ES2875762T3

ES2875762T3 - Uso terapéutico de ligando específico en enfermedades asociadas a MSRV

Info

Publication number: ES2875762T3
Application number: ES17159699T
Authority: ES
Inventors: Corinne Bernard; Alois Lang; Hervé Perron; Jean-Baptiste Bertrand
Original assignee: Geneuro SA
Current assignee: Geneuro SA
Priority date: 2008-07-08
Filing date: 2009-07-08
Publication date: 2021-11-11
Anticipated expiration: 2029-07-08
Also published as: KR20110031969A; JP2011527887A; WO2010003977A1; EA024655B1; JP6495361B2; CA2729869A1; PL2315777T3; IL210204A0; SI2315777T1; US9815888B2; HRP20171067T1; IL210204A; PL3211005T3; BRPI0915667B8; KR101682040B1; US20170107274A1; HUE054712T2; MX2010014319A; JP2015157812A; CN102143975B

Abstract

Un ligando que comprende - las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable de cadena ligera (VL): CDR1, CDR2 y CDR3 respectivamente expuestas en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, - las tres CDR de la región variable de cadena pesada (VH): CDR4, CDR5 y CDR6 respectivamente expuestas en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, en el que dicho ligando se une al antiligando que consiste en la secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 32, y dicho ligando se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento scFv y un fragmento Fab, y en el que dicho ligando es para su uso en un método de tratamiento.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso terapéutico de ligando específico en enfermedades asociadas a MSRV

Sector de la técnica

El objetivo de la presente solicitud es un ligando que presenta unión significativa a una molécula diana, el antiligando.

Estado de la técnica

De acuerdo con la presente invención, el "antiligando" es la proteína ENV (envoltura) de MSRV, MSRV para "retrovirus asociado a esclerosis múltiple" (Perron, et al. (1997). "Molecular identification of a novel retrovirus repeatedly isolated from patients with multiple sclerosis. The Collaborative Research Group on Multiple Sclerosis." Proc Natl Acad Sci USA 94(14): 7583-8.). La "proteína ENV de MSRV" debe entenderse como el producto completo o parcial codificado por genes ENV de MSRV como se define en Komurian-Pradel, F, et al. (1999). Virology 260(1): 1-9, y Rolland A, et al. (2006) J Immunol 176(12): 7636-44 o cualquier molécula que imite las propiedades antigénicas o de unión de ENV de MSRV (mimótopo). "ENV-T" se corresponde a la proteína completa, que se detalla en el ejemplo 2 (restos 1 a 542) y "ENV-SU" también llamada ENV-1 corresponde a la secuencia S30 a K316 como se detalla en el ejemplo 2. ENV-SU también se menciona en Rolland A, et al. (2006) J Immunol 176(12): 7636 44. De forma habitual para retrovirus, MSRV muestra variabilidad en su proteína de envoltura ENV (Perron, H et al. (2000) J Neurovirol 6: S67-75; Voisset, C., O. Bouton, et al. (2000) AIDS Res Hum Retroviruses 16(8): 731-40). Los mimótopos que imitan fragmentos proteicos parciales de ENV de MSRV han demostrado existir y unirse selectivamente por anticuerpos de pacientes con esclerosis múltiple (Jolivet-Reynaud, C., H. Perron, et al. (1999). "Specificities of multiple sclerosis cerebrospinal fluid and serum antibodies against mimotopes." Clin Immunol 93(3): 283-93 PERRON HERVE ET AL: "Monoclonal antibody against envelope protein from Human Endogenous Retrovirus "W' (MSRV-ENV or Syncytin) inhibits TLR4-initated immunotoxicity cascade in human peripheral blood mononuclear cells and displays therapeutic effects in novel preclinical models for Multiple Sclerosis",JOURNAL OF NEUROVIROLOGY, vol. 13, n.° Supl. 1, 2007, páginas 112-113, y 8TH INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON NEUROVIROLOGY; SAN DIEGO, CA, EE. UU.; 30 de octubre-2 de noviembre de 2007 ISSN: 1355-0284 desvelan el uso de un anticuerpo anti-MSRV para tartar encefalomielitis alérgica experimental EAE inducida por MRSV/ENV en ratones SCID humanizados. No hay, sin embargo, ninguna divulgación de secuencias de anticuerpos en este resumen.

Objeto de la invención

La invención se refiere a un ligando como se define en las reivindicaciones.

La presente invención se refiere a un ligando que se une al antiligando que consiste en la secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 32 y que comprende cada una de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tiene las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 y la presente descripción también desvela cualquier secuencia que tenga:

varios aminoácidos sustituidos en dichas secuencias como se indica a continuación, y que se sabe que son factibles para obtener secuencias de aminoácidos funcionalmente equivalentes (Huang 1986; Zabin, Horvath et al. 1991; Edgar y Schwartz 1992; Sardana, Emini et al. 1992; Xu, Kapfer et al. 1992; Lamande y Bateman 1993; Verdoliva, Ruvo et al. 1995; Yu, Schurr et al. 1995; Wehrmann, Van Vliet et al. 1996; Ullmann, Hauswald et al.

1997; Minuth, Kramer et al. 1998; Ullmann, Hauswald et al. 2000; Janke, Martin et al. 2003): de 0 a 3 en CDR1 (SEQ ID NO: 1), de 0 a 2 en CDR2 (SEQ ID NO: 2), de 0 a 2 en CDR3 (SEQ ID NO: 3), de 0 a 1 en CDR4 (SEQ ID NO: 4), de 0 a 4 en CDR5 (SEQ ID NO: 5), de o a 2 en CDR6 (SEQ ID NO: 6), o

- aminoácidos sustituidos con otros aminoácidos que tienen funciones o propiedades químicas equivalentes, bien conocidos por los expertos en la materia (también llamados "similitud de aminoácidos") como se indica, por ejemplo, en la siguiente lista de aminoácidos similares (código de una letra): G o A, F o Y, D o E, N o Q, K o R o H, S o T, C o M, V o L o I, W o P, y/o sustituidos de acuerdo con la técnica anterior (Huang 1986; Zabin, Horvath et al. 1991; Edgar y Schwartz 1992; Sardana, Emini et al. 1992; Xu, Kapfer et al. 1992; Lamande y Bateman 1993; Verdoliva, Ruvo et al. 1995; Yu, Schurr et al. 1995; Wehrmann, Van Vliet et al. 1996; Ullmann, Hauswald et al. 1997; Minuth, Kramer et al. 1998; Ullmann, Hauswald et al. 2000; Janke, Martin et al. 2003) dentro de dicha secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 6.

Estas variantes son el resultado de deleciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos en los péptidos de las SEQ ID NO: 1 a 6 y también están abarcadas por la presente divulgación y pueden obtenerse por métodos conocidos en la técnica tales como por mutagénesis dirigida al sitio o por síntesis química.

Los ligandos de la presente invención tienen la capacidad de unirse al antiligando de la presente invención.

De acuerdo con la presente invención, por la expresión "unir" o "unión" debe entenderse que el ligando reconoce significativamente el antiligando de acuerdo con los criterios dados en el ejemplo 5.

La presente divulgación también describe un ligando que comprende una región variable de cadena ligera (VL) que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3 o cualquier secuencia que tenga al menos un 80 % de identidad y más preferiblemente un 90 % de identidad con dichas secuencias, y un dominio de región variable de cadena pesada (VH) que comprende las CDR que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 o cualquier secuencia que tenga al menos un 80 % de identidad y más preferiblemente un 90 % de identidad con dichas secuencias.

En un aspecto adicional, el ligando comprende una región variable de cadena ligera (VL) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7 o cualquier secuencia que tenga al menos un 75 % de identidad y más preferiblemente un 80 % e incluso más preferiblemente un 90 % de identidad con dicha secuencia y una región variable de cadena pesada (VH) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 8 o cualquier secuencia que tenga al menos un 75 % de identidad y más preferiblemente un 80 % e incluso más referiblemente un 90 % de identidad con dicha secuencia.

Las variantes de estas secuencias VH y VL según la presente invención se unen significativamente al antiligando. "Identidad de secuencia" significa, por ejemplo, que en una secuencia que tiene un 80 % de identidad de secuencia, están presentes un 80 % de aminoácidos idénticos en la misma posición tras la alineación de las secuencias, pudiendo realizarse dicha alineación por métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en Sequence -Evolution - Function Computational Approaches in Comparative genomics. Koonon E. et al., 2003: Kluwer Academic Publishers o de acuerdo con los parámetros por defecto del libro de instrucciones del software "Mac Vector" (Reino Unido).

El ligando de la presente invención también puede definirse como comprendido dentro de una proteína scFv recombinante.

De acuerdo con aspectos adicionales de la invención, el ligando puede estar comprendido en un fragmento Fab, en un anticuerpo, dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, monoclonal, oligoclonal, quimerizado, modificado por ingeniería o humanizado. En un aspecto particular de la invención, el anticuerpo que comprende ligando es una IgG humana y más particularmente una IgG1 o una IgG4.

Los anticuerpos policlonales, oligoclonales, monoclonales pueden producirse por métodos clásicos tales como los descritos por Kohler y Milstein (1975) o usando los procedimientos descritos en Sambrook et al., A Guide to Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.a edición (1989) usando los antiligandos descritos anteriormente.

Más particularmente, el antiligando de la presente invención que se usa para obtener los anticuerpos es el antiligando que consiste en la SEQ ID NO: 20 o la SEQ ID NO: 32 o, como se desvela, cualquier secuencia que tenga al menos 75 % de identidad de secuencia con las secuencias expuestas en la SEQ ID NO: 20 o la SEQ ID NO: 32 o cualquier secuencia 100 % complementaria con las mismas.

En particular, habitualmente se usa en inmunización en forma de un péptido unido a una proteína vehículo tal como seroalbúmina o KLH.

La invención presente divulgación también se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicho ligando como un principio activo. Este ligando también puede estar presente en la composición farmacéutica en forma de un fragmente scFv, Fab o de un anticuerpo.

La composición farmacéutica se usa para tratar enfermedades asociadas a MSRV.

Dentro del significado de la presente divulgación "tratamiento" abarca tratamientos profilácticos o curativos.

La composición farmacéutica se administra en cantidades que serán terapéuticamente eficaces e inmunogénicas y conocidas en la técnica, la dosificación que se administra depende del individuo a tratar.

En un aspecto adicional, la presente solicitud trata de un método de tratamiento que comprende administrar el ligando, el scFv, el fragmento Fab o el anticuerpo o el ligando en cualquier vector molecular o terapéutico adecuado manteniendo sus propiedades de unión como se describe anteriormente o la composición farmacéutica como se describe anteriormente.

El método de tratamiento está dirigido al tratamiento de enfermedades asociadas a MSRV.

MSRV, es un retrovirus humano aislado por primera vez en pacientes con esclerosis múltiple (Perron, H., B.

Lalande, et al. (1991), Lancet 337(8745): 862-3; Perron, H., J. A. Garson, et al. (1997), Proc Natl Acad Sci USA 94(14): 7583-8). Las enfermedades asociadas o síndromes se definen por la presencia en los pacientes correspondientes (i) de ARN o antígenos específicos de MSRV, preferiblemente detectados en fluidos corporales (sangre, líquido cefalorraquídeo, orina), (ii) de un número de copias elevado de ADN o ARN en células o tejidos de órganos con lesiones o disfunciones, (iii) de proteínas o antígenos específicos de MSRV en células o tejidos implicados en el proceso de la enfermedad o del síndrome clínico, o (iv) de proteínas o antígenos de MSRV en fluidos corporales de individuos con la enfermedad o que expresan el síndrome clínico (como se describe en el ejemplo 8, véase a continuación y otros a continuación). Como MSRV tiene homología genética con la familia de retrovirus endógeno humano de tipo W (HERVW) (Blond et al., 1999; Dolei, 2005; Dolei y Perron, 2008) también pueden obtenerse definiciones alternativas o complementarias de enfermedades asociadas a MSRV con ácidos nucleicos de HERV-W, antígenos o proteínas usados para los mismos ensayos de detección (Antony et al., 2004; Arru et al., 2007; Karlsson et al., 2004; Mameli et al., 2007). Además, la expresión de MSRV puede asociarse con la regulación positiva de ciertas copias de HERV-W codetectadas en lesiones patogénicas (Mameli et al., 2009). Por tanto, la definición de enfermedades asociadas a MSRV comprende de forma implícita la asociación con elementos de HERV-W.

La enfermedad asociada a MSRV se selecciona del grupo que comprende esclerosis múltiple, esquizofrenia, síndrome aislado clínicamente (CIS, con síntomas neurológicos), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, epilepsia, psoriasis, cáncer, pancreatitis inflamatoria y diabetes tal como diabetes de tipo 1 o tipo 2, cuando se asocian con inflamación o desregulación inmunitaria y con la presencia de productos de expresión de MSRV como se define anteriormente.

En una realización particular, el método de tratamiento de enfermedades asociadas a MSRV comprende la administración del anticuerpo IgG4 o IgG1 como tratamiento crónico con inyecciones repetidas regularmente.

En otro aspecto, la presente divulgación trata de una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico de longitud completa expuesta en la SEQ ID NO: 13, SEQ ID nO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 o cualquier secuencia que tenga al menos un 70 % y más preferiblemente un 80 % e incluso más preferiblemente un 90 % de identidad con dichas secuencias o cualquier secuencia un 100 % complementaria de la misma.

"Identidad de secuencia" significa, por ejemplo, que en una secuencia que tiene un 80 % de identidad de secuencia, hay un 80 % de nucleótidos idénticos presentes en la misma posición tras la alineación de las secuencias, pudiendo realizarse dicha alineación por métodos conocidos en la técnica (véase anteriormente).

Preferentemente, la molécula de ácido nucleico comprende cada una de las secuencias expuestas en la SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 o cualquier secuencia que tenga al menos un 70 % y más preferiblemente un 80 % e incluso más preferiblemente un 90 % de identidad con dichas secuencias o cualquier secuencia un 100 % complementaria de las mismas.

En un aspecto adicional de la presente solicitud, el ácido nucleico codifica una cadena VH y, más particularmente, está representado por la SEQ ID NO: 10 o 12 o cualquier secuencia que tenga al menos un 70 % y más preferiblemente un 80 % e incluso más preferiblemente un 90 % de identidad con dichas secuencias o cualquier secuencia un 100 % complementaria de la misma, sin limitación a los porcentajes descritos previamente de sustituciones, inserciones y deleciones que mantienen las propiedades antigénicas y de unión de las moléculas de ligando o antiligando originales (Huang 1986; Zabin, Horvath et al. 1991; Edgar y Schwartz 1992; Sardana, Emini et al. 1992; Xu, Kapfer et al. 1992; Lamande y Bateman 1993; Verdoliva, Ruvo et al. 1995; Yu, Schurr et al. 1995; Wehrmann, Van Vliet et al. 1996; Ullmann, Hauswald et al. 1997; Minuth, Kramer et al. 1998; Ullmann, Hauswald et al. 2000; Janke, Martin et al. 2003).

La secuencia de ácido nucleico también puede codificar una cadena VL que está representada por las secuencia SEQ ID NO: 9 u 11 o cualquier secuencia que tenga al menos un 70 % y más preferiblemente un 80 % e incluso más preferiblemente un 90 % de identidad con dichas secuencias o cualquier secuencia un 100 % complementaria de la misma sin limitación a los porcentajes descritos previamente de sustituciones, inserciones y deleciones que mantienen las propiedades antigénicas y de unión de las moléculas de ligando o antiligando originales (Huang 1986; Zabin, Horvath et al. 1991; Edgar y Schwartz 1992; Sardana, Emini et al. 1992; Xu, Kapfer et al. 1992; Lamande y Bateman 1993; Verdoliva, Ruvo et al. 1995; Yu, Schurr et al. 1995; Wehrmann, Van Vliet et al. 1996; Ullmann, Hauswald et al. 1997; Minuth, Kramer et al. 1998; Ullmann, Hauswald et al. 2000; Janke, Martin et al. 2003).

Cualquier ácido nucleico que hibride en condiciones rigurosas con ácidos nucleicos que codifican al menos uno de los péptidos de acuerdo con la presente divulgación también está abarcado por la presente solicitud. Como se usa en este documento, la expresión "condiciones rigurosas " se refiere a condiciones que permiten la hibridación entre las secuencias de sonda y la secuencia de nucleótidos a detectar. Las condiciones rigurosas adecuadas pueden definirse por, por ejemplo, las concentraciones de sal o formamida en las soluciones de prehibridación e hibridación, o por la temperatura de hibridación, y son bien conocidas en la técnica. En particular, la rigurosidad puede aumentarse reduciendo la concentración de sal, aumentando la concentración de formamida o elevando la temperatura de hibridación. El intervalo de temperatura correspondiente a un nivel particular de rigurosidad puede estrecharse adicionalmente calculando la relación de purina a pirimidina del ácido nucleico de interés y ajustando la temperatura en consecuencia. También se conocen en la técnica variaciones sobre los intervalos y condiciones anteriores.

La presente solicitud también se refiere a un gen quimérico que comprende, unidos de forma funcional entre sí al menos un promotor que es funcional en un organismo hospedador, un ácido nucleico según la presente solicitud y un elemento terminador que es funcional en el mismo organismo hospedador. Los diversos elementos que un gen quimérico puede contener son, en primer lugar, elementos que regulan la transcripción, la traducción y la maduración de proteínas, tales como un promotor, una secuencia que codifica un péptido señal o un péptido de tránsito, o un elemento terminador que constituye una señal de poliadenilación y, en segundo lugar, un polinucleótido que codifica una proteína. La expresión "unidos de forma funcional entre sí" significa que dichos elementos del gen quimérico están unidos entre sí de tal manera que la función de uno de estos elementos se ve afectada por la de otro. A modo de ejemplo, un promotor está unido de forma funcional a una secuencia codificante cuando es capaz de afectar a la expresión de dicha secuencia codificante. La construcción del gen quimérico según la presente solicitud y el ensamblaje de sus diversos elementos puede realizarse usando técnicas bien conocidas para los expertos en la materia, en particular las descritas en Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). La elección de los elementos reguladores que constituyen el gen quimérico depende esencialmente del organismo hospedador en que deben funcionar, y los expertos en la materia son capaces de seleccionar los elementos reguladores que son funcionales en un organismo hospedador dado. El término "funcional" pretende indicar capaz de funcionar en un organismo hospedador dado.

Los promotores que el gen quimérico según la presente solicitud puede contener son constitutivos o inducibles. A modo de ejemplo, un promotor universalmente potente usado para la expresión en células de mamífero es pCMV (promotor de citomegalovirus).

Según la presente divulgación, el gen quimérico también puede comprender otras secuencias reguladoras, que están localizadas entre el promotor y la secuencia codificante, tales como activadores de la transcripción (potenciadores).

La presente divulgación también se refiere a un vector de clonación y/o expresión que comprende un gen quimérico según la solicitud. El vector según la presente solicitud es de utilidad para transformar un organismo hospedador y expresar en este organismo un ligando. Este vector puede ser un plásmido, un cósmido, un bacteriófago o un virus. Preferentemente, el vector de transformación es un plásmido. Generalmente, las cualidades principales de este vector deben ser una capacidad de mantenerse así mismo y de autorreplicarse en las células del organismo hospedador, en particular en virtud de la presencia de un origen de replicación, y de expresar un ligando en el mismo. Para el propósito de transformación estable en un organismo hospedador, el vector también puede integrarse en el genoma. La composición del vector puede entonces limitarse a los elementos necesarios para sintetizar el ligando en los hospedadores. La elección de dicho vector, y también las técnicas de inserción del gen quimérico en este vector, se describen minuciosamente en Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) y son parte del conocimiento general de los expertos en la materia. De forma ventajosa, el vector usado en la presente solicitud también contiene, además del gen quimérico según la presente divulgación, un gen quimérico que codifica un marcador de selección. Este marcador de selección hace posible seleccionar los organismos hospedadores que se transforman de forma eficaz, es decir, aquellos que incorporan el vector. Puede hacerse mención de genes que codifican enzimas fácilmente identificables tales como la enzima GUS, o genes que codifican pigmentos o enzimas que regulan la producción de pigmentos en las células transformadas. Dichos genes marcadores de selección se describen en particular en las solicitudes de patente WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 y WO 97/04103.

La presente divulgación también se refiere a organismos hospedadores transformados que contienen al menos un gen quimérico según la presente divulgación, integrado en su genoma o portado en un elemento genético extracromosómico, por ejemplo, un plásmido. La expresión "organismo hospedador" pretende indicar cualquier organismo monocelular o pluricelular inferior o superior en que puede introducirse el gen quimérico según la presente divulgación para producir un ligando de acuerdo con la presente solicitud. Preferiblemente, el organismo hospedador es células CHO (ovario de hámster chino) o HEK (epitelio de riñón humano).

La expresión "organismo hospedador transformado" pretende indicar un organismo hospedador que ha incorporado en su genoma, o en un elemento genético extracromosómico, por ejemplo, un plásmido, al menos un gen quimérico de acuerdo con la presente divulgación y, por consiguiente, produce un ligando en sus tejidos, o en un medio de cultivo. Para obtener los organismos hospedadores de acuerdo con la presente solicitud, los expertos en la materia pueden usar uno de los muchos métodos de transformación conocidos.

Uno de estos métodos consiste en poner las células o los tejidos de los organismos hospedadores a transformar en contacto con polietilenglicol (PEG) y con los vectores de acuerdo con la presente divulgación (Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168(1), 111-115; Mercenier y Chassy, 1988, Biochimie 70(4), 503-517). La electroporación es otro método, que consiste en someter las células o los tejidos a transformar y los vectores de la presente solicitud a un campo eléctrico (Andreason y Evans, 1988, Biotechniques 6(7), 650-660; Shigekawa y Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1), 56-62). Otro método consiste en inyectar directamente los vectores en las células o en los tejidos por microinyección (Gordon y Ruddle, 1985, Gene 33(2), 121-136). De forma ventajosa, puede usarse el método "biolístico". Consiste en bombardear células o tejidos con partículas en que se han adsorbido los vectores (Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24), 9692-9696; Klein et al., 1992, Biotechnology 10(3), 286-291; patente de Estados Unidos n.° 4.945.050).

La presente divulgación también abarca un método para la producción del ligando, el scFv, el fragmento Fab o los anticuerpos descritos anteriormente, que comprende la etapa de cultivar la célula hospedadora descrita anteriormente en condiciones que permiten la síntesis del ligando, el fragmento Fab o el anticuerpo.

El ligando de la presente solicitud se caracteriza por sus propiedades de unión a un antiligando. En una forma específica, el antiligando de la invención se caracteriza porque consiste en la secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 20, con la selección preferida representada por la SEQ ID NO: 32.

Un método de detección en una muestra biológica del antiligando, usando el ligando en la forma de scFv, un fragmento Fab o un anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación, también es parte de la presente solicitud. El método comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra con el ligando de acuerdo con la presente divulgación, el scFv, el fragmento Fab o un anticuerpo como se describe anteriormente,

(b) detectar la presencia de antiligando en la muestra.

Dicho método de detección puede completarse por una etapa adicional de contacto de la muestra con un ligando que se une específicamente al antígeno GAG de MSRV, codificado por el gen gag de MSRV como se describe en "Komurian-Pradel et al., Virology, 1999; 260(1), páginas 1-9".

De acuerdo con otro aspecto, la presente solicitud también se refiere a un kit de inmunoensayo para la detección del antiligando en una muestra biológica, comprendiendo dicho kit un ligando de acuerdo con la presente divulgación, un scFv, un fragmento Fab o un anticuerpo como se describe anteriormente, y reactivos para la detección de la unión específica del antiligando al ligando anterior, el fragmento Fab o al antígeno, comprendiendo también dicho kit todos los reactivos necesarios para la reacción inmunológica.

Dicho kit puede comprender adicionalmente un ligando que se une específicamente al antígeno GAG, como se define previamente.

De acuerdo con otro aspecto, la presente divulgación también trata con el uso de dicho kit de inmunoensayo, como se describe anteriormente, en la detección de una enfermedad asociada a MSRV seleccionada del grupo que comprende esclerosis múltiple, esquizofrenia, síndrome clínicamente aislado, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, epilepsia, psoriasis, cáncer, pancreatitis inflamatoria y diabetes, y más particularmente diabetes de tipo 1 o diabetes de tipo 2.

La muestra biológica puede ser suero, orina, saliva, material de biopsia y similares.

El diseño de inmunoensayos es convencional en la técnica y los protocolos tales como el uso de soportes sólidos o inmunoprecipitación son técnicas bien conocidas. El anticuerpo puede marcarse con fines de detección usando marcadores enzimáticos, fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivos o colorantes. Los ensayos que amplifican las señales del complejo inmunitario tales como ensayos usando biotina y avidina o estreptavidina e inmunoensayos ligados a enzimas tales como ELISA o ensayos de tipo sándwich son parte de la presente solicitud.

Descripción de las figuras

Figura 1: (A) secuencia de aminoácidos de VL, (B) secuencia de aminoácidos de VH, las secuencias CDR están subrayadas.

Figura 2: estructura de la proteína ENV completa (ENV-T) y el fragmento de escisión superficial (ENV 1 o ENV-SU).

Figura 3: medida de densidad óptica por colorimetría con sustrato de peroxidasa que compara el ligando anticuerpo murino GNb AC1 (IgG1 murino perox) y el fragmento scFv recombinante con ligando (ScFv VH+VL biot) solamente.

La concentración del anticuerpo de recubrimiento y de cada ligando de detección fue 5 pg/ml cada uno; la dilución del conjugado de estreptavidina-peroxidasa fue 1/2000.

Figura 4: medida de densidad óptica por colorimetría con sustrato de peroxidasa que compara el ligando anticuerpo murino GNb AC1 y el fragmento de unión Fab con ligando solamente. La concentración de cada ligando de detección o IgG1 fue 10 ng/ml anti-Fab o anti-IgG con peroxidasa de Jackson diluida a 1/250. Se ensayaron diferentes concentraciones de ENV-T.

Figura 5: ensayo de GNbACI y anticuerpos quiméricos IgG1 e IgG4 de acuerdo con la invención sobre dilución en serie del antígeno ENV (ENV-T). La concentración de los anticuerpos fue 1 |jg/ml y el anticuerpo secundario marcado con peroxidasa anti-IgG 1/250. El anticuerpo 2G5E12 es un anticuerpo irrelevante que no se une al antígeno ENV, usado aquí como control negativo.

Figura 6: ensayo de GNbACI y las construcciones quiméricas de IgG1 e IgG4 sobre la concentración constante de antígeno (ENV-T) sobre dos lotes de ligandos (A) lote 1, (B) lote 2. La concentración de antígeno fue de 1 a 0,0078 de anticuerpo monoclonal murino original (GNb AC1), indicado como mulgG, las construcciones de IgG1 o de IgG4 humana con el ligando (indicado como huIgG1 y huIgG4, jg/ml). La dilución del anticuerpo secundario anti-IgG de ratón o anti-IgG humana de Jackson fue: 1/250.

Figura 7: construcciones de anticuerpo humano quimérico GNbAC1, scFv, IgG1 e IgG4 con ligando: inhibición de la activación pro-inflamatoria de p Bm C por antígeno ENV (ENV SU) representada por la reducción de IL-6. La relación entre el anticuerpo o scFv y el antígeno ENV fue 25/1.

Figura 8: resultados de ApoH-ELlSA. Se ensayaron los sueros del estudio de múltiples centros europeos sobre esclerosis múltiple con enmascaramiento en un laboratorio independiente.

Figura 9: antigenemia de ENV y GAG de MSRV en pacientes con esquizofrenia y controles. Los anticuerpos usados son 2A12A5 y 6A2B2 para ENV y 2G5E12 para GAG.

Figura 10: densidad óptica (DO) de ApoH-ELISA para la detección del antígeno ENV de MSRV con el anticuerpo monoclonal específico 6A2B2.

Figura 11: seguimiento clínico de ratones SCID humanizados que desarrollan neuroinflamación aguda y desmielinización (encefalomielitis alérgica experimental, un modelo animal de esclerosis múltiple): comparación del resultado clínico de grupos tratados con diferentes anticuerpos en comparación con grupos no tratados. El anticuerpo monoclonal murino original (GNb AC1) se indica como mulgG, las construcciones de IgG1 o de IgG4 humana con el ligando se indican como huIgG1 y huIgG4.

Figura 12: curvas de supervivencia de ratones SCID humanizados que desarrollan neuroinflamación aguda y desmielinización (encefalomielitis alérgica experimental, un modelo animal de esclerosis múltiple): comparación del resultado clínico de grupos tratados con diferentes anticuerpos en comparación con grupos no tratados. El anticuerpo monoclonal murino original (GNb AC1) se indica como mulgG, las construcciones de IgG1 o de IgG4 humana con el ligando se indican como huIgG1 y huIgG4.

Figura 13: curvas de peso de cada ratón NOD-SCID ensayado en el presente experimento.

La dosis de la proteína ENV inyectada para cada ratón se indica en paréntesis. La última inyección de la proteína ENV emulsionada en IFA y PTX (P14) se indica por la flecha. Los ratones se llamaron M1 a M6, de acuerdo con la dosis de ENV que han recibido, que se indica al lado del código entre paréntesis (de 0 a 20 microgramos) en la leyenda del gráfico. La interrupción de las curvas corresponde al día de la muerte del animal en la categoría correspondiente.

Figura 14: concentraciones de glucosa en sangre (glucemia) en ratones de control (control) y en ratones NOD-SCID a los que se ha inyectado ENV (ENV): comparación entre el día de la primera inyección (P0) y una semana después de la última inyección (P30). La glucemia medida en P30 se expresa como un porcentaje de la medida a P0 (eje Y) en grupos con inyección simulada e inyectados con ENV (eje X: -controles y "ENV").

Figura 15: definición de CDR de la cadena pesada del anticuerpo GNb AC1.

15A: los aminoácidos identificados de acuerdo con la definición de Chothia se presentan con letra minúscula. Los aminoácidos identificados de acuerdo con la definición de Kabat se presentan con letras subrayadas. 15B: de acuerdo con la definición preferida que combina ambas determinaciones, las regiones ^cD^rmurinas originales a considerar para el injerto del ligando funcional en la cadena pesada variable del anticuerpo IgG4 humano están subrayadas.

Figura 16: definición de CDR de la cadena ligera del anticuerpo GNb AC1.

Las CDR identificadas de acuerdo con la definición de Kabat están subrayadas.

Las CDR identificadas de acuerdo con la definición de contacto (no convencional) tienen letras minúsculas.

Figura 17: actividad de unión del anticuerpo GNb AC1 quimérico a la proteína ENV inmovilizada. Las condiciones se describen en el texto del ejemplo correspondiente. El eje Y representa la medida de densidad óptica (DO) para cada punto por colorimetría y correlaciona la cantidad de anticuerpo unido a la proteína ENV diana. El eje X representa la concentración de la proteína recombinante ENV usada para recubrir los pocillos correspondientes de la microplaca y, después del lavado, obtener un espectro cuantitativo amplio de la proteína inmovilizada en placa correspondiente.

Figura 18: actividad de unión del anticuerpo humanizado H2/VK3 a ENV inmovilizada. Las condiciones se describen en el texto del ejemplo correspondiente. El eje Y representa la mediada de densidad óptica (DO) para cada punto por colorimetría y correlaciona la cantidad de anticuerpo unido a la proteína ENV diana. El eje X representa la concentración de proteína recombinante ENV usada para recubrir los pocillos correspondientes de la microplaca y, después del lavado, obtener un espectro cuantitativo amplio de la proteína inmovilizada en placa correspondiente.

Figura 19: actividad de unión del anticuerpo humanizado H4/VK3 a ENV inmovilizada. Las condiciones se describen en el texto del ejemplo correspondiente. El eje Y representa la mediada de densidad óptica (DO) para cada punto por colorimetría y correlaciona la cantidad de anticuerpo unido a la proteína ENV diana. El eje X representa la concentración de proteína recombinante ENV usada para recubrir los pocilios correspondientes de la microplaca y, después del lavado, obtener un espectro cuantitativo amplio de la proteína inmovilizada en placa correspondiente.

Figura 20: comparación de la actividad de unión del anticuerpo humanizado H2/VK3 (H2vk3) y el anticuerpo quimérico (GNbAC1 IgG4) a ENV inmovilizada. Las condiciones se describen en el texto del ejemplo correspondiente. El eje Y representa la mediada de densidad óptica (DO) para cada punto por colorimetría y correlaciona la cantidad de anticuerpo unido a la proteína ENV diana. El eje X representa la concentración de proteína recombinante ENV usada para recubrir los pocillos correspondientes de la microplaca y, después del lavado, obtener un espectro cuantitativo amplio de la proteína inmovilizada en placa correspondiente.

Figura 21: anticuerpo H2VK3 purificado en condiciones en gel no reductor. Las condiciones se describen en el texto del ejemplo correspondiente. A la izquierda, los números KD indican los niveles (barras) a los que las proteínas convencionales con peso molecular definido (KD) han migrado en el gel, como se muestra en el carril de la izquierda del dibujo. El anticuerpo purificado H2/VK3 se muestra (flecha) como una banda única en el carril central del dibujo, con seroalbúmina bovina (patrón en tampones de anticuerpo, como control mostrado por la flecha a un peso molecular diferente), mostrado en carril derecho del dibujo.

Figura 22: comparación de las actividades de unión del anticuerpo purificado H2/VK3 (hH2+hVK3 purificado) y el anticuerpo quimérico purificado (GNbAC1 IgG4) a ENV inmovilizada (0,5 microgramos/ml).

El eje X representa la concentración del anticuerpo quimérico IgG4 o el anticuerpo humanizado seleccionado en nanogramos/ml. El eje Y representa la densidad óptica medida por colorimetría, que correlaciona la cantidad de anticuerpo unido a la concentración constante inmovilizada de proteína ENV en el ensayo.

Figura 23: secuencias de aminoácidos de la cadena pesada H2 y de la cadena ligera VK3 de anticuerpo humanizado.

Los aminoácidos en letras en negrita en superíndice representan aminoácidos murinos mantenidos en la región flanqueante, basándose en su posición consenso con las secuencias de anticuerpo humano analizadas en las bases de datos.

Figura 24: las citoquinas proinflamatorias están fuertemente reguladas positivamente por estimulación de astrocitos con proteínas relacionadas con ENV de HERV-W.

Los resultados se presentan como la media de valores triplicados. ENV: MSRV-ENV; sincitina: ENV de HERV-W del cromosoma 7q copia; X: anticuerpo irrelevante (isotipo de control); anti-ENV murino: anticuerpo murino GNb AC1; anti-ENV quimérico: IgG4 humana quimérica GNb AC1; pg/ml: picogramos por mililitro.

Figura 25: cultivos de células mononucleares de sangre periférica.

Los resultados se presentan como la media de valores triplicados: ENV: MSRV-ENV; sincitina: ENV de HERV-W del cromosoma 7q copia; X: anticuerpo irrelevante (isotipo de control); anti-ENV murino: anticuerpo murino GNb AC1; anti-ENV quimérico: IgG4 humana quimérica GNb AC1; pg/ml: picogramos por mililitro.

Figura 26: detección de proteínas ENV de HERV-W relacionadas glucosiladas humanas con tres formas del ligando GNb AC1 (anticuerpo murino, quimérico y humanizado). A) detección de proteínas ENV de HERV-W relacionadas glucosiladas humanas con el anticuerpo murino GNb AC1. B): detección de proteínas ENV de HERV-W relacionadas glucosiladas humanas con el anticuerpo quimérico GNb AC1. C): detección de proteínas ENV de HERV-W relacionadas glucosiladas humanas con el anticuerpo humanizado. Eje Y: densidad óptica; eje X: proteína ENV de MSRV bacteriana (lote ENV-T 7A); fragmento superficial de ENV de MSRV bacteriano (lote ENV-SU4A); sincitina glucosilada humana; proteína ENV de MSRV glucosilada humana (lote ENV-T P1).

Figura 27: valoración del neurocomportamiento de ratas a las que se ha inyectado por vía intracerebral ENV de MSRV de solución simulada (simulación):

La horizontal representada por líneas cruzadas en el eje Y (A) y la vertical representada por erguimientos en el eje Y (B) son la actividad locomotora después de la exposición a la novedad en varios puntos temporales después de la inyección intracerebral (P5, P6, P7, P11 y P12) en ratas simuladas (solución de PBS), ENV-icv (ENV inyectada en los ventrículos intracerebrales) y ENV-hip.

Figura 28: valoración del neurocomportamiento de ratas a las que se ha inyectado por vía intracerebral ENV de MSRV de solución simulada (simulación):

La horizontal representada en el eje Y por el número de líneas cruzadas (A) y la vertical representada en el eje Y por el número de erguimientos (B) son la actividad locomotora después de inyección salina en ratas simuladas, ENV-icv y ENV-hip en P11.

Figura 29: valoración del neurocomportamiento de ratas a las que se ha inyectado por vía intracerebral ENV de MSRV de solución simulada (simulación):

La horizontal representada en el eje Y por el número de líneas cruzadas (A) y la vertical representada en el eje Y por el número de erguimientos (B) son la actividad locomotora después de tensión por confinamiento en ratas simuladas, ENV-icv y ENV-hip en P13.

Figura 30: valoración del neurocomportamiento de ratas a las que se ha inyectado por vía intracerebral ENV de MSRV que muestra efecto terapéutico del ligando IgG4 GNbAC1:

(A) actividad locomotora horizontal medida en un campo abierto después de exposición a la novedad en P12 y en P32 - como se indica en el eje X - en ratas simuladas, ratas no tratadas a las que se ha inyectado ENV (ENV+) y ratas ENV+ tratadas con IgG4, como se indica en la leyenda

(B) confirmación del efecto terapéutico del ligando IgG4 observado en P32 con actividad locomotora horizontal después de tensión por confinamiento; se mide el número de líneas cruzadas en el eje Y en un campo abierto después de una tensión por confinamiento después de la inyección sistémica de recuerdo de proteína ENV en ratas simuladas, ratas ENV+ no tratadas y ratas ENV+ tratadas con IgG4, como se indica en el eje X.

Figura 31: estudio de ratones desnudos a los que se ha injertado linterna "ENV positivo" que muestran efecto terapéutico del ligando IgG1 GNbAC1.

Índice esplénico (eje Y) calculado en ratones de control y tratados con IgG1 (eje X) 19 días después de la inyección de las células de linterna. El índice esplénico se calculó del siguiente modo: [(peso del bazo/peso corporal) x 100]. Las barras de error no solapantes indican la significancia estadística.

Figura 32: estudio de ratones SCID a los que se ha injertado linterna "ENV positivo" que muestran efecto terapéutico del ligando IgG1 GNbAC1.

Relación del peso del bazo/peso corporal (eje Y) calculado en ratones SCID no tratados y tratados con IgG1 7 días después de la inyección de las células de linterna B. La relación del peso del bazo/peso corporal se calculó del siguiente modo: [(peso del bazo/peso corporal) x 100].

Figura 33: estudio de ratones SCID a los que se ha injertado linterna "ENV positivo" que muestran el efecto terapéutico del ligando IgG1 GNbAC1.

La cantidad de células linfoblastoides viables y muertas - eje Y -(A) y de otros glóbulos blancos (B) en el fluido peritoneal recogido en ratones de control y tratados con IgG1 - eje X - 7 días después de la inyección de las células de linfoma y 6 días después de la inyección del anticuerpo.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invención sin limitar de ninguna manera la presente invención.

Descripción detallada de la invención

Ejemplos

Ejemplo 1: análisis de anticuerpo específico murino (GNbAC1): identificación de la secuencia y de la estructura de un ligando molecular específico para la proteína ENV de MSRV y sus equivalentes.

Se obtuvo un hibridoma murino después de la fusión de mieloma de ratón y células esplénicas de un ratón Balb-C inmunizado con una proteína recombinante de MSRV producida en E. coli y purificada de un clon "ENV" de MSRV, como se describe en (Komurian-Pradel, F., G. Paranhos-Baccala, et al., (1999), Virology 260(1): 1-9).

La amplificación por PCR de las regiones VH y VL a partir de este hibridoma que produce IgG1/kappa (GNbAC1) se hizo de acuerdo con el siguiente protocolo.

Se extrajeron los ARN poli(A+) y se purificaron a partir de 5 x 107 células de hibridoma que producen IgG1/kappa usando un kit de purificación de ARNm (Amersham Bioscience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó transcripción inversa de 800 ng de ARNm usando un kit de RT-PCR (Amersham Bioscience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc que codifica las secuencias génicas de la región variable de la cadena ligera (VL) y pesada (VH) se obtuvo usando el método de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE), como se describe previamente (Ruberti et al., 1994, J. Immunol. Methods 173, 33-39).

El cebador directo fue la siguiente SEQ ID NO: 21 (RACEforward), los cebadores inversos fueron los siguientes: SEQ ID NO: 22 (CL_Ala130_Fwd) para la amplificación de VL, y SEQ ID NO: 23 (CH1_Pro119_Fwd) para la amplificación de VH, con el código de letras R = A/G, K = G/T, H = A/T/C. Los cebadores inversos CL_Ala130_ y CH1_Pro119_, deducidos a partir de las secuencias consenso publicadas por (Kabat et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. National Institute of Health Bethesda, MD), son específicos de los extremos N-terminales del dominio kappa/CL e IgG/CH1 de ratón, respectivamente.

Los productos de PCR se obtuvieron el ADN polimerasa Taq y se ligaron directamente en el vector pCR®2.1-TOPO® usando un kit de clonación TA (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de los ADN clonados se determinaron por secuenciación en un secuenciador automático ABI310 usando un kit de reacción listo para secuenciación de ciclo terminador con colorante (Applied Biosystems).

Estas amplificaciones por PCR, seguidas por las etapas de clonación y secuenciación proporcionaron las secuencias de las cadenas VL y VH representadas en la SEQ ID NO: 7 y 8, respectivamente, por sus secuencias de aminoácidos deducidas a partir de las secuencias originales de nucleótidos. Además, el análisis de estas secuencias de aminoácidos ha permitido la identificación de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) implicadas en la especificidad del ligando (de acuerdo con Kabat (Wu y Kabat 1970, An analysis of the sequences of the variable regions of Bence Jones proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity. J. Exp. Med. 132:211-250; Kabat et al., 1987, 1991, Sequences of proteins of immunological interest; 4a ed. Impresión del Gobierno de Estados Unidos n.° 165-492) o por la estructura de acuerdo con Chothia (Chothia y Lesk 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342: 877-883).

Las tres secuencias CDR se identifican en la secuencia de aminoácidos de VH (figura 1B) y corresponden a la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO. 6 y se identifican tres secuencias CDR en la secuencia de aminoácidos de VL (figura 1A) y corresponden a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO. 3. Estas secuencias CDR representan las secuencias "mínimas" centrales requeridas para la especificidad de unión del ligando y, por lo tanto, están comprendidas en cualquier composición o construcción molecular que retenga la actividad del ligando específico actualmente identificado. No obstante, se sabe a partir de los expertos en la materia que pueden sustituirse unos pocos aminoácidos con propiedades equivalentes, reteniendo de ese modo la especificidad de las secuencias originales del ligando y haciendo un ligando equivalente. Dichas variaciones son conocidas como posibles en un intervalo máximo de un 10-12 %.

Ejemplo 2: ejemplo de un antígeno ENV de MSRV, producción y purificación para inmunización de ratones para obtener esplenocitos reactivos anti-ENV para la generación de hibridomas específicos:

Fuente: plásmido pV14 del virión de MSRV (Perron, Jouvin-Marche et al., 2001) que comprende la secuencia proteica correspondiente al número de acceso de la base de datos (NCBI-Entrez/Genbank): AF331500.1,

La figura 2 representa la estructura de la proteína ENV completa (ENV-T, SEQ ID NO: 19) y el fragmento de escisión superficial (ENV 1 o ENV-SU, SEQ ID nO:24). En la figura 2 el péptido señal empieza en el resto n.° 1 (metionina) y finaliza en el resto n.° 29 (treonina).

Método de producción:

Después del ligamiento de la secuencia codificante de ENV-T proporcionada por Geneart (EE. UU.) en el plásmido de expresión, el vector de expresión pET-15b suministrado por Novagen (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ, Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones del proveedor y las transformación de las bacterias de la cepa de E. coli BL21 por permeabilización clásica con CaCl2 como se describe en "DNA Isolation and Sequencing" (Essential Techniques Series) de Bruce A. Roe, Judy S. Crabtree y Akbar S. Khan publicada por John Wiley & Sons, ISBN 0 471-97324-0 QP625.N89R64 1996 John Wiley & Sons y en "Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course (Paperback) de Katharine G. Field (Autor), Walt Ream (Autor), las bacterias transformadas se cultivan en medio LB en presencia de 30 pg/ml de canamicina a 37 °C hasta la densidad óptica.

La expresión de la proteína entonces se induce por IPTG 1 mM y el cultivo continúa adicionalmente a 37 °C durante 4 horas.

Método de extracción:

Después de centrifugación a 5000 g durante 20 minutos a 4 °C, el sedimento bacteriano se resuspende en 20 ml/l de cultivo de tampón de lisis (Tris 20 mM, pH 7,5; NaCl 0,15 M; leupeptina 1 pg/ml, pepstatina 1 pg/ml, PMSF 1 mM, MgCl2 2 mM, lisozima 50 pg/ml). La solución se incuba 30 minutos a 4 °C con agitación y después se sonica en hielo/etanol (4 etapas de 7 minutos al 80 % 0,5). Se añade DNasa 1 mM y la solución se incuba 1 hora a 4 °C con agitación. La suspensión se centrifuga a 40.000 g durante 30 minutos a 4 °C.

El sedimento se resuspende en 7,5 ml/l de cultivo de un tampón de solubilización (Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, urea 2 M, SDS al 1,5 %, pmercaptoetanol 50 mM). La solución se incuba 2 horas a 8 °C con agitación.

La suspensión después se centrifuga a 40.000 g durante 30 minutos a 10 °C.

Método de purificación:

El sobrenadante de urea se diluye 5 veces en un tampón Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, SDS al 1,5 %.

La purificación se realiza en 1 ml/l de cultivo por cromatografía de afinidad con columna de Ni Sepharose Fast Flow (Amersham BioScience). El sobrenadante se carga a 2 ml/min en la resina después del equilibrado con un tampón Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, urea 500 mM, SDS al 1,5 %, pmercaptoetanol 10 mM. La elución de ENV se realiza por etapas a 30 y 50 mM de imidazol.

La purificación se realiza con una columna de desalada (Amersham BioScience, 25 ml de resina). La combinación de la cromatografía de afinidad se carga a 2 ml/minuto en la resina después del equilibrado con un tampón Tris 20 ml, pH 7,5, NaCl 150 mM, SDS al 1,5 %, DTT 10 mM. Las proteínas se eluyen con el mismo tampón.

Después de eso, las proteínas se cargan a 1 ml/minuto en gel de filtración Superdex 200 (Amersham Bioscience) equilibrado con tampón Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, SDS al 1,5 %, DTT 10 mM. Las proteínas se eluyen con el mismo tampón.

Eliminación de endotoxinas:

La purificación se realiza con columna Acticlean (Amersham Bioscience, 8 ml de resina). La combinación se carga a 1 ml/minuto en la resina después de equilibrado con un tampón Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, SDS al 1,5 %, DTT 10 mM. Las proteínas se eluyen con el mismo tampón.

Controles de calidad del lote

- Espectrometría de masas MALDI-TOFF: no puede usarse a causa del SDS.

- Secuenciación N-terminal: ALPYXTFLFT

- Ensayo de endotoxinas: < 5 UE/ml

Características del lote

Solubilidad aparente: 100 %

Pureza: > 90 %

Concentración: 0,05 mg/ml

Almacenamiento: -80 °C

Cantidad: 1,5 mg

Tampón: Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, SDS al 1,5 %, DTT 10 mM

Ejemplo 3: evidencias in vitro de actividad de unión del ligando específica para el antígeno ENV de MSRV: I- Objetivo

Se ha evaluado la afinidad del ligando por el antiligando recombinante en la forma de una proteína recombinante scFv de las secuencias VH VL clonadas, o en la forma de un fragmento Fab escindido del GNbAC1 murino original (que contiene las cadenas VH VL escindidas desprovistas de función y de estructura de anticuerpo murino) por técnicas de inmunoensayo (ELISA). Este ligando se comparó con el GNbAC1 murino original, y con construcciones moleculares que insertan el ligando en las cadenas constantes de IgG1 o IgG4 humanas y las secuencias apropiadas para su uso como vectores farmacológicos.

II- Material y métodos

a) Clonación de VH y VL:

Clonación y secuenciación de nucleótidos de la región variable de GNbAC1 de las cadenas ligera (VL) y pesada (VH)

Se extrajeron ARN poli(A)+ y se purificaron de 5 x 107 células de hibridoma que producen el anticuerpo GNbAC1 usando un kit de purificación de ARNm (Amersham Bioscience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó la transcripción inversa de 800 ng de ARNm usando un kit de RT-PCR (Amersham Bioscience) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

El ADNc que codifica las secuencias génicas de la región variable de las cadenas ligera (VL) y pesada (VH) se obtuvo usando el método de amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE), como se describe previamente (Ruberti et al., 1994, The use of the RACE method to clone hybridoma cDNA when V region primers fail. J. Immunol. Methods 173, 33-39). El cebador directo fue el siguiente: RACE aller, (SEQ ID NO: 21). Los cebadores inversos fueron los siguientes: CL_Ala130_retour (SEQ ID NO: 25) para la amplificación de VL y CH1_Pro119_retour (SEQ ID NO: 26) para la amplificación de VH, con el código de letras R = A/G, K = G/T, H = A/T/C. Los cebadores inversos CL_Ala130_retour y CH1_Pro119_retour, deducidos de las secuencias consenso publicadas por Kabat et al. (1991, Sequences of proteins of immunological interest. National Institute of Health Bethesda, MD), son específicos de los extremos N-terminales del dominio kappa/CL y el dominio IgG/CH1 de ratón, respectivamente.

Los productos de PCR se obtuvieron usando la ADN polimerasa Taq y se ligaron directamente en el vector pCR®2.1-TOPO® usando un kit de clonación TA (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de los ADN clonados se determinaron por secuenciación en un secuenciador automático ABI310 usando un kit de reacción listo para secuenciación de cicloterminador con colorante (Applied Biosystems).

b) Construcción y expresión de scFv:

El scFv se obtuvo de acuerdo con técnicas descritas en "Mallano A, et al. 2008, Generation and characterization of a human single-chain fragment variable (scFv) antibody against cytosine deaminase from Yeast. M. BMC Biotechnol. Sep 10;8:68".

c) Fab del anticuerpo GNbAC1

El Fab se obtuvo de acuerdo con las técnicas descritas en "Lefranc G, Lefranc MP. Antibody engineering and perspectives in therapy. Biochimie. Sep 1990; 72(9):639-51".

II-1 Material

II-1a Anticuerpos monoclonales

El ligando, las construcciones moleculares de IgG humana o GNbAC1 se produjeron y purificaron en las siguientes concentraciones:

Tabla 1: Concentración de los diferentes li andos scFv Fab y anticuerpos

II-1b Proteínas recombinantes

Tanto la proteína ENV completa de MSRV (ENV-T) como las proteínas recombinantes del fragmento de dominio superficial (ENV-SU) se produjeron por Protein Expert en E. coli y se purificaron adicionalmente como se describe en el ejemplo 2.

T l 2: n nr i n l r ín r m in n

II-1c ELISA de tipo sándwich

- Se recubrieron micropocillos con 100 pl por pocillo de un anticuerpo de captura anti-ENV (3C1D5, proporcionado por bioMérieux) diluido en bicarbonato sódico 50 mM, pH 9,6. Se precintó la placa y se tuvo una noche a 4 °C. - Los micropocillos se lavaron 3 veces con 250 pl por pocillo de PBST al 0,05 % (solución salina tamponada con fosfato con un 0,05 % de Tween 20; Sigma P7949). Después de lo último, las placas se invirtieron y se transfirieron sobre papel absorbente para eliminar cualquier tampón residual.

- Se añadieron 200 pl por pocillo de PBST al 0,05 % leche al 5 %. Las placas se precintaron y se incubaron 1 hora a TA con agitación ligera.

- Los micropocillos se lavaron 3 veces con 250 pl por pocillo de PBST al 0,05 %. Después de lo último, las placas se invirtieron y se transfirieron sobre papel absorbente para eliminar cualquier tampón residual.

- Los micropocillos se incubaron con 100 pl por pocillo de antígeno ENV (ENV-T o ENV-SU) diluido en PBST al 0,05 %. Las placas se precintaron y se incubaron 2 horas a temperatura ambiente en agitación ligera.

- Se añadieron 100 pl por pocillo de anticuerpo de detección (GNbAC1 o fragmento recombinante scFv) diluido en PBST al 0,05 % leche al 5 %. Las placas se precintaron y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente en agitación ligera. El GNbAC1 se marcó con peroxidasa y el scFv se marcó con biotina por Squarix, Alemania. - Los micropocillos se lavaron 4 veces con 250 pl por pocillo de PBST al 0,05 %. Después de lo último, las placas se invirtieron y se transfirieron sobre papel absorbente para eliminar cualquier tampón residual.

- Se añadieron 100 pl por pocillo de solución de sustrato (1 comprimido de o-fenilendiamina (OPD) diluida en 10 ml de tampón fosfato citrato 0,05 M pH 5 10 pl de H2O2 al 30 % (preparado en el último momento). Las placas se incubaron 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.

- Se añadieron 50 pl por pocillo de solución de parada de H2SO42N.

- La absorbancia se leyó a 490 nm en 30 minutos de reacción de parada.

II-1d ELISA directo en microplacas recubiertas con antígeno ENV (ENV-T o ENV-SU como se describe anteriormente)

- Los micropocillos se recubrieron con 100 pl por pocillo de antígeno ENV diluido en bicarbonato sódico 50 mM, pH 9,6. La placa se precintó y se incubó 2 horas a 37 °C en agitación ligera.

- Los micropocillos se lavaron 4 veces con 250 pl por pocillo de PBS (solución salina tamponada con fosfato).

Después de lo último, las placas se invirtieron y se transfirieron sobre papel absorbente para eliminar cualquier tampón residual.

- Se añadieron 100 pl por pocillo de anticuerpo de detección de acuerdo con la presente invención (GNbAC1 o su fragmento Fab) diluido en PBS BSA al 1 % (PBS con un 1 % de seroalbúmina bovina). La placa se precintó y se incubó 1 hora a temperatura ambiente en agitación ligera.

- Los micropocillos se lavaron 4 veces con 250 |jl por pocilio de PBS. Después de lo último, las placas se invirtieron y se transfirieron sobre papel absorbente para eliminar cualquier tampón residual.

- Se añadieron 100 j l por pocillo de anticuerpo de detección secundario en PBS BSA al % (anti-IgG de Jacksondiluido 1/250; IgG antihumano con peroxidasa de Jackson 115-035-146 o IgG antirratón con peroxidasa de Jackson 115-035-062, según lo adecuado con el anticuerpo primerio). La placa se precintó y se incubó 1 hora a temperatura ambiente en agitación ligera.

- Los micropocillos se lavaron 6 veces con 250 j l por pocillo de PBS. Después de lo último, las placas se invirtieron y se transfirieron sobre papel absorbente para eliminar cualquier tampón residual.

- Se añadieron 100 j l por pocillo de solución de sustrato (1 comprimido de o-fenilendiamina (OPD) diluida en 10 ml de tampón fosfato citrato 0,05 M pH 5 10 j l de H2O2 al 30 %, preparado en el último momento). Las placas se incubaron 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.

- Se añadieron 50 j l por pocillo de solución de parada H2SO42 N.

- La absorbancia se leyó a 490 nm en 30 minutos de reacción de parada.

III-Resultados

III-1 ELISA de tipo sándwich: IgG1 murina (GNbAC1) y scFv

Tabla 3: Concentraciones de anticuerpo de recubrimiento frente a ligando de detección con peroxidasa o biotina para cada concentración de antígeno o tampón de control. Los resultados corresponden a las densidades ópticas

Lo resultados con el ELISA realizado en paralelo con el scFv y el GNbAC1 original se presentan con condiciones diferentes en la figura 3.

La concentración del anticuerpo de recubrimiento y el ligando de detección fue 5 jg/ml cada uno; la dilución del conjugado de estreptavidina-peroxidasa fue 1/2000.

Se analizó GNbAC1 y el scFv recombinante como ligandos de detección en un ELISA de tipo sándwich frente a las proteínas recombinantes ENV-SU y ENV-T. Como puede observarse en la figura 3, a la misma concentración, el mAb y el scFv son capaces de detectar las proteínas ENV, con un DO sobre la mitad de la de IgG para el scFv, cuando la IgG es divalente y el scFv es monovalente. Por lo tanto, respecto a la cantidad de sitios de unión por molécula, el ligando aislado ha producido mejores resultados que la IgG murina completa. Por tanto, las funciones de anticuerpo no son necesarias y dichos resultados mejorados con el ligando aislado eran inesperados.

III-2 ELISA directo: GNbAC1 y Fab

Tabla 4: Concentraciones de anticuerpo de recubrimiento frente a ligandos de detección marcados con peroxidasa (marcaje directo) para cada concentración de antígeno o tampón de control. Los resultados corresponden a las densidades i m i . NA: M i n li l l liz i n r l mas técnicos)

Se analizó la IgG1 murina y su fragmento Fab como ligandos de detección en un ELISA de tipo sándwich frente a la proteína recombinante ^eNV-T. Como puede observarse en la figura 4, a la misma concentración, el Fab monovalente detecta la proteína ENV con una densidad óptica superior o igual a la IgG divalente. Nuevamente, se observa que el ligando aislado produce sorprendentemente mejores resultados que la IgG completa.

Por tanto, se puede concluir que, repetidamente, las funciones de anticuerpo no eran necesarias y que el propio ligando es más eficaz que la IgG murina "natural".

Ejemplo 4: Diseño, construcción y análisis in vitro de construcciones moleculares con cadenas constantes de IgG1 e IgG4 humanas y ligando.

Después de haber evidenciado el rendimiento mejorado inesperado del ligando aislado que comprende sitios de unión monovalentes con secuencias VH y VL naturales (Fab) o recombinantes (scFv) en detección por inmunoensayo del antígeno diana, se han diseñado y construido secuencias recombinantes para la producción de moléculas IgG1 o IgG4 humanas quiméricas que comprenden las secuencias de ligando (VH VL). Por tanto, se han producido anticuerpos completos como vectores moleculares para el ligando y se evaluaron por inmunoensayos en comparación con la IgG murina original.

Para producir estos vectores de anticuerpo recombinante con el ligando insertado, se adaptaron clones para su expresión en células CHO y se produjeron anticuerpos y se purificaron por "Polymmun", Viena, Austria. Las condiciones técnicas para las producciones de estos anticuerpos con vectores apropiados se resumen a continuación:

Establecimiento de las líneas celulares CHO recombinantes GNbAC1_IgG1 y GNbAC1_IgG4

Esta sección describe la fuente de genes del anticuerpo monoclonal recombinante GNbAC1 expresado de forma recombinante como IgG1 e IgG4 quimérica humana/de ratón, en las que las regiones constantes son las humanas y las regiones variables son las secuencias VH y VL originales como se describe en la SEQ ID NO: 8 y en la SEQ ID NO: 7, respectivamente.

Plásmidos de expresión

Cadenas ligeras de IgG1 quiméricas GNbAC1 (LC)

Básicamente este plásmido de expresión es el pCIneo disponible en el mercado (Promega), que se usó en una primera etapa para insertar la estructura de cadena ligera kappa humana de codones optimizados (optimización de uso de codones para la expresión en células CHO, diseñado por GENEART, que también incluye optimización de la estructura de ARNm) que incluye una señal kappa de inmunoglobulina secuenciada y la región constante c-kappa humana con sitios de restricción intermedios para insertar cualquier región de cadena ligera variable. De acuerdo con la secuencia primaria de VL (SEQ ID NO: 7), se sintetizó un inserto sintético de nucleótidos en GENEART AG (Regensburg, Alemania) que incluye sitios de restricción en el extremo 3' de la secuencia señal y en el sitio 5' de la región de cadena ligera kappa para insertar la región variable optimizada - codones de VL - (SEQ ID NO: 27) en el vector de expresión abierto en BsiWI y AccIII que porta la estructura de la cadena ligera kappa humana de codones optimizados - codones de IgG1L - bajo el control del promotor de CMV. Adicionalmente, el vector contiene la neomicina fosfotransferasa para la selección de células CHO con G418. La SEQ ID NO: 28 indica la secuencia de nucleótidos de la construcción que asocia los "codones de IgG1L y codones de VL" optimizados usados para la expresión en células CHO.

Cadenas pesadas de IgG1 quiméricas de GNbAC1 (HC)

El vector de clonación para la generación del vector de expresión eucariota de IgG1 GNbAC1 consiste en dos casetes de expresión eucariotas con regiones reguladores idénticas. Este vector ya contiene una estructura de IgG1 humana de codones optimizados (optimización del uso de codones para la expresión en células CHO, diseñado por GENEART, que también incluye la optimización de la estructura de ARNm) que incluye la región señal de una cadena pesada de inmunoglobulina y la región constante de IgG1 humana con sitios de restricción intermedios para insertar cualquier región de cadena pesada variable.

La información para la secuencia de aminoácidos de la región variable (VH) del anticuerpo monoclonal de ratón GNbAC1 se presenta en la SEQ ID NO: 8. De acuerdo con esa secuencia primaria, se sintetizó un inserto sintético de nucleótidos en GENEART que incluye sitios de restricción (en el extremo 3' de la secuencia señal y en el sitio 5' de la región CH1 de cadena gamma, para insertar la región pesada variable optimizada (SEQ ID NO: 29) - codones de VH - en el vector de expresión eucariota abierto con AgeI y NheI que porta la estructura de IgG1 humana de codones optimizados bajo el control del promotor de SV40. Adicionalmente, el vector contiene la dihidrofolato reductasa murina como segundo casete de expresión para su uso como marcador de selección/amplificación en cultivos de células animales. La SEQ ID NO: 30 representa la secuencia de nucleótidos de la construcción que asocia los codones optimizados de la estructura de IgG1H humana y los codones de VH optimizados usados para la expresión en células CHO.

Cadena pesada de IgG4 quimérica GNbAC1 (HC)

El vector de clonación para la generación del vector de expresión eucariota de IgG4 GNbAC1 consiste en dos casetes de expresión con las regiones reguladoras idénticas y es igual que para la construcción de IgG1.

Sin embargo, como no había ninguna región constante de IgG4 humana disponible, se sintetizó la cadena pesada completa incluyendo la secuencia señal, la región pesada variable (VH) de GNbAC1 de ratón y la región constante de IgG4 humana por GENEART.

La SEQ ID NO: 31 muestra la secuencia de nucleótidos de la región codificante de la cadena pesada optimizada de IgG4 quimérica GNbAC1 (codones de IgG4H). Después de ello, el inserto se introdujo en el vector de expresión eucariota abierto con NotI y SacII que produce la construcción, mostrada en la SEQ ID NO: 32, que asocia los codones IgG4H optimizados y los codones VH optimizados usados para la expresión en células CHO.

Todos los plásmidos se clonaron en GENEART y después de ello se transformaron en la cepa de E. coli TOP10. Las bacterias recombinantes se propagaron en 50 ml de medio LB/Amp y los plásmidos se aislaron con los sistemas Promega PureYield™ Plasmid Midiprep. El rendimiento y la pureza de los plásmidos se controlaron de forma fotométrica con un cociente de la densidad óptica a 260 nm y 280 nm, determinado en al menos 1,5.

Establecimiento de las líneas celulares CHO recombinantes GNb AC1_IgG1 y GNb AC1_IgG4

Procedimiento de transfección

Se eligieron células de ovario de hámster chino deficientes en dihidrofolato reductasa (mencionadas como CHO dhfr-, ATCC n.° CRL 9096) como la línea celular precursora para la generación de la línea de expresión final. Estas células - originarias de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) - se propagaron en "medio de cultivo" que consiste en DMEM suplementado con L-glutamina 4 mM, hipoxantina 0,1 mM, timidina (HT) 0,016 mM, 0,25 g/l de peptona de soja, Pluronic F-68 al 0,1 % y suplemento libre de proteínas (Polymun Scientific) con una relación de división 1:6 dos veces a la semana.

Se usaron 5 x 106 células lavadas una vez con medio basal y resuspendidas en 10 ml de medio completo para la transfección. Se formaron poliplexes por incubación de 900 pl de polietilenimina (1 mg/ml de PEI lineal, PM: 25.000, Polysciences Inc.) con 12 pg de plásmido HC y 12 pg plásmido LC en un volumen total de 2 ml durante 30 minutos a TA. La interacción de los poliplexes con células CHO en 12 ml duró cuatro horas antes de la centrifugación a 170 g, descartando el sobrenadante y resuspendiendo las células en "medio de cultivo". Después de 24 horas, se remplazó el medio completo por 50 ml de medio de selección compuesto por DMEM suplementado con L-glutamina 4 mM, 0,25 g/l de peptona de soja, Pluronic F-68 al 0,1 %, suplemento libre de proteínas (Polymun Scientific) y 0,5 pg/ml de G418. Se sembraron 100 pl de la suspensión celular por pocillo en cinco placas de 96 pocillos. 4 experimentos de transfección (construcción "codones de IgG1H codones de VH" cotransfectada con "codones de IgG1L codones de VL" para GNbAC1-IgG1 quimérico; construcción "codones de IgG4H codones de VH" cotransfectada con "codones de IgG1L codones de VL" para GNbAC1-IgG4 quimérico) generaron un total de 20 x placas de 6 pocillos (correspondientes a 1920 pocillos) por subtipo de IgG.

Después de 10 a 14 días, los clones formados se alimentaron con 100 pl de "medio de amplificación" que consistía en MTX 0,048 pM en medio de selección. Los clones en crecimiento se alimentaron con otros 100 pl de medio de amplificación que contenía de nuevo MTX 0,048 pM y después de ello se analizaron en un ELISA de tipo sándwich doble. El ELISA usó suero policlonal específico gamma humano para el recubrimiento y anticuerpo policlonal acoplado a HRP de cadena kappa humana para la detección.

Los clones de alta producción seleccionados se adaptaron a MTX 0,19 pM en medio de selección.

La tabla 5 describe la selección de los mejores productores de IgG1 GNb AC1 y de IgG4 GNb AC1 a MTX 0,096 y 0,19 pM en matraces Roux T25 y recipientes de centrifugación.

En el caso de GNb AC1_IgG1 se decidió el clon 6B6 y en el caso de GNb AC1_IgG4 se decidió el clon 7C1. En el caso de GNbAC1_IgG1 se hizo la crioconservación de tres clones, GNb AC1_IgG1_6B6, GNb AC1_IgG1_8H2 y GNb AC1_IgG1_18A8 y en el caso de GNb AC1-IgG4 la crioconservación de dos clones, GNb AC1_IgG4_6C1 y GNb AC1_IgG4_7C1. El mejor clon se subclonó por el método de dilución limitante como se describe, por ejemplo, en " Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Tercera Edición) Joseph Sambrook, Peter MacCallum Cancer Institute, Melbourne, Australia; David Russell, Cold Spring Harbour Laboratory Books".

Subclonación de los mejores transfectantes productores GNb AC1_IgG1_6B6 y GNb AC1_IgG4_7C1

La subclonación se realizó en placas de 96 pocillos con 90, 30 y 10 células por pocillo en medio de amplificación con, en el caso de GNb AC1_IgG1_6B6: metotrexato 0,19 pM (Sigma, MTX) y sobrenadante de cultivo de GNb AC1_IgG1_6B6 al 50 % filtrado a 0,2 pm, en el caso de GNb AC1_IgG4_7C1: MTX 0,19 pM y sobrenadante de cultivo de GNb AC1_IgG4_7C1 al 50 % filtrado a 0,2 pm. Los pocillos de crecimiento se adaptaron a MTX 0,38 pM en placas de 96 pocillos, se analizaron por ELISA y se fotografiaron en matraces T25 para exploración adicional y adaptación a MtX 0,77 pM.

La tabla 6 describe la selección de los mejores productores de GNb AC1 IgG1_6B6 - y GNb AC1 IgG4_7C1 -subclones a MTX 0,77 pM en matraces Roux T25 y recipientes de centrifugación.

El mejor productor en el caso de GNb AC1_IgG1_6B6 fue el clon GNb AC1_IgG1_6B6_10E4 y en el caso de GNb AC1_IgG4_7C1 el clon GNb AC1_IgG4_7C1_15B7. Estos dos clones se eligieron para desarrollo adicional de líneas celulares.

Se hizo la crioconservación de dos clones de GNb AC1-IgG1: GNb AC1-IgG1_6B6_1D1, GNb AC1_IgG1_6B6_10E4 y de dos clones de GNb AC1-IgG4: GNb AC1-IgG4_7C1_3E11, GNb AC1-IgG4_7C1_15B7.

Subclonación de los mejores subclones productores GNb AC1-IgG1_6B6_10E4 y GNb AC1-IgG4_7C1_15B7 Se realizó un procedimiento de subclonación final de nuevo en placas de 96 pocillos con 90, 30 y 10 células por pocillo en medio de amplificación en el caso de GNb AC1_IgGl_6B6_10E4 con MTX 0,77 pM y un 50 % de sobrenadante de cultivo de GNb AC1_IgG1_6B6_10E4 filtrado a 0,2 pm, en el caso de GNb AC1_IgG4_7C1_15B7 con MTX 0,77 pM y un 50 % de sobrenadante de cultivo GNb AC1_IgG4_7C1_15B7 filtrado a 0,2 pm. Los pocillos de crecimiento se analizaron por ELISA, los mejores productores se propagaron a matraces T25 y matraces de centrifugación (Sp125) para exploración adicional.

La tabla 7 describe la selección de los mejores productores de los subclones GNb AC1 IgG1_6B6_10E4 y GNb AC1 IgG4_7C1_15B7 a MTX 0,77 pM en matraces T25 Roux y matraces de centrifugación.

Después de los cultivos de centrifugación se crioconservaron, en el caso de GNb AC1_IgG1, dos clones GNb AC1_IgG1_6B6_10E4_18C7 y GNb AC1_IgG1_6B6_10E4_18D12, en el caso de GNb AC1_IgG4, dos clones GNb AC1_IgG4_7C1_15B7_3E4 y GNb AC1_IgG4_7C1_15B7_5G10.

Tabla 5: ocillos seleccionados des ués de transfección de ada tación a diferentes niveles de MTX

T l : l n l i n l rim r l n i n MTX 77 M

T l 7: l n l i n l n l n i n fin l MTX 77 M:

Los vectores de anticuerpo de IgG1 y de IgG4 recombinantes se produjeron de esta manera con ligando insertado que comprende las seis secuencias CDR como se describe en el ejemplo 1. Estos vectores que comprenden las seis CDR se analizan en el siguiente ejemplo, para determinar la influencia positiva y negativa de los vectores y, por tanto, proponer una selección y/o un uso adecuado para cada uno de ellos.

Ejemplo 5: estudio del ligando y sus construcciones quiméricas de IgG1 y de IgG4 humana, frente a la IgG murina original: afinidad in vitro.

El material y los métodos fueron los mismos que se describen en los ejemplos 3 y 4.

5.a. ELISA con diferentes concentraciones de proteína completa ENV de MSRV (ENV-T)

Tabla 8: densidades ópticas (DO) medidas por ELISA con diferentes ligandos (1 microgramo) o control irrelevante (2G5E12) sobre diferentes concentraciones (columna de la izquierda, en microgramos) y antiligando (ENV-T) recubierto sobre pocillos de placa de microtitulación. La unión se revela con anticuerpo anti-Ig marcado con peroxidasa (1/250; Jackson-EE. UU.) y reacción de sustrato de peroxidasa. El valor promedio de todas las DO del control irrelevante es 0,1004 y su desviación típica (DT) es 0,0205, por lo tanto, puede determinarse un valor de corte, por debajo del cual todos los valores son no específicos con un intervalo de confianza del 99 %: promedio 3*DT = 0,1618. Todos los valores presentados con las construcciones de GNb AC1 son, por lo tanto, significativos de una unión específica a la proteína diana.

Se analizó el anticuerpo GNbACI y la versión quimérica de IgG1 y de IgG4 como anticuerpos de detección en un ELISA de tipo sándwich frente a la proteína recombinante ENV. Como puede observarse en la figura 5 y en la tabla 8, a la misma concentración, los mAb murinos y quiméricos son capaces de detectar las presentes concentraciones de proteínas ENV, con cinética similar. La especificidad y afinidad relativa de las nuevas construcciones (ligando en un vector humano) se mantienen, por tanto, y ambas construcciones de IgG1 y de IgG4 humana con el ligando han proporcionado anticuerpos quiméricos humanos capaces de detectar picogramos de la proteína ENV recombinante. Esto es sorprendentemente bueno y confirma la optimización conseguida en todo su diseño completo, las condiciones de construcción y de expresión. También valida la selección de una estructura de ligando estable y robusta, como se describe en el ejemplo 1.

Además, esta experiencia proporciona un medio para identificar moléculas equivalentes al ligando a través de la magnitud de su unión y el antiligando original (ENV), como se evidencia aquí con el ligando (GNb AC1) frente a un ligando irrelevante "no de unión" (2G5E12):

El antígeno Env-T se recubre sobre pocillos de placa ELISA de microtitulación con diluciones en serie que varían de 1 |jg/ml a aproximadamente 0,01 jg/ml.

El ligando de referencia (GNbAC1) y un ligando irrelevante (2G5E12) se ensayan a 1 jg/ml y se revelan con un anticuerpo secundario (aquí, anticuerpo secundario anti-IgG marcado con peroxidasa de Jackson Ltd, EE. UU., diluido 1/250, a partir de ahora mencionado como anti-IgG de ratón (H+L) de Jackson o anti-IgG humana; Jackson, EE. UU.).

La curva con el ligando de referencia muestra saturación de la señal (densidad óptica superior o igual a 3) a la concentración máxima de ENV y disminuye progresivamente hasta una densidad óptica de aproximadamente 1,0 0,5, evidenciando de ese modo una curva de respuesta a dosis típica de actividad de unión específica (por encima del valor de corte estadístico calculado de 0,1618; véase la tabla 8). En paralelo, la molécula irrelevante (2G5E12), no muestra curva de respuesta a dosis (curva promedio plana) y oscila entre una densidad óptica de 0,1 y 0,05 a cualquier concentración de ENV, por debajo del valor de corte estadístico calculado de 0,1618 (tabla 8).

Por tanto, cualquier molécula equivalente al ligando, por tanto, puede evidenciarse por,

1) La existencia de una curva de respuesta a dosis en este ensayo, con las condiciones del presente ejemplo, como se muestra en el párrafo 5z, y

2) La ausencia de una curva plana, que oscila por debajo de un corte estadístico calculado (promedio tres desviaciones típicas) de los valores de densidad óptica obtenidos con un anticuerpo irrelevante (véase 2G5E12 en la tabla 8), en comparación con valores por encima del corte obtenido con GNbAC1 de referencia para una concentración de ENV de 0,01 microgramo (véase la tabla 8); o

3) La existencia de una curva de respuesta a dosis en un ensayo como se describe a continuación, con diluciones en serie del ligando y una concentración fija de antiligando, en el párrafo 5b (tabla 9), y

4) La ausencia de una curva plana, que oscila por debajo de un corte estadístico calculado (promedio tres desviaciones típicas) de los valores de densidad óptica obtenidos con un anticuerpo irrelevante (véase 2G5E12 en la tabla 9), en comparación con valores por encima del corte obtenido con GNbAC1 de referencia correspondiente a una concentración de 0,01 microgramo/ml, en las mismas condiciones que las descritas en el párrafo 5b (véase la tabla 9).

5.b ELISA con diferente concentración de mAb

Tabla 9. Densidades ópticas medidas por ELISA con diluciones en serie del ligando y una concentración fija de antiligando. (ENV-T; 0,01 microgramo) recubierto sobre pocillos de placa de microtitulación. La unión se revela con ni r ni-I m r n r xi 12 k n-EE. . r i n r r xi .

continuación

Con la detección del anticuerpo secundario anti-ratón, el valor promedio de todas las DO del control irrelevante es 0,0735 y su desviación típica (DT) es 0,0057, por lo tanto, puede determinarse un valor de corte, por debajo del cual todos los valores son no específicos con un intervalo de confianza por 99 %: promedio 3*DT = 0,0907. Todos los valores presentados con GNb AC1 murino correspondiente son, por lo tanto, significativos de una unión específica a la proteína diana.

Con la detección del anticuerpo secundario anti-humano, el valor promedio de todas las DO del control irrelevante es 0,0513 y su desviación típica (DT) es 0,0094, por lo tanto, puede determinarse un valor de corte, por debajo del cual todos los valores son no específicos con un intervalo de confianza del 99 %: promedio 3+DT = 0,0796. Todos los valores presentados con las construcciones quiméricas de GNb AC1 son, por lo tanto, significativos de una unión específica a la proteína diana.

En la figura 6, puede observarse que tanto el anticuerpo IgG murino GNbAC1 como las versiones quiméricas IgG1 e IgG4 son eficaces como anticuerpos de detección en un ELISA de tipo sándwich frente a la proteína recombinante ENV-T, con cantidades tan bajas como unos pocos nanogramos de IgG purificada para detectar menos de unos pocos nanogramos de proteína ENV.

Además, como el anti-IgG humana o de ratón no reacciona de forma cruzada con el anticuerpo murino original o con las construcciones quiméricas con las estructuras de IgG1 o IgG4 humana, el ligando insertado (VH+VL) no ha creado ninguna modificación indeseada y no se detecta en las construcciones humanas, en estas condiciones. 5c: afinidad del GNbAC1 por ENV-T

Tabla 10: determinación de la afinidad de unión del ligando insertado en los vectores de anticuerpo IgG4 e IgG1 (las ni in i n n l l

5.d: punto isoeléctrico de GNbAC1

Se determinó el punto isoeléctrico de GNbAC1 de acuerdo con técnicas descritas en "Fractionation of complex protein mixtures by liquid-phase isoelectric focusing. Hey J, Posch A, Cohen A, Liu N, Harbers A. Methods Mol Biol.

2008;424:225-39".

El punto isoeléctrico de las construcciones de IgG1 (pI 8,3) y de IgG4 (7,53) son muy útiles y determinarán la estabilidad y las condiciones de almacenamiento para un uso terapéutico. El pI neutro de la IgG4 por tanto, es mejor para la formulación de un mAb terapéutico que puede ser un tratamiento crónico con inyecciones repetidas de forma regular. Por tanto, la IgG4 es una construcción preferida desde este punto.

Ejemplo 6: estudio del ligando y de sus construcciones de IgG1 y de IgG4 humana, frente a GNbACI: actividad inhibidora sobre citoquinas proinflamatorias en cultivos de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humana.

Materiales y métodos:

Medio de cultivo

Las PBMC se cultivaron en RPMI Glutamax (Gibco) FBS al 10 % (Biowest S1810 Sur América) aminoácidos no esenciales al 1 % piruvato al 1 % penicilina al 1 % - estreptomicina, a 37 °C en CO2 al 6,5 %.

Preparación de PBMC a partir de capas leucocitarias

Las capas leucocitarias se proporcionan por HUG.

La sangre, diluida con PBS-FBS al 2 % (4 ml 31 ml), se pone suavemente en 15 ml de Ficoll y se centrifuga a 2850 rpm (1659 g) / 20 min / temperatura ambiente / sin rotura.

Las PBMC después se recogen cuidadosamente y se lavan 3 veces con PBS-SVF al 2 % y se centrifugan a 1500 rpm / 10 min.

Las células después se cuentan y se congelan en SVF al 90 % DMSO al 10 %.

Preparación de PBMC a partir de células congeladas

- Las PBMC mantenidas a -80 °C se descongelan a 37 °C, se lavan 3 veces con el medio y se centrifugan a 1500 rpm / 10 min.

- Las células entonces se cuentan y se diluyen hasta una concentración de habitualmente 1 x 106 células/ml. Ensayo de inhibición

- La mezcla de ENV mAb se prepara antes de descongelar las PBMC. Los mAb (relación elegida con ENV) ENV (concentración elegida) se mezclan en cada pocillo de placas de 48 pocillos, en 100 ul de medio y se incuban 1 hora a 4 °C.

- Las PBMC después se añaden en cada pocillo, para una concentración final de 1 x 106 células/ml (0,5 ml o 1 ml final por pocillo).

- Las células se incuban 24, 48 o 72 horas a 37 °C, CO2 al 5 %.

- Los sobrenadantes se recogen por centrifugación a 1400 rpm / 10 min / TA y se mantienen a -20 °C.

Dosificación de citoquinas 11-2d

Las citoquinas se dosifican con conjuntos de ELISA BD Pharmingen, para IL-6, IL-12p40, TNF-a e IFN-^y. Se siguió el protocolo del proveedor.

Tabla 11: dosificación de citoquina en diferentes sobrenadantes de cultivo de PBMC (células mononucleares de n r rif ri n in if r n li n .

Sobre ensayos celulares en PBMC se ensayó el potencial de nuestros anticuerpos o scFv de inhibir la interacción entre la proteína ENV y las células (a través del receptor TLR4) y, por tanto, la producción de citoquinas proinflamatorias tales como IL-6 (inmunidad innata) e IFN-y (inmunidad mediada por linfocitos T). Las diferentes moléculas se ensayaron a la misma relación (mol/mol) con la proteína (25/1) de modo que se pudiera comparar su rendimiento.

Como puede observarse en la figura 7 y en la tabla 11, todas las moléculas de ligando, sean de origen murino o recombinante (scFv o construcciones de IgG y de IgG4 con el ligando), tienen y mantienen sus propiedades inhibidoras, como se representa por la reducción de las citoquinas proinflamatorias (IL-6) producidas por las PBMC. No obstante, puede observarse que GNb AC1 y la IgG4 humana recombinante con el ligando insertado, son eficaces sobre la activación de linfocitos (reduciendo ambos la producción de interferón-gamma), mientras que scFv (muy probablemente porque es monovalente, en esta ocasión) y la construcción de IgG1 humana fueron mucho menos eficaces sobre la inhibición de interferón-gamma. Aquí, el hecho de que la región Fc de IgG1 humana tenga efectos proactivos sobre las células inmunitarias humanas, indica claramente que esta propiedad puede contrarrestar los efectos inhibidores del ligando sobre este tipo de activación de linfocitos por ENV. Con el mismo ligando en el vector de IgG4 humana (que no es inmunológicamente proactiva), presenta el efecto inhibidor del ligando divalente como en la IgG murina original.

Por esta razón, según lo que se expone en la sección del ejemplo 5.d, la IgG4 sería una construcción preferida cuando deben evitarse las funciones inmunitarias de los anticuerpos. Como parece ser aquí el caso, las funciones del anticuerpo no son necesarias para el efecto inhibidor (dado que se produce un ligando divalente, ya que scFv monovalente tiene mala eficacia), sino que también resulta ser perjudicial para el efecto inhibidor del ligando.

Respecto al efecto sobre la producción de IL-6 (de monocitos/macrófagos y, posiblemente también, linfocitos B) IgG1 e IgG4 resultan bastante equivalentes y con buena inhibición, que difiere de lo que se observó con interferóngamma. De forma interesante, el scFv monovalente presenta menos inhibición, pero significativa, de esta citoquina de "inmunidad innata". Por tanto, ciertas activaciones inmunitarias se inhiben bien por ambos vectores de IgG1 y de IgG4 humana con el ligando, pero IgG4 presenta inhibición única tanto de células de inmunidad innata (resultante de IL-6) como de inmunidad adquirida (resultante de IFN-^y) de PBMC humanas. De forma interesante, el vector de IgG1, no obstante, proporciona una inhibición más fuerte de las citoquinas proinflamatorias de la inmunidad innata (representadas aquí por el ejemplo de IL-6) y activa algunos clones de células T (como se refleja por las dosificaciones de interferón-gamma), que podría resultar útil en ciertos mecanismos de defensa antivírica.

Por tanto, se confirma la alta afinidad y actividad biológica del ligando, en una forma de suministro farmacéutico que consiste en vectores de anticuerpo humano con afinidades de unión y especificidades habituales, pero que divergen en los efectos inmunitarios dependiendo de su isotipo.

Ejemplo 7: identificación molecular del sitio de unión del ligando en la proteína ENV diana (secuencia de unión antiligando)

La ubicación de epítopos de IgG1/kappa murina original (GNb AC1) se ha conseguido por Pepscan BV., Países Bajos.

A partir de estos resultados, se identifica la secuencia de aminoácidos del sitio de unión del ligando como incluido dentro de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 20.

Incluido en la secuencia anterior, el mejor epítopo diana consiste en la parte C-terminal del dominio SU escindido (ENV1) en la proteína ENV completa (ENV-T) y corresponde más particularmente a la siguiente secuencia de aminoácidos seleccionada expuesta en la SEQ ID NO: 32.

Esta secuencia antiligando (y su secuencia seleccionada) no está comprendida exclusivamente, sino también, dentro de la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína de la envoltura (ENV) de MSRV como se describe en el ejemplo 2.

No obstante, los expertos en la materia saben que los aminoácidos pueden sustituirse por su equivalente funcional y, aquí, pueden proporcionar un sitio de unión similar con una secuencia diferente. Además, se han descrito mimótopos "ENV de MSRV", que pueden unirse de forma eficaz a anticuerpos específicos (Jolivet-Reynaud, C., H. Perron, et al., 1999. "Specificities of multiple sclerosis cerebrospinal fluid and serum antibodies against mimotopes." Clin Immunol 93;3: 283-93.).

Ejemplo 8: evidencias de la presencia de antígeno diana ENV de MSRV en pacientes con enfermedades asociadas a MSRV: ejemplos de enfermedades asociadas o síndromes patológicos en esclerosis múltiple, síndrome aislado clínicamente (neurológico) -CIS-, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica -CIDP-, esquizofrenia y epilepsia.

8a. Esclerosis múltiple, síndromes aislados clínicamente y polineuropatías:

Materiales y métodos

Inmunodosificación de antigenemia de ENV

Recogida de suero preliminar:

El estudio se aprobó por los comités éticos de los hospitales universitarios de Créteil y Grenoble, Francia. Se incluyeron pacientes neurológicos de ambos centros. Todos los pacientes han proporcionado su consentimiento informado por escrito antes de su inclusión. Se reclutaron donantes de sangre sanos de los centros de transfusión de Grenoble y de Montpellier. No se obtuvieron controles neurológicos de Grenoble. Los datos clínicos sobre los pacientes se indican en resultados. Las alícuotas de muestra de suero de los pacientes con MS y los controles sanos se codificaron y enviaron a un laboratorio independiente para ensayo enmascarado con ELISA de ApoH usando condiciones de lectura colorimétrica.

Recogida de suero en múltiples centros europeos:

El estudio se aprobó por los comités éticos de la facultad de medicina, Universidad de Würzburg en Alemania, de la Universidad de Sassari, del Hospital Don Gnocchi's de Milán en Italia, de1Hospital Universitario de Marsella en Francia y de la Universidad de Pamplona en España. Se incluyeron 74 pacientes con MS definida de acuerdo con los criterios de McDonald (McDonald, Compston et al., 2001) y 14 pacientes con síndromes aislados clínicamente (CIS). Los datos clínicos y de tratamiento correspondientes se presentan en la tabla 12 a continuación. (McDonald, Compston et al., 2001). En el caso de recidiva de MS, se extrajeron muestras de sangre antes del inicio del tratamiento con esteroides. Las alícuotas de muestras de suero de los pacientes con MS y los controles sanos se codificaron y enviaron a un laboratorio independiente para ensayo enmascarado con ELISA de ApoH usando condiciones de lectura luminométrica.

Recogida de muestras: se recogió un tubo (tubo seco B&D de 7 ml) de sangre. Las muestras se trataron en 2 horas después de su recogida. Después de la coagulación sanguínea se centrifugaron durante 10 minutos a 2800 g a 14 °C. Después se recogió el suero y se dividió en alícuotas en 250 pl en tubos Eppendorf. Las alícuotas se almacenaron congeladas a -20 °C.

Inmunoensayo de ELISA de ApoH

Método colorimétrico: se cargaron placas de microtitulación recubiertas con ApoH (APOH Technologies, Montpellier, Francia) con muestras de suero diluidas en Tris-HCl 50 mM, pH 7,6; las placas se incubaron durante 1,5 horas a 37 °C; las placas después se lavaron cuatro veces con PBS; se diluyó el mAb anti-ENV de ratón purificado con PBS que contenía BSA al 5 % hasta una concentración de 10 pg/ml y se añadió. Las placas se incubaron durante 1 hora a 37 °C y después se lavaron cuatro veces con PBS. Se añadió anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa (H+L; Sigma) diluido 1:5000 en PBS que contenía BSA al 5 %, las placas se incubaron durante 1 hora a 37 °C y después se lavaron seis veces con PBS. Se añadió la solución de sustrato OPD y las placas se incubaron durante 30 minutos en la oscuridad. La reacción de color se detuvo con H2SO42N. Se leyó la absorbancia a 490 nm con un lector Tecan. El valor de corte estadístico (C.O.) de este ensayo se determinó sobre una serie de sueros negativos de 50 donantes de sangre sanos (BD), con el promedio de triplicados de sueros individuales como el resultado de densidad óptica (DO). El C.O., por tanto, se calculó a partir de la serie validada estadísticamente de controles negativos, como su valor promedio más tres desviaciones típicas (A+3DT; significancia de positividad p<0,01) y se confirmó experimentalmente en un panel de muestras positivas y negativas de referencia. El intervalo de confianza para la determinación de la positividad con el ensayo, por lo tanto, representa el 99,9 %.

Método luminométrico: se cargaron muestras diluidas en Tris-HCl 50 mM, pH 7,6 en microplacas recubiertas con ApoH (APOH Technologies, Montpellier, Francia). Las microplacas se incubaron 1 hora y 30 minutos a 37 °C, se lavaron cuatro veces con PBS. Se añadió mAb de ratón anti-ENV purificado (1 pg/ml en PBS-BSA al 5 %,), las microplacas ser incubaron 1 hora a 37 °C y se lavaron cuatro veces con PBS. Se añadió anticuerpo de cabra anti ratón marcado con peroxidasa (Jackson, dilución 1/2000 en PBS-BSA al 5 %), las microplacas se incubaron 1 hora a 37 °C y se lavaron seis veces con PBS. Se añadió la solución de sustrato SuperSignal femto (Pierce) y se leyó con un lector TECAN.

Anticuerpos monoclonales

Los anticuerpos monoclonales (mAb) se desarrollaron por bioMerieux (Marcy l'Etoile, Francia) después de inmunizar ratones con la proteína de envoltura (ENV) de MSRV recombinante expresada a partir de regiones de RT-PCR clonadas amplificadas a partir de viriones de MSRV extracelulares purificados. Después del ensayo de los sueros de los ratones por ELISA con ENV, las células esplénicas se fusionaron con la línea celular de mieloma no secretora Sp2/0-Ag14 para obtener hibridomas. Los clones específicos se seleccionaron detectando su producción de anticuerpos en el mismo ensayo ELISA. Por tanto, se aislaron aproximadamente 40 mAb específicos de proteína ENV de MSRV y aproximadamente 28 mAb se seleccionaron adicionalmente y se validó su especificidad de unión. Usando la técnica de ELISA de ApoH sobre sueros humanos, el mAb de mejor unión fue 2A12A5.

Resultados

Inmunodosificación de proteína ENV de MSRV en suero.

Se ha desarrollado un inmunoensayo en microplaca original, en que la fase de captura depende de las propiedades particularmente eficaces de la apolipoproteína-H (ApoH) en la unión a proteínas microbianas cuando se asocian con estructuras de la envoltura y/o con los lípidos (Stefas et al., 1997; Stefas et al., 2001). ApoH permite una primera interacción de baja afinidad con las regiones de aminoácidos de la propia proteína, que en segundo lugar activa una reacción alostérica que causa unión de tipo covalente del dominio C-terminal de ApoH con los dominios de unión a lípidos o a membrana. Por lo tanto, las proteínas de la envoltura vírica o las partículas de virión pueden capturarse de forma irreversible y, después de las etapas de lavado que eliminan la muestra original, pueden detectarse antígenos específicos por la adición de un anticuerpo monoclonal dirigido a un epítopo aún expuesto después de la etapa de captura de "ApoH".

Para la validación técnica del ensayo, tanto el virión de MSRV, sedimentado y purificado a partir de sobrenadantes de cultivo de células B de MS, de acuerdo con las condiciones descritas previamente (Perron et al., 1997a; Perron et al., 1997b) como la proteína de envoltura (ENV) de MSRV recombinante, se ensayaron con diluciones en serie y diferentes mAb anti-ENV de MSRV. La comparación se hizo con virus bien conocidos, tales como el virus de la hepatitis C (HCV) y el virus de la hepatitis B (HBV), detectados por los mAb específicos correspondientes. Después de ensayos adicionales con muestras reales de suero, el mAb 2A12A5 demostró ser el más eficaz para la inmunodetección de diagnóstico después de la etapa de captura de ApoH y se mantuvo para los siguientes estudios. Primer estudio preliminar enmascarado: esclerosis múltiple -MS- y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica -CIDP-.

Para una evaluación preliminar de este inmunoensayo en diferentes grupos de pacientes con diversas enfermedades, primero se analizaron los sueros de 29 pacientes con MS, de 28 pacientes con otras enfermedades neurológicas, de 60 pacientes con enfermedades no neurológicas y de 50 donantes de sangre sanos (un total de 167 muestras de suero). Los resultados se presentan en la tabla 12, para MS y otras enfermedades neurológicas.

continuación

Los resultados igual a 1 se consideran como "indeterminados" y las muestras correspondientes, o una nueva muestra de los mismos individuos deben ensayarse de nuevo en un experimento diferente para la determinación. El valor medio (promedio) y la desviación típica - d.t. - de todas las densidades ópticas, se ha determinado en cada grupo y subgrupo de sujetos como se indica a continuación: BD (N = 50): valor medio 0,53, d.t. 0,16.

MS (N = 29): valor medio de MS positiva (N = 23) 1,27 d.t. 0,22, promedio de MS negativa (N = 6) 0,90 d.t. 0,25, valor medio de todos MS 1,20 d.t. 0,25.

OND (N = 20): valor medio de OND negativa 0,88 d.t. 0,10.

CIDP (N = 8): valor medio de CIDP positiva (N = 5) 1,12 d.t. 0,09, promedio de CIDP negativa (N = 3) 0,9 d.t. 0,03, promedio de todos los CIDP 1,04 d.t. 0,13.

Se analizó el suero de 29 pacientes con MS de Francia (19 de Créteil, 10 de Grenoble) como evaluación preliminar de este inmunoensayo en diferentes grupos de pacientes con diversas enfermedades. Los resultados en los pacientes de MS se presentan en la tabla 12a. Se usaron diez donantes de sangre sanos como patrones negativos para la determinación del límite de positividad (punto de corte o CO, valor umbral bajo el cual no se detecta señal específica). De acuerdo con el valor de corte estadístico de esta serie, 23 pacientes con MS tienen antigenemia de ENV de MSRV significativamente positiva (DO media = 0,88), mientras que 6 pueden considerarse negativos, aunque bastante cerca del umbral (DO media de "MS negativa" = 0,62). De forma interesante, los casos de MS negativa tuvieron una duración mayor de formas más bien benignas (n.° 24, 25, 28) o estaban experimentando el protocolo de tratamiento con ciclofosfamida.

En paralelo, se analizó el suero de 28 pacientes con otras enfermedades neurológicas (OND) (12 de Créteil, 16 de Grenoble). Cinco pacientes obtuvieron un resultado positivo, representando por tanto aproximadamente un 18 % de los pacientes con OND ensayados aquí. No obstante, todos los casos de OND positiva tuvieron un diagnostico similar: polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP) mientras que los pacientes con OND con otros diagnósticos fueron todos negativos (o "indeterminados" al límite corte según un caso de síndrome de Guillain-Barré agudo). Por tanto, los resultados de los pacientes con OND se presentan en la tabla 12a como OND sin CIDP por separado de los pacientes con CIDP (tabla 12c). Aproximadamente la mitad de los casos de CIDP son positivos pero, dados los presentes números bajos, aquí no se pretendió analizar las enfermedades neurológicas "inflamatorias" frente a "no inflamatorias".

Además, se ha ensayado en paralelo el suero de otras enfermedades no neurológicas (ONND) tales como 15 pacientes con infección por el virus de la hepatitis B crónica, así como 15 pacientes con infección por virus de la hepatitis C crónica. Ninguna de estas 30 muestras se encontró positiva. El suero polirreactivo de 30 pacientes con anti-ADN, antinúcleo y antifactor reumatoide, que habitualmente impiden numerosos ensayos serológicos, no produjeron ningún resultado positivo. Cincuenta sueros de donantes de sangre sanos también se ensayaron en paralelo. Ninguno se encontró positivo.

La comparación de los resultados del grupo de MS con cualquier otro grupo, muestra una diferencia significativa, excepto por el subgrupo de CIDP. Los valores de densidad óptica de los grupos completos de MS y OND (incluyendo MS negativo y CIDP), cuando se compara con un ensayo no paramétrico (ensayo de normalidad fallido), son significativamente bastante diferentes (p = <0,001; ensayo de suma de rango de Mann-Whitney T = 517.000). Cuando se compara el grupo completo de MS con todos los casos de CIDP, ya no puede encontrarse una diferencia estadística (p = 0,053; ensayo de suma de rango de Mann-Whitney T = 99.000). No se evidenció ninguna diferencia significativa entre los valores de DO de "MS positiva" y de "CIDP positiva" (p = 0,072; ensayo de suma de rango de Mann-Whitney T = 42.000).

Serie de sueros multicéntricos europeos con ensayo enmascarado: esclerosis múltiple - MS - y síndrome aislado clínicamente - CIS.

Para confirmar los primeros resultados con un panel mayor de pacientes con MS de diferentes áreas geográficas, se reclutó el suero en una colaboración multicéntrica con departamentos neurológicos de diferentes países europeos. En estas muestras, se usó una lectura luminométrica para mejorar la detección de la señal y la diferenciación con "ruido" de fondo no específico.

Después de las evaluaciones internas de los sueros con el método colorimétrico, una comparación con la lectura de luminometría confirmó una detección de señal y dinámica potenciadas. Por tanto, se hizo la toma de muestras de suero por ensayo cuadruplicado en pacientes con MS seleccionados aleatoriamente con todas las formas y duraciones de enfermedad, principalmente con tratamiento específico en curso, pero que representan cada origen geográfico de la presente red clínica. Se codificaron y enviaron para ensayo en mascarado a un laboratorio centralizado (APO-H technologies, Montpellier, Francia). Se enviaron sueros no codificados (10 controles negativos y 10 MS positivos) para la validación técnica para la determinación del valor de corte. Además, se enviaron 14 sueros de síndrome aislado clínicamente (CIS, episodio neurológico único e imágenes adicionales y/o anomalías biológicas) codificados y ensayados de forma enmascarada dentro de esta serie. Esta fue la primera evaluación en CIS y se esperaba que comprendiera una mayoría de los primeros episodios de MS.

Los resultados se presentan en la figura 8 (resultados de ELISA de ApoH de sueros del estudio multicéntrico europeo ensayado de forma enmascarada en un laboratorio independiente). Se expresan como la relación de unidades de luminometría (RLU) divididas por el valor de corte determinado dentro de los mismos experimentos, siendo por tanto comparables con la relación de la serie previa (véase, tabla 9). De hecho, el intervalo de relaciones (1 a 6) obtenido aquí dentro de los sueros "MS positivos" con luminometría confirma la optimización técnica de la dinámica de señales en comparación con la colorimetría (1 a 2).

Los resultados de ELISA de ApoH de los sueros del estudio multicéntrico europeo se ensayaron de forma enmascarada en un laboratorio independiente.

La técnica de lectura usada fue luminometría y los resultados se presentan en el eje Y, como la relación de unidades de luminometría individuales (RLU) divididas por el valor de corte determinado en la serie de sueros negativos de referencia en el mismo experimento. Por tanto, valores >1 son positivos.

Los análisis estadísticos de los resultados de luminometría de ELISA de APO-H entre los grupos dieron los siguientes resultados (valores p del ensayo de Fisher): (i) comparando BD frente a todos MS, BD frente a todos MS CIS, BD frente a r Rm S, BD frente a PPMS, BD frente a SPMS, BD frente a CIS: p < 0,001; (ii) comparando CIS frente a RRMS: p = 0,759, CIS frente a PPMS: p = 0,704, CIS frente a SPMS: p = 0,749, RRMS frente a PPMS, SPMS: p = 1, PPMS frente a SPMS: p = 1.

Aquí, 54 de los 74 casos de MS no seleccionados (73 %), originados en diferentes países y regiones del estudio, tuvieron una antigenemia positiva para la proteína ENV de MSRV, pero ninguno de los 26 BD codificados (según los 10 BD no codificados usados como muestras de referencia para el experimento). La presente diferencia entre MS y BD fue altamente significativa (Ji al cuadrado: p < 0,0001), pero "la serie no enmascarada" diferente con mayores números (por encima de cien) detectó pocos donantes sanos positivos o asintomáticos de sangre (4/103; no mostrado). De forma interesante, 9 de los 14 CIS (aproximadamente un 64 %) fueron positivos, pero con valores inferiores.

Los valores de diferentes grupos (MS, BD, CIS) así como de diferentes subgrupos que representan diferentes formas de MS, primaria progresiva (PPMS), secundaria progresiva (SPMS) y recidivante remitente (RRMS) se compararon con ensayo de Fisher. Los resultados de los donantes de sangre sanos fueron significativamente diferentes de todas las combinaciones de MS y CIS (constantemente p < 0,001), mientras que no se evidenció ninguna diferencia significativa en la detección de antigenemia de ENV de MSRV entre cualquier subgrupo que representa MS posible (CIS) o definitiva, o diferentes formas de evolución de la enfermedad MS (un 71 % fueron positivos en rRmS, un 78 % en PPMS, un 70 % en SPMS). No obstante, se ilustra una ligera tendencia de heterogeneidad en los subgrupos CIS frente a MS por valores p inferiores: p = 0,7 a 0,75, frente a p = 1 entre formas de MS, revelando el último valor una distribución de resultados estadísticamente idéntica.

8b. Serie de enfermedad psiquiátrica: Esquizofrenia-SCZ.

Pacientes y métodos

Pacientes y controles sanos

Los pacientes, que cumplen los criterios DSM-IV (American Psychiatric Association: Diagnostic and statistical Manual of Mental Disorders, DSM-IV; 1994) para esquizofrenia se seleccionaron aleatoriamente al final de una hospitalización por un episodio agudo en un departamento de psiquiatría afiliado a la universidad francesa. Fueron criterios de exclusión trastorno neurológico, infección aguda o crónica y serología positiva para virus de la inmunodeficiencia humana (VIH1+2), virus de la hepatitis B y C. La distribución de edad y género en estos controles normales no fue estadísticamente diferente del presente grupo de pacientes. Los síntomas psicóticos se evaluaron con la versión francesa de la escala de signos y síntomas de enfermedad psicótica - SSPI -(Houenou et al., 2007). Se evaluaron los síntomas afectivos con la escala de clasificación de compulsión maniaca de Bech y Rafaelsen y la escala de clasificación de depresión de Montgomery y Asberg - MADRS-(Bech et al., 1978; Montgomery y Asberg, 1979). El protocolo se aprobó por el comité ético local. Se obtuvo el consentimiento informado firmado de todos los sujetos, después de una descripción completa del estudio por el psiquiatra a cargo de las evaluaciones clínicas de los pacientes.

Recogida de suero

Un tubo (tubo seco B y D de 7 ml) de sangre se trató en 2 horas después de la recogida: después de la coagulación se centrifugaron 10 minutos a 2800g y 14 °C. El suero se recogió, se dividió en alícuotas en tubos de baja unión y se almacenó a -80 °C.

Inmunoensayo

Se realizaron ensayos ELISA con la etapa de captura de APO-H (Stefas et al., 1997) con IgG monoclonales (2A12A5, 6A2B2 para ENV de MSRV y 2G5E12 para GAG de MsRV), producidas y seleccionadas por su especificidad por bioMérieux, Marcy L'Etoile, Francia.

Se cargaron 100 pl por pocillo de las muestras diluidas 1/10 en Tris-HCl 50 mM pH 7,6 en microplacas recubiertas con ApoH (APOH Technologies, Montpellier-Francia). Las microplacas se incubaron 2 horas a 37 °C, se lavaron cuatro veces con 250 pl de PBS por pocillo. Se añadieron 100 pl por pocillo de anticuerpo primario (10 pg/ml en PBS-BSA al 2 %), las microplacas se incubaron 1 hora a 37 °C y se lavaron cuatro veces con PBST al 0,05 % más dos veces con PBS. Se añadieron 100 pl por pocillo de anticuerpo marcado con peroxidasa (antirratón de Jackson, 1/250 en PBS-BSA al 2 %), las microplacas se incubaron 1 hora a 37 °C y se lavaron como previamente. Se añadieron 100 pl de solución de sustrato (OPD) por pocillo, las microplacas se incubaron 30 minutos en la oscuridad y la reacción se detuvo con H2SO42N (50 pl/pocillo). La absorbancia se leyó a 490 nm con un lector Biotek.

Análisis estadísticos:

Se realizaron con el software SigmaStat. Se seleccionó el ensayo de suma de rango de Mann-Whitney de ensayo no paramétrico para la comparación de las series de datos, ya que su distribución nunca se ajustaba a la distribución normal (ensayo de normalidad fallido). Se usó el ensayo de Ji al cuadrado para comparar la prevalencia de antigenemia positiva frente a negativa en cada población, para cada antígeno y/o cada anticuerpo usado. El valor de corte para cada condición, bajo la que están los resultados, se calculó a partir de la serie estadística de controles negativos y su valor promedio más tres desviaciones típicas (M 3DT; significancia de positividad: p < 0,01) y se confirmó sobre las muestras positivas y negativas de preferencia.

Resultados

Se han incluido 49 pacientes esquizofrénicos y 49 controles, coincidentes en edad (33+/-6,5 años) y género (73 % hombres, 27 % mujeres). Se incluyeron ocho pacientes en la primera aparición del trastorno esquizofrénico, mientras que la mayoría (N = 41) tenían esquizofrenia crónica grave. Eran eutímicos en el momento de la inclusión tanto para valores depresivos (media de MADRS = 5,6 6,6) y para el valor de compulsión maniaca (media del valor de Bech = 4,8 4,5). Todos los pacientes salvo uno no tratado tomaban fármacos antipsicóticos (27 % antipsicóticos clásicos y 71 % antipsicóticos atípicos). Un tercio de los pacientes (N = 13) eran resistentes al fármaco de acuerdo con los criterios de Kane (Kane 1996).

Para el antígeno GAG de MSRV, se ensayaron 49 controles y 49 pacientes esquizofrénicos. Para ENV de MSRV se ensayaron 30 controles (debido a limitaciones técnicas) y 49 pacientes esquizofrénicos. Los resultados del inmunoensayo se expresan como la densidad óptica media obtenida en duplicados de suero dividida por el valor de corte para hacer toda la serie comparable con los valores normalizados (figura 22 y tabla 10).

Un 47 % (N = 23) y un 43 % (N = 21) de los sujetos esquizofrénicos tenían antigenemia de ENV de MSRV positiva, respectivamente con los anticuerpos 2A12A5 y 6A2B2. Un 49% (N = 24) de los pacientes esquizofrénicos tenían antigenemia de GAG de MSRV positiva, siendo uno positivo y siendo uno "límite" para GAG solamente. La comparación con los controles sanos reveló una diferencia significativa en la prevalencia de positivos (ensayos de Ji al cuadrado: p < 0,001 para detecciones de ENV; p < 0,0001 para GAG). La comparación de los valores de ELISA en pacientes frente a los controles con el ensayo de suma de rango de Mann-Whitney también confirmó diferencias altamente significativas (p < 0,001; tabla 2). Entre los controles, un sujeto tenía antigenemia significativamente positiva. De forma interesante, hubo una correlación positiva entre los resultados para la proteína ENV y los obtenidos para la proteína GAG. El ensayo de suma de rango de Mann-Whitney que compara los valores de ELISA obtenidos con anti-ENV6A2B2 con los obtenidos con anti-GAG 2G5E12 reveló ausencia de diferencia significativa (p = 0,744), igual que para anti-ENV-2A12A5 en comparación con anti-GAG-2G5E12 (p = 0,290), y para anti-ENV-6A2B2 en comparación con anti-ENV-2A12A5 (p = 0,159). Por lo tanto, estos anticuerpos detectaron una expresión equivalente y/o paralela de los antígenos de MSRV:

Los valores de ELISA de antigenemia de "ENV" variaban entre los positivos, como se muestra en la tabla 10 por las desviaciones típicas aumentadas (0,28 para el anticuerpo 2A12A5, 0,48 para 6A2BA) en comparación con los controles negativos (0,09 y 0,08 respectivamente). Esto está confirmando la detección de una producción dinámica de antígenos de MSRV en ciertos pacientes con esquizofrenia.

Tabla 13: Dosificaciones de cápside de MSRV (GAG) y envoltura (ENV) en los sueros de pacientes esquizofrénicos

Z nr l

La relación de ensayo del inmunoensayo (ELISA) (eje Y) es la densidad óptica promedio medida en pocillos duplicados del mismo suero dividida por el valor de corte de la serie correspondiente (véase, Materiales y métodos). El antígeno ENV se dosifica con anticuerpo monoclonal 2A12A5 o anticuerpo monoclonal 6A2B2 y el antígeno GAG se dosifica con el anticuerpo monoclonal 2G5E12 como se indica en las columnas respectivas con los valores trazados.

En la figura 9, el valor promedio y los intervalos de confianza (0,01 y 0,001) se representan por barras y recuadros, y la distribución de los valores máximos y mínimos para cada antígeno y anticuerpo (indicados en la parte superior de cada columna) se representan por puntos. La serie de valores de los pacientes con esquizofrenia se indica como "SCZ" en la parte inferior de los diagramas correspondientes, y aquellos de donantes de sangre sanos se marcan como "Controles" (parte inferior/eje X).

8c. Otras enfermedades neurológicas: Epilepsia.

Los ensayos ELISA se realizaron como se describe anteriormente (8b). Los pacientes con epilepsia y los controles normales se ensayaron en paralelo para la presencia de la proteína ENV de MSRV en su suero. Los resultados se presentan en la figura 10.

Cada barra vertical representa la DO media de resultados duplicados del suero de un único paciente con epilepsia (38 desde la izquierda) o control (24 desde la derecha).

La barra negra horizontal representa el valor de corte del ensayo, por encima del cual la señal detectada es específica de presencia de antígeno en suero. Se determina por el promedio de los resultados de los donantes de sangre sanos (controles) más tres veces su desviación típica.

Por tanto, aquí, se ha detectado un subgrupo de 8 pacientes con epilepsia asociada a ENV de MSRV, que puede corresponder simplemente a un subgrupo con esta etiología particular entre otros casos con una causa etiológica diferente. Solamente la epilepsia positiva MSRV es relevante para el tratamiento con el ligando anti-ENV en, por ejemplo, vectores de anticuerpo.

8d: Pacientes con psoriasis

Se sabe desde hace tiempo que los pacientes con psoriasis expresan retrovirus similar (Iversen, O. J. (1990), "The expression of retrovirus-like particles in psoriasis." J Invest Dermatol 95 (5 Supl.): 41S-43S. / Bjerke, J. R., G. Haukenes, et al. (1983), "Activated T lymphocytes, interferon, and retrovirus-like particles in psoriatic lesions." Arch Dermatol 119(12):955-6). Por lo tanto, su relevancia para los presente vectores terapéuticos que comprenden el ligando es obvia para los expertos en la materia.

Ejemplo 9: Eficacia in vivo de vectores farmacéuticos que comprenden el ligando y que retienen la afinidad de ligando con características de actividad, frente a GNbAC1. Evidencias in vivo de efectos antiinflamatorios, inmunoprotectores y neuroprotectores del ligando, suministrado en forma de un ligando en vector con un compuesto de vector farmacológico apropiado: Ejemplo de efecto terapéutico en modelos animales con neuroinflamación, desmielinización y/o degeneración neuronal.

Materiales y métodos:

EAE inducida por MSRV/ENV en el modelo de ratón SCID humanizado (huSCID).

Se adquirieron ratones SCID de 6 a 8 semanas de edad sin patógenos de Charles River, Francia. La humanización de los ratones se consiguió usando PBMC de donantes de sangre sanos (Etablissement Franpais du Sang, Lión, Francia), de acuerdo con el protocolo descrito previamente (Firouzi et al., 2003). En particular, los ratones se irradiaron con radiación gamma y recibieron anticuerpo anti-NK antes de la humanización con 50 x 106 PBMC humanas por inyección intraperitoneal (i.p.). La calidad de la humanización se controló entonces por detección específica de inmunoglobulina humana en suero de ratón. Cuando se necesita más de un donante por serie, todos los subgrupos huSCID se hicieron comparables con la misma proporción de ratones humanizados con cada donación de sangre.

Fue necesario un retardo de 2 semanas antes de la inclusión en el protocolo de EAE (antes de la primera inyección con antígeno de mielina). Después, los grupos de ratones recibieron inyección de proteína básica de mielina (MBP) y adyuvante incompleto de Freund (IFA, que comprende diluyente solamente) para los grupos "simulados de control" o recibieron inyecciones de MBP y proteína ENV de MSRV sin endotoxinas purificada homogeneizada en diluyentes IFA para EAE "inducida por ENV". Cuando se controló la actividad de la enfermedad clínicamente y por MRI para obtener las lesiones causadas y los déficit clínicos en progresión, se estudió el efecto de ligando anti-ENV seleccionados en comparación con el anticuerpo monoclonal murino original (GNb_AC1) con inyección en ratones enfermos (MBP-EAE inducido por ENV en ratones huSCID).

Para la inducción o "inducción simulada" de EAE, a los animales primero se les inyectó s.c. en el cuello en el día 0, 50 |jg de MBP humana 150 |jg de péptido MBP (péptido MBP 87-99) 20 |jg de proteína ENV recombinante IFA (grupo ENV) o 50 jg de MBP humana 150 jg de péptido MBP (péptido MBP 87-99) IFA solamente (grupo de control). También se inyectaron i.p. 200 ng de toxina pertúsica (PTX) por animal 2 días después en todos los grupos. Se hizo una segunda inyección por vía intraperitoneal (i.p.) de los mismos componentes a la misma dosis (incluyendo el péptido MBP y la proteína completa MBP humana), correspondiente a la descripción previa para cada grupo, en el día indicado (tabla 11). También estuvo acompañada por una inyección similar de 200 ng por animal de PTX. La tercera y última inyección de los mismos inmunógenos se hizo s.c. en el lado opuesto del cuello en el día indicado (tabla 14), acompañada por inyección similar de PTX.

Tabla 14. Serie preclínica de evaluación del tratamiento con anticuerpo: descripción de los diferentes grupos y

" - " ^ -

continuación

Para el seguimiento, los animales se pesaron 5 días por semana y se valoraron clínicamente. El valor clínico se hizo con los siguientes criterios: 0 = sin signos; 1 = parálisis de la cola o hiperreflexia de una o más extremidades posteriores o debilidad unilateral de la extremidad posterior; 2 = debilidad bilateral de la extremidad posterior o extremidad anterior; 3 = parálisis unilateral adicional o deficiencia mayor; 4 = parálisis completa de la extremidad posterior o extremidad anterior; 5 = parálisis parcial adicional o deficiencia mayor de extremidades opuestas; 6 = moribundo o muerto.

La duración total de los experimentos de Hu-SCID no excedió de los dos meses, con la excepción de los estudios de supervivencia que implican los ratones tratados con mAb y de control (cuatro meses).

MRI y análisis de inmunohistoquímica (imágenes no mostradas en el presente ejemplo):

Los animales se controlaron por análisis ponderado T2 de MRI e histología post-mortem, que confirmó ambos tipos de lesiones con inflamación y desmielinización en el sistema nervioso central, así como imágenes (MRI) de la mejora destacada de los patrones inflamatorios en ratones tratados con mejora clínica.

Resultados:

Los ratones SCID con sistema linfoide humano (injertados como se indica anteriormente) proporcionan animales híbridos con un sistema inmunitario humano funcional. Estos animales aquí han recibido tres inyecciones de proteína ENV de MSRV emulsionada con MBP en diluyentes oleosos (IFA), en los días indicados por las flechas azules. Cuando los animales tenían un valor clínico elevado con neuroinflamación en curso visualizada por MRI (EAE), se les inyectó una única dosis (10 |jg por vía intraperitoneal) del anticuerpo monoclonal murino original (GNb AC1, indicado como mulgG en la figura 10) o de una de las construcciones de IgG1 o IgG4 humana con el ligando (indicado como hulgG1 y hulgG4 en la figura 11). Un grupo permaneció sin tratar, para compararlos con los animales tratados y el grupo de "control simulado" al que se le inyectó MBP en IFA sin ENV que permaneció sano, pero recibió una inyección del anticuerpo murino original (GNbAC1) en el mismo día que los animales enfermos tratados. Como puede observarse a partir de los resultados ilustrados en las figuras 11 y 12, todos los ratones no tratados murieron después de 30 días y tuvieron una progresión clínica grave después de la última de las tres inyecciones con proteína ENV de MSRV. Se han observado lesiones graves por histología e inmunohistología, que evidencian desmielinización, infiltración de células linfoides, muerte neuronal, rotura de la barrera hematoencefálica y astrogliosis. De forma interesante, en esclerosis múltiple, la rotura de la barrera hematoencefálica también es una marca distintiva de lesiones activas del SNC.

Por tanto, el anticuerpo murino o la IgG1 o 4 humana quimérica que comprende el ligando dirigido a ENV, podría difundir desde la inyección intraperitoneal al organismo completo y, en particular, a las lesiones activas del SNC en animales enfermos.

De forma destacada, las curvas de supervivencia muestran un 100 % de supervivencia en animales tratados con los anticuerpos quiméricos IgG1 o IgG4 frente a un 0 % en los no tratados en el día 35. Sorprendentemente, la IgG1/kappa murina original (GNbAC1) tiene menos eficacia cuando se inyecta a la misma dosis, ya que un animal murió en el día 28. Además, las curvas clínicas de la figura 11 muestran una mejora muy buena y duradera en animales tratados con las construcciones de IgG1 o 4 humana, pero solamente estabilización o una mejora leve en los animales tratados con el anticuerpo murino original.

Dicha mejora destacada de los animales tratados con ligando en los vectores de IgG1 o de IgG4 humana, también se evidenció por control por MRI, en comparación con controles no tratados.

Por tanto, la eficacia clínica de la IgG1 o 4 quimérica humana se confirma en modelos animales que muestran neuroinflamación, desmielinización, muerte neuronal, rotura de la barrera hematoencefálica y astrogliosis en el sistema nervioso central (SNC; véase los modelos Hu-SCID y C57/bl6 a los que se ha inyectado la proteína ENV de MSRV). Sorprendentemente, la eficacia se mejora, en comparación con la IgG murina original que contiene el mismo ligando (cadenas VH VL).

Por tanto, la eficacia terapéutica en el presente modelo animal de neuroinflamación se pone de manifiesto para otras aplicaciones en enfermedades o síndromes asociados a MSRV, como se define en el texto de la presente invención. Además, el "efecto de ligando" inesperado de una composición mínima o construcción que comprende las seis CDR definidas en el ejemplo 1, hace posible usar el ligando de forma totalmente independiente de las funciones del anticuerpo, pero también variar y elegir los valores añadidos e intereses relativos de diferentes vectores (no exclusivamente relacionados con los isotipos de IgG) para cada posible aplicación terapéutica.

Ejemplo 10: la proteína ENV de MSRV se detecta con gran intensidad en ciertas células de biopsias en pacientes con tumor sólido o de biopsias en pacientes con trastornos linfoproliferativos o cánceres linfoides.

Materiales y métodos:

- Anticuerpo de ensayo

GNb AC1, 1.0 ml, concentración: 5,918 mg/ml

- Anticuerpo de control negativo

Proteína IgG1 kappa de mieloma de ratón (MOPC-21, Sigma), 1,0 ml, concentración: 1,0 mg/ml

Este anticuerpo se usó simultáneamente con el anticuerpo de ensayo.

- Proteína de inhibición

ENV-T (MSRV ENV, GeNeuro SA), 10 ml (10 viales de 1 ml), concentración: 0,05 mg/ml

Este antiligando se usó simultáneamente con el anticuerpo de ensayo.

- Muestras tisulares humanas

Se obtuvieron tejidos humanos recogidos de forma ética con el completo consentimiento del paciente de una fuente externa.

Todos los tejidos se sometieron a ensayo de antigenicidad. Se evaluó una sección teñida con IHC de una proteína habitualmente expresada; S100, CD45, desmina, citoqueratina o vimentina asociada con cada tejido, antes de considerar los tejidos aceptables para su uso en este estudio.

- Validación del ensayo

Los parámetros investigados incluyeron:

1. Comparación de la tinción del tejido de control positivo usando formalina tamponada neutra, paraformaldehído y fijación en acetona.

2. El uso de un método de detección de inmunotinción apropiado.

3. Determinación del título óptimo del anticuerpo de ensayo, se investigó de 0 a 5,0 pg/ml (el anticuerpo de control de isotipo se procesó a las mismas concentraciones).

4. La especificidad de la tinción se validó por omisión del anticuerpo de ensayo sustituido con tampón. Además, se bloquearon los sitios de unión antigénicos de MSRV usando la proteína ENV-T antes de la incubación del tejido.

5. Se empleó cualquier bloqueo necesario de los materiales endógenos que pudieran interferir con la señal del antígeno diana.

- Método de tinción inmunohistoquímica (IHC)

Como resultado de los hallazgos de la fase de validación, cada una de las muestras tisulares se exploró simultáneamente de la siguiente manera:

• GNbAC1 omitido del procedimiento de tinción

• Anticuerpo MOPC-21 a 1,0 pg/ml

• GNbAC1 a 0,25, 1,0 y 3,0 pg/ml

Cada muestra tisular se evaluó usando un microscopio óptico. El sistema de valoración identificó el tejido y el tipo celular y reflejó subjetivamente la intensidad de esa tinción.

Toda la tinción en los tejidos tratados con el anticuerpo de control negativo o sin anticuerpo, y que no delimitaba específicamente las células individuales, se asumió como no específica. La tinción no específica se registró para tejidos tratados con el anticuerpo de ensayo cuando la tinción inmunohistoquímica en estos tejidos era similar en intensidad y en distribución a los tejidos que no se trataron con el anticuerpo de ensayo y donde las células individuales no estaban delimitadas específicamente.

Se registró tinción positiva señalando la estructura tisular o los tipos de células y después indicando la intensidad del siguiente modo:

0 negativo

leve

+ moderado

++ marcado

La frecuencia de tinción identificada en cada tipo celular se indicó del siguiente modo:

<10 % poca

11-40 % varias

41-75 % mucha

>76 % la mayoría

Si una sección no se consideraba adecuada para evaluación, no se incluían datos en la tabla de resultados hasta que se repitió, cuando fue posible, la tinción.

Hubo menos tinción de membrana a 0,25 jg/ml en comparación con las otras diluciones ensayadas.

El tejido hepático se incluyó como comparación entre un control positivo conocido y un tejido que no se identificó inicialmente como positivo.

No se identificó tinción significativa en el control de tampón negativo o el isotipo. La tinción positiva en comparación con los tejidos teñidos positivamente prácticamente se eliminó cuando se hacía reaccionar ENV-T con el anticuerpo anti-MSRV/ENV GNbAC1.

Para un futuro trabajo de exploración para ensayar mAb, se usó GNb AC1 1,00 jg.mM como concentración óptima, estando 3,00 jg.mM un paso por encima a la misma y siendo 0,25 jg.m l'1 la baja concentración.

Como resultado de los hallazgos de la validación, se adoptó el siguiente procedimiento de tinción IHC para la exploración del tejido humano normal congelado.

Procedimiento Tiempo

Secar al aire secciones N/A tisulares 10 minutos aprox.

Fijar en acetona y secar al aire N/A

Lavar en agua corriente Aprox. 10 min

Peróxido de hidrógeno al 0,3 % en metanol Aprox. 5 min

Lavar en agua corriente Aprox. 5 min

Lavar en PBS Durante una noche a 2-8 °C

Incubar con el anticuerpo monoclonal GNb AC1 a 0,25, 1,0 y 3,0 Aprox. 5 min

jg/ml y con el control de isotipo a 1,0 jg/ml. También omitir

principalmente del procedimiento de tinción e inhibir con ENV-T a 10

jg/ml con GNb Ac 1 a 1,0 jg/ml

Lavar en PBS Aprox. 30 min

Incubar con EnVision/HRP Aprox. 5 min cada uno

Lavar en PBS x 2 Aprox. 5 min

Tratar con el sustrato enzimático DAB Aprox. 5 min

Lavar en agua corriente Aprox. 15 segundos

Teñir con contraste en hematoxilina de Mayers Según lo necesario

Lavar en agua corriente Según lo necesario

Deshidratar, limpiar y montar

Resultados:

- Cáncer de mama.

Tabla 15: Resultados obtenidos con tejidos de carcinoma de mama de diferentes individuos. INTENSIDAD Negativa 0 Leve Moderada + Marcado ++ FRECUENCIA Pocos Varios Muchos Mayoría

Hallazgos GNbAC1

microscópicos ENV-T IsotipoConcentr. de anticuerpo ug/ml 10,00 1,00 0,00 0,25 1,00 3,00

Epitelio 0 0 0 Pocos Varios Pocos Ductal/glandular.

Mama (mamario) Citoplasma/membrana +

Contenidos luminales. 0 0 0 0 Varios Pocos

(carcinoma in Superficie luminal. 0 0 0 0 Varios Muchos situ)

+ +

Vasos-endotelio 0 0 0 0 Muchos Pocos Citoplasma/membrana +

Epitelio 0 0 0 0 Pocos Muchos Ductal/glandular.

Citoplasma/membrana ++ Contenidos luminales. 0 VariosVarios Varios Varios Varios

+ ++

Superficie luminal. 0 0 0 0 Pocos Muchos

++ (adenocarcinoma Vasos-endotelio 0 0 0 0 Varios Muchos de mama)

Citoplasma/membrana + +

Epitelio 0 0 0 0 Pocos Varios Ductal/glandular.

Citoplasma/membrana + Contenidos luminales. 0 0 0 0 0 0

Superficie luminal. 0 0 0 0 Varios Muchos

(adenocarcinoma Vasos-endotelio 0 0 0 0 Varios Varios de mama)

Citoplasma/membrana +

Por tanto, puede evidenciarse que ENV de MSRV se expresa altamente en células epiteliales ductales/glandulares y en células endoteliales de los vasos sanguíneos adyacentes en 3/3 tumores mamarios de mama ensayados con GnbAC1 específico.

Por tanto, de acuerdo con la anotación de "enfermedades asociadas a MSRV", ahora se evidencia que el carcinoma de mama es una de estas enfermedades humanas.

Cáncer linfoide y trastornos proliferativos:

Tabla 16: Resultados obtenidos con tejidos linfoides hiperplásicos de diferentes individuos. INTENSIDAD Negativa 0 Leve + Moderada ++ Marcada +++; FRECUENCIA Pocos Varios Muchos Mayoría; NP: no practicable Concentración de anticuerpos ug/ml

ENV-

Hallazgos T Isotipo GNb AC1

microscópicos 10,00 1,00 0,00 0,25 1,00 3,00 Amígdala Membrana 0 0 Varios Muchos Varios citoplasmática linfoide ++ ++ ++ Membrana citoplasmática 0 0 Pocos Muchos Muchos del endotelio de los vasos + + ++ (hiperplasia Membrana Muchos Mayoría Mayoría folicular)

citoplasmática linfoide ++ ++ ++ Membrana citoplasmática 0 0 Pocos Muchos Muchos del endotelio de los vasos + + ++ (hiperplasia Glóbulos blancos en membranaMuchos 0 0 NI NI NI folicular) citoplasmática de los vasos

+

Por tanto, puede evidenciarse que ENV de MSRV se expresa altamente en células linfoides y en células epiteliales de los vasos sanguíneos adyacentes en 2/2 biopsias de amígdala con hiperplasia marcada de pacientes con trastorno linfoproliferativo, cuando se ensayan con GNbAC1.

Por tanto, de acuerdo con la anotación de "enfermedades asociadas a MSRV", ahora se evidencia que los trastornos linfoproliferativos, incluyendo los cánceres de células linfoides, están entre estas enfermedades humanas.

- Cáncer renal

Tabla 17: Resultados obtenidos con tejidos de carcinoma renal de diferentes individuos. INTENSIDAD Negativa 0 Leve + Moderada ++ Marcada +++; FRECUENCIA Pocos Varios Muchos Mayoría; NP: no practicable Concentración de anticuerpos microg/ml

Hallazgos microscópicos ENV- T Isotipo GNb AC1

10,00 1,00 0,00 0,25 1,00 3,00 Superficie del lumen de los túbulos 0 0 0 Pocos Pocos Muchos Citoplasma/membrana ++ Glomerular mesangial 0 0 0 0 0 0 (cáncer de riñón) Membrana/citoplasma

Bucles de vasos glomerulares 0 0 0 Pocos Pocos NP Endotelio/citoplasma ++ ++ NP Cilindros urinarios 0 Muchos Mayoría ++ Superficie del lumen de los túbulos Pocos Varios Varios Citoplasma/membrana + + Glomerular mesangial Pocos Pocos Pocos Membrana/citoplasma ++ ++ ++ (carcinoma de células Cápsula de Bowman 0 Varios Varios renales) ++ ++ Bucles de vasos glomerulares 0 Muchos Mayoría Endotelio/citoplasma ++ ++ Cilindros urinarios Pocos Pocos Pocos

A pesar de la ligera tinción de fondo en un tipo celular (diferente en cada caso), el análisis fue practicable y, por tanto, se puede evidenciar que ENV de MSRV se expresa altamente en células renales y en células endoteliales de los vasos sanguíneos adyacentes en 2/2 biopsias renales de pacientes con carcinoma renal, cuando se ensayan con anticuerpo anti-ENV de Ms RV específico (GNbAC1).

Por tanto, de acuerdo con la anotación de "enfermedades asociadas a MSRV", ahora se evidencia que los cánceres renales son una de estas enfermedades humanas.

Las fotografías correspondientes de visualización en microscopio óptico de secciones tisulares teñidas con anticuerpo anti-ENV específico (GNb AC1) o anticuerpo de control irrelevante (MOPC-21) han confirmado los hallazgos presentados en las tablas 15-17, para cánceres renales, para cánceres linfoides o trastornos linfoproliferativos y para cáncer de mama.

Ejemplo 11: A. Las proteínas ENV y GAG de MSRV se detectan con niveles significativos y concordantes en el suero de determinados casos agudos que desarrollan diabetes:

Se recogieron de forma anónima sueros de pacientes con diabetes insulinodependiente aguda de los volúmenes restantes después de ensayo rutinario con fines de diagnóstico y de seguimiento. Se obtuvieron sueros de donantes de sangre sanos de la organización de banco de sangre habilitada.

Los sueros se ensayaron de acuerdo con la técnica de inmunodetección usando placas de captura de APOH y detección de ligando específico, como se describe previamente en los ejemplos de la presente invención.

La siguiente proporciona la densidad óptica media en ensayos triplicados, medida de sueros de pacientes con diabetes aguda (Diab.) y de donantes representativos de sangre (BD).

Se usaron ligandos de anticuerpo monoclonal murino anti-MSRV:

- Un GNbAC1 anti-envoltura (ENV) (Geneuro, Suiza).

- Un anti-poliproteína de la matriz y la cápside (GAG): 2G5E12 (bioMerieux Francia).

La unión específica de estos anticuerpos se reveló por un anticuerpo secundario anti-ratón (Jackson, EE. UU., ref.

115-035-146). Las diluciones o concentraciones usadas se indican en la siguiente tabla.

Los resultados son significativos cuando la relación (P/N) de la densidad óptica media dividida por el valor de corte (determinado a partir del valor medio de controles sanos más dos desviaciones típicas -DT- de la serie correspondiente) es mayor de uno. Dichos valores están en negrita y letras mayúsculas en las filas P/N 2.

Por tanto, puede evidenciarse que diez de los diez y ocho pacientes tienen antigenemia significativa para al menos la proteína ENV, detectada por el anticuerpo monoclonal murino de ligando. Todos los pacientes "MSRV positivos" se detectan por los dos anticuerpos y tienen resultados significativos para ambas proteínas GAG y ENV.

Dichos resultados con detección coincidente de dos anticuerpos monoclonales diferentes dirigidos a dos epítopos diferentes que representan dos proteínas diferentes de MSRV (ENV y GAG), son obviamente significativos y valiosos en términos de asociación con MSRV como se describe en otra parte en la presente invención, para la determinación de enfermedades asociadas a MSRV.

Por lo tanto, la diabetes de tipo I u otra diabetes asociada a inflamación comprende un subgrupo de pacientes cuya patogénesis de la enfermedad puede estar causada por los efectos proinflamatorios e inmunopatogénicos de la proteína ENV de MSRV.

Tabla 18: resultados de antigenemia de ELISA de APOH en pacientes con diabetes (Diab.) en comparación con donantes sanos (BD). Véanse los comentarios detallados en el texto del ejemplo. P/N 2 = relación de densidad óptica calculada como el resultado de la muestra dividido por el valor de corte. El último se determina con donantes sanos como la media del grupo sano dos veces su' desviación típica. _______________

GNb AC1 2G5E12

1 ug/ml Jackson 080604CP01

115-035-146 1 ug/ml Jackson

- -

Ejemplo 12: Descubrimiento inesperado de un modelo animal apropiado para diabetes inducida por ENV. 1. Introducción

El modelo de ratón mutante espontáneo SCID diabético no obeso (NOD-SCID) tiene la mutación SCID transferida a un fondo NOD susceptible a diabetes. Sorprendentemente, los experimentos preliminares realizados por el solicitante revelaron que la inmunización primaria de ratones NOD-SCID humanizados con la proteína (25 |jg) y MBP murina (proteína y péptido) dio lugar sistemáticamente a una muerte rápida de todos los animales ensayados, mientras todos los ratones SCID humanizados que habían recibido los mismos inmunógenos sin la proteína ENV (controles simulados) sobrevivieron. En una primera etapa, se evaluaron los efectos perjudiciales de la proteína ENV en los ratones NOD-SCID de una manera de respuesta a dosis usando control clínico combinado con una estrategia histológica. En una segunda etapa, se evaluaron los efectos beneficiosos de nuestro ligando IgG4 quimérico en la prevención del daño inducido por la proteína ENV.

2. Evaluación de los efectos perjudiciales de la proteína ENV en ratones NOD-SCID

a. Materiales y métodos

a.1. Animales

Se adquirieron seis ratones SCID sin patógenos (de 6 a 8 semanas de edad) de Charles River, Francia. Los animales se mantuvieron 3 por jaula en un ciclo convencional de luz-oscuridad con acceso ad libitum a comida y agua y no se distribuyeron durante un periodo de 8 días de aclimatación. Se tuvo especial cuidado por asegurar condiciones de alojamiento muy limpias. Particularmente, los animales se alojaron en jaulas especiales equipadas con tapa de filtro.

a.2. Humanización de ratones NOD-SCID

Para obtener ratones NOD-SCID, desprovistos del sistema inmunitario linfoide, con un sistema inmunitario humano injertado, los ratones se humanizaron con células mononucleares periféricas humanas ofreciendo de este modo el potencial de estudiar la tarea funcional del sistema inmunitario humano en modelos animales inmunopatogénicos. Esto proporciona resultados mucho más cercanos a la situación humana real en términos de inmunopatología y respuesta a proteínas patogénicas humanas, tales como ENV de MSRV. La humanización de los ratones se consiguió de acuerdo con el protocolo descrito previamente por Firouzi et al., 2003, excepto que los animales no se irradiaron con radiación gamma y no se trataron con ligando anti-NK porque los ratones NOD-SCID están espontáneamente desprovistos de células NK. Se obtuvo sangre (capa leucocitaria, 45-50 ml) de 2 controles sanos del centro de transfusión de sangre (EFS) de Lion. La calidad y la seguridad de la sangre se garantizaron por análisis inmunológico y hematológico. Todos los procedimientos experimentales se realizaron bajo un flujo de aire laminar y usando guantes estériles. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas se obtuvieron por un método de separación por densidad en gradiente de Ficoll y se administraron a NOD-SCID por inyección i.p. (50.106 células). Como se usó la sangre de dos donantes diferentes para humanizar todos los animales, se humanizó la misma proporción de ratones con cada donante de sangre. Aquí ya puede confirmarse que no se observaron diferencias entre los animales con injerto de cada donante en todos los experimentos futuros, como se describe a continuación.

3. Evaluación de los efectos perjudiciales de la proteína ENV en los ratones NOD-SCID

Inyecciones de la proteína ENV

En el día 0 (P0), los ratones recibieron una única inyección intraperitoneal (i.p.) (0,5 ml) de proteína ENV (PX'Therapeutics, Francia) con las siguientes dosis: 0,1, 1, 5, 10 y 20 jg. La proteína ENV se diluyó en solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril (Lonza, Francia). Un único ratón recibió inyección con PBS en solitario.

Para evitar cualquier disminución en la concentración en la proteína ENV y en la bioactividad, se consiguió una segunda inyección de proteína ENV emulsionada en 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund (Sigma, Francia) en P7. Cada ratón recibió una única inyección subcutánea en el cuello. Las dosis de proteína ENV usadas para cada ratón fueron las mismas que para la primera inyección en P0.

Se realizó una tercera inyección s.c. de proteína ENV emulsionada en diluyente de aceite mineral -"IFA"-(0,5 ml) en el cuello en P14. El mismo día, los ratones recibieron una inyección i.p. de 200 ng (0,5 ml) de toxina pertúsica -"PTX"-(Wako, Alemania) por animal para abrir de forma transitoria la barrera hematoencefálica para el paso de células inmunitarias extra-SNC.

Evaluación clínica

Se controló el estado de salud general (aspecto del pelaje, forma de caminar en la jaula, postura) y el peso de los animales 5 días por semana desde P14 hasta P37.

Examen histológico

Se retiraron el cerebro y los órganos internos de todos los animales muertos y se conservaron en formol (10 %) para el posterior examen histológico.

b. Resultados

1. Control clínico

Durante unos pocos primeros días después de la inyección de la proteína ENV emulsionada en IFA y PTX, todos los ratones que habían recibido las dosis mayores de proteína ENV presentaban una disminución del peso corporal (véase la figura 13) asociada con un fuerte empeoramiento de su estado de salud general como se indica por una baja actividad del comportamiento en la jaula y la prosternación. Finalmente, todos estos ratones murieron en los cuatro días siguientes a la última inyección. De forma interesante, los ratones a los que se habían inyectado dosis inferiores de proteína ENV mostraron un ligero aumento del peso corporal asociado con un buen estado de salud general a pesar de la aparición gradual de pelaje erizado leve en los dos ratones restantes a los que se habían inyectado dosis bajas de proteína ENV.

Durante la semana después de la última inyección, el peso corporal de los ratones supervivientes se estabilizó o disminuyó ligeramente (véase la figura 13), pero su estado de salud general estuvo inalterado.

Durante la segunda semana después de la última inyección, los ratones supervivientes siguieron ganando peso (véase la figura 13) y su estado de salud general se estabilizó.

2. Examen histológico

Objetivos del estudio

Estudio histológico del páncreas de ratones NOD M4, M5 y M6.

Materiales y métodos

Se han recibido muestras de tejido pancreático, fijado en formalina. Las muestras tisulares se han incrustado en parafina, cortadas en secciones de 5 pm de grosor. Las secciones tisulares se han teñido con hematoxilina-eosinaazafrán y se han examinado con un microscopio óptico. Se han tomado imágenes numeradas representativas. Resultados

M4 páncreas: La arquitectura global del páncreas está conservada. Están presentes lesiones inflamatorias focales: forman pequeños infiltrados, de composición polimórfica, con una distribución predominantemente perivascular y periductular. No hay alteración significativa del páncreas exocrino. Se observan lesiones de los islotes endocrinos: hay células inflamatorias presentes a lo largo de su periferia y son visibles células endocrinas apoptóticas.

M5 páncreas: Hay pancreatitis presente. Hay infiltrados inflamatorios grandes presentes dentro del páncreas exocrino y están asociados con necrosis focal de células acinares. A veces hay necrosis fibrinoide presente.

M6 páncreas:

Hay varias lesiones presentes. Hay áreas confluyentes grandes de necrosis presentes en el páncreas y provocan la necrosis completa de una gran cantidad de células acinares. Además, las lesiones inflamatorias también implican el tejido adiposo peripancreático, con focos de citoesteatonecrosis. El aspecto histológico es típico de pancreatitis necrotizante aguda.

En resumen:

- Lesiones inflamatorias focales y leves en páncreas de M4.

- Pancreatitis aguda de intensidad moderada en páncreas de M5.

- Pancreatitis necrotizante aguda grave en páncreas de M6.

c. Análisis

Globalmente, nuestros resultados sugieren que la inyección de la proteína ENV es letal en ratones NOD-SCID solamente para dosis mayores de 5 |jg. Como los animales a los que se les ha inyectado dosis altas de proteína ENV presentaban un deterioro en su estado de salud general antes de la inyección de PTX, es poco probable que el daño principal del SNC pudiera explicar los efectos perjudiciales de la proteína ENV observada en ratones NOD-SCID. Es más probable que la proteína ENV haya activado una disfunción principal en uno o varios órganos diferentes dando lugar a la muerte de los animales. Como los ratones NOD-SCID portan un fondo susceptible a diabetes, el estado histológico del páncreas de los animales muertos presentados anteriormente es muy sugerente de inflamación del páncreas inducida por ENV. De forma interesante, la dosis letal más baja induce lesiones en los islotes-beta y el páncreas endocrino solamente, lo que corresponde claramente a lesiones por diabetes y es suficiente para explicar la muerte de los ratones a esta dosis, en ausencia de células secretoras de insulina eliminadas por la inflamación inducida por ENV.

Con dosis mayores, parece que probablemente estamos más allá de la dosis relativa/peso que podrían encontrarse en diabetes humana y que dichos altos niveles de ENV inducen inflamación mucho mayor obtenida en el páncreas completo, incluyendo la parte exocrina en pancreatitis necrotizante aguda. No obstante, estas observaciones son relevantes para pancreatitis, que aquí se demuestra que aparece cuando se inyectan dosis mayores de proteínas ENV de MSRV.

4: Control de la glucemia después de inyecciones repetidas de proteína ENV en ratones NOD-SCID

A. Introducción

En un experimento previo, se ha demostrado que inyecciones subcutáneas repetidas de 5 jg de proteína ENV en ratones NOD-SCID humanizados pueden dar lugar a muerte del grupo correspondiente de animales que podría estar ligado a una destrucción aguda de las células-beta de los islotes pancreáticos. Para evitar la interpretación ambigua de la evolución de la cinética de glucemia en condiciones que causan muerte repentina de los animales, en el presente estudio se han usado inyecciones repetidas de dosis subletal de proteína ENV para estudiar la glucemia de los ratones NOD-SCID humanizados.

B. Materiales y métodos

1. Animales

Véase 2.a.1 anterior.

2. Humanización de ratones NOD-SCID

Véase 2.a.2 anterior.

3. Inyecciones de proteína ENV

En este estudio, a los ratones se les inyectó una vez a la semana (P0, P9, P16 y P23) durante 4 semanas. Para cada punto temporal dos ratones recibieron una inyección subcutánea en el cuello de 2,5 jg de proteína ENV (PX'Therapeutics, Francia) emulsionada en 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund (Sigma, Francia). Los dos ratones restantes (ratones de control) recibieron una inyección subcutánea en el cuello de 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund.

4. Medición de glucemia

En P0 y P30 se recogieron muestras de sangre de la vena de la cola lateral en animales conscientes. Se evaluaron las concentraciones de glucosa en sangre usando un lector de glucemia (Optium Xceed, Abbott, Francia).

C. Resultados

Como se esperaba con la dosis subletal, los ratones que habían recibido cuatro inyecciones de proteína ENV aún estaban vivos después de la cuarta inyección a pesar de la aparición gradual de pelaje erizado leve como se describe previamente.

En P0 (día de la primera inyección de ENV y de la solución simulada en controles), no pudieron detectarse diferencias obvias entre los ratones de control y los ratones a los que se había inyectado ENV. De forma interesante, en P30, la concentración de glucosa en sangre (glucemia) de los ratones a los que se había inyectado ENV se encontró aumentada en comparación con los ratones de control, mientras que la de los ratones de control no era diferente de sus valores previos en P0 (figura 14)

Esta variación en la glucemia en los animales tratados con ENV resultó bastante significativa de una evolución hacia hiperglucemia en animales a los que se había inyectado ENV, que es una marca distintiva de diabetes humana y corrobora los hallazgos histopatológicos previos.

Por lo tanto, estos resultados validan adicionalmente nuestras condiciones experimentales como un modelo preclínico relevante para estudiar fármacos terapéuticos dirigidos a ENV en diabetes.

Ejemplo 13: Evidencias de un efecto terapéutico del ligando GNbACI, bajo la forma de un ligando IgG4 quimérico, en la prevención de la aparición de enfermedad relacionada con diabetes en un modelo animal apropiado.

1. Materiales y métodos

a.1. Animales

Este estudio se realizó sobre los dos ratones supervivientes a los que se inyectaron dosis bajas de proteína ENV (0,1 y 1 |jg) usadas en el experimento previo.

2. Procedimientos experimentales

Como la inyección repetida de 5 jg de proteína ENV ha demostrado dar lugar a una rápida muerte del ratón, se usó esta dosis de exposición para la evaluación de los efectos beneficiosos de nuestro ligando. Como se describe en el experimento previo, los ratones recibieron tres inyecciones s.c. de proteína ENV emulsionada en IFA (0,5 ml) en el cuello en P50, P57 y P64. Para cada punto temporal, los ratones recibieron en el mismo día una única inyección i.p. (0,5 ml) de 1001 jg de ligando quimérico de IgG4 GNbACI. El estado clínico y el peso de cada ratón se controló 5 días por semana desde P50 hasta P81.

3. Resultados

La observación de los animales tratados hasta 120 días de seguimiento indica claramente que estos animales tenían supervivencia a largo plazo. Por tanto, la inyección de GNbAC1 los ha protegido y los ha hecho sobrevivir a la dosis mortal de ENV de MSRV inyectada tres veces sucesivas.

Durante este periodo de seguimiento, su estado de salud general permaneció bueno y siguieron ganando peso, en el intervalo fisiológico (no se observó obesidad).

Puede concluirse, en este modelo animal que corrobora lesiones de diabetes y, además, que puede dar lugar a pancreatitis, que el ligando GNbAC1 IgG4 ha sido eficaz contra las dosis mortales de ENV de MSRV y que tiene efectos terapéuticos de interés en enfermedades tales como diabetes o pancreatitis asociada con inflamación y la expresión de ENV de MSRV o antigenemia.

Ejemplo 14: Diseño, construcción y análisis in vitro de un anticuerpo humanizado GNbAC1 con cadenas de isotipo IgG4 que comprenden 6 secuencias de aminoácidos CDR del ligando, con (i) optimizaciones en la primera etapa para la inserción en las cadena variables de IgG4 humanizada, (ii) la selección de la mejor combinación de secuencias CDR para la actividad de unión a la diana óptima (proteína ENV) en el vector de IgG4 y (iii) selección de optimizaciones para la expresión estable de IgG4 en células CHO.

A. Diseño de construcciones moleculares, producción y selección de las construcciones, para obtener un vector de anticuerpo IgG4 humanizado y estabilizado con el ligando.

1. Análisis de regiones Fv de anticuerpo murino anti ENV GNbAC1

Para encontrar las regiones flanqueantes humanas adecuadas para la inmunización del anticuerpo murino GNbAC1, se alinearon secuencias de aminoácidos de las regiones Fv de cadena pesada y ligera de GNbAC1 con la base de datos de genes de la línea germinal de anticuerpo humano de Panorama Research Institute (1230 Bordeaux Drive, Sunnyvale, California 94089, EE. UU.). Los mejores aciertos de los genes V de la línea germinal humana se identificaron como candidatos del gen V humano.

A partir de la búsqueda de la base de datos, se identificó que los genes VH1-46 y VH1-69 humanos tienen las secuencias más cercanas a la cadena pesada de GNbAC1 murino. Por lo tanto, se seleccionó un VH1-69 como regiones flanqueantes humanas para la humanización. Usando la misma base de datos, se identificó la secuencia JH4 humana para usarse para la región flanqueante 4 en la cadena pesada humanizada.

Para la cadena ligera de anticuerpo, VK1-5, VK3-11, VK1-33, VK1-39 mostraron alta homología con la cadena ligera del anticuerpo murino. Por lo tanto, se eligió VK1-39 para la humanización de la cadena ligera. Usando el mismo método, se identificó JK4 para la construcción de la región flanqueante 4 de la cadena ligera del anticuerpo humano. Para definir las regiones CDR adecuadas para su injerto en la cadena VH humana del anticuerpo humanizado, se volvió a evaluar una delimitación adaptada y optimizada de estas regiones CDR en la cadena pesada variable del anticuerpo murino original. Por tanto, se usó una combinación de definición de Kabat y definición de Chothia (Johnson G, Wu TT. Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Res 2001; 29: 205-6, y Chothia C, Gelfand I, Kister A. Structural determinants in the sequences of immunoglobulin variable domain. J Mol Biol 1998; 278: 457-79), como nuestra definición preferida. En resumen, la definición de Chothia favorece la variabilidad conformacional mientras que la definición de Kabat favorece la variabilidad de secuencia. Las regiones CDR de la cadena pesada del anticuerpo murino GNbAC1 se muestran en la figura 15 (SEQ ID NO: 33, 34 y 35), con selección de las regiones preferidas para la inserción funcional en la cadena pesada variable (VH) de IgG4 humana de acuerdo con la definición preferida descrita previamente.

Para definir las regiones CDR adecuadas para su injerto en la cadena VL humana del anticuerpo humanizado, también se volvió a evaluar una delimitación adaptada y optimizada de estas regiones CDR dentro de la cadena ligera variable del anticuerpo murino original. Por tanto, se usó una combinación de la definición de Kabat (Johnson G, Wu TT. Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Res 2001; 29: 205-6) y la definición de contacto (Panorama Research Institute, CA, EE. UU.). Después de la evaluación para la cadena ligera del anticuerpo murino, se usaron definiciones de Kabat como nuestra definición preferida para definir las regiones CDR. Las regiones CDR seleccionadas para la cadena ligera del anticuerpo se muestran en la figura 16 (SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 38).

2. Región variable de cadena pesada humanizada

Basándose en las CDR del anticuerpo murino y el gen VH1-69 de la línea germinal humana, se diseñaron siete secuencias VH para la humanización de la cadena pesada de GNbAC1. Se denominaron H1, H2, H3, H4, H4A, H4B y H4C. Los fragmentos de ADN de estas regiones V se sintetizaron y fusionaron al extremo 5' de un ADNc de la región constante de IgG4 humana para crear 7 cadenas pesadas de IgG4 de longitud completa. Las cadenas pesadas de IgG4 de longitud completa se insertaron en una estructura de plásmido pCMV en dirección 3' de un promotor de CMV (véase, el ejemplo 4). Los clones que contenían los insertos correctos de cadena pesada se identificaron por digestión con enzimas de restricción y sus secuencias de ADN se confirmaron en consecuencia por análisis de secuenciación y corresponden respectivamente a la SEQ ID NO: 39 hasta la SEQ ID NO: 45.

3. Regiones variables de cadena ligera humanizadas

Basándose en las CDR de cadena ligera del anticuerpo murino y el gen VK1-39 de la línea germinal humana, se diseñaron y sintetizaron tres secuencias VL humanizadas. Estas secuencias se denominaron VK1, VK2 y VK3. Los tres fragmentos de ADN de VK se fusionaron a la región constante kappa en una estructura de plásmido pTT5 que contenía la secuencia de la cadena kappa humana. Cada fase de lectura abierta de la cadena ligera está dirigida por un promotor de CMV. Para aumentar la expresión génica, la secuencia de cadena ligera kappa también incluye un intrón en la unión de VL y las regiones constantes de cadena ligera. Los clones plasmídicos con insertos correctos se identificaron por digestiones con enzimas de restricción y sus secuencias se confirmaron por análisis de secuenciación de ADN.

4. Expresión de variantes de anticuerpos humanizados

Para expresar anticuerpos, se purificaron los plásmidos de siete cadenas pesadas y tres cadenas ligeras usando el kit de purificación de ADN plasmídico Maxi (Qiagen). Además, se purificaron los plásmidos para la cadena pesada de GNbAC1 IgG4 quimérica y la cadena ligera kappa de GNbAC1 quimérico (proporcionado por GeNeuro) usando el mismo kit. Se cultivaron células de ovario de hámster chino (CHO) en medio sin suero (Invitrogen) en placas de 6 pocillos y se cotransfectaron con diversas combinaciones de plásmidos de cadena pesada y ligera a una relación de ADN 1:1. Las transfecciones se realizaron usando el reactivo de transfección Invitrogen Freestyle Max. Se realizó un total de 32 transfecciones, que incluían las combinaciones de 8 cadenas pesadas (7 cadenas pesadas humanizadas más 1 cadena pesada quimérica) y 4 cadenas ligeras (3 cadenas ligeras humanizadas más 1 cadena ligera quimérica). En el día 3 después de la transfección, se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular. Las concentraciones de anticuerpos en los sobrenadantes se determinaron por un ensayo ELISA de IgG4 humana en que se usó el anticuerpo quimérico purificado GNbAC1 (suministrado por GeNeuro) para generar una curva patrón.

5. Exploración preliminar de variantes de anticuerpos humanizados

Para evaluar las variantes de anticuerpos humanizados, se usó el anticuerpo quimérico generado a partir de la cotransfección de las cadenas pesadas quiméricas y ligeras quiméricas en células CHO como un control de referencia/positivo para la actividad de unión a la proteína ENV. Como el anticuerpo quimérico GNbAC1 y todas las variantes de anticuerpos humanizados están en el formato IgG4, se puede usar convenientemente un ensayo de unión basado en ELISA con proteína ENV de MSRV inmovilizada para evaluar las actividades de unión relativas del anticuerpo. En este ensayo de unión, se recubren placas ELISA con proteína ENV recombinante purificada (proporcionada por GeNeuro) a 1 |jg/ml. Las placas se bloquearon con BSA al 1 % y se aplicaron anticuerpos anti-ENV con diversas diluciones a los pocillos. Los anticuerpos unidos se detectaron por un anticuerpo secundario anti-Fc de IgG humana conjugado con HRP, seguido por revelado del color con sustrato de HRP (KPL). Usando este ensayo, se demostró que el anticuerpo quimérico IgG4 anti-ENV tiene muy buena actividad de unión a ENV inmovilizada (figura 17).

Usando el mismo ensayo de unión, se evaluaron los sobrenadantes recogidos del cultivo CHO que se transfectaron con diversas combinaciones de secuencias pesadas y ligeras humanizadas. Se establecieron dos criterios para determinar el mejor anticuerpo:

- el anticuerpo humanizado debe tener actividades de unión cercanas al anticuerpo quimérico GNbACI;

- el anticuerpo humanizado debe tener un nivel de expresión razonable, es decir, >100 ng/ml, en los sobrenadantes después de la cotransfección de los plásmidos de cadena pesada y ligera.

Basándose en estos criterios de selección, se seleccionó HA/VK3 como el mejor anticuerpo por su buena actividad de unión (figura 18) y expresión (>1 ug/ml en placa de 6 pocillos). H4/VK3 fue el segundo mejor anticuerpo, ya que su actividad de unión a la proteína ENV es inferior a la de H2/VK3 (figura 19). El tercer anticuerpo, H1/VK3 tiene buena actividad de unión, pero tiene mala expresión del anticuerpo (<10 ng/ml en placa de 6 pocillos) (datos no mostrados). Basándose en esta exploración preliminar, se decidió centrarse en H2/VK3 para evaluación adicional.

6. Evaluación adicional de H2/VK3

Después de la exploración preliminar, se comparó adicionalmente H2/VK3 con el anticuerpo IgG4 quimérico anti-ENV en el ensayo de unión usando concentraciones normalizadas de anticuerpos. La concentración del anticuerpo H2/VK3 en el sobrenadante se midió cuidadosamente con nuestro ELISA de IgG4 usando el anticuerpo quimérico GNbAC1 purificado como patrón. El anticuerpo H2/VK3 en los sobrenadantes y el anticuerpo IgG4 quimérico GNbAC1 purificado se diluyeron a las mismas concentraciones y se compararon en el ensayo ELISA de unión a ENV. El ensayo demostró que el anticuerpo H2/VK3 humanizado tiene actividad de unión a ENV casi idéntica a la IgG4 quimérica antiproteína ENV (figura 20).

A continuación, se aumentó en escala la expresión de H2/VK3 de modo que pudiera purificarse una cantidad suficiente del anticuerpo H2/VK3. Se prepararon los plásmidos pCMV H2 y pTT5 VK3 usando el kit de purificación de plásmidos Maxi (Qiagen). Se cultivaron células CHO en medio CHO sin suero y se transfectaron con dos plásmidos usando el reactivo de transfección Invitrogen Freestyle Max. Cinco días después de la transducción, se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular y se centrifugaron a 3400 r.p.m. durante 15 minutos. Los sobrenadantes después se pasaron a través de una columna de proteína A (GE), se lavaron con PBS y se eluyeron con tampón de elución a pH 3,5. Las fracciones que contenían proteínas se combinaron y se concentraron a un volumen apropiado por columnas de centrifugación Amicon con un corte de peso molecular de 10 kDa. Las concentraciones de anticuerpos se determinaron por ELISA de IgG4 humana y se verificaron por el ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad). El anticuerpo H2/VK3 purificado se comprobó en gel de SDS-PAGE no reductor y se observó una única banda al peso molecular de aproximadamente 150 kDa (figura 21).

Finalmente, el H2/VK3 purificado se comparó con el anticuerpo GNbAC1 quimérico purificado en el ensayo de unión a ENV. Los resultados demostraron que H2/VK3 purificado tiene una actividad de unión casi idéntica al anticuerpo quimérico purificado (figura 22). Basándose en estos resultados, se concluyó que H2/VK3 cumplía nuestros criterios y se seleccionó como anticuerpo GNbAC1 humanizado. Dados los datos de actividad de unión previos (figura 3-6 y 8) se insertan las 6 secuencias CDR necesarias para mantener la actividad del ligando dentro del anticuerpo humanizado en las secuencias de aminoácidos de las cadenas H2 y VK3 del vector de anticuerpo IgG4 humanizado seleccionado (figura 22) y se exponen en la SEQ ID NO: 49 hasta la SEQ ID NO: 54.

Se han optimizado por selección y mutación de las secuencias CDR analizadas en las cadenas VH y VL murinas, que se eligieron en primer lugar por su inserción adecuada dentro de las construcciones de VH humana y VL humana principales (SEQ ID NO: 33-38). Las secuencias de aminoácidos para la cadena pesada H2 y la cadena ligera v K3 humanizadas seleccionadas (para la construcción de IgG4 humanizada seleccionada) y sus restos murinos restantes también se muestran en la figura 23.

Se produjo 1 mg de construcción de anticuerpo humanizado completo H2/VK3 a partir de células CHO por cotransfección de los plásmidos pCMV H2 y pTT5 VK3 en medio de CHO sin suero y este anticuerpo H2/VK3 se purificó por una columna de proteína A.

7. Generación de mAb humanizado anti-ENV con la mutación S241P

Los anticuerpos IgG4 a veces se encuentra que son funcionalmente monovalentes in vivo. Los estudios recientes han dilucidado que esto se debe al intercambio in vivo de semimoléculas de IgG (una cadena H más una L) entre las moléculas de IgG4. Este proceso produce anticuerpos biespecíficos que en la mayoría de situaciones se comportarán como anticuerpos funcionalmente monovalentes (Aalberse y Schuurman 2002, IgG4 breaking the rules, Immunology. 2002, 105:9-19). Esto está causado en gran medida por la inestabilidad de los puentes disulfuro intercatenarios debido al cambio de P a S en la posición del resto 241 (región de bisagra) y probablemente reducirá la especificidad y potencia del anticuerpo. Para evitar este problema, se ha realizado una evaluación de proteína 3D de la posible sustitución de aminoácidos (usando softwares tales como los disponibles en www.NCBI-ENTREZ con, por ejemplo, Protein Cn3D viewer, o tal como M CLC Main Workbench, CLC Bio company, Aarhus, Dinamarca, o los desarrollados en Panorama Research Institute, CA, EE. UU.). Por tanto, se ha concebido que una modificación original de la secuencia primaria de nucleótidos que consiste en el remplazo del resto de serina (S) existente en la posición 241 por un resto de prolina (P), de la secuencia optimizada de nucleótidos que la codifica dentro de la construcción de nucleótidos, era una solución para una inestabilidad final del vector de anticuerpo IgG4 con el ligando. Por tanto, se realizó mutagénesis dirigida al sitio y el producto de PCR se clonó en el plásmido pCMV, denominado H2 S241P. La secuencia de ADN de la cadena pesada H2 mutada se confirmó por análisis de secuenciación.

Esta optimización ahora se combina con la modificación de la secuencia de cadena ligera kappa con la inclusión de un intrón en la unión de VL y las regiones constantes de cadena ligera, ya mencionada anteriormente, para aumentar la expresión génica.

Esta combinación original de secuencias optimizada a partir de los clones seleccionados previamente por mutaciones de nucleótidos o inserciones con influencia sobre la estructura primaria de aminoácidos o sobre la tasa de producción del producto final se muestra en la figura 23, en que las secuencias correspondientes al producto de anticuerpo IgG4 con la composición de aminoácidos y su estructura inherente proporcionan un vector optimizado, estable y altamente expresado para el ligando de la presente invención, conservando sus propiedades de unión funcional para el antígeno de proteína ENV diana. Muestra las secuencias finales de la cadena pesada del anticuerpo humanizado anti-ENV H2 S241P, con su secuencia de nucleótidos codificante (SEQ ID 55) y su secuencia de aminoácidos (SEQ ID 56). También muestra las secuencias finales de la cadena ligera del anticuerpo humanizado anti-ENV VK3 con su secuencia de nucleótidos codificante (SEQ ID 57), en que el intrón está subrayado: (SEQ ID 58). La secuencia de nucleótidos con corte y empalme de la cadena ligera VK3 sin intrones va a continuación (SEQ ID 59). La última mostrada es la secuencia de aminoácidos codificada correspondiente a la cadena ligera finalmente optimizada VK3 (SEQ ID 60).

Finalmente, se produjeron 2 mg de la versión final del anticuerpo humanizado con la mutación S241P de células CHO. Se purificaron los plásmidos pCMV H2 S241P y pTT5 por el kit Maxi de ADN plasmídico Qiagen. Las células CHO se cultivaron en medio CHO sin suero y se transfectaron con los plásmidos pCMV H2 S241P y pTT5 usando el reactivo Max de transfección Freestyle (Invitrogen). Después de 5 días, se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular y se centrifugaron a 3400 rpm durante 15 minutos. Se purificó la proteína de anticuerpo usando columna de proteína A (GE).

A. Secuencia de aminoácidos y de nucleótidos optimizada para la expresión en células CHO de vectores de anticuerpo IgG4 quimérico y humanizado con el ligando.

B1. Secuencias proteicas y de nucleótidos de codones optimizados (para la expresión en células CHO) de la versión quimérica y humanizada del anticuerpo mAb GNb AC1.

B1.1 GNb AC1 quimérico

La secuencia correspondiente a la proteína madura chGNb AC1 IgG4 HC se expone en la SEQ ID 61.

La secuencia correspondiente a la proteína madura chGNb AC1 LC se expone en la SEQ ID 62.

B. 1.2 GNb AC1 humanizado

La secuencia correspondiente a la proteína madura huGNb AC1 IgG4 HC se expone en la SEQ ID 63.

La secuencia correspondiente a la proteína madura huGNb AC1 LC se expone en la SEQ ID 64.

B.2. Secuencias de nucleótidos de la cadena ligera y pesada humanizada de secuencias plasmídicas que incluyen GNbAC1

Las secuencias de nucleótidos de huGNb AC1 LC se exponen en la SEQ ID 65

Las secuencias de nucleótidos de huGNb AC1IgG4HC se exponen en la SEQ ID 67.

C. Análisis in vitro complementario de la actividad de unión del ligando IgG4 humanizado seleccionado (vector de anticuerpo IgG4 humanizado estabilizado y de codones optimizados).

C1. Análisis bioquímicos de unión de anticuerpo.

Protocolo: incubación 2 h a 37 °C de ENV en tampón bicarbonato 50 mM, pH 9,6 - detección con anticuerpos diluidos en PBS BSA al 1 % durante 1 h a temperatura ambiente - detección con anticuerpo secundario anti-ratón y anti-humano marcado con peroxidasa respectivamente (ref 115-035-146 y ref 109-035-088, Jackson, EE. UU.) diluido 1/1000 en PBS BSA al 1 % e incubado durante 1 h a temperatura ambiente. El revelado se hace añadiendo el sustrato OPD y leyendo la densidad óptica con un espectrofotómetro después de 30 min (se realizan etapas de lavado con PBS entre cada etapa).

Tabla 19: cinética de unión de respuesta a dosis del anticuerpo GNb AC1 humanizado con una proteína diana, ENV de MSRV.

Estos resultados muestran claramente que el anticuerpo IgG4 humanizado, en dos experimentos, tiene cinética de respuesta a dosis reproducible con diana de proteína ENV fija y diluciones en serie de anticuerpo (parte superior de la tabla) o concentración de anticuerpo fija y diluciones de proteína diana (parte inferior de la tabla). Son equivalentes a los del mismo isotipo de anticuerpo quimérico, pero mucho mejores que el anticuerpo GNb AC1 original, mientras que no se observa cinética de unión significativa para el anticuerpo de control irrelevante (2G5E12).

C2. Ensayo de reactividad de PBMC

Materiales y métodos: véase el ejemplo 6.

Tabla 20: inhibición de las citoquinas proinflamatorias 11-6 e IFN-y en cultivos de PBMC con proteína ENV de MSRV, por el ligando GNb AC1 insertado tanto en vectores de anticuerpo lgG4 humanizados como quiméricos. NB.

La señal de fondo sin ENV se muestra a continuación (sin ENV) y la inducción del control positivo por LPS bacteriano se muestra en la parte inferior

Estos resultados evidencian una inhibición significativa de:

(i) La inducción de interleuquina 6 (IL-6) por la proteína ENV de MSRV que alcanza el máximo a las 24 h en cultivos de células mononucleares de sangre periférica (con proteína ENV completa, ENV-T, usada a 0,1 microg/ml) se inhibe significativamente en presencia de anticuerpos tanto humanizados como quiméricos.

(ii) La inducción de interferón gamma (IPN-y) por la proteína ENV de MSRV que alcanza el máximo a las 72 h en cultivos de células mononucleares de sangre periférica (con fragmentos superficial de la proteína ENV, ENV-SU, usada a 0,5 microg/ml) se inhibe fuertemente en presencia del anticuerpo humanizado, pero no en presencia del anticuerpo quimérico. Por tanto, evidencia el efecto mejorado del anticuerpo humanizado sobre la activación de células T, en comparación con el anticuerpo quimérico. En el último vector quimérico, las cadenas VH y VL murinas restantes podrían provocar una activación inmunitaria adversa a través del reconocimiento de células T humanas de xenoinjertos (cadenas proteicas murinas injertadas en la región flanqueante). Esto no sucede con el vector seleccionado de IgG4 humanizada del ligando que se une a proteínas ENV. Esta diferencia no se observa con IL-6 a las 24 h, ya que esto no implica reconocimiento específico de antígeno (inmunidad adquirida con linfocitos T), sino solamente activación de la inmunidad innata, bloqueada por el ligando cuando se une a las proteínas ENV inmunopatogénicas diana.

Ejemplo 15: las proteínas de la envoltura HERV-W del cromosoma 7q (Sincitina) y las partículas de MSRV inducen ambas respuestas proinflamatorias en células inmunitarias y astrocitos que se inhiben por el anticuerpo GNb AC1 anti-ENV de MSRV y su construcción de IgG4 quimérica con el ligando.

Ha surgido una relación entre las características inmunopatogénicas en seres humanos y el efecto biológico de estas proteínas ENV. Como las secuencias de ENV de MSRV y sincitina comparten más de un 81 % de identidad de secuencia (Mallet, Bouton et al., 2004; Mameli, Astone et al., 2007), se investigó si estas dos proteínas hermanas podrían presentar efectos proinflamatorios similares. Como los estudios previos sobre células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y astrocitos cerebrales han demostrado reactividad a ENV de MSRV o sincitina respectivamente, aquí se ha realizado un análisis paralelo sobre ambos tipos celulares.

Métodos

Preparación y aislamiento de proteínas

Véase el ejemplo 2

Aislamiento y preparación de células

Se aislaron PBMC humanas de placas leucocitarias de donantes sanos (centro de transfusión - HUG - Ginebra) por centrifugación en gradiente de densidad sobre Ficoll-Paque.

Los astrocitos humanos se solicitaron de InVivogen.

Estimulación celular

Se sembraron PBMC en placas de 24 o de 48 pocillos a una concentración de 1 x 106/pocillo en 1 ml de medio que consiste en RPMI Glutamax 1640 (Invitrogen) suplementado con aminoácidos no esenciales al 1 %, penicilina al 1%/estreptomicina, piruvato sódico al 1 % y FCS inactivado por calor al 10 % (BioWest). Las células se incubaron a 37 °C en CO2 al 5 % en atmósfera humidificada durante 24, 48 o 72 h.

Para los experimentos de cultivo celular, se pre-incubaron sincitina, ENV de MSRV y LPS en 100 pl de medio con los anticuerpos dirigidos contra ENV (IgG de ratón monoclonal GNb AC1, GeNeuro) durante 1 h a 4 °C antes de añadirse a las células.

Ensayos de producción de citoquinas

Se recogieron los sobrenadantes de cultivo a las 24, 48 o 72 h y se almacenaron a -20 °C antes de la evaluación de la producción de citoquinas por ELISA. Se realizó un kit de ELISA OptEIA de BD Bioscience para la detección de citoquinas humanas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Resultados

ENV de MSRV y sincitina son dos proteínas relacionadas con HERV-W

Para comparar las propiedades biológicas asociadas con la proteína de envoltura sincitina de HERV-W (número de acceso NCBI AF072056.2) con las de ENV de MSRV (número de acceso NCBI AF331500.1), se han expresado y producido las dos proteínas en condiciones similares para el presente estudio (condiciones descritas en el ejemplo 2).

Para abordar y comparar los efectos biológicos de las dos proteínas relacionadas con HERV-W, se ha estudiado su efecto en la inducción de citoquinas proinflamatorias. Se descubrió que la estimulación de proteínas relacionadas con ENV de HERV-W, regulaba positivamente de forma potente las respuestas proinflamatorias de interleuquina 6 (IL-6) de astrocitos. De forma más importante, esta estimulación no se vio afectada por un anticuerpo irrelevante (que no se une a ninguna ENV), pero se inhibía fuertemente por el anticuerpo murino GNb AC1 y por la IgG4 quimérica humana GNb AC1, lo que demuestra claramente que nuestro ligando en cualquier forma de vector de anticuerpo está inhibiendo los efectos proinflamatorios de las variantes relacionadas con ENV de HERV-W y no de ENV de MSRV solamente.

En la figura 24, se revela un ejemplo de este efecto biológico análogo por la dosificación de liberación de IL-6 en el sobrenadante de cultivo en presencia de cada proteína relacionada con ENV de HERV-W. Este es un efecto específico, ya que también se inhibía por el ligando GNb AC1, en forma de anticuerpos murinos o quiméricos IgG4. De este modo, también se evidencia una eficacia inhibidora similar del ligando sobre diferentes proteínas relacionadas con ENV de HERV-W.

Además de los astrocitos, que están implicados en lesiones cerebrales locales e inflación, se han demostrado los efectos inmunitarios sistémicos tanto de ENV de MSRV como de sincitina, que estimulan la producción de citoquinas proinflamatorias en cultivos de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMc , es decir, linfocitos y monocitos).

En la figura 25, se valida un ejemplo de este efecto biológico análogo sobre PBMC por la detección de IL12 P40 (característica de respuesta inmunitaria innata) y se confirmó por la misma dosificación de liberación de IL-6 en el sobrenadante de cultivo para ambas proteínas relacionadas con ENV de HERV-W. Además, como para el experimento con astrocitos, esta liberación de IL-6 también se inhibe específicamente por el ligando GNb AC1, en forma de anticuerpos murinos o quiméricos IgG4.

Ejemplo 16: el ligando GNb AC1 y el anticuerpo IgG4 GNb AC1 quimérico humano recombinante y el anticuerpo IgG4 humanizado que comprende el ligando se unen tanto a ENV de MSRV como a proteínas ENV 7q/sincitina de HERV-W con glucosilaciones de células humanas.

1. Materiales y métodos:

a. La proteína recombinante bacteriana ENV se obtuvo como se describe en el ejemplo 2.

b. LA proteína ENV de MSRV glucosilada humana se produjo para Geneuro, por P'X therapeutics, Grenoble, Francia, de acuerdo con el siguiente procedimiento: se produjo proteína análoga ENV de HERV-W, llamada sincitina, con el mismo protocolo.

Proceso de producción de proteína purificada glucosilada ENV de expresión de células humanas.

Transfección:

Se sembraron células HEK-Freestyle a 106 células/ml y se transfectaron con Env-MSRV_pMCMVHE/1 usando el reactivo de transfección 293Fectin.

Recolección y lisis:

Tres días después de la transfección, las células se recogieron y se centrifugaron. El sedimento celular se resuspendió en tampón de lisis (PBS suplementado con anti-proteasas) y se realizó alteración celular por sonicación.

Solubilización:

Después de la centrifugación, el sedimento se resuspendió en tampón de solubilización (Tris 50 mM, pH 8, NaCl 100 mM, urea 2 M, FOS-colina10 al 2%) y se solubilizó durante una noche a 4 °C en agitación.

Dilución antes de la purificación:

El siguiente día, la proteína solubilizada se diluyó cuatro veces en tampón de dilución (Tris 50 mM, pH 8, NaCl 100 mM) y se homogeneizó antes de la purificación.

Método de purificación de la combinación 1 de EnvMSRV marca His: cromatografía de afinidad en Ni sepharose Se realiza cromatografía de afinidad en Ni sepharose (GE Heathcare, 4 ml) para purificar Env-MSRV marcada con His.

Tampón de equilibrado: Tris 50 mM, pH 8, NaCl 100 mM, FOS-colina10 al 0,5 %, urea 0,5 M.

Tampón de elución: Tris 50 mM, pH 8, NaCl 100 mM, FOS-colina10 al 0,5 %, urea 0,5 M, imidazol 1 M.

Etapa de elución: gradiente en 30 CV desde un 0 % a un 100 % de tampón de elución.

Concentración de la combinación: 7 veces usando corte Amicon de 30 kDa.

Método de purificación de la combinación 2 de EnvMSRV marca His: cromatografía de afinidad en Ni sepharose Esta segunda cromatografía de afinidad se realizó usando el flujo directo de la primera como material de partida = carga, diluida a Tris 50 mM, pH 8, NaCl 100 mM, FOS-colina10 al 0,2 %, urea 0,5 M

Tampón de equilibrado: Tris 50 mM, pH 8, NaCl 100 mM, FOS-colina10 al 0,2 %, urea 0,5 M.

Tampón de elución: Tris 50 mM, pH 8, NaCl 100 mM, FOS-colina10 al 0,2 %, urea 0,5 M, imidazol 1 M.

Control de calidad:

El análisis de control de calidad por SDS-PAGE se siguió por tinción con azul de Coomassie y análisis de transferencia de Western usando el anticuerpo murino GNb AC1. La secuencia N-terminal confirmó la identidad de la proteína purificada.

Diálisis de lotes y congelación

Se dializaron dos lotes de Env-MSRV frente a Tris 50 mM, pH 8, NaCl 100 mM, FOS-colina10 al 0,5 % o 0,2 % antes de la adición de un 10 % de glicerol y congelación en nitrógeno líquido.

c. Detección de unión específica con ensayo ELISA

Todas las preparaciones de ENV se diluyeron en tampón CaCO2 50 mM pH 9,6; se incubaron en pocillos de microplacas de ELISA durante 2 h a 37 °C, para el recubrimiento de la proteína en las microplacas de ELISA. No obstante, debido a la inferior relación de producción, la concentración de sincitina recubierta fue inferior a la de ENV de MSRV.

Los anticuerpos de detección se diluyeron en PBS BSA al 1 % y se incubaron 1 h a temperatura ambiente en pocillos triplicados de microplaca. El anticuerpo secundario anti-ratón marcado con peroxidasa para el monoclonal murino (ref 115-035-14) y el anticuerpo secundario anti-humano para recombinantes humanizados y quiméricos humanos (ref 115-035-088) se diluyó 1/1000 en tampón PBS BSA al 1 % y se incubó 1 h a temperatura ambiente. El revelado con OPD para peroxidasa se realizó durante 30 min seguido por lectura de densidad óptica a 490 nm. Se realizaron lavados entre cada etapa de incubación con 4, 4 y 6 ciclos de lavado, respectivamente.

2. Resultados:

Como puede observarse a partir de la figura 26 a continuación, ambas preparaciones de proteína purificada glucosilada bacteriana y humana de ENV de MSRV se detectaron fácilmente por todos los tipos de anticuerpo con el ligando (murino, quimérico y humanizado), produciendo una buena señal en medidas de densidad óptica por luminometría. De forma interesante, en las presentes condiciones de ELISA, solamente el anticuerpo humanizado ligando GNb AC1 produjo un buen reconocimiento de sincitina glucosilada humana, mientras que a esta misma concentración de recubrimiento, los anticuerpos murino y quimérico produjeron bajas señales con sincitina.

Estos resultados muestran claramente que el ligando de la presente invención, ya sea su vector molecular usado para la unión al epítopo diana (anticuerpo murino, IgG4 quimérico o IgG4 humanizado), se encuentra que se une de forma eficaz a todas las formas de las proteínas diana que comprenden el epítopo, es decir, ambas proteínas ENV glucosiladas bacterianas y humanas y, particularmente con el anticuerpo humanizado, ambas proteínas relacionadas con HERV-W, ENV de ^mS^rV y la proteína 7q ENV de HERV-W, también llamada sincitina.

Por tanto, el ligando terapéutico se une a las formas glucosiladas humanas de la proteína ENV diana.

Ejemplo 17: análisis in vivo del anticuerpo quimérico GNb AC1 con el isotipo IgG4 con efecto terapéutico en un modelo animal de anomalías de comportamiento esquizofrénico inducidas por ENV de MSRV.

I. Introducción

En el ejemplo 8, se ha demostrado la presencia de la proteína ENV de MSRV en el suero de pacientes con esquizofrenia. Este resultado subraya la necesidad de explorar la relación entre la presencia de la proteína ENV y la aparición de alteraciones cerebrales y deficiencias del comportamiento en modelos animales adecuados. Las teorías de neurodesarrollo de la esquizofrenia postulan que la enfermedad es el resultado de comportamiento de una lesión primaria mucho antes de que la enfermedad se manifieste clínicamente (Weinberger y Lipska, 1995; Lewis y Levitt, 2002). Por tanto, esta característica fisiopatológica tiene que tenerse en cuenta en el diseño de los modelos animales apropiados que imiten los trastornos relacionados con esquizofrenia.

II. Experimento 1: Efecto del anticuerpo quimérico IgG4 sobre las alteraciones de comportamiento y anatómicas después de inyección intracerebroventricular unilateral repetida de la proteína ENV en ratas que habían recibido una sensibilización inmunitaria inducida por ENV en la edad adulta prematura.

A. Materiales y métodos

1. Animales

Se adquirieron ratas Sprague-Dawley macho (de 6 a 8 semanas de edad) (n=8) de Charles River, Francia. Los animales se mantuvieron 3 por jaula en un ciclo convencional de luz-oscuridad con acceso ad libitum a comida y agua y no se distribuyeron durante un periodo de 8 días de aclimatación. Todos los procedimientos cumplen la Directiva del Consejo de Comunidades Europeas del 24 de noviembre de 1986 (86/609/EEC) y la Directiva del Consejo Nacional del 19 de octubre de 1987 (87848, "Ministére de l'Agriculture et de la Forét", Francia). Se hicieron todos los esfuerzos por minimizar la cantidad de animales usados y su sufrimiento.

2. Sensibilización inmunitaria inducida por ENV

El primer día, llamado "punto 0" (P0), las ratas se asignaron aleatoriamente a un grupo de inyección simulada (n=2) con inyección de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Lonza, Francia) y un grupo al que se inyecta ENV (n=6) con inyección de 250 ng de proteína ENV recombinante (His-ENVT-081206-1, PX'Therapeutics, Francia) disuelta en PBS.

Cada rata se anestesió por administración i.p. de una solución mezclada de xilazina 10 mg/kg (Rompun®, Alcyon, Francia) y quetamina 80 mg/kg (Imalgene®, Alcyon, Francia). Se recortó el pelo de un área que se extiende entre las orejas hasta justo antes de los ojos. Se insertan tapones para los oídos y el animal se fija en un instrumento estereotáxico con la barra de incisión superior 5 mm por encima de la línea intraaural. El área del cuero cabelludo recortado se limpió con una solución antiséptica basada en clorhexidina (Alcyon, Francia) y se hizo una incisión entre las orejas hasta un punto entre los ojos. La piel se retrajo con fórceps y se retiró el tejido subyacente, incluyendo el periostio, para exponer un área de cráneo seco y limpio (aproximadamente 15 x 18 mm).

Se dirigió la cánula de plástico (d.e. = 0.457 mm y d.i. = 0.267 mm) (Plastic One, EE. UU.) para implantarse en el ventrículo lateral derecho. La cánula se montó en el aparato estereotáxico, la punta "se centró" en el bregma. Se perforó un orificio a través del cráneo sobre el ventrículo lateral (anteroposterior 0,92 mm; medio-lateral, ± 1,7 mm respecto al bregma). La punta de la cánula se colocó sobre el orificio central de modo que la punta estuviera a nivel con la superficie del cráneo. La cánula se bajó 3,5 mm a través de la corteza cerebral en el ventrículo lateral.

Para cada rata, se consiguió la inyección de PBS en solitario o con proteína ENV a través de un inyector de acero inoxidable, colocado en y proyectándose 0,5 mm por debajo de la punta de la cánula. El inyector se conectó por tubos de polietileno a una jeringa Hamilton (VWR, Francia) para distribuir de forma manual soluciones sobre un periodo de 3 minutos. El inyector se extrajo 3 minutos después de completarse la eyección para prevenir el flujo de PBS o de proteína ENV junto con la extracción del inyector.

La herida se cerró usando sutura quirúrgica con un portaagujas. Se permitió que los animales se recuperaran en una jaula individual durante un periodo de 2 días. Después, los animales se alojaron aleatoriamente tres por jaula y se mantuvieron sin distribuir hasta los experimentos posteriores.

3. Inyección intracerebroventricular unilateral repetida de proteína ENV después de un periodo de espera Ocho meses después, se implantaron cánulas craneales que permiten inyecciones intracerebroventriculares (icv) repetidas en todas las ratas.

El día de la cirugía (P0) se anestesió cada rata por administración i.p. de una solución mezclada de xilazina 10 mg/kg (Rompun®, Alcyon, Francia) y quetamina 80 mg/kg (Imalgene®, Alcyon, Francia). Se recortó el pelo de un área que se extiende entre las orejas hasta justo antes de los ojos. Se insertaron tapones para los oídos y el animal se fija en un instrumento estereotáxico con la barra de incisión superior 5 mm por encima de la línea intraaural. El área del cuero cabelludo recortado se limpió con una solución antiséptica basada en clorhexidina (Alcyon, Francia) y se hizo una incisión entre las orejas hasta un punto entre los ojos. La piel se retrajo con fórceps y se retiró el tejido subyacente, incluyendo el periostio, para exponer un área de cráneo seco y limpio (aproximadamente 15 x 18 mm). Se perforaron tres orificios, dos aproximadamente 7 mm anteriores al bregma sobre el lado derecho e izquierdo del cráneo y el tercero 7 mm posterior al bregma. Se roscaron tornillos de nailon (diámetro = 0,50 mm) (Plastic One, EE. UU.) para ajustarlos firmemente a los orificios y que sirvan como anclajes para el cemento dental. Se tuvo cuidado de conservar la dura en estos procedimientos. Se dirigió la cánula de plástico (d.e. = 0,457 mm y d.i. = 0,267 mm) (Plastic One, EE. UU.) para implantarla en el ventrículo lateral derecho. La cánula se montó en el aparato estereotáxico, la punta "se centró" en el bregma y un punto marcado 0,92 mm posterior y 1,7 mm lateral a la marca cero. Se hizo un orificio con un taladro en este sitio marcado. La punta de la cánula se posicionó sobre el orificio central de modo que la punta estuviera a nivel con la superficie del cráneo. La cánula se bajó 3,5 mm a través de la corteza cerebral en el ventrículo lateral derecho. Con la cánula mantenida en la pinza del instrumento estereotáxico, se creó una pequeña cantidad de masilla dental (Paladur®, Heraeus Kulzer, Francia) alrededor de la cánula y de los tornillos de anclaje. La herida se cerró usando sutura quirúrgica y un portaagujas. La aguja de montaje se extrajo cuando se sedimentó el material dental y se dejó que el animal se retirara del aparato estereotáxico.

Las inyecciones de PBS o de proteína ENV se consiguieron en el mismo día (P0) y 25 días (P25) después del implante de las cánulas craneales.

Para cada punto temporal, se administró PBS en solitario o 250 ng de proteína ENV recombinante (His-ENVT-081206-1, PX'Therapeutics, Francia) a través de un inyector de acero inoxidable, colocado en y proyectándose 0,5 mm por debajo de la punta de la cánula. El inyector se conectó por tubos de polietileno a una jeringa Hamilton (VWR, Francia) para distribuir de forma manual soluciones (3 pl) sobre un periodo de 3 minutos. El inyector se extrajo 3 minutos después de completarse la eyección para prevenir el flujo de PBS o de proteína ENV junto con la extracción del inyector.

4. Administración sistémica del anticuerpo quimérico IgG4

El día después del segundo recuerdo de proteína ENV (P26), las ratas a las que se ha inyectado ENV se seleccionaron aleatoriamente para recibir una única inyección intraperitoneal (i.p.) de PBS (n=3) o de 100 pg del anticuerpo quimérico IgG4 diluido en PBS (n=3).

5. Imágenes de resonancia magnética (MRI) in vivo

Se examinó la morfología cerebral de las ratas en P13 y P37 por MRI in vivo. En primer lugar, se anestesiaron las ratas con un sistema aprobado (TEM Sega, Francia) usando inhalación de isoflurano al 3 % con un flujo de 0,6 l/min de aire con un 30 % de oxígeno. Después de la inducción, se mantuvo la anestesia con gas isoflurano al 1,5 hasta el 2 % y 0,6 l/min de flujo. Se controló la temperatura corporal y se mantuvo a 37±1 °C usando una almohadilla térmica de agua en circulación. Se controló la tasa de respiración durante todo el experimento. Las ratas se colocaron en una posición en decúbito prono en un lecho de plástico (Bruker Biospec Anima1Handling Systems, Alemania) equipado con fijación estereotáxica (barra dental y pinzas para las orejas). Después se colocó un catéter intravenoso de calibre 22 en la vena de la cola de las ratas para posteriores inyecciones.

Se realizó la exploración en un sistema Bruker 7T Biospec (Bruker, Alemania) equipado con una configuración de gradiente 400 mT/m, usando un serpentín corporal transmisor (d.e. = 112 mm y d.i. = 72 mm) y se usa un serpentín superficial de 25 mm de diámetro para la recepción de señales. Primero se usa un ecolocalizador de gradiente rápido con tres orientaciones ortogonales y un campo de visión de 5 cm para identificar las regiones cerebrales y permite el cálculo de las coordenadas espaciales fijas para las siguientes exploraciones. Se realizan dos adquisiciones rápidas con secuencias de potenciación de la relajación (RARE) en el plano axial. Las primeras imágenes ponderadas T2 se adquieren con secuenciación de impulso de eco de espín usando un tiempo de repetición (TR) de 4200 ms, un único eco con tiempo de eco (TE) de 36 ms, un ancho de banda del receptor de 35714 Hz y un tiempo de exploración de 4 min. Las segundas imágenes ponderadas T2 se adquieren con una secuenciación de impulso eco de espín usando un TR de 3000 ms, dos ecos con TE de 17 ms y 51 ms, un ancho de banda del receptor de 55555 Hz y un tiempo de exploración de 5 min. Para ambas secuencias, se adquirió un total de 30 cortes (800 pm de grosor) con un campo de visión de 2,56 cm y un tamaño de matriz de adquisición de 256 x 256 que produce una resolución en el plano de 100 x 100 pm.

Para evaluar la dinámica de las barreras cerebromeníngea y cerebroventricular en ratas a las que se ha inyectado proteína ENV, se usó el método de MRI potenciado con gadolinio. Se adquirieron imágenes ponderadas T1 previas a contraste coronal con secuencias de disparo rápido de ángulo bajo (FLASH) y un tiempo de repetición/tiempo de eco = 2,2/1,4 ms. Se adquirió un total de 30 cortes (800 pm de grosor) con un campo de visión de 2,56 cm y un tamaño de matriz de adquisición de 256 x 192 que produce una resolución en el plano de 100 x 133 pm. Después de ello, los animales recibieron una inyección en bolo de gadolinio 0,5 M (Dotarem®, Guerbet, Francia) (1 ml/kg de peso corporal). Se realizó exploración T1 posterior a contaste 10 min después de la administración de gadolinio en las mismas condiciones que las descritas anteriormente.

6. Análisis del comportamiento

En P15 y P40, las ratas se ensayaron para la actividad locomotora usando un aparato digiscan automatizado vinculado a un ordenador PC (Imetronic, Pessac, Francia). La actividad locomotora se controló en una jaula de ensayo de fotoceldas equipada con una matriz de cuatro haces infrarrojos horizontales paralelos (dos en la parte frontal y dos en la parte posterior) colocados 0,7 cm por encima del suelo para medir la actividad horizontal. Se registró la cantidad de interrupciones del haz de forma automática. La actividad horizontal se expresó en términos de cruces de la jaula (es decir, interrupciones consecutivas en cualquier lado de la jaula). El número de cruces de la jaula se registró de forma continua y se acumuló sobre intervalos de 10 minutos.

Para todas las ratas, se evaluó la actividad locomotora en condiciones de tensión leve (es decir, después de la exposición a un entorno nuevo o después de inyección i.p. de solución salina) y en una exposición a anfetamina. Todos estos ensayos se realizaron durante la fase inactiva (periodo de luz). Para el ensayo de novedad, las ratas se retiraron de su jaula habitual y se colocaron en una jaula de fotoceldas individual y se midió la actividad locomotora durante 1 hora. Después, las ratas recibieron una inyección de solución salina (1 ml/kg, i.p.) y se controló su actividad locomotora durante 1 hora adicional. Finalmente, a los animales se les inyectó D-anfetamina (sulfato 1,5 mg/kg, i.p., Sigma Aldrich, A-5880, lote 90K3354) y se registró su actividad durante dos horas adicionales.

B. Resultados

1. Imágenes de resonancia magnética in vivo

a) Después de la primera inyección de recuerdo de proteína ENV

En P12, el análisis cualitativo de las imágenes ponderadas T2 de la mayoría de los animales reveló hiperseñales grandes correspondientes a los ventrículos laterales. En comparación con las imágenes MRI clásicas de cerebros de rata sin tratar, la ampliación de estas hiperseñales observada en el presente estudio sugiere una inflamación de los ventrículos laterales en los animales correspondientes. Además, se observó una expansión más fuerte del ventrículo lateral derecho (es decir, el de la inyección) en animales tanto de inyección simulada como de ENV. El grado de las hiperseñales correspondientes a los ventrículos laterales observadas en animales a los que se inyectó la proteína ENV fue diferente al de los animales a los que se inyecto PBS, lo que sugiere que la proteína ENV activa los procesos neuroinflamatorios.

Las comparaciones de las imágenes ponderadas T1 adquiridas antes y después de la inyección con gadolinio revelaron diferencias en los animales a los que se había inyectado PBS o proteína ENV. Estos resultados sugieren que las barreras cerebromeníngea y cerebroventricular pueden alterarse 12 días después de la inyección intracerebroventricular (icv) de la proteína ENV.

b) Después de la segunda inyección de recuerdo de proteína ENV

Como se describe después de la inyección de recuerdo de proteína ENV, el análisis cualitativo de imágenes ponderadas T2 obtenidas después de la segunda inyección de recuerdo (P37) reveló hiperseñales grandes correspondientes a los ventrículos laterales en la mayoría de los animales. En ratas de simulación, no se detectó ninguna hiperseñal significativa (teniendo en cuenta el aumento de la señal más allá de la señal de fondo normal del líquido cefalorraquídeo que se visualiza normalmente por MRI dentro de los ventrículos cerebrales), que correspondía a los ventrículos laterales entre los dos puntos temporales. De forma destacada, las ratas a las que se había inyectado ENV presentaban una fuerte ampliación de estas hiperseñales después de la segunda inyección. Incluso más significativamente, las hiperseñales podían ampliarse hasta estructuras adyacentes, particularmente el hipocampo. Las imágenes MR obtenidas en ratas a las que se ha inyectado ENV tratadas con el anticuerpo quimérico IgG4 revelaron una fuerte ampliación de las hiperseñales correspondientes a los ventrículos laterales. De forma interesante, la extensión de estas hiperseñales ponderadas T2 en las estructuras adyacentes como el hipocampo estaba limitada en ratas a las que se ha inyectado ENV tratadas con el anticuerpo quimérico IgG4. Como el anticuerpo se inyectó en la periferia del sistema nervioso central - SNC - (por vía intraperitoneal) este último punto pone de relieve los hechos de que:

1- los efectos proinflamatorios inmediatos en ventrículos cerebrales que se refieren exclusivamente al protocolo particular usado para el presente modelo animal, que implica una inyección icv directa de la proteína ENV de MSRV, no se inhiben inmediatamente por el anticuerpo quimérico IgG4 ligando inyectado más de 24 horas después de la inyección icv de ENV y, por tanto, después del inicio de la inflamación local del ventrículo. Debe precisarse que la inflamación local del ventrículo no es una característica principal de la patogénesis en psicosis y muy probablemente no implica problemas del neurocomportamiento en el presente modelo. Esta inflamación local inmediata posterior a ivc, por tanto, puede considerarse como un efecto secundario del presente modelo.

2- las características relevantes que se sabe que están asociadas con la expresión de psicosis, tales como implicación patogénica del hipocampo, aquí se inhiben en ratas a las que se ha inyectado ligando terapéutico de la presente invención, en forma del anticuerpo IgG4 quimérico humano inyectado después de la inyección icv de ENV, a una distancia del SNC y en la periferia del s Nc . Esto se evidencia aquí por la inhibición de la extensión de las hiperseñales, observadas por MRI, desde los ventrículos hasta la región cerebral crítica del hipocampo. Las comparaciones de las imágenes ponderadas T1 adquiridas antes y después de la inyección de gadolinio no revelaron ninguna diferencia aparente en todos los grupos. Estos resultados sugieren que las barreras cerebromeníngea y cerebroventricular no parecen alterarse adicionalmente después de la segunda inyección de recuerdo de la proteína ENV.

En este primer conjunto de experimentos, se mostró por primera vez que dos inyecciones de recuerdo icv de la proteína ENV pueden dar lugar a procesos neuroinflamatorios en áreas ventriculares y del hipocampo en ratas que habían recibido sensibilización inmunitaria inducida por ENV en la edad adulta prematura. De forma destacada, las alteraciones anatómicas y funcionales del hipocampo son coherentes con los estudios MRI presentados en pacientes esquizofrénicos con disminución cognitiva a largo plazo asociada con pérdida neuronal y agrandamiento ventricular (Bornstein et al., 1992). De forma interesante, el daño en el hipocampo inducido por inyecciones de recuerdo repetidas de proteína ENV se inhibió por la administración del anticuerpo IgG4 quimérico humano, después de la inducción de patogénesis inducida por e Nv , que es coherente con un efecto terapéutico del ligando cuando se administra en la formulación de este anticuerpo quimérico en un modelo preclínico de esquizofrenia.

III. Experimento 2: Evaluación de las alteraciones del neurocomportamiento después de una única inyección bilateral de proteína ENV en el hipocampo o los ventrículos laterales de ratas

A. Materiales y métodos

1. Animales

Se adquirieron ratas Sprague-Dawley macho (de 6 a 8 semanas de edad) (n = 6) de Charles River, Francia. Los animales se mantuvieron 3 por jaula en un ciclo convencional de luz-oscuridad con acceso ad libitum a comida y agua y no se distribuyeron durante un periodo de 8 días de aclimatación. Todos los procedimientos cumplen la Directiva del Consejo de Comunidades Europeas del 24 de noviembre de 1986 (86/609/EEC) y la Directiva del Consejo Nacional del 19 de octubre de 1987 (87848, "Ministére de I'Agriculture et de la Forét", Francia). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar la cantidad de animales usados y su sufrimiento.

2. Inyección bilateral de proteína ENV en el hipocampo y en los ventrículos laterales

El día de la cirugía (P0), las ratas se asignaron aleatoriamente a un grupo de simulación (n = 2) con inyección de PBS (Lonza, Francia) y dos grupos de ensayo con inyección icv (ratas ENV-icv, n = 2) o intrahipocampo (ratas ENV-hip, n = 2) de 250 ng de proteína ENV recombinante (ENVT, lote 081206-1, PX'Therapeutics, Grenoble, Francia) disuelta en PBS.

Cada rata se anestesió por administración i.p. de una solución mezclada de xilacina 10 mg/kg (Rompun®, Alcyon, Francia) y quetamina 80 mg/kg (Imalgéne®, Alcyon, Francia).

Se recortó el pelo de un área que se extiende entre las orejas hasta justo anterior a los ojos. Se insertan tapones para los oídos y el animal se fija en un instrumento estereotáxico con la barra de incisión superior 5 mm por encima de la línea intraaural. El área de cuero cabelludo recortado se limpió con una solución antiséptica basada en clorhexidina (Alcyon, Francia) y se hizo una incisión entre las orejas hasta un punto entre los ojos. Se retrajo la piel con fórceps y se retiró el tejido subyacente, incluyendo el periostio, para exponer un área de cráneo seco y limpio (aproximadamente 15 x 18 mm).

Se dirigió la cánula de plástico (d.e. = 0,457 mm y d.i. = 0,267 mm) (Plastic One, EE. UU.), para implantarse de forma bilateral en el ventrículo lateral o en el hipocampo. La cánula se montó en el aparato estereotáxico, la punta se "centró" en el bregma. Se perforaron orificios de forma bilateral a través del cráneo sobre el ventrículo lateral (anteroposterior, 0,92 mm; medio lateral, ± 1,7 mm respecto al bregma) o el hipocampo (anteroposterior, 4,8 mm; medio lateral, ± 5,0 mm respecto al bregma). La punta de la cánula se colocó sobre los orificios centrales de modo que la punta estuviera a nivel con la superficie del cráneo. La cánula se bajó 3,5 mm a través de la corteza cerebral en el ventrículo lateral o 7,5 mm en el hipocampo.

Para cada rata, la inyección de PBS en solitario o proteína ENV se consiguió a través de un inyector de acero inoxidable, se colocó en y proyectándose 0,5 mm por debajo de la punta de la cánula. El inyector se conectó por tubos de polietileno a una jeringa Hamilton (VWR, Francia) para distribuir de forma manual soluciones sobre un periodo de 3 minutos. El inyector se extrajo 3 min después de completarse la eyección para evitar el flujo de PBS o proteína ENV junto con la extracción del inyector.

La herida se cerró usando sutura quirúrgica en un portaagujas. Se permitió que los animales se recuperaran en una jaula individual durante un periodo de 2 días. Después, los animales se alojaron aleatoriamente tres por jaula y se mantuvieron sin distribuir hasta los experimentos posteriores.

3. Análisis del comportamiento

Se ensayó la respuesta locomotora de las ratas en condiciones de tensión leve en un campo abierto usando tres paradigmas: novedad, inyección de solución salina y tensión por confinamiento. Se ensayó la respuesta locomotora a novedad en P5, P6, P7, P11 y P12, mientras que la actividad locomotora después de inyección de solución salina y tensión por confinamiento se ensayó una vez en P11 y P13, respectivamente.

El aparato de campo abierto consistía en una caja cuadrática (80 cm x 75 cm x 40 cm) hecha de madera, que estaba débilmente iluminada. El suelo del campo abierto se dividió en nueve zonas cuadradas de tamaño idéntico. Para el ensayo de novedad, las ratas se colocaron individualmente en el centro del campo abierto y se dejó que exploraran el campo durante 5 minutos. Después se permitió que las ratas volvieran a su propia jaula. Se limpió la arena con una solución salina entre los animales. Para el ensayo de inyección de solución salina en P11, las ratas recibieron una inyección de solución salina (1 ml/kg, i.p.) y se colocaron inmediatamente en el centro del campo abierto y se dejó que exploraran el campo durante 5 minutos. Para el ensayo de tensión por confinamiento, los animales se confinaron a través de inmovilización durante 15 minutos en un tubo de plexiglás (5,5 cm x 21 cm) e inmediatamente se colocaron en el centro del campo abierto y se dejó que exploraran el campo durante 5 minutos.

Para todos los ensayos, se observó el comportamiento de cada animal por el experimentador. Se cuantificó una actividad motora horizontal global como el número de líneas cruzadas sobre el periodo de 5 min. Además, se valoró el número de erguimientos (levantarse sobre las patas traseras con las patas delanteras en el aire o contra la pared) del siguiente modo: 0 = ausente, 1 = pocas, 2 = moderadas, 3 = altas, 4 = muy altas.

B. Resultados

1. Respuesta locomotora a novedad

Para todos los puntos temporales, después de la exposición a la novedad, todas las ratas presentaban un alto grado de actividad locomotora horizontal y vertical en el campo abierto durante el periodo de 5 min.

Los resultados globales del ensayo de novedad sobre los diferentes puntos temporales experimentales se presentan en la figura 27. En todos los animales a los que se ha inyectado ENV, el aumento en la actividad locomotora horizontal no se presentaba pronto después de la inyección (P5), sino que surgía gradualmente con el tiempo, particularmente en ratas a las que se había inyectado en el hipocampo (ratas ENV-hip) (figura 27A). De forma interesante, solamente la rata ENV-hip presentaba actividad horizontal exacerbada persistente en P12. Además, se detectó actividad locomotora vertical aumentada tan pronto como el P5 y P6 en ratas ENV-hip, mientras que no se presentaron diferencias con el animal de simulación en las ratas ENV-icv en los mismos puntos temporales.

2. Actividad locomotora después de la inyección de solución salina

Después de la exposición a inyección de solución salina, todas las ratas presentaban un alto grado de actividad locomotora horizontal y vertical en el campo abierto durante el periodo de 5 min.

Solamente las ratas ENV-hip presentaban un aumento claro en la actividad locomotora horizontal en comparación con el animal de simulación (figura 28A), mientras que la actividad locomotora vertical de todos los grupos era similar (figura 28B).

3. Actividad locomotora después de tensión por confinamiento

Después de la exposición a tensión por confinamiento, todas las ratas presentaban un alto grado de actividad locomotora horizontal y vertical en el campo abierto durante el periodo de 5 min. Para la actividad tanto horizontal como vertical, las ratas ENV-hip presentaban mayor actividad locomotora en comparación con los animales de simulación, mientras que no pudieron detectarse diferencias claras entre las ratas de simulación y ENV-icv (figura 29).

En esta segunda serie de experimentos, se demostró que una única inyección bilateral de proteína ENV en los ventrículos laterales o en el hipocampo podría dar lugar a una exacerbación de la sensibilidad a condiciones de tensión leve. Además, las alteraciones en el comportamiento demostraron ser significativamente más graves y persistentes en ratas ENV-hip. Además, solamente se observó una respuesta locomotora aberrante a la exposición a tensión por confinamiento en ratas ENV-hip. Las ratas con inyección bilateral en el hipocampo de proteína ENV proporcionan un modelo relevante, mejor que el modelo con inyección icv, para estudiar tratamientos para esquizofrenia en un modelo preclínico.

Por lo tanto, se evaluó adicionalmente el efecto terapéutico del ligando IgG4 quimérico humano en este modelo optimizado.

IV. Evaluación del efecto terapéutico del ligando IgG4 quimérico sobre los síntomas psicóticos del neurocomportamiento después de una única inyección bilateral de proteína ENV en el hipocampo de ratas.

A. Materiales y métodos

1. Animales

Iguales que en la parte III del presente ejemplo.

2. Inyección bilateral de proteína ENV en el hipocampo o en los ventrículos laterales

Igual que en la parte III del presente ejemplo, con inyección adicional de anticuerpo en ciertos animales como se describe a continuación.

Para cada rata, la inyección de cada solución (PBS, ENV y IgG4) se consiguió a través de un inyector de acero inoxidable, colocado en y proyectándose 0,5 mm por debajo de la punta de la cánula. El inyector se conectó por tubos de polietileno a una jeringa Hamilton (VWR, Francia) para distribuir manualmente soluciones sobre un periodo de 3 min. El inyector se extrajo 3 min después de completarse la eyección para evitar el flujo de PBS o proteína ENV junto con la extracción del inyector. Para las ratas ENV tratadas con IgG4, se infundieron 2 |jg del anticuerpo 10 minutos después de la inyección de proteína ENV en ambos hemisferios en las mismas coordenadas. La herida se cerró usando sutura quirúrgica en un portaagujas. Se permitió que los animales se recuperaran en una jaula individual durante un periodo de 2 días. Después, los animales se alojaron aleatoriamente 3 por jaula y se mantuvieron sin distribuir hasta los experimentos posteriores.

3. Resultados

Estos resultados proporcionan por primera vez una reproducción del experimento previo con inyección estereotáxica en el hipocampo de proteína ENV con una exacerbación de la sensibilidad a condiciones de tensión leve, como en el ejemplo ilustrado a continuación para P12 en la figura 31A.

Asombrosamente, y no observado en el experimento previo que detuvo el seguimiento de los animales después de 12 días (P12), las alteraciones del comportamiento de ratas ENV+ (no tratadas) demostraron tener una evolución significativa desde hiperreactividad hasta tensión leve aún observada en P12 hasta hiporreactividad (congelación) observada en este grupo en P32 (representada por la barra central en los histogramas de la figura 30A). A partir de los resultados adicionales sobre el efecto terapéutico del ligando IgG4 en el día 32, esta observación es bastante interesante porque reproduce las características clave de la evolución clínica natural del subtipo de esquizofrenia humana identificado que se correlaciona con la presencia de antigenemia de ENV elevada y ^cR^pen sangre (como se evidencia en el ejemplo 8): la aparición de una "fase sintomática negativa" (hiporreactividad a tensión para el presente modelo animal) asociada con disminución cognitiva y pérdida neuronal, después de la fase prematura caracterizada por síntomas positivos (hiperreactividad a tensión para el presente modelo animal).

De hecho, este es típicamente un efecto posterior asociado con pérdida neuronal que también puede evidenciarse por agrandamiento ventricular cerebral, como en las observaciones de MRI realizadas durante el presente estudio de cerebros de rata tomadas 9 meses después de la inyección icv de ENV primaria. De forma interesante de nuevo, y aunque esto no se había cuantificado objetivamente por ensayos apropiados del comportamiento como en el presente experimento, estas ratas habían evolucionado progresivamente hacia hiposensibilidad marcada durante este largo retardo; esto entonces podría observarse de forma subjetiva pero constantemente.

Aquí, con ensayos cuantitativos y apropiados, se confirma el desplazamiento de "síntomas positivos" a "síntomas negativos" por el segundo ensayo con tensión por confinamiento en P32 (figura 30B) de animales a los que se ha inyectado proteína ENV en el hipocampo, frente a los controles de simulación. Por tanto, se enfatiza el significado y la importancia del efecto terapéutico ahora presentado en animales similares tratados con el ligando IgG4, después de una inyección paralela de proteína ENV de MSRV.

Como puede observarse en la figura 31A, los animales "ENV+" tratados con IgG4 no desarrollaban esta disminución cognitiva con aparición de esta hiporreactividad del comportamiento ("congelación") en P32, y no podían diferenciarse del control de simulación en este punto temporal (como se ilustra por las barras de error solapantes en los histogramas), mientras que esta diferencia fue significativa con los animales no tratados (sin solapamiento de las barras de error en los histogramas). De nuevo, un segundo ensayo del comportamiento después de la tensión por confinamiento ha reproducido esta diferencia entre las ratas "ENV+" tratadas con el ligando IgG4 y los animales no tratados con una diferencia incluso mayor en los resultados entre los dos grupos: mientras que los animales "ENV+" no tratados tenían una actividad significativamente reducida en casi la mitad en comparación con los animales tratados, los últimos obtuvieron resultados indistinguibles de los controles de simulación (figura 31B).

Por tanto, como el subtipo de esquizofrenia con niveles elevados de CRP en suero se identifica como asociado con MSRV en el ejemplo 8 y se caracteriza por esta última fase de "sintomatología negativa" asociada con disminución cognitiva y pérdida neuronal, la evidencia de un efecto terapéutico beneficioso en un modelo preclínico del tratamiento con el ligando IgG4 se evidencia inesperadamente en dicha sintomatología drástica; esto, después de la inyección de ENV de MSRV ha estado iniciando un proceso patogénico relevante en este modelo, que está confirmando un mero efecto terapéutico del ligando de la presente invención en dichas formas de esquizofrenia (Dickerson, F., C. Stallings, et al. 2007).

EJEMPLO 18: Análisis in vivo del anticuerpo quimérico GNb AC1 con isotipo IgG1 con efecto terapéutico en un modelo animal de cáncer, injertado con células de linfoma humano.

I. Experimento 1: Efecto del anticuerpo IgG1 quimérico GNb AC1 sobre la migración de células de linfoma B humano inyectadas por vía subcutánea en ratones desnudos

A. Materiales y métodos

1. Animales

Se adquirieron ratones desnudos hembra sin patógenos (de 6 a 8 semanas de edad) (n=4) de Charles River, Francia. Los animales se mantuvieron en la misma jaula en un ciclo convencional de luz-oscuridad con acceso ad libitum a comida y agua y no se distribuyeron durante un periodo de 8 días de aclimatación. Todos los procedimientos cumplen la Directiva del Consejo de Comunidades Europeas del 24 de noviembre de 1986 (86/609/EEC) y la Directiva del Consejo Nacional del 19 de octubre de 1987 (87848, "Ministére de I'Agriculture et de la Forét", Francia). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar la cantidad de animales usados y su sufrimiento.

2. Cultivo celular

La línea celular Akata es una línea celular positiva al virus de Epstein-Barr derivada de un paciente que padecía linfoma de Burkitt. La línea celular se mantuvo en medio RPMI 1640 (Sigma, Francia) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Gibco®, Invitrogen, Francia), 40 U de penicilina por ml and 50 |jg de estreptomicina por ml a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 %.

3. Inyección de células y administración de anticuerpos

En P0 (primer día), se inyectaron por vía subcutánea 15 x 107 células de linfoma en ratones desnudos. Después de un retardo de 6 h, dos ratones de control recibieron una inyección i.p. de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Lonza, Francia) y un ratón recibió una inyección i.p. del anticuerpo quimérico IgG1 (100 jg/animal). El último ratón se trató de forma simular con el mismo anticuerpo 72 h después de la inyección de células de linfoma.

4. Examen histológico

En P19, todos los ratones se sacrificaron por sobredosis de pentobarbital y se les sometió a autopsia para evaluar la presencia de anomalías anatomopatológicas. Se capturaron fotografías con una cámara digital [modelo Coolpix S500 (es decir, 7 millones de píxeles), Nikon, Francia] y se transfirieron de la cámara a un ordenador PC.

B. Resultados

Inesperadamente, no pudo detectarse ninguna masa tisular subcutánea visible (tumor) en ratones no tratados, mientras que ambos ratones tratados con IgG1 mostraron una masa localmente delimitada en el sitio de la inyección.

En la autopsia, se observó una fuerte esplenomegalia en ambos ratones de control, mientras que ambos ratones tratados con IgG1 no mostraron alteración macroscópica del bazo. Para estimar mejor el agrandamiento del bazo, se calculó un índice esplénico del siguiente modo: [(peso del bazo/peso corporal) x 100]. De forma interesante, los ratones desnudos no tratados presentaron un aumento de factor 2 de la relación de peso del bazo/corporal en comparación con la de los ratones desnudos tratados con IgG1, como se muestra en la figura 32. Además, también pudo ser visible un ligero agrandamiento hepático en los ratones de control en comparación con los ratones tratados con IgG1. El examen macroscópico de otros órganos (corazón, pulmones, riñones, cerebro, intestino y estómago) no reveló ninguna anomalía principal.

C. Análisis

En este primer experimento, se mostró que la inyección subcutánea de células linfoblastoides en ratones desnudos puede dar lugar a diseminación de las células de linfoma en órganos linfoides, como se evidencia por una fuerte esplenomegalia, mientras que las células inyectadas in situ parecen haber migrado casi todas. En ratones tratados con IgG1 quimérica, se informó de una ausencia de agrandamiento del bazo asociado con la persistencia de la masa de células de linfoma inyectadas de forma local confinadas in situ.

De acuerdo con los presentes datos, el anticuerpo IgG1 quimérico GNb AC1 debe haber prevenido la migración de las células de linfoma a través de su efecto de ligando. Estos resultados son, por tanto, un argumento convincente de que el anticuerpo quimérico IgG1 que comprende el ligando de la presente invención puede ser una herramienta útil en el tratamiento de tumores humanos positivos a ENV.

II. Experimento 2: Evidencias in vivo de citotoxicidad celular contra linfoma de células B humano después de inyección del ligando de unión a ENV de MSRV en forma de anticuerpo IgG1 quimérico en un modelo de ratón SCID.

A. Materiales y métodos

1. Animales

Se adquirieron ratones SCID hembra (inmunodeficiencia combinada grave; desprovistos de linfocitos T y B funcionales, con población NK reducida) sin patógenos (de 6 a 8 semanas de edad; n = 5) de Charles River, Francia. Los animales se mantuvieron en la misma jaula en un ciclo convencional de luz-oscuridad con acceso ad libitum a comida y agua y no se distribuyeron durante un periodo de 8 días de aclimatación. Todos los procedimientos cumplen la Directiva del Consejo de Comunidades Europeas del 24 de noviembre de 1986 (86/609/EEC) y la Directiva del Consejo Nacional del 19 de octubre de 1987 (87848, "Ministére de I'Agriculture et de la Forét, Francia"). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar la cantidad de animales usados y su sufrimiento.

2. Cultivo celular

La línea celular de linfoma es una línea celular positiva al virus de Epstein-Barr derivada de un paciente que padecía linfoma de Burkitt. La línea celular Akata se mantuvo en medio RPMI 1640 (Sigma, Francia) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Gibco®, Invitrogen, Francia), 40 U de penicilina por ml and 50 |jg de estreptomicina por ml a 37 °C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5 %.

3. Inyección de células y administración de anticuerpos

El primer día P0, se inyectaron por vía intraperitoneal 15 x 107 células linfoblastoides (LC) Akata en todos los ratones SCID. Después de un retardo de 24 h, tres ratones de control recibieron una inyección i.p. de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Lonza, Francia) y dos ratones recibieron una inyección i.p. de 100 jg del anticuerpo quimérico IgG1.

4. Examen histológico y recuento celular

En P7, todos los ratones se sacrificaron por sobredosis de pentobarbital. Después de ello, se recogieron las células del lavado peritoneal en 5 ml de PBS. La determinación de la viabilidad de las LC se basó en tinción con colorante azul de tripano del fluido peritoneal. Se observaron las LC y otros glóbulos blancos y se contaron con microscopia de baja energía. Las células humanas de linfoma de Burkitt se podían identificar fácilmente por su morfología y la confirmación de su especificidad se obtuvo por inmunocitoquímica realizada con anticuerpos monoclonales anti-virus de Epstein-Barr, específicos de proteínas expresadas de latencia, así como con anticuerpos monoclonales específicos de marcadores de células B humanas (no mostrados).

Los ratones también se sometieron a autopsia para evaluar la presencia de anomalías anatomopatológicas. Particularmente, se estimó la alteración esplénica potencial por la relación de peso del bazo/corporal calculada del siguiente modo: [(peso del bazo/peso corporal) x 100].

B. Resultados

El examen macroscópico de todos los ratones no reveló la presencia de tumor palpable, que fie coherente con la duración muy corta del estudio, justificada por la necesidad de abordar la citotoxicidad dependiente de anticuerpos en un corto retardo después de la inyección de las células de linfoma y, después de ello, la inyección de anticuerpo o simulada. Sin embargo, pudo detectarse fácilmente esplenomegalia en ambos ratones de control, mientras que ambos ratones tratados con IgG1 no mostraron modificación macroscópica del bazo. Como en el experimento previo con inyección subcutánea de las mismas células en ratones desnudos, los ratones SCID no tratados presentaban un aumento de factor 2 de la relación de peso del bazo/corporal en comparación con la de ratones SCID tratados con IgG1 (figura 32). El examen macroscópico de otros órganos (corazón, pulmones, riñones, cerebro, intestino y estómago) no reveló ninguna anomalía principal.

El análisis del fluido peritoneal de ratones tratados con IgG1 reveló una disminución en la cantidad de células de linfoma tanto vivas como muertas en comparación con la de los ratones de control (figura 33A). De forma muy interesante, aproximadamente un 50 % de las células de linfoma recogidas de la cavidad peritoneal de los ratones tratados con IgG1 quimérica GNb AC1 eran células muertas seis días después de la inyección de anticuerpos. En paralelo, se observó un aumento en la cantidad de otros glóbulos blancos mononucleares (principalmente macrófagos de origen monocítico y unas pocas células NK, en ratones SCID) en ratones tratados con IgG1 en comparación con los ratones de control (figura 33B).

C. Análisis

En este segundo experimento, se ha observado que la inyección intraperitoneal de células de linfoma de Burkitt en ratones SCID puede inducir esplenomegalia después de 7 días, de forma coherente con el estudio previo en ratones desnudos que muestra lo mismo después de 19 días. De forma interesante, los ratones tratados con IgG1 no mostraron dicho agrandamiento del bazo.

Además, el conjunto de (i) la disminución en la cantidad de células de linfoma vivas recogidas de la cavidad peritoneal, en comparación con animales no tratados, de (ii) la importante proporción de células malignas muertas y de (iii) el aumento en la cantidad de otros glóbulos blancos mononucleares, es altamente indicativo de efectos citotóxico directo dependiente de anticuerpos y/o mediado por células sobre las células tumorales. Este efecto, por tanto, está reflejando (i) la especificidad del ligando que se está uniendo a las células tumorales que expresan el epítopo diana en proteínas ENV de MSRV expuestas en células tumorales humanas como se evidencia en el ejemplo 8 y (ii) los efectos inmunitarios humorales mediados por isotipo IgG1 añadido que implican destrucción de células tumorales. El último efecto puede estar medio a través de, por ejemplo, la activación del complemento por sitios activos de IgG1 y, por ejemplo, actividad tumoricida de los macrófagos inducida a través de la interacción del receptor Fc con GNb Ac 1 IgG1 unido al antígeno tumoral ENV de MSRV.

Independientemente de los mecanismos implicados en los efectos de este anticuerpo quimérico IgG1, los resultados demuestran una inhibición de la proliferación de células de linfoma en un modelo animal preclínico con células tumorales humanas, evidenciando por tanto el potencial terapéutico del anticuerpo de ligando anti-ENV en el tratamiento de dichos cánceres positivos a ENV.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ligando que comprende

- las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable de cadena ligera (VL): CDR1, CDR2 y CDR3 respectivamente expuestas en la S^eQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,

- las tres CDR de la región variable de cadena pesada (VH): CDR4, CDR5 y CDR6 respectivamente expuestas en la SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6,

en el que dicho ligando se une al antiligando que consiste en la secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 32, y dicho ligando se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento scFv y un fragmento Fab,

y en el que dicho ligando es para su uso en un método de tratamiento.

2. Un ligando que comprende:

- las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable de cadena ligera (VL): CDR1, CDR2 y CDR3 respectivamente expuestas en la Se Q ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,

en el que dicho ligando se une al antiligando que consiste en la secuencia aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 32, y dicho ligando se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento scFv y un fragmento Fab,

en el que dicho ligando es para su uso en un método de tratamiento de la esclerosis múltiple.

3. El ligando para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que es un anticuerpo quimérico o humanizado.

4. El ligando para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho ligando es una IgG.

5. El ligando para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho ligando es una IgG1 o IgG4 humana.

6. El ligando para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho ligando es una IgG4 humanizada que comprende:

- una región variable de cadena ligera (VL) que tiene las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 48 y

- una región variable de cadena pesada (VH) que tiene las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 40.

7. El ligando para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho ligando es una IgG4 humanizada que comprende:

- una cadena ligera (LC) que comprende las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 64 y - una cadena pesada (HC) que comprende las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 63.

8. Un ligando que comprende:

en el que dicho ligando se une al antiligando que consiste en la secuencia de aminoácidos definida por la SEQ ID NO: 20 o SEQ ID NO: 32, y dicho ligando es un anticuerpo IgG4 humanizado que comprende:

9. Un ligado de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicho ligando es un anticuerpo IgG4 humanizado que comprende: