas estas inmunizaciones debería ser capaz de unir gp120 con elevada afinidad. Se anticipa que estará presente la actividad catalítica en la IgG de las inmunizaciones con TSA/CRAA de ambas cepas de ratones.

Neutralización del VIH-1: Inicialmente, se seleccionarán muestras cegadas de IgG de todos los ratones en varios estadios de inmunización en un ensayo de línea celular T, bien caracterizado, cuantitativo, usando una cepa de laboratorio convencional (VIH-1 MN). Se realizarán otros estudios usando IgG hiperinmune obtenida hacia el final del programa de inmunización. Los controles incluirán células incubadas con IgG sin VIH-1 para descartar la posibilidad de un efecto tóxico inespecífico de la IgG. Estas muestras de IgG se analizarán usando linfocitos activados con PHA obtenidos de la sangre como un tipo celular y macrófagos obtenidos de la sangre como el segundo tipo celular. Un único VIH-1 ADA de aislamiento primario, de doble tropismo, será el aislamiento vial usado en el ensayo celular primario. La razón para usar ambos tipos celulares es evitar perder cualquier actividad neutralizadora/inactivadora que pueda residir en un epítopo único específico para los diferentes tipos de virus y células. Resulta evidente a partir de trabajos anteriores que una serie de factores son responsables de las profundas diferencias en la neutralización de cepas de laboratorio de aislamientos de campo. Aquellas muestras de Ac que exhiben actividad neutralizadora se compararán directamente por su potencia con monoclonales humanos que inhiben V3 y CD4 y sueros policlonales humanos positivos para VIH-1 bien caracterizados. Además, estos anticuerpos se evaluarán posteriormente por su estadio de, mecanismo(s) de acción, reversibilidad así como su amplitud de actividad neutralizadora sobre una gran variedad de subtipos/clases antigénicas en múltiples tipos celulares primarios.

La IgG a probar incluirá las preparaciones de anti-gp120 no catalítico (de ratones no autoinmunes inmunizados con el epítopo B-T no modificado) y anti-gp120 catalítico (por ejemplo, de ratones inmunizados con los TSA/CRAA del epítopo B-T). Como el epítopo B marcado en gp120 es esencial para la unión de CD4, puede anticiparse que incluso los Ac no catalíticos en preparaciones de IgG de la invención inhibirán la neutralización de VIH-1. Asumiendo que se provocan suficientes valoraciones de Ac, la IgG hiperinmune de cada uno de los grupos de ratones experimentales puede inhibir la infectividad del VIH-1.

Se compararán preparaciones homogéneas de construcciones de Fv catalíticas y una no catalítica para la actividad de neutralización de VIH-1. Esto confirmará los resultados obtenidos de los estudios con IgG policlonal. Además, como las construcciones de Fv carecen del dominio Fc, fenómenos como la unión del complemento y la unión del receptor de Fc serán eliminados. La ausencia de infectividad aumentada de VIH-1 por tales fenómenos quedará de esta manera confirmada usando las construcciones de Fv.

El mayor atractivo de los Ac catalíticos es su mayor e irreversible capacidad neutralizadora de antígenos comparados con los Ac no catalíticos. En la presente invención, las muestras de IgG catalítica deberían exhibir potente neutralización de VIH-1, en concentraciones varios órdenes de magnitud inferiores que las muestras de IgG no catalítica. El epítopo marcado por el catalizador es un constituyente del sitio de unión de CD4 de gp120. Además, se ha encontrado que la escisión del enlace marcado (Lys432-Ala433) por tripsina bloquea la unión de gp120 a CD4. El sitio de unión de CD4 tiende a conservarse a través de diferentes cepas y subtipos de VIH-1. Por consiguiente, los catalizadores anti-gp120 de la presente invención representan una herramienta terapéutica beneficiosa para el tratamiento de trastornos infecciosos, tales como la infección por VIH.

Ejemplo III Uso de CRAA y anticuerpos catalíticos en la lesión por isquemia-reperfusión y en el choque séptico/SIRS

La lesión por isquemia-reperfusión se produce cuando se interrumpe el suministro de sangre a un tejido durante un período prolongado (isquemia) y a continuación se restablece (reperfusión). Este tipo de lesión afecta tanto a pacientes con ataque cardiaco como con ictus tras el tratamiento para restablecer el flujo sanguíneo a los tejidos dañados. La isquemia y en particular la reperfusión están asociadas con liberación en este tejido de ciertos factores que causan una respuesta inflamatoria y lesión por inducción de la muerte celular programada.

El choque séptico y el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) son términos para un síndrome frecuentemente fatal que incluye cambios hemodinámicos, inflamación y por último la insuficiencia de órganos importantes en un orden predecible comenzando con los pulmones. El síndrome del choque séptico se asoció originalmente con infecciones bacterianas por gram negativos y los efectos de las endotoxinas, pero posteriormente se encontró que una diversidad de otros problemas médicos, tales como el daño tisular extenso como resultado de un accidente, inician el mismo síndrome, que en ausencia de infección se denomina SIRS [46]. La insuficiencia de múltiples órganos observada en ambos síndromes está claramente asociada con la presencia de muerte celular programada y puede estar causada en gran medida por la misma.

Lesión por isquemia-reperfusión

Los cuatro factores principales que inducen la muerte celular programada en este trastorno son las especies reactivas de oxígeno (ROS) y el óxido nítrico (\rightarrowperoxinitrito \rightarrowROS hidroxilo) que inducen y son inducidas por interleucina-1 beta (IL-1) y por el factor de necrosis tumoral (TNF) alfa.

Considerando la implicación de la muerte celular programada en la lesión por isquemia-reperfusión y choque séptico/SIRS, el hecho de que los factores solubles recién mencionados despeñen un papel prominente en ambos enfatiza las similitudes en la patofisiología entre las emergencias médicas.

Los CRAA nuevos de la invención pueden usarse para aprovechar el desarrollo de anticuerpos catalíticos que escinden IL-1 y TNF para el tratamiento de la lesión por isquemia-reperfusión, el choque séptico/SIRS y el síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto (SIRA) así como para otros trastornos inflamatorios tales como la artritis reumatoide y para el tratamiento del dolor neuropático.

Lesión por isquemia-reperfusión

El retorno temprano de flujo sanguíneo a los tejidos isquémicos es crítico para detener la progresión de los daños celulares como resultado de una interrupción del suministro de oxígeno y nutrientes. Paradójicamente, la reinstauración del flujo sanguíneo a los tejidos isquémicos está asociada con otros daños tisulares. Se ha demostrado experimentalmente que, por ejemplo, cuatro horas de isquemia intestinal son sustancialmente menos dañinas que tres horas de isquemia más una hora de reperfusión [47,48]. La importancia de la fase de reperfusión para el daño tisular total se ha ilustrado en numerosos estudios que muestran que las intervenciones terapéuticas iniciadas durante la fase isquémica son sólo tan eficaces como las iniciadas en el inicio de la reperfusión [49,50,51,52]. Los tejidos dañados por isquemia-reperfusión muestran rápidamente zonas de muerte celular necrótica rodeadas por áreas de células sufriendo muerte celular programada [53,54,55].

Está bien establecido que los tejidos isquémicos deben exponerse a oxígeno molecular tras la reperfusión para exhibir daños [56-61].

Se han postulado varios mecanismos para explicar la patogénesis de la lesión por isquemia-reperfusión pero la mayor atención se ha enfocado en las ROS. ROS se refiere a cualquier compuesto derivado de oxígeno molecular que tiene carga negativa incluidos el superóxido, el peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo que están reducidos en uno, dos y tres electrones respectivamente.

Numerosas líneas de evidencias han implicado a las ROS en lesiones por isquemia-reperfusión incluidas las siguientes: 1) Se ha detectado la producción de ROS en tejidos isquémicos por resonancia de espín electrónico y "spin trapping" [62,63] así como por medio de reducción de nitroazul de tetrazolio, quimioluminiscencia y atrapamiento de salicilato. 2) La exposición de tejidos a ROS en ausencia de lesión por isquemia-reperfusión produce cambios patológicos similares a los daños por isquemia-reperfusión mismos [64,65,66,67]. 3) El tratamiento con agentes que barren ROS o limitan la producción de ROS reducen significativamente los daños de la lesión por isquemia-reperfusión [68,69].

Uno de los efectos iniciales de la isquemia es la depleción de ATP en el tejido afectado, que a su vez hace que las membranas se vuelvan permeables a los iones, y el secuestro ineficaz del calcio. El aumento resultante de calcio citosólico promueve la activación de fosfolipasa y enzimas proteolíticas dependientes de calcio, y un importante resultado es la conversión de xantina deshidrogenasa en xantina oxidasa [70]. La xantina oxidasa se encuentra en células parenquimatosas y endoteliales, y produce ROS superóxido y, directa o indirectamente, peróxido de hidrógeno. El hecho de que la inhibición de la xantina oxidasa reduce el daño causado por la lesión por isquemia-reperfusión apoya la idea de que la producción de ROS por esta enzima contribuye a la patogénesis.

En los tejidos isquémicos se presenta reducción de fofatidiletanolamina, la degradación de fosfolípidos y la liberación de ácidos grasos libres. Con el inicio de la reperfusión se produce una rápida utilización de los ácidos grasos libres, particularmente el ácido araquidónico, que estimula las rutas de la lipooxigenasa y ciclooxigenasa que dan como resultado la producción de ROS. Se ha observado que los inhibidores de la ciclooxigenasa son beneficiosos para reducir el daño tisular de la lesión por isquemia-reperfusión.

El óxido nítrico es una especie altamente reactiva liberada continuamente por el endotelio [71]. Mantiene la microcirculación en un estado de vasodilatación activa e impermeabilidad vascular y evita la adherencia de plaquetas y leucocitos al endotelio. Es sintetizado enzimáticamente por una sintasa endotelial constitutivamente activa a partir de L-arginina y su producción puede inhibirse por medio de análogos de L-arginina tales como metiléster de N^{G}-nitro-L-arginina (L-NAME). La inhibición de la producción del óxido nítrico en la vasculatura coronaria con inhibidores tales como L-NAME puede causar isquemia miocárdica por vasoconstricción [72]. Existen evidencias sustanciales, sin embargo, de que los inhibidores de la síntesis de óxido nítrico pueden reducir sustancialmente el nivel de daño tisular asociado con la lesión por isquemia-reperfusión [73, 74].

Las formas inducibles de sintasa de óxido nítrico son responsables de niveles aumentados de esta molécula durante la lesión por isquemia-reperfusión. Los inductores incluyen citocinas inflamatorias, aminoácidos neuroexcitadores y la vasodilatación relacionada con el flujo durante la hipertermia postisquémica. Noiri y col. [75] demostraron que un oligo antisentido dirigido a transcriptos de genes de sintasa de óxido nítrico inducible puede reducir la expresión de estos genes. Administrado sistémicamente, este oligo fue captado por el riñón y redujo significativamente la insuficiencia renal causada por la producción experimental de isquemia renal en ratas.

El óxido nítrico puede combinarse con el anión superóxido para producir el radical libre tóxico peroxinitrito, dando lugar a la producción del radical hidroxilo, una ROS que se cree que es un factor causante principal en la lesión por isquemia-reperfusión [74]. La reducción del oxígeno molecular para producir superóxido tiene lugar en todas las células que respiran aeróbicamente en el sistema de transporte de las mitocondrias.

Se ha mostrado también que el óxido nítrico induce la muerte celular programada en una serie de situaciones fisiológicas y experimentales. La activación de la producción de óxido nítrico en alto nivel ayuda a formar la primera línea de defensa contra patógenos invasores y células tumorales.

La liberación de ROS en áreas de lesión por isquemia-reperfusión atrae leucocitos inflamatorios, que a su vez pueden causar daño tisular por medio de un arsenal citotóxico que incluye la liberación de más ROS. Numerosos estudios han mostrado: 1) que los leucocitos se acumulan en las áreas de lesión por isquemia-reperfusión, y 2) que la depleción de neutrófilos circulantes o el uso de agentes que evitan la activación de los neutrófilos puede en algunos casos reducir el daño tisular asociado con la lesión por isquemia-reperfusión.

Las fases terminales de la muerte celular programada incluyen una serie de enzimas que pertenecen a la familia ICE. Se ha mostrado que los péptidos capaces de inhibir algunas de estas enzimas reducen el daño cerebral isquémico que se produce como resultado de la oclusión transitoria de la arteria cerebral media en roedores y mejora significativamente las deficiencias de conducta resultantes [76]. La última observación demuestra que la recuperación funcional de tejido neural isquémico puede seguir a tratamientos que evitan que la muerte celular programada llegue a completarse. Presumiblemente, el grado de recuperación funcional sería aún mayor en los casos en los que la isquemia es seguida por lesión por reperfusión.

Numerosos estudios han demostrado que la muerte celular programada es una característica ubicua de los tejidos dañados por lesión por isquemia-reperfusión [53, 54, 55].

La inducción de niveles de sintasa de óxido nítrico inducible se han correlacionado positivamente con la muerte celular programada en corazones de rata por Szabolcs y col. [77]. Se transplantó tejido cardiaco de ratas Lewis a ratas Wistar-Fourth como un modelo de rechazo de aloinjerto cardiaco, mientras que los transplantes de Lewis a Lewis sirvieron como un control. El número de miocitos cardiacos que sufrieron muerte celular programada aumentó bruscamente desde el día 3 hasta el día 5 tras el transplante. En el día 5, los aloinjertos mostraron un aumento significativamente mayor en los miocitos, endotelio y macrófagos que sufrían muerte celular programada cuando se comparó con injertos singénicos. Se mostró que la expresión de ARNm de sintasa de óxido nítrico inducible, proteína y actividad enzimática aumentan en paralelo con el tiempo y la extensión con la muerte celular programada en los miocitos cardiacos. La tinción inmunohistoquímica demostró que las áreas de óxido nítrico inducible aumentado también expresaron nitrotirosina, indicativo de la formación de peroxinitrito.

Numerosas líneas de evidencias respaldan la conclusión de que la interleucina-1 beta (IL-1) y el factor de necrosis tumoral (TNF) alfa desempeñan papeles importantes en la evolución de la lesión por isquemia-reperfusión.

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Se ha mostrado que la producción de ambas citocinas proinflamatorias está asociada con la activación celular de la serie monocito/macrófago, que puede presentarse como el resultado de la actividad de radicales oxígeno derivados de xantina oxidasa.

La IL-1 se descubrió en la década de 1940 y se mostró inicialmente que produce fiebre cuando se inyecta en animales. A principios de 1970, se encontró que IL-1 tiene una diversidad de otros efectos biológicos cuando se inyecta en animales incluidos la neutrofilia, respuestas antimicrobianas elevadas, síntesis aumentada de reactivos hepáticos de fase aguda e inducción de factores estimulantes de colonias. También se encontró que estimula la respuesta de células T a los mitógenos en cultivo y que funciona como un adyuvante.

Estudios de clonación han demostrado que IL-1 es una familia de tres miembros constituida por IL-1 alfa, IL-1 beta y IL-1ra. Los dos primeros son agonistas y el último un antagonista de receptores. IL-1 está localizado en las membranas celulares mientras que IL-1 beta se libera como una citocina y es la forma como se denomina simplemente en este texto. Se sintetiza como un precursor y debe ser escindida antes de volverse activa. La más específica de estas enzimas es la enzima convertidora de interleucina-1beta (ICE) que está estrechamente relacionada con la familia de enzimas activas en las fases finales de la muerte celular programada.

Se ha demostrado expresión de IL-1 en áreas sometidas a lesión por isquemia-reperfusión en la retina, el hígado, músculo esquelético e intestino. Tanto la expresión de IL-1 como de TNF se demostraron de manera similar en el cerebro y en el corazón. En el modelo de roedor usado por Hara y col. [76], la expresión de IL-1 alcanzó su máximo 30-60 minutos tras revertir la oclusión experimental de la arteria cerebral media y disminuyó a partir de entonces.

El tratamiento de miocitos cardiacos de rata con IL-1 induce la transcripción de sintasa de óxido nítrico y la expresión aumentada de la enzima por una vía dependiente de proteincinasa A. Se ha mostrado también que IL-1 induce esta enzima en células endoteliales del cerebro. De manera similar, se ha mostrado que IL-1 y TNF inducen la sintasa de óxido nítrico cardíaca y hepática. Como se discutió anteriormente, las ROS causan daño genómico que induce la expresión de p53 que puede dar como resultado la muerte celular programada.

IL-1 también induce la expresión de otras citocinas proinflamatorias tales como IL-6. En algunos casos la inducción está mediada por el factor de transcripción NF-\kappaB que también puede mediar los efectos del TNF. La frecuentemente observada sinergia entre IL-1 y TNF así como entre IL-1 e IL-6 puede explicarse en parte en base a vías de transducción de señales significativamente solapadas en poblaciones celulares que responden a las tres citocinas.

Se ha encontrado que el tratamiento de IL-1ra de ratas que sufren lesión por isquemia-reperfusión hepática reduce la producción de TNF, el daño tisular y la mortalidad [78]. Se indujo isquemia en hígados de rata obturando los vasos de los lóbulos izquierdo y medio durante 90 minutos. En una serie de experimentos, se administró IL-1ra sistémicamente cinco minutos antes de inducir la isquemia, y se determinaron los niveles de TNF en la sangre y el hígado en diversos puntos temporales tras el comienzo de la reperfusión. En los animales de control, se encontró que los niveles de TNF en ambos tejidos aumentaron a lo largo del tiempo a medida que continuaba la reperfusión, con la finalización del experimento 41/2 horas desde el inicio de la isquemia. En contraste, el tratamiento con IL-1ra causó un descenso en los niveles de TNF en los dos tejidos. El examen histológico demostró que el tratamiento con IL-1ra estaba asociado con daño hepático sustancialmente menor comparado con los controles.

En una segunda serie de experimentos, se extrajeron los lóbulos derecho lateral y caudado no afectados del hígado tras completar el período de isquemia. El ochenta por ciento de los animales de control murieron comparado con el 30% de los tratados con IL-1ra.

En estudios similares, se demostró que el tratamiento con IL-1ra y la IL-1ra que se presenta naturalmente protegen al tejido cerebral de la rata del daño inducido por la lesión por isquemia-reperfusión.

Se examinó el papel de TNF en la lesión por isquemia-reperfusión en el cerebro. En una serie de experimentos, se administraron dosis variables de TNF intracerebroventricularmente a ratas 24 horas antes de ocluir la arteria cerebral media durante 80 ó 160 minutos (transitorio) o hasta terminar el experimento 24 horas más tarde (permanente). En algunos grupos se administró anticuerpo neutralizador de TNF 30 minutos antes de la inyección de TNF. La administración de TNF exógeno produjo un significativo aumento dependiente de la dosis (32%) en el tamaño del infarto causado por la oclusión permanente. La dosis alta de TNF (25 pmol) causó un aumento en el tamaño del infarto tanto en ambos grupos de oclusión transitoria de 100% y 34%, respectivamente. Todos estos efectos del TNF exógeno fueron abolidos en el animal que recibió tratamiento previo con el anticuerpo para TNF.

En aún otra serie de experimentos, se evaluaron los efectos del bloqueo del TNF endógeno bloqueando la función del TNF con un anticuerpo neutralizante o un receptor de TNF soluble (sTNF-RI) administrados 30 minutos antes ó 3 ó 6 horas tras la oclusión permanente. El bloqueo de la función del TNF previo o tras la oclusión dio como resultado una reducción de hasta el 26% en el tamaño del infarto según la dosis del inhibidor.

Se ha mostrado que el TNF media parcialmente el daño hepático asociado con la fase de reperfusión de la lesión por isquemia-reperfusión. La producción hepática de TNF fue responsable del secuestro de neutrófilos y la activación en el área afectada, dando lugar a la liberación de ROS. La inmunización pasiva con anticuerpos neutralizantes para TNF pudo inhibir significativamente estos efectos patogénicos. También se ha mostrado que el TNF administrado a hepatocitos cultivados potencia la citotoxicidad de ROS administradas al mismo tiempo. De manera similar, se ha mostrado que los anticuerpos neutralizantes para TNF reducen los efectos cardiovasculares y mejoran la tasa de supervivencia tras la inducción de la lesión por isquemia-reperfusión aguda por una oclusión de 45 minutos de la arteria mesentérica superior en un modelo de rata.

Choque séptico/SIRS

Dejando a un lado la etiología, los acontecimientos fisiopalógicos básicos que se producen en la lesión por isquemia-reperfusión y en el choque séptico/SIRS son muy similares, pero en la primera la patología está localizada mientras que en el último es sistémica y puede terminar en una insuficiencia de múltiples órganos comenzando con los pulmones. Los elementos fundamentales en ambos grupos de trastornos son las ROS, el óxido nítrico, la IL-1, el TNF y la muerte celular programada.

La mayor parte de los estudios experimentales en este campo incluyen el choque séptico por la facilidad con que puede inducirse este síndrome usando bacterias o productos bacterianos. Los cambios fisiopatológicos descubiertos en estos estudios asociados con el choque séptico/SIRS en pacientes demuestran que el síndrome está dirigido por una cascada de mediadores proinflamatorios. Se acepta en general que esta cascada es iniciada por IL-1 y TNF que se liberan inicialmente desde los macrófagos y otras células inflamatorias. Una gran diversidad de otros tipos de células también producen IL-1 y la mayoría de las células en el cuerpo tienen receptores para IL-1. Se ha mostrado que la producción de IL-1 está estimulada por ROS y TNF y estas dos citocinas promueven la producción de ROS. En el choque séptico, la producción de IL-1 y TNF es el resultado de la acción de endotoxinas y otros productos bacterianos. La elevada expresión de estos dos factores junto con las ROS llevan a una excesiva producción de una gran diversidad de mediadores secundarios incluidos IL-6, IL-8, interferón gamma, prostaglandina I_{2}, tromboxano A_{2}, prostaglandina E_{2}, factor de transformación de crecimiento beta, factor activador plaquetario, bradicinina, angiotensina y péptido intestinal vaso activo. Estos factores contribuyen a los cambios patológicos cardiovasculares, hemodinámicos y de la coagulación y a otros cambios asociados con este síndrome.

TNF fue la primera citocina que se relacionó con el choque séptico/síndrome SIR, cuando se demostró que su sobreproducción es un antecedente para el choque y la muerte. Poco después se mostró que IL-1 era similarmente tóxico y era sinérgico cuando se administraba con TNF. Como resultado, las cantidades de otra manera no letales de TNF e IL-1 combinadas, produjeron choque letal en animales.

Tras un ataque inflamatorio, el TNF es la primera citocina en aparecer en la circulación seguida por IL-1. En voluntarios a los que se les inyectó endotoxina, por ejemplo, los niveles de TNF alcanzan un máximo 60-90 minutos tras el ataque y regresan a los valores basales dentro de las tres horas. Los niveles de IL-1 alcanzan una meseta 3-4 horas tras el tratamiento. Estas observaciones generales y los hallazgos de que TNF puede inducir la producción de IL-1 han contribuido a la idea de que TNF es la citocina inicial que comienza el choque séptico/síndrome SIR mientras que IL-1 está más involucrada con su continuación.

Se ha sugerido a la medición de los niveles séricos de IL-6, que es inducida por TNF y por IL-1, como una mejor medida de producción de TNF e IL-1 que una medición directa de estas citocinas. Los niveles de IL-6 en la circulación frecuentemente se correlacionan directamente con la gravedad de la enfermedad en pacientes con trauma, sepsis y choque séptico/SIRS. A diferencia de IL-1 y TNF, sin embargo, la administración de IL-6 no induce inflamación o choque séptico/SIRS y los inhibidores de IL-6 no evitan los efectos letales de este síndrome.

Una gran cantidad de otras evidencias respaldan la idea de que estos mediadores desempeñan un papel crítico en la patogénesis de este síndrome. Casey y col. [77], por ejemplo, examinaron la correlación entre los diversos factores involucrados en el choque séptico y el resultado para 97 pacientes, 57 de los cuales tuvieron choque séptico en estado avanzado o sufrieron hipotensión que es un indicador prematuro de choque séptico/SIRS inminente. La tasa de supervivencia para este grupo de pacientes fue del 54%. La correlación positiva más potente fue entre los niveles plasmáticos de IL-6 y la mortalidad y la segunda más potente fue con los niveles de IL-1. IL-1 es por lo general no detectable en los sujetos normales (< 40 pg/ml). No hubo correlación entre TNF y entre los niveles de endotoxina y muerte. La falta de correlación con TNF se atribuyó al hecho de que esta citocina se produce sólo en las etapas más tempranas de la cascada de factores y tiene una semivida corta. Los niveles de TNF elevados, sin embargo, mostraron correlación con la presencia de sepsis por gram positivos.

Las citocinas proinflamatorios involucradas en choque séptico/SIRS, en particular TNF, activan las cascadas de coagulación y del complemento que causa la activación de neutrófilos con la liberación de ROS. La sintasa de óxido nítrico es inducida por IL-1 y TNF tanto en células endoteliales como en células inflamatorias. Los neutrófilos activados consumen oxígeno en la así llamada explosión respiratoria formando el ión superóxido que reacciona con óxido nítrico para formar peroxinitrito que se descompone para formar los ROS hidroxilo altamente tóxicos. Las ROS, especialmente superóxido, generan factores quimiotácticos cuando reaccionan con un precursor plasmático en un proceso autoamplificado.

Los pacientes con choque séptico/SIRS han respondido favorablemente al tratamiento con antioxidantes confirmando la importancia de las ROS en la patogénesis de este síndrome. Se ha observado una marcada reducción en la tasa de mortalidad, por ejemplo, en pacientes con el síndrome de insuficiencia respiratoria aguda (SDRA) relacionada con sepsis tras el tratamiento con una combinación de cuatro antioxidantes. SDRA se refiere a la insuficiencia pulmonar relacionada fisiopatológicamente que es la primera de las insuficiencias de múltiples órganos que caracterizan la fase terminal del choque séptico/SIRS. De manera similar, en otro estudio, los pacientes con SDRA que recibieron el antioxidante N-acetil cisteína mostraron mejor función pulmonar y cardiaca icluidos cambios en la resistencia vascular pulmonar, trabajo cardiaco y entrega de oxígeno.

La interpretación mecánica del choque séptico/SIRS que se ha desarrollado en base a estos y a una gran cantidad de otros datos sugiere que este síndrome podría prevenirse por medio de agentes que bloqueen la producción de TNF e IL-1. Se ha mostrado que los anticuerpos neutralizadores de IL-1 mejoran el síndrome de choque séptico en modelos animales. La administración de IL-1ra recombinante, sin embargo, ha sido el enfoque usado con mayor frecuencia para bloquear la función de IL-1 en modelos animales de choque séptico/SIRS [78].

El tratamiento simultáneo de conejos, por ejemplo, con cantidades adecuadas de IL-1ra seguido por cantidades normalmente letales de endotoxina dan como resultado hipotensión sólo leve y transitoria e infiltración disminuida de los neutrófilos en los tejidos. También se ha demostrado que IL-1ra previene la muerte de ratas infectadas con K. pneumoniae y de peritonitis con E. coli.

Se ha estudiado en babuinos la capacidad de la infusión de IL-1ra para atenuar el posterior choque séptico letal por E. coli. Cuando se administró en exceso en el intervalo de 10^{3} hasta 10^{4} veces con respecto a los niveles de IL-1, IL-1ra previno una respuesta sostenida de IL-1, aunque no se observó efecto sobre la producción inicial de la citocina, dando como resultado una tasa de supervivencia del 100% a las 24 horas frente al 43% en los controles tratados con placebo.

Muchos informes han proporcionado evidencias de que los anticuerpos neutralizadores de TNF y los receptores solubles de TNF pueden proteger a los animales de inyecciones de toxinas bacterianas de otra manera letales, tales como endotoxina, que puede inducir el choque séptico. Para resultar beneficiosos, sin embargo, estos tratamiento deben administrarse antes o durante la infusión de endotoxina o bacterias.

También se ha investigado el papel de TNF en el inicio del choque séptico usando ratones knock out para el receptor TNF-1. Se mostró que estos ratones no responden a dosis de TNF que produce un síndrome de choque séptico letal en ratones normales. Los knock out tampoco responden a las dosis normalmente letales de endotoxina si se los trata previamente con D-galactosamina y un agente que sensibiliza a los animales a la toxina al bloquear su metabolismo por el hígado. No hubo diferencias entre los ratones normales y los knock out en términos de niveles plasmáticos de TNF inducidos por la endotoxina. Tras un desafío subletal con endotoxina, se encontró que los niveles de IL-6 liberados en la circulación eran dramáticamente menores en los ratones knock out comparados con los controles. Finalmente, se ha mostrado que los macrófagos de los ratones knock out se vieron gravemente limitados en su capacidad para producir óxido nítrico por la vía de la sintasa de óxido nítrico inducible. En contraste, los ratones con una deleción de IL-6 no mostraron tal déficit.

Hasta seis antagonistas de TNF en desarrollo por cinco diferentes compañías para el tratamiento del choque séptico han estado en ensayos clínicos de Fase II-III al mismo tiempo. Cuatro de estos inhibidores eran anticuerpos neutralizantes y dos eran receptores solubles de TNF recombinantes. Ninguno de estos productos se ha distinguido por sí mismo como un tratamiento viable para este síndrome. Los antagonistas de TNF incluidos los anticuerpos neutralizantes, sin embargo, no están exentos intrínsecamente de eficacia en pacientes porque han mostrado posteriormente promesas sustanciales en ensayos clínicos para el tratamiento de la artritis reumatoide.

Claramente, los intentos durante los últimos diez años para desarrollar nuevos tratamientos para el choque séptico/SIRS han dado lugar a muchas decepciones. Pruitt y col. [78] han resumido una serie de razones presentadas por numerosos investigadores para las razones por las que los ensayos de inhibidores de citocinas han fracasado. Tal vez el único mayor obstáculo para el éxito se refiera al coste de los inhibidores de citocinas existentes. Su elevado precio los excluye para el uso profiláctico. Por ejemplo, como puntualizaron Pruitt y col. [78], para mantener una concentración plasmática terapéutica de 10-15 microgramos/ml, debe administrarse IL-1ra en concentraciones de 1,5-2,0 mg/kg/hora de aproximadamente 2,5 gramos por día durante todo el tiempo en que el paciente está séptico.

Por consiguiente, los pacientes que reciben inhibidores de IL-1 o TNF son ya sintomáticos. Aún nuestra comprensión de la patogénesis de este síndrome sugiere fuertemente que la función de IL-1 y particularmente de TNF deben bloquearse en el mismo inicio de la cascada de liberación excesiva de citocinas proinflamatorias que tiene un papel fundamental en llevar adelante el síndrome. Una vez más, los estudios en animales han mostrado de manera convincente que para ser eficaz, debe administrarse IL-1 y TNF previo o simultáneamente con el ataque inflamatorio que engendra el choque séptico/ síndrome SIR.

En el ensayo Synergen Inc. en Fase II, por ejemplo, se administró IL-1ra en promedio 9 horas tras considerar al paciente candidato adecuado para el estudio [79]. Como resultado, numerosos pacientes que entraron en el ensayo habían desarrollado una respuesta séptica 24 o más horas antes del inicio de la infusión de IL-1ra. Por consiguiente para muchos pacientes la cascada proinflamatoria está muy avanzada en el momento en que se comenzó el intento para bloquear la función de IL-1.

Las respuestas positivas en los ensayos clínicos de IL-1ra pudieron haberse ocultado también por el uso del criterio de mortalidad por todas las causas de 28 días. Una reevaluación de los datos de los ensayos en Fase II y primera Fase III reveló que el principal beneficio obtenido de la infusión de IL-1ra se presentó 3-7 días tras el tratamiento [78]. Las curvas de supervivencia fueron posteriormente paralelas esencialmente. Este hallazgo podría reflejar la semivida muy corta de IL-1ra. La semivida de fase beta de IL-1ra en primates sépticos, por ejemplo, es de aproximadamente 21 minutos. De manera similar, las semividas de IL-1 y TNF se miden en minutos a horas. No resulta sorprendente, por consiguiente, que la mortalidad tras la primera semana después de la infusión de IL-1ra sea irrelevante para evaluar el valor de la terapia.

Aún otro problema con los ensayos clínicos con IL-1ra, que es generalmente aplicable a los inhibidores de IL-1 o TNF administrados sistémicamente, proviene de la práctica para determinar la dosis del inhibidor de citocina en base a la concentración plasmática de la citocina. La razón es que la concentración local de estas citocinas en el tejido puede ser mucho mayor que la que está presente en el plasma. En los pacientes con SDRA, por ejemplo, se ha mostrado que las concentraciones de IL-1 en los pulmones es tan elevada como 15 ng/ml mientras que las concentraciones plasmáticas son inferiores 100 pg/ml.

Por consiguiente, los datos de choque séptico/SIRS y la comprensión actual del síndrome respalda el desarrollo de nuevas terapias que puedan (1) bloquear IL-1 y TNF y sean suficientemente baratas para poder administrarlas profilácticamente a los pacientes en riesgo; y (2) evitar la muerte celular programada que es un factor contribuyente principal de la insuficiencia orgánica que causa muchas muertes asociadas con este síndrome.

Por consiguiente, en este documento se describen CRAA que estimularán la producción inmune de anticuerpos catalíticos específicos para TNF e IL-1. Estos anticuerpos pueden administrarse usando protocolos ya desarrollados para inmunoterapias basadas en la administración de otros anticuerpos monoclonales conocidos. Como los anticuerpos de la presente invención actúan catalíticamente, las dosificaciones serán muy inferiores que las de los anticuerpos que se unen de manera reversible y estequiométrica. Por consiguiente, el coste del tratamiento profiláctico para pacientes en riesgo de sufrir el síndrome se reducirá en gran medida. Un ejemplo de CRAA para provocar anticuerpos catalíticos para TNF\alpha se muestra en la Figura 15. Los ejemplos de CRAA para provocar anticuerpos catalíticos para IL1\beta se muestran en las Figuras 16 y 17. En la Figura 17 se muestra un centro electrófilo de boronato.

Ejemplo IV Inmunización pasiva con los anticuerpos catalíticos de la presente invención

Existen muchas áreas en la medicina donde la administración de anticuerpos monoclonales está proporcionando beneficios clínicos. En el campo del transplante de órganos, se ha usado un AcMo (OKT3) que se une a los receptores de células T para la depleción de células T in vivo. Además, se están usando los AcMo para tratar la enfermedad de injerto frente al huésped con algo de éxito. Se ha establecido un ensayo clínico que está evaluando la capacidad de AcMo anti-CD4 para la depleción de células T en el tratamiento de la esclerosis múltiple.

Por consiguiente, los procedimientos de administración de anticuerpos monoclonales son muy conocidos por los clínicos expertos en la técnica. En un estudio controlado, en fase III, aleatorizado, de quimioterapia sola o en combinación con un AcMo recombinante para el oncogén HER2, se proporciona un ejemplo de procedimiento y un programa de dosificación.

Todos los pacientes aleatorizados para el brazo del estudio con el AcMo recombinante humanizado para Her2 recibirán tratamiento como una dosis de carga I.V. de 4 mg/kg en el Día 0 (el primer día de infusión del AcMo para HER2, o el día tras la aleatorización para los pacientes en el grupo de control), a continuación semanalmente como una dosis de 2 mg/kg por vía I.V. a lo largo del transcurso del estudio. Todos los pacientes se controlarán durante cada visita del estudio por medio de una evaluación clínica, un examen físico dirigido a los síntomas (si es adecuado) y pruebas de laboratorio. Se realizarán evaluaciones rutinarias de los tumores en todos los pacientes en intervalos prescritos durante el estudio. Se registrarán todos los acontecimientos adversos.

La administración de los anticuerpos catalíticos de la presente invención se realizará como se describió anteriormente para el anticuerpo monoclonal para HER2. Como en el estudio de HER2, tras la infusión, se evaluará a los pacientes para determinar la eficacia del anticuerpo catalítico administrado.

En el caso en que los anticuerpos catalíticos administrados como se indicó anteriormente den lugar a efectos laterales indeseables en el paciente, se administrarán los CRAA inmunizantes para inhibir de manera covalente la acción de los anticuerpos catalíticos.

Ejemplo V Inmunización activa usando los CRAA de la presente invención

La inmunización activa se realizará usando los procedimientos anteriormente desarrollados con vacunas diseñadas para provocar respuestas de anticuerpos protectores contra los antígenos deseados [82,83]. Por ejemplo, pueden administrarse los CRAA mezclados con una formulación adyuvante adecuada tal como alum por vía intramuscular a una dosis optimizada para la máxima síntesis de anticuerpos (100-1000 \mug/kg de peso corporal), y pueden administrarse dos o tres inyecciones de estímulo en intervalos de 4 semanas, hasta que la concentración de anticuerpos catalíticos en el suero alcance niveles meseta. Se anticipa que la inmunidad protectora generada de esta manera dure por varios años, porque la vacunación dará como resultado la formación de células de memoria específicas, de larga vida que pueden estimularse para producir anticuerpos tras la exposición a la célula cancerosa u organismo ofensor. Las descripciones y procedimientos para determinar las concentraciones de anticuerpos catalíticos se presentan en los Ejemplos I y II. Como la respuesta sintética de anticuerpos para la mayoría de los antígenos es dependiente de las células T, puede incorporarse un epítopo de célula T adecuado en el inmunógeno por síntesis peptídica, como se describió en el caso de gp120, Ejemplo II. Como alternativa, puede conjugarse un vehículo tal como hemocianina de lapa al CRAA por medio de acoplamiento a través de grupos amino de cadena lateral lys o grupos sulfhidrilo de cadena lateral Cys para maximizar la respuesta de anticuerpos si es necesario.

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Gennady Gololobov

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<120> Procedimientos para Identificar Inductores e Inhibidores de Anticuerpos Catalíticos, Composiciones y Sus Usos

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<130> UNMC 63123

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<140>

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<141> 23-03-1999

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<150> US 09/046.373

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<151> 23-03-1998

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<160> 10

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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0

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<210> 1

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Virus-1 de Inmunodeficiencia Humana

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Clostridium tetani

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<400> 2

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2

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<210> 3

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<211> 9

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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<210> 4

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<211> 6

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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<210> 5

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<211> 11

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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<210> 6

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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<210> 7

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<210> 8

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<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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10

Claims (10)

1. Un análogo de antígeno reactivo de manera covalente (CRAA), que comprende la siguiente fórmula estructural:

X1-Y-E-X2

en la que X1 y X2 son secuencias peptídicas que comprenden de tres a diez aminoácidos en el lado amino terminal y el lado carboxi terminal del centro de reacción, en el que las secuencias peptídicas son de un epítopo de una proteína asociada a enfermedad; Y es un residuo aminoácido cargado positivamente seleccionado del grupo constituido por lisina, arginina o sus análogos, y E es un centro de reacción electrófilo seleccionado del grupo constituido por un resto fosfonato o un resto boronato.

2. Un análogo de antígeno reactivo de manera covalente según se reivindica en la reivindicación 1, en el que X1 y X2 son cada uno secuencias peptídicas de un epítopo presente en proteínas seleccionadas de factor de necrosis tumoral, receptor del factor de crecimiento epidérmico, interleucina-1, gp120, gp160, gag, pol, antígeno de superficie de hepatitis B, exotoxinas bacterianas, EGF, TGFa, p53, antígeno específico de la próstata, antígeno carcinoembrionario, prolactina, gonadotrofina coriónica humana, c-myc, c-fos, c-jun, receptor del factor de crecimiento epidérmico, HER-2, receptores de prolactina, receptores de esteroides e IL-4.

3. Un análogo de antígeno reactivo de manera covalente según se reivindica en la reivindicación 1 ó en la reivindicación 2, provocando dicho análogo de antígeno reactivo de manera covalente la producción de anticuerpos catalíticos para el receptor del factor de crecimiento epidérmico, en el que X1 es Mer-Glu-Glu-Asp-Gly-Val-Arg-Lys-Cys; Y es Lys; E es un éster de fosfonato; y X2 es Cys-Glu-Gly-Pro-Cys-Arg;

o provocando dicho análogo de antígeno reactivo de manera covalente la producción de anticuerpos catalíticos para gp120, en el que X1 es Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln-Glu-Val-Gly; Y es Lys; E es un éster de fosfonato; y X2 es Ala-Met-Tyr-Ala;

o provocando dicho análogo de antígeno reactivo de manera covalente la producción de anticuerpos catalíticos para TNFa, en el que X1 es Leu-Ala-Asn-Gly-Val-Glu-Leu; Y es Lys; E es un éster de fosfonato; y X2 es Asp-Asn-Gln-Leu-Val-Val-Pro;

o dicho análogo de antígeno reactivo de manera covalente la producción de anticuerpos catalíticos para IL-1b, en el que X1 es Pro-Lys-Lys-Lys-Met-Glu-Lys; Y es Lys; E es un éster de fosfonato; y X2 es Phe-Val-Phe-Asn-Lys-Ile-Glu.

4. Un análogo de antígeno reactivo de manera covalente según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para uso en la preparación de una preparación farmacéutica para estimular la producción de anticuerpos catalíticos y para aislar y purificar dichos anticuerpos.

5. El análogo de antígeno reactivo de manera covalente para uso según se reivindica en la reivindicación 4, en el que dicha preparación farmacéutica además comprende una cantidad inmunogénica de un análogo de estado de transición (TSA).

6. Un análogo de antígeno reactivo de manera covalente según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para uso en la inhibición de un anticuerpo catalítico.

7. Un análogo de antígeno reactivo de manera covalente según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende un epítopo inmunogénico microbiano de un organismo infeccioso, para uso en la inmunización activa de un paciente contra una infección microbiana.

8. Una preparación farmacéutica para tratar una afección patológica relacionada con la presencia de un anticuerpo catalítico producido de manera endógena, comprendiendo dicha preparación un análogo de antígeno reactivo de manera covalente según se reivindica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que se une de manera irreversible por dicho anticuerpo catalítico, en una cantidad suficiente para inhibir la actividad de dicho anticuerpo catalítico y un medio biológicamente compatible.

9. Un análogo de antígeno reactivo de manera covalente según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para uso en el tratamiento de un estado de enfermedad en un paciente por medio de la inhibición irreversible de la acción de un anticuerpo catalítico.

10. Un análogo de antígeno reactivo de manera covalente para uso según se reivindica en la reivindicación 9, en el que dicho estado de enfermedad es una enfermedad autoinmune, siendo dicha enfermedad autoinmune de preferencia seleccionada del grupo constituido por tiroiditis autoinmune, lupus eritematoso sistémico, asma, artritis reumatoide, enfermedad conectiva mixta, síndrome de Reiter, síndrome de Sjogren, vasculitis y retinopatía en perdigonada; o un trastorno linfoproliferativo, siendo dicho trastorno linfoproliferativo de preferencia seleccionado del grupo constituido por mieloma múltiple, leucemia linfoblástica aguda, linfoma linfoblástico, linfoma linfocítico pequeño, linfoma linfoplasmacitoide, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma centro folicular, linfoma de tejido linfoide asociado a la mucosa, leucemia de células vellosas, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Burkitt y linfoma monocitoide nodular.