MXPA01001264A - Prevencion y tratamiento de enfermedades virales - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a la generación de Estructuras Moleculares Relacionadas con Fusión (FRMS) que contienenuno o más determinantes transicionales relacionados con fusión. Las vacunas altamente eficaces pueden ser construidas las cuales presentan determinantes relacionadas con fusión para un sistema'inmunológico que produce anticuerposúnicos capaces de neutralizar potencialmente una amplia variedad de aislados primarios de diferentes lugares en el mundo y de clases virales filogenéticas diferentes. La presente invención ofrece los métodos para formación, aislamiento y purificación de las FRMS, asícomo el uso de estas FRMS en una variedad de composiciones y métodos que incluyen, por ejemplo, inmunógenos de vacunas, de diagnóstico y terapéuticos. La presente invención se refiere a las FRMS capaces de producir anticuerpos neutralizantes para fagos virales y aislados primarios de un virus. Los anticuerpos aumentados para las FRMS pueden utilizarse para-estudiar la ruta molecular hacia la fusión del virus y la célula hospedera y para identificar los puntos del posible bloqueo mediado por el anticuerpo para esta ruta. La invención también se refiere al uso de los anticuerpos de la invención para agentes antivirales, aditivos de productos sanguíneos, aditivos contraceptivos, inmunización pasiva en tratamientos posteriores a la exposición o inmunización de feto.

Description

, PREVENCIÓN Y TRAT.AMIENTO DE ENFERMEDaADES VIRiLES Las invenciones que consisten de anticuerpos monoclonales para las FRMS y proteína de envoltura viral marcada por afinidad, respectivamente, fueron efectuadas con el apoyo del gobierno o a través de las asignaciones económicas números ROÍ AI44669-01 y R21 AI44312-02 otorgadas por los National Institutes of Health (Institutos Nacionales de Salud) . El gobierno tiene ciertos derechos sobre estas invenciones. La solicitud reclama prioridad con relación a la Solicitud de Patente provisional Norteamericana número 60/095,105 presentada el día 3 de Agosto de 1998, y con relación a la solicitud de patente provisional norteamericana número 60/141,806 presentada el día 29 de Junio de 1999, ambas incorporándose aquí por referencia en su totalidad. 1. INTRODUCCIÓN La presente invención se refiere al descubrimiento sorprendente que vacunas altamente efectivas pueden ser construidas con los presentes determinantes de transición relacionados con fusión para el sistema inmune que engendran anticuerpos únicos capaces de neutralizar de manera potente un amplio rango de aislados primarios, a partir de ubicaciones en todo el mundo de diferentes clases virales filogenéticas . La invención se refiere a la generación de estructuras moleculares relacionadas con fusión (FRMS) que comprenden uno o varios determinantes relacionados con fusión. La invención se refiere además al descubrimiento que una neutralización amplia y uniforme de diversos aislados primarios indica que los determinantes críticos presentados por FRMS, son altamente conservados y pueden ser relacionados de manera íntima con el funcionamiento básico de la proteína de envoltura en el enlace y fusión. La presente invención ofrece métodos para la formación, aislamiento y purificación de las FRMS así como en cuanto al uso de FRMS en varias composiciones y métodos, incluyendo, por ejemplo, inmunógenos de vacuna, para propósitos de diagnóstico y como agentes terapéuticos . La presente invención se refiere a FKMS capaces de producir anticuerpos neutralizantes para patógenos' virales y aislados primarios de un virus. Los anticuerpos preparados para FRMS pueden ser empleados para estudiar la ruta molecular hacia la fusión del virus y célula huésped y para identificar puntos de un bloqueo posible mediado por anticuerpos de esta ruta. La invención se refiere también al uso de anticuerpos de la invención para agentes antivirales, aditivos de productos sanguíneos, aditivos contraceptivos, inmunización pasiva en tratamientos posteriores a la exposición o inmunización de feto . 2 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La cita de una referencia aquí no debe considerarse como la admisión que dicha referencia es una técnica anterior de la presente invención. Los virus son agentes infecciosos responsables de muchas enfermedades, en seres humanos, animales, bacterias y plantas, y por consiguiente son de gran importancia médica y comercial. En términos generales, una partícula viral libre, que se conoce como virión, está constituido por un genoma (que puede ser .ARN o .ADN) , proteínas o poliamidas asociadas, y un revestimiento de proteína que se conoce co o cápside. Algunos viriones están además rodeados por una envoltura membranosa. Las estructuras de cápside y envolturas sirven para proteger el genoma contra nucleasas presentes en el entorno y sirven también para facilitar la situación y penetración celular en la cual se efectuará la infección y la replicación. 2.1 PENETRACIÓN VIRAL Un virus debe emplear la maquinaria biosintética de la célula huésped para su replicación. Los virus emplean las rutas sintéticas y sustratos disponibles en las células de los animales para mantener y propagar su propia información genética. Para poder tener acceso a la biomaquinaria de la célula, el virus debe penetrar o infectar la célula. La penetración es facilitada para la presencia de una o varias proteínas a receptores virales en membranas de células huéspedes. Las proteínas virales se unen sobre estos receptores iniciando una serie compleja e eventos a través de los cuales el ácido nucleico viral o nucleoproteínas son liberadas en la célula. En el caso de virus envueltos, la infección es presentada por la fusión de la envoltura viral con una membrana celular como por ejemplo una membrana de superficie celular o una membrana interna. Ya los virus envueltos están implicados en enfermedad de seres humanos y animales. 2.2 VIH Un ejemplo clínicamente importante de un virus envuelto es el VIH. El virus será inmunodeficiencia humana (VIH) ha sido implicado como la causa primaria de la enfermedad del sistema inmuno de degeneración lenta que se conoce como síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) (Barre-Sinoussi, F., et al., 1983, Science 220:868-870; Gallo, R., et al., 1984, Science 224:500-503). En seres humanos, la replicación de muestras de VIH ocurre principalmente en poblaciones de linfocitos T CD4+, y la infección VIH revoca el agotamiento de este tipo de células y eventualmente provoca la incompetencia inmune, infecciones oportunistas, disfunciones neurológicas, crecimiento neoplásico, y finalmente la muerte del paciente. Existen por lo menos dos tipos distintos de VIH que incluyen: VIH-1 (Barre-Sinoussi, F., et al., 1983, Science 220:868-870; Gallo, R et al., 1984 Science 224:500-503) y VIH-2 (Clavel, F., et al., 1986, Science 233:343-346; Guyader, M.,et al 1987, Nature 326:662-669). Además existe una heterogeneidad genética significativa dentro de las poblaciones de cada uno de estos tipos. VIH es miembro de la clase de los lentivirus en la familia de retrovirus (Teich, N., et al., 1984, RNA Tumor Viruses, Weiss, R., et., al., eds., CSH-Press, por paginas 949-956). Los retrovirus son pequeños virus envueltos que contienen un genoma de muestra .ADN de cadena única y se replican a través de un intermedio de ADN producida por una transcriptasa reversa codificada viralmente, una mezcla ADN polimerasa dependiente de ARN (Varmus, H., 1988 Science 240-: 1427-1439) . La partícula viral VIH comprende un núcleo viral, que consiste en parte de proteínas de cápside, junto con el genoma de mezcla ARN viral y estas enzimas requeridos para eventos replicativos tempranos. Cuando la proteína ya haya miristilado, forma una protección externa alrededor del núcleo viral, que, a su vez, se encuentra rodeado por una envoltura membrana de lípido derivada de una membrana de célula infectadas. La glicoproteína de la superficie de envoltura de nuestro VIH son sintetizadas como una proteína de precursor única de 160 kilodaltones que es disociado con una por una proteasa celular durante el crecimiento viral en glicoproteínas, gp41 y gpl20. gp41 es una glicoproteína de transmembrana y el gpl20 es una glicoproteína extracelular que permanece no covalentemente asociado con gp41 como posiblemente en forma trimérica o multimérica (Hammarskjold, M., et al., 1989, Biochem Biophys, Acta 989:269-280). VIH se enfoca hacia las células CD4+ debido al hecho que una proteína de membrana celular CD4 (CD4) actúa como un receptor celular para el virus de mezcla de VIH-1 (Dalgleish, A., et al., 1984, Nature 312:763-767; Klatzmann et al., 1984, Nature 312:767-768; Maddon et al., 1986, Cell 47:333-348). La entrada viral en las células depende del enlace de gpl20 sobre las moléculas de receptor CD4 celular (McDougal, J.S., et al./ 1986, Science 231-382-385; Maddon, P.J., et al., 1986, Cell 47:333-348), lo que explica el tropismo de mezcla VIH para células CD4+. Al interactuar la proteína de envoltura viral con el receptor celular, el complejo proteínico de envoltura CD4 se encuentra sometido a cambios de conformación lo que facilita una interacción subsecuente con co-receptores celulares de huésped para formar un complejo trimolecular . Cambios adicionales de conformación en el complejo trimolecular permiten la fusión de la membrana celular adyacente y la liberación por la envoltura viral de material genético en la célula. 2.3 ESTRATEGIAS DE TRATAMIENTO VIRAL 2.3.1 TERAPIA Aun cuando se están haciendo esfuerzos considerables para diseñar agentes terapéuticos efectivos, actualmente no existen fármacos anti-retrovirales curativos contra el SIDA.

Intentos para desarrollar tales fármacos se han enfocado hacia varias etapas del ciclo vital de muestra VIH (Mitsuya, H., et al., 1991, FASEB J. 5:2369-2381). Varios blancos virales para intervención con el ciclo vital de mezcla VI han sido sugeridos puesto que la opinión prevalente es que l interferencia con una proteína de célula huésped podría tener efectos colaterales severos. Por ejemplo, la transcriptas reversa codificada viralmente ha sido un enfoque d desarrollo farmacológico. Numerosos fármacos enfocados haci la transcriptasa reversa, incluyendo análogos de 2', 3'-didesoxinucleósidos AZT, ddl, ddC, y d4T han sid desarrollados los cuales han sido activos contra VI (Mitsuya, H., et al., 1991, Science 249:1533-1544). Los nuevos regímenes de tratamiento para mezcla de VI demuestran que una combinación de compuestos VIH, que s enfocan hacia la transcriptasa reversa (RT) , por ejempl azidotimidina (AZT), lamivudina (3TC) , didesoxiinosina (ddl), didesoxicitidina (ddC) empleados en combinación con u inhibidor de VIH-1 proteasa tienen un efecto mucho mayor ( la reducción 2 a 3 log) sobre la carga viral en comparació con AZT solo (aproximadamente de reducción 1 log) . Po ejemplo a resultados mejorados han sido obtenido recientemente con la combinación de AZT, ddl, 3TC y ritonavi (Perelson, A.S., et al., 1996, Science 15:1582-1586). Si embargo, es probable que el uso de largo plazo d combinaciones de estos agentes químicos provocará toxicidad, principalmente para la médula ósea. Una terapia citotóxica de largo plazo puede también provocar la supresión de células CD8"T que son esenciales para controlar la mezcla VIH, a través de actividad de células asesinas (Blazevic, V., et al., 1995, AIDS Res. Hum. Retroviruses 11:1335-1342) y mediante la liberación de factores supresivos, especialmente las quimiocinas desvariantes, MIP lá y MIP lß (Cocchi, F., et al., 1995 Science 270:1811-1815). Otra preocupación importante en la terapia anti-retroviral química de largo plazo es el desarrollo de mutaciones de VIH con resistencia parcial o completa (Lange, J.M., 1995, AIDS Res. Hum Retroviruses 10:S77-82). Se cree que tales mutaciones pueden ser una consecuencia inevitable de una terapia antiviral. El patrón de desaparición de virus de tipo silvestre y la aparición de virus mutantes debido al tratamiento en combinación con una disminución coincidental del número de células CD4+ T sugiere fuertemente que, por lo menos en algunos compuestos, la aparición de mutantes virales es un factor subyacente en el fracaso de la terapia contra el SIDA. Además, el fracaso de los fármacos puede también ser diluido a reservorios de VIH en poblaciones de células en crecimiento lento que son latentes y no producen activamente el virus y por consiguiente escapan a muchos de los tratamientos convencionales.

Se hicieron también intentos para desarrollar párrafos que pueden inhibir la penetración viral en las células. Para esos estudios, el enfoque ha sido por consiguiente hacia CD4, en el receptor de superficie similar para mezcla VIH. CD4 soluble recombinante, por ejemplo, muestra una inhibición de la infección de células CD4+ T por algunas cepas VIH-1 (Smith, D.H., et al., 1987, Science 238:1704-1707). Ciertos aislados primarios VIH-1 más sin embargo, son rápidamente menos sensibles a la inhibición CD4 recombinante (Daar, E., et al., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:6574-6579). Además, ensayos clínicos mezclas CD4 soluble recombinante han producidos resultados que no fueron conclusivos (Schooley, R., et al., 1990. Ann. Int. Med. Kahn, J.O., et al., 1990, .Ann. Int. Med. 112:254-261; Yarchoan, R., et al., 1989, Proc. Vth Int. Conf. On AISD, p. 565, MCP 137) . Las últimas etapas de replicación de mezcla de VIH que involucran un procesamiento específico para virus crucial de ciertas proteínas codificadas virales, han sido también sugeridas como enfoques farmacológicos anti-mezcla VIH posibles. Un procesamiento de etapa tardía depende de la actividad de una proteasa viral y se están desarrollando fármacos que inhiben esta proteasa (Erickson, J., 1990, Science 249-527-533) . Recientemente, quimiocinas producidas por células CD8+ T han sido implicadas en la supresión de infección de mezcla de VIH (Paul, W.E., 1994, Cell 82:177; Bolognesi, D.P., 1993, Semin. Immunol. 5:203). Las quimiocinas desvariantes, MlP-lá, y MIP-lß, secretadas por las células mezcla de CD8+ T, suprimen la producción de antígeno de p24 mezcla VIH-1 en células infectados por aislados VIH-1 o VIH-2 in vi tro (Cocchi, F, et al., 1995, Science 270-1811-1815). Así, estas quimiocinas así como otras quimiocinas pueden ser útiles para terapias para infección por mezcla VIH. En el resultado clínico, sin embargo, de todos estos fármacos y de otros fármacos candidatos sigue siendo materia de discusión. 2.3.2 VACUNAS Otra estrategia importante en el tratamiento antiviral y prevención antiviral es el desarrollo de vacunas debido a la naturaleza potencialmente pandémica de una infección viral, como por ejemplo mezcla VIH, existe una densidad significativa para vacunas efectivas. En general, métodos tradicionales para preparar vacunas incluyendo el uso de patógenos desactivados o atenuados. Una desactivación adecuada del microorganismo patogénico lo vuelve inocuo como agente biológico pero no destruye su inmunogenicidad alguno de la dirección de estas partículas "muertas" en un huésped provocará una respuesta inmune capaz de prevenir una infección una infección futura con un microorganismo vivo. Sin embargo, una preocupación principal con el uso de vacunas muertas (empleando patógeno desactivado) es el fracaso en cuanto a la desactivación de la totalidad de los microorganismos. Aun cuando esto se logre, esto que los patógenos son muertos no significa en el huésped o bien por otras razones desconocidas, la inmunidad lograda es frecuentemente incompleta, de corta duración y requiere de inmunizaciones múltiples. Finalmente, el proceso de desactivación puede alterar los antígenos del microorganismo, volviéndolos menos efectivos como inmunógenos. La alteración se refiere a la producción de cepas de microorganismos patogénicos que han prendido esencialmente en su capacidad de producir enfermedad. Una forma de lograr esto es sometiendo el microorganismo a condiciones no habituales de crecimiento y/o pasaje frecuente en cultivo celular se seleccionan mutantes que han perdido su virulencia pero que pueden provocar una respuesta inmune. Patógenos atenuados frecuentemente son buenos inmunógenos puesto que se replican de hecho en la célula huésped y provocan una inmunidad a largo plazo. Sin embargo, existen numerosos problemas con el uso de vacunas vivas, el problema principal siendo la atenuación suficiente y los riesgos de reversión a la virulencia. Una alternativa a los métodos anteriores es el uso de vacunas de subunidad. Esto involucra la inmunización solamente con los componentes que contienen en material inmunológico relevante.

En el caso de mezcla VIH, por ejemplo, las proteínas de envoltura (gpl60, gpl20, gp41) son los antígenos principales para anticuerpos anti-mezcla VIH presentes en pacientes SIDA (Barin et al., 1985, Science 228:1094-1096). A la fecha por consiguiente, estas proteínas han sido los candidatos más comunes para actuar como antígenos para el desarrollo de vacunas anti-mezcla VHI . Varios grupos han empezado a emplear varias porciones de gpl60, gpl20, y/o gp41 como blancos inmunogénicos para el sistema inmune del huésped. Verse, por ejemplo, Ivanoff, L., et al., Patente Norteamericana No. 5,141,867; Saith, G., et al., W092/22,654; Shafferman, A., WO91/09,872; Formoso, C, et al., WO90/07,119. Puesto que la proteína de envoltura de VIH media los pasos tempranos de enlace y entrada en la infección, muchas estrategias de vacuna se han enfocado hacia el bloqueo de la función de la glicoproteínas de envoltura viral. En 1993, dos formas recombinantes de la subunidad gpl2Q de superficie de la proteína de envoltura de VIH (rgpl20) fueron presentadas como vacunas candidatos para un estudio de eficacia a gran escala patrocinado por National Institutes of Health (Institutos Nacionales de Salud) (NIH) . En estudios clínicos previos, estas vacunas rgp 120 demostraron ser seguras y provocaron la aparición de anticuerpos capaces de neutralizar de manera potente aislados adaptados en laboratorio relacionados de VIH (Belshe, R.B., et al., 1994, Journal of the .American Medical Association 272:475; Kahn, J.O., et al. ,1994, Journal of Infectious Diseases 170:1288). El progreso fue detenido, sin embargo, por hallazgos que virus de Aislados Primarios ("Pl") eran refractarios en gran medida a la neutralización por sueros de vacuna de rgpl20 (Cohén, J., 1993, Science 262:980; Cohén, J., 1994, Science 264:1839). 2.4. NECESIDAD DE NEUTRALIZACIÓN DE AISLADOS PRIMARIOS La epidemia en expansión de infección por VIH amenaza con infectar más de 40 millones de personas en el mundo entero para el año 2000 (U AIDS Report (www.unaids .org/unaids/report) ) . La necesidad de una vacuna efectiva contra VIH es urgente, pero el avance hacia este meta ha sido bloqueado por la incapacidad de las vacunas candidatos para provocar el surgimiento de anticuerpos capaces de neutralizar la capacidad de infección de varios aislados primarios (PIs) de individuos infectados por VIH (Wrin, T., et al., 1995, Journal of Virology 69:39; Moore, J.P., et al., 1995, AIDS 9 (suppl A), S117; Mascóla, J.R. et al., 1996 Journal of Infectious Diseases 173:340). Desafortunadamente a la fecha, los investigadores no han tenido el éxito para producir vacunas que generen anticuerpos capaces de bloquear una amplia variedad de aislados primarios de VIH. Los aislados primarios se toman directamente de perdonas infectadas y se sometan a un crecimiento solamente limitado en el laboratorio en linfocitos primarios de sangre periférica (PBls) . Así, aislados primarios de VIH son clínicamente más relevantes que cepas adaptadas en laboratorio. Las cepas adaptadas en laboratorio son las cepas que se cultivan de manera persistente en líneas de células TR establecidas, en el laboratorio (ver Wrin et al., 1995 J. of virology 69:39). Vacunas previas candidatos han provocado la neutralización de anticuerpos para cepas adaptadas en laboratorio. Por ejemplo, Wrin et al., 1995, Journal of Virology 69:39, probaron proteínas de envoltura de VIH producidas por tecnología de ADN recombinante derivada de aislados adaptados en laboratorio. Los anticuerpos generados por la inmunización con estas proteínas recombinantes neutralizaron solamente aislados adaptados en laboratorio del virus. Los vectores virales recombinantes y el .ADN empleados para producir proteína de envoltura oligomérica nativa in situ tampoco pudieron provocar la neutralización de anticuerpos para aislados primarios. Además, inmunógenos producidos por tecnología recombinante que comprenden gpl20 y el receptor de CD4 soluble provocaron anticuerpos contra gpl20 (Gershoni, 1993 FASEB Journal 7:1185), pero estos anticuerpos no pudieron neutralizar los aislados primarios. Anticuerpos neutralizantes son importantes para evitar el enlace y la fusión del virus sobre la célula huésped. Se ha analizado la acción de anticuerpos que neutralizan aislados adaptados en laboratorio. Los anticuerpos neutralizantes dirigidos específicamente sobre el dominio de enlace de CD4 en gpl20 interfieren con el enlace de CD4. La mayoría de los anticuerpos neutralizantes, sin embargo, interfieren con pasos subsecuentes al enlace de CD40. Por ejemplo, algunos anticuerpos neutralizantes inhiben la interacción con el co-receptor (Trkola et al., 1998, Journal of Virology 72:1876; Wu, et al., 1996 Nature 384:179-83). La identificación de inmunógenos que provocan la neutralización de anticuerpos en un huésped es necesaria al desarrollo de vacunas eficaces. Anticuerpos neutralizantes deben actuar no solamente contra aislados adaptados en laboratorio sino también contra los aislados "primarios clínicamente relevantes. Como se entiende a partir de lo anterior, sigue existiendo la necesidad de nuevas moléculas de inmunógeno que generan anticuerpos que neutralizan efectivamente una amplia variedad de aislados primarios. 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente que vacunas altamente efectivas pueden ser construidas las cuales presentan determinantes relacionados con fusión de transición para el sistema inmune que engendran anticuerpos únicos capaces de neutralizar de manera potente un amplio rango de aislados primarios de virus con envoltura, desde ubicaciones en todo el mundo y a partir de clases virales filogenéticas diferentes. La vacuna de la presente invención comprende como inmunógenos. Estructuras Moleculares Relacionadas con Fusión (FRMS) que comprende uno o varios determinantes relacionados con fusión. La invención se basa además en el descubrimiento que la neutralización amplia y uniforme de diversos aislados primarios indican que los determinantes críticos presentados por FRMS se conservan en gran medida y pueden ser unidos íntimamente con el funcionamiento básico de la proteína de envoltura en enlace y fusión. La presente invención ofrece el uso de tales FRMS en varias composiciones y métodos incluyendo, por ejemplo, como inmunógenos de vacuna, aditivos de producto sanguíneo, agentes antivirales, agentes de diagnóstico y agentes terapéuticos. La presente invención se refiere a FMRS capaces de provocar la neutralización de anticuerpos para patógenos virales envueltos. Epítopos que provocan estos anticuerpos neutralizantes resultan de cambios de conformación durante el proceso de enlace y fusión de la envoltura viral y membranas de célula huésped. En una modalidad, los complejos resultan de la interacción de proteína virales con por lo menos un receptor o co-receptor celular huésped y se crean mediante el co-cultivo de células transformadas con un ácido nucleico que expresa una proteína viral y células que expresan receptor (es) celular (es) de huésped. De preferencia, las células expresan de manera recombinante el (los) receptor (es) de célula huésped. En una modalidad adicional, se fijan cultivos al principio de la interacción célula-célula para conservar inmunógenos competentes para fusión. En una modalidad preferida, los inmunógenos relacionados con fusión se forman como resultado de la interacción de la proteína de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana principal de tipo 1 (VIH-1), el receptor celular huésped CD4 y el co-receptor celular huésped CCR5. La vacunación con las FRMS de la presente invención como inmunógenos provoca una respuesta inmune con relación al patógeno viral y provoca la producción de anticuerpos neutralizantes en el huésped vacunado. Además del uso de las FRMS como vacuna, anticuerpos preparados para FRMS pueden emplearse para estudiar la vía molecular hacia la fusión del virus y de la célula huésped y para identificar puntos de un posible bloqueo mediado por anticuerpos con relación a esta vía. Además, "marcadores" de alta afinidad específicos pueden ser expresados como parte de la proteína de envoltura y receptor (es) celular (es) de huésped que facilitan el aislamiento y al purificación délas FRMS de la invención. La presente invención se refiere además al desarrollo de anticuerpos monoclonales (mAb) provocados por estos inmunógenos de FRMS. Se proporcionan anticuerpos monoclonales que son capaces de neutralizar aislados primarios. mAbs neutralizantes para epítopos dependientes de fusión funcionalmente conservados pueden también ser útiles para inmunización pasiva en tratamientos posteriores a la exposición o bien para la inmunización de feto. La presente invención ofrece una estructura molecular aislada que comprende un epítopo formado como resultado de la asociación de (a) una proteína de envoltura de un virus envuelto, con (b) una o varias membranas celulares, dicha proteína de envoltura y proteínas de membrana celular son necesarias y suficientes en condiciones adecuadas para la fusión de dicha envoltura del virus con una membrana de célula que contiene dichas proteínas de membrana celular. La presente invención ofrece una estructura molecular aislada comprende un epítopo formado como resultado de la asociación de (a) una proteína de envoltura de VIH, o un mutante de la misma que se ensambla en la envoltura viral; con (b) CD4 humano y co-receptor para fusión de VIH. En una modalidad, el co-receptor es el receptor de quimiocina CCR5 o CXCR4. En otra modalidad, la estructura molecular se forma mediante la asociación de un mutante de gp41 de VIH que presenta un defecto de fusión. En otra modalidad, el mutante contiene una o varias mutaciones seleccionadas dentro del grupo que consiste de V2E, G10V, V570R, y Y586E. En otra modalidad, la estructura molecular se forma mediante la asociación de proteína de envoltura de VIH cíe tipo silvestre. La presente invención ofrece una estructura molecular aislada que comprende un epítopo formado como resultado de la asociación de (a) una proteína de envoltura mutante de un virus envuelto, dicha proteína de envoltura en forma de tipo silvestre funciona en fusión de la envoltura viral con una membrana de célula huésped, 'y dicha proteína de envoltura mutante presenta defecto de fusión; y (b) una o varias proteínas de membrana celular de huésped que funcionan como receptores para dicha proteína de envoltura. En una modalidad, dicho virus proviene de una familia de viral que se selecciona dentro del grupo que consiste de Retroviridae, Rhabdoviridae, Caronaviridae, Filoviridae, Poxviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, y Herpesviridae. En otra modalidad, la proteína de envoltura es El y E2 de HCV y la proteína de membrana celular es CD81. En otra modalidad, la estructura molecular, es una estructura molecular celular reticulada. En otra modalidad, la estructura molecular es aislada a partir de un lisado celular. En una modalidad, la estructura molecular celular comprende células que expresan de manera recombinante la proteína de envoltura. En otra modalidad, el lisado de célula proviene de varias células que comprenden células que expresan de manera recombinante la proteína de envoltura. En otra modalidad, la estructura molecular celular comprende además células que expresan de menare recombinante la proteína de membrana celular de huésped o varias proteínas de membrana celular de huésped. La presente invención ofrece un virus envuelto recombinante, en donde dicho virus expresa de manera recombinante en su envoltura un receptor de célula para una proteína de envoltura nativa de dicho virus. En una modalidad, dicho receptor de célula es CD4 humano o un co-receptor para VIH, o bien dicho virus expresa de manera recombinante tanto CD4 humano como dicho co-receptor. En otra modalidad, dichas condiciones adecuadas comprenden una disminución del pH. En otra modalidad, la estructura molecular celular reticulada comprende además una partícula viral reticulada de dicho virus, que contiene dicha proteína de envoltura. La presente invención ofrece una formulación de vacuna que comprende una cantidad inmunogénica de la estructura molecular y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La presente invención ofrece un anticuerpo monoclonal para la estructura molecular. En una modalidad, el anticuerpo es marcado. La presente invención ofrece un antisuero policlonal purificado específico para la estructura molecular. La presente invención ofrece un gel, espuma, crema o un ungüento contraceptivo que comprende una cantidad de anticuerpo efectiva para inhibir o disminuir la infección por el virus. La presente invención ofrece un gel, una espuma, una crema, o un ungüento contraceptivo que comprende una cantidad del anticuerpo efectiva para inhibir o disminuir infección por VIH. La presente invención ofrece un gel, una espuma, una crema, o un ungüento contraceptivo que comprende una cantidad del antisuero efectiva para inhibir o disminuir infección por VIH. La presente invención ofrece una muestra de sangre de mamífero, a la cual se ha agregado una cantidad de anticuerpo efectiva para inhibir o disminuir una infección por el virus. La presente invención ofrece una muestra de sangre de humana, a la cual se ha agregado una cantidad efectiva de anticuerpo para inhibir o disminuir una infección por VIH. En una modalidad, dicha proteína de envoltura o proteínas de membrana celular de huésped comprende además un marcador de afinidad. En otra modalidad, dicha proteína de envoltura, CD4, o bien co-receptor comprende además un marcador de afinidad. En otra modalidad, el anticuerpo es marcado. La presente invención ofrece un conjunto de elementos que comprende en uno o varios recipientes un anticuerpo monoclonal marcado para la estructura molecular. La presente invención ofrece un conjunto de elementos que comprende en uno o varios recipientes un anticuerpo monoclonal marcado para lá estructura molecular. En una modalidad, el conjunto de elementos comprende la estructura molecular en un recipiente separado. La presente invención ofrece una línea de células que expresa de manera recombinante una proteína de envoltura de un virus envuelto que funciona en fusión de la envoltura viral con una membrana de célula huésped, o bien una forma mutante 'de dicha proteína de envoltura que es defectuosa para la fusión, dicha línea de célula expresa una o varias proteínas de membrana celular que funcionan como receptores para proteína de envoltura. En una modalidad, dicha proteína o varias dichas proteínas que funcionan como receptores se expresan de manera recombinante . La presente invención ofrece una línea de células que expresa de manera recombinante gpl 60 de VIH, dicha línea de células expresa CD4 y un co-receptor para VIH; dicha línea de células no tiene una proteasa funcional que disocia gpl60 para producir gpl20 y gp41. La presente invención ofrece un método para el tratamiento o la prevención de una infección por un virus en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad inmunogénica de la estructura molecular efectiva para tratar o prevenir la infección por el virus. En una modalidad, el sujeto es un ser humano. En otra modalidad, el sujeto es un animal doméstico.

La presente invención ofrece un método para el tratamiento o la prevención de infección por VIH en un ser humano, que comprende la administración al ser humano de una cantidad inmunogénica de la estructura molecular efectiva para tratar o prevenir infección por VIH. La presente invención ofrece un método para el tratamiento o la prevención de una infección por un virus en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad del anticuerpo monoclonal efectiva para tratar o prevenir infección por el virus. La presente invención ofrece un método para el tratamiento o la prevención de infección por VIH en un ser humano, que comprende la administración al ser humano de una cantidad del anticuerpo monoclonal efectiva para tratar o prevenir infección por VIH. En una modalidad, dicho ser humano tiene un alto riesgo de infección por VIH. En una modalidad, el método es para el tratamiento de SIDA en dicho ser humano. La presente invención ofrece un método para el tratamiento o la prevención de infección por VIH en un feto humano que comprende la administración a una mujer embarazada que tiene dicho feto de una cantidad del anticuerpo monoclonal efectiva para tratar o prevenir infección por VIH en dicho feto. La presente invención ofrece un método para inhibir infección por un virus en una muestra de sangre, que comprende la puesta en contacto de dicha muestra de sangre con una cantidad del anticuerpo monoclonal efectiva para inhibir la infección por dicho virus. La presente invención ofrece un método para inhibir infección por VIH en una muestra de sangre humana, que comprende la puesta en contacto de dicha muestra de sangre humana con una cantidad del anticuerpo monoclonal efectiva para inhibir la infección por VIH. La presente invención ofrece un método para descontaminar herramienta quirúrgica o dental, que comprende la puesta en contacto de dicha herramienta con una cantidad del anticuerpo monoclonal efectiva para inhibir la infección por dicho virus. La presente invención ofrece un método para descontaminar herramienta quirúrgica o dental, que comprende la puesta en contacto de dicha herramienta con una cantidad del anticuerpo monoclonal efectiva para inhibir la infección por VIH. La presente invención ofrece un método para monitorear la producción de anticuerpo hacia la estructura molecular en un paciente que recibió previamente una cantidad de la estructura molecular que comprende el asilamiento de dicho sujeto de una muestra que comprende suero; y la detección de la presencia de anticuerpos para la estructura molecular en dicho suero. En una modalidad, dicha detección se efectúa por un método que comprende la realización de un inmunoensayo competitivo con anticuerpo marcado para la estructura molecular. La presente invención ofrece un método para la producción de un inmunógeno para su uso en una vacuna para el tratamiento o la prevención de infección por un virus, que comprende los siguientes pasos, en el orden indicado: (a) poner en contacto una proteína de envoltura o bien una forma quimérica de la misma de un virus envuelto, dicha proteína de envoltura funciona en fusión de la envoltura viral con una membrana de célula, o una forma mutante o una forma quimérica de la misma de dicha proteína de envoltura que es defectuosa para la fusión con una o varias proteínas de célula o formas quiméricas de las mismas que funcionan como receptores para dicha proteína de envoltura; (b) exponer dicha proteína de envoltura o bien forma quimérica de la misma o bien forma mutante o bien forma quimérica de la misma, y dicha proteína de célula huésped o dichas proteínas de célula huésped o formas quiméricas de las mismas, a un agente de reticulación; y (c) aislar una estructura reticulada que comprende dicha proteína de envoltura o forma quimérica de la misma o forma mutante o forma quimérica de la misma. La presente invención ofrece un método para la producción de un inmunógeno para su uso en una vacuna para el tratamiento o la prevención de infección por VIH, que comprende los siguientes pasos, en el orden indicado: (a) co-cultivar una primera célula que expresa recombinantemente una proteína de envoltura de VIH o bien una forma quimérica de la misma, o bien una forma mutante o una forma quimérica de la misma de dicha proteína de envoltura que es defectuosa para la fusión con una segunda célula que expresa (i) CD4 humano o una forma quimérica, y (ii) un co-receptor para VIH o una forma quimérica del mismo; (b) exponer dicha proteína de envoltura o bien forma quimérica de la misma o bien forma mutante o bien forma quimérica de la misma, y dicho CD4 o forma quimérica y co-receptor o forma quimérica, a un agente de reticulación; y (c) aislar una estructura reticulada que comprende dicha proteína de envoltura o forma quimérica de la misma o forma mutante o forma quimérica de la misma. En una modalidad, dicho virus es VIH y dichas proteínas de célula huésped son CD4 humano y un co-receptor para VIH. En una modalidad, dicha segunda célula expresa recombinantemente CD4 o dicho co-receptor o bien tanto CD4 como dicho co-receptor o formas quiméricas de cualesquiera de los anteriores. En otra modalidad, dicha primera célula y dicha segunda célula son el mismo tipo de célula. En otra modalidad, dicha proteína de envoltura o forma quimérica de la misma o forma mutante o forma quimérica de la misma se encuentra presente en una partícula viral o bien partícula de tipo virus. En otra modalidad, dicha estructura reticulada es un complejo celular reticulado. En otra modalidad, el virus se selecciona dentro del grupo que consiste de Retroviridaé, Rhabdoviridae, Caronaviridae, Filoviridae, Poxviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, y Herpesviridae . En otra modalidad, dicho paso de puesta en contacto ocurre mediante la infección de células que expresan dichas proteínas de célula huésped con dicho virus que expresa dicha proteína de envoltura o forma quimérica de la misma o forma mutante o forma quimérica de la misma. En otra modalidad, una forma quimérica de dicha proteína de envoltura o bien una dichas proteínas de célula de huésped es puesta en contacto, dicha forma quimérica comprende un marcador de afinidad. En otra modalidad, una forma quimérica de dicha proteína de envoltura o CD4 o bien dicho c-receptor es puesta en contacto, dicha forma quimérica comprende un marcador de afinidad. La presente invención ofrece un método para producir un inmunógeno para su uso en una vacuna para el tratamiento o la prevención de infección por VIH, que comprende los siguientes pasos, en el orden indicado: (a) co-cultivar una primera célula que expresa recombinantemente una proteína de envoltura de VIH o bien una forma quimérica de la misma, o bien una forma mutante o una forma quimérica de la misma de dicha proteína de envoltura que es defectuosa para la fusión con una segunda célula que expresa (i) CD4 humano o una forma quimérica, y (ii) un co-receptor para VIH o una forma quimérica, en donde se expresa por lo menos una de dichas formar quiméricas que comprenden un marcador de afinidad; (b) lisar dichas células co-cultivadas para formar un lisado de célula en condiciones no desnaturalizantes; y (c) aislar de dicho lisado de célula una estructura molecular que comprende dicha proteína de envoltura o forma quimérica de la misma o forma mutante o forma quimérica de la misma a través de un método que comprende la puesta en contacto de dicho lisado celular con un socio de enlace sobre dicho marcador de afinidad y recuperar una estructura molecular unida sobre dicho marcador de afinidad. La presente invención ofrece una estructura reticulada que es el producto del método. La presente invención ofrece un anticuerpo monoclonal para la estructura que neutraliza in vitro los siguientes aislados primarios de VIH: 92US657, 92US660S 92RW023, 931N101, 92UG035, y 92TH023. La presente invención ofrece un gel, una espuma, una crema, o un ungüento contraceptivo que comprende una cantidad del anticuerpo para inhibir o disminuir infección por VIH. La presente invención ofrece un método para el tratamiento o la prevención de una infección por un virus en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad inmunogénica de la estructura efectiva para tratar o prevenir infección por el virus. La presente invención ofrece un método para el tratamiento o la prevención de infección por VIH en un ser humano, que comprende la administración al ser humano de una cantidad inmunogénica de la estructura molecular efectiva para tratar o prevenir infección por VIH. La presente invención ofrece un método para v descontaminar herramientas quirúrgicas o dentales, que comprende la puesta en contacto de dichas herramientas con una cantidad del anticuerpo monoclonal efectiva para inhibir la infección por dicho VIH. La presente invención ofrece un método para descontaminar herramientas quirúrgicas o dentales, que comprende la puesta en contacto de dichas herramientas con una cantidad del anticuerpo monoclonal efectiva para inhibir la infección por dicho virus. La presente invención ofrece un método para tamizar una estructura molecular para eficacia de vacuna, que comprende la inmunización de un mamífero no humano transgénico con la estructura molecular, en donde dicho mamífero no humano transgénico expresa a partir de uno o varios transgenes tanto CD4 humano como un co-receptor para VIH, y detectar anticuerpos neutralizantes para VIH producidos por dicho mamífero. La presente invención ofrece un método para tamizar una estructura molecular para eficacia de vacuna, que comprende la inmunización de un mamífero no humano transgénico con la estructura molecular, en donde dicho mamífero no humano transgénico expresa a partir de uno o varios transgenes dicha proteína de membrana celular de huésped o dichas proteínas de membrana celular de huésped; y detectar anticuerpos neutralizantes para dicho virus, producidos por dicho mamífero. En una modalidad, el mamífero es un ratón. En otra modalidad, dicha primera célula expresa recombinantemente una proteína de envoltura de VIH o una forma quimérica de la misma. 4. BREVE DECRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Neutralización del virus 168P Pl homologo por sueros de vacuna FC y Fl . Ratones transgénicos (hu CD4 +, hu CCR5 +, CD4+ de ratón) fueron inmunizados con inmunógeno de FC (COS-env con U87-CD4-CCR5; cuadrados; n = 3 ratones) o bien con controles celulares (células U87-CD4-CCR5 solas o bien co-cultivadas con células COS transfectadas de manera ficticia; círculos n = 3 ratones) . Ratones no inmunizados fueron también empleados (triángulos; n = 2 ratones) . Se probaron sueros para neutralización de 168P empleando células U87-CD4 que expresan ya sea CXCR4 (símbolos negros) o bien CCR5 (símbolos blancos) . Los datos presentan promedios de tres a seis ensayos de neutralización empleando fueron obtenidos 2 semanas después de la segunda y tercera inmunización. Figura 2A-2B. Neutralización de 168P por sueros de vacuna FC pero no Fl . (A) ratones transgénicos fueron inmunizados con inmunógeno de FC (cuadrados negros; n = 4) inmunógenos de Fl (COS-env con células U87; círculos grises n = 4; COS-env con células U87-CD4, rombos grises, n = 3; COS-env con sCD4, rombos blancos, n = 2; COS-env con células U87-CD4-CCR5, cada una fijada separadamente antes de la mezcla para inmunización, cuadrados grises, n = 2) o bien inmunógeno de célula COS transfectadas de manera ficticia (co-cultivadas con células U87-CD4-CCR5, círculos blancos n = 2) . Se emplearon también ratones no inmunizados (triángulos blancos, n = 2) . La neutralización fue independiente del uso de co-receptores específicos y los datos aquí representan promedios de tres a seis ensayos de neutralización en células U87-CD4-CXCR4 o bien CCR5. En algunos casos, sueros de todos los animales dentro de cada grupo experimental fueron combinados. (B) Neutralización de P168 por sueros de vacuna FC pero no Fl . Neutralización del virus P168 Pl homologo en cultivo de PBL (linfocito) humano. Se aislaron PLBs, estimulados con fitohemaglutinina, y cultivados en presencia de interleucina- 2; se determinó la neutralización. Se determinó un antígeno p24 de VIH después de 5 días de cultivo mediante ELISA (Coulter Corporation) y los valores fueron normalizados al control de virus (36 ng/ml) . Los asteriscos indican niveles de antígeno p24 por debajo del límite de detección en la dilución empleada en el ELISA. Figuras 3A-B. El suero de vacuna FC no neutraliza viriones de VIH seudotipados que llevan una proteína de envoltura (A) de MLV anfotrópica o bien SIVmac251 primario (B) . en el caso de VIH que lleva una proteína de envoltura de MLV anfotrópica (seudotipo de anfo MLV) , la sensibilidad a la neutralización con antisueros FC y Fl combinados se determinó en células U87-CD4-CXCR4. En el caso de aislado primario, la neutralización de SIVmac251 fue determina en células U87-CD4-CCR5. Los símbolos son: inmunógeno de FC (cuadrados negros) e inmunógeno de Fl (células Cos-env + U87, círculos grises) . Figura 4A-B. Neutralización de virus TCLA 168C por sueros de vacuna de Fl . La sensibilización a la neutralización del virus 168P Pl (A) y su derivado TCLA 168C (B) fue probada en células U87-CD4-CXCR4 con sueros combinados: inmunógeno de FC (cuadrados negros), inmunógenos de Fl (células COS-env + U87, círculos grises; células COS-env + U87-CD4, rombos grises, COS-env + sCD4, rombos blancos) , y controles de células transfectados de manera ficticia (círculos blancos) . Figura 5. Neutralización de diversos virus de Pl a partir de clases A-E. Aislados primarios fueron expandidos en PBLs de ser humano, y la neutralización fue determinada en células U87-CD4-CCR5 (o bien CXCR4) con sueros combinados: inmunógenos de FC (cuadrados negros) , inmunógenos de Fl (células COS-ENV + U87, círculos grises; COS-env + U87-CD4, rombos grises; COS-env + sCD4, rombos blancos, y controles de células transfectadas de manera ficticia (círculos blancos) . El biotipo viral es indicado en la esquina derecha inferior como SI o ?SI, en caso aplicable. El isotipo viral es indicado en la esquina inferior de cada gráfica. Figura 6. Adsorción de actividad de neutralización de virus Pl por células COS-env fijadas con formaldehído. El suero de vacuna de FC fue repetidamente incubado con células COS-env fijadas con formaldehído (cuadrados grises) o bien células COS de control (cuadrados blancos) . El suero obtenido antes de la inmunización con FC fue adsorbido de manera similar (círculos grises y blancos, respectivamente) . Los sueros de FC iniciales y de pre-inmunización se indican como cuadrados negros o círculos negros, respectivamente. Se probó Sear para neutralización de 168P empleando células U87-CD4-CXCR4. Figura 7. La actividad de neutralización de virus Pl no es adsorbida por células U87-CD4-CCR5 intactas. Un suero de vacuna de FC combinado fue incubado con células U87-CD4-CCR5 (cuadrados blancos) o bien en un pozo de microcultivo vacío (ficticio, cuadrados negros) . El suero de Fl combinado (COS-env + U87-CD4) fue tratado de la misma manera (círculos bancos y negros, respectivamente) . Los sueros fueron probados para determinar la neutralización restante de 168P con células U87-CD4-CCR5.

Figura 8. Neutralización de la actividad de dos aislados primarios de clases B de VIH con sobrenadantes de hibridoma. Figura 9. Títulos de suero de ratones inmunizados con inmunógenos de vacuna competentes para fusión. Con el 5 cuadrado que representa un inmunógeno competente para fusión (FRMS) (env + con CD4-CCR5) ; los círculos negros representan inmunógeno de células que expresan inmunógeno de proteína de envoltura y células que expresan ni CD4 ni CCR5 (env) ; los círculos blancos representan inmunógeno de células que expresan proteína de envoltura y células que expresan CD4 de inmunógeno (env + CD4) los triángulos blancos' representan controles de célula que expresan inmunógeno CD4 y CCR5 (CD4- "N , CCR5) Figura 10. Neutralización cruzada del aislado de virus primario 320SI por anticuerpos obtenidos a partir de ratones inmunizados con un complejo de inmunógeno competente para fusión de la presente invención. Los círculos negros representan inmunógeno competente para fusión (FRMS) (env con CD4/CCR5) ; los cuadrados blancos representan inmunógeno de células que expresan una proteína de envoltura (env) ; los círculos blancos representan inmunógenos de células que expresan proteína de envoltura y CD4 (env + CD4) . Figura 11. Proteína de envoltura co-purificada con CD4-Spep y CCR5-Spep detectada por análisis Western blot. a) proteína de envoltura 168P aislada después de co-cultivo con células que expresan CD4-Spep; b) proteína de envoltura 168P aislada después de co-cultivo con células que expresan CD4 y CCR5-Spep; c) proteína de envoltura 168P no fue detectable después de co-cultivo con células transfectadas de manera ficticia. Figura 12. Co-cultivo de células BSC40 infectadas con rV-168Penv y rV-CD4/CCR5 24 horas después de la infección. 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a estructuras moleculares relacionada con fusión (FRMS) capaces de provocar anticuerpos neutralizantes para patógenos virales envueltos. Las FRMS de la presente invención comprenden epítopos formados como resultado de la asociación de una o varias moléculas celulares con una o varias moléculas de envoltura viral. El proceso de fusión de envoltura viral con una membrana celular se inicia después del enlace de una proteína de envoltura viral sobre receptores y/o co-receptores celulares específicos en la célula de huésped e involucra la fusión de la envoltura viral con membranas celulares de superficie o interna. La fusión es impulsada por cambios de conformación que ocurren dentro del complejo envoltura-receptor-correceptor. No pretendemos limitarnos a un mecanismo particular, se cree que los cambios de conformación que ocurren durante la fusión revelan epítopos inmunógenicos novedosos y únicos para anticuerpos neutralizantes. Las estructuras moleculares relacionadas con fusión de la presente invención imitan los intermedios conformacionales formados durante la fusión. Las FRMS de la presente invención pueden emplearse para varios propósitos incluyendo, sin limitarse a ellos, los propósitos presentados en las Secciones 5.5 y 5.7 del presente documento. Por ejemplo, en una modalidad preferida de la invención, las FRMS cuando se emplean par vacunar animales huéspedes provocan anticuerpos neutralizantes para el virus infectante y, por consiguiente, proporcionan componentes efectivos novedosos de formulaciones de vacunas de la presente invención para el tratamiento o la prevención de infección viral y sus consecuencias no deseadas. Por consiguiente, la presente invención ofrece una estructura molecular aislada que comprende un epítopo formada como resultado de la asociación de (a) una proteína de envoltura de un virus envuelto, con (b) una o varias proteínas de membrana celular, dicha proteína de envoltura y proteínas de membrana celular son necesarias y suficientes en condiciones adecuadas para la fusión de dicha envoltura del virus con una membrana celular que contiene dichas proteínas de membrana celular. Como se emplea aquí, una proteína o membrana celular incluye proteínas de la membrana de superficie celular y membranas internas (incluyendo, sin limitarse a ella, la membrana de retículo endoplásmico) . Dicha proteína de membrana celular puede ser una proteína de membrana integral (por ejemplo, una proteína de transmembrana) o bien puede fijarse sobre la membrana a través de un lípido unido (por ejemplo, cadena de ácido graso o en grupo prenilo) , o bien a través de un oligosacárido (por ejemplo, sobre un fosfolípido, fosfatidilinositol) , o bien la proteína de membrana celular puede también estar asociada con la membrana por interacciones no covalentes (por ejemplo, con asociación con una proteína de membrana integral) . La presente invención ofrece también una estructura molecular aislada que comprende un epítopo formado como resultado de la asociación de (a) una proteína de envoltura mutante de un virus envuelto, dicha proteína de envoltura en forma de tipo silvestre funciona en la fusión de la envoltura viral con una membrana de célula huésped, y dicha proteína de envoltura mutante es defectuosa para la fusión; y (b) una o varias proteínas de membrana celular huésped que funcionan como receptores para dicha proteína de envoltura. En una modalidad específica, la presente invención ofrece una estructura molecular aislada que comprende un epítopo formado como resultado de la asociación de (a) una proteína de envoltura de VIH o un mutante de la misma que se ensambla en la envoltura viral; con (b) CD4 humano y un co-receptor para fusión de VIH. En una modalidad, el co-receptor es el receptor de quimiocina CCR5 o CXCR4. En otra modalidad específica, la estructura molecular ' se forma mediante la asociación de un mutante de gp41 de VIH que es defectuoso para la fusión. En otra modalidad, el mutante contiene una o varias mutaciones seleccionadas dentro del grupo que consiste de V2E, G10V, V570R, y Y586E. En otra modalidad, la estructura molecular se forma mediante la asociación de proteína de envoltura de VIH de tipo silvestre. En otra modalidad específica, la proteína de envoltura es El y E2 de Flavivirus HCV y la proteína de membrana celular es CD81. La presente invención ofrece también un método para la producción de un inmunógeno para su uso en una vacuna para el tratamiento o la prevención de infección por un virus, que comprende los siguientes pasos, en el orden indicado: (a) poner en contacto una proteína de envoltura o bien una forma quimérica de la misma de un virus envuelto, dicha proteína de envoltura funciona en fusión de la envoltura viral con una membrana de célula, o una forma mutante o una forma quimérica de la misma de dicha proteína de envoltura que es defectuosa para la fusión con una o varias proteínas de célula o formas quiméricas de las mismas que funcionan como receptores para dicha proteína de envoltura; (b) exponer dicha proteína de envoltura o bien forma quimérica de la misma o bien forma mutante o bien forma quimérica de la misma, y dicha proteína de célula huésped o dichas proteínas de célula huésped o formas quiméricas de las mismas, a un agente de reticulación; y (c) aislar una estructura reticulada que comprende dicha proteína de envoltura o forma quimérica de la misma o forma mutante o forma quimérica de la misma. En una modalidad, dicho virus es VIH y dichas proteínas de célula huésped son CD4 y un co-receptor para VIH. En una modalidad específica, la presente invención ofrece también un método para la producción de un inmunógeno para su uso en una vacuna para el tratamiento o la prevención de infección por VIH, que comprende los siguientes pasos, en el orden indicado: (a) el co-cultivo de una primera célula que expresa recombinantemente una proteína (s) de envoltura de VIH o bien una forma quimérica de la(s) misma(s), o bien una forma mutante o una forma quimérica de la misma de dicha proteína de envoltura que es defectuosa para la fusión, con una segunda célula que expresa (i) CD4 humano o una forma quimérica del mismo, y (ii) un co-receptor para VIH o una forma quimérica del mismo; (b) exponer dicha proteína de envoltura o bien forma quimérica de la misma o bien forma mutante o bien forma quimérica de la misma, y dicho CD4 o forma quimérica y co-receptor o forma quimérica del mismo, a un agente de reticulación; y (c) aislar una estructura reticulada que comprende dicha proteína de envoltura o forma quimérica de la misma o forma mutante o forma quimérica de la misma. En una modalidad específica, dicha segunda célula expresa recombinantemente CD4 o dicho co-receptor o bien tanto CD4 como dicho co-receptor o formas quiméricas de cualesquiera de los anteriores. En otra modalidad específica, la presente invención ofrece un método para la producción de un inmunógeno para su uso en una vacuna para el tratamiento o la prevención de infección por VIH, que comprende los siguientes pasos, en el orden indicado: (a) el co-cultivo de una primera célula que expresa recombinantemente una proteína de envoltura de VIH o bien una forma quimérica de la misma, o bien una forma mutante o una forma quimérica de la misma de dicha proteína de envoltura que es defectuosa para la fusión, con una segunda célula que expresa (i) CD4 humano o una forma quimérica del mismo, y (ii) un co-receptor para VIH o una forma quimérica del mismo en donde se expresa por lo menos una de dichas formas quiméricas que comprenden un marcador de afinidad; (b) lisar dichas células co-cultivadas para formar un lisado de célula en condiciones no desnaturalizantes; y (c) aislar de dicho lisado de células una estructura molecular que comprende dicha proteína de envoltura o forma quimérica de la misma o forma mutante o forma quimérica de la misma a través de un método que comprende la puesta en contacto de dicho lisado celular con un socio de enlace para dicho marcador de afinidad y recuperar una estructura molecular unida sobre dicho marcador de afinidad. 5.1 F0RI4ACIÓN DE LAS FRMSs La presente invención se refiere a FRMS que comprenden un epítopo formado como resultado de la asociación de una o varias moléculas de envoltura viral y una o varias moléculas de célula de huésped. Las FRMS de la presente invención abarcan estructuras que resultan de la asociación de por lo menos una proteína de envoltura viral y por lo menos una proteína de célula de huésped. Por ejemplo, una FRMS de la presente ' invención puede abarcar complejos competentes para fusión (por ejemplo, complejos formados durante eventos de fusión de la envoltura viral con una membrana celular) , complejos defectuosos para la fusión (como por ejemplo los formados durante eventos previos a la fusión entre una envoltura viral defectuosa para la fusión y una membrana celular) así como complejos formados por la asociación de una o varias moléculas de envoltura vitral con uno o varios receptores celulares y/o co-receptores para el virus. En el caso de VIH, las FRMS resultan de la asociación de proteína de envoltura de VIH con CD4 y un receptor de quimiocina. Las FRMS de la presente invenció comprende por consiguiente epítopos capaces de provocar anticuerpos neutralizantes para el virus. Las FRMS de la presente invención se forman a través de varios métodos de conformidad con lo descrito aquí. En una modalidad preferida, células que expresan uno o varias componentes cuya asociación resulta en las FRMS se cultivan para formar las FRMS. Todos los componentes pueden ser expresados en una célula, o bien un primer componente puede ser expresado en una célula y un segundo componente puede ser expresado en una célula diferente, y un tercer componente (eventualmente) puede ser expresado en una de las células antes mencionadas o bien en una célula diferente. Alternativamente, una de las células puede ser reemplazada por una partícula viral o seudovirus o virus recombinante o partícula de tipo virus que contiene el (los) componente (s) en su superficie. Los componentes (proteína de envoltura viral, receptor de célula huésped y/o cualquier co-receptor de célula huésped necesaria) pueden ser expresados cada uno de manera endógena o recombinante por las células. Así, se pueden formar FRMS por medio de la interacción de moléculas endógenas, moléculas exógenas (por ejemplo, expresadas recombinantemente) o bien cualquier combinación de las mismas . En otra modalidad de la presente invención, una forma soluble de una proteína de envoltura viral de un virus de envoltura se emplea en la formación de una FRMS de la invención. Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de envoltura soluble puede ser agregada a células de huésped in vitro, dichas células de huésped expresan el (los) receptor (es) para el virus. Así, la asociación de la proteína de envoltura viral soluble y receptor (es) de célula huésped resulta en la formación de una FRMS.

En otra modalidad de la présente invención, uno o varios receptor (es) de célula soluble (es) se emplean en la formación de la FMRS. En una modalidad, por ejemplo, receptor (es) celular (es) soluble (s) cuya asociación con la(s) proteína (s) de envoltura viral resulta en la formación de una FRMS, puede (n) emplearse en la formación de una FRMS mediante la puesta en contacto de la(s) proteína (s) de envoltura viral con dicho (s) receptor (es) de célula (s) soluble (s). En otra modalidad específica, la totalidad de los componentes cuya asociación resulta en la formación de la FRMS se encuentran en una forma soluble y la FRMS es reconstitucional in vitro. En esta modalidad, la reconstitución de una FRMS puede opcionalmente ser auxiliada por la adición mAb para la FRMS. En otra modalidad de la invención, la FRMS es forzada al observarse una disminución de pH. Por ejemplo, en algunas modalidades, dicha fusión de célula mediada por pH permite que la formulación de la FRMS para virus envueltos, dichas proteínas de membrana celular se localizan en membranas celulares internas . 5.1.1 EXPRESIÓN ENDÓGENA DE COMPONENTES DEL COMPLEJO Los componentes celulares involucrados en la formación de una FRMS para un virus particular incluyen los receptores de células y/o co-receptores para el virus particular. En una modalidad específica, por lo menos alguno de esos componentes son expresados de manera endógena por la célula. Así, cualquier célula conocida en la técnica que expresa un componente celular de la FRMS puede emplearse en la formación de una FRMS. Células que expresan receptores y/o co-receptores celulares nativos para proteínas virales pueden emplearse. Por ejemplo, como se describe aquí, se sabe que CD4 humano es un receptor celular para VIH. En una modalidad de la invención, se empelan células endógenas que expresan CD4 en la formación de una FRMS. Células que expresan de manera endógena un componente de los complejos de la invención pueden comprender uno o varios de los componentes celulares empleados para formar las FRMS. Por ejemplo, se pueden emplear células que expresan la totalidad de los componentes celulares requeridos de la FRMS o células pueden emplearse las cuales no expresan la totalidad de los componentes celulares requeridos. Por ejemplo, en el caso de una FRMS de VIH, cualquier célula que expresa tanto CD4 como un co-receptor de VIH, como por ejemplo CCR5 puede emplearse en la formación de una FRMS de VIH. Alternativamente, cualquier célula que expresa de manera endógena CD4 pero que no expresa de manera endógena un co-receptor de VIH, en esta modalidad, de conformidad con lo comentado abajo, componentes del complejo que no son expresados de manera endógena pueden ser introducidos en la célula y expresados de manera recombinante. En esta modalidad, componentes celulares adicionales del complejo son introducidos a la célula de tal manera que la célula exprese tanto componentes celulares exógenos como endógenos. En una modalidad específica de la invención, el co-receptor CXCR4 se encuentra localizado predominantemente en líneas de células T. En otra modalidad específica de la invención, el co-receptor CCR5 se encuentra localizado predominantemente en células de macrófago. En una modalidad específica de la invención, el co-receptor CXCR4 se encuentra localizado predominantemente en líneas de células T. En otra modalidad específica de la invención, el co-receptor CCR5 se encuentra localizado predominantemente en células de macrófago. Componentes exógenos pueden ser A introducidos en la célula por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo los métodos descritos en la sección 5.1.2, abajo. En otra modalidad de la invención, una célula transformada por medio de una integración de genoma o gen viral, que expresa un componente viral de la FRMS puede emplearse en la formación de un complejo relacionado con fusión. De esta forma, se puede decir que la célula expresa de manera endógena un componente viral importante en la construcción de una FRMS. Dichas células transformadas viralmente pueden también expresar de manera endógena uno o varios componentes celulares de la FRMS. Alternativamente, se pueden emplear partículas virales como fuente de la expresión endógena de componentes virales de una FRMS . 5.1.2 EXPRESIÓN RECOMBINANTE DE COMPONENTES IMPORTANTES EN LA FORMACIÓN DE LAS FRMS Cualesquiera de los componentes importantes en la construcción de una FRMS o fragmentos, análogos o derivados de la misma puede ser introducido en la célula de tal manera que el componente exógeno se exprese en la célula. La presente invención abarca sistemas de expresión, tanto vectores de expresión eucarióticos como procarióticos que pueden emplearse para expresar un componente importante en la formación de una FRMS o fragmento, análogo o derivado de la misma de la presente invención. En otras modalidades de la invención, la proteína ?de la envoltura viral es expresada en una célula huésped. En esta modalidad, en la proteína de envoltura viral exógena puede ser introducida en la célula por transección o vectores virales de conformidad con lo descrito aquí, o bien por infección con el virus vivo o atenuado que comprende la proteína de envoltura viral. Así, una infección viral puede provocar la producción de una proteína de envoltura viral en modalidades preferidas, la expresión de una proteína de envoltura viral en la membrana celular es incrementada por la modificación (por ejemplo por medios recombinantes), es decir de la proteína de envoltura viral con el objeto de incrementar su expresión en la superficie de célula con o bien otra membrana de célula. Por ejemplo, señales de enfoque se conocen en la técnica las cuales incrementan la administración de proteínas celulares a compartimientos o ubicaciones subcelulares particulares. Por ejemplo, una señal de retículo endoplásmico, KDEL, (códigos de aminoácidos de una letra) pueden ser introducidas en la proteína de envoltura viral para promover el enfoque de la proteína hacia ER cuando una célula es infectada por el virus. La invención proporciona también una célula que expresa los componentes virales y celulares importantes para la formación de una mezcla FRMS. En una modalidad, se construye una célula para expresar el receptor y/o co-receptor para un virus y para expresar recombinantemente la proteína de envoltura viral. Dicha célula puede expresar de manera endógena los receptores y/o co-receptores de célula huésped para el virus o bien expresar de manera recombinante una o ambas de esta proteína (s). En modalidades en donde proteínas virales y celulares se expresan de manera recombinante, los ácidos nucleicos se codifican tales proteínas pueden ser expresados a partir de vectores diferentes o bien a partir de un vector único (por ejemplo, en donde un vector comprende varios genes enlazados de manera operativa sobre un promotor único) . Así, en esta modalidad, la totalidad de los componentes necesarios para la formación de una mezcla FRMS se expresan en una célula individual. En una modalidad específica, se construye una célula para expresar recombinantemente CD4 un Co-receptor CCR5 o CXCR4 y gpl60 VHI . Alternativamente, se puede emplear gpl20 y gp41 en lugar de gpl60. En una modalidad preferida, cuando se construye una célula individual para expresar gpl60, CD4 y un Co-receptor VIH-1, la proteína de envoltura viral es también construida de tal manera que no tenga el sitio" de proteasa nativo responsable de la disociación de gpl60 a gpl20 y gp41. En esta modalidad, un sitio de proteasa alternativo es construido en la proteína de envoltura viral, dicha proteasa no es nativa para la célula huésped (como por ejemplo la proteasa bacterial). La formación de FRMS es desencadenada en la célula que expresa las tres proteínas, por el contacto de la célula con la proteasa no nativa, (por ejemplo la visión de una cantidad efectiva para inducir disociación al medio célula) . Varias proteasas y sitios de proteasas se conocen en la técnica y pueden ser empleados de conformidad con la invención. La secuencia de nucleótido se codifica para la proteína de envoltura viral o proteína de receptor celular de la presente invención o un análogo funcionalmente activo o fragmento o bien otro derivado de la misma puede ser insertada en un vector de expresión apropiado por ejemplo, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traslación de las secuencias de codificación de proteína insertada y/o para efectuar los métodos de la invención.

La invención abarca el uso de vectores de expresión de ADN y/o vectores virales que contienen secuencias de codificación de un componente de mezcla FRMS o análogo, derivado o fragmento de la misma asociada operativamente con un elemento regulatorio que dirige la expresión de las secuencias de codificación y células huéspedes manipuladas genéticamente que contienen cualesquiera de las secuencias de codificación antes mencionadas asociadas operativamente con un elemento regulatorio que dirige la expresión de las secuencias de codificación en la célula huésped. Los vectores de expresión de ADN y vectores virales que contienen los ácidos nucleicos que codifican un componente importante en la formación de una mesura FRMS de la presente invención pueden ser producidos por tecnología de mesura ADN recombinante empleando técnicas bien conocidas . Así como métodos para la preparación de vectores de expresión y vectores virales de la invención por expresión de secuencias que contienen ácido nucleico que codifican un componente importante en la formación de una mesura FRMS o análogo, derivado o fragmento de la misma se describen aquí. Métodos bien conocidos por parte de los expertos en la materia pueden ser empleados para construir vectores de expresión que contienen productos génicos que codifica secuencias y señales de control de trascripción y asociación apropiados. Estos métodos incluyen, por ejemplo técnicas de mezcla .ADN recombinante in vi tro, técnicas sintéticas así como recombinación genética. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, et al . , 1989, Molecular Cloning, (clonación molecular) , un manual de laboratorio, segunda edición, Cold Spring , Harbor Press, N.Y.; y Ausubel, et al . , 1989-1999, Current Protocols in Molecular Biology (protocolos actuales en biología molecular) Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., ambos incorporándose aquí por referencia en su totalidad. Alternativamente, secuencias de producto génico pueden ser sintetizadas químicamente empleando, por ejemplo, sintetizadores de oligonucleótidos. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en "Oligonucleotide Synthesis", (síntesis de oligonucleótido) , 1984, Gait, M.J. ed., IRL Press Oxford, que se incorpora aquí en su totalidad. La expresión de genes puse ser regulado por varios métodos conocidos en la técnica incluyendo, sin limitación, los presentados en Mizuno, T. et al., 1984, Proc. Nati. Acad Sci USA. 81 (7) : 1966-70. Los ácidos nucleicos o mezcla ADN que codifican uno o varios componentes que resultan en la formación de la mezcla FRMS pueden ser introducidos en una célula y puede lograrse por varios métodos, por ejemplo liposomas, electroporación, transfección, vectores virales, bacteriófago, etc. En una modalidad, ácidos nucleicos que codifican uno o varios componentes importantes en la formación de una mezcla FRMS se logran mediante el empaque de ADN de plásmido que comprende los ácidos nucleicos que codifican para el componentes (s) en liposomas o bien por medio de la formación de complejos de .ADN de plásmido que comprende los ácidos nucleicos que codifican para el componente (s) con lípidos o liposomas para formar complejos ADN-lípido o ADN-liposoma. El liposoma es compuesto de lípidos catiónicos y neutrales comúnmente empleados para transfectarse en gas in vi tro . Los lípidos catiónicos forman complejos con ADN de plásmido y forman liposomas. Liposomas catiónicos y neutrales se contemplan dentro del marco de esta invención. Liposomas catiónicos pueden formar complejos con la molécula biológicamente activa cargadas' negativamente (.ADN) mediante la mezcla de estos componentes y permitiendo su asociación de carga. Liposomas catiónicos son esencialmente útiles con un ácido nucleico debido a la carga negativa de los ácidos nucleicos. Ejemplos de liposomas catiónicos incluyen lipofectina, lipofectamina, lipofectace y DOTAP (Hawley-Nelson et al., 1992, Focus ' 15 (3) : 73-83; Felgner et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84 : 7413; Stewart et al., 1992, Human Gene Therapy 3:267-275). Lípidos catiónicos comercialmente disponibles están también disponibles, por ejemplo, bromuro de dimetildioctadeclamonio (DDAB) ; un lípido biodegradable 1, 2-bis (oleoiloxi) -3- (trimetilamonio) propano (DOTAP); esos liposomas pueden ser mezclados con un lípido neutro, por ejemplo, L-á dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) , o colesterol (Chol), dos lípidos neutrales comúnmente empleados para administración sistémica. Las relaciones entre .ADN y liposoma puede ser optimizado empleando los métodos usados por los expertos en la materia (véase por ejemplo, Nicolau et al., 1987, Methods Enzymol. 149:157) y pueden ser utilizados fácilmente aquí por parte de una persona con un conocimiento normal en la materia para insertar el complejo de esta invención. En otra modalidad de la presente invención, el .ADN de plásmido que codifica para los genes o ácidos nucleicos que codifican uno o varios componentes que resultan en la formación de una FRMS de la invención pueden ser suministrados a través de policationes, moléculas que llevan varias cargas positivas y se emplean para lograr una transferencia de gen in Vi tro, in vivo y ex vivo . Los policationes, por ejemplo polietilenimina, pueden emplearse para lograr una transferencia exitosa de gen (véase por ejemplo, Boletta et al., 1996, J. Am. Soc. Nephrol. 7:1728). Virus recombinantes pueden también emplearse para suministrar los componentes cuya asociación resulta en la mezcla FRMS. Células infectadas por estos virus o transformadas por el genoma viral expresan de esta forma los componentes deseados. Así, en otra modalidad de la presente invención, ya sea un vector recombinante vivo o bien un vector viral recombinante desactivado que expresa uno o varios componente (s) descrito (s) aquí puede ser manipulado. En cuanto a este aspecto, varios virus pueden ser manipulados genéticamente para expresar un componente importante en la formación de una FRMS. En algunos casos, puede ser deseable que los virus recombinantes estén ya sea adaptados al frío, sensibles a la temperatura o atenuados . De conformidad con la presente invención, se puede emplear una amplia variedad de virus y vectores virales para administrar las secuencias de nucleótidos que codifican uno o varios componente (s) importante (s) para la formación de una FRMS de la presente invención, algunos ejemplos describiéndose a continuación. Los vectores retrovirales son empleados habitualmente para suministrar genes a células huéspedes. Los vectores retrovirales son solo vehículos de suministro de genes extremadamente eficientes que no provocan daño detectable cuando penetran en las células. El ácido nucleico retroviral puede integrarse en ADN cromosomal huésped permitiendo la persistencia durante largo tiempo y una transmisión estable a una progenia futura, dicho vector pueden emplearse para la administración de uno o varios componente (s) lo que resulta en la formación de una FRMS. Un ejemplo de un vector retroviral apropiado es los lentivirus que tienen la ventaja de infectar y translucir células que no se dividen. En una modalidad de ese tipo, un vector lentiviral que codifica un genoma de vector ARN en paquete y unido operativamente a un promotor en donde todos los genes auxiliares o retrovirales funcionales están ausentes, se emplea para transferir ADN que codifica un componente importante en la formación de FRMS de la presente invención. Ejemplos de tales vectores se describen en el documento WO 98/17815, WO 98/17816 y WO 98/17817, cada uno de los cuales se incorpora cada uno aquí por referencia en su totalidad. En otra modalidad, vectores virales no integrantes que infectan y transducen células que no se están dividiendo, por ejemplos vectores adenovirales pueden ser empleados para administrar un componente importante en la formación de una mezcla FRMS. Vectores adenovirales tienen varias ventajas puesto que tales vectores evitan los riesgos asociados con la alteración permanente del genoma de la célula huésped o la promoción de muta génesis de inserción. Los adenovirus encuentran entre los vectores virales no integrantes mejores desarrollados y pueden emplearse para transferir cassette de expresión de hasta 75 kb. Los adenovirus recombinantes pueden ser producidos en títulos extremadamente altos y son altamente infecciosos y transfieren genes de manera eficiente a una amplia variedad de células que se replican o que no se replican y son además ideales para la transferencia de genes de mamífero in vivo . Vectores basados en adenovirus son relativamente seguros y pueden ser manipulados para codificar el (los) componente (s) deseado (s) al mismo tiempo que son desactivados en términos de su tamaño de su capacidad de replicación en un ciclo de vida viral lítico normal. El adenovirus tiene un tropismo natural para el epitelio de las vías respiratorias. Por consiguiente, los vectores basados en adenovirus son especialmente preferidos para aplicaciones de administración epitelial. En una modalidad particular, la terapia con gen basada en adenovirus comprende un genoma de 2 serotipos de adenovirus en donde las regiones Ela y El del genoma que están involucradas en etapas iniciales de la replicación viral han sido removidas y reemplazadas por secuencias de nucleótidos de interés. En la modalidad adicional el vector de terapia génica basado en adenovirus contiene solamente el cuadro de lectura abierto esencial (0RF3 o 0RF6 de la región temprana adenoviral 4 (E4) y es removido de todos los demás cuadros de lectura abiertos E4, o bien puede contener además remociones en las regiones E3 (véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana número 5,670,488, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) . En otra modalidad, el vector de terapia basada en adenovirus empleado puede ser un seudo-adenovirus (PAV) que no contiene ningún gen viral dañino y presenta una capacidad teórica para material foráneo de casi 36 kb. En otra modalidad, sistemas de virus asociados, con adeno (.AAV) pueden emplearse para suministrar el componente importante en la formación de una FRMS de la presente invención. AAV tienen un amplio rango de huéspedes y los AAV han sido diseñados actualmente los cuales no requiere de virus auxiliar. Ejemplos de tales vectores AAV se describen en el documento WO 97/17458. Vectores virales de vaccinia pueden ser empleados de conformidad con la presente invención, puesto que fragmentos grandes de .ADN son fácilmente clonados en su genoma y variantes de vaccinia atenuadas recombinantes han sido descritas en (Meyer, et al., 1991, J Gan. Virol 72:1031-1038) . En una modalidad de la invención, un vector viral de vaccinia es empleado para suministrar los componentes importantes a la formación de una mezcla de FRMS de tal manera que los componentes son expresados en la célula infectada por vaccinia recombinante. En una modalidad específica, los componentes son CD4, un co-receptor (por ejemplo CCR5 o CXCR4) y la proteína de envoltura de VIH. En esta modalidad específica, la infección de una célula con vaccinia recombinante resulta en la expresión de los componentes y formación de una FRMS de VIH. En otra modalidad específica, dos virus de vaccinia recombinante diferentes son construidos de tal manera que el primer virus codifique la próteína de envoltura de VIH y de tal manera que el segundo virus codifique CD4 humano y/o receptor de quimiocina. En esta modalidad, el primer virus es empleado para infectar una primera población de células de tal manera que la infección resulte en la expresión de la proteína de envoltura de VIH. El segundo virus es empleado para infectar una segunda población de células de tal manera que la infección resulte en la expresión de CD4 y en el receptor de quimiocina. El co-cultivo de la primera población infectada de células con la segunda población infectada de células resulta en la formación de una FRMS de VHI. En una modalidad adicional, las células co-cultivadas pueden ser reticuladas. Ortomixovirus, incluyendo influenza; para mixovirus, incluyendo el virus sincitial respiratorio y virus de Sendai; Raptovirus pueden ser manipulados para expresar mutaciones que resultan en fenotipos atenuados (ver Patente norteamericana número de serie 5,578,473, expedida el día 26 de noviembre de 1996 que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) . Esos genomas virales pueden ser también manipulados para expresar secuencias de nucleótidos foráneos, como por ejemplo un componente importante en la formación de una FRMS de la presente invención (ver patente norteamericana número de serie 5,166,057 expedida el 24 de noviembre de 1992 que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) .

Técnicas genéticas reversas pueden ser aplicadas para manipular genomas virales de ARN de cadena negativa y positiva para introducir mutaciones que resultan en fenotipos atenuados, como se demuestra en virus de influencia, virus de sarampión, virus Sindbis así como virus de polio (ver Palese et al., 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:11354-11358). Estas técnicas pueden también emplearse para introducir ADN foráneo, es decir, codificar un componente con proteína importante en la formación de una FRMS para generar vectores virales recombinantes a emplear de conformidad con la presente invención. Además, adenovirus y retrovirus atenuados pueden ser manipulados para expresar un componente importante en la formación de una FRMS. Por consiguiente, se pueden manipular una amplia variedad de virus para suministrar un componente importante en la formación de una FRMS de la presente invención. Se pueden emplear bacteriófagos para infectar específicamente una célula bacteriana (Soothill, J.S., 1992, J. Med. Microbiol. 37:358-261). En los vectores virales de la presente invención, el ADN no virales (por ejemplo, que codifica un receptor de célula) o bien un ADV viral no nativo (por ejemplo que codifica una proteína de envoltura viral) puede codificar cualquier componente importante en la formación de una FRMS . Así, una especie de materia podría determina que proteína (s) de envoltura viral, receptor (es) de célula y/o co-receptor (s) empleados para construir la FRMS de la presente invención pueden proporcionarse a las células a través de virionos células infectadas con virus o bien viriones química/genéticamente desactivados, vectores virales, replicones virales (es decir constructos virales no replicantes, por ejemplo, replicones de VEE) , partículas de tipo virus producidas por métodos de .ADN recombinante así como .ADN desnudo. Como arriba, los sistemas de expresión recombinantes pueden emplear elementos de regulación que incluyen promotores inducidos y no inducidos, realizadores, operadores, sin dedicarse a ellos. Cualesquiera de los métodos previamente descritos para la inserción de ADN o fragmentos de ácido nucleico en un vector pueden emplearse para construir vectores de expresión que contienen un gen o un gen quimérico que consiste de señales apropiadas de control de transcripción/translación y la señal de secuencias de codificación de proteína. Esos métodos pueden incluir técnicas de .ADN recombinante y sintéticas in vi tro . En general, la expresión de una secuencia de ácido nucleico y modifica una proteína o fragmento de péptido puede ser regulada por una segunda secuencia de ácido nucleico de tal manera que la proteína o péptido sea expresado un una célula huésped transformada con la molécula de .ADN recombinante . Por ejemplo, la expresión de una proteína de envoltura viral puede ser controlada por cualquier promotor/enlazador conocido en la técnica. Un promotor/enlazador puede ser homólogo (es decir nativo) o bien heterólogo (es decir no nativo) . Promotores que pueden emplearse para controlar la expresión de proteína incluye, sin limitarse a ello, la región de promotor inicial SV40 (Benoist et al., 1981, Nature -290:304-310), el promotor contenido en la repetición de terminal 3' de virus de sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797), el promotor de timidinquinasa de herpes (Wagner et al., 1981 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:1441-1445), las secuencias regulatorias del gen de metalotioneina (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42), vectores de expresión vegetal que comprenden la región de promotor de nopalinsintetasa (Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213), el promotor de ARN 35S de virus del mosaico de la coliflor (Gardner et al 1981, Nucí. Acids Res. 9:2871), y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115- 120), elementos promotores aparte de levadura y otros hongos tales como el promotor que responde a Gal4, el promotor ADC (alcohol deshidrogenasa) , el promotor PGK (fosfoglicerolquinasa) el promotor de fosfatasa alcalina, y las regiones de campo de transmisión animal siguientes que presentan especificidad tisular y que han sido empleadas en animales transgénicos: región de control de gen de elastasa I que es activada en células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7 : 425-515) ;una región de control de gen que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), una región de control de gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; .Alexander et al., 1987, Mol Cell. Biol. 7:1436-1444), una región de control de virus del tumor mamario de ratón que es activa en células testiculares, de mama, linfoides y de mastín (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), una región de control de gen de albúmina que es activa en hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), una región de control de gen de alfa-fetoproteína que se activa en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58), una región de control de gen alfa 1-antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), una región de control de gen beta-globina que es activa en células eritroides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986 Cell 46:89-94), una región de control de gen de proteína gástrica de mielina que es activa en células oligodendrocitas en el cerebro (Réadhead et al., 1987, Cell 48:703-712); una región de control de gen de cadena-2 ligera de miosina que es activa en el músculo esqueletal (Sani, 1985, Nature 314:283-286), y una región de control de gen de hormona de liberación de gonadotrópica que es activa en el hipotálamo (Masón et al., 1986 Science 234:1372-1378). En una modalidad especifica, se emplea un vector que comprende una región unida dé manera operativa a un ácido nucleico que codifica una proteína viral celular o bien una proteína quimérica y uno o varios orígenes de replicación y, opcionalmente, uno o varios marcadores seleccionados (ejemplo un gen de resistencia a los antibióticos) . En otra modalidad, dos o más promotores puede emplearse para dirigir la expresión de dos o más genes con un plásmido único. En una modalidad específica, el conector temprano inmediato (IE) de CMV se emplea para dirigir la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína viral o celular o una proteína quimérica. Los promotores pueden ser inducidos o constituidos. La expresión de ciertos promotores puede ser empleada para en presencia de ciertos inductores; por consiguiente, por ejemplo, la expresión de quimera de proteína manipulada genéticamente puede ser controlada. Promotores invisibles pueden emplearse para controlar la disposición de las proteínas de la invención, de tal manera que la proteína sea producida en preferencia del inductor.

La presente invención ofrece también métodos para la expresión estable de los componentes que resultan en la formación de una FRMS de la invención. En el caso de producción de largo plazo de alto rendimiento de proteínas recombinantes, es posible obtener una expresión estable. Por ejemplo, líneas de células que expresan establemente uno o varios receptores celulares y co-receptores' celulares para el virus, pueden ser manipulados. En lugar de emplear vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células huéspedes pueden ser transformados con ADN controlado con elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, secuencias de promotor, realzador, secuencias, terminadores de transcripción sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Por ejemplo, después de la introducción de .ADN, las células manipuladas pueden dejarse crecer durante uno o dos días en un medio enriquecido, y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombínate proporciona resistencia a los focos de selección (es decir, mediante la integración estable del plásmido en sus cromosomas) y evite a las células crecer para formar a su vez una entidad que puede ser clonada y expandida en líneas de células. Este método puede emplearse de manera provechosa para manipular líneas de células. Este método puede emplearse de manera provechosa para manipular líneas de células que expresan en los productos seleccionados de gen. Tales líneas de células serían especialmente útiles para tamizar y evaluar compuestos que afectan la actividad endógena del producto de gen seleccionado . Numerosos sistemas de selección pueden emplearse para generar líneas de células que se expresan de manera estable, incluyendo, sin limitación hacia ellos," genes de timidinquinasa (Wigler, et al., 1977, Cell 11:223), hipoxantin-guaninfosforibosiltransferasa (Szybalska et al., 1962, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 48:2026), así como adeninfosforibosiltransferasa (Lowy, et al., 1980, Cell 22:817) pueden emplearse en células tk", hgprt" o aprt" A respectivamente. Así mismo, la resistencia con, los metabolitos puede emplearse como la base de selección para los siguientes genes: DHFR, que promociona la resistencia al metrotrexato (Wigler, et al., 1980, Nati. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Nati. Acad Sci USA 78:1527); gpt, que confía la resistencia al ácido micofenólico (Mulligan et al., 1981 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que proporciona resistencia al a inoglicósido G-418 (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); e higro que proporciona resistencia a la higromicina (Santerre, et al., 1984, Gene 30:147). 5.1.3 CÉLULAS DE EXPRESIÓN DE COMPONENTES CUYA ASOCIACIÓN RESULTA EN FRMS La presente invención abarca la extensión de componente (s) cuya asociación resulta de la formación de la FRMS. En varias modalidades de la invención, la impresión puede ser en células primarias, células de animal así como líneas de célula de insecto. De conformidad con la presente invención, varias células o cepas celulares primarias o secundarias pueden emplearse incluyendo cuatro ceros sin limitarse a las células habitual de piel, médula ósea, hígado, bazo, médula, páncreas, riñon, tejido adrenal y neurológico para nombrar algunas opciones. Otras células que pueden emplearse de conformidad con la presente invención son células inmunes (como por ejemplo células T, células B, células asesinas y naturales, etc.) macrófagos/monocitos, adipositos, pericitos, fibroblastos, células neuronales, células reticulares, etc. En la modalidad adicional, líneas de células secundarias pueden emplearse, incluyendo, sin limitación, líneas de células hepáticas como por ejemplo CGSB, NR, células de hígado de Chang, o bien otras líneas de células como por ejemplo CHO, VERO, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 373, CaSki y líneas de células W138. En una modalidad preferida, las células huéspedes comprende uno o varios receptores de célula que facilitan el enlace o la infección viral. En una modalidad preferida de la invención, las célula es eucariótica, de preferencia una línea de células, de preferencia de mamífero, y especialmente de ser humano que puede ser empleado para el método de la presente invención. Las células pueden ser derivadas de ser humano (por ejemplo, células HeLa) , primates, ratones, conejos, pollos, etc. aun cuando también puede provenir de un animal no humano transgénico. Numerosas líneas de células eucarióticas pueden ser adquiridas a partir de ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD) . En una modalidad más preferida se deriva una célula eucariótica de un ser humano. En otras modalidades, la célula es derivada de un ratón, mono o rata. De preferencia se emplean líneas de células no tumorales así como células permisivas autólogas para preparar la FRMS de la presente invención. .Así, la presente invención ofrece células que comprenden uño o varios componentes que resultan en la formación de una FRMS de la invención. La presente invención ofrece también células que comprenden la totalidad de los componentes requeridos para la formación de la mesura FRMS de la invención. En una modalidad, la presente invención ofrece una célula que expresa de manera recombinante una proteína de envoltura de un virus envuelto que funciona en la fusión de la envoltura viral con una membrana de célula huésped, o bien una forma mutante de dicha proteína de envoltura que es defectuosa para fusión. En una modalidad adicional, la célula expresa una o varias proteínas de membrana celular que funcionan como receptores para dicha proteína de envoltura. En la modalidad especifica, la invención ofr ce una célula que expresa de manera recombínate gpl60VHI, CD4 de ser humano y un Co-receptor para VIH. La presente invención ofrece también una línea de células que expresa de manera recombinante una proteíha de envoltura de un virus envuelto que funciona en fusión de la envoltura viral con una membrana de célula huésped o bien una forma mutante de una proteína de envoltura que es defectuosa para la fusión. En una modalidad adicional, la línea de células expresa una o varias proteínas de membrana celular que funcionan como receptores para dicha proteína de envoltura. En la modalidad especifica, la invención ofrece una línea dé células que expresa de manera recombinante gpl60 VIH dicha línea de células expresa CD4 y un Co-receptor para VIH; dicha línea de células no tiene una proteasa funcional que disocia gpl60 para, producir gpl20 y gp41. En otras modalidades de la invención, células que comprenden la FRMS de la presente invención se administran como inmunógeno (s) es decir a un sujeto (ver sección 5.5). En la modalidad preferidas, cuando el sujeto es un ser humano, las células son células primarias humanas. En una modalidad preferida adicional, las células son autólogas. 5.1.4 EMPLEO DE MUTANTES DEFECTUOSOS PARA LA FUSIÓN EN LA FORMACIÓN DEL COMPLEJO En una modalidad, cualquier proteína de envoltura viral que contiene una actividad de fusión de tipo silvestre se emplea para efectuar la FRMS. En la modalidad alternativa, que se ha empleado una proteína de envoltura defectuosa para la fusión, de conformidad con lo descrito en esta sección. La presente invención ofrece el uso de mutaciones de las proteínas de envoltura viral o bien proteínas de receptor Co-receptor 'de célula huésped, dichas mutaciones inhiben la realización del proceso de envoltura viral y fusión de membrana celular. La invención ofrece mutaciones defectuosas para fusión que no permiten la culminación del proceso de fusión de envoltura viral-membrana celular, pero que resultan en la formación de una estructura molecular relacionada con fusión de la invención. Las mutaciones defectuosas para fusión se emplean para construir epítopos que comprenden una FRMS, En una modalidad de la invención, la asociación de la proteína de envoltura defectuosa para fusión con el (los) receptor (es) celular resultan en la acumulación de FRMS. Así, las mutaciones defectuosas para fusión de la presente invención pueden emplearse en la formación de una FRMS. En cualquier técnica para mutagénesis conocida puede emplearse para modificar los nucleótidos individuales en la secuencia de .ADN, para el propósito de efectuar sustitución (es) de amino ácido en las secuencias de péptidos expresada, para crear/remover sitios de restricción, o bien para agregar marcadores de afinidad. Tales técnicas incluyen, sin limitarse a ellas, la muta génesis química, la muta génesis dirigida hacia sitios in vi tro (Hutchinson, C, et al, 1978, J. Biol. Chem 253:6551), la muta génesis dirigida por oligonucleótidos (Smith, 1985, Ann. Rev. Genet. 19:423-463; Hill et al., 1987, Methods Enzymol. 155:558-568), la extensión de empalme basada en reacción en cadena de polimerasa (Ho et al., 1989 Gene 77:51-59), la muta génesis de mega iniciadores basada en reacción en cadena de (Sakar et al., 1990, Biotechniques, 8:404-407), etc. las modificaciones pueden ser confirmadas por secuenciamiento de .ADN. Una mutación defectuosa para fusión puede ser construida para cualquier virus envuelto. En una modalidad específica, se construyen mutaciones que afectan la capacidad de llevar a cabo la fusión. La dirección de mutaciones puede bajarse en trabajo publicado o bien basarse en modelo molecular a partir predicciones de estructuras conocidas o hipotéticas. Las mutaciones conocidas no afectan negativamente la expresión de proteína de envoltura y el tránsito hacia la superficie de la célula será preferido. En una modalidad adicional, un mutante defectuoso para fusiones confirmado por medio de la expresión de un gen que presenta mutación en una célula (por ejemplo, los métodos de la invención) como por ejemplo COS, 293T y está ensayado para competencia de fusión. Las células pueden ser entalladas para expresión superficial de célula del componente mutante (por métodos conocidos tales como por ejemplo, citometría de flujo o bien mediante inmunoflorecencia indirecta de célula viva) . Además, un procesamiento proteólitico de una proteína mutante, por ejemplo un mutante de gp 160 VIH puede ser ensayado por análisis de bazo o bien a través de otro método conocido en la técnica. La competencia de fusión de componentes mutantes puede ser ensayada de conformidad con lo descrito en la sección 5.7, aquí, (por ejemplo mediante el ensayo de formación de sincitio, por ejemplo, en el caso de VIH, ensayo de fusión de célula U87-CD4-co-receptor) . En una modalidad adicional de la invención, proteínas de envoltura de mutante defectuosas para el enlace, defectuosas A para la fusión o bien con fusión detenida se prueban para la capacidad de provocar anticuerpos que neutralizan virus aislados primarios en el ensayo de vacunación de ratón transgénico. En esta modalidad, los inmunógenos pueden comprender células que expresan la proteína de envoltura de mutante de prueba cocultivada con, por ejemplo, células U87-CD4-CCR5 (cuando se prueban mutantes relacionados con VIH) . En una modalidad preferida de la invención, mutaciones que provocan una neutralización amplia del virus de Pl se desarrollan como subunidad e inmunógenos basados en virus recombinantes. La tabla I ofrece una lista de mutaciones ejemplares que se proporcionan para VIH. Como será aparente a un experto en la materia, mutaciones similares pueden ser construidas para otros virus envueltos Tabla I: Proteína/sitio mutación (es) Sitio de disociación terminal C de pgl20 REKR a REKT gpl20-gp41 Mutaciones de péptido gp41 V2E, G10V de fusión Mutaciones de hélice V570R, Y586E, L568A, W571R, Q577R, helicoidal de gp41 N656L de envoltura Disociación incrementada alteración en el sitio de disocia-de gpl20 ción de furinproteasa de REKR a RSKR de terminal C de gpl20 A Mutaciones adicionales por ejemplo dentro de la hoja de puente de la estructura de núcleo de gpl20 incluyen las mutaciones de Kwong et al. (Kwong PD, et al., Nature 393:648-59; Kwong PD, et al., 1999, J Biol Chem. 274:4115-23) y regiones de interacción gp41/gpl20 putativa. En otra modalidad, las FRMS de la presente invención se preparan empleando proteínas de envoltura viral que contienen mutaciones de enlace y mutaciones relacionadas con fusión. En una modalidad, las proteínas virales se unen a receptores de célula huésped, sin embargo, la mutación provoca la suspensión del proceso de fusión antes o durante la fusión de la envoltura viral y de membrana de célula huésped. Así, las FRMS de la presente invención incluyen epítopos que resultan de la asociación de una o varias proteínas de envoltura viral y una o varias proteínas de membrana de célula, incluyendo las proteínas que son defectuosas para la fusión, con fusión suspendida o bien defectuosas para el enlace en la medida en que las proteínas mutantes cuando se emplean en los métodos de la invención resulten en un epítopo que provoca anticuerpos neutralizantes Pl . Complejos de proteína suspendidos durante el proceso de fusión pueden ser aislados y empleados en los métodos y composiciones de la invención incluyendo, sin limitarse a ellos, inmunógenos, kits de diagnóstico, vacunas y composiciones. Por ejemplo, en una modalidad específica, las FRMS comprenden la proteína de envoltura viral principal de VIH-1. Son varias clases de mutaciones relacionadas con fusión que pueden ser empleadas para la construcción de complejos de la presente invención. Sin limitación en cuanto al mecanismo, durante la fusión de VIH-1 y célula huésped, el complejo de proteína oligomérica gpl60, que comprende la superficie gpl20 y porciones de transmembrana de gp41, se enlaza inicialmente al receptor CD4 en la célula huésped. Cambios de conformación tanto en la proteína de envoltura como en el receptor CD4 facilitan la interacción con una molécula de co-receptor en la superficie de célula huésped. Cambios conformacionales adicionales en el complejo trimolecular proteína viral-CD4-co-receptor permiten la exposición de un intermedio de pregancho de gp41 viral y la inserción del dominio de fusión hidrofóbico de gp41 de terminal N en la membrana de célula huésped. Regiones de repetición de héptado helicoidales dentro del intermedio pregancho se colapsan subsecuentemente para formar el núcleo de doble hélice trimérico de gp41 activo de fusión. El núcleo de doble hélice impulsa la fusión última de membranas de células y virus adyacentes. Las proteínas de envoltura virales con mutaciones que cancelan la disociación proteolítica de proteína de precursor de gpl60 que evitan la liberación del dominio de fusión hidrofóbico de gp41 pueden emplearse para construir los complejos de la presente invención. Particularmente, se ha mostrado que ciertas mutaciones que alteran el sitio altamente conservado lys/arg-X-lys/arg-arg en la terminal C de gpl20 cancela la fusogenicidad (véase, por ejemplo, Lee CN, et al., 1994, AIDS Res. Hum. Retroviruses. 10:1065-9). Además, mutaciones que afectan el péptido de fusión de gp41 de terminal N pueden emplearse para crear los complejos de la presente invención. La región de terminal N hidrofóbica de gp41 media la fusión mediante inserción en la membrana celular y desestabilización de la bicapa de lípidos, tal vez mediante la adopción de una estructura helicoidal. Ciertos cambios de aminoácidos dentro de esta región hacen que la proteína de envoltura sea no fusogénica. Péptidos sintéticos que llevan estos cambios o bien son incapaces de unirse sobre bicapas de lípidos incapaces de provocar fusión. Dos mutaciones defectuosas para la fusión en gp41 han sido bien caracterizados: V2E y G10V (Kliger Y, et al., 1997, J Biol. Chem. 272: 13496-505). La primera incluye una sustitución polar en el péptido hidrofóbico, mientras que la última puede afectar la estructura helicoidal asumida en la bicapa de lípidos. Estas mutaciones pueden ser introducidas en el gen de envoltura 168P (gp41: ala-val-gly-ile-gly-val-leu-phe-leu-gly-phe-leu-gly... ) por mutagénesis dirigida por sitio o bien cualquier método conocido en la técnica y las proteínas de envoltura probadas para expresión y determinación de la fusogenicidad. Además, proteínas de envoltura que tienen mutaciones que alteran la región de núcleo de doble hélice de gp41 pueden emplearse para construir las estructuras de la presente invención. El motivo de doble hélice altamente conservado se encuentra en proteínas involucradas en fusión de muchas familias de virus, y estructuras similares han sido identificadas en proteínas celulares que median la fusión vesicular. Péptidos sintéticos que imitan ya sea la región helicoidal N o la región helicoidal C (por ejemplo, DPI07 y DP178) (Furuta et al., 1998, Nature Structural Biology 5:276-279) neutralizan de manera potente la capacidad de infección del virus, probablemente mediante el enlace de la región helicoidal análoga y mediante interferencia con los colapsos del intermedio pregáncho . Además de la información estructural detallada disponible a partir de la cristalografía, las regiones helicoidales N y C de gp41 han sido también saturadas por mutagenesis. Se identificaron varias mutaciones que conservan la expresión y ensamble normales de proteína de envoltura y sin embargo no son fusogénicas, probablemente debido al trastorno de la interfaz entre las hélices helicoidales N y C (por ejemplo V570R y Y586E) (Weng et al., 1998, Journal of Virology 72:9676-9682). Una proteína de envoltura viral competente o mutada así como receptores de célula y/o co-receptores de célula pueden ser incorporados en vectores virales o bien células diploides por métodos conocidos en la técnica incluyendo los descritos aquí. Genes virales que codifican proteínas virales son clonados de manera rutinaria para expresión en células bacterianas, en células eucarióticas o procarióticas, o bien en vectores virales o de .ADN. De la misma manera, receptores celulares humanos pueden ser clonados y expresados para producir modelos a través de los cuales se estudian enfermedades patogénicas peligrosas. Genes virales o bien receptores de huésped pueden incorporarse en ADN foráneo por transfección o bien a través del uso de vectores virales. 5.1.5. OTROS MÉTODOS PARA FORMAR LAS FRMS Además, otros métodos a través de los cuales se activa la formación de las estructuras de la presente invención se contemplan, dichos métodos incluyen la manipulación de condiciones de pH, temperatura y concentración de sal. Además, anticuerpos monoclonales que se enlazan con una fuerza suficiente para envolver proteína pueden activar los cambios de conformación que son necesarios para formar las estructuras de la presente invención. Así, las FRMS de la presente invención pueden formarse como resultado de la interacción de proteínas virales y varios componentes celulares animales incluyendo, sin limitación, los presentados en la lista arriba. 5.2. CAPTURA DE FRMS Una vez formada una FRMS, se pueden emplear varios métodos para conservar o "capturar" la FRMS en una forma inmunogénica que proporciona eficacia de vacuna para aislados virales primarios. En una modalidad, las FRMS de la presente invención resultan de la interacción de una o varias proteínas de envoltura con uno o varios receptores y/o co-receptores celulares de huésped. En una modalidad, los complejos son "capturados" mediante la fijación o la reticulación de la FRMS. Por ejemplo, una FRMS formada en células co-cultivadas que expresan los componentes virales y celulares, respectivamente, que resultan en una FRMA puede ser capturada por fijación de las células con un agente de reticulación. En una modalidad específica, células transformadas con un ácido nucleico que expresa una proteína de envoltura viral y células transformadas con ácidos nucleicos que expresan receptores y co-receptores celulares de huésped se cultivan conjuntamente. La proteína viral expresada en la superficie de una primera célula se une sobre el (los) receptor (es) expresado (s) en la superficie de una segunda célula. Las células son fijadas al inicio de esta interacción célula-célula. Sin limitación en cuanto al mecanismo, la reticulación "captura" el complejo de fusión intermedio y proporciona determinantes relacionados con fusión que pueden ser aislados y empleados, como por ejemplo, como componente de vacuna. Cualquier método conocido en la técnica puede A emplearse para expresar los componentes virales o celulares de un complejo de fusión en una célula (ver, por ejemplo, Sección 5.1.1, aquí). Al capturar la FRMS, células de fusión o bien células mutantes defectuosas para la fusión pueden ser fijadas o reticuladas por cualquier método conocido en la técnica. Reactivos de reticulación que pueden ser empleados incluyen, sin limitación, formaldehído glutaraldehído, formalina, p-azidobenzoilhidrazida, N- (4- [p-azidosaliciclamido] -butil) -3 ' - (2 '-piridiltio) -propionamida, bis (beta- [4-azidosalicilamido] -etil) disulfuro, 1, 4-bismaleimidil-2, 3-dihidroxibutano, 1,6-bismaleimidohexano, 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno, adipimidato de dimetilo-2HCl, suberimidato de dimetilo-2HCl, adipodimidato de dimetilo-2IÍCl, pimelimidato de dimetilo-2HC1, glutarato de disuccinimidilo, tartrato de disuccinimidilo, hidrocloruro de l-etil-3-[3-dimetilanonopropil] carbodiimida, ácido (N-hidroxisuccinimidil) -4-azidosalicílico, 2- [7-azido-4-metil-coumarin-3-acetamidometil-l, 3-aminopropionato de sulfosuccinimidilo, N-succinimidil-4-yodoacetilaminobenzoato', N-succinimidil-3- [2-piridiltio] propionato, y 6- [3- (2-piridilatio) -propionamida] hexanoato de succini idilo (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) . En una modalidad preferida de la invención, el reactivo de reticulación es formaldehído. En una modalidad específica, A niveles inferiores de formaldehído (0.2%) se emplean con el objeto de conservar la antigenicidad. En otras modalidades, concentraciones más elevadas sin embargo pueden emplearse para optimizar la estabilidad. El formaldehído en concentraciones de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 8% puede emplearse para preparar los complejos de la presente invención. Otros agentes que pueden emplearse para reticular células de fusión incluyen, sin limitación, glutaraldehído (de 0.05 a 0.5%). Un experto en la materia que tiene el beneficio de la divulgación contenida aquí reconocerá que condiciones de fijación o reticulación (por ejemplo, reactivo empleado, concentración de reactivos, tiempo y temperatura) pueden variar para determinar condiciones óptimas para la inmunogenicidad de la FRMS . En una modalidad adicional, los complejos de la presente invención pueden ser preparados mediante la infección de células diploides humanas en cultivo celular, por ejemplo, con virus de vaccinia recombinante que expresa proteínas de envoltura viral y CD4/co-receptor (si no están presentes de manera endógena) . Durante la fusión, las células son reticuladas para capturar las estructuras relacionadas con fusión y determinantes. En otra modalidad de la invención, cuando células que expresan el (los) receptor (es) de célula y/o co-receptores para un virus son infectados directamente con el virus vivo o A atenuado, las células sometidas a infección pueden ser reticuladas con el objeto de capturar la FRMS. En otras modalidades de la invención, una célula individual puede ser manipulada para expresar la totalidad de los componentes importantes para la formación de una FRMS. En esta modalidad, dicha célula o bien dichas células pueden ser reticuladas o fijadas con el objeto de capturar la FRMS. En esta modalidad, no es necesario que ocurra una interacción célula-célula al momento de la fijación, puesto que todos los componentes son expresados en una célula individual . La invención ofrece partículas virales que son manipuladas para expresar en la envoltura viral los componentes celulares o proteínas importantes para la formación de FRMS. En esta modalidad, las partículas virales recombinantes pueden ser reticuladas para capturar la FRMS formada dentro de la envoltura de partícula viral. En una modalidad alternativa de la invención, los complejos no deben estar fijos ni reticulados. Se ha encontrado que los complejos de la presente invención se forman en lisados celulares, en solución. Por consiguiente, la creación de los complejos de la presente invención, por ejemplo, mediante simple lisis de células transfectadas o infectadas con proteína de envoltura de VIH-1 así como CD4/co-receptor en donde la FRMS se forman en solución. Protocolos de lisis de célula son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra) . Protocolos de lisis de célula pueden involucrar lisis por detergentes (por ejemplo, NP40 al 1%) lisis de congelamiento, descongelamiento, lisis de sonicación, o bien cualquier método conocido en la técnica. En una modalidad específica, cultivos celulares se fijan al principio de interacción de célula-célula mediante la fijación en formaldehído al 0.2% a temperatura de hielo en solución salina amortiguada con fosfato. En otra modalidad de la presente invención, la lisis con detergentes de células incluye el uso del detergente Brij 97. Por consiguiente, la invención ofrece una estructura molecular que es una estructura molecular celular reticulada o es aislada de un lisado celular. En otras modalidades, la invención ofrece mutaciones defectuosas para la fusión que permiten la acumulación de FRMS y permiten la captura de FRMS. 5.3.AISLAMIENTO DE FRMS En una modalidad, células (por ejemplo células reticuladas) que expresan los componentes cuya asociación resulta en la FRMS, pueden emplearse como inmunógeno en las vacunas de la invención. De manera alternativa, estructuras moleculares que comprenden la FRMS pueden ser aisladas para uso como inmunógeno . Una vez formada la FRMS, puede ser aislada y purificada por métodos estándares que incluyen cromatografía (por ejemplo, cromatografía por intercambio de iones, afinidad, y columna) , centrifugación, solubilidad diferencial, o bien por cualquier otra técnica estándar para purificación de proteínas. Además, los componentes importantes en la formación de una FRMS pueden ser sintetizados, los cuales comprenden un marcador de afinidad que facilita la recuperación y purificación. El marcador de péptido puede estar asociado con cualquier parte de la proteína, en la medida en que dicha asociación no altera la formación de epítopos generados por asociación del componente modificado con otros miembros del complejo. En varias modalidades, una proteína quimérica de este tipo que comprende un marcador de afinidad puede elaborarse mediante el ligado de una secuencia de gen que codifica para el componente sobre la secuencia que codifica el marcador de péptido en el cuadro de lectura apropiado y mediante la expresión recombinante de la proteína. Se debe tomar precaución para asegurar que el gen modificado permanece dentro del mismo cuadro de lectura de translación, sin interrupción por señales de detención de translación. Varios marcadores de péptido conocidos en la técnica pueden emplearse en la modificación de una proteína, como por ejemplo, sin limitación, la secuencia de polihistidina (Petty, 1996, Metal-chelate affinity chromatography, (cromatografía por afinidad metal-quelato) , en Current Protocols in Molecular Biology, (protocolos actuales en biología molecular) volumen 2, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience) , glutation S-transferasa {GST; Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229), la proteína de enlace E. coli maltosa (Guan et al., 1987, Gene 67:21-30) y varios dominios de enlace de celulosa (Patentes Norteamericanas Nos. 5,496,934; 5,202,247; 5,137,819; Tomme et al., 1994, Protein Eng. 7:117-123), S TAG® System (Novagen, Inc.), etc. Otros marcadores de péptido posibles son secuencias cortas de aminoácidos para las cuales anticuerpos monoclonales están disponibles, como por ejemplo, sin limitación, los siguientes ejemplos bien conocidos, el epítopo FLAG, el epítopo myc en los aminoácidos 408-439, el epítopo de hemaglutinina de virus de influenza (HA) . Otros marcadores de péptido son reconocidos por socios de enlace específicos y por consiguiente facilitan el aislamiento por enlace por afinidad con el socio de enlace, que es de preferencia inmovilizado y/o en una superficie de fase sólida. Como lo observarán los expertos en la materia, muchos métodos pueden ser empleados para obtener la región de codificación de los marcadores de péptido antes mencionados, incluyendo, sin limitación, clonación de ADN, amplificación de ADN, y métodos sintéticos. Algunos de los marcadores de péptido y reactivos para su detección y aislamiento están disponibles en el comercio. Secuencias de ADN que codifican marcadores de péptido A deseados que son conocidos o fácilmente disponibles a partir de bibliotecas o proveedores comerciales son adecuados en la práctica de esta invención. Estos marcadores así como otros marcadores de péptido son reconocidos por los socios de enlace específicos y por consiguiente facilitan el aislamiento por enlace por afinidad con el socio de enlace que puede estar inmovilizado en una superficie de fase sólida. El producto de gen de proteína quimérica puede ser preparado empleando técnicas de .ADN recombinante. Por ejemplo, una secuencia de gen que codifica un componente importante en la formación de una FRMS puede ser introducido en un vector que contiene la secuencia de un marcador de péptido, de tal manera que el gen de componente sea expresado como una prcteína quimérica marcada con péptido. Marcadores de péptido, que pueden ser reconocidos por socios de enlace específicos, pueden ser empleados para enlace de afinidad con el socio de enlace inmovilizado en una superficie de fase sólida. En una modalidad preferida, una proteína relacionada con fusión marcada con poli-histidina es construida mediante la inserción de un gen de proteína relacionado con fusión o fragmento de gen en un vector de expresión como por ejemplo uno de la serie de vectores de pET15 (Novagen) , que expresan secuencias insertadas como proteínas quiméricas con marcadores de poli-histidina de terminal N. Proteínas que A tienen una sucesión de seis o más residuos de histidina en su terminal amino o carboxilo tienen una fuerte afinidad de enlace con el níquel. Proteínas quiméricas marcadas con polihistidina se unirán específicamente con la superficie de una fase sólida revestida con níquel quelado. En una modalidad preferida, placas de microtitulación revestidas con quelatos de metal se emplean para aislar las proteínas quiméricas marcadas con poli-histidina (Pierce) . Alternativamente, por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht, et al. permite la purificación fácil de proteínas quiméricas no desnaturalizadas expresadas en líneas de células humanas (Janknecht, et al., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88, 8972-8976). En este sistema, el gen de interés es subclonado en un plásmido de recombinación de vaccinia de tal manera que el cuadro de lectura abierta del gen pueda ser fusionado de manera translacional sobre un marcador de terminal amino que consiste de seis residuos de histidina. Extractos de células infectadas con virus de vaccinia recombinante se cargan en columnas de ácido Ni2" nitriloacético-agarosa y proteínas marcadas con histidina son eluidas selectivamente con amortiguadores que contienen imidazol. En otra modalidad específica, un constructo de expresión puede ser preparado mediante la subclonación de una proteína relacionada con fusión en el sitio de restricción EcoRI de A cada uno de los tres vectores pGEX (vectores de expresión de glutation S-transferasa; Smith et al., 1988, Gene 7:31-40). Esto permite la expresión de una proteína quimérica que comprende la proteína relacionada con fusión unida al dominio de enlace de GST en los tres cuadros de lectura de tal manera que, en un cuadro, la actividad de enlace de GST se mantenga en la proteína quimérica resultante. Un péptido quimérico de GST tiene una fuerte afinidad de enlace para su sustrato, glutation. En una modalidad específica, FRMS que comprende un marcador GST es separada de una mezcla de enlace que comprende un lisado celular o células fijas mediante el contacto de dicha mezcla con una superficie de fase sólida enlazada con glutation, como por ejemplo perlas de glutation-sepharose. Por ejemplo, la proteína quimérica de GST puede ser anclada a perlas de glutation-agarosa o bien a una columna de glutation-sepharose. La mezcla es después agregada a la columna o perlas de una manera que permite que ocurra una interacción o un enlace. Al final del período de reacción, el material no unido puede ser removido por lavado. La interacción entre la proteína quimérica y las perlas de glutation-agarosa permite el aislamiento del complejo. En otra modalidad, una proteína quimérica puede ser fácilmente purificada mediante el uso de un anticuerpo específico para la proteína quimérica expresada. En otra modalidad, una FRMS marcada por afinidad puede ser A construida mediante la conjugación de un compuesto de afinidad con una proteína relacionada con fusión. Los compuestos de afinidad pueden ser empleados, como por ejemplo, sin limitarse a ellos, biotina, fotobiotina, y otros compuestos conocidos en la técnica. En una modalidad, compuestos de afinidad o bien marcadores de afinidad pueden ser conjugados con la proteína relacionada con fusión a través de un reticulador polifuncional, y de preferencia una molécula bifuncional. Como se emplea aquí, el término reticulador polifuncional abarca moléculas que tienen más que un grupo funcional que reacciona con un grupo funcional en la proteína relacionada con fusión. Típicamente, dicho reticulador forma enlaces covalentes con un grupo amino o sulfhidrilo en un péptido. Por ejemplo, se puede emplear esteres de N-hidroxisuccinimida de biotina. En una modalidad preferida de la invención, un método altamente específico para aislar la FRMS a través de asociación con CD4, de un co^receptor chemok o bien con una proteína de envoltura es el uso de moléculas marcadas por afinidad con S-péptido que aprovecha la interacción específica y de alta afinidad (Ka = 10~9 M) del S-péptido de 15 aminoácidos de .RNasa A y el fragmento de digestión de subtilisina más grande designado R?asa S (proteína S; aminoácidos 21-124 de R?asa A) (Potts et al., 1963; Dorai et al., 1994). Este sistema S • AG® fue desarrollado comercialmente por ?ovagen, Inc. para su uso en la detección de aislamiento de proteinas quiméricas recombinantes expresadas en sistemas bacterianos y baculovirus, y ha sido extendido recientemente a proteínas quiméricas de mamíferos. Las proteínas relacionadas con fusión de la FRMS son marcadas con S-péptidos. La invención ofrece ejemplos de componentes de complejos que fueron marcados con el S-péptido en el extremo de terminal C de CD4, CCR5 o bien moléculas de proteína de envoltura. Complejos marcados fueron fácilmente aislados y purificados por cromatografía de afinidad de agarosa de proteína S. En una modalidad, reactivos de reticulación impermeables en membrana pueden emplearse para fijar células que contienen complejos marcados. En una modalidad específica, células fijadas que contienen complejos marcados con un agente de reticulación impermeable a membrana facilita el hecho de evitar la desactivación del marcador de péptido S citoplásmico. Alternativamente, la secuencia de péptido S puede ser alterada (ala-glu-thr-ala-ala-ala-ala-phe-glu-arg-gln-his-met-asp-ser) de tal manera que ya no contenga residuos de lisina vulnerables y por consiguiente pueda ser fijada con formaldehído sin resultar en la desactivación del marcador citoplásmico. Células de fusión pueden ser fijadas con un amplio rango de reactivo de reticulación impermeables a membrana incluyendo, sin limitación, BS3 y DTSSP (esteres de' N-hidroxisuccinimidil (NHS) homobifuncionales que reaccionan a través de aminas para formar enlaces ya sea no disociables o reversibles, respectivamente) ; sulfo-SMPB (éster de NHS heterobifuncional y maleimida para reticular de manera irreversible grupos amina y sulfhidrilo) ; Sulfo-SANPAH y SASD (éster de NHS heterobifuncional y reticuladores de fenilazida fotoreactivos que forman o bien enlaces no disociables o bien enlaces reversibles, respectivamente) (Pierce .Chemical Company). Complejos marcados son fácilmente purificados proporcionando una preparación aislada de los componentes relacionados con fusión que pueden ser empleados, por ejemplo, para inclusión en formulaciones de vacuna. Complejos marcados purificados o aislados pueden también emplearse como estándares de diagnóstico para ensayos in vitro. Además, complejos marcados permiten el análisis funcional de la fusión mediada por envoltura. Por consiguiente, la presente invención ofrece un método para purificar un complejo de proteína que comprende una proteína de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 que interactúa funcionalmente con CD4 humano y CC5R humano, que incluye los pasos de: a) marcar el complejo con una secuencia de polipéptidos para facilitar la purificación subsecuente; y b) aislar el complejo marcado. En otras modalidades específicas, la invención ofrece un complejo de proteína aislado que comprende una proteína de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 que interactúa funcionalmente con CD4 y CCR5 humano. 5.4. TIPOS DE FRMS Como resultará aparente a un experto en la materia, cualquier virus envuelto puede ser empleado en los métodos de la invención con el objeto de construir o emplear la FRMS. Por ejemplo, un uso importante de la FRMS de la invención es como inmunógenos de vacuna. Una ventaja de las vacunas que comprenden FRMS es que estos inmunógenos ofrecen tasas de neutralización significativamente más altas de aislados primarios. Los virus envueltos que pueden ser empleados incluyen, sin limitación, las familias de Retroviridae, Rhabdoviridae, Coronaviridae, Filoviridae, Arenaviridae, Poxviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Orthomyxoviridae, Para yxoviridae, Herpesviridae, y Iridoviridae. 5 En una modalidad de la invención, una FRMS retroviral es formada por los métodos de la invención. Por ejemplo, en una modalidad preferida, ' la FRMS de la presente invención comprende el inmunógeno de envoltura viral principal del virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) y 0 proviene de la interacción con el receptor celular huésped para VIH-1 y un co-receptor celular huésped. El co-receptor celular huésped puede ser CCR5, CXCR4, CCR3, CCR2b o bien A cualquier otro conocido en la técnica. Una FRMS ejemplificada de la presente invención resulta de la interacción de la 5 proteína de envoltura viral de aislado 168P de VIH-1 que proviene de la interacción con el receptor celular huésped CD4, y el co-receptor celular huésped CCR5. Será aparente a un experto en la materia que otras proteínas de envoltura de VIH recombinante incluyendo las que actúan independientemente 0 de CD4, podría emplearse para preparar FRMS dentro del alcance de la presente invención. En una modalidad específica, a título de ejemplo pero no limitativo, para una vacuna de VIH, los inmunógenos de la presente invención se preparan mediante el co-cultivo de 5 células COS-7 que expresan proteína de envoltura (LaCasse et al. 1998, Science, 283:357-360) y células que expresan el receptor de CD4 humano y co-receptor de CCR5 (U87-CD4-CCR5) . En esta modalidad, las células que expresan la envoltura son cosechadas empleando 0.5 M de EDTA 24 horas después de la transfección (eficiencia de transfección de 30-60%) y co-cultivadas con un número igual de células blanco U87-CD4-CCR5. El progreso hacia la fusión "es evaluado mediante la tinción de células que expresan la envoltura y mediante el monitoreo microscópico de su incorporación en sincitios multinucleados . La fusión es completa después de 12-24 horas. Los complejos se forman inmediatamente. Las células fijadas después de 1-5 horas de co-cultivo se encuentran en 10-30% A estimado de formación máxima de Sincitios * Este punto temporal temprano en la fusión fue seleccionado inicialmente para capturar los intermedios de transición que llevan a la fusión. Otros puntos temporales (por ejemplo, 10 horas, 24 horas, o más) pueden también emplearse para obtener los complejos relacionados con fusión de la presente invención. Complejos a partir de los puntos posteriores en el proceso de fusión pueden revelar epítopos neutralizantes adicionales y pueden emplearse para representar la apariencia y transcurso en el tiempo de inmunógenos críticos. En otras modalidades, se genera FRMS de flavivirus por los métodos de la invención. Los virus que pertenecen a la familia de los flavivirus incluyen, por ejemplo, virus de la hepatitis C (HCV) , virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis portada por garrapata, así como virus de diarrea viral bovina. Como resultado, los flavivirus son similares a los Tovaridiae que incluyen los alfa-virus (por ejemplo, virus de la encefalitis equina Venezolana, virus de Sindbis, virus d el bosque de Semliki) así como virus de Rubéola. En contraste con VIH, los flavovirus penetran en las células blanco a través de endocitosis mediada por receptores seguido por fusión inducida por PH dentro del endosoma. Virus dentro de la familia de los flavovirus codifican una proteína de envoltura (E) que es proteolíticamente disociada A en muchos miembros de familia en proteínas El y E2 maduras. En el caso específico de HCV (virus de hepatitis C) , la proteína E2 es la porción de enlace de receptor (enlace de la proteína de membrana celular CD81) y El es la proteína de fusión viral putativa. En otra modalidad de la invención, una FRMS de flavivirus o togavirus se forma a través de los métodos de la invención. Por ejemplo, una FRMS de HCV de la invención resulta en la asociación de El, E2 y CD81. En una modalidad específica, las proteínas El y E2 de HCV pueden ser co-expresadas en un sustrato celular aceptable y localizadas en el retículo endoplásmico celular (ER) y no significativamente en la superficie celular. En una modalidad, estos cultivos de células son incubados en un medio amortiguado a un pH de 5 a 6.8 con el objeto de desencadenar una fusión E1E2 de la membrana intracelular. Los cultivos son tratados con un agente de reticulación para capturar las estructuras competentes para fusión intermedias y se emplean directamente (o bien al aislarse membranas ER intracelulares) como inmunógeno de vacuna . En otra modalidad específica, las membranas ER intracelulares trastornadas que contienen proteína E1R2 son aisladas como miscelas evertidas y después incubadas con una célula permisiva apropiada que expresa el receptor E2, CD81. Las miscelas que contienen E1E2 son internalizadas y la fusión A mediada por El ocurre en el endosoma. Las células son después reticuladas y empleadas, por ejemplo, como inmunógenos de vacuna. Alternativamente, las proteínas E1E2 son manipuladas para alterar las señales de retención de ER y por consiguiente permitir la expresión de proteínas E1E2 en la superficie celular, evitando así la necesidad de aislar membranas de ER. En otra modalidad específica, .ADN recombinante derivado do de partículas de tipo virus HCV o E1E2 de HCV que contienen viriones pseudotipados (por ejemplo, un alfavirus o VSV) pueden ser producidas y activadas con fusión mediante incubación con células que expresan receptores en un medio ajustado a un pH de 5-6.8. Los cultivos son tratados con un agente de reticulación como por ejemplo formaldehído y la FRMS es empleada como inmunógéno de vacuna. Alternativamente, viriones pueden ser incubados con células que expresan CD81; viriones internalizados pueden ser inducidos a la fusión dentro del endosoma y pueden ser capturados por tratamiento de reticulación para su uso como un inmunógeno de vacuna de la presente invención. En otra modalidad de la invención, se genera una FRMS de ortomixovirus por los métodos de la invención. La familia de los orthomyxoviridae incluye todos los virus de la influenza, incluyendo, sin limitación, influenza A, influenza B e influencia C. Así, en una modalidad preferida, una FRMS de A influenza provoca anticuerpos neutralizantes contra una amplia variedad de cepas de gripe y podría permitir una vacuna contra la gripe independiente de cambios. Como los flavivirus y los togavirus, los ortomixovirus ingresan en las células blanco a través de una endocitosis mediada por receptor y fusión dentro del endosoma. En este caso, la proteína neuraminidasa (NA) viral funciona como la proteína de enlace con receptor de ácido siálico (un carbohidrato de superficie celular expresado de manera ubicua) , y la proteína de hemaglutinina (HA) funciona en la fusión inducida por pH. En contraste con los flavivirus, el virus de influenza surge de la superficie celular y por consiguiente la expresión de proteína NA y HA recombinante ocurre en la superficie de la célula. En otras modalidades, la FRMS de influenza es generada por los métodos de la presente invención. La FRMS de influenza es generada por los métodos similares a los descritos arriba para los flavivirus, y estos métodos incluyen la fusión mediada por HA activada por pH entre células apropiadas o entre células y membranas celulares aisladas o partículas de virion, la captura del complejo puede efectuarse, por ejemplo, con un agente de reticulación que permite la endocitosis mediada por NA, y la captura subsecuente de la fusión endosomal. En otra modalidad de la invención, se genera una FRMS de paramixovirus por los métodos de la invención. La familia de los paramixovirus abarca varios subgrupos de importancia médica y veterinaria significativa, incluyendo, sin limitarse a ellos, los morbilivirus (virus de sarampión, virus del moquillo canino, virus de la fiebre biliosa hematúrica) , rubulavirus, (virus de paperas, enfermedad de Newcastle) , paramixovirus (parainfluenza humana y bovina) , y pneumovirus (virus de sincitio respiratorio) . Estos virus son similares a los ortomixovirus, excepto que la fusión de los paramixovirus ocurre en la superficie de la célula y no en el endosoma, y es independiente del pH. En el caso de los paramixovirus, la proteína neuraminidashemaglutinina (HN) (o bien simplemente hemaglutinina (H) ) media la fijación de la célula mientras que la proteína de fusión (F) media la fusión virus-célula o célula-célula. Por ejemplo, en el caso del virus del sarampión, la proteína H enlaza el receptor CD46 celular y la proteína F media la fusión de membrana. En una modalidad específica, células que expresan proteínas H y F a partir de MV son co-cultivadas con células que expresan CD46 (y co-receptores actualmente no identificados) y resultan en una fusión célula-célula que puede ser capturada por reticulación o bien otros métodos descritos aquí. Alternativamente, en otra modalidad, el co-receptor puede ser expresado en células que permiten la fusión que expresan CD46 exógeno. Se pueden emplear también modalidades específicas (de conformidad con A lo descrito para VIH y otros virus arriba) . En una modalidad de la invención, una FRMS de herpesvirus es generada por los métodos de la invención. Los herpesvirus comprenden una gran familia que incluye miembros de importancia médica y veterinaria significativa. Los herpesvirus humanos incluyen, sin limitarse a ellos, HSV 1 y HSV 2, virus de la varicela zoster, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, así como herpesvirus de Kaposi HHV 8. Por ejemplo, en el caso de HSV 1, el enlace y la penetración es un proceso complejo que involucra varias glicoproteínas virales (gD, gC, y gH/gL) y varios receptores de células así como moléculas de adhesión (proteínas A-C mediadoras de la entrada de glicosaminoglicanos y herpes virus (Hve) ) . El enlace y la fusión ocurren en la superficie de la célula de manera independiente del pH. En una modalidad específica, la FRMS de HSV se construye empleando una célula que expresa los receptores celulares y moléculas de adherencia (por ejemplo, células MRC5 humana) y el co-cultivo de estas células con células que expresan las glicoproteínas gD, gC, gH, y gL de HSV. La fusión célula-célula es de preferencia suspendida por fijación con un agente de reticulación para permitir la captura de la FRMS. De conformidad con lo descrito aquí, proteínas virales y receptores celulares de huésped pueden ser combinados para formar la FRMS de la presente invención para virus ' que incluyen el virus de herpes, virus de pox, paramixovirus, virus del sarampión, paperas, rubéola, virus sincitial respiratorio, influenza, hepatitis C, ébola, así como flavivirus tales como dengue y fiebre amarilla. Además, la FRMS de la presente invención puede incluir proteínas virales a partir de virus de importancia veterinaria incluyendo rabia, leucemia felina, virus de inmunodeficiencia felina así como fiebre biliosa hematúrica. La tabla II presenta una lista de ejemplos del (de los) receptor (es) celular (es) para virus envuelto particulares, que cuando se expresan junto con la proteína de envoltura viral y cuando se permite su asociación con la proteína de envoltura resultan en la formación de FRMS.

Tabla II Virus receptor (es) celular (es) Coronavirus bovino receptor de ácido N-acetil-9-O-ace- tilneuramínico Virus de coriomenin- CD4+ gitis Virus del dengue p65 de sulfato de heparina de tipo altamente sulfatado Ébola CD16b Virus de leucemia receptor de glicoproteína de felina envoltura extracelular (Env-SU) Virus de leucemia del receptor de GALV Mono gibon (GALV) Virus de herpes simplex receptor de glicosaminoglicano de sulfato de heparino Receptor de factor de crecimiento de fibroblasto VIH-1 CD4 receptor de quimiocina CCR5 receptor de quimiocina CXCR4 Citomegalovirus humano sulfato de heparina proteoglicano anexina II CD13 (aminopeptidasa N) Coronovirus humano receptor N de aminopeptidasa humana Influenza A, B y C receptor de hemaglutinina Virus de sarampión receptor CD46 Morbilivirus receptor CD46 Virus de la hepatitis receptores de la familia de antígeno del ratón carcinoembriónico receptor Bgla de familia de antígeno carcinoembriónico Virus de leucemia de glicoproteínas de envoltura murino Virus de herpes gamma receptor de interferón gama de murino Retrovirus de murino glicoproteína gp70 receptor Rmc-1 Coronavirus de murino receptores de familia de antígeno Virus de hepatitis de carcinoembriónico ratón Virus de enfermedad de proteína hemaglutinina-neuraminidasa Newcastle proteína de fusión Virus Pox receptor de gama interferón Virus 1 linfotrópico de glicoproteína de superficie gp46 células T Virus de vaccinia receptor TNFRp55 receptor TNFRp75 receptor de interleucina-1 beta soluble Otras enfermedades virales que pueden ser tratadas o prevenidas por los métodos de la presente invención incluyen, sin limitarse a ellas, las enfermedades provocadas por virus de hepatitis de tipo C, influenza, varicela, herpes simplex de tipo I (HSV-1), herpes simplex de tipo II (HSV-II), fiebre biliosa hematúrica, virus sincitial respiratorio, citomegalovirus, equinovirus, arbovirus, hantavirus, virus de paperas, virus de sarampión, virus de la rubéola, virus de la inmunodeficiencia humana de tipo I (VIH-1), virus de la inmunodeficiencia humana de tipo II (VIH-2), togavirus (como por ejemplo virus del Dengue) , alfavirus, flavivirus, coronavirus, virus de la rabia, virus de Marburg, virus de ébola, virus de la parainfluenza, ortomixovirus, buniavirus, arenavirus, virus de la leucemia de células T humanas de tipo T, virus de la leucemia de células T humanas de tipo II, virus de la inmunodeficiencia del simio, lentivirus, virus de Epstein-Barr, virus de herpes humano, virus de herpes cercopitecino 1 (virus B) , y poxvirus. La tabla III presenta una lista de ejemplos de proteínas de envoltura para familiares particulares de virus envueltos, que cuando se expresan junto con la(s) proteína (s) de receptor celular y se deja asociar con la(s) proteína (s) de receptor celular resulta en la formación de FRMS. Tabla III: FAMILIA EJEMPLO DE PROTEÍNAS DE ENVOLTURA Togaviridae E2 Flaviridae E Coronaviridae E2(S) Rhabdoviridae G Paramixoviridae HN, H, F Orthomyxoviridae HA Bunyaviridae Gl, G2 Arenaviridae Gl, G2 Retroviridae gpl20, gp41, gpl60 Herpesviridae - HSV gB, gD y gH - EBV gp350/220 y gp85 Poxviridae 56-Kd y 14-Kd En otras modalidades de la invención, una estructura de doble hélice de triple hebra de orthomyxoviridae (como por ejemplo influenza) , filoviridae (como por ejemplo ébola) , o bien retroviridae (como por ejemplo VIH) facilita la formación de FRMS. En otra modalidad, péptidos sintéticos pueden ser empleados para inhibir la infección viral. Por ejemplo, a título de ilustración, péptidos sintéticos que comprenden cualesquiera de las hélices helicoidales de gp41 pueden enlazarse con la región helicoidal análoga e inhibir en términos generales la capacidad de infección viral (ver, por ejemplo, Wild, C, et al., 1992, Proceedings of the National Academy of Sciences (Actas de la Academia Nacional de Ciencias), USA 89:10537; Furuta, R.A., et al., 1998, Nature Structural Biology 5:276). En otras modalidades, anticuerpos neutralizantes para inmunógenos de FRMS pueden enfocar de la misma manera estructuras involucradas en la activación de fusión. En otra modalidad de la invención, cepas virales pueden ser empleadas las cuales no requieren de un receptor de célula huésped', pero requieren solamente de un co-receptor de célula huésped para asociación con el virus. Por ejemplo, en el caso de VIH, una cepa de VIH que no requiere de CD4 para enlace viral puede emplearse en los métodos de la invención (ver, por ejemplo, Hoxie, et al., 1998, J. Reprod. Immunol. 41:197-211) . Por consiguiente, cuando se emplea una cepa de este tipo, no es necesaria la expresión de CD4. 5.5. FORMULACIONES DE VACUNA Y ADMINISTRACIÓN DE VACUNAS La presente invención se refiere también a métodos para vacunar un individuo o un animal para elevar la respuesta inmune y para prevenir una infección por un virus. Las FRMS de la presente invención pueden presentarse al vacunado de varias maneras. Las FRMS descritas arriba pueden ser administradas al vacunado como células fijas combinadas con un adyuvante. Además, se pueden administrar al vacunado FRMS aisladas y purificadas. Las FRMS pueden ser preparadas in situ por medio de la inmunización simultánea de un vacunado con células transfectadas que expresan una proteína viral y células transfectadas que expresan receptores y/o co-receptores celulares de huésped. De la misma manera, vectores que contienen ADN que codifica proteínas virales y vectores que contienen ADN que codifica proteínas de receptor pueden emplearse en esta estrategia de inmunización. Los vectores pueden incluir vectores virales como por ejemplo vaccinia y vectores empleados en inmunización de .ADN. Después de la inmunización simultánea, la interacción entre la proteína viral y la proteína de receptor celular de huésped ocurre in vivo formando la FRMS de la presente invención y exponiendo de esta forma al vacunado a los epítopos únicos capaces de provocar anticuerpos neutralizantes. Otro método a través del cual las FRMS pueden ser formadas in situ incluye el uso de los receptores y co-receptores en células huéspedes. Por ejemplo, en la preparación de las FRMS de envoltura de VIH ejemplificada que provienen de la interacción con CD4 y CCR5, células transfectadas que expresan la glicoproteína de VIH o bien vectores que contienen el ADN que codifica la proteína se inyectan en el nodo linfático de un huésped o bien se enfocan hacia el nodo linfático de un huésped (por ejemplo, por VEE o bien otros vectores) . La proteína viral se une e inicia la fusión in vivo con las células huéspedes que tienen receptores vitrales y co-receptores para formar las FRMS por lo que el vacunado se encuentra expuesto a los epítopos neutralizantes recién formados . En una modalidad específica, una formulación de vacuna comprende un complejo de proteína aislado que comprende una proteína de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 que interactúa funcionalmente con CD4 humana y CCR5 humano, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención ofrece un ' método para inmunizar un animal en cuanto a un virus que comprende los pasos de administrar al animal una formulación de vacuna que comprende un complejo de proteína que comprende una o varias proteínas virales que interactúan funcionalmente con uno o varios receptores o co-receptores celulares huéspedes para mediar el A enlace viral, la penetración viral y/o la infección viral; con lo que ' se generan anticuerpos neutralizantes para el virus. En una modalidad, la invención ofrece una formulación de vacuna que comprende (a) un primer ácido nucleico que codifica una proteína de envoltura de un virus envuelto; y (b) un segundo ácido nucleico que codifica una o varias proteínas de membrana celular, dicha proteína de envoltura y proteínas de membrana celular son necesarias y suficientes en condiciones adecuadas para la fusión de dicha envoltura del virus con una membrana celular que contiene dichas proteínas de membrana celular, de tal manera que la proteína de envoltura y las proteínas de membrana celular se expresen en el sujeto y se produzcan anticuerpos neutralizantes para el virus; y (c) un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la invención ofrece un método para el tratamiento de un huésped que ha sido expuesto a un virus o bien para prevenir la infección de un huésped por dicho virus, el método comprende los pasos de administrar al huésped anticuerpos generados por la inmunización de un animal con un complejo de proteína aislada que comprende una proteína de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 que interactúa funcionalmente con CD4 humana y CCR5 humano en una cantidad efectiva para tratar o prevenir una infección de dicho huésped. A En otra modalidad, a invención ofrece un método para la preparación de un complejo de proteína que comprende una o varias proteínas virales que interactúan funcionalmente con uno o varios receptores o co-receptores celulares de huésped para mediar el enlace viral, la penetración viral y/o la infección viral, que incluye los pasos de: a) cultivar una primera célula que expresa una o varias proteínas virales; b) cultivar una segunda célula que expresa uno o varios receptores o co-receptores celulares de huésped para dicha proteína viral o dichas varias proteínas virales; c) co-cultivar las primeras células y las segundas células; d) fijas dicho co-cultivo durante la fusión célula-célula; y e) aislar las células fijadas.

Muchos métodos pueden emplearse para introducir las formulaciones de vacuna de la invención; estos método incluyen, sin limitarse a ellos, la administración por vía oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, así como a través de escarificación (rasguño a través de las capas superiores de la piel, como por ejemplo, empleando una aguja bifurcada) . El paciente o el sujeto al cual se administra la vacuna es de preferencia un mamífero, especialmente un ser humano, pero puede ser también un animal no humano incluyendo, sin limitación, vacas, caballos, borregos, cerdos, aves (por ejemplo, pollos, cabras, gatos, perros, hámster, ratones y A ratas . El paciente o el sujeto al cual se le administra la vacuna puede ser también un animal salvaje no humano, incluye, sin limitación león, chita, elefantes, jirafas, ñu, leopardos, panteras, etc. Así, en esta modalidad, la invención ofrece un medio para manejar la vida silvestre, y proporciona un método para prevenir o tratar un animal salvaje o una población de animales salvajes que tiene un alto grado de endogamia de tal manera que estas poblaciones son altamente susceptibles a enfermedades virales. En varias modalidades de los métodos descritos aquí, el sujeto es un ser humano. En otras modalidades, dicho ser humano tiene un alto riesgo de infección por VIH. En otras modalidades, el sujeto es un animal doméstico. La presente invención ofrece por consiguiente un método para inmunizar a un animal, o bien para tratar o prevenir enfermedades virales o trastornos virales en un animal, que comprende la administración al animal de una dosis inmunizante efectiva de una vacuna de la presente invención. Las formulaciones de vacuna déla presente invención pueden también emplearse para producir anticuerpos para usurase en inmunoterapia pasiva, en donde una protección de corto plazo de un huésped se logra mediante la administración de un anticuerpo preformado dirigido contra un organismo heterólogo. La vacunación de ratones con inmunógenos que contienen FRMS de la presente invención provoca la producción de anticuerpos neutralizantes por animales inmunizados. En una modalidad de ejemplo, los complejos son administrados como vacuna que comprende células enteras fijas formuladas con un auxiliar. Será aparente a un experto en la materia sin embargo que otras estrategias de vacuna pueden emplearse en la práctica de a presente invención. Por ejemplo, FRMS aisladas y purificadas y/o epítopos de las mismas pueden administrarse con vacunas subunitarias . Además, como se mencionó previamente genes que codifican los complejos funcionales pueden ser construidos y colocados en vectores o plásmidos para su uso en vacunas de plásmido de ADN o vector vivas.

Las formulaciones de vacuna de virus de la presente invención comprenden una cantidad inmunizante efectiva de una o varias FMRS como inmunógenos de vacuna de la invención y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Se contempla también refuerzos. En una modalidad, las composiciones de vacuna de la presente invención pueden comprender "vehículos farmacéuticamente aceptables" . Como se emplea en esta descripción, vehículos farmacéuticamente aceptables son sustancias que no interfieren con la operación del inmunógeno y no son tóxicas para el animal. Vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica e incluyen, sin limitarse a ellos, solución salina, solución salina regulada, dextrosa, agua, glicerol, amortiguador acuoso isotónico estéril, emulsiones de aceite en agua o agua en aceite, composiciones acuosas, liposomas, microperlas, microsomas, o bien compuestos adyuvantes y combinaciones de los mismos. Un ejemplo de un vehículo aceptable de este tipo es un medio de cultivo fisiológicamente equilibrado que contiene uno o varios agentes de estabilización como por ejemplo proteínas estabilizadas, hidrolizadas, lactosa, etc. El vehículo es de preferencia estéril. La formulación debe adecuarse al modo de administración . La composición, si se desea, puede contener también cantidades menores de agentes de humedecimiento o emulsificantes, o bien agentes de amortiguamiento de pH. La composición puede ser una solución líquida, suspensión, emulsión, tableta, pildora, cápsula, formulación de liberación prolongada, o polvo. La formulación oral puede incluir vehículos estándares, por ejemplo grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. En general, los ingredientes son suministrados ya sea separadamente o mezclados conjuntamente en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en forma de un polvo liofilizado seco o bien un concentrado sin agua en una recipiente herméticamente sellado como por ejemplo una ampolleta o una bolsa indicando la cantidad de agente activo. Cuando la composición es administrada por inyección, una ampolleta de diluyente estéril puede suministrarse de tal manera que los ingredientes pueden mezclarse antes de la administración . En una modalidad específica, un complejo competente para fusión liofilizada de la presente invención se proporciona en un primer recipiente; un segundo recipiente comprende diluyente que consiste de una solución acuosa de 505 de glicerina, 0.25% de fenol, y un antiséptico (por ejemplo, 0.005% de verde brillante). La dosis precisa de inmunógeno o FRMS a emplear en la formulación depende también de la vía de administración y de la naturaleza del paciente, y debe decidirse de conformidad con el juicio del médico y de las circunstancias de cada paciente según técnicas clínicas estándares. Una cantidad inmunizante efectiva es la cantidad suficiente para producir una respuesta inmune al complejo en el huésped al cual se le administra el complejo dependiente de fusión, o inmunógeno de vacuna . En una modalidad específica, una cantidad inmunizante efectiva de un inmunógeno de vacuna para un sujeto humano de la presente invención se encuentra dentro del rango de 10 a 100 mg por kilogramo de peso corporal, con mayor preferencia de 0.1 a 10 mg por kilogramo de peso corporal. Se pueden también aplicar refuerzos, pero no se prefiere esta modalidad. La cantidad exacta de inmunógeno de vacuna empleada en una preparación dada no es un factor crítico, a condición que se administre la cantidad mínima necesaria para provocar una respuesta inmune. Un rango de dosificación desde aproximadamente 10 µg, hasta aproximadamente 1 miligramo o más se contempla. Como ejemplo, las dosificaciones individuales en una modalidad específica, pueden encontrarse dentro de un rango de aproximadamente 50 a 650 µg por inmunización. En otras modalidades, la dosificación depende de la formulación del inmunógeno de vacuna (por ejemplo, mimítopo purificado, vs FRMS purificada, vs preparaciones con células enteras) . En una modalidad preferida, la formulación de vacuna comprende una cantidad inmunizante efectiva del inmunógeno de FRMS, de preferencia en combinación con un inmunoestimulante; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se emplea en el presente contexto, la expresión "inmunoestimulante" abarca cualquier compuesto o' composición que tiene la capacidad de incrementar la actividad del sistema inmune, ya sea con un efecto de potenciación específico en combinación con un inmunógeno específico o bien simplemente un efecto independiente de la actividad de uno o varios elementos de la respuesta inmune. Algunos de los compuestos A in unoestimulantes más comúnmente empleados en composiciones de vacuna son los adyuvantes de alumbre o dipéptido de muramilo (MDP) y sus análogos. Métodos para utilizar estos materiales son conocidos en la técnica y se encuentran al alcance del especialista en la materia determinan una cantidad óptima de estimulante para una vacuna viral dada. Puede también desearse más que un inmunoestimulante en una formulación dada. El uso de inmunógenos purificados o bien vacuna de complejos puede efectuarse mediante métodos estándares. Por ejemplo, la(s) proteína (s) purificada (s) debe ser ajustada a una concentración apropiada, formulada con cualquier adyuvante de vacuna adecuado y empacada para su uso. Adyuvantes adecuados pueden incluir, sin limitación: geles minerales, como por ejemplo hidróxido de aluminio; sustancias tensoactivas como por ejemplo lisolecitina, polioles plurónicos; polianiones; péptidos; emulsiones de aceite; alumbre, y MDP. El inmunógeno puede también estar incorporado en liposomas, o bien combinados con polisacáridos y/u otros polímeros para su uso en una formulación de vacuna. En casos en el" cual el complejo es un hapteno, es decir, una molécula que es antigénica en que puede reaccionar selectivamente con anticuerpos análogos, pero no inmunogénica en que no puede provocar una respuesta inmune, el hapteno puede ser unido covalentemente a un vehículo o molécula inmunogénica; por ejemplo, una proteína A grande como por ejemplo albúmina sérica proporcionará inmunogenicidad al hapteno acoplado a ella. El hapteno-vehículo puede ser formulado para su uso como vacuna. Dosis efectivas (cantidades inmunizantes) de las vacunas de la invención pueden también ser extrapoladas a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba de modelo de animal. Por consiguiente, la presente invención ofrece un método para el tratamiento o la prevención de infección por un virus en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad inmunogénica de la FRMS efectiva para tratar o prevenir infección por virus. En una modalidad específica, la presente invención ofrece un método para el tratamiento o la prevención de infección por VIH en un ser humano, que comprende la administración al ser humano de una cantidad inmunogénica de la FRMS efectiva para tratar infección por VIH. La presente invención proporciona también un método para el tratamiento o la prevención de infección por un virus en un paciente, que comprende la administración al paciente de una cantidad de FRMS efectiva para tratar o prevenir la infección por el virus. En una modalidad específica, la invención proporciona un método para el tratamiento o la prevención de infección por VIH en u ser humano, que comprende la administración al ser humano de una cantidad del anticuerpo A monoclonal efectiva para tratar o prevenir la infección por VIH. 5.6 ANTICUERPOS PRODUCIDOS La presente invención se refiere a la formación de anticuerpos policlonales y monoclonales que reaccionan con una FRMS de la invención. Según la invención, la FRMS, sus fragmentos u otros derivados, o análogos de los mismos, pueden emplearse como un inmunógeno para generar anticuerpos que se unen de manera inmunoespecífica con dicho inmunógeno. Tales anticuerpos incluyen, sin limitarse a ellos, cadena policlonal, monoclonal, quimérica, única, fragmentos Fab, y una biblioteca de expresión de Fab. La presente invención se refiere también a métodos para generar una respuesta inmune, por ejemplo, la producción de anticuerpos, en un animal. En una modalidad, un animal recibe una FRMS de la invención. De preferencia, la FRMS comprende una proteína de envoltura de VIH y proviene de la interacción con CD4, y CCR5. La FRMS es administrada de tal manera que se produce una respuesta inmune en el animal al inmunógeno. De preferencia, se producen anticuerpos a epítopos en la FRMS. Con mayor preferencia, los anticuerpos producidos incluyen anticuerpos neutralizantes. En una modalidad altamente preferida, los anticuerpos producidos son capaces de neutralizar una amplia variedad de aislados primarios del virus . Varios procedimientos conocidos en la técnica pueden emplearse para la producción de anticuerpos policlonales para una FRMS o derivado o análogo. En una modalidad particular, anticuerpos policlonales de conejo para un epítopo de FRMS, una secuencia del mismo, puede no tenerse. Para la producción de anticuerpo, varios animales huéspedes pueden ser inmunizados por inyección con la FRMS nativa, o bien una versión sintética, o derivado (por ejemplo, fragmento o quimera) de la misma, incluyendo, sin limitación, conejos, ratones, ratas, etc. Varios adyuvantes pueden ser empleados para incrementar la respuesta inmunológica, según la especie huésped e incluyendo, sin limitación, adyuvante de Freund (completo e incompleto) , geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensoactivas, como por ejemplo lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones; péptidos; emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa, dinitrofenol, así como adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (Bacilo Calmette-Guerin) así como corynebacterium parvum. Para la preparación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia una FRMS, derivado o análogo de la misma, cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas de células continuas en cultivo puede empelarse. Por ejemplo, la técnica de hibridoma originalmente desarrollada por Kholer y Milstein, (Kholer et al., 1975, Nature 256:495-497), así como la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983, I munology Today 4:72), y la técnica de EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., 1985, en Monoclonal .Antibodies and Cáncer Therapy (Anticuerpos Monoclonales y Terapia del Cáncer), Alan R. Liss, Inc., Páginas 77-96) . En una modalidad adicional de la invención, anticuerpos monoclonales pueden ser producidos en animales sin gérmenes (ver, por ejemplo, PCT/US90/022548) . De conformidad con la invención, anticuerpos humanos pueden ser empleados y pueden ser obtenidos mediante el uso de hibridomas humanos (Colé et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 80: 2026-2030) o bien mediante la transformación de células B humanas con virus de EBV in vitro (Colé et al., 1985, en Monoclonal .Antibodies and Cáncer Therapy (Anticuerpos Monoclonales y Terapia del Cáncer) , Alan R. Liss, Inc., Páginas 77-96). En una modalidad específica, bazos de ratones inmunizados con FRMS son cosechados y los esplenocitos son aislados mediante la remoción del bazo en medio de cultivo. Los esplenocitos son fusionados con células de mieloma de ratón negativas para HPRT empleando polietilenglicol (PEG) . Pellas de células que contienen una proporción de 4:1 entre esplenocitos y células de mieloma son resuspendidas y tratadas en un medio exento suero que contiene 50% de PEG-4000 pre-probado (tiempo de contacto 2.5 min) . La suspensión de células es después diluida lentamente en un medio exento de suero, y las células son colocadas en placas en platos de cultivo de 96 pozos en un medio de selección HAT: medio de cultivo DMEM que contiene 20% de suero bovino fetal pre-probado, 10% de NCTC-109 (Gibco), 1% de aminoácidos no esenciales, IX glutamina y IX Pen-Strep, IX OPI (15 mg/ml de oxaloacetato, 5 mg/ml de piruvato de sodio, y 20 unidades/ml de insulina), 100 µM de hipoxantina, 0.4 µM de aminopterina, y 16 µM de timidina. Pozos que contienen hibridomas son monitoreados microscópicamente y sobrenadantes son cosechados según lo apropiado/necesario para ensayo de producción de anticuerpos. De hecho, de conformidad con la invención, las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984 Proc. Nati. Acad, Sci. USA. 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-545) mediante el empalme de genes a partir de una molécula de anticuerpo de ratón específica para una FRMS junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada puede emplearse; tales anticuerpos se encuentran dentro del alcance de esta invención. En otra modalidad, la presente invención ofrece también anticuerpos "humanizados" (Patente Norteamericana No. 5,225,539). De conformidad con esta invención, técnicas descritas para la producción de cadena única (Patente Norteamericana No. 4,946,778) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos de cadena única específicos para FRMS. Una modalidad adicional de la invención emplea las técnicas descritas para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab' (Huse et al., 1986 Science 246:1275-1281) para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos de Fab monoclonales con la especificidad deseada para proteínas supresores de tumores, derivados, análogos. Fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo de la molécula pueden ser generados por técnicas conocidas. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, sin limitarse a ellos, el fragmento F(ab')2 que puede ser producido por digestión de pepsina de la molécula de anticuerpo, los fragmentos Fab' que pueden ser generados por reducción de los puentes disulfuro del fragmento F(ab') , los fragmentos Fab que pueden ser generados mediante el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaina o un agente reductor, y fragmentos de Fv. Fragmentos Fab de bibliotecas combinatorias son también contempladas en la invención (véase, por ejemplo, Chanock et al., 1993, Infect Agents Dis. 2:118-31). En la producción de anticuerpos, el tamizado para el anticuerpo deseado puede lograrse por técnicas conocidas (ensayo inmunosorbente enlazado con enzima o bien ELISA) . Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen A específicamente FRMS, se puede ensayar hibridomas generados por un producto que se une con un epítopo de FRMS y que no se une con los epítopos generados por otras proteínas. Para la selección de un anticuerpo que se une específicamente a un primer homologo de FRMS pero que no se une específicamente a un homologo de FRMS diferente, se puede seleccionar con base en el enlace positivo con el primer homologo de FRMS y la falta de enlace con un segundo homologo de FRMS. El tamizado de anticuerpo puede también efectuarse por ensayos funcionales, como por ejemplo ensayo de neutralización de virus, tales como los conocidos en la técnica o descritos aquí . Anticuerpos específicos para un dominio de una FRMS se proporcionan también. Se proporcionan también anticuerpos específicos para un epítopo de una proteína de FRMS. Los anticuerpos generados pueden ser aislados por técnicas estándares conocidas (por ejemplo, cromatografía por inmunoafinidad, centrifugación, precipitación, etc.) y empleados en inmunoensayos de diagnóstico. Los anticuerpos pueden también emplearse para monitoréar el tratamiento y/o progresión de la enfermedad. Cualquier sistema de inmunoensayo conocido en la técnica, como por ejemplo los presentados en la lista arriba, pueden emplearse para el propósito, incluyendo, sin limitarse a ellos, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que emplean técnicas A como por ejemplo radioinmunoensayos, ELISA (Ensayos Inmunosorbentes Enlazados con Enzima) , inmunoensayo "de emparedado", reacciones de precipitina, reacciones de precipitina con difusión de gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, ensayos inmunoradiométrieos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A así como ensayos de inmunoelectroforesis, solamente para nombrar algunos. Las FRMS de la invención, cuando se emplean como inmunógenos son capaces de provocar anticuerpos neutralizantes contra patógenos vitrales. En una modalidad preferida, las FRMS provocan anticuerpos neutralizantes contra una amplia variedad de aislados primarios del virus. En una modalidad específica, las FRMS provocan anticuerpos neutralizantes para aislados primarios de VIH-1. Los anticuerpos neutralizantes, si bien no están provocados por la proteína de envoltura de VIH estática, pueden unirse por lo menos débilmente sobre la envoltura estática y son llevados con la proteína de envoltura a través del proceso de enlace y fusión, durante lo cual los anticuerpos completan su enlace de alta afinidad con estructuras intermedias críticas. Tales anticuerpos neutralizantes pueden, de hecho, ser transportados hacia el sitio crítico para estar disponibles en el momento crítico independientemente del sitio celular de acción, particularmente independientemente del sitio celular de la A fusión de membrana (ya sea en la superficie celular o bien en membranas internas tales como la membrana endosomal) . Así, proteínas de envoltura viral pueden servir como vector para llevar los anticuerpos (por ejemplo, enlazados por ejemplo a una toxina, otra proteína, inmunógenos de vacunas) en la célula, en el citoplasma o bien en la ruta de presentación de histocompatibilidad. Sobrenadantes de célula de hibridoma de la presente invenció pueden ser ensayados para determinar la capacidad de neutralizar el virus homologo así como para determinar la capacidad de neutralizar un rango de virus genéticamente diversos. La capacidad de neutralizar virus genéticamente diversos sugiere el reconocimiento por mAb de un determinante conservado. Además, mAb puede ser ensayado para determinar la inhibición de la fusión célula-célula mediada por envoltura. mAb puede también ser ensayado para determinar la capacidad de unión y/o inmunoprecipitación de proteína de envoltura y complejos asociados con receptores que contienen proteína de envoltura. Especialmente interesantes son los mAb específicos para epítopos dependientes de fusión y que se unen solamente débilmente, si es que se unen, con proteína de envoltura estática. En una modalidad, se identifican hibridomas mediante el uso de ensayo de tamizado de alto rendimiento para detectar neutralización de virus Pl, y mAbs se caracterizan para determinar el espectro y blancos moleculares de neutralización de virus Pl . En varias modalidades de la invención, los anticuerpos producidos por los métodos de la invención se emplean de manera individual (por ejemplo, mAb únicos) o bien en combinación (por ejemplo, uno o varios mAbs dirigidos hacia el mismo epítopo o hacia epítopos diferentes) . El uso de combinación de anticuerpos puede incluir varios mAbs dirigidos hacia el mismo virus o hacia virus diferentes. En algunas modalidades de la invención, puede ser provechoso emplear varios mAbs enfocados hacia el mismo virus o bien varios mAbs enfocados también hacia la misma FRMS de un virus. .7. ENSAYOS PARA ENLACE DE ANTICUERPO E INHIBICIÓN DE INFECCIÓN VRAL La capacidad de anticuerpos de la presente invención o derivados o análogos de los mismos para unirse con FRMS de la invención y por consiguiente interferir con la infección viral puede ensayarse a través de varios métodos . El enlace puede ser ensayado por medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden efectuar bioensayos en los cuales células conocidas por expresar un receptor de quimiocina están expuestas al derivado o análogo de mAb a probar y ensayar para un efecto conocido (por ejemplo, transducción de señal) . Alternativamente, mAb, derivados o análogos pueden ser probados para determinar la capacidad de enlace con receptores de quimiocina, receptores de célula huésped o proteínas de envoltura viral por procedimientos, incluyendo, sin limitarse a ellos, cromatografía por afinidad de proteína, absorción por afinidad, inmunoprecipitación, reticulación, así como método basados en bibliotecas tales como ensayo de proteína, presentación de fagos, y el sistema de dos híbridos (ver, generalmente, Phizicky et al., 1995, Microbiol. Rev 59:94-123). Tamizado de alto rendimiento de alto enlace para mAb, derivado o análogo puede efectuarse por métodos conocidos en la técnica, incluyendo citometría de flujo, sin limitarse a esta técnica. En una modalidad específica, células que expresan CD4 humano y uno de los co-receptores de VIH 8por ejemplo, CC CKR-5, CxC CKR4, CCR5, CXCR4, etc.) son tratadas con mAb biotinilado, derivado o análogo y se detecta el enlace de superficie celular con la FRMS con un conjugado avidina FITC. Alternativamente, se puede emplear un sistema de citometría de flujo en un ensayo de enlace competitivo empleando anticuerpos monoclonales de la invención de la siguiente manera o bien mediante cualquier método conocido en la técnica. En una modalidad específica, un mAb de la invención es marcado y examinado para determinar la capacidad de enlazarse con una FRMS de la invención en comparación con la capacidad de un anticuerpo de prueba para enlazarse con la misma FRMS. Anticuerpos de prueba de la invención pueden ser derivados de muestras como por ejemplo suero de un sujeto, o bien muestras de fabricación tales como sobrenadantes de hibridoma. En otra modalidad, la actividad antiviral presentada por mAb, derivado y/o análogo de mAb de la invención puede medirse, por ejemplo, a través de ensayos in vitro efectuados fácilmente que pueden probar la capacidad del compuesto para inhibir la formación de sincitios o de inhibir la infección por virus exento de célula y evaluar los efectos del compuesto sobre la proliferación y viabilidad celular. Mediante la aplicación de estos ensayos se puede determinar la actividad antiviral relativa que presenta un mAb, derivado y/o análogo del mismo contra un virus dado o una cepa de formulación de virus de inmunodeficiencia más adecuada para actividad inhibitoria específica contra virus y cepa. En una modalidad, se empela un ensayo de fusión de célula para probar la capacidad de pAb, derivado u homologo, para inhibir la formación de sincitios inducida por virus in vitro. En una modalidad específica, un ensayo de fusión de células se emplea para probar la capacidad de un derivado o análogo de mAb de la invención para inhibir la formación de sincitios inducida por VIH in vitro. En esta modalidad, dicho ensayo incluye el cultivo de células CD4+ no infectadas en presencia de células crónicamente infectadas por VIH y la composición que contiene el mAb, derivado o análogo a ensayar. En cada caso, se puede probar un rango de concentraciones. Este rango debe incluir un cultivo de control en donde no se agrega ningún mAb, derivado y/o análogo. Condiciones estándares para el cultivo, bien conocidas por parte de los expertos en la materia, se emplean. Después de la incubación durante un período apropiado de tiempo, como por ejemplo 24 horas a una temperatura de 37° C, el cultivo es examinado microscópicamente para determinar la presencia de células gigantes multinucleadas que indican la fusión de células y la formación de sincitios. En otra modalidad, un ensayo de infectividad in vitro se lleva a cabo empleando macrófagos primarios y el aislado trópico de macrófago VIH-lBaL, el primer aislado de VIH-1 trópico de macrófago descrito (ver, Gartner et al., 1986, Science 233:215). De conformidad con este ensayo, células de macrófago primarias aisladas de conformidad con métodos bien conocidos son infectadas por VIH-lBaL que ha sido propagado y mantenido solamente en macrófagos primarios. El virus de inmunodeficiencia ingresado es incubado con macrófagos primarios en presencia de concentraciones de mAb, derivado o análogo a probar. Después de un período definido de infección, el virus no unido es removido por lavado y las células son colocadas en cultivo. El nivel de replicación viral en este ensayo puede ser evaluado por técnicas conocidas, incluyendo, sin limitarse a ellos, la medición de niveles de transcriptasa reversa (RT) o al liberación de antígeno de núcleo p24 extracelular diferentes días después de la infección. Un nivel constante de inhibición de infección viral o replicación es determinado por la medición de la producción de niveles de p24 de VIH (o bien otro indicador de infección o replicación viral, como por ejemplo, transcriptasa reversa) con relación a ensayos de control efectuados en ausencia de mAb, derivado o análogo. De preferencia, mAb, derivado o análogo, reduce los niveles de virus, de conformidad con lo medido, por ejemplo, p24, en > 50% con relación a los ensayos de control efectuados en ausencia del compuesto de prueba. La presencia de p24 puede ser determinada empleando métodos conocidos tales como los ensayos inmunosorbentes enlazados con enzima comercialmente disponibles (Coulter, Hialeah, Florida; Abbott Laboratories, Hvalstad, Noruega) . Alternativamente, se puede probar la actividad transcriptasa reversa mediante el monitoreo de sobrenadante exento de células empleando técnicas estándares tales como las descritas, por ejemplo, en Goff et al. (Goff et al., 1981, J. Virol. 38:239-248) y Willey et al. (Willey et al., 1988, J Virol. 62:139-147). En otras modalidades de la invención, un mAb de la invención es ensayado en un ensayo de neutralización de aislado A primario. Varios ensayos de neutralización son conocidos en la técnica y se encuentran dentro del alcance de la invención. En una modalidad, mAbs de la invención son ensayados en un ensayo de enfoque. En una modalidad del ensayo de enfoque, un anticuerpo de prueba es incubado con una cantidad medida de virus antes de la adición del virus a las células huéspedes. La infección de las células huéspedes es medida por la tinción de dichas células por métodos inmunohistoquímicos conocidos en la técnica empleando un anticuerpo específico para la(s) proteína (s) viral (s). Generalmente, se efectúa un ensayo de control en paralelo en el cual no se emplea anticuerpo de prueba. Un anticuerpo de prueba que inhibe (por ejemplo, previene o disminuye) la infección en comparación con la infección de control es una indicación de un anticuerpo neutralizante. En otra modalidad de la invención, un ensayo de PBL puede emplearse para ensayar la neutralización por un anticuerpo de prueba. En una modalidad del ensayo de PBL, un anticuerpo de prueba es incubado con una cantidad medida de virus antes de la adición del virus a células huéspedes . Se permite la incubación de cultivos de células huéspedes durante un período de días, y la infección es ensayada mediante la medición de los viriones presentes en una muestra de sobrenadante de célula huésped. Generalmente, se efectúa un ensayo de control en paralelo en el cual no se emplea anticuerpo de prueba. Un anticuerpo de prueba que inhibe (por ejemplo, previene o disminuye) la infección en comparación con la infección de control es una indicación de un anticuerpo neutralizante. 5.7.1. MODELO DE RATÓN TRANSGÉNICO La presente invención abarca el uso de un animal transgénico no humano que expresa uno o varios componentes cuya asociación resulta en la formación de la FRMS de la invención. En modalidades específicas, los componentes cuya asociación resulta en la formación de FRMS incluye los componentes que aparecen en las listas de la Tabla II y Tabla III, del presente documento. Los" modelos de animales transgénicos de la presente invención pueden emplearse como modelos de tolerancia y/o modelos de infección. En el caso de los modelos de tolerancia, se prefiere que la totalidad de los componentes celulares importantes par la formación de las FRMS se expresen en el animal transgénico. En el caso de modelos de infección, uno o varios de los componentes importantes para la formación de la FRMS puede ser expresado de tal manera que el animal transgénico es capaz de infección por el virus a partir del cual se deriva la FRMS. Animales de cualquier especie, incluyendo, sin limitarse a ellos, ratones, ratas, conejos, conejillos de Indias, cerdos, microcerdos, cabras, borregos, y primates no humanos como por ejemplo babuinos, monos, y chimpancés pueden ser empleados para generar animales transgénicos que expresan un componente A que resulta en la formación de una FRMS. El término "transgénico", como se emplea aquí, se refiere a animales que expresan uno o varios componentes cuya asociación resulta en la formación de las secuencias de gen de FRMS a partir de una especie diferente (por ejemplo, ratones que expresan secuencias humanas que codifican uno o varios componentes cuya asociación resulta en la formación de una FRMS) , así como animales que han sido manipulados genéticamente para sobreexpresar secuencias endógenas (es decir, de la misma especie) que codifican uno o varios componentes cuya asociación resulta en la formación de una FRMS o animales que han sido manipulados genéticamente para expresar secuencias de gen endógenas que codifican uno o varios componentes cuya asociación resulta en la formación de una FRMS, es decir, animales "noqueados", y su progenie. Cualquier técnica conocida puede ser empleada para introducir un gen que codifica uno o varios componentes cuya asociación resulta en la formación de un transgen de FRMS en animales para producir las líneas de fundación de animales transgénicos. Tales técnicas incluyen, sin limitarse a ellas, microinyección pronuclear (Hoppe y Wagner, 1989, Patente Norteamericana No. 4,873,191); transferencia de gen mediado por retrovirus en líneas de gérmenes (Van der Putten, et al., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82, 6148-6152); enfoque de genes en células precursoras embriónicas (Thompson, et al., 1989, Cell 56, 313-321) ; electroporación de embriones (Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814); así como transferencia de gen mediada por esperma (Lavitrano et al., 1989, Cell 57, 717- 723) . (Para una reseña de estas técnicas, véase Gordon, 1989, Transgenic Animáis (animales transgénicos), Intl. Rev. Cytol. 115, 171-229) . Cualquier técnica conocida puede emplearse para producir clones de animales transgénicos que contienen uno o varios componentes cuya asociación resulta en la formación de un transgen de FRMS, por ejemplo, transferencia nuclear en oocitos enucleados de núcleos de células embriónicas fetales o adultas cultivadas inducidas a la quiescencia (Campbell, et al., 1996, Nature 380, 64-66; Wilmut, et al., Nature 385, 810-813) . La presente invención ofrece animales transgénicos que llevan un transgen de uno o varios componentes cuya asociación resulta en la formación de una FRMS en todas sus células, así como animales que llevan el transgen en algunas pero no en todas sus células, es decir, animales mosaicos. El transgen puede ser integrado como un transgen único o bien en concatámeros por ejemplo, tándems cabeza a cabeza o bien tándems cola a cabeza. El transgen puede también ser introducido selectivamente en un tipo de célula particular y activado en dicho tipo de célula particular de conformidad, por ejemplo, con las enseñanzas de Lasko et al. (Lasko, et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 6232-6236). Las secuencias regulatorias requeridas para dicha activación específica para tipo de célula dependerán del tipo de célula particular de interés, y será aparente a un experto en la materia. Cuando se desea que el transgen de gen sea integrado en el sitio cromosomal del gen endógeno, se prefiere un enfoque de genes. En resumen, cuando se debe de emplear una técnica de este tipo, se diseñan vectores que contienen ciertas secuencias de nucleótidos homologas con el gen endógeno para el propósito de integrar, a través de recombinación homologa con secuencias cromosomales, y trastornar la función de la secuencia de nucleótidos del gen endógeno. El transgen puede también ser introducido selectivamente en un tipo de célula particular, desactivando así el gen endógeno que codifica uno o varios componentes cuya asociación resulta en la formación de una FRMS solamente • en este tipo de célula, de conformidad, por ejemplo, con las 5 enseñanzas de Gu, et al. (Gu, et al., 1994, Science 265, 103- 106) . Las secuencias regulatorias requeridas para dicha desactivación específica para tipo de célula dependerá del tipo de célula particular de interés y será aparente al experto en la materia. • 10 Una vez que se han generado animales transgénicos, la expresión del componente recombinante cuya asociación resulta en la formación de un gen de FRMS puede ser ensayado v empleando técnicas estándares. El tamizado inicial puede ser logrado por análisis Southern blot o bien técnicas de reacción en cadena de polimerasa para analizar tejidos animales para ensayar si la integración del transgen se ha efectuado. El nivel de expresión de ARNm del transgen en los tejidos de los animales transgénicos puede también ser evaluado empleando técnicas que incluyen, sin limitación, análisis Northern blot de muestras de tejido obtenidas a partir del animal, análisis de hibridación in situ, así como RT-PCR (reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa reversa) . Muestras del tejido que expresa el gen componente pueden también ser evaluadas de manera inmunocitoquímica empleando anticuerpos específicos para el producto de transgen de componente. En una modalidad específica, la invención abarca el uso de un ratón transgénico para el desarrollo de un sistema de modelo que permite el tamizado de vacunas de prueba previstas como vacunas para una especie otra que el ratón. En una modalidad preferida, la vacuna de prueba es una vacuna prevista para un ser humano. El modelo de ratón transgénico de la presente invención un ratón construido para expresar los receptores y/o coreceptores de célula huésped de otra especie para un virus que no es nativo para un ratón. Tales ratones son provechosos para el análisis de la neutralización viral puesto que el efecto de los anticuerpos neutralizantes dirigidos hacia los receptores de célula huésped es eliminado. Estos ratones proporcionan un sistema de modelo para la tolerancia viral. Por ejemplo, un ratón transgénico puede ser construido o empleado el cual expresa receptor (es) de célula huésped humana para un virus capaz de infectar un ser humano (como por e emplo VIH) . En una modalidad de la invención, estudios de vacuna emplean ratones transgénicos que expresan co-receptor de CD4 y CCR5 humano bajo el control de elementos regulatorios de CD4 que restringen la co-expresión a timocitos y linfocitos T auxiliares (Killeen et al., 1993, EMBO J., 12:1547-53). Estos ratones se emplean con el objeto de permitir el análisis de la neutralización del virus sin el efecto de confusión provocando por la neutralización de anticuerpos dirigidos contra CD4 o CCR5. En cuanto a ese aspecto, la respuesta inmune imita la respuesta inmune que se observa en los seres humanos; se restringen los epítopos inmunogénicos a la envoltura y a conformaciones dependientes de VIH de CD4 y co-receptor. Aun cuando restricciones posteriores a la entrada para la replicación de VIH han limitado hasta la fecha la utilidad de estos ratones para estudios de infectividad, la presente invención ofrece un uso novedoso como sistema para el análisis de vacunas de VIH. En este modelo, los transgenes funcionan solamente para proporcionar tolerancia a los componentes de CD4 y CCR5 humanos de la vacuna. Con el objeto de llevar a cabo el ensayo, ratones transgénicos son inmunizados una o varias veces con la FRMS de la invención. Opcionalmente, se pueden emplear inmunógenos de control para vacunar otros ratones que sirven como control. El inmunógeno de FRMS puede encontrarse en cualesquiera de las formas descritas aquí incluyendo en lisado de célula, en solución, en una estructura reticulada, aislada, purificada, etc. El inmunógeno de FRMS puede también ser introducido al ratón en una formulación de vacuna. Después, sueros o anticuerpos producidos a partir de ratones inmunizados con FRMS o inmunógenos de control se recogen y ensayan para determinar la capacidad de neutralizar virus Pl .

El suero se recoge a un momento apropiado después de la inmunización para permitir la producción de una respuesta inmune en el ratón. Estos tiempos son bien conocidos en la técnica. En una modalidad, el suero se obtiene 2 semanas después de cada inmunización. De preferencia, suero o anticuerpos se probaron para determinarla capacidad de neutralizar dos, tres o cuatro aislados primarios del virus. Con mayor preferencia, sueros o anticuerpos son probados para la capacidad de neutralizar cuatro, seis, ocho aislados primarios del virus. Con mayor preferencia, suero o anticuerpos son probados para determinar la capacidad de neutralizar 10-15, 15-25, o más aislados primarios del virus . La neutralización del aislado primario puede ser ensayada por métodos conocidos en la técnica incluyendo los presentados aquí. En una modalidad, la neutralización es determinada por la inhibición de la capacidad de infectar asociada con la incubación del anticuerpo de prueba con una muestra del virus a emplear en la infección. Un anticuerpo que inhibe (por ejemplo disminuye o bloquea) una infección viral es una indicación de un anticuerpo neutralizante. En otras modalidades, sueros o anticuerpos son probados para determinar la capacidad de inhibir la formación de sincitios o para inhibir la infección por virus exentos de células y evaluar los efectos del compuesto sobre la proliferación celular y la viabilidad. En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo de prueba es un anticuerpo monoclonal. En una modalidad más preferida de la invención, el anticuerpo de prueba es un anticuerpo monoclonal humano producido en respuesta a un inmunógeno de FRMS. Como será aparente a un experto en la materia, poca o ninguna inhibición de la infectividad o actividad de neutralización se espera en sueros o anticuerpos obtenidos de ratones inmunizados con inmunógenos de control. En otras modalidades de la invención, un ensayo de neutralización de virus se efectúa sobre más que un aislado primario. En modalidades preferidas, ensayos de neutralización de virus se efectúan en 2-5, 5-10, 10-15 aislados primarios. En una modalidad más preferida, los ensayos de neutralización se efectúan en 10-15, 20-30 o 30 o más aislados primarios. En otra modalidad preferida, los aislados primarios ensayados son de más que una clase viral. La neutralización puede caracterizarse en términos de neutralización porcentual de un numero de aislados primarios. En general, en esta modalidad, un ensayo único se emplea para evaluar la neutralización de anticuerpos. En una modalidad, un anticuerpo de la presente invención neutraliza 30-40%, 40-50%, o bien 50-60% de los aislados primarios del virus. En una modalidad preferida, un anticuerpo de la invención neutraliza 60-75%, 70-85%, o bien 80-90% de los aislados primarios del virus. En una modalidad más preferida, un anticuerpo de la invención neutraliza 90-95% 95-98%, o bien 99-100% de los aislados primarios del virus. En modalidades preferidas, cuando se evalúan mAb para la neutralización de aislados primarios, la neutralización es expresada como el número de foci en la presencia de mAb (o bien sobrenadante de hibridoma) con relación al número en presencia del medio solo. En una modalidad específica, ratones transgénicos (hu CD4+, hu CCR5+, CD4+ de ratón) son inmunizados con un inmunógeno de FRMS de VIH (COS-env reticulado co-cultivado con células U87-CD4-CCR5) o bien con controles de célula (células U87-CD4-CCR5 solas o bien co-cultivadas con células COS transfectadas de manera ficticia) . La sensibilidad del virus 168P homólogo a la neutralización por suero de vacuna se determina con células U87-CD4 que expresan ya sea co-receptor de CCR5 o bien CXCR4 (ver, LaCasse, et al., 1998, Science 72:2491; Follis, K.E., et al., 1998, Journal of Virology 72:7603). En otra modalidad específica de la invención, en donde se emplean aislados primarios de VIH en un ensayo de neutralización, tales aislados primarios pueden incluir, sin limitarse a ellos, 92US657, 92US660, 92TH014, 89.6, 320NSI, 320SI, SHIV89.6P, 168P, 92RW023, 92UG031, 92UG037, 92RW008, 93IN101, 93IN999, 93IN905, 93IN904, 92UG035, 92UG021, 92UG024, 92UG046, 92TH023, 92TH024, 93TH051, y 93TH053.

En una modalidad de la invención, un anticuerpo producido por una FRMS de VIH por los métodos de la invención (ver sección 5.6) puede neutralizar 60-70%, 70-80%, 80-85% de tales aislados primarios de VIH. En una modalidad preferida, un anticuerpo producido para una FRMS de VIH puede neutralizar 80-90%, 90-95%; o 95-99% de tales aislados primarios de VIH. En una modalidad más preferida, un anticuerpo producido para una FRMS de VIH puede neutralizar el 100% de tales aislados primarios de VIH. En otra modalidad específica, aislados primarios de VIH pueden incluir uno o varios aislados de clases A, B, C, D, E, F, G, H, o bien I. En otras modalidades, aislados primarios de VIH pueden incluir uno o varios aislados de un grupo M, un grupo 0, grupo N. En otra modalidad, la actividad de neutralización puede ser demostrada como mediada por anticuerpos por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede adsorber sueros sobre un soporte sólido que contiene proteína A y proteína G. En el caso en el cual un anticuerpo es responsable de la actividad de neutralización de virus del suero, suero sin proteínas de enlace con proteína A y proteína G contendrá poca o ninguna actividad de neutralización de virus, mientras que un producto eluido del soporte sólido de proteína A y proteína G contendrá una actividad de neutralización de virus. Por consiguiente, la presente invención ofrece un método para tamizar una estructura molecular para eficacia de vacuna, que comprende la inmunización de un mamífero no humano transgénico con la estructura molecular, en donde dicho mamífero no humano transgénico expresa uno o varios transgenes tanto CD4 humano como un co-receptor para VIH, y la detección de cualquier anticuerpo neutralizante para VIH producido por dicho mamífero. La invención ofrece también un método para tamizar una estructura molecular para eficacia de vacuna, que comprende la inmunización de un mamífero no humano transgénico con la estructura molecular, en donde dicho mamífero no humano transgénico expresa uno o varios transgenes, dicha proteína o dichas proteínas de membrana celular de huésped; y la detección de cualquier anticuerpo neutralizante para dicho virus producido por dicho mamífero. 5.7.2. DETERMINACIÓN DE EFICACIA DE VACUNA La in unopotencia del inmunógeno o de varios inmunógenos de la invención puede determinarse mediante el monitoreo de la respuesta inmune de animales de prueba después de inmunización con la F.RMS mediante el uso de cualquier inmunoensayo conocido en la técnica. La generación de una respuesta humoral (anticuerpo) y/o inmunidad de mediada por célula, debe considerarse como una indicación de una respuesta inmune. .Animales de prueba pueden incluir ratones, hámster, perros, gatos, monos, conejos, chimpancés, etc., y eventualmente sujetos humanos. De conformidad con lo' descrito en la Sección 5.10 aquí, métodos para introducir la vacuna pueden incluir vías de inmunización oral, intracerebral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal o bien otras vías de administración estándares. La respuesta inmune de los sujetos de prueba puede ser analizada por varios enfoques tales como: la reactividad del suero inmune resultante al inmunógeno de la invención, de conformidad con lo ensayado por técnicas conocidas, por ejemplo, ensayo inmunosorbente enlazado con enzima (ELISA), inmunoabsorción, ensayos radioinmunes (RÍA) , A radioinmunoprecipitaciones, etc. Alternativamente, la protección de huéspedes inmunizados contra infección por el patógeno y/o la atenuación de los síntomas debido a la infección por el patógeno en huéspedes inmunizados puede servir como evidencia de eficacia de la vacuna. Como ejemplo de prueba de animal adecuada de vacuna viral, la vacuna de la presente invención puede ser probada en conejos para determinar la capacidad de inducir una respuesta de anticuerpo al inmunógeno de FRMS. Se pueden emplear conejos New Zeland White adultos jóvenes machos sin patógeno específico (SPF) . El grupo de prueba puede recibir una concentración fija de la vacuna. Un grupo de control recibe una inyección de 1 mM de Tris-HCl pH 9.0 sin el inmunógeno de FRMS. Muestras de prueba pueden ser extraídas de los conejos cada semana o cada dos semanas, y el suero puede ser analizado para determinar la presencia de anticuerpos para FRMS. La presencia de anticuerpos específicos para el inmunógeno puede ser ensayada, por ejemplo, empleando un ensayo ELISA. En una modalidad preferida de la invención, prueba con animales de la eficacia de la vacuna viral se efectúa mediante el uso de modelo de ratón transgénico de conformidad con lo descrito en la sección 5.7.1. La invención ofrece también métodos para optimizar y cuantiflcar vacunas que comprenden las FRMS de la presente invención. De preferencia, los complejos se preparan empleando células autólogas sin reactividad con relación a los componentes celulares de huésped. Las composiciones de vacuna que comprenden complejos preparados empleando células no autólogas, sin embargo, pueden evaluarse empleando animales transgénicos genéticamente manipulados para que sean tolerantes a los componentes celulares de huésped de los complejos. Empleando estos animales transgénicos es posible determinar si el éxito logrado por la vacunación con los complejos de fusión de la presente invención se debe a epítopos competentes para fusión novedosos presentados por los complejos. Por ejemplo, en una modalidad preferida, las FRMS resultan de la interacción de proteína de envoltura viral de VIH (168P) y las proteínas humanas CD4 y CCR5. De conformidad con lo descrito en la sección 6, composiciones de vacuna han sido probadas en ratones transgénicos genéticamente manipulados para ser tolerantes a los componentes humanos de la vacuna. Ratones que expresan tanto el receptor CD4 humano como el co-receptor CCR5 humano fueron empleados para evaluar el complejo y demostrar que el anticuerpo neutralizante generado fue contra epítopos inmunológicos restringidos a la proteína de envoltura o conformaciones dependientes de VIH de CD4 y co-receptor. Se observa que estos ratones transgénicos fueron originalmente empleados como un modelo de ratón para infección por VIH. El uso de animales transgénicos para tamizar inmunógenos de vacuna es un uso novedoso de estos ratones. Los ratones transgénicos que presentan tolerancia a porciones de huésped de vacunas pueden emplearse para optimizar componentes de vacuna, probar variantes y evaluar adyuvantes . Además, será aparente a un experto en la materia que este principal puede ser aplicado a cualquier modelo viral para proporcionar métodos rápidos y seguros para tamizar vacunas virales. Adicionalmente, será aparente que animales transgénicos otros que ratones transgénicos pueden ser empleados para tamizar vacunas candidatos. En una modalidad, la invención ofrece un método para tamizar una estructura molecular para eficacia de vacuna, que comprende la inmunización de un mamífero no humano transgénico con una estructura molecular que comprende un epítopo formado como resultado de la asociación de (a) una proteína de envoltura de un virus envuelto, con (b) una o varias proteínas de membrana celular, dicha proteína de envoltura y proteínas de membrana celular son necesarias y suficientes en condiciones adecuadas para la fusión de dicha envoltura del virus con una membrana celular que contiene dichas proteínas de membrana celular, en donde dicho mamífero no humano transgénico expresa a partir de dicho o dichos transgen (es) dicha proteína de membrana celular de huésped o dichas proteínas de membrana celular de huésped; y la detección de cualquier anticuerpo neutralizante para dicho virus producido por dicho mamífero. En una modalidad preferida, la estructura molecular es aislada. En una modalidad específica, la invención ofrece un método para tamizar una estructura molecular para eficacia de vacuna que comprende la inmunización de un mamífero no humano transgénico con una estructura molecular que comprende un epítopo formado como resultado de la asociación de (a) una proteína de envoltura de VIH, o bien un mutante de la misma que se ensambla en la envoltura viral; con (b) CD4 humano y un co-receptor para fusión de VIH, en donde dicho mamífero no humano transgénico expresa uno o varios transgenes tanto CD4 humano como un co-receptor para VIH, y la detección de cualquier anticuerpo neutralizante para VIH producido por dicho mamífero. En una modalidad preferida, el mamífero es un ratón. En otra modalidad preferida, la estructura molecular es aislada. 5.8. USOS PARA .ANTICUERPOS Los anticuerpos generados por las formulaciones de vacuna de los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse en métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos generados contra las FRMS o inmunógeno de vacuna por inmunización con las FRMS de la presente invención tienen también usos potenciales tales como inmunoensayos de diagnóstico, inmunoterapia pasiva, descontaminación viral, tratamiento antiviral y prevención y generación de anticuerpos anti-idiotípicos. La presente invención abarca también anticuerpos que son provocados por los epítopos novedosos de las FRMS de la presente invención contienen anticuerpos útiles como estándares de referencia y componentes en ensayos de diagnóstico y conjuntos de elementos de diagnóstico. Además, mAb para las FRMS de la presente invención pueden emplearse como estándares de referencia, agentes de diagnóstico para bioensayos in vitro e in vivo y como marcadores para determinantes críticos en fusión y unión. Por ejemplo, durante la producción a gran escala de las FRMS de la invención, los mAb de la presente invención son útiles para determinar la cantidad de FRMS que se produce en cada lote. En esta modalidad, los mAb pueden emplearse para determinar la cantidad de variación de lote a lote (por ejemplo por ELISA o RÍA empleando mAb) . Alternativamente, se puede emplear FRMS marcada, a través de un ensayo de competencia con la FRMS de prueba para enlazar un mAb específico para la FRMS. Ensayos similares pueden ser empleados para determinar el título de anticuerpo de una muestra de suero de un sujeto. En un ensayo de este tipo, una muestra de suero de un sujeto se toma en un momento dado después de la administración de la vacuna de la invención. El suero de muestra después probado A. para determinar su capacidad de neutralizar un virus. El suero puede también ser probado para determinar su capacidad de enlazarse con la FRMS de inmunógeno, o bien para competir con un mAb neutralizante para enlace con la FRMS de inmunógeno. La incapacidad o capacidad débil de la muestra de suero de neutralizar el virus o de enlazarse con FRMS ofrece una indicación que sería deseable para el sujeto efectuar vacunas de refuerzo con el inmunógeno de FRMS. Por consiguiente, la presente invención ofrece un método para monitorear la producción de anticuerpo para la estructura molecular en un sujeto que recibió previamente una cantidad de la estructura molecular que comprende el aislamiento a partir de dicho sujeto de una muestra que contiene suero; y la detección de la presencia de anticuerpos para la estructura molecular en dicho suero. En una modalidad, la detección se efectúa a través de un método que comprende la realización de un inmunoensayo competitivo con anticuerpo marcado para la estructura molecular. Además, sueros policlonales o bien anticuerpos monoclonales pueden ser administrados a individuos para los propósitos de tratar o prevenir una infección viral y sus secuencias. En modalidades particulares, dicho anticuerpo puede ser administrado para propósitos de profilaxis después de la exposición o bien para evitar la transferencia materna de virus al neonato a través de una inmunización pasiva. mAb humanizados de la presente invención pueden emplearse para proteger contra la transmisión de virus de madre a infante o bien en profilaxis o tratamiento después de exposición. Los mAb de la presente invención son también útiles en estudios de inmunización pasiva en un modelo de ratón hu-PBL-scid de infección por VIH y en estudios de SHIV en macacos rhesus. Por consiguiente, la presente invención ofrece un método para el tratamiento o la prevención de infección por VIH en un feto humano, que comprende la administración a una mujer embarazada que contiene dicho feto de una cantidad del anticuerpo monoclonal efectiva para tratar o prevenir infección por VIH en dicho feto. La producción de mAb para la FRMS de la presente invención puede emplearse para delinear adicionalmente la ruta bioquímica e inmunoquímica hacia la infección, y para definir los epítopos críticos para neutralización de virus de Pl . Anticuerpos monoclonales ( Ab) generados para la FRMS de la presente invención pueden ser empleados para determinar la base biológica para el enlace y la penetración, y la base inmunoquímica para la neutralización de virus de aislado primario. En esta modalidad, se deben seleccionar inmunógenos para el desarrollo de rrAb que son excelentes en cuanto a estudios de inmunogenicidad en modelos de vacunación, son potentes y provocan un amplio rango de anticuerpos neutralizantes de virus de aislados primarios. Los anticuerpos de la presente invención pueden también emplearse en la producción de anticuerpo antiidiotípico. El anticuerpo antiidiotípico puede a su vez ser empleado para inmunización, con el objeto de producir una subpoblación de anticuerpos que se unen al antígeno inicial del microorganismo patogénico (Jerne, 1974, 7Ann. Immunol. (París) 125c:373; Jerne, et al., 1982, EMBO J. 1:234). Además, se puede emplear mAb como agente antiviral en sangre y productos de sangre. La presente invención ofrece anticuerpos neutralizantes que son útiles como un aditivo para la descontaminación de sangre y productos sanguíneos contaminados o sospechados de ser contaminados por un virus. Por ejemplo, el mAb de la invención es útil como un aditivo para sangre de donante (por ejemplo, sangre en un banco de sangre) que debe ser empleado en el tratamiento de un sujeto. El mAb de la presente invención es útil como aditivo para bolsas de recolección de sangre, guantes, recipientes de recolección de muestras de sangre. En una modalidad específica de la invención, uno o varios mAb(s) de la invención se emplean para limpiar el canal de parto antes del parto de un niño con el objeto de evitar una infección perinatal. Cantidades efectivas de mAb de la invención para aditivos para sangre y producto sanguíneo incluyen de 1 µg/ml a 10 mg/ml. Como será evidente a un experto en la materia, cantidades efectivas serán influenciadas por afinidad de anticuerpo, aditivos, y formulaciones. Cualquier cantidad puede ser empleada de tal manera que la cantidad efectiva pueda inhibir (por ejemplo, reducir o prevenir) una infección viral. En una modalidad preferida, se emplea en descontaminación una mezcla de mAb neutralizante contra varios virus. En una modalidad específica, una cantidad efectiva de un mAb neutralizante de la invención que es inmunoespecífico para VIH se agrega a la muestra de sangre humana antes de la transfusión de dicha sangre en un paciente receptor. En esta modalidad, el VIH es neutralizado por mAb. Por consiguiente, la presente invención ofrece una muestra de sangré de mamífero a la cual se ha agregado una cantidad de anticuerpo efectiva para inhibir o disminuir la infección por el virus. En una modalidad específica, la presente invención proporciona una muestra de sangre humana, a la cual se ha agregado una cantidad de anticuerpo que es efectiva para inhibir o disminuir una infección por VIH. La presente invención ofrece también un método para inhibir la infección por un virus en una muestra de sangre que comprende la puesta en contacto de dicha muestra de sangre con una cantidad del anticuerpo monoclonal efectiva para inhibir la infección por dicho virus. En una modalidad específica, la presente invención proporciona un método para inhibir una infección por VIH en una muestra de sangre humana, que comprende la puesta en contacto de dicha muestra de sangre humana con una cantidad de anticuerpo monoclonal efectiva para inhibir la infección por VIH. Los anticuerpos neutralizantes de la presente invención son también útiles para descontaminar cualquier objeto expuesto al virus hacia el cual se enfoca el anticuerpo. Objetos que pueden ser descontaminados con el mAb de la invención incluyen, sin limitarse a ellos, herramientas quirúrgicas y dentales (como por ejemplo taladros, ganchos, escalpelos, etc) . En una modalidad preferida, una mezcla de mAb neutralizante contra varios virus se emplea en procesos de descontaminación. En una modalidad preferida, objetos no fácilmente desechables (por ejemplo, herramientas auxiliada por computadora, herramientas auxiliadas por robótica, herramientas especializadas, etc) son descontaminados con uno o varios mAbs de la invención. Cantidades efectivas del mAb de la invención para descontaminación incluyen de 1 µg/ml a 10 mg/ml. Como será evidente á un experto en la materia, cantidades efectivas serán influenciadas por afinidad de anticuerpo, aditivos y formulaciones. Cualquier cantidad puede ser empleada de tal manera que la cantidad efectiva sea capaz de inhibir una infección viral después de descontaminación. En una modalidad específica, el VIH es neutralizado en la descontaminación. Por consiguiente, la presente invención ofrece un método para descontaminar herramientas quirúrgicas o dentales, que comprende la puesta en contacto de dichas herramientas con una cantidad de anticuerpo monoclonal efectiva para inhibir la infección por dicho virus. En una modalidad específica, la presente invención ofrece un método para descontaminar herramientas quirúrgicas o dentales, que comprende la puesta en contacto de dichas herramientas con una cantidad de ^ anticuerpo monoclonal efectiva para inhibir infección por VIH. En otra modalidad de la presente invención, anticuerpos enfocados hacia una FRMS pueden emplearse para tamizar moléculas que comprenden un epítopo reconocido por el anticuerpo. Por ejemplo, un mAb de la presente invención puede emplearse para tamizar pequeñas moléculas para determinar la presencia de un epítopo reconocido por anticuerpo. Un enlace de mAb sobre las pequeñas moléculas indica la presencia de dicho epítopo en la pequeña molécula. Tales pequeñas moléculas a su vez pueden ser probadas como inmunógenos o bien agentes terapéuticos potenciales. En otra 5 modalidad, los mAbs de la invención pueden ser empleados para identificar péptidos que se unen sobre el anticuerpo (por ejemplo, a partir de una biblioteca de presentación de fagos) . Tales péptidos pueden ser probados, por ejemplo, para determinar su inmunogenicidad (es decir, como mimetopos) . ^ 10 Los mAb de la presente invención son también útiles como agente antiviral en productos contraceptivos o microbicidas. La adición de uno o varios mAb de la invención a un producto A contraceptivo o microbicida se prefiere particularmente en el caso de virus que se sabe son transmitidos sexualmente. Así, la invención ofrece un producto contraceptivo que comprende una cantidad efectiva de uno o varios pAb(s,> neutralizantes de la invención. Productos contraceptivos o microbicidas a W los cuales se puede agregar los mAb de la invención incluyen, sin limitarse a ellos, cremas, espumas, ungüentos, geles, condones, diafragmas, etc. Los productc= contraceptivos pueden comprender además un agente espermicida. En una modalidad preferida, una mezcla de mAbs neutralizantes contra varios virus se emplea en el producto contraceptivo. Cantidades efectivas de mAb de la presente invención para productos contraceptivos o microbicidas incluyen de 1 µg/ml a 10 mg/ml. Como será aparente a un experto en la materia, cantidades efectivas serán influenciadas por afinidad de anticuerpos, aditivos y formulaciones cualquier cantidad puede ser empleada de tal manera que la cantidad efectiva sea capaz de inhibir (por ejemplo, reducir o prevenir) la infección viral. Por ejemplo, para el uso en un contraceptivo antiviral, una cantidad efectiva es una cantidad que puede inhibir la infección en una exposición por transmisión sexual de un virus. En una modalidad específica, los productos contraceptivos o microbicidas comprenden mAb de la presente invención inmunoespecífico para VIH o bien otro virus sexualmente transmitido. Por consiguiente, la presente A invención ofrece un contraceptivo o microbicida en forma de un gel, espuma, crema, o en forma de un ungüento, que comprende una cantidad del anticuerpo de la invención efectiva para inhibir o disminuir la infección por el virus. En una modalidad específica, la presente invención proporciona un contraceptivo o microbicida en forma de un gel, espuma, crema, o bien de un ungüento que comprende una cantidad del anticuerpo de la invención efectiva para inhibir o disminuir una infección por VIH. 5.9. COMPOSICIONES TERAPÉUTICAS La presente invención proporciona métodos para provocar la producción de anticuerpos anti-FRMS en un sujeto mediante la administración de una FRMS. Cualesquiera de las FRMS de la invención, y fragmentos, análogos y derivados funcionalmente activos de la misma; ácidos nucleicos que codifican la FRMS de la invención, y fragmentos funcionalmente activos y derivados de la misma; así como anticuerpos que se unen de manera inmunoespecífica a una FRMS pueden emplearse como agentes terapéuticos (se conoce aquí como "agente terapéutico") . La presente invención ofrece también composiciones farmacéuticas. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente terapéutico, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia regulatoria del Gobierno Federal o Estatal o bien que aparece en la lista de la Farmacopea Norteamericana o bien otras farmacopeas generalmente reconocidas para su uso en animales, y más particularmente para su uso en seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o bien vehículo con el cual se administra el agente terapéutico. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles como por ejemplo agua y aceite, incluyendo los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, como por ejemplo aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí, y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra de manera intravenosa. Soluciones salines y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol pueden también emplearse como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sucrosa, gelatina, malta, arroz, harina, gis, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada seca, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, puede contener también cantidades menores de agentes de emulsificación o humidificación, o bien agentes de regulación de pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida, y similares. La composición puede ser formulada como supositorio, con aglomerantes tradicionales y vehículos tales como triglicéridos. Las formulaciones orales pueden incluir vehículos estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martín. Tales composiciones que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva del agente terapéutico, de preferencia en forma purificada, junto con una cantidad adecuado de vehículo con el objeto de proporcionar la forma adecuada para una administración apropiada al paciente. La formulación debe ser adecuada al modo de administración. En una modalidad preferida, la composición se formula de conformidad con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, composiciones para administración intravenosa son soluciones en amortiguador acuoso isotónico estéril. En caso necesario, la composición puede incluir también un agente de solubilización y un anestésico local como por ejemplo lignocaína para controlar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se A. suministran ya sea de manera separada o bien mezclados conjuntamente en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en forma de un polvo liofilizado seco o bien concentrado anhidro en un recipiente herméticamente sellado como por ejemplo una ampolleta o una bolsa indicando la cantidad de agente activo. Cuando la composición debe ser administrada por infusión, puede ser suministrada con una botella de infusión que contiene agua de grado farmacéutico estéril o bien una solución salina. Cuando la composición es administrada por inyección, se puede proporcionar una ampolleta de agua estéril para inyección o solución salina de tal manera que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración.

Los agentes terapéuticos de la presente invención pueden ser formulados como formas neutrales o bien formas de sal. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales formadas con grupos amino libres tales como las derivadas de ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con carboxilo libres tales como las derivadas de hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino, etanol, histidina, procaína, etc. 5.10. TERAPIA GÉNICA La terapia génica se refiere a una terapia efectuada mediante la administración de una molécula de ácido nucleico a un sujeto. En esta modalidad de la invención, la(s) molécula (s) de ácido nucleico produce su(s) proteína (s) codificada (s) y media un efecto terapéutico mediante la formación de una FRMS in vivo . En una modalidad específica, una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica uno o varios componentes cuya asociación resulta en la FRMS de la invención o un derivado funcional de la misma, se administran para producir una respuesta inmunológica a la FRMS, a través de una terapia génica. En modalidades más específicas, un ácido nucleico o ácidos nucleicos que codifican una proteína en envoltura viral de un virus de envoltura, un receptor de célula huésped, y un co-receptor de célula huésped o derivados funcionales de los mismos, se administran a través de terapia génica. En otra modalidad, una proteína de envoltura viral de un virus de envoltura se administra a través de la terapia génica. Cualesquiera de los métodos para terapia génica disponibles en la técnica puede emplearse de conformidad con la presente invención. A continuación se describen métodos a título de ejemplo. Para reseñas generales de los métodos de terapia génica, véase Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, biotherapy 3:97-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Sience 260:926-932; Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; and May, 1993, TIBTECH 11:155-215). Métodos comúnmente conocidos en la técnica para tecnología de .ADN recombinante que pueden emplearse se describen en Ausubel et al. (eds), 1993, Current Protocols in Molecular Bi ology, (protocolos actuales en biología molecular) , John Wiley & Sons, NY) y Kriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual , (transferencia y expresión de genes, un manual de laboratorio), Stockton Press, NY. En una modalidad específica preferida, el agente terapéutico comprende una proteína de envoltura de VIH y/o receptor CD4 humano, y un co-receptor (como por ejemplo un receptor de quimiocina CCR5 o CXCR4) en un huésped adecuado. En una modalidad particular, se emplearon una modalidad de ácido nucleico en la cual se suministra una secuencia de codificación de proteína de envoltura de VIH a un sujeto, dicho sujeto expresa CD4 nativo y un co-receptor nativo. La administración del ácido nucleico en un paciente puede efectuarse ya sea de manera directa, en su caso el paciente se encuentra expuesto directamente al ácido nucleico o a un vector que lleva ácido nucleico, o bien de manera indirecta, en dicho caso, las células son transformadas primero con el ácido nucleico in vi tro, y después transplantadas en el paciente. Estos dos enfoques son conocidos, respectivamente como terapia génica in vivo y ex vivo. En una modalidad específica, el ácido nucleico es administrado directamente in vivo, en donde es expresado para producir el producto codificado. Esto puede lograrse por cualesquiera de varios métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante su construcción como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y su administración de tal manera que se vuelva intracelular, por ejemplo, por infección empleando un vector retroviral defectuoso o atenuado o bien otro tipo de vector viral (véase, por ejemplo, patente norteamericana número 4,980,276) o bien mediante inyección directa de mezcla .ADN desnudo o bien mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, pistola génica; Biolistic, Dupont) , o bien revestimiento con líquidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección, o bien mediante la encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas, o bien mediante su administración en el enlace con un péptido el cual se sabe que penetra en el núcleo o bien mediante su administración en un enlace con un ligando sometido a una endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), que puede emplearse para enfocar tipos de células que expresan específicamente los receptores, etc. En otra modalidad, un complejo de ácido nucleico-ligando puede ser formado en el cual el ligando comprende un péptido viral isogénico que trastorna los endosomas evitando la A degradación liposo al del ácido nucleico. En otra modalidad, el ácido nucleico puede ser enfocado in vi vo para absorción específica para célula y expresión mediante el enfoque de un receptor especifico véase, por ejemplo publicaciones de patentes internacionales WO 92/06180 por Wy et al., WO 92/22635 por Wilson et al., WO 92/20316 por Findeis et al., WO 93/14188 por Clarke et al . , y WO 93/20221 por Young). Alternativamente, el ácido nucleico puede ser introducido intracelularmente e incorporado dentro de ADN de célula huésped para su expresión por recombinación homologa (Koller y Smithies, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935, Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438). En una modalidad especifica, un vector viral que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína de envoltura viral, y proteína (s) de membrana de célula huésped (por ejemplo, receptor (es) de célula huésped) se emplean. Cualesquieran de los vectores descritos en la sección 5.1.2 puede emplearse para propósitos de terapia génica. Por ejemplo se puede emplear un vector retroviral (véase Miller et al., 1993, Meth enzymol. 217:581-599). Estos vectores han sido modificados para remover secuencias retrovirales que no son necesarias para empacar el genoma viral y para la integración en .ADN de célula huésped. Otras referencias que ilustran el uso de vectores retrovirales en terapia génica incluyen: Clowes et al., 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651, Kiem et al., 1994, A Blood 83:1467-1473, Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141, y Grossman y Wilson, 1993, Curr. Opin. In Genetics y Devel. 3:110-114. De conformidad con lo descrito en la sección 5.1.2 los adenovirus son otros vectores virales que pueden ser empleados en terapia génica. Los adenovirus son vehículos especialmente atractivos para suministrar genes al epitelio respiratorio. Los adenovirus infectan naturalmente el epitelio respiratorio en donde provocan una enfermedad leve. Otros blancos para sistemas de administración basados en adenovirus son el hígado, el sistema nervioso central, las células endoteliales y los músculos. Los adenovirus tienen la ventaja de poder infectar células que no se está dividiendo.

Kozarsky y Wilson, 1993, Current Opinión in Genetics and Development (opinión actual en genética y desarrollo) 3:499-503 presentan una reseña de la terapia génica basada en adenovirus. Bout et al., 1994 Human Gene Therapy (terapia génica humana) 5:3-10, demostraron el uso de vectores de adenovirus para transferir genes al epitelio respiratorio de monos rhesus. Otros casos del uso de adenovirus en terapia génica pueden encontrarse en Rosenfeld et al., 1991, Science 252-431-434, Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155, and Mastrangeli et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:225-234. El virus asociado con adeno (AAV) también ha sido propuesto para su uso en terapia génica (Walsh et al., 1993, Proc. Soc. Exp. Biol. Med 204:289-300). Otro enfoque de la terapia génica incluye la transferencia de un gen en células en cultivo tisular por métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio, o bien infección viral. Cualquier método conocido en la técnica para transferir un gen en una célula puede emplearse con relación al aspecto de terapia génica de la invención, incluyendo, sin limitarse a ellcs, los métodos descritos en la sección 5.1.2. Habitualmente, el método de transferencia incluye la transferencia de un marcador seleccionable a las células. Las células son después colocadas bajo selección para aislar las células que han absorbido y están expresando el gen transferido. Estas células son después administradas a un paciente. En esta modalidad, el ácido nucleico es introducido en una célula amplia de la administración in vi vo de la célula recombinante resultante. Dicha administración puede 5 efectuarse por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo sin limitarse a ellos, transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o bacteriófago que contiene las secuencias de ácido nucleico, fusión celular, transferencia de gen mediada por '=" 10 cromosoma, transferencia de gen mediada por microcélula, fusión de esteroplasto, etc. Se conocen numerosas técnicas par Aa la introducción de genes foráneos en células (véase, por ejemplo, Loeffler and Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618, Cohén et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644, Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29:69-92) y pueden emplearse de conformidad con la presente invención, a condición que las funciones necesarias de desarrollo y fisiológicas de las células receptoras no sean trastornadas. La técnica debe proporcionar una transferencia estable del ácido nucleico a la célula de tal manera que el ácido nucleico pueda ser expresado por la célula, y pueda ser heredado y pueda ser expresado por la progenia de la célula. Las células recombinantes y resultantes pueden ser administradas a un paciente por varios métodos conocidos en la técnica. En una modalidad preferida, se inyectan células epiteliales, por ejemplo, de manera subcutánea. En otra modalidad, células subcutáneas recombinantes pueden ser aplicadas como injerto de piel sobre el paciente. Las células sanguíneas recombinantes (por ejemplo células progenitoras o 5 células precursoras hematopoyéticas) se administran de preferencia de manera intravenosa. La cantidad de células contempladas para su uso depende del efecto deseado, estado del paciente, etc., y un experto en la materia puede determinar dicha cantidad. —* 10 Células en las cuales se puede introducir un ácido nucleico para propósitos de terapia génica abarca cualquier tipo deseado de células disponibles, e incluyen, sin limitarse a ellas células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fribroblastos, células de músculo, hepatocitos así como células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrofilos, eosinofilos, megacariocitos, granulocitos; y varias células W progenitoras o precursoras, particularmente células progenitoras o precursoras hematopoyéticas, por ejemplo, las células obtenidas a partir de la medula ósea, sangre de cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal, etc. En una modalidad preferida, la célula ha empleado para la terapia génica es autóloga para el paciente. En una modalidad en la cual se emplean células recombinantes en terapia génica, se emplea una molécula de ácido nucleico que codifica los componentes cuya asociación resulta en la formación de FRMS. En una modalidad específica, por ejemplo, el ácido nucleico codifica una proteína de envoltura viral de VIH CD4 humano y un co-receptor (por ejemplo un receptor de quimiocina CCR5 o CXCR4) . La molécula de ácido nucleico codificadora es introducida en las células de tal manera que el gen o los genes puedan ser expresados por las células o su progenie, y las células recombinantes son después administradas in vi vo para efecto terapéutico. En una modalidad especifica, se emplean células progenitoras o precursoras. Cualquier célula progenitora y/o precursora que puede ser aislada y mantenida in vi tro puede emplearse potencialmente de conformidad con esta modalidad de la invención. Tales células precursoras incluyen, sin limitarse a ellas, células precursoras hematopoyéticas (HSC) , células precursoras de tejidos epiteliales tales como la piel y forro de los intestinos, células de músculo de corazón embriónico, células precursoras de hígado (Publicación de patente internacional WO 94/08598), y células precursoras neurales (Ste ple y Anderson, 1992, Cell 71:973-985). En una modalidad especifica, el ácido nucleico ha introducido para propósitos de la terapia génica comprende un promotor inducible enlazado operativamente con la región codificadora (ver sección 5.1.2), de tal manera que la expresión del ácido nucleico pueda ser controlada mediante el control de la presencia o ausencia del inductor apropiado de transcripción. Métodos adicionales pueden ser adaptados para su uso para administrar una molécula de ácido nucleico que codifica los componentes que resultan en la formación de la FRMS de la invención serán aparentes a un experto en la materia y se encuentran dentro del alcance de la invención. Por consiguiente, la invención proporciona un método para el tratamiento de la prevención de infección por un virus en un sujeto, que comprende la administración al sujeto (a) de un primer ácido nucleico que codifica una proteína de envoltura de un virus envuelto; y (b) un segundo ácido nucleico que codifica una o varias proteínas de membrana celular, dicha proteína de envoltura y dichas proteínas de membrana celular son necesarias y suficientes en condiciones adecuadas para la fusión de dicha envoltura del virus con una membrana celular que contiene dichas proteínas de membrana celular de tal manera que la proteína de envoltura y proteína de membrana celular sean expresadas en el sujeto y de tal manera que se produzcan anticuerpos neutralizantes para el virus. En una modalidad, el elemento en donde el primer ácido nucleico y ei segundo ácido nucleico son iguales. En la modalidad, el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico son vectores de ácido nucleico diferentes. En una modalidad especifica, la proteína de envoltura es una proteína de envoltura de VIH, y las proteínas de membrana celular son CD4 y un co-receptor de VIH. 5.11.MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN La invención ofrece métodos para el tratamiento y la prevención de infección viral y enfermedades mediante la administración a un sujeto que requiere de dicho tratamiento de una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un agente terapéutico de la presente invención. El sujeto es de preferencia un animal, incluyendo, sin limitarse a estos, animales tales como monos, vacas, cerdos, caballos, pollos, gatos, perros, y en su preferencia un mamífero, y especialmente un ser humano. En una modalidad especifica, el sujeto es un ser humano que no padece de infección de VIH. A Se conocen varios sistemas de administración los cuales pueden ser empleados para administrar un agente terapéutico de la presente invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el agente terapéutico, endocitosis mediada por receptores (véase por ejemplo., Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construcción de ácido nucleico terapéutico como parte de un vector retroviral o bien otro tipo de vector, etc. Los métodos de introducción incluyen, sin limitarse a ellos, la administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea , intranasal, epidural, así como la vía oral. Los compuestos pueden ser administrados por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por infusión o inyección de polos, por absorción a través de los forros epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo mucosa oral, mucosa rectal y mucosa intestinal, etc.) y pueden ser administrados conjuntamente con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local, además, puede ser deseable introducir las composiciones farmacéuticas de la invención que comprenden anticuerpo en el sistema nervioso central por cualquier vía adecuada, incluyendo inyección intraventricular e intratecal; la inyección intraventricular puede ser facilitada por un catéter intraventicular, por ejemplo, fijado sobre un tanque, como por ejemplo un tanque Ommaya. Se A puede emplear también administración pulmonar, como por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o atomizador, y formulación con un agente de tipo aerosol. En una modalidad específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención que comprenden , anticuerpo localmente al área que requiere de tratamiento. Esto puede lograrse, por ejemplo, y sin limitación mediante la aplicación tópica, por inyección, a través de un catéter, por medio de un supositorio, o bien por medio de un implante, dicho implante es de material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, por ejemplo membranas sialásticas o fibras. En una modalidad altamente especifica, las composiciones farmacéuticas de la invención se administran a una herida abierta a un ser humano, dicha herida se sospecha que se encuentra expuesta a VIH. En otra modalidad, el agente terapéutico puede ser • administrado en la vesícula, particularmente un liposoma (por ejemplo Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat et al., 1989 en Liposomes in the Therapy of Infecctious Disease and Cáncer, (liposomas en la terapia de enfermedades infecciosas y cáncer), Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, Science . , pp. 317-327; véase - 10 generalmente Science . ) En otra modalidad, el agente terapéutico puede ser administrado en un sistema de liberación controlada. En una modalidad, se puede emplear una bomba, (véase Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N Engl. J. Med. 321:574) . En otra modalidad, se pueden emplear materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Reléase, (aplicaciones médicas de liberación controlado), Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Florida (1974) ; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, (biodisponibilidad de fármaco controlada, diseño de producto farmacológico y desempeño) Smolen and Ball (eds), Wiley^ New York (1984); Ranger et al., 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véase también Levy et al., 1985 Science 228:190; During et al., 1989, Ann Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105). En otra modaliad, se puede colocar un sistema de liberación controlada en la cercanía del blanco terapéutico, requiriéndose de esta forma solamente de una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson en Medical Applications of Controlled Reléase (aplicaciones médicas de liberación controlado) 1984, supra, volumen 2, páginas. 115-138) . Otros sistemas de liberación controlada se comentan en la reseña de Langer (Langer, 1990, Science 249:1527-1533). Las composiciones pueden, si se desea, presentarse en un empaque o dispositivo surtidor que puede contener una o A varias formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. El empaque puede comprender por ejemplo, una hoja de metal o plástico, por ejemplo un empaque de tipo blister. El empaque o el dispositivo surtidor puede estar acompañado por instrucciones de administración. Las composiciones que comprenden un compuesto de la invención formulado en un vehículo farmacéutico compatible pueden también prepararse, colocarse en un recipiente apropiado, y marcarse para el tratamiento de una condición indicada. 5.12 DEMOSTRACIÓN DE UTILIDAD CONTRA VIH La presente invención ofrece ensayos para provocar la eficacia anti-VIH de anticuerpos dirigidos contra una FRMS de VIH. La invención ofrece además métodos para monitorear la eficacia de una vacuna de FRMS en pacientes o sujetos mediante el ensayo de anticuerpos en una muestra de suero derivados del paciente o sujeto después de vacunación. Los agentes terapéuticos de la presente invención se prueban de preferencia in vitro y después in vivo para la actividad terapéutica o la actividad profiláctiva deseada entes de su uso en seres humanos. Cualquier ensayo in vi tro o in vivo conocido en la técnica para medir la infección viral o producción puede emplearse para probar la eficacia de un agente terapéutico de la presente invención. En una modalidad de la invención se proporciona el método para tamizar una preparación que comprende un mAb para actividad anti-VIH, dicho ensayo comprende en ensayo de dicha preparación o fracción para determinar la capacidad de inhibir una infección por VIH. A título de ejemplo, para ensayar un agente terapéutico in vi tro, uno puede examinar el efecto del agente terapéutico sobre la infección por VIH en células cultivadas. En el resumen células hepatopoyéticas cultivadas (por ejemplo, PBMCs primarias, macrófagos aislados en células CD4+ T aisladas o bien células T humanas o H9 cultivadas) son infectadas de manera precisa por VIH-1 empleando títulos conocidos en la técnica para infectar con precisión células in vi tro, por ejemplo 105 TCIDio/ml. Después, cantidades apropiadas del agente terapéutico son agregadas al medio de cultivo celular. Los cultivos son ensayados 3 y 10 días después de la infección para la producción de VIH-1 mediante la medición de niveles de antígeno VIH empleando un ensayo ELISA. La reducción de niveles de antígeno de VIH o bien en comparación con niveles observados en controles contratados indica que el agente terapéutico es efectivo para el tratamiento de infección por VIH. Alternativamente, se puede emplear cualquier ELISA de VIH comercialmente disponible como ensayo comparativo para el tratamiento previo y tratamiento posterior con el agente terapéutico. Además, ensayos para trascripción impulsados por LTR VIH-1 son útiles para la prueba de la eficacia de los agentes terapéuticos de la invención. Específicamente, un gen reportero, es decir, un gen cuya proteína o producto de ARN es fácilmente detectado como por ejemplo. Sin limitación, el gen de clorafenicolacetiltransferasa (CAT) es clonado en un constructo de plásmido de AD? de tal manera que la transcripción del gen reportero sea impulsada por el promotor de LTR VIH-1. El cosntructo resultante es después introducido por transfección o bien por cualquier otro método conocido en la técnica, en una línea de células cultivadas, por ejemplo sin limitación, la línea de células T CD4~ humana HUT 78. después de la exposición de las células transformadas el agente terapéutico se determina la transcripción a partir de LTR VIH-1 mediante la medición de la actividad de CAT empleando técnicas que son rutinarias. La reducción de la transcripción impulsado por LTR de VIH-1 demuestra la utilidad del agente terapéutico para el tratamiento y/o la prevención de infección por VIH. Pruebas ejemplares en modelos de animales se describen en la sección 5.7.1. en este documento. La eficacia de los agentes terapéuticos de la presente invención puede también determinarse en monos rhesus infectados SIV (véase Letrin, N.L., et al., 1990, J. AIDS 3:1023-1040), particularmente en monos rhesus infectados por SIVmac25?, dicha cepa de SIV induce en síndrome en monos infectados experimentalmente que es muy similar al SIDA humano (Kestler, H., et al., 1990, Science 248:1109-1112). Específicamente, monos pueden ser infectados SIVmac;5:, sin células, por ejemplo, con virus en título de 104'5 TCID50/ml. La infección es monitoreada por la aparición de antígeno p27 de SIV en PBMCs . La utilidad del agente terapéutico se caracteriza por un incremento normal de peso, una disminución de título de SIV en PBMCs y un incremento de células TCD4+. Alternativamente, se emplea un modelo de SHIV en el cual una proteína de VIH es construida en la estructura de SIV. En una modalidad, monos son inmunizados empleando una vacuna de FRMS que comprende células que expresan envoltura de VIH y células que expresan Co-receptores CD4 y CCR5 de rhesus. Si se obtiene una neutralización in vi vo adecuada, esos animales serán retados con un virus de SHIV infeccioso que lleva una envoltura de VIH a la neutralización. Específicamente se vacunan los monos con un inmunógeno que comprende una o varias FRMS y se retan con un aislado primario 89.6P de SHIV (véase por ejemplo, Montefiori et al., 1998, J Virol. 72:3427-31) . Una vez probado el agente terapéutico in vi tro, y también de manera preferida en un modelos de animal no humano se puede determinar la utilidad del agente terapéutico en sujetos humanos. La eficacia del tratamiento con un agente terapéutico puede ser evaluada mediante la medición de varios parámetros de infección por VIH y enfermedad asociada con VIH. Específicamente, el cambio de carga viral puede ser determinado mediante ensayos cuantitativos para ARN de VIH-1 empleando relación en cadena de polimerasa de transferasa reversa cuantitativa (Van Ge en, B., et al., 1994, J. Virol. Methods 49:157-168; Chen, Y.H. et al., 1992, AIDS 6:533-539) o bien mediante ensayos para la producción viral a partir de PBMCs aislados. La producción viral a partir de PBMCs se determina mediante el cocultivo de PBMCs a partir del sujeto con células PBL no infectadas y mediante la medición subsecuente de títulos de VIH-1 empleando un ensayo ELISA para niveles de antígeno p24 (véase, por ejemplo, Wrip, et al., 1995, Science 69:39; Popovic, M., et al., 1984, Science 204:497-500). La administración del agente terapéutico puede también ser evaluada mediante la evaluación de cambios en cuanto a los niveles de células TCD4", peso corporal y otra condición física asociada con infección por VIH o SIDA o bien complejo relacionado SIDA (ARC) . La reducción de la carga viral de VIH o producción, el incremento del número de célula T CD4+ o la mejora de los síntomas asociados con VIH demuestra la utilidad de un agente terapéutico para su administración en el tratamiento/prevención de infección VIH. 5.13. CONJUNTO DE ELEMENTOS La invención se refiere también a conjuntos de elementos que comprenden los complejos de proteína competentes para fusión o anticuerpos generados por estos complejos. Los conjuntos de A elementos que incluyen los complejos de la presente invención o anticuerpos pueden ser empleados para analizar lotes de vacuna para llevar a cabo estudios de estabilidad o bien desarrollar calificaciones de liberación de vacuna. Los anticuerpos y los complejos pueden también emplearse en conjuntos de elementos de diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpo o virus en el sistema huésped. Por ejemplo, anticuerpos o complejos de la presente invención pueden emplearse como sustrato o reactivo en un conjunto de elementos que proporciona un ensayo inmunosorbente enlazado con enzima de diagnóstico estándar (ELISA) o bien ELISA competitivo. La invención ofrece también un paquete farmacéutico o conjuntos de elementos que comprende uno o varios recipientes que contiene uno o varios de los ingredientes de las formulaciones de vacuna de la presente invención. Asociados con dicho (s) recipiente (s) puede encontrase un folleto en un formato prescrito por una agencia de gobierno que regula las indicaciones, uso o venta de sustancias farmacéuticas o productos biológicos, dicho folleto refleja la aprobación por parte de la agencia de fabricación, uso o venta para administración para seres humanos. En una modalidad, la invención ofrece un conjunto de elementos que comprende en uno o varios recipientes un anticuerpo monoclonal marcado para una estructura molecular A que comprende un epítopo formado como resultado de la asociación de (a) una proteína de envoltura de un virus envuelto, con (b) una o varias proteínas de membrana celular, dicha proteína de envoltura y proteínas de membrana celular son necesarias y suficientes en condiciones adecuadas para la fusión de dicha envoltura del virus con una membrana de célula que contiene dichas proteínas de membrana celular. En una modalidad adicional, la invención ofrece un conjunto de elementos que comprende además en un recipiente separado una estructura molecular que comprende un epítopo formado como resultado de la asociación de (a) una proteína de envoltura de un virus envuelto, con (b) una o varias proteínas de membrana celular, dicha proteína de envoltura y proteínas de membrana celular son necesarias y suficientes en condiciones adecuadas para la fusión de dicha envoltura del virus con una membrana de célula que contiene dichas proteínas de membrana celular. En una modalidad específica, la invención proporciona un conjunto de elementos que comprende en uno o varios recipientes un anticuerpo monoclonal marcado para una estructura molecular que comprende un epítopo formado como resultado de la asociación de (a) una proteína de envoltura de VIH, o un mutante de la misma que se ensambla en la envoltura viral; con (b) CD4 humano y un co-receptor para la fusión de VIH. En una modalidad adicional, la invención A ofrece un conjunto de elementos que comprende además en un recipiente separado un epítopo formado como resultado de la asociación de (a) una proteína de envoltura de VIH, o un mutante de la misma que se ensambla en la envoltura viral; con (b) CD4 humano y un co-receptor para la fusión de VIH. En una modalidad, la invención ofrece un conjunto de elementos que comprende en uno o varios recipientes una estructura molecular que comprende un epí~opo formado como resultado de la asociación de (a) una proteína de envoltura de un virus envuelto, con (b) una o varias proteínas de membrana, dicha proteína de envoltura y proteínas de membrana celular son necesarias y suficientes en condiciones adecuadas para la fusión de dicha envoltura del virus con una membrana de célula que contiene dichas proteínas de membrana celular. En una modalidad preferida, la estructura molecular es aislada. En una modalidad adicional, la invención ofrece un conjunto de elementos que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable, y en donde dicha estructura molecular se encuentra presente en una cantidad inmunológica. En otra modalidad, la invención proporciona un conjunto de elementos que comprende en uno o varios recipientes (a) un primer ácido nucleico que codifica una proteína de envoltura de un virus envuelto; y (b) un segundo ácido nucleico que codifica una o varias proteínas de membrana celular, dicha proteína de envoltura y proteínas de membrana celular son necesarias y suficientes en condiciones adecuadas para la fusión de dicha envoltura del virus con una membrana celular que contiene dichas proteínas de membrana celular, de tal manera que la proteína de envoltura y las proteínas de membrana celular se expresen en el sujeto y se produzcan anticuerpos neutralizantes para el virus. 6. EJEMPLOS Los inventores de la presente invención han hecho el descubrimiento sorprendente que la capacidad de neutralizar virus Pl se relaciona con la presentación de una proteína de envoltura de funcionamiento en una infección activa, en comparación con al presentación estática, no de funcionamiento de la proteína de envoltura en vacunas de rgpl20. Como se describe aquí, la próteína* de envoltura de VIH organiza una serie compleja de interacciones proteína-proteína y cambios estructurales que resultan finalmente en la fusión del virus y membranas celulares, y en la infección de la célula. Al enlazarse con CD4, la proteína de envoltura es sometida a un cambio de conformación que facilita la interacción subsecuente con una de varias moléculas de co-receptor, predominantemente el receptor 5 de quimiocina CC (CCR5) o bien el receptor 4 de quimiocina CXC (CXCR4) (Berger, E.A., 1997, AIDS 11 (complemento A), S3; Moore, J.P., et al., 1997, Current Opinions in Immunology (Opiniones A Actuales en Inmunología) 9:551; Doranz, B.J., et al., 1997, Immunology Research 16:15). Sin limitación en cuenta al mecanismo, la interacción con cualquier co-receptor induce un cambio de conformación adicional en la proteína de envoltura y la exposición del dominio de fusión hidrofóbico de la subunidad gp41 de transmembrana, lo que media después la fusión de las membranas de célula y virus adyacentes. Con base en este modelo dinámico de enlace de VIH y penetración, se desarrollaron inmunógenos de vacuna de VIH por los métodos de la invención los cuales incorporan explícitamente estas estructuras intermedias funcionales. Los ejemplos descritos aquí sirven para ilustrar los métodos y las composiciones de la invención.

Ejemplo 1: NEUTRALIZACIÓN DE AISLADOS PRIMARIOS AMPLIOS A PARTIR DE INMUNÓGENO DE VIH-FRMS Como ejemplo de la invención se generaron inmunógenos de vacuna para VIH que capturan las estructuras transientes que surgen durante el enlace y la fusión de VIH. En modelo de inmunización de ratón transgénico, vacunas de células enteras fijadas en formaldehído provocaron la formación de anticuerpo capaces de neutralizar la infectividad de 23 de 24 aislados primarios de VIH de diversas ubicaciones geográficas y clases genéticas A-E. El desarrollo de estos inmunógenos dependientes de la fusión ofrece vacunas contra VIH ampliamente efectivas y clínicamente importantes. A De conformidad con lo descrito arriba, la proteína de envoltura de VIH regula una serie compleja de interacciones proteína-proteína y cambios estructurales que resultan finalmente en la fusión de virus y membranas celulares, y en la infección de la célula. Sin limitación en cuanto al mecanismo, al enlazarse con CD4, la proteína de envoltura es sometida a un cambio de conformación que facilita la interacción subsecuente con una de varias moléculas de co-receptor, predominantemente el receptor 5 de quimiocina CC (CCR5) o bien el receptor 4 de quimiocina CXC (CXCR4) (reseñado en Berger, E.A., 1997, AIDS 11 (complemento A) ,_ S3; Moore, J.P., et al., 1997, Current Opinions in Immunology (Opiniones Actuales en Inmunología) 9:551; Doranz, B.J., et al., 1997, Immunology Research 16:15). La interacción con cualquier co-receptor induce un cambio de conformación adicional en la proteína de envoltura y la exposición del dominio de fusión hidrofóbico de la subunidad gp41 de transmembrana, lo que media después la fusión de las membranas de célula y virus adyacentes. El presente ejemplo ilustra métodos para desarrollar inmunógenos de vacuna de VIH que incorporan explícitamente estas estructuras intermedias funcionales . Otra medición de la función de la proteína de envoltura es la capacidad de mediar una fusión célula-célula. Cuando células que expresan una proteína de envoltura son co-cultivadas con células que expresan CD4 y co-receptor, se forman sincitios multinucleados en el transcurso de 6-24 horas. En el ejemplo actual, el proceso de unión y fusión fue capturado en progreso con reticulación con formaldehído antes de la formación extensiva de sincitios. Preparación de las FRMS En estos estudios, la proteína de envoltura de funcionamiento fue derivada de un virus Pl T-linfocitrópico obtenido de Ámsterdam Cohort (ACH168.10; 168P) . El gen de envoltura molecularmente clonado de ACHÍ 68.10 fue aislado por reacción en cadena de polimerasa empleando el plásmido pCR3.1-Uni (Invitrogen) (Tersmette, M., et al., 1989 Journal of Virology 63:2118; Wrin, T., et al., 1995, Science 69:39; LaCasse, R.A., et al., 1998, Journal of Virology 72:2491). La proteína de envoltura clonada molecularmente, así como el virus de inducción de sincitio parental (SI) emplea ambos co-receptores CCR5 y CXCR4. Células Cos-7 fueron transfectadas para expresar la proteína » de envoltura (COS-env) y subsecuentemente co-cultivadas con células de glioma, U87 humanas que expresan CD4 y el co-receptor CCR5 (U87-CD4-CCR5) . El gen de envoltura funcional 168P (168P23) fue transfectado en células COS-7 (American Type Culture Collection, Manassus, VA) por precipitación con fosfato de calcio (20 µg de ADN/106 células/10 cm plato de cultivo) por métodos conocidos en la técnica (verse, por ejemplo, Jordán, M., et al., 1996, Nucleic Acids Research 24:596). Células COS-7 de expresión transiente fueron cosechadas dos días después empleando 0.5 mM de EDTA en una solución salina regulada con fosfato (PBS) y socios de fusión U87-CD4-CCR5 (Hill, C.M., et al., 1997 Journal of Virology 71:6296) fueron preparados empelando 0.1 mM de EDTA en PBS. Co-cultivos fueron iniciados por medio de la mezcla de dos tipos de células (1.5 x 106 células cada uno) en platos de cultivo de 10 cm. El transcurso temporal de la fusión célula-célula fue monitoreado microscópicamente y por tinción inmunoquímica (HIVIG) en co-cultivos paralelos (LaCasse, R.A, et al., 1998 Science 72:2491). Los co-cultivos fueron típicamente cosechados por fijación en formaldehído a 4-5 horas, cuando poca o ninguna formación abierta de sincitio era evidente. Captura de FRMS Para capturar los productos intermedios de transición durante el proceso de unión y fusión, co-cultivos fueron fijados en formaldehído al 0.2% después de 5 horas cuando ninguna o pocas células de núcleos múltiples eran evidentes. Específicamente, los cultivos fueron fijados in situ empleando formaldehído al 0.2% en PBS a una temperatura de 4o C durante la noche por métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Yamamoto, J.K., et al., 1991, AIDS Research and Human Retroviruses (Investigación sobre SIDA y Retrovirus Humanos) 7:911; Verschoor, E.J., et al., 1995, Veterinary Immunology and Immunopathology (Inmunología e Inmunopatología Veterinaria) 46:139). Las células fueron subsecuentemente raspadas, lavadas dos veces con PBS, resuspendidas en una densidad nominal de 3 x 106 células/0.1 ml en PBS que contenía 10% DMSO, y congeladas a una temperatura de -80° C para almacenamiento o usadas inmediatamente como inmunógenos, de conformidad con lo descrito a continuación. Inmunización con inmunógeno de FRMS La preparación de células enteras tratadas con formaldehído fue empleada como un inmunógeno de FRMS o bien competente para fusión (FC) . Para probar la capacidad de estos inmunógenos para provocar anticuerpos neutralizantes, fue necesario restringir la respuesta inmune a epítopos virales e inducidos por virus. De otra forma, anticuerpos para CD4 y CCR5 serían generados los cuales bloquearía ellos mismos la infectividad. Por consiguiente, se empleó un modelo animal que era inmunológicamente más tolerante a los componentes CCR5 y CD4 (hu) humano de la vacuna. Así, se efectuaron estudios de inmunogenicidad con ratones transgénicos que expresan co-receptores hu CD4 y hu CCR5. La construcción de un ratón transgénico hu CD4 con remoción enfocada hacia CD4 ha sido descrita (Killeen, N., et al., 1993, EMBO Journal 12:1547). El diseño de un ratón transgénico hu CCR5 es resumido de la siguiente manera: un ADNc de hu CCR5 de 1.15 kb fue clonado molecularmente en un sitio Salí manipulado en el exón 2 de un cásete de expresión de CD4 de murino (constructo c en(Sawada, et al., 1994, Cell 77:917). Este minigen contenía un realzador de CD4 de murino, el promotor de CD4, el primer exón (no codificador) y el 'intrón 1 con una remoción interna que eliminó el silenciador de CD4. Fundadores transgénicos fueron identificados por citometría de flujo empleando un mAb por métodos conocidos en la técnica. Estos animales fueron cruzados con ratones transgénicos que expresan hu CD4 para proporcionar progenie que expresan hu CD4, hu CCR5, y CD4 de ratón. Las crías fueron tamizadas para la expresión de hu CD4, hu CCR5 y CD4 de ratón mediante citometría de flujo empelando un citómetro de flujo Coulter EPICS ÉLITE. Se empelaron los siguientes reactivos de anticuerpo: CD4 humano-a ratón/CyChrome (Pharmingen), CCR5 humano-ratón a MAB 180 (R & D Systems) con Ig- ratón cabra a-FITC (Caltag) , y L3T4 de CD4 de ratón rata a/PE. Ratones transgénicos que expresan hu CD4, hu CCR5 y CD4 de ratón fueron inmunizados con inmunógeno de FRMS o bien con controles de células (Células U87-CD4-CCR5, solas o bien co-cultivadas con células COS transfectadas de manera ficticia. Vacunas que comprenden células enteras fijadas por formaldehído (3 x 106 células/0.1 ml) formuladas con un A volumen igual de adyuvante Ribi (R-700; reconstituidas en la mitad del volumen recomendado de PBS) ; en algunos experimentos la inmunización inicial fue con adyuvante que contenía material de pared celular (R-730) . Los ratones recibieron 0.05 ml de vacuna en cuatro sitios subcutáneos. Las inmunizaciones de refuerzo fueron a intervalos de tres semanas y los ratones fueron sangrados 10-28 días después de las inmunizaciones a partir de la cola. .Anticuerpos séricos dirigidos contra gpl20 fueron cuantificados por ELISA de gpl20, así como por métodos conocidos en la técnica (véase, Moore, J., et al., 1989, AIDS 3:155). Neutralización viral La sensibilidad del virus 168P homólogo a la neutralización por suero de vacuna fue determinada con células U87-CD4 que expresan ya sea CCR5 o bien co-receptor CXCR4. Este ensayo de neutralización de virus Pl ha sido validado con relación a un ensayo de neutralización estándar en cultivo de PBL (LaCasse, R.A, et al., 1998 Science 72:2491; Follis, K.E. et al., 1998, Journal of Virology 72:7603) y se determinó que tenía un buen desempeño en presencia de suero de ratón. Todos los sueros fueron desactivados térmicamente antes del uso de ensayos de neutralización. Un ensayo de neutralización del virus Pl 168P homólogo por sueros de vacuna competente para fusión (FC) e incompetente A para fusión (Fl) se efectúo de la siguiente manera. Ratones transgénicos (hu CD4+, hu CCR5+, CD4+ de ratón) fueron inmunizados con inmunógeno de FC (CÓS-env con U87-CD4-CCR5; cuadrados; n = 3 ratones) o bien con controles en células (células U87-CD4-CCR5 solas o co-cultivadas con células COS transfectadas de manera ficticia; círculos n =3 ratones) .

Ratones no inmunizados fueron también empleados (triángulos; n = 2 ratones) . Se probaron sueros para neutralización de 168P empelando células U87-CD4 que expresan ya sea CXCR4 (símbolos negros) o bien CCR5 (símbolos blancos) . Datos representan promedios de tres a seis ensayos de neutralización empleando un suero obtenido 2 semanas después de la segunda y tercera inmunización.

Como se indica en la figura 1, resultados de ensayos de neutralización de virus indicaron que no se observó ninguna inhibición de infectividad en sueros provenientes de ratones inmunizados con controles de células, lo que indica que los ratones transgénicos eran de hecho tolerantes a hu CD4 y CCR5 y que otras reactividades celulares adventicias no presentaron interferencias con el ensayo de infectividad de virus (figura 1) . Sueros de ratones inmunizados con inmunógenos de FRMS neutralizaron el virus Pl 168P homólogo. La actividad de neutralización fue demostrada adicionalmente como mediada por anticuerpos y como tal la actividad podía ser adsorbida y subsecuentemente eludía partir de un soporte sólido que contiene proteína A y proteína G. Específicamente, el suero fue adsorbido secuencialmente sobre proteína-A Sepharosa {Sigma) y proteína-G agarose (Sigma) a 4°. La adsorción de anticuerpo fue confirmada por ELISA de gpl20. Los soportes sólidos fueron combinados y los anticuerpos fueron eluídos empleando 100 mM de glicina, pH 2.5. El producto eluído fue neutralizado y dializado por ultrafiltración de centrifugación (Microcon-100; Amicon) . La neutralización por sueros de FC en ensayo de PBL fue determinada como más que 99%, mientras que la neutralización por sueros de FC en ensayo de células U87-CD4-coR fue determinada en un nivel de 80-90%. Es interesante observar que el ensayo de neutralización de PBL sensibles, sueros de vacuna "incompetente para la fusión" demostraron una cierta inhibición de la replicación de virus de Pl aún cuando mucho menos que los sueros de vacuna "competente para la fusión" (véase, (LaCasse, R.A, et al., 1996 Science 283:357-62). El efecto mínimo puede explicar las reclamaciones intermitentes en la literatura de neutralización de virus de Pl por sueros de vacuna de rpgl20 (Devico, A.A. Silver, et al., 1996, Virology 218:258-63; Berman, PW, et al., 1998, AIDS Res & Hum Retrovirus 14 (complemento 3) S277-S89) . La base molecular para diferencias en cuanto a sensibilidad de neutralización en virus Pl se desconoce en este momento, y puede o no correlacionarse con grupos de clases filogenéticas per se. Determinantes serotípicamente distintos pueden surgir independientemente en varias clases. Así, envolturas "competentes para la fusión" derivadas de clases otras que B pueden emplearse para determinar empíricamente el número de envolturas prototípicas que definen serotipos de neutralización "competentes para la fusión". Independientemente del número total de serotipos de VIH, es significativo que el 80% de los virus de Pl probados pudieran ser fuertemente neutralizados (> 70%) empleando una envoltura de clase B única representativa pero apropiadamente presentada. El co-receptor CXCR4 puede sustituir CCR5 La neutralización del virus 168P por suero de FC fue observada independientemente del co-receptor empleado en ensayo de infección de células U87-CD4 (figura 1) . Varios reportes han demostrado que en general la sensibilidad a la neutralización es independiente del uso de co-receptor específico ((LaCasse, R.A, et al., 1998 Science 72:2491; Trkola, A. et al., 1998, Journal of Virology 72:1876; Montefiori, D.C., et al., 1998, Journal of Virology 72:3427; Follis, K.E., et al., 1998, Science 72:7603). El hecho que la neutralización fue observada aquí con CXCR4, un co-receptor al cual el animal no había sido expuesto, indica que la neutralización puede no ser directamente enfocada hacia el componente CCR5 de la vacuna. Además, el co-receptor CXCR4 puede sustituir CCR5. Inmunógenos incompetentes para la fusión La fusión de determinantes dependientes de la fusión en la inducción de neutralización de virus de Pl se examinó. Los inmunógenos incompetentes para la fusión (Fl) son co-cultivos que expresan env pero no se someten a la fusión célula-célula. Estos inmunógenos incluyen COS-env co-cultivados con células U87 (no CD4 o bien co-receptor CCCR5) , COS-env co-cultivado con células U87-CD4, y células COS-env a las cuales se formó un complejo con CD4 (sCD4) . Específicamente, los cultivos que expresan envoltura fueron incubados con sCD4 (Berger, E.A. et al., 1988, Proceedings of the National Academy of Sciences (Actas de la Academia Nacional de Ciencias) USA 85:2357) (5 µg/ml; 1 hora a 37°) y subsecuentemente lavados para remover sCD4 no unido. Todos los inmunógenos de Fl fueron fijados con formaldehído como arriba. Un inmunógeno de Fl adicional comprendía células COS-env y U87-CD4-CCR5 que fueron fijadas separadamente con formaldehído antes de su mezcla durante la formulación de la vacuna . En contraste notable con inmunógenos de FC o FRMS, todos los inmunógenos de Fl no pudieron provocar una neutralización significativa del virus Pl homólogo (figura 2a) . específicamente P168 fue neutralizado por inmunógenos de FC pero no por inmunógenos de Fl . Como se muestra en la figura 2A, ratones transgénicos fueron inmunizados con inmunógeno de FC (cuadrados negros; n = 4), inmunógenos de Fl (COS-env con células U87; círculos grises n = 4; COS-env con células U87-CD4, rombos grises, n = 3; COS-env con sCD4, rombos blancos, n = 2; COS-env con células U87-CD4-CCR5, cada una fijada separadamente antes de la mezcla para inmunización, cuadrados grises, n = 2) o bien inmunógenos de células COS transfectadas de manera ficticia (co-cultivadas con células U87-CD4-CCR5, círculos blancos n = 2) . Ratones no inmunizados (triángulos blancos, n = 2) fueron también empelados. La neutralización fue independiente del uso de co-receptores específicos y los datos aquí representan promedios de tres a seis ensayos de neutralización en células U87-CD4-CXCR4 o bien CCR5. En algunos casos, sueros de todos los animales dentro de cada grupo experimental fueron combinados. Estos resultados son consistentes con la falla bien documentada de vacunas de rgpl20 para provocar la neutralización de virus Pl. La diferencia en la neutralización por virus de vacuna de FC y Fl se observó también en ensayos que empelan linfocitos de sangre primaria humana (PBLs) (figura 2B) . La neutralización del virus P168 Pl homologo en cultivo de PBL humano por inmunógenos de FC pero por inmunógenos de Fl se demostró también. Como se muestra en la figura 2B, los linfocitos fueron aislados, estimulados con fitohemaglutinina, y cultivados en presencia de interleucina-2; se determinó la neutralización de conformidad con lo descrito aquí. Se determinó un antígeno p24 de VIH después de 5 días de cultivo mediante ELISA (Coulter Corporation) y los valores fueron normalizados al control de virus (36 ng/ml) . * indica niveles de antígeno p24 por debajo del límite de detección en la dilución empleada en ELISA. Grupos de vacuna fueron de conformidad con lo definido en la figura 2A, y sueros son combinados para este ensayo. Especificidad del inmunógeno de FRMS Con el objeto de excluir la posibilidad que sueros de vacuna de FC inhibieran la infectividad viral de manera no específica, se mostró que sueros de vacuna de FRC no inhiben la infectividad de viriones de VIH seudotipados que llevan una proteína de envoltura de virus leucemia de murino (MLV) anfotrópica (provirus NL4-3-Luc-R~E~ defectuoso para envoltura fue seudotipado empelando proteína de envoltura de MLV anfotrópica (Deng, H., et al., 1996, Nature 381:661). Además, se mostró que sueros de vacuna de FC no neutralizaban un aislado primario del virus de la inmunodeficiencia del simio SIVmac251. Un aislado primario de SIVmac251 (Langlois, A.L., et al., 1998, Journal of Virology 72:6950) producido en PBLs de rhesus fue empleado (figura 3) . Como se muestra en la figura 3, suero de vacuna de FC no neutralizó viriones de VIH seudotipados que llevan una A proteína de envoltura de MLV anfotrópica o bien SIVmac251 primario. Un VIH que lleva una proteína de envoltura de MLV anfotrópica (seudotipo de anfo MLV) , fue empleado en sensibilidad de neutralización con antisueros FC y Fl combinados determinados en células U87-CD4-CXCR4. La neutralización de SIVmac251 de aislados primarios fue determinada en células U87-CD4-CCR5. los símbolos son de conformidad con lo definido en la figura 2: inmunógeno de FC (cuadrados negros) e inmunógeno de Fl (células Cos-env + células U87, círculos negros) . Neutralización de aislados adaptada para laboratorio Como en el caso de las vacunas convencionales de rgp20, las vacunas de Fl pudieron provocar la neutralización de un aislado adaptado para laboratorio relacionado de VIH, la línea de células T adaptada derivada de 168P, 168C (se describe en Wrin, T., et al., 1995, Science 69:39; LaCasse, R.A., et al., 1998, Science 72:2491). La sensibilidad de neutralización del virus de Pl 168P y su derivado TCLA 168C se probó en células U87-CD4-CXCR4. Grupos de vacuna y símbolos son de conformidad con definido en la figura 2: los sueros fueron combinados para este ensayo. Los resultados demostrados en la figura 4 indicaron una neutralización de virus TCLA 168C por sueros de vacuna Fl . Los títulos de neutralización del virus TCLA 168C fueron comparables entre sueros de vacuna de FC o Fl, así como los títulos de A anticuerpos anti-gpl20, lo que sugiere un grado similar de inmunogenicidad adherente entre las vacunas. La incapacidad de las vacunas de Fl para provocar una neutralización de virus de Pl en el modelo de ratón transgénico subraya la especificidad de la neutralización provocada por vacunas de FC. Una comparación estadística fue evaluada en el conjunto de datos que comprende la totalidad de los animales de experimento y la totalidad de los ensayos de neutralización de virus. Un modelo sencillo para la unión virus-anticuerpo fué empleado para calcular una "constante de unión" K para cada ensayo, y se determinó un valor K medio para cada ratón. Un análisis de varianza comprueba ese seguimiento, demostró una diferencia significativa en la neutralización media entre inmunógenos de FC y Fl (p < 0.01). En todos los experimentos, las respuestas dentro de grupos experimentales fueron consistentes y uniformes. Además, la incapacidad consistente de sueros de vacuna de FUI para inhibir la infectividad de virus de Pl es un argumento fuerte en el sentido que la respuesta inmune puede no ser dirigida hacia blancos celulares humanos adventicios tales como los que confundieron estudios iniciales de vacunas contra SIV desactivadas (ver, Cranage, M.P., et al., 1993, AIDS Research and Human Retroviruses 9:13; Putkonen, P., et al., 1993, Journal of Medical Primatology 22:100; Arthur, L.O., et al., 1992, Science 258:1935). Al contrario, la presente invención reconoce que inmunógenos de FC o FRMS presentan determinantes únicos que median la neutralización de virus de Pl . Neutralización de aislados primarios por sueros vacunados con FRMS Un asunto crítico en el desarrollo de vacunas contra VIH se centra en la capacidad de los antisueros de vacuna de neutralizar un rango amplio de varios virus de Pl. Con el objeto de demostrar la amplitud de la neutralización de virus de Pl provocada por inmunógenos de FRMS como por ejemplo un inmunógeno de FC examinamos la sensibilidad de un panel de virus de Pl representativos a partir de cinco clases filogenéticas geográficamente diversas y prevalentes. Los provirus infecciosos ÁCH320 ,2A.1.2 (320SI) y ACH320.2A.2.1 (320NSI) (Groenink, M., et al., 1991, Journal of Virology 65:1968; Guillon, C, et al . , 1995, AIDS Research and Human Retroviruses 11:1537) fueron obtenidos a través del programa de reactivos contra SIDA de NIBSC (Reino Unido). HIV89.6 (Coliman, R., et al., 1992, Journal of Virology 66:7517), SHIV89.6, y SHIV89.6P (Reimann, K.A., et al., 1996, Journal of Virology 70:3198) fueron también empleados. Todos los demás aislados primarios fueron obtenidos a través del programa de reactivos de referencia e investigación del SIDA de NIH y la red UNAIDS para el aislamiento y la caracterización de VIH-1. Virus de Pl fueron sometidos a una A expansión limitada en PBLs activados con PHA (Wrin, T., et al., 1995, Science 69:39). Como se ilustra en la figura 5, los sueros de FC provocados por una proteína de envoltura de clase B funcionando pudieron neutralizar 23 de 24 virus de Pl probados - virus monocitrópicos/NSI y T/linfoci'trópicos/SI de Norteamérica/Europa (clase B) , África (clases A y D) , Tailandia (clases B y E) e India (clase C) . Grupos de vacuna y símbolos son de conformidad con lo definido en la figura 2; para este ensayo se combinaron sueros. A pesar de la diversidad de secuencias entre estos aislados, la mayoría de ellos fueron similarmente sensibles a la neutralización por sueros de vacuna de FC. Un aislado (92RW008) no alcanzó mis que el 50% de neutralización y otros dos aislados (931N904 y 92UG024) presentaron una neutralización limitada arriba del 50%; estas excepciones al patrón por otra parte amplio de neutralización es un argumento adicional en el sentido que inmunógenos de FC de la invención pueden enfocar primariamente determinantes virales. Sueros de Fl fueron uniformemente incapaces de neutralizar estos virus de Pl heterólogos. La neutralización amplia y uniforme de virus de Pl diversos por los inmunógenos de FRMS sugiere que los determinantes críticos presentados por inmunógenos de FRMS (como por ejemplo, inmunógenos de FC) son altamente conservados y pueden ser íntimamente unidos al funcionamiento básico de la proteína de envoltura en enlace y fusión. Agentes de neutralización Con el objeto de definir con mayor precisión el blanco molecular para neutralización de virus de Pl por vacunas de Fc, se intento remover anticuerpos neutralizantes de sueros de vacuna de FC al efectuarse una incubación con proteína de envoltura expresada en la superficie de células COS transfectadas. Por consiguiente, células CCOS fijadas con formaldehído que expresan una proteína de envoltura 168P fueron incubadas con suero de FC y el suero recuperado fue después probado para la neutralización del virus de Pl. El suero de vacuna de FC fue secuencialmente adsorbido cuatro veces con aproximadamente 106 células COS fijadas con formaldehído que expresan la envoltura de 168P. Las incubaciones fueron durante un período de una hora a une temperatura de 4° con sacudimiento. Los controles incluyeron suero presangrado y células COS transfectadas de manera ficticias fijadas con formaldehído. La adsorción del anticuerpo anti-gpl20 en volumen fue monitoreada por ELIS de gpl20. Los sueros finales fueron probados para determinar la neutralización de 168P de VIH empleando células U87-CD4-CXCR4. La actividad de neutralización en suero de vacuna de FC fue removida por incubación con células que expresan una envoltura, pero solamente reducida de manera mínima por incubación con controles de células COS (figura 6 y figura 7) . Específicamente, un suero de vacuna de FC fue incubado repetidamente con COS-env fijadas con formaldehído o bien células COS de control y probado para determinar la neutralización residual de 168P empelando células U87-CD4-CXCR4. El suero obtenido antes de la inmunización FFC fue adsorbido de manera similar. Producción de anticuerpos neutralizantes Con el objeto de demostrar que los métodos de la invención son útiles para generar anticuerpos neutralizantes, se prepararon sobrenadantes de hibridoma a través de los métodos de la invención (empleando COS-env + U87-CD4-CCR5 reticulada co o inmunógeno) fueron capaces de neutralizar aislados primarios. En resumen, los hibridomas fueron ensayados para neutralización de virus en el ensayo de células U87-CD4-CXCR4 de conformidad con lo descrito arriba. Se probaron sobrenadantes de hibridoma para determinar la capacidad de neutralizar dos aislados de clase B de VIH representativos (ACH168.10 (168P) y 92US657). La neutralización es expresada como el número de foci en presencia de sobrenadante de hlbridoma con relación al número en presencia de medio solo. Cada punto representa un hibridoma seleccionado. Como se muestra en la figura 8, se encontró, que la mayoría de los hibridomas neutralizaban ambos virus de Pl a 60%-80% (con infectividad residual de 0.4 - 0.2, respectivamente). Así, los inmunógenos de FRMS son capaces de provocar la neutralización de anticuerpos monoclonales contra un virus de aislado primario. Globalmente, este ejemplo ilustra que una proteína de envoltura de clase B apropiadamente presentada puede provocar una neutralización potente contra la mayoría de los virus de Pl a partir de múltiples clases de VIH y sugiere que una protección amplia de vacuna puede no requerir un número indicado de serotipos de VIH. Además, aún cuando las formas estáticas de la proteína de envoltura no funcionan como un inmunógeno efectivo, la presente invención reconoce que los epítopos relacionados con fusión críticos son suficientemente representados en la proteína estática para permitir el enlace. Cuando se empelan en formulaciones de vacuna, los inmunógenos de FRMS de la invención ofrecen una protección amplia contra una amplia variedad de serotipos y clases virales. Ejemplo 2: mutaciones defectuosas para la fusión Varias mutaciones han sido examinadas para su uso en los métodos de la presente invención. En el caso de VIH, tres clases de mutaciones de la proteína de envoltura incluyen, sin limitarse a ellas: 1) mutaciones que cancelan la disociación proteolítica de la proteína de precursor gpl60; 2) mutaciones que afectan el dominio de péptido de fusión gp41 de terminal N; y 3) mutaciones que A alteran el dominio de doble hélice. Las mutaciones que cancelan la disociación proteolítica de las proteínas de precursor gpl60 incluyen ciertas mutaciones que alteran el sitio K/R-X-K/R-R altamente conservado en el extremo C de gpl20 previenen la disociación proteolítica de la poliproteína gpl60 y también cancelan la fusogenicidad (Freed, E.O., et al., 1989, J. Virol. 63:4670-5; Guo H.G. et al., 1990, Virology, 174:217-24; Bosch V., et al., 1990, J. Virol 1990:2337-44; Dubay, J,W. et al., 1995, J. Virol., 69:4675-82) . La mutagenesis dirigida por sitio (QuickChange, Strategene) fue empleada para introducir una mutación de sitio de disociación documentada en la proteína de envoltura 168P (REKR a REKT) . gpl60 de proteína de envoltura 168P con defecto de disociación fue expresado en la superficie de la célula pero no pudo mediar la fusión célula-célula ni infección por viriones de VIH seudotipados. Mutaciones que afectan el dominio de péptido de fusión gpl41 de terminal N incluyen la mutación de la región de terminal N hidrofóbica de gp41, se cree que dicha regio media la fusión mediante la inserción en membrana celular y desestabilización de la dicapa de lípidos. Ciertos cambios de aminoácidos dentro de esta región vuelven la proteína de envoltura péptidos sintéticos no fusogénicos. Mutaciones en el péptido de fusión de terminal N gp41 han sido bien caracterizadas: V2E (Freed, E.O., et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1992:70-4; Pereira, F.B., et al., 1997, AIDS Rres. & Hum Retrovirus 13:1203-11) y G10V (Delahunty, M.D., et al., 1996, Virology 218-94-102). El primero incluye una sustitución polar en el péptido hidrofóbico, mientras que el segundo puede afectar la estructura helicoidal considerada en la dicapa de lípidos. Estas mutaciones son introducidas en el gen de envoltura 168P (AVGIGVLFLGFLG.. ) por mutagenesis dirigida a sitio y las proteínas de envoltura son probadas para expresión de fusogenicidad. La incorporación de estas mutaciones en p7AbT4587-168P permiten la generación fácil de los virus de vaccinia de recombinación análogos de la invención.

Mutaciones que alteran las regiones de doble hélice incluyen mutaciones que se encuentran dentro del motivo de doble hélice altamente conservado se encuentra en proteínas de fusión de muchas familias de virus (Weissenhorn, W., et al., 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:6032-6), por ejemplo, V570R y Y586E de VIH. En una modalidad, se introducen cambios en el gen de envoltura 168P y se prueba la expresión y la fusogenicidad en ensayos de células antes de su transferencia a pAbt4587-168P para la generación del virus de vaccinia recombinante análogo. Ejemplo 3: Preparación de FRMS Inmunógenos competentes para la fusión fueron preparados mediante el co-cultivo de células C0S-7 transfectasa con fosfato de calcio (American Type Culture Collection, Rockville, MD) que expresan la proteína de envoltura 168P de VIH clonada molecularmente (a partir de ACH168.10 , un aislado primario de inducción de sincitios que empleó tanto CCR5 como CXCR4) (LaCasse, R.A., et al., 1998, Science 72:2491) con un número igual de socios de fusión de célula. Los socios de fusión de célula fueron células U87-CD4 que expresan CCR5 (U87-CD4-CCR5) (Dan Littman, Skirball Institute of Biomolecular Medicine, NYU Medical Center) . Los cultivos fueron terminados al inicio de la interacción célula-célula (3-5 horas) mediante fijación con formaldehído al 0.2% a temperatura de hielo en una solución salina amortiguada con fosfato. La cosecha fue programada hacia la captura de intermedios de transición que llevan a la fusión célula-célula. Estudios de inmunotinción preliminares y contemporáneos indicaron de 10 a 30% de formación máxima de sincitios al momento de la cosecha. Las células fueron recogida por raspado seguidas por fijación durante la noche. Ejemplo 4: Inmunización de ratones con las FRMS Ratones transgénicos que expresan tanto CD4 humano como el co-receptor CCR5 (Dan Littman, Skirball Institute of Biomolecular Medicine, NYU Medical Center) fueron inmunizados tres veces a intervalos de 21 días con células preparadas y recogidas como en el ejemplo 1. Las células fueron formuladas como vacuna empleando adyuvante de Ribi (Ribi ImmunoChem Research, Ine) (2 x 106 células/0.2 ml/ratón) . LA sangre fue recogida de la vena de la cola. Los sueros obtenidos fueron empleados en ensayos de neutralización ene líneas de células U87-CD4 que expresan ya sea CCR5 o bien CXCR4. Este ensayo de neutralización rápido de Pl ha sido validado con relación a un ensayo de neutralización estándar en cultivo de linfocitos de sangre periférica (PBL) (LaCasse, R.A., et al., 1998, Science 72:2491), tiene un buen desempeño en presencia de suero de ratón. En tres experimentos separados, vacunas competentes para la fusión fueron administradas a tres ratones. Ensayos de neutralización de virus que emplean 168P de virus Pl fueron efectuados empleando tanto células U87-CD4-CCR5 como células -CXCR4 y en algunos casos fueron analizados después de la segunda así como después de la tercera inmunización. En todos los casos, los resultados fueron concordantes y fueron promediados en los datos presentados en la figura 9, La neutralización potente del virus Pl 168P homólogo fue observada de manera consistente; niveles de neutralización > 80% fueron obtenidos típicamente en una división 1:100 del suero de ratón. La neutralización fue observada empleando CXCR4, un co-receptor al cual el animal no había sido expuesto. Se efectuaron varias inmunizaciones de control críticas. Un control fundamental fue la confirmación que inmúnógenos de proteína de envoltura que no funcionan no provocaron anticuerpos que neutralizan el virus de Pl en el modelo de vacunación de ratón transgénico. En un estudio, un ratón recibió una vacuna que comprende envoltura 168P/células COS que habían sido co-cultivadas con células UU87 que no expresan ni CD4 ni un co-receptor. Aún cuando se observó una cierta neutralización de virus de Pl 168P en un total de tres ensayos a partir de dos sangrados, el título y la magnitud fueron bastante distintos de lo que se observó mediante el empleo de vacunas competentes para la fusión. Cambios conformacionales inducidos al unirse CD4 se consideran como críticos para una interacción subsecuente con co-receptor. Por consiguiente, anticuerpos dirigidos hacia estas proteínas de envoltura novedosas son provechosos para la neutralización de virus de Pl. En paralelo con la vacuna de control de la proteína de envoltura, otro ratón recibió una vacuna de control que comprende células CCOS que expresan la envoltura 168P que habían sido co-cultivadas con células U87-CD4. No se observó la formación de sincitio empleando este sistema incompetente para la fusión. Parece que la adición de CD4 tuvo poca contribución a la neutralización muy mínima que se observó empelando la proteína de envoltura sola. Una neutralización residual puede surgir de anticuerpos dirigidos hacia CD4 y CCR5 si la tolerancia la los transgenes es incompleta. Así, vacunas de control que contienen U87-CD4-CCR5, solas o co-cultivadas con célula COS transfectasa de manera ficticia fueron probados. En tres estudios, no se observó ninguna inhibición de la infectividad viral. Estos datos confirman la tolerancia de estos ratones transgénicos y validan el modelo de vacunación. Respuestas inmunes específicas parecen limitadas epítopos virales y tal vez inducidos por virus. No solamente estos ratones parecen ser tolerantes a CD4 humano y CCR5 como lo sería un vacunado humano, sino que anticuerpos dirigidos hacia otras proteínas celulares no parecen interferir con la capacidad de infección viral en este ensayo. La posibilidad que la respuesta de anticuerpo pueda ser mediada en parte por la inmunización de ADN fue explorada. Durante la transfección, células que expresan envoltura fueron expuestas a cantidades del orden del microgramo de ADN de plásmido. Para probar si los animales estaban respondiendo a la inmunización con ASDN, dos ratones recibieron inyecciones subcutáneas de 20 µg de plásmido 168P23 (en el vector de expresión pCR3.1-Uni. Aún cuando esta vía de administración no es preferida para inmunización de ADN, refleja la vía de administración empleada con vacunas celulares transfectadas. El ADN no fue desactivado con formalina en este experimento. En un total de ocho ensayos de neutralización con virus, no se observó ninguna neutralización con virus de Pl al efectuarse una inmunización de ADN. Ejemplo 5: Neutralización de Pl adicional empleando anticuerpos para la FRMS ACH320.2A.1.2 (320SI) (Amsterdam Cohort) es un virus de Pl T-linfocitrópico clonado molecularmente que es particularmente refractario a neutralización por Ig de VIH, Ig de CD4, e Ig G?-bl2. Sueros residuales que permanecen en el ejemplo 3 fueron empleados para probar la sensibilidad de este virus de Pl a inmunógenos competentes para la fusión e incompetentes para la fusión. Aún cuando se limito dilución inicial 1:100 de suero competente para la fusión, este aislado de clase B heterólogo fue claramente sensible a la neutralización. La incapacidad de los sueros incompetentes para la fusión (env y env + CD4) para neutralizar el virus 320SI heterólogo a diferencia de la neutralización parcial observada contra el virus 168P homólogo fue también de interés (figura 10) . Un asunto crítico en el desarrollo de vacunas contra VIH se centra en la capacidad de los antisueros de vacuna para neutralizar un amplio rango de virus Pl diversos. Para determinar la amplitud de la neutralización de virus de Pl provocada por inmunógenos competentes para la fusión, se examinó la sensibilidad de un panel de virus de Pl representativos a partir de cinco clases filogenéticas geográficamente diversas y prevalentes. Ensayos de neutralización en células U87-CD4-co-receptor son de conformidad con lo descrito arriba y en el ejemplo 1. Sueros competentes para la fusión provocados por una proteína de clase B funcionando pudieron neutralizar 23 de 24 virus de Pl probados - virus monocitrópicos/NSI y T/linfocitrópicos/SI de Norteamérica/Europa (clase B) , África (clases A y D) , Tailandia (clases B y E) e India (clase C) . A pesar de la diversidad de secuencias entre estos aislados, la mayoría de ellos fueron similarmente sensibles a la neutralización por sueros de vacuna competente para la fusión. Un aislado (92RW008) no alcanzó más que el 50% de neutralización y otros dos aislados (931N904 y 92UG024) presentaron una neutralización limitada arriba del 50%. Sueros de control fueron uniformemente incapaces de neutralizar estos virus de Pl heterólogos, lo que corresponde al fracaso histórico de inmunógenos rgpl20. La neutralización amplia y uniforme de diversos virus de Pl provocada por una sola proteína de envoltura de clase B representativa presentada apropiadamente sugiere que los determinantes críticos presentados por inmundgenos competentes para fusión son altamente conservados y pueden ser íntimamente unidos al funcionamiento básico de la proteína de envoltura en la unión y fusión. Estos hallazgos sugieren que el número de diferentes serotipos de neutralización de VIH requeridos para protección a nivel mundial contra infección por VIH puede ser limitado. Ejemplo 6 - Preparación de aislamiento de FRMS marcadas Las FMRS de la presente invención fueron marcadas empleando un sistema comercialmente disponible para facilitar su aislamiento y purificación. Los métodos de manipulación molecular empleados para construir CCD4, CCR5, CXCR4 y envoltura de VIH marcados con péptido S paralelos y se describirán con detalles solamente en el caso de CD4-Spep. Las moléculas fueron marcadas con un péptido SS en el extremo de terminal C de la molécula de CD4. La secuencia de codificación de péptido S (lys-glu-thr-ala-ala-ala-lys-phe-glu-arg-gln-his-met-asp-ser) fue insertada entre la isoleucina de terminal C citoplásmica y el cordón de terminación (TGA) del plásmido de expresión ADNc de CD4 (CD4-Spep) empleando un olig?nucleßtido sintético y una reacción en cadena de polimerasa de XL de alta fidelidad (PE Applied Biosystems) . La expresión funcional de CD4 modificada fue confirmada por infección de células COS-7 que expresan CD4-Spep y el Co-receptor CXCR4. El CD4 marcado en terminal C pudo soportar la infección por virus 168P de manera comparable a CD4 nativo. CD4 marcado con péptido S fue también fácilmente aislado empleando cromatografías de afinidad de proteínas (Novagen Inc.) . Empleando métodos similares, hemos construido CCR5 y Co-receptor CXR4 marcados con péptido S homólogos así como moléculas de envoltura de VIH. Todos los cosntructos fueron funcionales en unión y fusión. Células COS-7 fueron transfectadas con CXCR4, y o bien CD4-Spep o CD4 nativa (en vectores de expresión pcDNA3.1), y 2 días subsecuentemente marcadas en la superficie de la célula con biotina (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin; Pierce Chemical Co.). los lizados fueron preparados en Tritón X-100 0.5% con inhibidores de proteasa. Moléculas de CD4 fueron purificadas ya sea mediante 1) inmunoprecipitaciones empleando Mab T4 (coulter Corp. , Hialeah, FL) y agarrosa de proteína cargada con anticuerpo Ig del á-Ratón - conejo o bien 2) purificación de afinidad empleando agárosa de proteína S. las proteínas fueron liberadas también durante hervor en amortiguador de muestra dentro de dodeciisulfato de sodio (SDS) , resueltas por electroforesis en gel dé poliacrilamida-SDS al 10%, y transferidas a nitrocelulosa. Las proteínas biotiniladas son detectadas por avitin-peroxidaza de rábano agrio (Pierce) y substrato de DAB realizado con níquel. La agarosa de proteína S resultó en la purificación específica de CD4-Spep 62kD con un rendimiento y una pureza que rebasó el rendimiento y la pureza de la inmu?oprecipitación mediada por anticuerpos áCD4. En el transcurso temporal del aislamiento de péptido S después de dar formación con formalina fue examinado. Células COS-7 fueron transfectadas con CD4-Spep (± CXCR4 ) y fueron subsecuentemente cosechadas en amortiguador de lisis X-100 al 0.5% (control) o bien sometidas a fijación con formaldehído a temperatura de hielo antes de la lisis. La proteína de CD4-Spep fue purificada por agarosa de proteína S y analizada por Western blot empleando HRP de proteína S (Novagen, Ine) . se observó una perdida mínima de enlace péptido S (y/o recuperación) con fijación en formaldehído al 2% durante 1 hora, alguna recuperación es perdida con formaldehído al 2% en 1 hora y más a las 3 horas. Condiciones intermedios de reacción (como por ejemplo, el formaldehído al 0.2% durante 1-2 horas) permitieran un aislamiento eficiente de concejos efectivamente reticulados. Para identificar complejos CD4-Spep específicos, se efectuaron experimentos empleando fijación con formaldehído así como el agente de recuperación especifico DTDDP (Pierce Chemical Company) . DTDDP es un éster de mezcla N-hidroxisuccinimidilhomobifuncional que reacciona, como el formaldehído, con aminas primarias. Debido a su carga negativa, mezcla de DTSSP no puede penetrar y atravesar la membrana celular y por consiguiente, a diferencia del formaldehído no afecta el marcador de péptido S plásmido. También a diferencia del formaldehído, la reticulación con DTSSP es reversible; un envase de disulfuro interno puede ser disociado para liberar componentes reticulados. Las células COS-7 fueron transfectadas con envoltura 168P o bien plásmidos CD4-Spep células que expresan la envoltura así A como células transfectadas de manera ficticia fueron marcadas metabólicamente en un plato de 10 cm durante 8 horas empleando un mCi total de 35S-metionina y cisteína. Células que expresan envoltura (o bien ficticia) y CD4-Spep fueron después co-cultivadas durante 4 horas para permitir la interacción celular-célula, y sometidas a reticulación con formaldehído (0.2% 1 hora en hielo) o DTSSP (2mM, 2X10 min. en hielo) . Lisados fueron preparados y complejos que contienen péptido S fueron aislados por cromatografía de afinidad en gel de agarosa de proteína S. Complejos reticulados con formaldehído analizados por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS al 6%. Un complejo de peso molecular que no se encuentra en el control mesura CD4-Spep ficticio + fue identificado. Proteínas virales gpl20 y gpl60 fueron también visibles, probablemente aisladas a través de la asociación no covalente con CD4-Spep. La detección de complejos de alto peso molecular purificados por afinidad de S (es decir CD-Spep) y marcados metabólicamente (es decir envoltura) sugiere que los complejos reticulados pueden ser aislados para estudio adicional. Para continuar el análisis de estos complejos de altos pesos moleculares, se examinaron complejos reticulados DTSSP. Se analizaron complejos purificados por afinidad con proteína S resueltos por electroforesis en gel de poliacrilamida 6%/SDS A con o sin tratamiento previo con 50mM DTT. Complejos específicos para envoltura fueron incapaces de ser resueltos claramente arriba de los aislados a partir del control de CD4-Spep ficticio +, con reticulados de DTSSP intactos. Se detectó poca gpl20, gpl60. sin embargo, la inversión de la reticulación con DTSSP resulta en la liberación especifica de proteínas gpl20 y gpl 60. Estos datos confirman que la formación de complejos envoltura CD4 que se observa empleando fijación con formaldehído y subrayan la potencia en el uso de agentes de reticulación reversibles. Esos datos soportan la utilidad del marcador de afinidad de CD4-Spep y las metodologías de reticulación química en el aislamiento de complejos asociados con CD4 activos para la fusión. Co-receptores CCR5 (CCR5-Spep) , CXCR4 (CXCR4-Spep) envoltura viral (Env-Spep) marcados con péptido S han sido producidos y pueden ser empleados para aislar los complejos activos para la fusión. Complejos aislados pueden ser empleados para definir la estructura molecular asociada con la progresión de la fusión de membrana mediada por envoltura. Se efectuaron estudios para determinar se la proteína de envoltura puede ser co-purificado con CD4-Spep o CCR5-Spep. Células 293T humanas fueron transfectadas separadamente con una proteína de envoltura 168P y a)CD4-Spep, o bien b)CCR5-Spep y CD4 o bien c) de manera ficticia, las células que expresan la envoltura fueron co-cultivadas con socios de A fusión (a-c) durante 5 horas y los complejos fueron solubilizados empleando 1% de detergente Brij-97 (Lapham et al., 1996) y aislados empleando cromatografía por afinidad con proteína S. La proteína de envoltura co-purificada empleando Brij-97 fue detectada por análisis Western blot empleando mAb 50.1 dirigido hacia el V-3 VIH (figura 11) . Como se anticipó, una gran cantidad de proteína de envoltura 168P pudo aislarse después del co-cultivo con células que expresan CD4-Spep. Una cantidad menor pero significativa de proteína de envoltura pudo también aislarse después de co-cultivo con células CD4 y CCR5-Spep. Una proteína de envoltura contaminante no fue detectable a partir de co-cultivos con células transfectadas de manera ficticia.

Complejos fueron aislados a partir de co-cultivos competentes para fusión reticulados con formaldehído en experimentos similares . Estos resultados sugieren fuertemente que complejos de proteína de envoltura CD4 y CCR5 surgen de manera temprana durante la fusión y pueden ser aislados por cromatografía por afinidad con proteína S. estas moléculas purificadas con proteína S y complejos pueden ser empleados como "virus divididos" o bien inmunógenos de vacuna subunitarios . Ejemplo 7: virus de vaccinia recombinantes que generan FRMS competentes para la fusión en cultivo celular o en el sitio de la vacunación. Otros enfoques aceptables de vacunas para traducirlas en la invención en una formulación práctica incluyen el uso de vectores virales. Por ejemplo la co-administración de virus de vaccínea recombinantes que expresan el CD4/CCR5, respectivamente, pueden impulsar la fusión celular in si tu. En una modalidad, dos virus de vaccínea recombinantes uno que expresa la proteína de envoltura 168P VIH (re-168Penv) y el segundo que expresa CD4 y co-receptor CCR5 (rV-CD4-CCR5) fueron construidos. Co-cultivos de células infectadas por rV-168Penv y células infectadas con rV-CD4/CCR5 fueron competentes para la fusión y proporcionaron sin sitios con varios núcleos (figura 12) . Células rV-168Penv, Células rV-CD4/CCR5 o bien células rV168Penv y células rV-CD4CCR5 co-cultivadas reticuladas fueron empleadas como FRMS para vacunar ratones transgénicos, de conformidad con lo descrito arriba. Sueros obtenidos a partir de ratones son vacunados con células rV-168Penc y rV-CD4/CCR5 co-cultivadas reticuladas capaces de neutralización de virus a través de varias clases de VIH lo que indica que los vectores virales pueden ser empleados exitosamente en los métodos de la invención en la formación de las FRMS . Se entenderá que los ejemplos y las modalidades descritas aquí son solamente para propósitos ilustrativos y que varias modificaciones o cambios tomando en cuenta estas modalidades y ejemplos serán aparentes a expertos en la materia y deben incluirse dentro del espíritu y alcance de esta solicitud y en el alcance de las reivindicaciones anexas. La presente invención no se limita en cuanto a su alcance a las modalidades especificas descritas aquí. De hecho, varias modificaciones de la invención además de las descritas aquí serán aparentes a un experto en la materia a partir de la descripción anterior y a partir de los dibujos anexos. Tales modificaciones se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Se citan varias referencias arriba, incluyendo solicitudes de patente, patentes, y publicaciones, cuyas divulgaciones se incorporan aquí por referencia en sus totalidades.

Claims (106)

1. REIVINDICACIONES Una estructura molecular aislada que comprende un epítopo formado como el resultado de la asociación de (a) una proteína de envoltura de un virus envuelto, con (b) una o varias proteínas de membrana celular, dicha proteína de envoltura y dichas proteínas de membrana celular son necesarios y suficientes en condiciones adecuadas para la fusión de dicha envoltura del virus con una membrana de célula que contiene dichas proteínas de membrana celular.
2. Una estructura molecular aislada que comprende un epítopo formado como el resultado de la asociación de (a) una proteína de envoltura de VIH, o un mutante de la misma, que se ensambla en la envoltura viral; con (b) CD4 humano y un co-receptor para fusión de VIH.
3. La estructura molecular de la reivindicación 2 en donde el co-receptor es CCR5 o CXCR4.
4. La estructura molecular de la reivindicación 2 que se forma mediante la asociación de un mutante de gp41 de VIH que es defectuoso para la fusión.
5. La estructura molecular de la reivindicación 4 en donde el mutante contiene una o varias mutaciones seleccionadas dentro del grupo que consiste de V2E, G10V, V570R, y Y586E.
6. La estructura molecular de conformidad con la reivindicación 2 que se forma mediante la asociación de una proteína de envoltura de VIH de tipo silvestre.
7. La estructura molecular aislada que comprende un epítopo formado como resultado de la asociación de (a) una proteína de envoltura mutante de un virus envuelto, dicha proteína de envoltura en forma de tipo silvestre funciona en la fusión de la envoltura viral con una membrana de célula huésped, y dicha proteína de envoltura mutante es defectuosa para la fusión; y (b) una o varias proteínas de membrana celular de huésped que funcionan como receptores para dicha proteína de envoltura.
8. La estructura molecular de conformidad con la reivindicación 1 o bien de conformidad con la reivindicación 7 en donde dicho virus es de una familia viral que se selecciona dentro del grupo que consiste de Retroviridae, Rhabdoviridae, Caronaviridae, Filoviridae, Poxviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Herpesviridae .
9. La estructura molecular de conformidad con la reivindicación 1 o bien de conformidad con la reivindicación 7 en donde la proteína de envoltura es El y E2 de HCV y la proteína de membrana celular es CD81.
10. 10. La estructura molecular de conformidad con la reivindicación 1 o de conformidad con la reivindicación 7 que es una estructura molecular celular reticulada.
11. 11. La estructura molecular de conformidad con la reivindicación 2 que es una estructura molecular celular reticulada.
12. 12. La estructura molecular de conformidad con la reivindicación 1 o de conformidad con la reivindicación 7 que es aislada de un lisado de células.
13. 13. La estructura molecular de conformidad con la reivindicación 2 que es aislada de un lisado de células . A
14. 14. La estructura molecular de conformidad con la reivindicación 10 en donde la estructura molecular celular comprende células que expresan de manera recombinante la proteína de envoltura.
15. 15. La estructura molecular de conformidad con la reivindicación 11 en donde la estructura molecular celular comprende células que expresan de manera recombinante la proteína de envoltura.
16. 16. La estructura molecular de conformidad con la reivindicación 12 en donde el lisado de células es de varias células que comprenden células que expresan de manera recombinante la proteína de envoltura.
17. 17. La estructura molecular de conformidad con la reivindicación 14 en donde la estructura molecular celular comprende además células que expresan de manera recombinante una o varias proteínas de membrana celular de huésped.
18. 18. Un virus envuelto recombinante, en donde dicho virus expresa de manera recombinante en su envoltura un receptor de célula para una proteína de envoltura nativa de dicho virus.
19. 19. El virus de conformidad con la reivindicación 18 que es VIH, y en donde dicho receptor de célula es CD4 humano o un co-receptor para VIH, o bien dicho virus expresa de manera recombinante tanto CD4 humano y dicho co- A receptor.
20. 20. La estructura molecular de la reivindicación 1 en donde dichas condiciones adecuadas comprenden una disminución del pH.
21. 21. La estructura molecular de conformidad con la reivindicación 11 en donde la estructura molecular celular reticulada comprende además una partícula viral reticulada de dicho virus, que contiene dicha proteína de envoltura.
22. 22. Una formulación de vacuna que comprende una cantidad inmunogénica de la estructura molecular de cualesquiera de las reivindicaciones 1-4, 6 y 8; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
23. 23. Un anticuerpo monoclonal para la estructura molecular de la reivindicación 1 o de la reivindicación 7.
24. 24. Un anticuerpo monoclonal para la estructura molecular de la reivindicación 2.
25. 25. Un antisuero policlonal purificado específico para la estructura molecular de la reivindicación 2.
26. 26. Un gel, una espuma, una crema o un ungüento contraceptivo que comprende una cantidad del anticuerpo de la reivindicación 23 efectiva para inhibir o disminuir la infección por el virus.
27. 27. Un gel, una espuma, una crema o un ungüento contraceptivo que comprende una cantidad del anticuerpo A de la reivindicación 24 que es efectiva para inhibir o disminuir una infección por VIH.
28. 28. Un gel, una espuma, una crema o un ungüento contraceptivo que comprende una cantidad del antisuero de la reivindicación 25 efectiva para inhibir o disminuir una infección por VIH.
29. 29. Una muestra de sangre de mamífero, a la cual se ha agregado una cantidad del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23 efectiva para inhibir o disminuir una infección por el virus.
30. 30. Una muestra de sangre humana, a la cual se ha agregado una cantidad del anticuerpo de la reivindicación 24 efectiva para inhibir o disminuir una infección por VIH.
31. La estructura molecular de conformidad con la reivindicación 1 o de conformidad con la reivindicación 7 en donde dicha proteína de envoltura o proteínas de membrana celular de huésped comprende además un marcador de afinidad.
32. La estructura molecular de conformidad con la reivindicación 2 en donde dicha proteína de envoltura, CD4 o bien co-receptor comprende además un marcador de afinidad.
33. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23 que es marcado .
34. A Un conjunto de elementos que comprende en uno o varios recipientes un anticuerpo monoclonal marcado para la estructura molecular de la reivindicación 1.
35. Un conjunto de elementos que comprende en uno o varios recipientes un anticuerpo monoclonal marcado para la estructura molecular de la reivindicación 2.
36. El conjunto de elementos de conformidad con la reivindicación 34 que comprende además en un recipiente separado la estructura molecular de la reivindicación 1.
37. El conjunto de elementos de conformidad con la reivindicación 35 que comprende además en un recipiente separado la estructura molecular de la reivindicación
38. 38. Una línea de células que expresa de manera recombinante una proteína de envoltura de un virus envuelto que funciona en la fusión de la envoltura viral con una membrana de célula huésped, o bien una forma mutante de dicha proteína de envoltura que es defectuosa para la fusión, dicha línea de células expresa una o varias proteínas de membrana celular que funcionan como receptores para dicha proteína de envoltura.
39. 39. La línea de células de conformidad con la reivindicación 38 en donde dicha proteína o dichas proteínas que funcionan como receptores son expresadas de manera recombinante.
40. 40. Una línea de células que expresa de manera recombinante gpl 60 de VIH, dicha línea de células expresa CD4 y un co-receptor para VIH; dicha línea de células no tiene una proteasa funcional que disocia gpl 60 para producir gpl20 y gp41.
41. 41. Un método para el tratamiento o la prevención de infección por un virus en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad inmunogénica de la estructura molecular de la reivindicación 1 o de la reivindicación 7 efectiva para tratar o prevenir infección por el virus.
42. 42. Un método para el tratamiento o la prevención de infección por un virus en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad inmunogénica de la estructura molecular de la reivindicación 10 efectiva para tratar o prevenir una infección por el virus .
43. 43. Un método para el tratamiento o la prevención de infección por un virus en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad inmunogénica de la estructura molecular de la reivindicación 12 efectiva para tratar o prevenir infección por el virus.
44. 44. Un método para el tratamiento o la prevención de infección por VIH en un ser humano, que comprende la administración al ser humano de una cantidad inmunogénica de la estructura molecular de la reivindicación 2 efectiva para el tratamiento o la prevención de infección por VIH.
45. 45. Un método para el tratamiento o la prevención de infección por VIH en un ser humano, que comprende la administración al ser humano de una cantidad inmunogénica de la estructura molecular de cualesquiera de las reivindicaciones 3-6 efectiva para el tratamiento o la prevención de infección por VIH.
46. 46. El método de conformidad con la reivindicación 41 en donde el sujeto es un ser humano.
47. 47. El método de conformidad con la reivindicación 41 en donde el sujeto es un animal doméstico.
48. Un método para el tratamiento o la prevención de infección por un virus en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 23 efectiva para el tratamiento o la prevención de infección por el virus.
49. Un "método para el tratamiento o la prevención de infección por VIH en un ser humano, que comprende la administración al ser humano de una cantidad del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 24 efectiva para el tratamiento o la prevención de infección por VIH.
50. El método de conformidad con la reivindicación 49 en donde dicho ser humano presenta un alto riesgo de infección por VIH.
51. Un método para el tratamiento o la prevención de infección por VIH en un feto humano, que comprende la administración a una mujer embarazada que tiene dicho feto de una cantidad del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 24 efectiva para el tratamiento o la prevención de infección por VIH en dicho feto.
52. El método de conformidad con la reivindicación 49 que es para el tratamiento de SIDA en dicho ser humano.
53. Un método para inhibir una infección por un virus en una muestra de sangre, que comprende la puesta en contacto de dicha muestra de sangre con una cantidad del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 23 efectiva para inhibir una infección por dicho virus.
54. Un método para inhibir una infección por VIH en una muestra de sangre humana, que comprende la puesta en contacto de dicha muestra de sangre humana con una cantidad del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 24 efectiva para inhibir una infección por VIH.
55. Un método para descontaminar herramientas quirúrgicas o dentales, que comprende la puesta en contacto de dichas herramientas con una cantidad del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 23 efectiva para inhibir una infección por dicho virus.
56. Un método para descontaminar herramientas quirúrgicas o dentales, que comprende la puesta en contacto de dichas herramientas con una cantidad del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 24 efectivo para inhibir una infección por VIH.
57. Un método para monitorear la producción de anticuerpo para la estructura molecular de la reivindicación 1 o de la reivindicación 7 en un sujeto que recibió previamente una cantidad de la estructura molecular de la reivindicación 1 o de la reivindicación 7 que comprende el aislamiento a partir de dicho sujeto de una muestra que comprende suero; y la detección de la presencia de anticuerpos para la estructura molecular de la reivindicación 1 o de la reivindicación 7 en dicho suero.
58. El método de conformidad con la reivindicación 57 en donde dicha detección se efectúa mediante un método que comprende la realización de un inmunoensayo competitivo con anticuerpo marcado para la estructura molecular de la reivindicación 1 o de la reivindicación 7.
59. Un método para producir un inmunógeno para su uso en una vacuna para el tratamiento o la prevención de infección por un virus, que comprende los siguientes pasos en el orden indicado: A (a) la puesta en contacto de una proteína de envoltura o de una forma quimérica de la misma de un virus envuelto, dicha proteína de envoltura funciona en la fusión de la envoltura viral con una membrana de célula, o bien una forma mutante o una forma quimérica de la misma de dicha proteína de envoltura que es defectuosa para la fusión, con una o varias proteínas de célula o formas quiméricas de las mismas que funcionan como receptores para dicha proteína de envoltura; y (b) la exposición de dicha proteína de envoltura o forma quimérica de la misma o forma mutante o forma quimérica de la misma, y dicha o dichas proteínas de célula huésped o formas quiméricas de las mismas, a un agente de reticulación; y (c) aislar una estructura reticulada que comprende dicha proteína de envoltura o forma quimérica de la misma o forma mutante o forma quimérica de la misma.
60. El método de conformidad con la reivindicación 59 en donde dicho virus es VIH y dichas proteínas de célula huésped son CD4 y un co-receptor para VIH.
61. Un método para la producción de un inmunógeno para su uso en una vacuna para el tratamiento o la prevención de infección por VIH, que comprende los siguientes pasos en el orden indicado: (a) el co-cultivo de una primera célula que expresa recombinantemente una proteína de envoltura de VIH o una forma quimérica de la misma, o una forma mutante o una forma quimérica de la misma de dicha proteína de envoltura que es defectuosa para la fusión, con una segunda célula que expresa (i) CD4 humano o una forma quimérica del mismo, y (ii) un co-receptor para VIH o una forma quimérica del mismo; y (b) la exposición de dicha proteína de envoltura o forma quimérica de la misma o forma mutante o forma quimérica de la misma, y dicho CD4 o forma quimérica del mismo y co-receptor o forma quimérica del mismo, a un agente de reticulación; y (c) el aislamiento de una estructura reticulada que comprende dicha proteína de envoltura o forma quimérica de la misma o forma mutante o forma quimérica de la misma.
62. 62. El método de conformidad con la reivindicación 61 en donde dicha segunda célula expresa de manera recombinante CD4 o dicho co-receptor o tanto CD4 como dicho co-receptor o formas quiméricas de cualesquiera de los anteriores.
63. 63. El método de conformidad con la reivindicación 61 en donde dicha primera célula y dicha segunda célula son el mismo tipo de célula.
64. 64. El método de la reivindicación 61 en donde dicha primera célula y dicha segunda célula son tipos diferentes de célula.
65. 65. El método de conformidad con la reivindicación 59 en donde en el paso (a) , dicha proteína de envoltura o forma quimérica de la misma o forma mutante o forma quimérica de la misma se encuentra presente en una partícula viral o partícula de tipo virus.
66. 66. El método de conformidad con la reivindicación 61 en donde dicha estructura reticulada es un complejo celular reticuládo.
67. 67. El método de conformidad con la reivindicación 59 en donde el virus se selecciona dentro del grupo que consiste de Retroviridae, Rhabdoviridae, Caronaviridae, Filoviridae, Poxviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, y Herpesviridae .
68. 68. El método de conformidad con la reivindicación 65 en donde dicho paso de puesta en contacto ocurre mediante la infección de células que expresan dichas proteínas de célula huésped con dicho virus que expresa dicha proteína de envoltura o forma quimérica de la misma o forma mutante o forma quimérica de la misma.
69. 69. El método de conformidad con la reivindicación 59 en donde una forma quimérica de dicha proteína de envoltura o una de dichas proteínas de célula huésped es puesta en contacto, dicha forma quimérica comprende un marcador de afinidad.
70. 70. El método de conformidad con la reivindicación 61 en donde una forma quimérica de dicha proteína de envoltura o CD4 o dicho co-receptor es puesto en contacto, dicha forma quimérica comprende un marcador de afinidad.
71. 71. Un método para la producción de un inmunógeno para su uso en una vacuna para el tratamiento o la prevención de una infección por VIH, que comprende las segundas etapas en el orden indicado: (a) el co-cultivo de una primera célula que expresa de manera recombinante una proteína de envoltura de VIH o una forma quimérica de la misma, o una forma mutante o una forma quimérica de la misma de dicha proteína de envoltura que es defectuosa para la fusión, con una segunda célula que expresa (i) CD4 humano o una forma quimérica del mismo, y' (ii) un co-receptor para VIH o una forma quimérica del mismo en donde se expresa por lo menos una de varias formas quiméricas que comprenden un marcador de afinidad; y (b) el lisado de dichas células co-cultivadas para formar un lisado de células en condiciones no desnaturalizantes; y (c) aislar a partir de dicho lisado de células una estructura molecular que comprende dicha proteína de envoltura o forma quimérica de la misma o forma mutante o forma quimérica de la misma mediante un método que comprende la puesta en contacto de dicho lisado de células con un socio de enlace para dicho marcador de afinidad y la recuperación de una estructura molecular unida a dicho marcador de afinidad.
72. 72. Una estructura reticulada que es el producto del método de la reivindicación 59.
73. 73. Una estructura reticulada que es el producto del método de la reivindicación 60.
74. 74. Una estructura reticulada que es el producto del método de la reivindicación 61.
75. 75. Una estructura reticulada que es el producto del método de la reivindicación 62.
76. 76. Un anticuerpo monoclonal para la estructura de la reivindicación 60 que neutraliza in vitro los siguientes aislados primarios de VIH: 92US657, 92US660, 92RW023, 93IN101, 92UG035, y 92TH023.
77. 77. Un gel, una espuma, una crema o un ungüento contraceptivo que comprende una cantidad del anticuerpo de la reivindicación 76 para inhibir o disminuir una infección por VIH-
78. 78. Un método para el tratamiento o la prevención de infección por un virus en un sujeto, que comprende la administración al sujeto de una cantidad inmunogénica de la estructura de la reivindicación 72 efectiva para tratar o prevenir una infección por el virus.
79. 79. Un método para el tratamiento o la prevención de infección por VIH en un ser humano, que comprende la administración al ser humano de una cantidad inmunogénica de la estructura de la reivindicación 73 efectiva para tratar o prevenir una infección por VIH.
80. 80. Un método para el tratamiento o la prevención de infección por VIH en un ser humano, que comprende la administración al ser humano de una cantidad inmunogénica de la estructura molecular de la reivindicación 74 efectiva para tratar o prevenir infección por VIH.
81. 81. Un método para descontaminar herramientas quirúrgicas o dentales, que comprende la puesta en contacto de dichas herramientas con una cantidad del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 76 efectiva para inhibir una infección por VIH.
82. 82. Un método para descontaminar herramientas quirúrgicas o dentales, que comprende la puesta en contacto de dichas herramientas con una cantidad del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 23 efectiva para inhibir una infección por dicho virus.
83. 83. Un método para tamizar una estructura molecular para eficacia de vacuna, que comprende la inmunización de un mamífero no humano transgénico con la estructura molecular de la reivindicación 2, en donde dicho mamífero no humano transgénico expresa, a partir de uno o varios transgenes, tanto CD4 humano como un co- receptor para VIH, y la detección de anticuerpos neutralizantes para VIH producidos por dicho mamífero.
84. 84. Un método para el tamizado de una estructura molecular para eficacia de vacuna, que comprende la inmunización de un mamífero no humano transgénico con la estructura molecular de la reivindicación 1, en donde dicho mamífero no humano transgénico expresa, a partir de un o varios transgenes, dicha (s) proteína (s) de membrana celular de huésped; y la detección de anticuerpos neutralizantes para dicho virus que son producidos por dicho mamífero.
85. 85. El mamífero de conformidad con la reivindicación 83 el cual es un ratón. A
86. 86. El método de conformidad con la reivindicación 61 en donde dicha primera célula expresa de manera recombinante una proteína de envoltura de VIH o una forma quimérica de la misma.
87. 87. Un conjunto de elementos que comprende en uno o varios recipientes la estructura molecular de la reivindicación 1.
88. 88. El conjunto de elementos de la reivindicación 87 que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable, y en donde dicha estructura molecular se encuentra presente en una cantidad inmunológica.
89. 89. Un complejo de proteína aislado que comprende una proteína de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 que interactúa funcionalmente con CD4 humano y CCR5 humano .
90. 90. Una formulación de vacuna que comprende el complejo de proteína de la reivindicación 89 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
91. 91. Un método para inmunizar un animal contra un virus, que comprende los pasos de administrar al animal una formulación de vacuna de la reivindicación 90 que incluye un complejo de proteína que comprende una o varias proteínas virales que interactúan funcionalmente con uno o varios receptores o co-receptores celulares de huésped para mediar la unión, penetración y/o A infección viral; por lo que se generan anticuerpos neutralizantes para el virus.
92. 92. Un método para la preparación de un complejo de proteína que comprende una o varias proteínas virales que interactúan funcionalmente con uno o varios receptores o co-receptores celulares de huésped para mediar la unión, penetración y/o infección viral, que incluye los pasos de: a) cultivar una primera célula que expresa una o varias proteínas virales; b) cultivar una segunda célula que expresa uno o varios receptores o co-receptores celulares de huésped para dicha o dichas proteínas virales; c) co-cultivar la primera célula y la segunda célula; d) fijar dicho co-cultivo durante la fusión célula-célula; y e) aislar las células fijadas.
93. Células fijadas elaboradas por el método de la' reivindicación 92.
94. Un método para purificar un complejo de proteína que comprende una proteína de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 que interactúa funcionalmente con CD4 humano y CCR5 humano, que A incluye los pasos de: a) marcar el complejo con una secuencia de péptidos para facilitar la purificación subsecuente; y b) aislar el complejo marcado.
95. Un método para el tratamiento o la prevención de infección por un virus en un sujeto que comprende la administración al sujeto (a) de un primer ácido nucleico que codifica una proteína de envoltura de un virus envuelto; y (b) un segundo ácido nucleico que codifica una o varias proteínas de membrana celular, dicha proteína de envoltura y dichas proteínas de membrana celular son necesarias y suficientes en condiciones adecuadas para la fusión de dicha envoltura del virus con una membrana de célula que contiene dichas proteínas de membrana celular, de tal manera que la proteína de envoltura y las proteínas de membrana celular son expresadas en el sujeto y se producen anticuerpos neutralizantes para el virus.
96. 96. El método de conformidad con la reivindicación 95 en donde el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico son el mismo.
97. 97. El método de conformidad con la reivindicación 95 en donde el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico son vectores de ácido nucleico diferentes.
98. 98. El método de conformidad con la reivindicación 95 en donde la proteína de envoltura es una proteína de envoltura de VIH, y las proteínas de membrana celular son CD4 y un co-receptor para VIH.
99. 99. Una formulación de vacuna que comprende (a) un primer ácido nucleico que codifica una proteína de envoltura de un virus envuelto; y (b) un segundo ácido nucleico que codifica una o varias proteínas de membrana celular, dicha proteína de envoltura y dichas proteínas de membrana celular son necesarias y suficientes en condiciones adecuadas para la fusión de dicha envoltura del virus con una membrana de célula que contiene dichas proteínas de membrana celular, de tal manera que la proteína de envoltura y las proteínas de membrana celular sean expresadas en el sujeto y de t al manera que se produzcan anticuerpos neutralizantes para el virus; y (c) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
100. 100. El método para el tratamiento de un huésped que ha estado expuesto a un virus o para prevenir una infección de un huésped por dicho virus, el método comprende los pasos de administrar al huésped anticuerpos generados por la inmunización de un animal con el complejo de proteína de la reivindicación 89 en una cantidad efectiva para tratar o prevenir infección por dicho huésped. 1.
101. Un complejo de proteína aislado que comprende una proteína de envoltura de virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1 que interactúa funcionalmente como CD4 humano y CCR5 humano, en donde uno o varios de los siguientes: proteína de envoltura, CD4 o CCR5, es marcado con un péptido. 2.
102. Un conjunto de elementos que comprende en uno o varios recipientes (a) un primer ácido nucleico que codifica una proteína de envoltura de un virus envuelto; y (b) un segundo ácido nucleico que codifica una o varias proteínas de membrana celular, dicha proteína de envoltura y dichas proteínas de membrana celular son necesarias y suficientes en condiciones adecuadas para la fusión de dicha envoltura del virus con una membrana de célula que contiene dichas proteínas de membrana celular, de tal manera que la proteína de envoltura y las proteínas de membrana celular sean expresadas en el sujeto y de tal manera que se produzcan anticuerpos neutralizantes para el virus.
103. 103. Una composición que comprende (a) el anticuerpo monoclonal de la reivindicación 23; (b) dicha proteína de envoltura de un virus envuelto; y (c) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
104. 104. Un método para el tratamiento o la prevención de infección por un virus en un sujeto que comprende la administración al sujeto de una cantidad de la composición de la reivindicación 103 efectiva para tratar o prevenir una infección por el virus.
105. 105. El método de conformidad con la reivindicación 92, en donde se emplea un vector viral de vaccinia para expresar dicho o dichos receptores o co-receptores celulares de huésped en dicha segunda célula.
106. 106. El método de conformidad con la reivindicación 92, en donde se emplea un vector viral de vaccinia para expresar dicha o dichas proteínas virales en dicha primera célula.