KR101682040B1

KR101682040B1 - Ｍｓｒｖ 관련 질환에서 특이적 리간드의 치료적 용도

Info

Publication number: KR101682040B1
Application number: KR1020117002937A
Authority: KR
Inventors: 코린 버나드; 알로이스 베르나르 랑; 헤르베 페론; 장-바티스트 베르트랑
Original assignee: 제네유로 에스에이
Priority date: 2008-07-08
Filing date: 2009-07-08
Publication date: 2016-12-02
Also published as: KR20110031969A; JP2011527887A; WO2010003977A1; EA024655B1; JP6495361B2; CA2729869A1; PL2315777T3; IL210204A0; SI2315777T1; US9815888B2; HRP20171067T1; IL210204A; PL3211005T3; BRPI0915667B8; US20170107274A1; HUE054712T2; MX2010014319A; JP2015157812A; CN102143975B; US20110243962A1

Abstract

본 발명은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 및 SEQ ID No. 6, 또는, 다음에 나타내는 바와 같이 상기 서열 내에 치환된 아미노산 수를 가지거나: CDR1 내 0 내지 3 (SEQ ID No.1), CDR2 내 0 내지 2 (SEQ ID No.2), CDR3 내 0 내지 2 (SEQ ID No.3), CDR4 내 0 또는 1 (SEQ ID No.4), CDR5 내 0 내지 4(SEQ ID No.5), 또는 CDR6 내 0 내지 2 (SEQ ID No.6), 또는 상기 SEQ ID No. 1 내지 SEQ ID No. 6 서열 내에 동등한 화학적 기능 및 특성을 가지는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산을 가지는 서열로 나타내어지는 각각의 상보성 결정 영역(CDRs)을 포함하는 리간드에 관한 것이다.

Description

ＭＳＲＶ 관련 질환에서 특이적 리간드의 치료적 용도{THERAPEUTIC USE OF SPECIFIC LIGAND IN MSRV ASSOCIATED DISEASES}

본 발명은 표적 분자인 안티-리간드에 상당한 결합을 나타내는 리간드에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, "안티-리간드"는 MSRV (다발성 경화증 관련 레트로바이러스)-ENV (엔벨로프) 단백질이다 (Perron, et al. (1997). "Molecular identification of a novel retrovirus repeatedly isolated from patients with multiple sclerosis. The Collaborative Research Group on Multiple Sclerosis." Proc Natl Acad Sci USA 94(14): 7583-8.). "MSRV-ENV 단백질"은 Komurian-Pradel, F, et al. (1999). Virology 260(1): 1-9,. 및 Rolland A, et al. (2006) J Immunol 176(12): 7636-44에서 정의되는 바와 같이 MSRV env 유전자에 의하여 인코딩되는 완전한 또는 부분적인 단백질 산물, 또는 MRSV-ENV의 항원성 또는 결합 특성을 모방하는 임의의 분자(미모토프: mimotope)로 이해될 것이다. <<ENV-T>>는 실시예 2에 상세히 기재하는 완전한 단백질에 상응하며 (잔기 1 내지 542), ENV-1로도 명명되는 <<ENV -SU>>는 실시예 2에 상세히 기재하는 S30 내지 K316 서열에 상응한다. Env-SU는 또한 Rolland A, et al. (2006) J Immunol 176(12): 7636-44에도 언급되어 있다. 레트로바이러스에 있어서 통상적인 바와 같이, MSRV는 그 표면 단백질 -ENV- 내에서 가변성을 나타낸다 (Perron, H et al. (2000) J Neurovirol 6: S67-75; Voisset, C., O. Bouton, et al. (2000) AIDS Res Hum Retroviruses 16(8): 731-40). MSRV ENV 부분적 단백질 단편을 모방하는 미모토프(mimotope)가 존재하며 다발성 경화증 환자로부터의 항체에 의하여 선택적으로 결합되는 것으로 보여져 왔다 (Jolivet-Reynaud, C., H. Perron, et al. (1999). "Specificities of multiple sclerosis cerebrospinal fluid and serum antibodies against mimotopes." Clin Immunol 93(3): 283-93).

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보다 상세하게, 본 발명의 리간드는 아미노산 서열 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 및 SEQ ID No. 6, 또는 다음 중 하나를 가지는 서열을 가지는 각각의 상보성 결정 영역 (CDRs)을 포함한다:

- 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 얻기 용이한 것으로 알려진 (Huang 1986; Zabin, Horvath et al. 1991; Edgar and Schwartz 1992; Sardana, Emini et al. 1992; Xu, Kapfer et al. 1992; Lamande and Bateman 1993; Verdoliva, Ruvo et al. 1995; Yu, Schurr et al. 1995; Wehrmann, Van Vliet et al. 1996; Ullmann, Hauswald et al. 1997; Minuth, Kramer et al. 1998; Ullmann, Hauswald et al. 2000; Janke, Martin et al. 2003), 다음에 나타내는 바와 같이 상기 서열 내에 치환된 아미노산 수: CDR1 내 0 내지 3 (SEQ ID No.1), CDR2 내 0 내지 2 (SEQ ID No.2), CDR3 내 0 내지 2 (SEQ ID No.3), CDR4 내 0 또는 1 (SEQ ID No.4), CDR5 내 0 내지 4(SEQ ID No.5), 또는 CDR6 내 0 내지 2 (SEQ ID No.6), 또는

- 상기 서열 SEQ ID No.1 내지 SEQ ID No. 6 내에, 예를 들어 다음에 열거하는 유사한 아미노산(1 문자 코드)과 같이 당업자에 주지된 동등한 화학적 기능 및 특성을 가지는 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 ("아미노산 유사성"으로도 언급): G 또는 A, F 또는 Y, D 또는 E, N 또는 Q, K 또는 R 또는 H, S 또는 T, C 또는 M, V 또는 L 또는 I, W 또는 P, 및/또는 종래 기술에 의하여 치환된 아미노산 (Huang 1986; Zabin, Horvath et al. 1991; Edgar and Schwartz 1992; Sardana, Emini et al. 1992; Xu, Kapfer et al. 1992; Lamande and Bateman 1993; Verdoliva, Ruvo et al. 1995; Yu, Schurr et al. 1995; Wehrmann, Van Vliet et al. 1996; Ullmann, Hauswald et al. 1997; Minuth, Kramer et al. 1998; Ullmann, Hauswald et al. 2000; Janke, Martin et al. 2003).

상기 변이체들은 SEQ ID Nos. 1 내지 6의 펩타이드 내에 아미노산의 결실, 부가 또는 치환의 결과이며, 본 발명에 포함되고, 부위 지정 돌연변이 또는 화학적 합성과 같이 당업계에 공지된 방법으로 얻을 수 있다.

본 발명의 리간드는 본 발명의 안티리간드에 결합하는 능력을 가진다.

본 발명에 의하면, "결합하다" 또는 "결합하는"의 표현은 리간드가 실시예 5에 제공되는 기준에 따라 안티-리간드를 상당히 인식하는 것으로 이해될 것이다.

본 발명의 다른 측면에서, 상기 리간드는 아미노산 서열 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 및 SEQ ID No. 3 또는 상기 서열들과 적어도 80% 동일성, 바람직하게 90% 동일성을 가지는 임의의 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 (VL), 및 아미노산 서열 SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 및 SEQ ID No. 6 또는 상기 서열들과 적어도 80% 동일성, 바람직하게 90% 동일성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 (VH)을 포함한다.

추가적인 측면에서, 본 발명의 리간드는 SEQ ID No. 7에 기재된 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 75%, 바람직하게 80%, 더 바람직하게 90% 동일성을 가지는 임의의 서열을 가지는 경쇄 가변영역 (VL), 및 SEQ ID No. 8에 기재된 아미노산 서열, 또는 상기 서열과 적어도 75%, 바람직하게 80%, 더 바람직하게 90% 동일성을 가지는 임의의 서열을 가지는 중쇄 가변영역 (VH)을 포함한다.

상기 VH 및 VL 서열의 변이체는 안티-리간드에 상당히 결합한다.

"서열 동일성"은 예를 들어, 80% 서열 동일성을 가지는 서열 내에서, 서열 정렬시에 80% 동일한 아미노산이 동일한 포지션에 존재함을 의미하며, 상기 정렬은 Sequence - Evolution - Function Computational Approaches in Comparative genomics. Koonon E. et al., 2003: Kluwer Academic Publishers 또는 "Mac Vector" Software (UK) 설명서의 디폴트 패러미터에 따라 당업계에 공지된 방법에 의하여 수행될 수 있다.

본 발명의 리간드는 또한 재조합 ScFV 단백질 내에 포함되는 것으로 정의될 수 있다.

본 발명의 추가적인 측면에 따라, 상기 리간드는 Fab 단편 내에, 항체 내에 포함될 수 있으며, 상기 항체는 다중클론성, 단일클론성, 올리고클론성, 키메릭, 엔지니어링된, 또는 인간화된 항체일 수 있다. 본 발명의 특별한 측면에서, 상기 리간드를 포함하는 항체는 인간 IgG, 보다 특별하게 IgG1 또는 IgG4이다.

다중클론성, 올리고클론성, 단일클론성 항체는 상기 안티 리간드를 이용하여 Kohler and Milstein (1975)에 기재된 전통적인 방법에 의하여 또는 Sambrook et al, A Guide to Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd edition (1989)에 기재된 절차를 이용하여 생산될 수 있다

보다 구체적으로, 항체를 얻기 위하여 사용되는 본 발명의 안티-리간드는 SEQ ID No. 20 또는 SEQ ID No. 32 또는 SEQ ID No. 20, 또는 SEQ ID No. 32에 기재된 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 가지는 서열, 또는 이의 100% 상보적 서열로 이루어지는 안티-리간드이다.

특히, 혈청 알부민 또는 면역화에 통상적으로 사용되는 KLH과 같은 담체 단백질에 연결된 펩타이드 형태이다.

본 발명은 또한 본 발명의 리간드를 활성 성분으로서 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 리간드는 또한 상기 약학적 조성물 내에 ScFv, Fab 단편, 또는 항체 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 MSRV 관련 질환 처리에 사용된다.

본 발명의 문맥상 "처리"는 예방적 또는 치료적 처리를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료적 및 면역원성 유효량으로 투여되며, 당업계에 공지된 바와 같이, 투여량은 처리되는 개인에 의존한다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 상기 리간드, ScFv, Fab 단편, 또는 항체, 또는 상기한 바와 같은 결합 특성을 유지하는 임의의 분자 또는 적합한 치료적 벡터 내에 상기 리간드, 또는 상기 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 처리 방법에 관한 것이다.

본 발명의 처리 방법은 MSRV 관련 질환을 처리하는 것을 목적으로 한다.

MSRV는 다발성 경화증 환자로부터 처음으로 분리된 레트로바이러스이다 (Perron, H., B. Lalande, et al. (1991), Lancet 337(8745): 862-3; Perron, H., J. A. Garson, et al. (1997), Proc Natl Acad Sci USA 94(14): 7583-8). 관련 질환 또는 증후군은 (실시예 8에 기재된 바와 같이) 해당 환자 내에 (i) 바람직하게 체액 (혈액, 뇌척수액, 뇨) 내에 검출되는, 특정 MSRV RNA 또는 항원, (ii) 병변 또는 이상 기관으로부터의 세포 또는 조직 내에 증가된 DNA 또는 RNA 복제수, (iii) 상기 질환 또는 임상적 증후군의 과정에 수반되는 세포 또는 조직 내에 특정 MSRV 단백질 또는 항원, 또는 (iv) 상기 질환을 가지거나 상기 임상적 증후군을 나타내는 개인의 체액 내에 MSRV 단백질 또는 항원의 존재로 정의된다. MSRV는 인간 내생 레트로바이러스 타입 W 패밀리와 유전적 상동성을 가지므로 (Blond et al., 1999; Dolei, 2005; Dolei and Perron, 2008), MSRV-관련 질환의 대안적 또는 보완적 정의를 또한 동일한 검출 시험에 사용되는 HERV-W 핵산, 항원 또는 단백질을 이용하여 얻을 수 있다 (Antony et al., 2004; Arru et al., 2007; Karlsson et al., 2004; Mameli et al., 2007). 또한, MSRV 발현은 병변 내에 동시 검출되는 특정 HERV-W 복제본의 상향 조절과 관련이 있을 수 있다 (Mameli et al., 2009). 따라서, MSRV-관련 질환의 정의는 분명히 HERV-W 요소와의 연관성을 가진다.

MSRV-관련 질환은 염증 또는 면역 조절 이상과 관련되어 상기한 바와 같은 MSRV 발현 산물의 존재시, 다발성 경화증, 정신분열증, 임상적 독립 증후군 (신경학상 증상을 가지는 CIS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 간질, 건선, 암, 염증성 췌장염 및 타입 1 또는 타입 2와 같은 당뇨병으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 상기 MSRV-관련 질환의 치료 방법은 IgG4 또는 IgG1 항체를 규칙적으로 반복되는 주사를 이용한 만성적 처리로서 투여하는 것을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18에 기재된 적어도 하나의 전장 핵산 서열, 또는 상기 서열들과 적어도 70%, 바람직하게 80%, 더 바람직하게 90% 동일성을 가지는 임의의 서열, 또는 이들의 100% 상보적 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다.

"서열 동일성"은 예를 들어, 당업계에 공지된 방법에 의하여 수행될 수 있는 서열 정렬시, 80% 서열 동일성을 가지는 서열 내에 80% 동일한 뉴클레오티드가 동일한 포지션에 존재함을 의미한다.

본 발명의 상기 측면의 바람직한 구현예에서, 상기 핵산 분자는 SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, 및 SEQ ID No. 18에 기재된 서열 각각, 또는 상기 서열과 적어도 70%, 바람직하게 80%, 더 바람직하게 90% 동일성을 가지는 임의의 서열, 또는 이들의 100% 상보적 서열을 포함한다.

본 발명의 추가적인 측면에서, 상기 핵산은 VH 사슬을 인코딩하며, 보다 구체적으로, SEQ ID No. 10 또는 12, 또는 본래 리간드 또는 안티-리간드 분자의 항원 또는 결합 특성을 유지하는 치환, 삽입 및 결실 백분율에 제한 없이, 상기 서열과 적어도 70%, 바람직하게 80%, 더 바람직하게 90% 동일성을 가지는 임의의 서열, 또는 이들의 100% 상보적 서열로 표시된다 (Huang 1986; Zabin, Horvath et al. 1991; Edgar and Schwartz 1992; Sardana, Emini et al. 1992; Xu, Kapfer et al. 1992; Lamande and Bateman 1993; Verdoliva, Ruvo et al. 1995; Yu, Schurr et al. 1995; Wehrmann, Van Vliet et al. 1996; Ullmann, Hauswald et al. 1997; Minuth, Kramer et al. 1998; Ullmann, Hauswald et al. 2000; Janke, Martin et al. 2003).

상기 핵산은 또한 SEQ ID No. 9 또는 11, 또는 본래 리간드 또는 안티-리간드 분자의 항원 또는 결합 특성을 유지하는 치환, 삽입 및 결실 백분율에 제한없이, 상기 서열과 적어도 70%, 바람직하게 80%, 더 바람직하게 90% 동일성을 가지는 임의의 서열, 또는 이들의 100% 상보적 서열로 표시되는 VL 사슬을 인코딩할 수 있다 (Huang 1986; Zabin, Horvath et al. 1991; Edgar and Schwartz 1992; Sardana, Emini et al. 1992; Xu, Kapfer et al. 1992; Lamande and Bateman 1993; Verdoliva, Ruvo et al. 1995; Yu, Schurr et al. 1995; Wehrmann, Van Vliet et al. 1996; Ullmann, Hauswald et al. 1997; Minuth, Kramer et al. 1998; Ullmann, Hauswald et al. 2000; Janke, Martin et al. 2003).

엄격한 조건하에 본 발명의 펩타이드 중 적어도 하나를 인코딩하는 핵산과 혼성화하는 핵산 또한 본 발명에 포함된다. 본원에 사용되는 용어 "엄격한 조건"은 프로브 서열과 검출될 핵산 서열 사이의 혼성화를 허용하는 조건을 의미한다. 적합한 엄격한 조건은 예를 들어 예비 혼성화 및 혼성화 용액 내에 염 또는 포름아미드의 농도, 또는 혼성화 온도에 의하여 정의될 수 있으며, 이는 당업계에 주지되어 있다. 특히, 엄격함은 염 농도 감소, 포름아미드 농도 증가, 또는 혼성화 온도 상승에 의하여 증가될 수 있다. 해당 핵산의 퓨린 대 피리미딘 비율을 계산하고 이에 따라 온도를 조정함으로써 특정 수준의 엄격함에 상응하는 온도 범위를 추가로 좁힐 수 있다. 상기 범위 및 조건에 대한 변화는 당업계에 공지되어 있다.

본 발명은 또한 서로 기능적으로 연결되는, 숙주 유기체 내에 기능적인 적어도 하나의 프로모터, 본 발명에 따른 핵산, 및 동일한 숙주 유기체 내에 기능적인 종결 엘리먼트를 포함하는 키메릭 유전자에 관한 것이다. 키메릭 유전자가 포함할 수 있는 다양한 구성 요소는, 첫째로 프로모터, 시그널 펩타이드 또는 트랜지트 펩타이드를 인코딩하는 서열, 또는 폴리아데닐화 시그널을 구성하는 종결 엘리먼트와 같은 단백질 전사, 번역 및 성숙을 조절하는 요소, 및 두번째로, 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드이다. "서로 기능적으로 연결되는"의 표현은 상기 키메릭 유전자의 구성 요소들이 이들 요소 중 하나의 기능이 다른 것의 기능에 의하여 영향을 받는 방식으로 서로 연결되어 있음을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때에 상기 코딩 서열에 기능적으로 연결된다. 본 발명에 따른 키메릭 유전자의 구성 및 그 다양한 구성 요소들의 어셈블리를 당업자에게 공지되어 있는 기법, 특히 Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 기재되어 있는 기법을 이용하여 수행할 수 있다. 상기 키메릭 유전자를 구성하는 조절 요소의 선택은 실질적으로 이들이 그 안에서 작용하는 숙주 유기체에 의존하며, 당업자는 주어진 숙주 유기체 내에서 기능성인 조절 요소를 선별할 수 있을 것이다. 용어 "기능성"은 주어진 숙주 유기체 내에서 작용할 수 있음을 의미하는 것으로 의도된다.

본 발명에 따르는 키메릭 유전자가 포함할 수 있는 프로모터는 구성적 또는 유도적이다. 예를 들어, 포유동물 세포 내에 발현을 위하여 사용되는 보편적으로 효능있는 프로모터는 pCMB (사이토메갈로바이러스 프로모터)이다.

본 발명에 의하면, 상기 키메릭 유전자는 또한 전사 활성 인자(인핸서)와 같은 상기 프로모터와 상기 코딩 서열 사이에 위치할 수 있는 기타 조절 서열을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따르는 키메릭 유전자를 포함하는 클로닝 및/또는 발현 벡터에 관한 것이다. 본 발명에 따른 벡터는 숙주 유기체를 형질전환시키고 상기 유기체 내에서 리간드를 발현시키기 위한 용도의 것이다. 상기 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, 또는 바이러스일 수 있다. 바람직하게, 상기 본 발명에 따른 형질전환 벡터는 플라스미드이다. 일반적으로, 상기 벡터의 주된 품질은 숙주 유기체 내에서 그 자체를 유지하고 특히 복제 기원의 존재에 의하여 자가복제할 수 있는 능력 및 그 안에서 리간드를 발현할 수 있는 능력일 것이다. 숙주 유기체의 안정한 형질전환을 위하여, 상기 벡터는 또한 게놈 내로 통합될 수 있다. 그렇다면, 상기 벡터의 조성은 상기 숙주 내에서 리간드를 합성하는데에 요구되는 요소들로 제한될 것이다. 이와 같은 벡터 및 본 발명에 따른 키메릭 유전자의 삽입 기법의 선택은 Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 상세히 기재되어 있으며, 당업자의 일반적인 지식의 일부이다. 유리하게, 본 발명에 사용되는 벡터는 또한 본 발명에 따른 키메릭 유전자 외에, 선별가능한 마커를 인코딩하는 키메릭 유전자를 포함한다. 이러한 선별가능한 마커는 효율적으로 형질전환되는 숙주 유기체, 즉, 상기 벡터를 혼입하는 숙주 유기체들의 선별을 가능케 한다. GUS 효소와 같은 용이하게 동정가능한 효소를 인코딩하는 유전자, 또는 염료 또는 형질전환된 세포 내에서 염료의 생산을 조절하는 효소를 인코딩하는 유전자를 언급할 수 있다. 이와 같은 선별가능한 마커 유전자는 특히 특허 출원 WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 및 WO 97/04103에 기재되어 있다.

본 발명은 또한 그 게놈 내로 통합되거나 염색체 외 유전적 유소, 예를 들어 플라스미드 상에 운반되는 본 발명에 따른 키메릭 유전자를 적어도 하나 포함하는 형질전환된 숙주 유기체에 관한 것이다. 상기 용어 "숙주 유기체"는 상기 본 발명에 따른 키메릭 유전자가 도입되어 본 발명에 따른 리간드를 생산할 수 있는 하등 또는 고등 단세포 또는 다세포 생물을 의미하는 것으로 의도된다. 바람직하게, 상기 숙주 유기체는 CHO (Chinese Hamster Ovary) 또는 HEK (Human Epthelium Kidney) 세포이다.

상기 표현 "형질전환된 숙주 유기체"는 그 게놈 내로 또는 염색체 외 유전적 요소, 예를 들어 플라스미드 내에 적어도 하나의 본 발명에 따른 키메릭 유전자를 혼입하고 결과적으로 그 조직 또는 배지 내에서 리간드를 생산하는 숙주 유기체를 의미하는 것으로 의도된다. 본 발명에 따른 숙주 유기체를 얻기 위하여, 당업자는 많은 공지의 형질전환 방법 중 하나를 이용할 수 있을 것이다.

상기 방법들 중 한가지는 상기 형질전환될 숙주 유기체의 세포 또는 조직을 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 및 본 발명에 따른 벡터와 접촉시키는 것으로 이루어진다 (Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168(1), 111-115; Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70(4), 503-517). 전기 천공법 또한 다른 방법이며, 이는 상기 형질전환될 세포 또는 조직 및 본 발명의 벡터에 전기장을 가하는 것으로 이루어진다 (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6(7), 650-660; Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1), 56-62). 다른 방법은 상기 벡터를 마이크로주입에 의하여 상기 세포 또는 조직 내로 직접 주입하는 것으로 이루어진다 (Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33(2), 121-136). 유리하게, 유전자 총(biolistic) 방법이 이용된다. 이는 세포 또는 조직을 본 발명의 벡터가 흡착되는 입자로 폭격(bombarding)하는 것으로 이루어진다 (Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24), 9692-9696; Klein et al., 1992, Biotechnology 10(3), 286-291; U.S. Pat. No. 4,945,050).

본 발명은 또한 상기 숙주 세포를 리간드, scFV, Fab 단편, 또는 항체의 합성을 허용하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는 상기한 바와 같은 리간드, ScFv, Fab 단편 또는 항체의 생산 방법을 포함한다.

본 발명의 리간드는 안티-리간드에 결합하는 특성을 특징으로 한다. 특정 형태에서, 본 발명의 안티-리간드는 SEQ ID No. 20로 나타내어지는 아미노산 서열, 바람직하게 SEQ ID No. 32로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 scFV, Fab 단편, 또는 항체 형태의 리간드를 이용하여 안티리간드의 생물학적 표본을 검출하는 방법 또한 본 발명의 일부이다. 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(a) 상기 표본을 본 발명에 따르는 리간드, scFV, Fab 단편, 또는 항체와 접촉시키는 단계;

(b) 상기 표본 내에 안티리간드의 존재를 검출하는 단계.

상기 검출 방법은 상기 표본을 "Komurian-Pradel et al. Virology, 1999　; 260(1), pages 1-9"에 기재된 바와 같은 MSRV gag 유전자에 의하여 인코딩되는 MSRV GAG 항원에 특이적으로 결합하는 리간드와 접촉시키는 부가적인 단계에 의하여 완결될 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 생물학적 표본 내에 안티-리간드의 검출을 위한 면역분석 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 본 발명에 따른 리간드, 상기한 바와 같은 ScFV, Fab 단편, 또는 항체, 및 상기 리간드, Fab 단편 또는 항원에 안티-리간드의 특이적 결합을 검출하기 위한 시약을 포함하며, 상기 키트는 면역학적 반응을 위하여 요구되는 모든 시약을 포함한다.

상기 키트는 이전에 정의한 바와 같은 GAG 항원에 특이적으로 결합하는 리간드를 부가적으로 포함할 수 있다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 상기한 바와 같은 면역분석 키트의 다발성 경화증, 정신분열증, 임상적 독립 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 간질, 건선, 암, 염증성 췌장염 및 당뇨병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 MSRV-관련 질환, 특히 타입 1 당뇨병 또는 타입 2 당뇨병의 검출에 있어서의 용도에 관한 것이다.

상기 생물학적 표본은 혈청, 뇨, 타액, 생검 물질 등일 수 있다.

면역분석의 디자인은 당업계에 통상적이며, 고체 지지체 또는 면역침전의 이용과 같은 프로토콜이 공지된 기법이다. 상기 항체는 효소, 형광, 화학발광, 방사성 또는 염료로 표지될 수 있다. 비오틴 및 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 이용하는 분석 및 ELISA와 같은 효소 결합 면역분석 또는 샌드위치 분석과 같은 면역 복합체로부터 시그널을 증폭시키는 분석은 본 발명의 일부이다.

도 1: (A) VL 아미노산 서열, (B) VH 아미노산 서열, CDR 서열 밑줄침.
도 2: 완전한 ENV 단백질 (ENV-T) 및 표면 절개 단편 (ENV 1 또는 ENV-SU) 구조.
도 3: 쥐 GNb AC1 항체 리간드(murine IgG1 perox)를 리간드만을 가지는 재조합 ScFv 단편(ScFv VH+VL biot)과 비교하는 퍼옥시다아제 기판을 이용하는 비색법에 의한 광학 밀도 측정.
코팅 항원 및 각각의 검출 리간드의 농도는 각각 5 mg/ml였다; 스트렙트아비딘-퍼옥시다아제 컨쥬게이트 희석은 1/2000이었다.
도 4: 쥐 GNb AC1 항체 리간드를 리간드만을 가지는 Fab 결합 단편과 비교하는 퍼옥시다아제 기판을 이용하는 비색법에 의한 광학 밀도 측정. 각각의 검출 리간드 또는 IgG1의 농도는 10mg/ml였다. +Jackson 퍼옥시다아제 안티-Fab 또는 안티-IgG는 1/250으로 희석되었다. 상이한 ENV-T 농도를 시험하였다.
도 5: 연속 희석 ENV 항원 (ENV-T) 상에서 GNbAC1 및 본 발명에 따르는 키메릭 항체 IgG1 및 IgG4 시험. 항체 농도는 1 mg/ml 및 2차 퍼옥시아다제-표지 항체 안티 IgG 1/250이었다. 2G5E12는 본원에서 음성 대조군으로 이용되는, ENV 항원에 결합하지 않는 부적절한 항체이다.
도 6: 두 리간드 (A) 랏 1, (B) 랏 2 상에서 일정한 항원 농도(ENV-T)에서 GNbAC1 및 키메라 구조물 IgG1 및 IgG4의 시험. 항원 농도는 1 내지 0.0078㎍/ml이고, 최초 쥐 단일클론 항원(GNb AC1)은 muIgG로 나타내어지고, 리간드를 가지는 인간 IgG1 또는 IgG4 구조물은 huIgG1 및 huIgG4로 나타내어진다. Jackson 안티-마우스 또는 안티-인간 IgG 2차 항체 희석은 1/250이었다.
도 7: 리간드를 가지는 GNbAC1, ScFv, IgG1 및 IgG4 키메릭 인간 항체 구조물: IL-6 감소로 나타내어지는 ENV 항원 (ENV SU)에 의한 PBMCs 전구염증 활성화 억제. 항체 또는 ScFv와 ENV 항원 사이의 비율은 25/1이었다.
도 8: ApoH- ELISA 결과. 다발성 경화증에 대한 European multicenter study로부터의 혈청을 독립적인 실험실에서 블라인드 시험하였다.
도 9: 정신분열증 환자 및 대조군 내에서 MSRV-ENV 및 GAG 항원혈증. 사용된 항체는 ENV에 대해서 2A12A5 및 6A2B2이고 GAG에 대해서 2G5E12이다.
도 10: 6A2B2 특이적 단일클론 항체를 이용한 MSRV-ENV 항원의 검출을 위한 ApoH-ELISA의 광학 밀도 (OD).
도 11: 급성 신경염증 및 탈수초를 보이는 인간화된 SCID 마우스의 임상적 추적 (실험적 알레르기성 뇌척수염, 다발성 경화증 동물 모델): 비처리군에 대한 상이한 항체 처리 군의 임상적 결과 비교. 상기 최초 쥐 단일클론 항체(GNb AC1)는 muIgG로 나타내어지고, 상기 리간드를 가지는 인간 IgG1 또는 IgG4 구조물은 huIgG1 및 huIgG4로 나타내어진다.
도 12: 급성 신경염증 및 탈수초를 보이는 인간화된 SCID 마우스의 생존 곡선. (실험적 알레르기성 뇌척수염, 다발성 경화증 동물 모델): 비처리군에 대한 상이한 항체 처리 군의 임상적 결과 비교. 상기 최초 쥐 단일클론 항체(GNb AC1)는 muIgG로 나타내어지고, 상기 리간드를 가지는 인간 IgG1 또는 IgG4 구조물은 huIgG1 및 huIgG4로 나타내어진다.
도 13: 본 실험에서 시험되는 각각의 NOD-SCID 마우스의 중량 곡선.
각각의 마우스에 대하여 주입되는 ENV 단백질 투여량을 괄호 안에 표시한다. IFA 및 PTX (P14) 내에 에멀젼화된 ENV 단백질의 최종 주입을 화살표로 표시한다. 상기 마우스를 그들이 투여받은 ENV 투여량에 따라 M1 내지 M6로 명명하며, 이는 그래프 설명에서 코드 옆에 괄호 사이에 표시한다 (0 내지 20 마이크로그램). 곡선의 중단은 상응하는 카테고리에서 동물 사망일에 해당한다.
도 14: 대조군 (대조군) 및 ENV-주입 NOD-SCID 마우스 (ENV) 내에 혈당 농도: 최초 주입일 (P0)과 최종 주입 후 1주일 (P30)의 비교. 위장 주입 및 ENV-주입군 (X 축: 대조군 및 ENV)에서 P30에서 측정된 혈당을 P0에서 측정된 것의 백분율로 표시한다 (Y-축).
도 15: GNb AC1 항체 중쇄의 CDR 정의
15A: Chothia 정의에 따라 동정된 아미노산을 더 작은 글씨 크기로 나타낸다. Kabat 정의에 따라 동정된 아미노산을 밑줄친 문자로 나타낸다.
15B: 두 결과를 결합한 바람직한 정의에 따라, 기능적 리간드가 인간 IgG4 항체 가변 중쇄 내로 이식되기 위하여 고려되는 본래 쥐 CDR 영역에 밑줄친다.
도 16: GNb AC1 항체 경쇄의 CDR 정의.
Kabat 정의에 따라 동정된 CDR을 밑줄친다.
Contact 정의(표준이 아님)에 따라 동정된 CDR은 더 작은 크기 글씨를 가진다.
도 17: 키메릭 GNb AC1 항체의 고정화된 DNV 단백질에의 결합 활성. 해당 실시예 본문에 조건을 기재한다. Y축은 비색법에 의한 각각의 지점에 대한 광학 밀도 (OD) 측정을 나타내며, 표적에 결합한 항체의 양과 상관 관계가 있다. X 축은 마이크로플레이트의 해당 웰을 코팅하고 세척 후 해당 플레이트-고정화 단백질의 넓은 정량 스펙트럼을 얻기 위하여 사용되는 ENV 재조합 단백질의 농도를 나타낸다.
도 18: 인간화된 항체 H2/VK3의 고정화 ENV에 대한 결합 활성. 해당 실시예 본문에 조건을 기재한다. Y축은 비색법에 의한 각각의 지점에 대한 광학 밀도 (OD) 측정을 나타내며, 표적 ENV 단백질에 결합한 항체의 양과 상관 관계가 있다. X축은 마이크로플레이트의 해당 웰을 코팅하고 세척 후 해당 플레이트-고정화 단백질의 넓은 정량 스펙트럼을 얻기 위하여 사용되는 ENV 재조합 단백질의 농도를 나타낸다.
도 19: 인간화된 항체 H4/VK3의 고정화 ENV에 대한 결합 활성. 해당 실시예 본문에 조건을 기재한다. Y축은 비색법에 의한 각각의 지점에 대한 광학 밀도 (OD) 측정을 나타내며, 표적 ENV 단백질에 결합한 항체의 양과 상관 관계가 있다. X축은 마이크로플레이트의 해당 웰을 코팅하고 세척 후 해당 플레이트-고정화 단백질의 넓은 정량 스펙트럼을 얻기 위하여 사용되는 ENV 재조합 단백질의 농도를 나타낸다.
도 20: 인간화된 항체 H2/VK3 (H2vk3) 및 키메릭 항체 (GNbAC1 IgG4)의 고정화된 ENV에의 결합 활성의 비교. 해당 실시예 본문에 조건을 기재한다. Y축은 비색법에 의한 각각의 지점에 대한 광학 밀도 (OD) 측정을 나타내며, 표적 ENV 단백질에 결합한 항체의 양과 상관 관계가 있다. X축은 마이크로플레이트의 해당 웰을 코팅하고 세척 후 해당 플레이트-고정화 단백질의 넓은 정량 스펙트럼을 얻기 위하여 사용되는 ENV 재조합 단백질의 농도를 나타낸다.
도 21: 비-환원 겔 내에 정제된 H2VK3 항체.
해당 실시예 본문에 조건을 기재한다. 좌측에, 사진의 좌측 레인에 도시하는 바와 같은 KD 수는 소정의 분자량 (KD)을 가지는 표준 단백질이 겔 내에서 이동한 수준 (막대)을 나타낸다. 정제된 H2/VK3 항체를 사진의 중앙 레인에 단일 밴드로서 도시하고 (화살표), 사진의 우측 레인에 소 혈청 알부민을 도시한다 (항체 버퍼 내에 표준, 대조군으로서 상이한 분자량으로 화살표로 도시함).
도 22: 정제된 H2/VK3 (정제된 hH2+hVK3) 및 정제된 키메릭 항체 (GNbAC1 IgG4)의 고정화된 ENV (0.5 microg/ml)에의 결합 활성 비교
X 축은 IgG4 키메릭 또는 선별된 인간화된 항체 농도를 나노g/ml로 나타낸다. Y 축은 비색법에 의하여 측정되는 광학 밀도를 나타내며, 이는 분석에서 고정화된 일정 농도의 ENV 단백질에 결합된 항체의 양과 상관관계가 있다.
도 23: 인간화된 항체 H2 중쇄 및 VK3 경쇄의 아미노산 서열.
위첨자 굵은 글씨의 아미노산은 데이터베이스에서 분석된 인간 항체 서열과의 일치 포지션에 근거하여 프레임워크 내에 유지되는 쥐 아미노산을 나타낸다.
도 24: 전구염증성 사이토카인은 HERV-W ENV 관련 단백질로 성상세포를 자극함에 의하여 강하게 상향 조절된다.
결과를 삼중 값의 평균으로 제시한다. ENV: MSRV-ENV; Syncytin: 염색체 7q 복제본으로부터 HERV-W ENV; X: 부적절한 항체 (대조군 아이소타입); 쥐 안티-ENV: GNb AC1 쥐 항체; 키메릭 안티-ENV: GNb AC1 키메릭 인간 IgG4 ; Pg/ml: 밀리리터 당 피코그램.
도 25: 말초 혈액 단핵 세포 배양액
결과를 삼중 값의 평균으로서 제시한다. ENV: MSRV-ENV; Syncytin: 염색체 7q 복제본으로부터 HERV-W ENV; X: 부적절한 항체 (대조군 아이소타입); 쥐 안티-ENV: GNb AC1 쥐 항체; 키메릭 안티-ENV: GNb AC1 키메릭 인간 IgG4; Pg/ml: 밀리리터 당 피코그램.
도 26: 세 가지 형태의 GNb AC1 리간드를 가지는 (쥐, 키메릭 및 인간화된 항체) 인간 글리코실화된 처리된 HERV-W ENV 단백질의 검출. A) GNb AC1 쥐 항체를 가지는 인간 글리코실화 처리된 HERV-W ENV 단백질의 검출. B) GNb AC1 키메릭 항체를 가지는 인간 글리코실화 처리된 HERV-W ENV 단백질의 검출. C) 인간화된 항체를 가지는 인간 글리코실화 처리된 HERV-W ENV 단백질의 검출. Y 축: 광학 밀도; X 축: 박테리아 MSRV-ENV 단백질 (ENV-T 7A 배치)　; 박테리아 MSRV-ENV 표면 단편 (ENV-SU4A 배치)　; 인간 글리코실화된 Syncytin　; 인간 글리코실화된 MSRV-ENV 단백질 (ENV-T P1 배치).
도 27: MSRV ENV 모의 용액(허위)을 대뇌 내로 주입한 래트의 신경행동학적 점수:
수평선 -Y축에서 교차선으로 나타냄 - (A) 및 수직 -Y축에 뒷다리로 서기로 나타냄- (B) 허위(PBS 용액) 내 대뇌 내 주입 (P5, P6, P7, P11 및 P12) 후 몇몇 시간 지점에서 새로운 것에 노출 후 운동 활성, ENV-icv (ENV 주입된 뇌실) 및 ENV-hipp 래트.
도 28: MSRV ENV의 모의 용액(허위)을 대뇌 내 주입한 래트의 신경행동학적 점수:
수평선 -Y축에서 교차선 수로 나타냄 - (A) 및 수직 -Y축에서 앞다리 들기 수로 나타냄- (B) 허위, ENV-icv 및 ENV-hipp 래트 내에서 P11로 식염수 주입 후 운동 활성.
도 29: MSRV ENV의 모의 용액(허위)을 대뇌 내 주입한 래트의 신경행동학적 점수:
수평선 -Y축에서 교차선 수로 나타냄 - (A) 및 수직 -Y축에서 앞다리 들기 수로 나타냄- (B) 허위, ENV-icv 및 ENV-hipp 래트 내에서 P13으로 식염수 주입 후 운동 활성.
도 30: IgG4 GNbAC1 리간드의 치료 효과를 나타내는 MSRV ENV을 대뇌 내 주입한 래트의 신경 행동학적 점수.
(A) P12 및 P32에서 새로운 것에 노출 후 개방 장 내에서 측정된 수평 운동 활성 - X 축으로 나타냄 - 허위 래트, ENV (ENV+) 주입한 비-처리 래트, 및 IgG4-처리된 ENV+ 래트 내, 기호 설명으로 나타냄.
(B) 제한 스트레스 후 수평 운동 활성으로 P32에서 관측된 IgG4 리간드 치료적 효과의 확인; X 축에 나타내는 바와 같이 허위 래트, ENV (ENV+) 주입한 비-처리 래트, 및 IgG4-처리된 ENV+ 래트 내 ENV 단백질의 회수 전신 주입 후 구속 스트레스 후 개방 장 내에서 측정된 - Y 축에서 교차선의 수-
도 31: IgG1 GNbAC1 리간드의 치료적 효과를 나타내는 "ENV-양성" 림프종-이식 누드 마우스의 연구.
림프종 세포의 주입 후 19일에 대조군 및 IgG1-처리 마우스 (X-축) 상에서 계산된 비장 지수 (Y 축). 비장 지수는 다음과 같이 계산하였다: [(비장 중량/체중) x 100]. 비-중복 오류는 통계학적 유의성을 나타낸다.
도 32: IgG1 GNbAC1 리간드의 치료적 효과를 나타내는 "ENV-양성" 림프종-이식 SCID 마우스의 연구.
B-림프종 세포의 주입 후 7일에 비-처리 및 IgG1-처리 SCID 마우스 상에서 계산된 비장 지수 (Y 축). 비장 지수는 다음과 같이 계산하였다: [(비장 중량/체중) x 100].
도 33: IgG1 GNbAC1 리간드의 치료적 효과를 나타내는 "ENV-양성" 림프종-이식 SCID 마우스의 연구.
림프종 세포 주입 후 7일, 및 항체 주입 후 6일에, 대조군 및 IgG1-처리된 마우스 - X 축- 에서 수집한 복수 내 생존 및 사망 림프아세포 수 - Y 축 - (A), 및 기타 백혈 세포 수 (B)

이하 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 제공되는 것이며, 본 발명을 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다.

실시예

실시예 1 : 쥐 특이 항체 ( GNbAC1 ) 분석: MSRV ENV 단백질 및 그 균등물에 특이적인 분자 리간드의 서열 및 구조의 확인

`Komurian-Pradel, F., G. Paranhos-Baccala, et al. (1999),Virology 260(1): 1-9)에 기재된 바와 같이, E. coli 내에서 생산되고 MSRV "ENV" 클론으로부터 정제된 재조합 MSRV 단백질로 면역화된 Balb-C 마우스로부터의 비장 세포와 마우스 골수종의 융합 후 쥐 하이브리도마를 얻었다.

하이브리도마를 생산하는 IgG1/Kappa (GNbAC1)로부터 VH 및 피 영역의 PCR 증폭을 다음 프로토콜에 따라 수행하였다.

Poly(A+) RNAs를 mRNA 정제 키트(Amersham Bioscience)를 이용하여 제조업자 지시에 따라 IgG1/Kappa를 생산하는 5x10⁷ 하이브리도마 세포로부터 추출하고 정제하였다. 역전사를 RT-PCR kit (Amersham Bioscience)를 이용하여 제조업자 지시에 따라 800 ng mRNA로부터 수행하였다. 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)의 가변 영역 유전자 서열을 인코딩하는 cDNA를 이전에 기재된 바와 같이 (Ruberti et al., 1994, J. Immunol. Methods 173, 33-39) cDNA 말단 (RACE)의 신속 증폭 방법을 이용하여 얻었다.

정방향 프라이머는 SEQ ID No. 21 (RACEforward)이었고, 역방향 프라이머는 다음과 같았다: VL 증폭을 위하여 SEQ ID No. 22 (CL_Ala130_Fwd), 및 VH 증폭을 위하여 SEQ ID No. 23 (CH1_Pro119_Fwd), 문자 코드 R = A/G, K = G/T, H = A/T/C. Kabat et al. (1991) (Sequences of proteins of immunological interest. National Institute of Health Bethesda, MD)에 의하여 공표된 일치 서열로부터 추론된 역방향 프라이머 CL_Ala130_ Backward 및 CH1_Pro119_ Backward는 마우스 kappa/CL 도메인 및 IgG/CH1 도메인 각각의 N-말단 끝에 특이적이다.

Taq DNA 폴리머라아제를 이용하여 PCR 산물을 얻고, TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 이용하여 제조업자 지시에 따라 pCR®2.1-TOPO® 벡터 내로 직접 결찰시켰다. 클로닝된 DNAs 서열을 Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems)를 이용하여 ABI310 자동 시퀀서 상에서 시퀀싱함으로써 결정하였다.

PCR 증폭에 이은 클로닝 및 시퀀싱 단계는 본래 핵산 서열로부터 추론되는 아미노산에 의하여, 각각 SEQ ID No. 7 및 8로 표시되는 VL 및 VH 사슬의 서열을 제공하였다. 또한, 상기 아미노산 서열 분석은 리간드 특이성에 수반되는 상보적 결정 영역 (CDR)의 동정을 허용하였다 (Kabat (Wu and Kabat 1970, An analysis of the sequences of the variable regions of Bence Jones proteins and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity. J. Exp. Med. 132:211-250; Kabat et al. 1987, 1991, Sequences of proteins of immunological interest; 4^th edn. US Govt. Printing Off. No.165-492)에 따라, 또는 Chothia (Chothia and Lesk 1987, Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al. 1989, Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. Nature 342: 877-883에 따른 구조에 의하여).

상기 세 개의 CDR 서열들을 VH 아미노산 서열 (도 1B) 상에서 동정한 결과 SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 및 SEQ ID NO. 6에 상응하며, 세 개의 CDR 서열들을 VL 아미노산 서열 (도 1A) 상에서 동정한 결과 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 및 SEQ ID NO. 3에 상응한다. 상기 여섯 개의 CDR 서열들은 특이적 리간드에 결합하는데에 요구되는 핵심 "최소" 서열을 나타내며, 따라서 본 발명에서 동정되는 특이적 리간드의 활성을 유지하는 임의의 조성물 또는 분자 구조물로 이루어진다. 그럼에도 불구하고, 몇몇 아미노산이 동등한 특성을 가지고 치환될 수 있으며 따라서 본래 리간드 서열의 특이성을 유지하고 동등한 리간드로 만들 수 있는 것으로 당업자에게 알려져 있다. 이와 같은 변이는 최대 10-12% 범위 내에서 가능한 것으로 알려져 있다.

실시예 2: 특이적 하이브리도마 발생을 위한 항- ENV 반응성 비장 세포를 얻기 위하여 마우스 면역화를 위한 MSRV ENV 항원, 생산 및 정제의 실시예

급원: 데이터베이스 접근 번호 (NCBI-Entrez/Genbank): AF331500 .1에 상응하는 단백질 서열을 포함하는 MSRV 비리온으로부터의 플라스미드 pV14 (Perron, Jouvin-Marche et al. 2001)

도 2는 완전한 ENV 단백질 (ENV-T, SEQ ID No. 19) 및 표면 절개 (ENV 1 또는 ENV-SU, SEQ ID No.24) 단편의 구조를 나타낸다. 도 2에서, 시그널 펩타이드는 잔기 #1(메티오닌)에서 시작하여 잔기 #29(트레오닌)에서 끝난다.

생산 방법:

Geneart (USA)에서 제공되는 ENV-T 코딩 서열을 Novagen (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ, UNITED STATES)에서 공급되는 발현 벡터 pET-15b 내로 제조업자 지시에 따라 결찰하고, John Wiley & Sons, ISBN 0-471-97324-0 QP625.N89R64 1996 John Wiley & Sons에 의하여 공표된 Bruce A. Roe, Judy S. Crabtree 및 Akbar S. Khan의 "DNA Isolation and Sequencing" (Essential Techniques Series) 및 "Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course (Paperback) by Katharine G. Field (Author), Walt Ream (Author)에 기재된 바와 같이, 전통적인 CaCl2 투과처리에 의하여 박테리아 BL21 E. coli 균주를 형질전환시킨 후, 형질전환된 박테리아를 30℃에서 광학 밀도까지 30mg/mL 카나마이신 존재하에 LB 배지 내에서 성장시킨다.

다음, 상기 단백질 발현을 1mM IPTG에 의하여 유도하고, 배양을 37℃에서 4시간 동안 추가로 지속한다.

추출 방법:

5000g에서 20 분 동안 4℃에서 원심 분리한 후, 박테리아 펠렛을 20 mL/L의 용해 완충 배지 (Tris 20mM pH7.5　; NaCl 0.15M　; 류펩틴 1mg/mL, 펩스타틴 1mg/mL, PMSF 1mM, MgCl2 2mM, 라이소자임 50㎍/mL) 내에 재현탁시킨다. 상기 용액을 30분 동안 4℃에서 교반하면서 인큐베이션한 다음, 얼음/에탄올 상에서 초음파처리한다 (80% 0.5에서 7분 중 4 단계). DNase 1mM을 첨가하고 용액을 4℃에서 1 시간 교반하면서 인큐베이션한다. 상기 현탁액을 40 000g으로 30분 동안 4℃에서 원심 분리한다.

상기 펠렛을 7.5mL/L의 가용화 완충 배지 (Tris 20mM pH 7,5, NaCl 150mM, 우레아 2M, SDS 1,5%, bmercaptoethanol 50mM) 내에 재현탁시킨다. 상기 용액을 2 시간 동안 8℃에서 교반하면서 인큐베이션한다.

다음, 상기 현탁액을 40 000g으로 30 분 동안 10℃에서 원심분리한다.

정제 방법:

상기 우레아 상등액을 완충액 Tris 20mM pH7,5, NaCl 150mM, SDS 1,5% 내에서 5 배 희석한다.

Ni Sepharose Fast Flow column (Amersham BioScience)을 이용하여 친화성 크로마토그래피에 의하여 1mL/L 배지 상으로 정제를 수행한다. 완충액 Tris 20mM pH7,5, NaCl 150mM, 우레아 500mM, SDS 1,5%, b-mercaptoethanol 10mM으로 평형화한 후, 상기 수지 상으로 상청액을 2mL/분으로 적재한다. Env 용리를 30 및 50mM 이미다졸에서 점진적으로 수행한다.

완충액 20mM pH7.5, NaCl 150mM, SDS 1,5%, DTT 10mM으로 평형화한 후, 정제를 탈염 컬럼 (Amersham BioScience, 25mL 수지)을 이용하여 수행한다. 친화성 크로마토그래피로부터의 풀을 수지 상으로 2mL/분으로 적재한다. 단백질을 동일한 완충액으로 용리한다.

그 다음, 단백질을 완충액 Tris 20mM pH7,5, NaCl 150mM, SDS 1,5%, DTT 10mM으로 평형화된 Superdex 200 겔 여과 (Amersham Bioscience) 상으로 1mL/min으로 적재한다. 단백질을 동일한 완충액을 이용하여 용리한다.

내독소 제거:

Acticlean 컬럼(Amersham Bioscience, 8mL 수지)을 이용하여 정제를 수행한다. 완충액 Tris 20mM pH7,5, NaCl 150mM, SDS 1,5%, DTT 10mM으로 평형화한 후, 상기 수지 상으로 풀을 1mL/분으로 적재한다. 단백질을 동일한 완충액으로 용리한다.

배치의 품질 조절

- 질량분석기 MALDI-TOFF: SDS 때문에 사용할 수 없음.

- N-말단 시퀀싱: ALPYXTFLFT

- 내독소 분석: < 5 UE/mL

배치 특성:

겉보기 용해도: 100%

순도: > 90%

농도: 0,05 mg/ml

저장: -80℃

양: 1,5 mg

완충액: Tris 20mM pH 7,5, NaCl 150mM, SDS 1,5%, DTT10mM

실시예 3 : MSRV ENV 항원에 특이적인 리간드 결합 활성의 실험실 내 증거

I- 목적

면역분석 기법 (ELISA)에 의하여 VH+VL 서열로부터 클로닝된 ScFv 재조합 단백질 형태 하에, 또는 본래 쥐 GNbAC1로부터 절개된 Fab 단편 형태 하에 (쥐 항체 기능 및 구조가 결핍된 절개된 VH+VL 사슬을 함유함) 재조합 안티-리간드에 대한 리간드의 친화성을 평가하였다. 상기 리간드를 본래 쥐 GNbAC1 및 상기 리간드를 인간 IgG1 또는 IgG4 고정 사슬 내에 삽입한 분자 구조물 및 약리학적 벡터로 사용을 위한 적절한 서열과 비교하였다.

II - 재료 및 방법

a) VH 및 VL 클로닝 :

GNb AC1 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) 가변 영역의 클로닝 및 뉴클레오티드 시퀀싱

Poly(A+) RNAs를 mRNA 정제 키트 (Amersham Bioscience)를 이용하여 제조업자 지시에 따라 GNb AC1 항체를 생산하는 5x10⁷ 하이브리도마 세포로부터 정제하였다. 역전사를 RT-PCR 키트 (Amersham Bioscience)를 이용하여 제조업자 지시에 따라 800 ng mRNA로부터 수행하였다.

경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH)의 가변영역 서열을 인코딩하는 cDNA를 이전에 기재된 바와 같이 (Ruberti et al ., 1994, The use of the RACE method to clone hybridoma cDNA when V region primers fail. J. Immunol . Methods 173, 33-39). Forward primer was the following: RACE aller, (SEQ ID No. 21). cDNA ends (RACE) 의 신속 증폭 방법을 이용하여 얻었다. 정방향 프라이머는 다음과 같았다: RACE aller, (SEQ ID No. 21). 역방향 프라이머는 다음과 같았다: VL 증폭을 위하여 CL_Ala130_retour (SEQ ID No. 25), 및 VH 증폭을 위하여 CH1_Pro119_retour (SEQ ID No. 26), 문자 코드 R = A/G, K = G/T, H = A/T/C. Kabat et al. (1991) (Sequences of proteins of immunological interest. National Institute of Health Bethesda, MD)에 의하여 공표된 일치 서열로부터 추론된 역방향 프라이머 CL_Ala130_retour 및 CH1_Pro119_retour는 마우스 kappa/CL 도메인 및 IgG/CH1 도메인 각각의 N-말단 끝에 특이적이다.

b) ScFv 구조 및 발현:

ScFV를 "Mallano A, et al. 2008, Generation and characterization of a human single-chain fragment variable (scFv) antibody against cytosine deaminase from Yeast. M. BMC Biotechnol. Sep 10;8:68"에 기재된 기법에 따라 수득하였다.

c) GNb AC1 항체로부터 Fab

Fab을 "Lefranc G, Lefranc MP. Antibody engineering and perspectives in therapy.Biochimie. 1990 Sep;72(9):639-51"에 기재된 기법에 따라 수득하였다.

II -1 재료

II -1a 단일클론 항체

리간드, 인간 IgG 분자 구조물 또는 GNbAC1를 생산하고 다음 농도로 정제하였다:

표 1: 상이한 리간드, ScFV, Fab 및 항체의 농도

II -1b 재조합 단백질

MSRV 완전 ENV 단백질 (ENV-T) 및 표면 도메인 단편 (ENV-SU 재조합 단백질) 모두를 E. Coli 내에서 단백질 전문가에 의하여 생산하고 실시예 2에 기재된 바와 같이 추가로 정제하였다.

표 2: 재조합 단백질의 농도

II -1c 샌드위치 ELISA

- 마이크로웰을 50mM 중탄산나트륨, pH 9.6 내에 희석된 안티-ENV 캡쳐 항체로 (3C1D5, bioMerieux 제공) 웰 당 100㎕ 코팅하였다. 플레이트를 밀봉하고 4℃에서 하룻밤 방치하였다.

- 마이크로웰을 웰 당 250㎕의 PBST 0.05% (0.05% 의 Tween20 과 인산 완충식염 용액; Sigma P7949)로 3회 세척하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 뒤집고 흡수지 상에 블롯팅하여 잔류 완충액을 제거하였다.

- 웰 당 200㎕의 PBST 0.05% + 5% 우유를 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 AT에서 1 시간 가볍게 교반하면서 인큐베이션하였다.

- 마이크로웰을 웰 당 250㎕의 PBST 0.05%로 3회 세척하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 뒤집고 흡수지 상에 블롯팅하여 잔류 완충액을 제거하였다.

- 마이크로웰을 PBST 0.05% 내에 희석된 ENV 항원 (ENV-T 또는 ENV-SU) 웰 당 100㎕로 인큐베이션하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 2 시간 동안 가볍게 교반하면서 인큐베이션하였다

- PBST 0.05% + 5% 우유 내에 희석된 검출 항체 (GNbAC1 또는 재조합 단편 ScFv)를 웰 당 100㎕ 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1 시간 동안 가볍게 교반하면서 인큐베이션하였다. GNbAC1를 Squarix, Germany에 의하여 퍼옥시다아제 표지 및 ScFv 비오틴 표지하였다.

- 마이크로웰을 웰 당 250㎕의 PBST 0.05%로 4회 세척하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 뒤집고 흡수지 상에 블롯팅하여 잔류 완충액을 제거하였다.

- 기질 용액(0.05M 시트르산 인산염 완충액 pH5 + 10ml H₂O₂　30% 내에 희석된 1 타블렛의 o-페닐렌디아민 (OPD), 마지막에 제조됨)을 웰 당 100㎕ 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 30분간 어두운 곳에서 인큐베이션하였다.

- 웰 당 50㎕의 정지 용액 2N H₂SO₄을 추가하였다.

- 정지 반응 30분 이내에 490nm에서 흡수율을 판독하였다.

II -1d ENV 항원 (상기한 바와 같은 ENV -T 또는 ENV - SU )으로 코팅된 마이크로플레이트 상에 직접 ELISA

- 마이크로웰을 50mM 중탄산나트륨, pH 9.6 내에 희석된 ENV 항원으로 웰 당 100㎕ 코팅하였다. 플레이트를 밀봉하고 37℃에서 2 시간 동안 가볍게 교반하면서 인큐베이션하였다.

- 마이크로웰을 웰 당 250㎕의 PBS (인산 완충 용액)으로 4회 세척하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 뒤집고 흡수지 상에 블롯팅하여 잔류 완충액을 제거하였다.

- PBS 0.05% + BSA 1% (1% 소혈청알부민과 PBS) 내에 희석된 본 발명에 따르는 검출 항체(GNbAC1 또는 재조합 Fab 단편)를 웰 당 100㎕ 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1 시간 동안 가볍게 교반하면서 인큐베이션하였다.

- 마이크로웰을 웰 당 250㎕의 PBS로 4회 세척하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 뒤집고 흡수지 상에 블롯팅하여 잔류 완충액을 제거하였다.

- PBS + BSA 1% (안티 IgG Jackson - 1/250 희석; IgG 항 인간 perox Jackson 115-035-146 또는, IgG 안티 마우스 perox Jackson 115-035-062, 1차 항체에 적합) 내에 희석된 2차 검출 항체를 웰 당 100㎕ 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 1 시간 동안 가볍게 교반하면서 인큐베이션하였다.

- 마이크로웰을 웰 당 250㎕의 PBS로 6회 세척하였다. 최종 세척 후, 플레이트를 뒤집고 흡수지 상에 블롯팅하여 잔류 완충액을 제거하였다.

- 웰 당 100 ㎕의 기질 용액 (10ml의 0.05M 시트르산 인산염 완충액 pH5 + 10ml H2O2　30% 내에 희석된 1 타블렛의 o-페닐렌디아민, 최종 순간에 제조됨)을 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 30분간 어두운 곳에서 인큐베이션하였다.

- 웰 당 50㎕의 정지 용액 2N H₂SO₄을 첨가하였다.

- 정지 반응 30분 이내에 490nm에서 흡수율을 판독하였다.

III - 결과

III -1 샌드위치 ELISA : 쥐 IgG1 ( GNbAC1 ) 및 ScFv

표 3 : 코팅 항체 대 각각의 농도의 항원 또는 대조군 완충액에 대한 퍼옥시다아제 또는 비오틴 검출 리간드의 농도.

결과는 측정된 광학 밀도에 상응한다. PBST : 0.05% Tween 20과 인산 완충 용액.

ScFv 및 본래 GNbAC1과 함께 수행된 ELISA 결과를 도 3에 상이한 조건과 함께 제시한다.

코팅 항체 및 검출 리간드의 각각 5㎍/ml였으며; 스트렙트아비딘-퍼옥시다아제 컨쥬게이트 희석은 1/2000였다.

ENV-SU 및 ENV-T 재조합 단백질에 대하여 샌드위치 ELISA로 검출 리간드로 GNbAC1 및 재조합 ScFv를 분석하였다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, IgG가 2가이고 ScFv가 1가인 경우, 동일 농도에서, ScFv에 대하여 IgG의 절반에 걸친 OD로 MAb 및 ScFv는 ENV 단백질을 검출할 수 있다. 따라서, 분자 당 결합 부위 수에 비하여, 분리된 리간드는 완전한 쥐 IgG 보다 나은 결과를 얻었다. 따라서, 항체 기능이 요구되지 않으며 이와 같은 분리된 리간드를 이용한 개선된 결과는 예기치 않은 것이었다.

III -2 직접 ELISA : GNb Ac1 및 Fab

표 4: 코팅 항체 대 각각의 농도의 항원 또는 대조군 완충액에 대한 퍼옥시다아제 표지 검출 리간드(직접 표지)의 농도. 결과는 측정되는 광학 밀도에 상응한다. NA : 적용 불가능한 측정 (기술적으로 곤란함).

ENV-T 재조합 단백질에 대하여 샌드위치 ELISA로 검출 리간드로서 쥐 IgG1 및 그 IgG1 단편을 분석하였다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 동일 농도에서, 1가 Fab는 2가 IgG와 동등하거나 우수한 광학 밀도로 ENV 단백질을 검출한다. 여기서도, 놀랍게도 분리된 리간드가 완전한 IgG 보다 나은 결과를 보임을 알 수 있다.

따라서, 항체 기능이 요구되지 않으며 리간드 자체가 "천연" 쥐 IgG 보다 효율적이라는 결론을 반복하여 내릴 수 있다.

실시예 4: 인간 IgG1 및 IgG4 불변 사슬 및 리간드를 포함하는 분자 구조물의 디자인, 구조 및 실험실 내 분석

천연 (Fab) 또는 재조합 (ScFv) VH 및 VL 서열을 가지는 1가 결합 부위를 포함하는 분리된 리간드의 예기치 않은 개선된 성능을 표적 항원의 면역분석 검출에서 입증한 후, 상기 리간드 서열 (VH+VL)을 포함하는 키메릭 인간 IgG1 또는 IgG4 분자의 생산을 위한 재조합 서열을 디자인 및 작제하였다. 따라서, 상기 리간드를 위한 분자 벡터로서 완전한 항체를 생산하고, 본래 쥐 IgG와 비교하여 면역분석에 의하여 이를 평가하였다.

상기 리간드가 삽입된 재조합 항체 벡터를 생산하기 위하여, CHO 세포 내에 발현을 위하여 클론을 적용하고 항체를 생산하고 "Polymmum", Vienna, Austria 에 의하여 정제하였다. 적절한 벡터를 이용한 항체의 생산을 위한 기술적 조건을 이하 요약한다:

재조합 CHO 세포주 GNbAC1_IgG1 및 GNbAC1_IgG4의 확립

불변 영역이 인간이고 가변 영역이 SEQ ID No.8 및 SEQ ID No.7에 각각 기재한 바와 같은 본래 VH 및 VL 서열인, 키메릭 인간/쥐 IgG1 및 IgG4로서 재조합에 의하여 발현되는 재조합 모노클론 항체 GNb AC1의 유전자 급원에 대하여 기재한다.

발현 플라스미드

키메릭 GNb AC1 IgG1 경쇄 (LC)

근본적으로, 발현 플라스미드는 상업적으로 유용한 pCIneo (Promega)로, 이는 제1 단계에서 시퀀싱된 이뮤노글로뷸린 카파 시그널 및 임의의 가변 경쇄 영역을 삽입하기 위한 중간 제한 부위를 가지는 인간 c-kappa-불변 영역을 포함하는 코돈 최적화된 (GENEART에 의하여 디자인된 CHO 세포 내 발현을 위한 코든 사용의 최적화, mRNA 구조의 최적화 또한 포함) 인간 kappa 경쇄 백본을 삽입하는데에 사용되었다. VL (SEQ ID No.7)의 1차 서열에 따라, 시그널 서열의 3 말단 내에 및 kappa 경쇄 영역의 5' 부위 내에 최적화된 가변 영역 -VL 코돈- (SEQ ID No.27)을 CMV 프로모터 조절하에 상기 코돈 최적화된 인간 kappa 경쇄 백본 -IgG1L 코돈- 을 운반하는 BsiWI und AccIII 개방된 진핵세포 발현 벡터 내로 삽입하기 위한 제한 부위를 포함하는, 합성 뉴클레오티드 삽입물을 GENEART AG (Regensburg, Germany)에서 합성하였다. 부가적으로, 상기 벡터는 G418을 가지는 CHO 세포 선별을 위한 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제를 함유한다. SEQ ID No.28은 CHO 세포 내로 발현을 위하여 사용되는 최적화된 "IgG1L 코돈 및 VL 코돈"을 연결하는 구조물의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

키메릭 GNb AC1 IgG1 중쇄 (HC)

GNb AC1 IgG1 진핵세포 발현 벡터 생산을 위한 클로닝 벡터는 동일한 조절 영역을 가지는 두 개의 진핵세포 발현 카세트로 이루어진다. 상기 벡터는 이미 이뮤노글로뷸린 중쇄의 시그널 영역 및 임의의 가변 중쇄 영역을 삽입하기 위한 중간 제한 부위를 가지는 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는 코든 최적화된 (GENEART에 의하여 디자인된 CHO 세포 내 발현을 위한 코든 사용의 최적화, mRNA 구조의 최적화 또한 포함) 인간 IgG1 백본을 포함한다.

마우스 모노클론 항체 GNb AC1의 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열 정보는 SEQ ID No. 8에 제시된다. 1차 서열에 따라, 시그널 서열의 3 말단 내에 및 감마 체인 CH1 영역의 5 부위 내에, 최적화된 가변 중쇄 영역 (SEQ ID No.29) -VH 코돈-을 SV40 프로모터의 조절 하에 코돈 최적화된 인간 IgG1을 운반하는 AgeI und NheI 개방된 진핵세포 발현 벡터 내로 삽입하기 위한 제한 부위를 포함하는 합성 뉴클레오티드 삽입물을 GENEART에서 합성하였다. 부가적으로, 상기 벡터는 동물 세포 배양에서 선별/증폭 마커로 사용하기 위한 2차 발현 카세트로서 마우스 디하이드로폴레이트 리덕테이즈를 함유한다. SEQ ID No.30은 CHO 세포 내로 발현을 위하여 사용되는 최적화된 인간 IgG1H-백본 코돈 및 최적화된 VH 코돈을 연결하는 구조물의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

키메릭 GNb AC1 IgG4 중쇄 (HC)

GNb AC1 IgG4 진핵세포 발현 벡터 생산을 위한 클로닝 벡터는 동일한 조절 영역을 가지는 두 개의 발현 카세트로 이루어지며 IgG1 구조물에 대한 것과 동일하다.

그러나, 인간 IgG4 불변 영역이 이용가능하지 않으므로, 시그널 서열, 마우스 GNb AC1 가변 중쇄 (VH) 영역 및 인간 IgG4 불변 영역을 포함하는 전체 중쇄를 GENEART에 의하여 합성하였다.

SEQ ID No. 31은 키메릭 GNb AC1 IgG4 최적화된 중쇄 (IgG4H 코돈)의 코딩 영역의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 그 다음, 삽입물을 NotI und SacII 개방 진핵세포 발현 벡터 내로 도입하여, CHO 세포 내로 발현을 위하여 사용되는 최적화된 VH 코돈과 최적화된 IgG4H 코돈과을 연결하는 SEQ ID No.32에 도시되는 구조물을 생산하였다.

모든 플라스미드를 GENEART에서 클로닝한 다음, E. coli 균주 TOP10 내로 형질전화하였다. 재조합 박테리아를 50 ml LB/Amp-배지 내에서 증식시켰으며, 플라스미드를 Promega PureYield Plasmid Midiprep Systems을 이용하여 분리하였다. 플라스미드의 수율 및 순도를 측광학적으로 조절하였으며, 260 nm 및 280 nm에서 광학 밀도 지수는 적어도 1.5로 결정되었다.

재조합 CHO 세포주 GNb AC1_IgG1 및 GNb AC1_IgG4의 확립

형질감염 절차

디하이드로폴레이트 리덕테이즈 결핍 중국 햄스터 난소 세포 (CHO dhfr-, ATCC no. CRL 9096로 언급)를 최종 발현주 새산을 위한 모 세포주로 선택하였다. American Type Culture Collection (ATCC)로부터 유래한 상기 세포들을 4 mM L-글루타민, 0.1 mM 하이포크산틴, 0.016 mM 티미딘 (HT), 0.25 g/l 소이 펩톤, 0.1% 플루로닉 F-68 및 무단백질 보충물 (Polymun Scientific)로 보충된 DMEM으로 이루어지는 "배양 배지" 내에서 1:6 분열비로 일주일에 2회 증식시켰다.

기본 배지로 1회 세척하고 10 ml 완전 배지 내에 재현탁시킨 5 x 10⁶ 세포를 형질감염에 사용하였다. 900㎕의 폴리에틸렌이민 (1 mg/ml PEI 선형, MW: 25,000, Polysciences Inc.)을 12㎍ HC and 12㎍ LC 플라스미드를 이용하여 총 부피 2 ml로 실온에서 30 분 동안 인큐베이션하여 폴리플렉스를 형성하였다. 12ml 내 폴리플렉스의 CHO 세포와의 상호작용을 4 시간 지속하고 170g에서 원심분리하여 상청액을 폐기하고 세포를 "배양 배지" 내에 재현탁하였다. 24 시간 후, 완전 배지를 4 mM L-글루타민, 0.25 g/l 소이 펩톤, 0.1 % Pluronic F-68, 무단백질 보충물 (Polymun Scientific) 및 0.5 ㎍/ml G418로 보충된 DMEM으로 이루어진 선택 배지 50 ml 선택 배지로 교체하였다. 세포 현탁액 100㎕를 다섯 개의 96-웰 플레이트 내에 웰 당 시딩하였다. 4회의 형질감염 실험 (키메릭 GNbAC1-IgG1을 위하여 "IgG4H 코돈 + VL 코돈"으로 동시-형질감염된 "IgG1H 코돈 + VH 코돈" 구조물; 키메릭 GNbAC1-IgG4를 위하여 "IgG1L 코돈 + VL 코돈" 구조물로 동시-형질감염된 "IgG4H 코돈 + VH 코돈" 구조물)은 IgG 서브타입 당 총 20x 96 웰 플레이트 (1920 웰에 해당)을 생산하였다.

10 내지 14 일 후, 형성된 클론에 선택 배지 내에 0.048 μM MTX로 이루어진 "증폭 배지"를 100㎕를 공급하였다. 성장하는 클론에 0.048 μM MTX를 함유하는 다른 증폭 배지 100㎕를 공급한 후, 이중 샌드위치 ELISA로 분석하였다. ELISA는 코팅을 위한 안티-인간 감마 특이적 다중클론 혈청 및 검출을 위한 안티-인간 kappa 사슬 HRP 커플링된 다중클론 항체를 이용하였다.

선별된 높은 생산자 클론을 선택 배지 내 0.19 μM MTX에 적응시켰다.

표 5는 T25 Roux 플라스크 및 스피너 용기 내에서 0.096 및 0.19 μM MTX에서 GNb AC1 IgG1 및 GNb AC1 IgG4의 최상의 생산자 선택에 대하여 기재한다.

GNb AC1_IgG1의 경우 6B6을 클로닝하고, GNb AC1_IgG4의 경우 7C1을 클로닝하기로 결정하였다. GNb AC1_IgG1의 경우 세 개의 클론 GNb AC1_IgG1_6B6, GNb AC1_IgG1_8H2 및 GNb AC1_IgG1_18A8의 냉동 보존 및 GNb AC1-IgG4의 경우 두 개의 클론 GNb AC1_IgG4_6C1 및 GNb AC1_IgG4_7C1의 냉동 보존을 행하였다. 예를 들어 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Third Edition) Joseph Sambrook, Peter MacCallum Cancer Institute, Melbourne, Australia; David Russell, Cold Spring Harbour Laboratory Books"에 기재된 바와 같이 희석 방법을 제한함으로써 최상의 클론을 서브클로닝하였다.

최상의 생산 형질감염체 GNb AC1_IgG1_6B6 및 GNb AC1_IgG4_7C1의 서브클로닝

웰 당 90, 30 및 10 세포를 구비한 96-웰 플레이트 내에서, GNb AC1_IgG1_6B6의 경우, 0.19 μM 메토트렉세이트 (Sigma, MTX) 및 0.2 ㎛ 여과된 50 % GNb AC1_IgG1 _6B6 배양 상등액을 구비하는 증폭 배지 내에서, GNb AC1_IgG4_7C1의 경우 0.19 μM MTX 및 0.2 ㎛ 여과된 50% GNb AC1_IgG4_7C1 배양 상등액을 구비하는 증폭 배지 내에서 서브클로닝을 수행하였다. 성장하는 웰을 96-웰 플레이트 내에서 0.38 μM MTX에 적응시키고, ELISA에 의해 분석하고, 추가적인 스크리닝 및 0.77 μM MTX에의 적응을 위하여 T25 플라스크 내에서 증식시켰다.

표 6은 T25 Roux 플라스크 및 스피너 용기 내에서 0.77 μM MTX에서 GNb AC1 IgG1_6B6 - 및 GNb AC1 IgG4_7C1 - 서브클론의 최상의 생산자 선별에 대하여 기재한다.

GNb AC1_IgG1_6B6의 경우 최상의 생산자는 클론 GNb AC1_IgG1_6B6_10E4이었고, GNb AC1_IgG4_7C1의 경우 클론 GNb AC1_IgG4_7C1_15B7이었다. 이들 두 클론을 추가적인 세포주 개발을 위하여 선택하였다.

두 개의 GNb AC1-IgG1 클론: GNb AC1-IgG1_6B6_1D1, GNb AC1_IgG1_6B6_10E4 및 두 개의 GNb AC1-IgG4 클론: GNb AC1-IgG4_7C1_3E11, GNb AC1-IgG4_7C1_15B7의 냉동 보존을 행하였다.

최상의 생산 서브클론 GNb AC1-IgG1_6B6_10E4 및 GNb AC1-IgG4_7C1_15B7의 서브클로닝

웰 당 90, 30 및 10 세포를 구비한 96-웰 플레이트 내에서, GNb AC1_IgG1_6B6_10E4의 경우, 0.77 μM MTX 및 0.2 ㎛ 여과된 50 % GNb AC1_IgG1 _6B6_10E4 배양 상등액을 구비하는 증폭 배지 내에서, GNb AC1_IgG4_7C1_15B7의 경우 0.77 μM MTX 및 0.2 ㎛ 여과된 50% GNb AC1_IgG4_7C1_15B7 배양 상등액을 구비하는 증폭 배지 내에서 추가적인 서브클로닝을 수행하였다. 성장하는 웰을 ELISA에 의해 분석하고, 최상의 생산자를 추가적인 스크리닝을 위하여 T25 플라스크 및 스피너 플라스크 (Sp125)로 증식시켰다.

표 7은 T25 Roux 플라스크 및 스피너 플라스크 내에서 0.77 μM MTX에서 GNb AC1 IgG1_6B6_10E4 - 및 GNb AC1 IgG4_7C1_15B7 - 서브클론의 최상의 생산자의 선별에 대하여 기재한다.

GNb AC1_IgG1의 경우 두 개의 클론 GNb AC1_IgG1_6B6_10E4_18C7 및 GNb AC1_IgG1_6B6_10E4_18D12, GNb AC1_IgG4의 경우 두 개의 클론 GNb AC1_IgG4_7C1_15B7_3E4 및 GNb AC1_IgG4_7C1_15B7_5G10을 스피너 배양 후 냉동 보존하였다.

표 5: 형질감염 및 상이한 수준의 MTX에 적응 후 선별된 웰

GNb AC1-IgG1:0.096 μM MTX:

* 피코그램/세포

GNb AC1-IgG4: 0.096 μM MTX:

표 6: 0.77μM MTX에서 첫번째 서브클로닝 후 선별된 서브클론

GNb AC1-IgG1:

표 7: 0.77μM MTX에서 두번째 (최종) 서브클로닝 후 선별된 서브클론:

GNb AC1-IgG1:

이와 같이, 실시예 1에 기재된 바와 같은 여섯 개의 CDR 서열을 포함하는 리간드가 삽입된 재조합 IgG1 및 IgG4 항체 벡터를 생산하였다. 상기 여섯 개의 CDRs을 포함하는 벡터를 하기 실시예에서 분석하여, 벡터의 긍정적 및 부정적 영향을 판단하고 따라서 이들 각각의 선별 및/또는 적절한 용도를 제안한다.

실시예 5: 리간드 및 인간 IgG1 및 IgG4 키메릭 구조물, 대 본래 쥐 IgG1 의 연구: 실험실 내 친화성

재료 및 방법은 실시예 3 및 4에 기재된 바와 동일하였다.

5a. 상이한 농도의 MSRV - ENV 완전 단백질 ( ENV -T)을 이용한 ELISA

표 8 : 마이크로티터 플레이트 웰 상으로 코팅된 상이한 농도 (좌측 컬럼 , ㎍)의 안티- 리간드 ( ENV -T) 상에서 상이한 리간드 (1 ㎍) 또는 부적합한 대조군 (2 G5E12 )으로 ELISA 에 의하여 측정된 광학밀도 ( OD ). 퍼옥시다아제 표지된 안티 - lg 항체 (1/250; Jacksone - USA ) 및 퍼옥시다아제 기질 반응으로 결합이 밝혀진다. 부적합한 대조군으로부터의 모든 OD 의 평균값은 0.1004이며, 그 표준 편차( SD )는 0.0205이므로, 그 이하의 모든 값이 99% 신뢰 구간으로 비-특이적인 컷오프 값을 결정할 수 있다: 평균+ 3* SD = 0.1618. 따라서 GNb AC1 구조물을 이용하여 제시된 모든 값은 표적 단백질에 특이적 결합에 있어서 유의하다.

항체 GNbAC1 및 검출 항체로서 키메릭 버젼 IgG1 및 IgG4을 ENV 재조합 단백질에 대한 샌드위치 ELISA로 분석하였다. 도 5 및 표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 동일 농도에서, 쥐 및 키메릭 MAbs는 해당 농도의 ENV 단백질을 유사한 역학으로 검출할 수 있다. 새로운 구조물 (인간 벡터 내 리간드)의 특이성 및 상대적 친화성이 따라서 유지되며, 리간드를 가지는 인간 IgG1 및 IgG4 구조물 모두 재조합 ENV 단백질의 피코그램을 검출할 수 있는 인간 키메릭 항체를 제공하였다. 이는 놀랍게도 우수하며, 그 전체 디자인, 구조 및 발현 조건을 통하여 얻어지는 최적화를 확인한다. 이는 또한 실시예 1에 기재된 바와 같은 안정하고 강한 리간드 구조의 선별을 입증한다.

또한, 이는 본원에서 리간드 (GNb AC1) 대 부적절한 "비-결합" 리간드 (2G5E12)을 이용하여 입증되는 바와 같이, 본래 안티-리간드 (ENV) 사이의 그들의 결합의 유의성을 통하여 리간드와 동등한 분자를 동정하는 수단을 제공한다:

Env-T 항원을 1 mg/ml으로부터 약 0.01 mg/ml 범위로 연속 희석하면서 마이크로티터 ELISA 플레이트 웰 상으로 코팅한다.

참조 리간드 (GNbAC1) 및 부적합한 리간드 (2G5E12)를 1 mg/ml에서 시험하고, 2차 항체를 이용하여 밝힌다 (Jackson Ltd, USA로부터 1/250 희석된 안티-IgG 퍼옥시다아제-표지 2차 항체, 이하 안티 마우스 IgG (H+L) Jackson 또는 안티 인간 IgG:Jackson, USA 로 언급함).

참고 리간드 곡선은 최고 ENV 농도에서 시그널 포화 (3과 동등하거나 그보다 우수한 광학 밀도)를 보이며, 약 1.0-0.5의 광학 밀도로 점진적으로 감소되며, 따라서 특이적 결합 활성에 전형적인 투여량-반응 곡선을 입증한다 (계산된 통계학적 컷오프 값 0.1618 이상: 표 8 참조). 동시에, 부적합한 분자 (2G5E12)는 투여량-반응 곡선을 나타내지 않으며 (편평한 평균 곡선), 임의의 ENV 농도에서 0.1 및 0.05의 광학 밀도 사이에서 오간다 (계산된 통계학적 컷오프 값 0.1618 이하, 표 8 참조).

따라서, 리간드와 동등한 임의의 분자를 다음에 의하여 입증할 수 있다

1) 문단 5a에 기재한 바와 같은 실시예의 조건을 이용한 시험에서 투여량-반응-곡선의 존재, 및

2) 0.01 ㎍의 ENV 농도에 대하여 참조 GNbAC1를 이용하여 얻은 통계학적 컷오프 위의 값과 비교하여 (표 8 참조), 부적합한 항체 (Cf. 표 8의 2G5E12)를 이용하여 얻은 광학 밀도 값으로부터 계산된 통계학적 컷오프 (평균 + 표준 편차 3배) 이하에서 왔다 갔다 하는 편평한 곡선의 부재; 또는

3) 문단 5b의 (표 9) 리간드 연속 희석 및 고정된 안티-리간드 농도를 이용한 이하 기재되는 바와 같은 시험에서 투여량-반응-곡선의 존재, 및

4) 문단 5b에 기재된 바와 동일한 조건으로 (표 9 참조), 0.01 ㎍/ml의 농도에서 해당 참조 GNbAC1를 이용하여 얻은 통계학적 컷오프 위의 값과 비교하여, 부적합한 항체 (Cf. 표 9의 2G5E12)를 이용하여 얻은 광학 밀도 값으로부터 계산된 통계학적 컷오프 (평균 + 표준 편차 3배) 이하에서 왔다 갔다 하는 편평한 곡선의 부재.

5b. 상이한 MAbs 농도를 이용한 ELISA

표 9. 마이크로티터 플레이트 웰 상으로 코팅된 리간드 및 고정된 안티 - 리간드 농도 ( ENV -T; 0.01 ㎍)를 연속 희석하면서 ELISA 에 의하여 측정된 광학 밀도. 퍼옥시다아제 표지 안티 - IgG 항체 (1/250; Jackson - USA ) 및 퍼옥시다아제 기질 반응으로 결합이 밝혀진다.

항-마우스 2차 항체 검출을 이용한, 부적합한 대조군으로부터의 모든 OD의 평균 값은 0.0735이고, 그 표준 편차 (SD)는 0.0057이며, 따라서 그 이하의 모든 값이 99% 신뢰 구간으로 비-특이적인 컷오프 값을 결정할 수 있다: 평균 + 3*SD = 0.0907. 해당하는 쥐 GNb AC1으로 제시된 모든 값은 따라서 표적 단백질에의 특이적 결합에 있어서 유의하다.

안티-인간 2차 항체 검출을 이용한, 부적합한 대조군으로부터의 모든 OD의 평균 값은 0.0513이고, 그 표준 편차 (SD)는 0.0094이며, 따라서 그 이하의 모든 값이 99% 신뢰 구간으로 비-특이적인 컷오프 값을 결정할 수 있다: 평균 + 3*SD = 0.0796. GNb AC1 키메릭 구조물로 제시된 모든 값은 따라서 표적 단백질에의 특이적 결합에 있어서 유의하다.

도 6에서, 몇 나노그램 미만의 ENV 단백질을 검출하기 위한 몇 나노그램의 적은 정제된 IgG의 양으로, 쥐 IgG 항체 GNbAC1 및 키메릭 버젼 IgG1 및 IgG4 모두 ENV-T 재조합 단백질에 대한 샌드위치 ELISA에서 검출 항체로서 효율적임을 알 수 있다.

또한, 안티-인간 또는 마우스 IgG는 본래 쥐 항체 또는 인간 IgG1 또는 IgG4 백본을 가지는 키메릭 구조물과 교차 반응하지 않으므로, 삽입된 리간드 (VH+VL)는 원치 않은 변형을 창출하지 않았으며 이러한 조건에서 인간 구조물 내에서 검출되지 않는다.

5c: GNbAC1 의 ENV -T에의 친화성

표 10: IgG4 및 IgG1 항체 벡터 내에 삽입된 리간드의 결합 친화성 결정 (단위는 표에 나타냄)

5d: GNbAC1 등전점

GNbAC1 등전점을 << Fractionation of complex protein mixtures by liquid-phase isoelectric focusing. Hey J, Posch A, Cohen A, Liu N, Harbers A. Methods Mol Biol. 2008;424:225-39 >> 에 기재된 기법에 따라 결정하였다.

구조물 IgG1의 등전점 (pI 8.3) 및 IgG4의 등전점 (pI 7.53)은 매우 유용하며 치료적 용도를 위한 안정성 및 저장 조건을 결정할 것이다. 상기 IgG4의 중성 pI는 따라서 규칙적으로 반복되는 주입을 이용한 만성 처리일 수 있는 치료적 MAb의 제제화를 위하여 더 나을 것이다. 따라서, 상기 IgG4는 이러한 관점에서 유리한 구조물이다.

실시예 6: 본 발명의 리간드 및 그 인간 IgG1 및 IgG4 구조물, 대 GNbAC1 의 연구: 인간 말초 혈액 단핵 세포 ( PBMC ) 배양액 내에 전구염증성 사이토카인에 대한 억제 활성

재료 및 방법:

배지

PBMCs를 RPMI Glutamax (Gibco) + 10%FBS (Biowest S1810 South America) + 1% 비필수 아미노산 + 1% 피루베이트 + 1% 페니실린-스트렙토마이신 내에서 37℃에서 6.5% CO₂ 하에 배양하였다.

연막으로부터 PBMCs 제조

연막은 HUG에 의하여 제공된다.

PBS-FBS 2% (4ml + 31ml)로 희석한 혈액을 15ml의 Ficoll 상에 부드럽게 올리고 2850rpm (1650g) / 20 분/ 실온 / 중단 없이 원심분리한다.

그 다음, 세포를 계수하고 SVF 90% + DMSO 10% 내에 동결한다.

동결된 세포로부터 PBMCs 제조

- -80℃로 유지한 PBMCs를 37℃로 해동하고, 배지로 3회 세척하고, 1500 rpm / 10분 원심분리한다.

- 그 다음, 세포를 계수하고 대개 1x10⁶ 세포/ml의 농도로 희석한다.

억제 시험

- PBMCs를 해동하기 전에 ENV + MAbs 혼합물을 제조한다. 상기 MAbs (ENV로 선택된 비율) + ENV (선택된 농도)를 100ul의 배지 내에서 48 웰 플레이트의 각각의 웰 내에서 혼합하고, +4℃에서 1 시간 인큐베이션한다.

- 그 다음, PBMCs를 최종 농도 1x10⁶세포/ml (웰 당 0.5ml 또는 1ml 최종)로 각각의 웰 내에 첨가한다.

- 상기 세포를 37℃, 5% CO₂에서 24, 48 또는 72시간 인큐베이션한다.

- 1400rpm/10분/RT에서 원심분리하여 상등액을 수집하고 -20℃로 유지한다.

II -2d 사이토카인 투여량

IL-6, IL-12p40, TNF-α 및 IFN-γ에 대하여 BD Pharmingen ELISA 세트를 이용하여 사이토카인을 투여한다. 공급자 프로토콜은 다음과 같다.

표 11 : 상이한 리간드와 함께 또는 없이 상이한 PBMC (말초 혈액 단핵세포 ) 배양 상등액 내 사이토카인 투여량

PBMCs 상에서 세포 시험을 이용하여 항체 또는 ScFv가 (TLR4 수용체를 경유하여) ENV 단백질과 세포 간의 상호작용을 억제하는 성능 및 따라서 IL-6 (선천적 면역) 및 IFN-γ (T-림프구 중재 면역)과 같은 전구염증성 사이토카인의 생산을 시험하였다. 단백질과의 동일한 비율 (몰/몰) (25/1)에서 상이한 분자를 시험하여 그들의 성능을 비교하였다.

도 7 및 표 11에서 알 수 있는 바와 같이, 쥐 또는 재조합 기원 (ScFv 또는 리간드를 가지는 IgG1 및 IgG4 구조물)의 모든 리간드 분자는 PBMCs에 의하여 생산되는 전구염증성 사이토카인 (IL-6)의 감소로 나타내어지는 바와 같이 그들의 억제 특성을 가지며 유지한다.

그럼에도 불구하고, 리간드가 삽입된 GNb AC1 및 재조합 인간 IgG4이 림프구 활성화 (인터페론-감마 생산 감소)에 효율적인 반면, ScFv (아마 1가 이기 때문에) 및 IgG1 인간 구조물은 인터페론 감마 억제에 있어 훨씬 덜 효율적이었다. 여기서, 인간 IgG1 Fc 영역이 인간 면역 세포에 대한 전활성 효과를 가진다는 사실은 이러한 특성이 상기 리간드의 ENV에 의한 이러한 유형의 림프구 활성화에 대한 억제 효과를 상쇄할 수 있음을 분명히 나타낸다. 인간 IgG4 벡터 내 동일한 리간드를 이용하여 (면역학적으로 전활성이 아님), 본래 쥐 IgG 내 2가 리간드의 억제 효과를 나타낸다.

이러한 이유로, 실시예 5.d에 나타난 바와 같이, 항체의 면역 기능이 피해져야 할 때 IgG4는 바람직한 구조물일 것이다. 본원에서 그러한 것으로 나타난 바와 같이, 상기 항체 기능은 억제 효과를 위하여 요구되지 않을 뿐 아니라 (1가 ScFv는 낮은 효율성을 가지므로 2가 리간드가 생산된다는 가정 하에) 상기 리간드의 억제 효과에 유해한 것으로 밝혀졌다.

(단핵구/대식세포 및, 가능하게 또는 B-림프구로부터) IL-6 생산에 대한 효과에 대하여, IgG1 및 IgG4는 인터페론-감마에서 보여진 것과 달리 다소 동등하고 우수한 억제를 나타낸다. 흥미롭게, 1가 ScFv는 이러한 "선천적 면역" 사이토카인의 덜하지만 유의한 억제를 나타낸다. 따라서, 특정 면역 활성은 상기 리간드를 가지지는 IgG1 및 IgG4 인간 벡터 모두에 의하여 잘 억제되나, IgG4가 인간 PBMC로부터의 선천적 면역 (IL-6 결과) 및 후천적 면역 (IFN-감마 결과) 세포 모두의 고유한 억제를 나타낸다. 흥미롭게도, 그럼에도 IgG1 벡터는 선천적 면역 전구염증성 사이토카인 (본원에서 예를 들어 IL-6로 나타내어짐)의 더 강한 억제를 제공하며, 일부 T-세포 클론 (인터페론 감마의 투여량에 의하여 반영됨)을 유발하며 이는 몇몇 항-바이러스 방어 메커니즘에서 유용한 것으로 밝혀질 수 있을 것이다.

따라서, 통상적인 결합 친화성 및 특이성을 가지는 인간 항체 벡터로 이루어지는 약학적 전달 형태 내에 상기 리간드의 높은 친화성 및 생물학적 활성, 그러나 그 이소타입에 따라 다른 면역 효과를 확인한다.

실시예 7 : 표적 ENV 단백질 상에 리간드 결합 부위의 분자적 동정 ( 안티 - 리간드 결합 서열)

본래 쥐 IgG1/kappa (GNb AC1)의 에피토프 매핑을 Pepscan BV., The Netherlands에 의해 달성하였다.

이 결과로부터, 상기 리간드의 결합 부위의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 20에 기재된 서열 내에 포함되는 것으로 확인된다.

상기 서열 내에 포함되는 최상의 표적 에피토프는 완전한 ENV 단백질 (ENV-T) 내에 절개된 SU (ENV1) 도메인의 C-말단 부분 내에 있으며, 보다 구체적으로 SEQ ID No. 32에 기재된 아미노산 선별 서열에 상응한다.

이러한 안티-리간드 서열 (및 그 선별 서열)은 독점적이 아니라 실시예 2에 기재된 MSRV 엔벨로프 단백질 (ENV)의 1차 아미노산 서열 내에 포함된다.

그럼에도 불구하고, 아미노산은 그 기능적 동등물로 치환될 수 있으며 상이한 서열을 가지는 유사한 결합 부위를 제공할 수 있는 것으로 당업자에게 알려져 있다. 또한, 특정 항체에 효율적으로 결합할 수 있는 "MSRV ENV" 미모토프에 대하여 기재되어 있다 (Jolivet-Reynaud, C., H. Perron, et al. 1999. "Specificities of multiple sclerosis cerebrospinal fluid and serum antibodies against mimotopes." Clin Immunol 93;3: 283-93.).

실시예 8: MSRV -관련 질환을 가지는 환자 내에 MSRV - ENV 표적 항원 존재의 증거: 다발성 경화증, 임상적 독립 (신경학적) 증후군 - CIS -, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증 - CIDP -, 정신분열증, 간질의 관련 질환 또는 병리학적 증후군의 예

8a. 다발성 경화증, 임상적 독립 증후군 및 다발신경병증:

재료 및 방법

ENV 항원혈증의 면역투여량

예비 혈청 수집:

본 연구는 University Hospitals of Creteil and Grenoble, France의 윤리 의원회의 인가를 받았다. 신경질환 환자는 두 센터로부터 포함되었다. 모든 환자로부터 서면 동의를 구하였다. 건강한 혈액 기증자를 Grenoble and Montpellier의 수혈 센터로부터 모집하였다. 비-신경질환 대조군을 Grenoble로부터 얻었다. 환자에 대한 임상적 데이터를 결과에 나타낸다. MS 환자 및 건강한 대조군으로부터의 혈청 표본 분취액을 암호화하고, 비색법적 판독 조건을 이용하여 ApoH ELISA로 블라인드 테스트하기 위하여 독립적인 실험실로 보냈다.

유럽 멀티센터 혈청 수집:

본 연구는 독일 University of Wurzburg, 의학부, 이탈리아 Don Gnocchi's Hospital of Milan, 프랑스 Marseille University Hospital, 및 스페인 University of Pamplona의 윤리 의원회의 인가를 받았다. McDonald 기준 (McDonald, Compston et al. 2001)에 따라 확실한 MS를 가지는 74 명의 환자 및 임상적 독립 증후군 (CIS)를 가지는 14 명의 환자가 포함되었다. 상응하는 임상적 및 처리 데이터를 다음의 표 12에 제시한다 (McDonald, Compston et al. 2001). MS 재발의 경우, 스테로이드 처리 시작 전에 혈액 표본을 채취하였다. MS 환자 및 건강한 대조군으로부터의 혈청 표본 분취액을 암호화하고, 발광 판독 조건을 이용하여 ApoH ELISA로 블라인드 테스트하기 위하여 독립적인 실험실로 보내졌다.

표본 수집: 1 튜브 (7ml B&D 건조 튜브)의 혈액을 수집하였다. 이러한 샘플링을 수집 후 2 시간 이내에 처리하였다. 혈액 응고 후, 이들을 14℃에서 2800g으로 10분간 원심 분리하였다. 그 다음, 혈청을 수집하고 에펜도르프 튜브 내에서 250㎕ 분취하였다. 분취액을 -20℃에서 동결 저장하였다.

ApoH-ELISA 면역분석

비색법: ApoH 코팅된 마이크로티터 플레이트 (APOH Technologies, Montpellier, France)에 Tris-HCl 50mM pH 7.6 내에 희석된 혈청 샘플을 적재하고; 상기 플레이트를 37℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션한 다음; 상기 플레이트를 PBS로 4회 세척하고; 정제된 마우스 안티-ENV mAb를 5% BSA를 함유하는 PBS로 10㎍/ml 농도로 희석하고 첨가하였다. 상기 플레이트를 37℃에서 1 시간 인큐베이션한 다음, PBS로 4회 세척하였다. 5% BSA를 함유하는 PBS 내에 1:5000으로 희석된 퍼옥시다아제-표지 양 안티-마우스 IgG (H+L; Sigma)를 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 1 시간 인큐베이션한 다음, PBS로 6회 세척하였다. OPD 기질 용액을 첨가하고, 플레이트를 어두운 곳에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 발색 반응을 2N H₂SO₄로 정지시켰다. 흡수율을 490nm에서 Tecan 판독기로 판독하였다. 이 실험의 통계학적 컷오프 값 (C.O.)을 50 명의 건강한 혈액 기증자 (BD)로부터의 일련의 음성 혈청 상에서 광학 밀도 (OD) 결과로서 개별 혈청으로부터의 삼중의 평균으로 결정하였다. 따라서 C.O.를 통계학적으로 유효한 일련의 음성 대조군으로부터 그들의 평균값 + 표준 편차 세 배 (A+3SD; 양성 유의성 p<0.01)로서 계산하고, 참조 양성 및 음성 표본 패널 상에서 실험적으로 확인하였다. 따라서, 이 실험에서 양성 판단을 위한 신뢰 구간은 99.9%로 나타난다.

발광측정법: Tris-HCl 50mM pH7.6 내에 희석된 표본을 ApoH-코팅된 마이크로플레이트 상에 적재하였다 (APOH Technologies, Montpellier, France). 마이크로플레이트를 37℃에서 1 시간 30분 동안 인큐베이션하고, PBS로 4회 세척하였다. 정제된 마우스 항-ENV mAb (PBS-BSA 5% 내 1 ㎍/ml)를 첨가하고, 마이크로플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 4회 세척하였다. 퍼옥시다아제-표지 양 안티-마우스 항체 (PBS-BSA 5% 내에 1/2000으로 희석, Jackson)를 첨가하고, 마이크로플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 6회 세척하였다. SuperSignal　femto (Pierce)　기질 용액을 첨가하고 TECAN 판독기로 판독하였다.

단일클론 항체

정제된 세포외 MSRV 비리온으로부터 증폭된 클로닝된 RT-PCR 영역으로부터 발현되는 재조합 MSRV 엔벨로프 (ENV) 단백질로 마우스를 면역화한 후, 단일클론 항체 (Mab)를 bioMerieux (Marcy l'Etoile, France)에 의하여 개발하였다. 마우스 혈청을 ENV를 이용하여 ELISA에 의하여 시험한 후, 비장 세포를 비-분비 골수종 세포주 Sp2/0-Ag14와 융합하여 하이브리도마를 얻었다. 항체 생산을 동일한 ELISA 분석에 의하여 스크리닝함으로써 특정 클론을 선별하였다. 따라서, 약 40 MSRV/ENV 단백질-특이적 Mab를 분리하였으며 약 28 Mab를 추가로 선별하여 그 결합 특이성을 입증하였다. 인간 혈청 상에서 ApoH-ELISA 기법을 이용하여, 최상의 결합 Mab는 2A12A5였다.

결과

혈청 내 MSRV ENV 단백질 면역용량

엔벨로프 구조 및/또는 지질과 연관될 때 미생물 단백질 결합에서 포획 상(capture phase)이 아포리포프로틴-H (ApoH)의 특히 효율적인 특성에 의존하는 마이크로플레이트 면역분석을 개발하였다 (Stefas et al., 1997; Stefas et al., 2001). ApoH는 단백질 자체의 아미노산 영역과의 제1 저-친화성 상호작용을 허용하며, 상기 단백질은 ApoH C-말단 도메인의 지질- 또는 막-결합 도메인과의 공유결합-유사 결합을 야기하는 알로스테릭 반응을 2차로 활성화한다. 따라서, 바이러스 엔벨로프 단백질 또는 비리온 입자가 비가역적으로 포획될 수 있으며, 본래 표본을 제거하는 세척 단계 후, 상기 "ApoH" 포획 단계 후에 여전히 노출된 에피토프를 표적화하는 모노클론 항체의 첨가에 의하여 특이적 항원을 검출할 수 있다.

상기 시험의 기술적 입증을 위하여, 이전에 기재된 조건에 따라 (Perron et al., 1997a; Perron et al., 1997b) MS C-세포 상청액로부터 펠렛화되고 정제된 MSRV 비리온, 및 정제된 재조합 MSRV 엔벨로프 단백질 (ENV) 모두를 연속 희석 및 상이한 안티-MSRV ENV Mab으로 시험하였다. 상응하는 특이적 Mab에 의하여 검출되는, 간염 C 바이러스 (HCV) 및 간염 B 바이러스 (HBV)와 같은 공지된 바이러스와 비교하였다. 실제 혈청 표본으로 추가적으로 시도한 후, Mab 2A12A5는 ApoH 포획 단계 후 진단적 면역검출에 가장 효율적인 것으로 나타났으며 다음 연구를 위하여 보관하였다.

제1 블라인드 예비 연구: 다발성 경화증 -MS- 및 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증 -CIDP.

다양한 질환을 가지는 상이한 환자군 내에서 이러한 면역분석의 예비 평가를 위하여, MS 환자 29 명, 기타 신경질환 환자 28 명, 비-신경학적 질환 환자 0 명, 및 건강한 혈액 기증자 50 명으로부터의 혈청 (총 167 혈청 표본)을 분석하였다. 결과를 MS 및 기타 신경질환에 대하여 표 12에 제시한다.

표 12 . MSRV -관련 질환 또는 MSRV -관련 서브그룹 환자의 확인을 위한 면역검출 시험. 첫 번째 혈청 시리즈 상에서 APO -H ELISA 결과 - 다발성 경화증 ( MS ) 환자, 기타 신경질환 ( OND ) 환자, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경증 ( CIDP ) 환자 및 건강한 혈액 기증자 ( BD ). 단일클론 IgG ( MSRV ENV 에 대하여 2A12A5)를 이용하여 APO -H 포획 단계를 수반하는 ( Stefas et al ., 1997) ELISA 시험을 수행하고, bioMerieux, Marcy L'Etoile , France 에 의하여 생산하고 특이성에 대하여 스크리 닝하였다. N= 환자 수, nr = 기록되지 않음, OD = 광학 밀도, P= 진행, RP = 진행 완화, RR = 재발 완화. CO = 그 이하의 값에서 시험 결과가 음성인 한계를 결정하는 컷오프 값. 평균값 + 표준 편차의 3배 (99% 신뢰 구간)으로 바닥에서 보여지는 바와 같이, 일련의 건강한 혈액 기증자로부터 결정된다. 비율 OD / CO = 실험의 CO 로 OD 를 나눈 값, 양의 결과 (>1)와 음의 결과 (<1)를 구분함.

1과 동등한 결과는 "결정되지 않은" 것으로 간주되고 해당 표본 또는 동일한 개인으로부터의 새로운 표본을 결정을 위한 별도의 실험으로 다시 시험하여야 한다. 모든 광학 밀도의 평균값 및 표준 편차 -s.d- 를 각각의 군 및 서브그룹의 대상에서 다음과 같이 결정하였다:

BD (N=50): 평균값 0.53, s.d. 0.16.

MS (N=29): 양성 MS (N=23)의 평균값 1.27 s.d. 0.22, 음성 MS (N=6)의 평균 0.90 s.d. 0.25, 모든 MS의 평균값 1.20 s.d. 0.25.

OND (N=20): 음성 OND의 평균값 0.88 s.d. 0.10.

CIDP (N=8): 양성 CIDP (N=5)의 평균값 1.12 s.d. 0.09, 음성 CIDP (N=3)의 평균 0.9 s.d. 0.03, 모든 CIDP의 평균 1.04 s.d. 0.13.

다양한 질환을 가진 상이한 군의 환자 내에서 면역분석의 예비 평가로서, 프랑스로부터 (Creteil로부터 19 명, Grenoble로부터 10 명) MS 환자 29 명을 분석하였다. MS 환자 결과를 표 12a에 제시한다. 10 명의 건강한 혈액 기증자를 양성 한계 (컷오프 또는 CO, RM 아래 값에서는 특정 시그널이 검출되지 않는 역가) 결정을 위한 음성 대조군으로서 사용하였다. 통계학적 컷오프 값에 의하면, 23 명의 MS 환자는 유의하게 양성인 MSRV-ENV 항원혈증을 가지는 반면 (평균 OD = 0.88), 6 명은 역가에 다소 가까우나 (음성 MS의 평균 OD = 0.62) 음성으로 간주될 수 있다. 흥미롭게, 음성 MS 경우는 다소 양성 형태 (#24, 25, 28)의 보다 긴 기간을 가지거나, 시클로포스파미드 처리 프로토콜을 받았다.

동시에, 신경질환 (OND) 환자 28 명 (Creteil로부터 12 명, Grenoble로부터 16 명)으로부터의 혈청을 분석하였다. 5 명의 환자는 양성 결과를 보였으며, 따라서 이는 시험된 OND 환자의 약 18%였다. 그럼에도 불구하고, 모든 양성 OND 경우는 유사한 진단을 가지는 반면: 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경증 (CIDP), 기타 진단을 가지는 OND 환자는 모두 음성이었다 (또는 급성 길렝바르 증후군의 한 경우에 대하여 컷오프 한계에서 "결정되지 않은"). 따라서, OND 환자로부터의 결과를 표 12b에 CIDP 환자(표 12c)와 별도로 CIDP없이 OND로서 제시한다. CIDP 경우의 약 절반이 양성이나, 낮은 수를 고려할 때 "염증성" 대 "비-염증성" 신경 질환을 분석하려는 의도는 아니었다.

나아가, 동시에 만성 간염 B 바이러스 감염 환자 15 명 및 만성 간염 C 바이러스 감염 환자 15 명과 같은 기타 비-신경질환 (ONND) 환자로부터의 혈청을 시험하였다. 이들 30 표본 중 어느 것도 양성으로 밝혀지지 않았다. 대개 수많은 혈청학적 시험을 간섭하는 항-DNA, 항-핵 및 항-류마티즘 인자를 가지는 환자 30 명으로부터의 다반응성 혈청 또한 어떠한 양성 결과도 나타내지 않았다. 건강한 혈액 기증자로부터의 50 혈청 또한 동시에 시험하였다. 어느 것도 양성으로 밝혀지지 않았다.

기타 군과 MS 군의 결과의 비교는 CIDP 서브그룹을 제외하고 유의한 차이를 나타낸다. 완전한 MS 및 OND 군으로부터의 (음성 MS 및 CIDP를 포함) 광학 밀도값을 비-패러미터 시험과 비교하면 (정상 시험 실패), 유의하게 다르다 (p = <0,001; Mann-Whitney's rank sum test T = 517,000). 완전한 MS 군을 모든 CIDP 경우과 비교하면, 통계학적 차이를 더 이상 발견할 수 없다 (p = 0,053; Mann-Whitney's rank sum test T = 99,000). "양성 MS"와 "양성 CIDP"의 OD 값 사이에 어떠한 유의한 차이도 입증되지 않았다 P= 0,072; Mann-Whitney's rank sum test T = 42,000).

블라인드 시험 유럽 다중센터 혈청 시리즈: 다발성 경화증 -MS- 및 임상학적 독립 증후군 -CIS.

상이한 지리학적 영역으로부터의 MS 환자의 더 많은 패널을 이용하여 최초 결과를 확인하기 위하여, 상이한 유럽 국가로부터 신경 부문을 가지는 다중센터 협력으로 혈청을 수집하였다. 이러한 표본에서, 시그널 검출 및 비특이적 배경 "노이즈"로 분화를 개선하기 위하여 발광측정 판독을 이용하였다.

비색법을 이용한 혈청의 내부 평가 후, 발광측정 판독과의 비교는 증진된 시그널 검출 및 역학을 확인하였다. 따라서, 4중 분석을 위한 혈청의 샘플링을 무작위로 선별된 모든 질환 형태 및 기간의, 주로 특정 처리가 진행 중이나, 임상적 네트워크의 각각의 지리학적 기원을 나타내는 MS 환자 내에서 행하였다. 이들을 암호화하고 블라인드 시험을 위하여 주요 실험실 (APO-H technologies, Montpellier, France)로 보냈다. 비-암호화된 혈청 (10 음성 대조군 및 10 양성 MS)을 컷오프 값의 결정을 위한 기술적 입증을 위하여 보냈다. 또한, 임상적 독립 증후군 (CIS, 단일 신경 에피소드 및 부가적인 영상화 및/또는 생물학적 이상)으로부터의 14 혈청을 암호화하여 보내고 이 시리즈 내에서 블라인드 시험하였다. 이는 CIS 내 최초 평가였으며 다수의 MS 최초 에피소드를 포함할 것으로 예상되었다.

결과를 도 8에 제시한다 (독립된 실험실 내에서 블라인드 시험된 유럽 다중센터 연구로부터의 혈청의 ApoH-ELISA 결과). 이는 발광측정 단위 (RLU)를 동일 실험 내에서 결정된 컷오프로 나눈 비율로서 표현되며, 따라서 이전의 시리즈 (표 9 참조)의 비율과 비교가능하다. 과연, 발광측정으로 "양성 MS" 혈청 내에서 얻어진 비율 범위 (1 내지 6)는 비색법 (1 내지 2)과 비교하여 시그널 역학의 기술적 최적화를 확인한다.

독립된 실험실 내에서 블라인드 시험된 유럽 다중센터 연구로부터의 혈청의 ApoH-ELISA 결과

사용된 판독 기법은 발광측정이었으며, 그 결과를 개별 발광측정 단위(RLU)를 동일 실험 내에서 일련의 참조 음성 혈청에 대하여 결정된 컷오프 값으로 나눈 비율로서 Y 축에 제시한다. 따라서, 1 보다 큰 값은 양성이다.

군 간의 APO-H ELISA 발광측정 결과의 통계학적 분석은 다음의 결과를 제공하였다 (Fisher test p 값): (i) BD vs. 모든 MS, BD vs. 모든 MS + CIS, BD vs. RRMS, BD vs. PPMS, BD vs. SPMS, BD vs. CIS 비교:p<0.001; (ii) comparing CIS vs. RRMS:p=0.759, CIS vs. PPMS: p=0.704, CIS vs. SPMS: p=0.749, RRMS vs. PPMS, SPMS: p=1, PPMS vs. SPMS: p=1 비교.

여기서, 상이한 국가 및 연구 영역으로부터 유래된 74 비-선택된 MS 케이스 중 54 (73%)는 MSRV ENV 단백질에 대하여 양성 항원혈증을 가졌으나, 암호화된 26 BD 중 어느 것도 (실험을 위한 참조 표본으로 사용된 10 비-암호화된 BE에 대하여) 그러하지 않았다. MS와 BD 강의 차이는 매우 유의하였으나 (Chi-Square: p<0,0001), 더 많은 수(100 이상)를 가지는 별개의 "비-블라인드 시리즈"는 몇몇 양성 건강한 또는 무증상 혈액 기증자를 검출하였다 (4/103; 도시하지 않음). 흥미롭게, 14 CIS 중 9 (약 64%)가 양성이었으나, 더 낮은 값을 가졌다.

상이한 형태의 MS, 원발성 진행성 MS (PPMS), 2차 진행 MS (2PMS) 및 재발-완화 (RPMS)를 보이는 상이한 서브그룹 뿐 아니라 상이한 군(MS, BD, CIS)으로부터의 값을 Fischer's test로 비교하였다. 건강한 혈액 기증자의 결과는 모든 MS 및 CIS 조합과 유의하게 차이가 있는 반면 (일정하게 p<0.001), 가능한 (CIS) 또는 확실한 MS, 또는 다른 MS 질환 진화 형태를 나타내는 어떠한 서브그룹 간에 MSRV ENV 항원혈증의 검출에서 어떠한 유의한 차이도 입증되지 않았다 (RPMS 71%가 양성, SPMS 70%가 양성). 그럼에도 불구하고, CIS 대 MS 서브그룹 내 약간의 이질성 경향이 더 낮은 p값에 의하여 예증된다: MS 형태 간에 p=0.7 내지 0.75, 대 p=1, 후자의 값은 통계학적으로 동일한 결과 분포를 나타냄.

8b. 정신질환 시리즈: 정신분열증 - SCZ

환자 및 방법

환자 및 건강한 대조군

정신분열증에 대한 DSM-IV (American Psychiatric Association: Diagnostic and statistical Manual of Mental Disorders, DSM-IV; 1994) 기준을 충족시키는 환자들을 프랑스 대학 소속 정신과 내 급성 에피소드 입원 말기 환자 중에서 무작위 선별하였다. 신경 질환, 급성 또는 만성 감염, 및 인체 면역 결핍 바이러스 (HIVI+2)에 대한 양성 혈청반응, 간염 B 및 C 바이러스가 제외 기준이었다. 정상 대조군 내 연령 및 성별 분포는 환자 군과 통계학적으로 다르지 않았다. 정신병 증상을 정신병 규모의 사인 및 증상의 프랑스어 버젼 -SSPI- (Houenou et al.,2007)을 이용하여 평가하였다. 감정적 증상을 Bech 및 Rafaelsen 조병 평가 규모 및 Montgomery 및 Asberg 우울증 평가 규모 -MADRS-(Bech et al., 1978; Montgomery and Asberg, 1979)를 이용하여 평가하였다. 상기 프로토콜은 지역 윤리 의원회의 인가를 받았다. 환자의 임상적 평가를 담당하는 정신과의사에 의한 연구에 대한 완전한 기재 후, 사인된 정보 동의서를 모든 대상으로부터 얻었다.

혈청 수집

1 튜브의 혈액 (7ml B&D 건조 튜브)을 수집 후 2 시간 이내에 처리하였다: 응고 후, 14℃에서 2800g으로 10 분 원심분리하였다. 혈청을 수집하고, 저-결합 튜브 내에서 분취하고 -80℃에서 저장하였다.

면역분석

APO-H 포획 단계를 포함하는 ELISA 테스트 (Stefas et al., 1997)를 단일클론 IgGs (MSRV ENV에 대하여 2A12A5, 6A2B2, 및 MSRV GAG에 대하여 2G5E12)를 이용하여 수행하고, bioMerieuv, Marcy L'Etoile, France에 의하여 생산하고 특이성에 대하여 스크리닝하였다.

웰 당 100 ml의 Tris-HCl 50mM pH7.6 내에 1/10 희석된 표본을 ApoH-코팅된 마이크로플레이트 (APOH Technologies, Montpellier-France) 상에 적재하였다. 마이크로플레이트를 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 웰 당 250 ml의 PBS로 4회 세척하였다. 웰 당 100 ml의 1차 항체 (PBS-BSA 2% 내 10 mg/ml)를 첨가하고, 마이크로플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하고, PBST 0.05%로 4회 PBS로 2회 세척하였다. 웰 당 100 ml의 퍼옥시다아제-표지 항체 (항-마우스 Jackson, PBS-BSA 2% 내 1/250)를 첨가하고, 마이크로플레이트를 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하고 상기한 바와 같이 세척하였다. 웰 당 100 ml의 기질 용액 (OPD)을 첨가하고, 마이크로플레이트를 어두운 곳에서 30분 동안 인큐베이션하고, 반응을 H2SO4 2N (50ml/웰)로 정지시켰다. 흡수율을 Biotek 판독기로 490nm에서 판독하였다.

통계학적 분석:

SigmaStat Software를 이용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 그 분포가 정규 분포 (정상 시험 실패)에 맞지 않았으므로, 비-패러미터 시험 Mann-Whitney 등급 합계 시험을 데이터 시리즈의 비교를 위하여 선택하였다. Chi-Square 시험을 이용하여 사용된 각각의 항원 및/또는 각각의 항체에 대하여 각 집단 내 양성 대 음성 항원혈증의 유병률을 비교하였다. 그 아래에 결과가 있는 각각의 조건에 대한 컷오프 값을 음성 대조군의 통계학적 시리즈로부터 평균값 + 표준편차 3배로서 (M+3SD; 양성의 유의성: p<0.01) 계산하고, 참조 양성 및 음성 표본 상에서 확인하였다.

결과

연령 (33 +/- 6.5 세) 및 성별 (73% 남성, 27% 여성)을 맞춘 49 명의 정신분열증 환자 및 49 명의 대조군을 포함시켰다. 8 명의 환자가 정신분열증의 개시에 포함된 반면, 다수(N=41)는 심각한 만성 정신분열증을 가졌다. 이들은 우울증 점수 (평균 MADRS = 5.6 -+ 6.6) 및 조병 점수 (평균 Bech 점수 = 4.8 -+ 4.5) 모두에 대한 포함에 있어서 기분정상상태였다. 비처리된 1명을 제외한 모든 환자는 항정신병 약물 (27% 전통적 및 71% 비전형적 항정신병제)을 투여받았다. 환자의 삼분의 일 (N=13)은 Kane 기준 (Kane 1996)에 따라 약물 내성이었다.

MSRV GAG에 대하여, 49 명의 대조군 및 49 명의 정신분열증 환자를 시험하였다. MSRV ENV에 대하여, 30 명의 대조군 (기술적 한계로 인하여) 및 49 명의 정신분열증 환자를 시험하였다. 면역분석 결과를 혈청 2배를 컷오프 값을 나누어 구하여지는 평균 광학 밀도로서 나타내어, 모든 시리즈를 정상값과 비교가능하도록 한다 (도 22 및 표 10).

정신분열증 대상의 47 % (N = 23) 및 43 % (N=21)가 각각 2A12A5 및 6A2B2 항체로 양성 MSRV ENV 항원혈증을 가졌다. 정신분열증 환자의 49% (N= 24)가 양성 MSRV GAG 항원혈증을 가졌으며, 하나는 양성이고 하나는 GAG에 대해서만 "경계"였다. 건강한 대조군과의 비교는 양성 (Chi-square 시험: 두 ENV 검출 모두에 대하여 p<0.001; GAG에 대하여 p<0.0001) 출현에 있어서 유의한 차이를 나타냈다. Mann-Whitney 등급 합계 시험을 이용한 환자 대 대조군 내 ELISA 값의 비교 또한 매우 유의한 차이 (p<0.001; 표 2)를 확인하였다. 대조군 중에서, 한 대상은 현저히 양성인 항원혈증을 가졌다. 흥미롭게, ENV 단백질에 대한 결과와 GAG 단백질에 대하여 얻은 결과 사이에 양의 상관 관계가 있었다. 안티-ENV6A2B2을 이용하여 얻은 ELISA 값을 안티-GAG 2G5E12에 대하여 얻은 값과 비교하는 Mann-Whitney 등급 합계 시험은 안티-GAG-2G5E12에 대한 안티-ENV-2A12A5 (p=0.290), 및 안티-ENV-2A12A5에 대한 안티-ENV-6A2B2 (p=0.159)로 유의한 차이를 나타내지 않았다 (p = 0.744). 따라서, 상기 항체들은 동등 및/또는 매우 유사한 MSRV 항원 발현을 검출하였다:

"ENV" 항원혈증 ELISA 값은 표 13에 기재하는 바와 같이, 음성 대조군과 비교하여 (0.09 및 0.08 각각) 표준 편차 증가에 의하여 (2A12A5 항체에 대하여 0.28, 6A2BA에 대하여 0.48) 양성 중에 변화한다. 이는 몇몇 정신분열증 환자 내 MSRV 항원의 역학적 생산의 검출을 확인하는 것이다.

표 13 : 정신분열증 ( SCZ ) 환자 및 대조군 혈청 내 MSRV 캡시드 ( GAG ) 및 엔 벨로프 ( ENV ) 투여량

SCZ　: 정신분열증 환자　; BD　: 혈액

상기 면역분석 (ELISA) 시험 비율 (Y 축)은 동일한 혈청으로부터의 2 웰 상에서 측정된 평균 광학 밀도를 해당 시리즈의 컷오프 값으로 나눈 값이다 (재료 및 방법 참조). 도표화된 값으로 각각의 컬럼에 나타내는 바와 같이 ENV 항원을 2A12A5 모노클론 항체 또는 6A2B2 모노클론 항체와 함께 투여하고, GAG 항원을 2G5E12 모노클론 항체와 함께 투여한다.

도 9에, 평균값 및 신뢰 구간 (0.01 및 0.001)을 막대 및 박스로 나타내고, 각각의 항원 및 항체(각각의 컬럼의 상부에 나타냄)에 대한 최대 및 최소값을 점으로 나타낸다. 정신분열증 환자로부터의 일련의 값을 "SCZ"로 해당 도표의 바닥에 표시하고, 건강한 혈액 기증자로부터의 값을 "대조군"으로 표시한다 (바닥/X 축).

8c. 기타 신경질환: 간질

상기한 바와 같이 (8b) ELISA 시험을 수행하였다. 간질 환자 및 정상 대조군을 그들 혈청 내 MSRV-ENV 단백질의 존재에 대하여 동시에 시험하였다. 결과를 도 10에 제시한다.

각각의 수직 막대는 단일 간질 환자 (좌측으로부터 38) 또는 대조군 (우측으로부터 24)의 혈청으로부터의 2중 결과의 평균 OD를 나타낸다.

수평 검정 막대는 시험의 컷오프 값을 나타내며, 그 위에서 검출된 시그널은 혈청 내 항원 존재에 대하여 특이한 것이다. 이는 건강한 혈액 기증자(대조군)로부터의 결과의 평균 + 표준편차의 3배에 의하여 결정된다.

따라서, 상이한 병원을 가지는 경우들 중에서 특정 병인을 가지는 서브그룹에 해당하는, MSRV-ENV 관련 간질을 가지는 8 명의 환자의 서브그룹을 탐지하였다. MSRV 양성 간질만이 예를 들어 항체 벡터 내 안티-ENV 리간드 처리에 적합하다.

8d. 건선 환자

건선 환자는 유사한 레트로바이러스를 발현하는 것으로 오래전부터 알려져 왔다 (Iversen, O. J. (1990), "The expression of retrovirus-like particles in psoriasis." J Invest Dermatol 95(5 Suppl): 41S-43S./ Bjerke, J. R., G. Haukenes, et al. (1983), "Activated T lymphocytes, interferon, and retrovirus-like particles in psoriatic lesions." Arch Dermatol 119(12): 955-6). 따라서, 상기 리간드를 포함하는 치료 벡터에 대한 적합성은 당업자에게 자명한 것이다.

실시예 9 : 본 발명의 리간드를 포함하고 활성 특성과 함께 리간드 친화성을 유지하는 약학적 벡터 vs . GNbAC1 의 생체 내 효율성. 적절한 약리학적 벡터 화합물로 벡터화된 리간드 형태 하에 전달된 상기 리간드의 항염증, 면역보호 및 신경보호 효과의 생체 내 증거: 신경염증 , 탈수초 및/또는 뉴런 변성의 동물 모델 내에서 치 료적 효과의 실시예 .

재료 및 방법:

인간화된 SCID (huSCID) 마우스 모델 내 MSRV/ENV-유도 EAE.

병원균이 없는 6 내지 8 주령 SCID 마우스를 Charles River, France로부터 구입하였다. 마우스의 인간화를 이전에 기재된 프로토콜에 따라 (Firouzi et al., 2003) 건강한 혈액 기증자로부터의 PBMCs를 이용하여 달성하였다 (Etablissement Francais du Sang, Lyon, France). 특히, 마우스를 감마선 조사하고, 50x10⁶ 인간 PBMCs로 인간화하기 이전에 안티-NK 항체를 복강 내 (i.p.) 주사하였다. 그 다음, 인간화 품질을 마우스 혈청 내 인간 이뮤노글로뷸린의 특이적 검출에 의하여 조절하였다. 시리즈 당 하나 이상의 기증자가 요구되는 경우, 모든 huSCID 서브그룹을 각각의 혈액 기증으로 인간화된 동일 비율의 마우스와 비교가능하도록 하였다.

EAE 프로토콜 내에 포함시키기 전 (수초 항원 최초 주입 전) 2 주의 지연이 요구되었다. 그 다음, 마우스 군에 "허위 대조군"을 위하여 수초 염기성 항원 (MBP) 및 완전한 Freund 보조제(IFA, 희석제만을 포함)를 주입하거나, 또는 "ENV-유도" EAE를 위하여 MBP 및 IFA 희석제 내 균질화된 정제된 내독소 비함유 MSRV ENV 단백질 주입하였다. 질환 활성을 임상적으로 및 MRI에 의하여 병변 야기 및 임상적 결핍 진행에 대하여 모니터링할 때, 본래 쥐 단일클론 항체 (GNb_AC1)와 비교하여, 병 든 마우스 (huSCID 마우스 내 ENV에 의하여 유도된 MBP-EAE) 내 주입으로 선별된 안티-ENV 리간드의 효과를 연구하였다.

EAE 유도 또는 "허위-유도"를 위하여, 동물에 0 일째에 최초로 목 내에 50 ㎍ 인간 MBP + 150 ㎍ MBP 펩타이드 (MBP 펩타이 87-99) + 20 ㎍ 재조합 ENV 단백질 + IFA (ENV 군) 또는 50 ㎍ 인간 MBP + 150 ㎍ MBP 펩타이드 (MBP 펩타이드 87-99) + IFA 단독 (대조군)을 s.c. 주사하였다. 동물 당 200 ng의 백일해 독소를 모든 군 내에 2 일 후 i.p. 주사하였다. 각각의 군에 대하여 이전에 기재한 것에 상응하는 동일 성분의 동일 투여량으로 (MBP 펩타이드 및 인간 MBP 완전 단백질을 포함) 복강 내 (i.p.) 두번째 주사를 지정된 날에 행하였다 (표 11). 이어서, 동물 당 PTX 200 ng를 유사 주입하였다. 동일한 면역원의 세번째 및 최종 주입을 지정된 날(표 14)에 목의 반대 편에 s.c. 행한 다음, PTX를 유사 주입하였다.

표 14. 예비 임상적 시리즈의 항체 처리 평가: Hu - SCID 마우스 내 ENV -유도 및 대조군 " MBP - EAE "에 프로토콜 및 상이한 군의 설명.

조사를 위하여, 동물의 무게를 일주일에 5일 측정하고 임상적으로 점수를 매겼다. 임상적 점수를 다음 기준에 따라 매겼다: 0 = 신호 없음; 1 = 꼬리 마비 또는 뒷다리의 반사항진 또는 뒷다리 한쪽 쇠약; 2 = 양 뒷다리 또는 앞다리 쇠약; 3 = 플러스 편마비 또는 주요 결핍; 4 = 완전한 뒷다리 또는 앞다리 마비; 5 = 플러스 반대 다리의 부분적 마비 또는 주요 결핍; 6 = 빈사 또는 사망

Hu-SCID 실험의 총 기간은 mAb 처리 및 대조군 마우스를 수반하는 생존 연구를 제외하고 (4 개월) 2 개월을 초과하지 않았다.

MRI 및 면역조직화학 분석 (본 실시예에 도시하지 않음):

동물을 MRI T2-가중 분석 및 검시 조직학에 의하여 모니터링하였으며, 이는 임상적 개선을 가지는 처리 마우스 내 염증 패턴의 영상화(MRI)의 현저한 개선뿐 아니라 중추 신경계 내 염증 및 탈수초를 가지는 병변 유형을 모두 확인하였다.

결과:

인간 림프계를 가지는 (상기한 바와 같이 이식된) SCID 마우스는 기능적 인간 면역계를 가지는 하이브리드 동물을 제공한다. 상기 동물에 청색 화살표로 나타내어지는 날에 유성 희석제 (IFA) 내에 MBP로 에멀젼화된 MSRV ENV 단백질을 3회 주입하였다. 상기 동물이 MRI에 의해 가시화되는 진행중인 신경염증(EAE)으로 증가된 임상적 점수를 가질 때, 이들에 본래 쥐 단일클론 항체 (GNb AC1, 도 10에 muIgG로 나타냄) 또는 상기 리간드를 가지는 인간 IgG1 또는 IgG4 구조물 (도 11에서 huIgG1 및 huIgG4으로 표시) 중 하나의 단일 투여량 (10 ㎍, 복강 내)을 주입하였다. 처리 동물 및 ENV 없이 IFA 내 MBP를 주입한 "허위-대조군"과의 비교를 위하여 미처리된 군은 건강한 채 유지되었으나, 처리된 병 든 동물과 같은 날에 본래 쥐 항체 (GNbAC1) 주입을 받았다.

도 11 및 12에 예시되는 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 모든 비-처리 마우스는 30 일 후에 사망하였고 MSRV ENV 단백질 3회 주입의 마지막 주입 후 심각한 임상적 진전을 나타냈다. 심각한 병변이 조직학 및 면역조직학에 의하여 보여졌으며, 이는 탈수초, 림프세포 침투, 신경세포사, 혈액 뇌 장벽 파괴 및 성상교세포증을 입증한다. 흥미롭게, 다발성 경화증에서, 혈액 뇌 장벽 파괴는 또한 활성 CNS 병변의 특징이다.

따라서, 쥐 항체 또는 ENV를 표적화하는 상기 리간드를 포함하는 키메릭 인간 IgG 1 또는 4는 모든 동물 내에서 복강 내 주사로부터 전신으로, 특히 활성 CNS 병변으로 확산되었을 것이다

놀랍게도, 생존 곡선은 35일째 IgG1 또는 IgG4 키메릭 항체 처리된 동물에서 100% 생존, 미처리 동물에서 0% 생존을 나타낸다. 놀랍게도, 본래 쥐 IgG1/kappa (GNbAC1)는, 28일 째에 한 마리가 사망하였으므로, 동일 투여량으로 주입시 덜 효율적이다. 더욱이, 도 11의 임상적 곡선은 인간 IgG1 또는 4 구조물 처리된 동물 내에 매우 우수하고 지속적인 개선을 나타내나, 본래 쥐 항체 처리된 동물 내에서는 안정화 또는 약간의 개선만이 나타난다.

이와 같이 미처리군과 비교하여 인간 IgG1 또는 IgG4 벡터 내 리간드로 처리된 동물의 놀라운 개선은 또한 MRI 모니터링에 의하여 입증되었다.

따라서, 중추신경계 (CNS; Hu-SCID 및 MSRV ENV 단백질 주입한 C57/bl6 모델 참조) 내에 신경염증, 탈수초, 신경세포사, 혈액 뇌-장벽 파괴 및 성상교세포증을 나타내는 동물 모델에서 인간 키메릭 IgG1 또는 4의 임상적 효율성이 확인된다. 놀랍게도, 동일한 리간드(VH+VL chains)를 포함하는 본래 쥐 IgG와 비교하여 효과가 개선된다.

따라서, 신경염증 동물 모델 내 치료 효과는 본원 명세서에 정의된 바와 같은 MSRV-관련 질환 또는 증후군에의 다른 적용을 자명하게 한다.

또한, 실시예 1에 정의된 6 CDRs을 포함하는 최소 조성물 또는 구조물의 예기치 않은 "리간드 효과"는 항체 기능과 전적으로 독립적으로 리간드를 사용하는 것을 가능케 할 뿐 아니라, 각각의 가능한 치료적 적용을 위한 상이한 벡터의 (IgG 이소타입에 독점적으로 관련되지 않음) 부가 가치 및 반사적 이익을 변화시키고 선택할 수 있도록 한다.

실시예 10 : MSRV - ENV 단백질이 고형 종양 환자 내 생체검사 또는 림프세포 증식성 질환 또는 림프암 환자 내 생체검사로부터의 몇몇 세포에서 높은 강도로 검출된다.

재료 및 방법:

- 시험 항체

GNb AC1, 1.0 ml, 농도: 5.918 mg/ml

- 음성 대조군 항체

마우스 골수종 단백질 IgG1 kappa (MOPC-21, Sigma), 1.0 ml, 농도: 1.0 mg/ml

상기 항체를 시험 항체와 동시에 사용하였다.

- 억제 단백질

ENV-T (MSRV ENV, GeNeuro SA), 10 ml (10 x 1ml vials), 농도: 0.05 mg/ml

상기 안티-리간드를 상기 시험 항체와 동시에 사용하였다.

- 인간 조직 표본

완전한 환자 동의 하에 윤리적으로 수집된 인간 조직을 외부 급원으로부터 얻었다.

모든 조직에 대하여 항원성 시험하였다. 상기 조직들을 본 연구에 사용에 허용가능한 것으로 여기기 전에 각각의 조직과 관련된 통상적으로 발현되는 단백질: S100, CD45, 데스민, 사이토케라틴 또는 비멘틴의 IHC 염색된 부분을 평가하였다.

- 분석 확인

조사된 패러미터는 다음을 포함하였다:

1. 중성 완충 포르말린, 파라포름알데히드 및 아세톤 고정을 이용하는 양성 대조군 조직 내 염색의 비교

2. 적절한 면역염색 검출법의 이용

3. 시험 항체의 최적 역가 결정, 0 내지 5.0 ㎍/ml를 조사하였다 (이소타입 대조군 항체를 동일 농도로 시험하였다).

4. 염색의 특이성을 완충액으로 치환하여 시험 항체를 생략함으로써 확인하였다. 또한, 조직 인큐베이션 전에 MSRV의 항원 결합 부위를 ENV-T 단백질을 이용하여 블록킹하였다.

5. 표적 항원 시그널을 간섭할 수 있는 내생 재료의 요구되는 블록킹을 이용하였다.

- 면역조직화학 (IHC) 염색법

유효 상의 발견 결과, 각각의 조직 표본을 다음 방식으로 동시에 스크리닝하였다:

· 염색 절차로부터 GNbAC1 생략

· 1.0 ㎍/ml MOPC-21 항체

· 0.25, 1.0 및 3.0 ㎍/ml GNbAC1

각각의 조직 표본을 광학 현미경을 이용하여 평가하였다. 점수 시스템은 조직 및 세포 유형을 확인하고 염색 강도를 반영하였다.

음성 대조군 항체로 처리되거나 항체 처리되지 않은 조직 내 모든 염색은 (개별 세포를 특이적으로 묘사하지 않음) 비-특이적인 것으로 추정되었다. 상기 조직 내 면역조직화학적 염색이 강도 및 분포에 있어서 시험 항체 처리되지 않은 조직과 유사할 때, 비-특이적 염색을 시험 항체 처리된 조직에 대하여 기록하였으며, 여기서 개별 세포는 특이적으로 묘사되지 않았다.

조직 구조 또는 세포 유형을 명명한 다음 강도를 다음과 같이 나타냄으로써 양성 염색을 기록하였다:

0 음성

+ 온화

++ 중간

+++ 현저함

각각의 세포 유형에서 확인된 염색 빈도를 다음과 같이 나타냈다:

<10% 약간

11-40% 몇몇

41-75% 많음

>76% 최고

평가에 적합하지 않은 것으로 간주되는 경우, 가능하다면 염색을 반복할 때까지 그것에 대한 데이터가 결과 표에 포함되지 않았다.

다른 시험된 희석액에 비하여 0.25 ㎍ml에서 막 염색이 덜하였다.

간 조직을 공지의 양성 대조군과 처음에 양성인 것으로 확인되었던 조직 사이의 비교로서 포함시켰다.

음성 완충액 대조군 또는 이소타입에서 어떠한 유의한 염색도 확인되지 않았다. ENV-T가 안티-MSRV/ ENV GNbAC1 항체와 반응할 때 양성으로 염색된 조직과 비교하여 양성 염색은 실질적으로 제거되었다.

추후의 스크리닝 작업을 위하여, 시험 Mab, GNb AC1을 최적 농도로서 1.00 ㎍/ml, 그 한 단계 위인 3.00 ㎍/ml, 및 낮은 농도로서 0.25 ㎍/ml로 사용하였다.

검증으로부터의 발견 결과, 다음의 IHC 염색 절차를 동결된 정상 인간 조직의 스크리닝을 위하여 채택하였다.

결과:

- 유방암

표 15 . 상이한 개인으로부터의 유방 종양 조직으로 얻은 결과

강도 음성 0 온화 + 중간 ++ 현저함 +++

빈도 약간 몇몇 많음 최고

따라서, 특정 GnbAC1로 시험된 3/3 유방 유선 종양에서 선상 상피 내에서 및 주변 혈관의 내피 세포 내에서 높게 발현되는 것이 입증된다.

따라서, "MRSV" 관련 질환"의 개념에 따르면, 유방암 종양은 이러한 인간 질환 중 하나임이 입증된다.

림프암 및 림프세포 증식성 질환:

표 16: 상이한 개인으로부터의 과형성 림프 조직으로 얻은 결과

강도 음성 0 온화 + 중간 ++ 현저함 +++

빈도 약간 몇몇 많음 최고

NP: 실현불가능

따라서, GNbAC1으로 시험할 때, 림프세포 증식성 질환을 가지는 환자로부터 현저한 과형성을 가지는 2/2 편도선 생체검사에서 MSRV ENV가 림프세포 내에서 및 주위 혈관의 내피 세포 내에서 높게 발현됨이 입증된다.

따라서, "MSRV 관련 질환"의 개념에 따르면, 림프세포암을 포함하는 림프세포 증식성 질환은 이러한 인간 질환 중 하나임이 입증된다.

- 신장 암

표 17 : 상이한 개인으로부터의 신장 종양 조직으로 얻은 결과

강도 음성 0 온화 + 중간 ++ 현저함 +++

빈도 약간 몇몇 많음 최고

NP: 실현불가능함

한 세포 유형에서 (각각의 경우 상이한) 가벼운 배경 염색에도 불구하고, 분석이 실행가능하였으며, 따라서 특이적 안티-MSRV ENV 항체 (GNbAC1)으로 시험시, 신장 종양 환자로부터 2/2 신장 생체검사에서 신장 세포 내에서 및 주위 혈관의 내피 세포 내에서 MSRV ENV가 높게 발현됨이 입증된다.

따라서, MSRV 관련 질환의 개념에 따르면, 신장 암은 이러한 인간 질환 중 하나임이 입증된다.

특이적 안티-ENV 항체 (GNb AC1) 또는 부적절한 대조군 항체 (MOPC-21)로 염색된 조직 부위의 약한 현미경 가시화 따른 상응하는 사진들은 신장암, 림프암 또는 림프세포 증식성 질환 및 유방암에 대하여 표 15-17에 제시된 발견을 확인한다.

실시예 11 : MSRV ENV 및 GAG 단백질이 당뇨병을 보이는 몇몇 급성 경우의 혈청 내에 상당한 일치하는 수준으로 검출된다.

급성 인슐린 의존성 당뇨병 환자로부터의 혈청을 진단 및 추적 목적의 통상적인 시험 후에 남은 용량으로부터 익명으로 수집하였다. 건강한 혈액 기증자로부터의 혈청을 혈액 뱅크 기관으로부터 얻었다.

혈청을 본원 명세서의 실시예에 기재된 바와 같이 APO-H 포획 플레이트 및 특이적 리간드 검출을 이용하여 면역검출 기법에 따라 시험하였다.

이하 표는 급성 당뇨병 (Daib.) 환자 혈청 및 대표적 혈액 기증자 (BD)로부터 측정된 삼중 시험의 평균 광학 밀도를 제공한다.

안티-MSRV 쥐 단일클론 항체 리간드를 사용하였다.

- 하나의 안티-엔벨로프 (ENV) GNbAC1 (Geneuro, Switzerland).

- 하나의 안티-매트릭스 및 캡시드 폴리프로틴 (GAG): 2G5E12 (bioMerieux France).

상기 항체들의 특이적 결합을 2차 안티-마우스 항체 (Jackson, USA, ref. 115-035-146)에 의하여 밝혔다. 사용되는 희석 또는 농도를 이하 표에 나타낸다.

평균 광학 밀도를 컷오프 값 (건강한 대조군 평균값 + 상응하는 시리즈의 표준 편차 -SD- 2배로 계산됨)으로 나눈 비율(P/N)이 1 보다 큰 경우, 결과는 유의하다.

이와 같은 값은 P/N 2 열 내에 굵고 더 큰 글씨이다.

따라서, 18 명의 환자 중 10 명이 리간드 쥐 단일클론 항체에 의하여 검출되는 ENV 단백질에 대한 유의한 항원혈증을 가지는 것으로 입증될 수 있다. 모든 "MSRV-양성" 환자를 두 개의 항체에 의하여 검출하며, 이들은 GAG 및 ENV 단백질 모두에 대한 유의한 결과를 가진다.

이와 같이 두 개의 상이한 MSRV 단백질 (ENV 및 GAG)을 나타내는 두 개의 상이한 에피토프를 표적화하는 두 개의 상이한 단일클론 항체의 일치하는 검출 결과는 MSRV-관련 질환의 결정을 위하여 본원 명세서에서 기재한 바와 같은 MSRV 관련의 측면에서 분명히 유의하다.

따라서, 타입 I 또는 기타 염증-관련 당뇨병은 그 질환 발병이 MSRV ENV 단백질의 전구염증성 및 면역병원성 효과에 의하여 야기될 수 있는 서브그룹 환자를 포함한다.

표 18: 건강한 기증자 ( BD )와 비교하여 당뇨병 ( Diab .) 환자 내에 APOH-ELISA 항원혈증. 실시예 본문의 상세한 기재 참조.

P/N 2 = 표본 결과로서 계산된 광학 밀도를 컷오프 값으로 나눈 비율. 컷오프 값은 건강한 기증자를 이용하여 건강한 군 평균 + 그 표준 편차 2배로 결정된다.

실시예 12 : ENV -유도 당뇨병에 대한 적합한 동물 모델의 예기치 않은 발견

1. 서론

비-비만 당뇨 SCID (비-SCID) 자발 돌연변이 마우스 모델은 당뇨병 취약 NOD 배경에 SCID 돌연변이를 가진다. 놀랍게도, 출원인에 의하여 수행된 예비 실험 결과, 인간화된 NOD-SCID 마우스의 ENV 단백질 (25 ㎍) 및 쥐 MBP (단백질 및 펩타이드)로의 1차 면역화는 시험된 모든 동물들의 신속한 사망을 체계적으로 유도하는 반면, ENV 단백질 없이 동일한 면역원을 받은 인간화된 SCID 마우스 (위장 대조군)은 생존하였음이 밝혀졌다. 첫번째 단계에서, 조직학적 접근과 결합된 임상적 모니터링을 이용하여 투여량-반응 방식으로 NOD-SCID 마우스 내 ENV 단백질의 유해한 효과를 평가하였다. 두번째 단계에서, 본 발명의 ENV 단백질에 의하여 유도되는 손상을 방지함에 있어서 IgG4 리간드의 이로운 효과를 평가하였다.

2. NOD - SCID 마우스 내 ENV 단백질의 유해한 영향 평가

a. 재료 및 방법

a. 1. 동물

병원균이 없는 SCID 마우스 6 마리 (6 내지 8주령)를 Charles River, France로부터 구입하였다. 동물들은 음식물 및 물에의 임의 접근하면서 표준 명-암 사이클로 케이지 당 3 마리 유지되고, 8 일의 순응 기간 동안 방해받지 않았다. 특별한 주의를 기울여 매우 깨끗한 주거 조건을 보증하였다. 특히, 동물들을 필터 리드를 구비한 특별 케이지 내에 머물도록 하였다.

a.2. NOD - SCID 마우스의 인간화

이식된 인간 면역계를 가진 림프 면역계가 없는 NOD-SCID 마우스를 얻기 위하여, 마우스를 인간 말초혈액 단핵 세포로 인간화하여 면역병원성 동물 모델 내 인간 면역계의 기능적 역할을 연구할 수 있는 가능성을 제공하였다. 이는 면역병리학 및 MSRV-ENV와 같은 인간 병원성 단백질에의 반응에 있어서 실제 인간 상황에 훨씬 근접한 결과를 제공한다. 동물들에 감마선 조사하지 않으며 NOD-SCID 마우스는 NK 세포가 자발적으로 결핍되어 있으므로 안티-NK 리간드로 처리하지 않음을 제외하고, 마우스의 인간화를 Firouzi et al., 2003에 의한 프로토콜에 기재된 바에 따라 달성하였다. 건강한 대조군 2로부터의 혈액 (백혈구-혈소판 층, 45-50 ml)을 Lyon 내 수혈 센터 (EFS)로부터 얻었다. 혈액의 품질 및 안전성을 면역학적 및 혈액학적 분석에 의하여 보증하였다. 모든 실험 절차를 공기 층흐름 하에 무균 글로브를 이용하여 수행하였다. 인간 말초혈액 단핵세포 (PBMCs)를 Ficoll 구배 밀도 분리에 의하여 얻었으며, i.p. 주사 (50.10⁶ 세포)에 의하여 NOD-SCID에 투여하였다. 두 명의 상이한 기증자의 혈액을 이용하여 모든 동물을 인간화하였기 때문에, 각각의 혈액 기증자를 이용하여 동일한 비율의 마우스를 인간화하였다. 하기하는 바와 같이, 모든 추후 실험에서 두 기증 혈액으로 이식된 동물 사이에 어떠한 차이도 보이지 않음을 이미 확인하였다.

3. NOD - SCID 마우스 내 ENV 단백질의 유해한 영향 평가

ENV 단백질 주입

0 일 째에 (P0), 마우스에 ENV 단백질(PX'Therapeutics, France)을 다음 투여량으로 단일 복강 내(i.p.) 주사하였다 (0.5 ml): 0.1, 1, 5, 10 및 20 ㎍. ENV 단백질을 무균 인산 완충용액 (PBS) (Lonza, France) 내에 희석하였다. 한 마리의 마우스는 PBS만을 투여받았다.

ENV 농도 및 생물학적 활성 감소를 피하기 위하여, 0.5 ml의 불완전 Freund 보조제 (Sigma, France) 내에 에멀젼화된 ENV 단백질의 두번째 주입을 P7에 행하였다. 각각의 마우스에 목 내에 단일 피하 주사하였다. 각각의 마우스에 대하여 사용된 ENV 단백질의 투여량은 P0에서의 첫번째 주입과 동일하였다.

미네랄유 희석제 - IFA - (0.5ml) 내에 에멀젼화된 ENV 단백질의 세번째 s.c. 주입을 P14에 목 내에 행하였다. 같은 날, 마우스에 백일해 독소 - PTX- (Wako, Germany)를 동물 당 200 ng (0.5 ml) i.p. 주사하여, CNS-외 면역세포의 통과를 위한 혈뇌 장벽을 일시적으로 개방하였다.

임상적 평가

일반적인 건강 상태 (홈 케이지 내 보행, 털 상태, 자세) 및 동물의 무게를 P14 에서 P37 동안 일주일에 5일 모니터링하였다.

조직학적 검사

모든 사망한 동물의 뇌 및 내부 기관을 제거하고, 연이은 조직학적 검사를 위하여 포르몰 (10%) 내에 보존하였다.

b. 결과

1. 임상적 모니터링

IFA 및 PTX 내 에멀젼화된 ENV 단백질 주입 후 며칠 동안, 최고 투여량의 ENV 단백질을 투여받은 모든 마우스는 체중 감소를 나타냈으며 (도 13)19 참조), 이는 홈 케이지 내 낮은 움직임 및 탈진 행동에 의하여 나타내어지는 바와 같이 일반적 건강 상태의 강한 악화와 관련이 있다. 최종적으로, 모든 마우스는 최종 주입 후 4 일 이내에 사망하였다. 놀랍게도, 더 낮은 투여량의 ENV 단백질을 투여받은 마우스는 미미한 체중 감소를 나타냈으며, 이는 낮은 투여량의 ENV 단백질을 주입한 잔류 마우스 두 마리 내에 약간 뻣뻣한 탈의 점진적 발생에도 불구하고 일반적으로 좋은 건강 상태와 관련이 있다.

최종 주입 후 일주일 동안, 생존 마우스의 체중이 안정화되거나 약간 감소하였으나 (도 13), 19 참조), 일반적인 건강 상태는 변화하지 않았다.

최종 주입 후 두번째 주 동안, 생존 마우스는 계속하여 체중이 증가되었고 (도 13)19 참조), 일반적 건강 상태가 안정화되었다.

2. 조직학적 검사

연구 목적

NOD 마우스 M4, M5 및 M6로부터 췌장의 조직병리학적 연구

재료 및 방법

포르말린 내 고정된 췌장 조직 표본을 받았다. 조직 표본을 파라핀 내 포매하고, 5 ㎛-두께로 절단하였다. 조직 부분들을 헤마톡실린-에오신-사프론으로 염색하고, 광학 현미경으로 검사하였다. 대표적인 수치화된 사진들을 촬영하였다.

결과

M4 췌장: 췌장의 전체 구성을 보존한다. 국소적 염증 병변이 존재한다: 이들은 주로 혈관주위 및 세관주위 분포로 다형성 조성물의 소 침윤을 형성한다. 외분비 췌장의 유의한 변화는 없다. 내분비 병변 자체가 관측된다: 염증 세포가 그 말초혈액 및 사멸 내분비 세포와 함께 보인다.

M5 췌장: 췌장염이 존재한다. 외분비 췌장 내에 대 염증성 침윤이 존재하며, 국소 샘꽈리 세포 괴사와 관련된다. 피브리노이드 괴사가 때때로 존재한다.

M6 췌장: 몇몇 병변이 존재한다. 큰 융합성 괴사 영역이 취장 내에 존재하며 다수의 샘꽈리 세포의 완전 괴사를 초래한다. 또한, 염증성 병변은 세포지방괴사의 초점과 함께 췌장주변 지방 조직을 수반한다. 이러한 조직학적 측면은 급성, 괴사 췌장에 있어 전형적인 것이다.

요약

- M4로부터 췌장 내 국소적 온화한 염증성 병변.

- M5로부터 췌장 내 중간 강도의 급성 췌장염.

- M6으로부터 췌장 내 심각한 급성 괴사 췌장.

c. 결론

전체적으로, 상기 결과는 ENV 단백질 주입이 NOD-SCID 마우스 내에서 5 ㎍ 보다 높은 투여량만으로 치명적임을 시사한다. 높은 투여량의 ENV 단백질을 주입한 동물들은 PTX 주입 전에 일반적인 건강 상태의 악화를 보였으므로, 주요 CNS 손상이 NOD-SCID 마우스 내에서 관측되는 ENV 단백질의 유해한 영향을 설명할 수 있을 것으로 보이지 않는다. ENV 단백질이 하나 또는 몇몇 개의 다른 기관 내에 동물의 사망을 초래하는 주요 기능 이상을 유발하였을 것이다. NOD-SCID 마우스는 당뇨병 취약 배경을 가지므로, 상기 제시한 바와 같은 사망한 동물의 췌장의 조직학적 상태는 ENV에 의하여 유도되는 췌장 염증을 높게 시사한다. 흥미롭게도, ENV-유도 염증에 의하여 제거된 인슐린 분비 세포 부재 하에, 최저 치사 투여량이 소도 베타세포 내 병변 및 내분비 췌장만을 유도하며, 이는 당뇨병 병변이 분명히 상응하고 이러한 투여량에서 마우스 사망을 설명하기에 충분하다.

더 높은 투여량은, 인간 당뇨병에서 접할 수 있는 상대적 투여량/중량 이상이며, 이와 같이 높은 수준의 ENV는 급성 괴사성 췌장에서 외분비 파트를 포함하는 전체 췌장에 달하는 훨씬 더 큰 염증을 유도하는 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, 이러한 관측은 췌장염에 부합하며, 더 높은 투여량의 MSRV-ENV 단백질 주입시 일어나는 것으로 보여진다.

4. NOD - SCID 마우스 내 ENV 단백질의 반복 주입 후 혈당의 모니터링

A. 서론

이전의 실험에서, 인간화된 NOD-SCID 마우스 내 5 ㎍의 ENV 단백질 반복 피하 주사는 해당 동물군의 사망을 초래할 수 있으며, 이는 급성 췌장 소도 세포 파괴와 관련된 것일 수 있음을 보였다. 동물의 돌연사를 야기하는 상황에서 혈당증 역학 진전의 모호한 해석을 피하기 위하여, 본 연구에서는 인간화된 NOD-SCID 마우스의 혈당증 연구를 위하여 아치사 선량의 ENV 단백질 주입을 반복하였다.

B. 재료 및 방법

1. 동물

2.a.1 참조.

2. NOD - SCID 마우스의 인간화

2.a.2 참조.

3. ENV 단백질 주입

본 연구에서는, 마우스에 4 주 동안 일주일에 1회 (P0, P9, P16 및 P23) 주입하였다. 각각의 시산 지점에 대하여, 2 마리의 마우스에 0.5 ml의 불완전 Freund 보조제 (Sigma, France) 내 희석된 2.5 ㎍의 ENV 단백질(PX'Therapeutics, France)을 목 내 피하 주사하였다. 나머지 두 마리 마우스 (대조군 마우스)에 0.5 ml의 불완전 Freund 보조제를 목 내 피하 주사하였다.

4. 혈당 측정

P0 및 P30에, 혈액 표본을 의식있는 동물 내 옆 꼬리정맥으로부터 수집하였다. 혈당 농도를 혈당 판독기(Optium Xceed, Abbott, France)를 이용하여 측정하였다.

C. 결과

아치사 선량으로 예상되는 바와 같이, ENV 단백질을 4회 주입한 마우스는 앞서 기재한 바와 같은 약간의 뻣뻣한 털의 점진적 출현에도 불구하고 4번째 주입 후에도 여전히 생존하였다.

P0에 (ENV 또는 대조군 내 위장 용액의 최초 주입일), 대조군과 ENV-주입 마우스 사이에 어떠한 명백한 차이도 감지할 수 없었다. 흥미롭게도, P30에, ENV-주입 마우스의 혈당 농도가 대조군 마우스와 비교하여 증가된 반면, 대조군 마우스의 혈당은 P0에서의 값과 다르지 않은 것으로 밝혀졌다 (도 14).

이러한 ENV-처리 동물 내 혈당 변화는 ENV-주입 동물 내 과혈당증으로의 상당히 유의한 진전을 나타내는 것이며, 이는 인간 당뇨병의 특징이며 앞선 조직병리학적 발견을 확증한다.

따라서, 상기 결과는 당뇨병에서 ENV-표적화 치료 약물 연구를 위한 적합한 예비임상 모델로서 실험적 조건을 더욱 검증하는 것이다.

실시예 13 : 적절한 동물 모델 내 당뇨병-관련 질환 발생의 예방에 있어서, 키메릭 Ig4 리간드 형태 하에 GNb AC1 리간드의 치료 효과의 증거.

1. 재료 및 방법

a.1. 동물

본 연구는 이전의 실험에 사용된 낮은 투여량의 ENV 단백질 (0.1 및 1 ㎍)을 주입한 두 마리 생존 마우스에 대하여 수행되었다.

2. 실험 절차

5 ㎍의 ENV 단백질의 반복 주입은 마우스의 신속한 사망을 초래하는 것으로 보여졌으므로, 본 발명의 리간드의 이로운 효과의 평가를 위하여 이와 같은 공격적 투여량을 사용하였다. 앞선 실험에서 기재한 바와 같이, P50, P57 및 P64에, 마우스에 IFA (0.5 ml) 내 에멀젼화된 ENV 단백질을 목 내 3회 s.c. 주사하였다. 각각의 시간 지점에서, 마우스에 같은 날 100 ㎍의 GNb AC1 IgG4 키메릭 리간드를 단일 i.p. 주사(0.5 ml)하였다. 각각의 마우스의 임상적 상태 및 중량을 P50에서 P81까지 일주일에 5일 모니터링하였다.

3. 결과

120일의 조사까지 처리 동물의 관측은 이들 동물들이 장기간 생존하였음을 분명히 나타낸다. 따라서, GNbAC1 주입은 이들을 보호하고 치사량의 MSRV-ENV의 3회 연속 주입까지 생존하도록 하였다.

조사 기간 동안, 상기 동물들의 일반적 건강 상태는 좋게 유지되었으며, 생리학적 범위 내에서 (비만이 관측되지 않음) 체중이 지속적으로 증가되었다.

따라서, 췌장염을 초래하는 당뇨병 병변을 확증하는 상기 동물 모델 내에서, GNb AC1 IgG4 리간드가 MSRV ENV의 치사 투여량에 대하여 효과적이며, 염증 및 MSRV ENV 발현과 관련된 당뇨병 또는 췌장염 또는 항원혈증과 같은 질환에서 목적으로 하는 치료 효과를 가지는 것으로 결론내릴 수 있다.

실시예 14: (i) 인간화된 IgG4 가변 사슬 내로 삽입을 위한 제1 단계 최적화, ( ii ) IgG4 벡터에 내 최적의 표적( ENV -단백질) 결합 활성을 위한 CDR 서열의 최상의 조합의 선택, 및 ( iii ) CHO 세포 내 IgG4 안정한 발현을 위한 최적화의 선택을 포함하는, 본 발명의 리간드로부터 6 CDR 아미노산 서열을 포함하는 IgG4 이소타입 체인을 가지는 GNb AC1 인간화된 항체의 디자인, 구성 및 실험실 내 분석.

A. 본 발명의 리간드를 가지는 인간화되고 안정화된 IgG4 항체 벡터를 얻기 위한, 분자 구조물의 디자인, 생산 및 구조물의 선별

1. GNb AC1 쥐 안티 - ENV 항체의 Fv 영역의 분석

GNb AC1 쥐 항체의 인간화를 위한 적합한 인간 체제를 찾기 위하여, GNb AC1 중쇄 및 경쇄 Fv 영역의 아미노산 서열을 Panorama Research Institute (1230 Bordeaux Drive, Sunnyvale, California 94089, USA)로부터의 인간 항체 생식세포 유전자 데이터베이스를 이용하여 정렬하였다. 최고 히트의 인간 생식세포 V 유전자를 인간 V 유전자 후보로 동정하였다.

상기 데이터베이스 조사로부터, 인간 VH1-46 및 VH1-69 유전자가 쥐 GNb AC1 경쇄와 가장 근접한 서열을 가지는 것으로 확인되었다. 따라서, VH1-69를 인간화를 위한 인간 체제로 선택하였다. 동일한 데이터베이스를 이용하여, 인간화된 중쇄 내 체제 4를 위하여 사용될 인간 JH4 서열을 동정하였다.

항체 경쇄에 대하여, VK1-5, VK3-11, VK1-33, VK1-39는 쥐 항체 경쇄에 높은 상동성을 나타냈다. 따라서, 경쇄의 인간화를 위하여 VK1-39을 선택하였다. 동일한 방법을 이용하여, 인간 항체 경쇄의 체제 4의 구성을 위한 JK4를 동정하였다.

인간화된 항체의 인간 VH 사슬 내로 이식을 위한 CDR 영역을 정의하기 위하여, 본래 쥐 항체 가변 중쇄 내에 이러한 CDR 영역의 적응되고 최적화된 설계를 재평가하였다. 따라서, 바람직한 정의로서 Kabat 정의 및 Chothia 정의의 조합을 이용하였다 (Johnson G, Wu TT. Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Res 2001; 29: 205-6. and Chothia C, Gelfand I, Kister A. Structural determinants in the sequences of immunoglobulin variable domain. J Mol Biol 1998; 278: 457-79). 요약하면, Chothia 정의는 구조적 가변성의 특혜를 주는 반면, Kabat 정의는 서열 가변성의 특혜를 준다. GNb AC1 쥐 항체 중쇄의 CDR 영역을 앞서 기재한 바람직한 정의에 따라 인간 IgG4 가변 중쇄 (VH) 내로 기능적 삽입을 위한 바람직한 영역의 선별과 함께 도 15에 도시한다 (SEQ ID No. 33, 34 및 35).

인간화된 항체의 인간 VL 사슬 내로의 이식에 적합한 CDR 영역을 정의하기 위하여, 또한 본래 쥐 항체 가변 경쇄 내에 이들 CDR 영역의 적응되고 최적화된 설계를 재평가하였다. 따라서, Kabat 정의(Johnson G, Wu TT. Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Res 2001; 29: 205-6) 및 Contact 정의(Panorama Research Institute, CA, USA)의 조합을 이용하였다. 쥐 항체 경쇄에 대한 평가 후, CDR 영역 정의에 대한 바람직한 정의로서 Kabat 정의를 이용하였다. 항체 경쇄에 대하여 선별된 CDR 영역을 도 16에 도시한다 (SEQ ID 36, and SEQ ID 38).

2. 인간화된 중쇄 가변 영역

쥐 항체 CDRs 및 인간 생식세포 VH1-69 유전자에 근거하여, GNb AC1 중쇄의 인간화를 위하여 7 VH 서열을 디자인하였다. 이들은 H1, H2, H3, H4, H4A, H4B, 및 H4C로서 디자인되었다. 이들 V 영역의 DNA 단편을 합성하고 인간 IgG4 불변 영역 cDNA의 5에 융합하여 7 전장 IgG4 중쇄를 창출하였다. 상기 전장 IgG4 종쇄를 CMV 프로모터의 pCMV 플라스미드 백본 다운스트림 내로 삽입하였다 (실시예 4 참조). 올바른 중쇄 삽입물을 함유하는 클론을 제한 효소 절단에 의하여 확인하고, 시퀀싱 분석에 의하여 그 DNA 서열을 결과적으로 확인하였으며, 각각 SEQ ID No. 39 내지 SEQ ID No. 45에 상응한다.

3. 인간화된 경쇄 가변 영역

쥐 항체 경쇄 CDRs 및 인간 생식세포 VK1-39 유전자에 근거하여, 3 개의 인간화된 VL 서열을 디자인하고 합성하였다. 이들 서열들을 VK1, VK2, 및 VK3로서 명명하였다. 상기 3 개의 VK DNA 단편을 인간 kappa 사슬 서열을 함유하는 pTT5 플라스미드 백본 내에서 kappa 불변 영역에 융합하였다. 각각의 경쇄 오픈 리딩 프레임은 CMV 프로모터에 의하여 구동된다. 유전자 발현을 증가시키기 위하여, 상기 kappa 경쇄 서열은 또한 VL 및 경쇄 불변 영역의 연결부에 인트론을 포함한다. 올바른 삽입물을 가지는 플라스미드 클론을 제한 효소 절단에 의하여 확인하고, 그들의 서열을 DNA 시퀀싱 분석에 의하여 확인한 바 각각 SEQ ID No. 46 내지 SEQ ID No. 48에 상응한다.

4. 인간화된 항체 변이체의 발현

항체를 발현시키기 위하여, 7 개의 중쇄 및 3 개의 경쇄의 플라스미드를 플라스미드 DNA 정제 Maxi 키트 (Qiagen)를 이용하여 정제하였다. 또한, 키메릭 GNb AC1 IgG4 중쇄 및 키메릭 GNb AC1 kappa 경쇄를 위한 플라스미드 (GeNeuro에 의하여 제공됨)를 동일한 키트를 이용하여 정제하였다. 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포를 무혈청 배지 (Invitrogen) 내에서 6-웰 플레이트 내에서 배양하고, 다양한 조합의 경쇄 및 중쇄 플라스미드로 1:1 DNA 비율로 동시-형질감염시켰다. 형질감염을 Invitrogen freestyle Max 형질감염 시약을 이용하여 수행하였다. 총 32 형질감염을 수행하였으며, 이는 8 중쇄 (7 인간화된 중쇄 + 1 키메릭 중쇄) 및 4 경쇄 (3 인간화된 경쇄 + 1 키메릭 경쇄)의 조합을 포함하였다. 형질감염 후 3 일째, 세포 배양 상청액을 정제된 키메릭 GNb AC1 IgG4 항체 (GeNeuro에 의하여 공급됨)를 이용하여 표준 곡선을 얻는 인간 IgG4 ELISA 분석에 의하여 결정하였다.

5. 인간화된 항체 변이체의 예비 스크린

인간화된 항체 변이체를 평가하기 위하여, CHO 세포 내 키메릭 중쇄 및 키메릭 경쇄의 동시-형질감염으로부터 생성된 키메릭 항체를 ENV 단백질에의 결합 활에 대한 벤치마크/양성 대조군으로서 이용하였다. 키메릭 GNb AC1 항체 및 모든 인간화된 항체 변이체는 IgG4 포맷이므로, 고정화된 MSRV ENV 단백질을 이용하는 ELISA-기초 결합 분석을 편리하게 이용하여 상대적인 항체 결합 활성을 평가할 수 있다. 이러한 결합 분석에서, ELISA 플레이트를 정제된 재조합 ENV 단백질 (GeNeuro에 의하여 제공됨) 1mg/ml로 코팅하였다. 상기 플레이트를 1% BSA로 블록킹하고, 다양한 희석의 안티-ENV 항체를 상기 웰에 적용하였다. 결합된 항체를 HRP와 컨쥬게이션된 2차 안티-인간 IgG Fc 항체에 이은 HRP 공제 (KPL)를 이용한 색 전개에 의하여 검출하였다. 이러한 분석을 이용하여, 상기 키메릭 안티-ENV IgG4 항체가 고정화된 ENV에 매우 우수한 결합 활성을 가짐을 보였다 (도 17).

동일한 결합 분석을 이용하여, 다양한 조합의 인간화된 중쇄 및 경쇄 서열로 형질감염된 CHO 배양액으로부터 수확된 상청액을 평가하였다. 최상의 항체 결정을 위한 두 개의 기준을 정하였다:

- 인간화된 항체는 키메릭 GNb AC1 항체에 근접하는 결합 활성을 가져야 한다.

- 인간화된 항체는 중쇄 및 경쇄 플라스미드의 동시 형질감염 후 상청액 내에서 적합한 발현 수준, 즉 > 100 ng/ml을 가져야 한다.

이러한 선별 기준에 근거하여, H2/VK3을 그 우수한 결합 활성 (도 180 및 발현 (6-웰 플레이트 내 >1 1ug/ml)으로 인하여 최상의 항체로 선별하였다. H4/VK3는 ENV 단백질에의 결합 활성이 H2/VK3 보다 낮으므로 (도 19), 두번째로 좋은 항체였다. 세번째 항체 H1/VK3는 우수한 결합 활성을 가지나, 항체 발현에 있어서는 떨어진다 (6-웰 플레이트 내 <10 ng/ml) (데이터 도시하지 않음). 이러한 예비 스크린에 근거하여, 추가적인 평가에서 H2/VK3에 집중하기로 결정하였다.

6. 추가적인 H2 / VK3 평가

예비 스크린 후, 정규화된 항체 농도를 이용하는 결합 분석으로 H2/VK3를 키메릭 안티-ENV IgG4 항체와 추가로 비교하였다. 상청액 내 항체 H2/VK3의 농도를 정제된 키메릭 GNb AC1 항체를 표준으로 이용하여 IgG4 ELISA로 조심스럽게 측정하였다. 상청액 내 H2/VK3 항체 및 정제된 키메릭 GNb AC1 IgG4 항체를 동일 농도로 희석하여 ENV-결합 ELISA 분석으로 비교하였다. 이러한 분석은 인간화된 H2/VK3 항체가 키메릭 IgG4 안티-ENV 단백질과 거의 동일한 ENV-결합 활성을 가짐을 보였다 (도 20).

다음, 충분한 양의 H2/VK3 항체가 정제될 수 있도록 H2/VK3 발현 규모를 확대하였다. pCMV H2 및 pTT5 VK3 플라스미드를 플라스미드 정제 maxi 키트 (Qiagen)를 이용하여 제조하였다. CHO 세포를 무혈청 CHO 배지 내에서 배양하고, Invitrogen Freestyle Max 형질감염 시약을 이용하여 2 개의 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질도입 후 5 일째에, 세포 배양 상청액을 수확하고 3400 rpm에서 15 분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 상청액을 단백질 A 컬럼 (GE)를 통과시키고, PBS로 세척하고, pH 3.5 용리 완충액으로 용리하였다. 단백질 함유 분획을 풀링하고, 분자량 컷오프 10 kD를 가지는 Amicon 스핀 컬럼에 의하여 적절한 부피로 농축하였다. 인간 IgG4 ELISA에 의하여 항체 농도를 결정하고, Bradford 단백질 분석 (Bio-Rad)에 의하여 확인하였다. 정제된 H2/VK3 항체를 비-환원 SDS-PAGE 겔 내에서 체크하였더니, 분자량 약 150 kD에서 단일 밴드가 관측되었다 (도 21).

최종적으로, ENV-결합 분석으로 정제된 H2/VK3를 정제된 키메릭 GNb AC1 항체와 비교하였다. 결과는 정제된 H2/VK3이 정제된 키메릭 항체와 거의 동일한 결합 활성을 가짐을 보인다 (도 22). 이러한 데이터에 근거하여, H2/VK3은 기준에 부합하며 인간화된 GNb AC1 항체로서 선별된 것으로 결론내렸다. 앞서 기재한 결합 활성 데이터 (도 3-6 및 8)를 고려하여, 인간화된 항체 내 리간드 활성을 유지하기 위하여 필요한 6 CDR 서열들을 선별된 인간화된 IgG4 항체 벡터의 H2 및 VK3 사실의 아미노산 서열 내로 삽입하고 (도 22), SEQ ID No. 49 내지 SEQ ID No. 54에 기재한다.

이들은 1차 인간 VH 및 VL 구조물 내 적절한 삽입을 위하여 처음 선택되었던 쥐 VH 및 VL 사슬 내에서 분석된 CDR 서열로부터의 선별 및 돌연변이에 의하여 최적화되었다 (SEQ ID 33-38). 선별된 인간화된 H2 중쇄 및 VK3 경쇄 (선별된 인간화된 IgG4 구조물을 위한) 아미노산 서열 및 그 잔류 쥐 잔기를 또한 도 23에 도시한다.

무혈청 CHO 배지 내에서 pCMV H2 및 pTT5 VK3 플라스미드의 동시-형질감염에 의하여 CHO 세포로부터 H2/VK3 완전한 인간화된 항체 구조물 1 mg을 생산하고, 이러한 H2/VK3 항체를 단백질 A 컬럼에 의하여 정제하였다.

7. S241P 돌연변이를 이용한 인간화된 안티 - ENV mAb 의 생산

IgG4 항체는 때때로 생체 내에서 기능적으로 1가인 것으로 밝혀진다. 최근 연구에 따르면, 이는 IgG4 분자 중 IgG 반-분자 (1 H-플러스 1 L-사슬)의 생체 내 교환으로 인한 것으로 밝혀졌다. 이러한 과정은 대부분의 상황에서 기능적으로 1가 항체로서 작용하는 2-특이성 항체를 초래한다 (Aalberse and Schuurman 2002, IgG4 breaking the rules, Immunology. 2002, 105:9-19). 이는 주로 잔기 포지션 241 (힌지 부위)에서 P의 S로의 변화로 인한 내부사슬 디설파이드 브릿지의 불안정성에 의하여 야기되며, 항체 특이성 및 성능을 감소시킬 것이다. 이러한 문제를 피하기 위하여, 가능한 아미노산 치환 (www.NCBI-ENTREZ 상에서 얻을 수 있는 소프트웨어, 예를 들어. Protein Cn3D viewer, 또는 M CLC Main Workbench , CLC Bio company , Aarhus, Denmark, 또는 Panorama Research Institute, CA, USA 에서 개발된 소프트웨어를 이용하여)의 3D 단백질 평가를 수행하였다. 따라서, 뉴클레오티드 구조물 내에서 이를 인코딩하는 최적화된 뉴클레오티드로부터 포지션 241의 기존의 세린 (S) 잔기를 프롤린 (P) 잔기로 치환하는 것으로 이루어지는 1차 뉴클레오티드 서열의 변형은 상기 리간드를 가지는 IgG4 항체 벡터의 불안정성에 대한 해결책인 것으로 생각하였다. 따라서, 부위 지정 돌연변이를 수행하고, PCR 산물을 H2 S241P로 명명되는 pCMV 플라스미드 내로 클로닝하였다. 상기 침묵(muted) H2 중쇄의 DNA 서열을 시퀀싱 분석에 의하여 확인하였다.

이러한 최적화를 이제 앞서 기재한 바와 같이 VL 및 경쇄 불변 영역의 연결부 내 인트론을 포함시킴과 함께, kappa 경쇄 서열의 변형과 조합하여 유전자 발현을 증가시킨다.

1차 아미노산 구조 또는 최종 산물의 생산율에 영향을 미치는 뉴클레오티드 돌연변이 또는 삽입에 의한 이미 선별된 클론으로부터 최적화된 서열들의 조합을 도 24에 도시하며, 여기서 아미노산 조성 및 그 고유의 구조를 가지는 IgG4 항체 산물에 상응하는 서열이 본 발명의 리간드가 그 표적 ENV 단백질 항원에 대한 기능적 결합 특성을 보존하기 위한 최적화된 안정하고 고도로 발현되는 벡터를 제공한다. 이는 인코딩 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID 55) 및 아미노산 서열 (SEQ ID 56)을 가지는, 안티-ENV 인간화된 항체 중쇄 H2 S241P의 최종 서열을 도시한다. 이는 또한 인코딩 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID 57)을 가지는 안티-ENV 인간화된 항체 경쇄 VK3의 최종 서열을 도시하며, 여기서 인트론에 밑줄쳐져 있다: (SEQ ID 58). 인트론 없는 경쇄 VK3의 스플리싱된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID 59 과 같다. 마지막으로, 최종적으로 최적화된 경쇄 VK3에 상응하는 인코딩된 아미노산 서열을 도시한다 (SEQ ID 60).

마지막으로, CHO 세포로부터 S241P 돌연변이를 가지는 인간화된 항체의 최종 버젼 2 mg을 생산하였다. pCMV H2 S241P 및 pTT5 VK3 플라스미드를 Qiagen 플라스미드 DNA Maxi 키트에 의하여 정제하였다. CHO 세포를 무혈청 CHO 배지 내에서 배양하고, Freestyle 형질감염 Max 시약(Invitrogen)을 이용하여 pCMV H2 S241P 및 pTT5 VK3 플라스미드로 형질감염시켰다. 5일 후, 세포 배양 상청액을 수확하고, 3400 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 항체 단백질을 단백질 A 컬럼 (GE)를 이용하여 정제하였다.

B. 본 발명의 리간드를 가지는 키메릭 및 인간화된 IgG4 항체 벡터의 CHO 세포 발현을 위하여 최적화된 아미노산 및 뉴클레오티드 서열

B1. 항체 mAb GNb AC1의 키메릭 및 인간화된 버젼의 단백질 및 코돈-최적화된 (CHO 세포 발현을 위하여) 뉴클레오티드 서열

B1.1 키메릭 GNb AC1

chGNb AC1 IgG4 성숙 단백질에 해당하는 서열을 SEQID 61에 기재한다.

chGNb AC1 LC 성숙 단백질에 해당하는 서열을 SEQ ID 62에 기재한다.

B1.2 인간화된 GNb AC1

huGNb AC1 IgG4 성숙 단백질의 해당 서열을 SEQ ID 63에 기재한다.

huGNb AC1 LC 성숙 단백질의 해당 서열을 SEQ ID 64에 기재한다.

B2. 플라스미드 서열을 포함하는 GNb AC1의 인간화된 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열

huGNb AC1 LC의 뉴클레오티드 서열을 SEQ ID 65에 기재한다.

huGNb AC1IgG4HC의 뉴클레오티드 서열을 SEQ ID 67에 기재한다.

C. 선별된 인간화된 IgG4 리간드 (안정화되고 코돈-최적화된 인간화된 IgG4 항체 벡터)의 결합 활성의 실험실 내 상호보완적 분석

C1 . 생화학적 항체 결합 분석

프로토콜: 중탄산염 50 mM pH9.6 완충액 내 37℃에서 2 시간 인큐베이션 - PBS BSA 1% 내에 실온에서 1 시간 동안 희석된 항체를 이용하여 검출 - PBS BS1 A% 내에 1/1000 희석되고 실온에서 1 시간 인큐베이션된, 퍼옥시다아제로 각각 표지된 2차 안티 마우스 및 안티 인간 항체로 검출 (ref 115-035-146 및 ref 109-035-088, Jackson, USA). OPD 기질을 첨가하고 30 분 후 분광광도계로 광학 밀도를 판독하여 밝힘 (PBS 세척 단계를 매 단계 사이에 수행함).

표 19: 표적 단백질, MSRV-ENV와 GNb AC1 인간화 항체의 투여량-반응 결합 역학

상기 결과는 두 실험에서 인간화된 IgG4 항체가 고정된 ENV-단백질 표적 및 항체 연속 희석 (표의 상부) 또는 고정된 항체 농도 및 표적 단백질 희석 (표의 하부) 중 하나로 재현가능한 투여량-반응 역학을 가짐을 분명히 보여준다. 이는 키메릭 항체 이소타입의 것과 동등하나, 본래 GNb AC1 항체 보다 훨씬 나은 반면, 부적절한 대조군 항체 (2G5E12)에 대해서는 유의한 결합 역학이 보이지 않는다.

C2 . PBMC 반응성 시험

재료 및 방법: 실시예 6 참조

표 20. 인간화된 및 키메릭 IgG4 항체 벡터 모두 내에 삽입된 GNb AC1 리간드에 의한, MSRV ENV 단백질로 PBMC 배양액 내 II -6 및 IFN -γ 전구염증성 사이토카인의 억제. NB . ENV 없는 배경 시그널을 아래 나타내고 ( ENV 없음), 박테리아 LPS에 의한 대조군 양성 유도를 맨 아래에 나타낸다.

상기 결과는 다음의 상당한 억제를 입증한다:

(i) 말초혈액 단핵 세포 배양액 (완전한 ENV 단백질, ENV-T, 0.1 ㎍/ml로) 내 24h에서 절정인 MSRV ENV 단백질에 의하여 유도되는 인터루킨 6 (II-6)이 인간화된 및 키메릭 항체 모두에 의하여 억제된다.

(ii) 말초혈액 단핵 세포 배양액 (ENV 단백질의 표면 단편,ENV-SU 0.5 ㎍/ml로) 내 72h에서 절정인 MSRV ENV 단백질에 의해 유도되는 인터페론 감마 (IFN-γ)가 인간화된 항체의 존재 하에 강하게 억제되나, 키메릭 항체의 존재 하에서는 그러하지 않다. 이는 따라서 키메라화된 항체와 비교하여 인간화된 항체의 T-세포 활성화에 대한 개선된 효과를 입증한다. 키메릭 벡터 내에, 잔류 쥐 VH 및 VL 사슬은 이종항원(프레임워크 내 이식된 쥐 단백질 사슬)의 인간 T-세포 인식을 통하여 불리한 면역 활성화를 유발할 수 있다. ENV 단백질에 결합하는 리간드의 선별된 인간화된 IgG4 벡터의 경우 그러하지 않다. IL-6은 특이적 항원 인식(T-림프구와의 후천적 면역)을 수반하지 않고 표적 면역병원성 ENV 단백질에 결합시 리간드에 의하여 블록킹되는 선천적 면역 활성화만을 수반하므로, 이러한 차이는 IL-6에서는 24h에서 보이지 않는다.

실시예 15 : 염색체 7q ( Syncytin )으로부터의 HERV -W 엔벨로프 단백질 및 MSRV 입자 모두 안티 - MSRV - ENV 항체 GNb AC1 및 리간드를 가지는 그 키메릭 IgG4 구조물에 의하여 억제되는 면역 및 성상교세포에 대한 전구염증성 반응을 유도한다.

인간 내 면역병원성 특징과 ENV 단백질의 생물학적 효과 사이의 연관성이 증가된다. MSRV-ENV 및 Syncytin은 91% 이상의 서열 동일성을 가지므로 (Mallet, Bouton et al. 2004; Mameli, Astone et al. 2007), 이들 두 자매 단백질이 유사한 전구염증성 효과를 나타내는지 여부를 조사하였다. 말초혈액 단핵 세포 (PBMCs) 및 뇌 성상교세포에 대한 이전의 연구는 MSRV-ENV 또는 Syncytin 각각에 대한 반응성을 나타내었으므로, 두 세포 유형 모두에 대한 동시 분석을 수행하였다.

방법

단백질 제조 및 분리

실시예 2 참조

세포 분리 및 제조

인간 PBMCs를 Ficoll-Paque 상에서 밀도 구배 원심분리에 의하여 건강한 기증자의 연막으로부터 분리하였다 (Transfusion Center -HUG -Geneva).

인간 성상교세포를 InVivogen으로부터 주문하였다.

세포 자극

PBMCs를 1% 비필수 아미노산, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% 소듐-피루베이트 및 10% 열-불활성화 FCS (BioWest)으로 보충된 RPMI Glutamax 1640 (Invitrogen)로 이루어지는 배지 1 ml 내에 1x10⁶/웰의 농도로 24 또는 48-웰 플레이트 내에 플레이팅하였다. 세포를 가습화된 분위기 내에서 24, 48 또는 72 시간 동안 5% CO2 내에서 37℃에서 인큐베이션하였다.

세포 배양 실험을 위하여, Syncytin, MSRV-ENV 및 LPS를 ENV에 대항하는 항체(GNb AC1 단일클론 마우스 IgG, GeNeuro)를 가지는 배지 100 ml 내에서 세포에 첨가하기 전 1 내지 4 시간 동안 예비 인큐베이션하였다.

사이토카인 생산 분석

배양 상청액을 24, 48 또는 72 시간에서 수확하고, ELISA에 의한 사이토카인 생산 평가 전에 -20℃에서 저장하였다. 인간 사이토카인 검출을 위한 BD Bioscience로부터의 OptEIA ELISA 키트를 제조업자 지시에 따라 수행하였다.

결과

MSRV - ENV 및 Syncytin 은 두 개의 HERV -W 관련 단백질이다.

HERV-W Syncytin 엔벨로프 단백질 (Accession number NCBI AF072056.2)과 관련된 생물학적 특성을 MSRV-ENV (Accession number NCBI AF331500.1)와 비교하기 위하여, 본 연구를 위한 유사한 조건 하에 (실시예 2에 기재된 조건) 상기 두 개의 단백질을 발현 및 생산하였다.

상기 두 개의 HERV-W 관련 단백질의 생물학적 효과를 비교하기 위하여, 전구염증성 사이토카인 유도에 있어서의 이들의 효과를 연구하였다. HERV-W ENV 관련 단백질을 이용한 자극이 전구염증성 인터루킨 6 (IL-6) 성상교세포 반응을 강하게 상향 조절함을 발견하였다. 가장 중요한 것은, 이러한 자극이 부적절한 항체 (어떠한 ENV에도 결합하지 않는)에 의하여 영향을 받지 않으나, GNb AC1 쥐 항체 및 GNb AC1 인간 키메릭 IgG4에 의하여 강하게 억제되는 것이며, 이는 본 발명의 리간드가 어떠한 형태의 항체 벡터 내에서든 HERV-W ENV 관련 변이체의 전구염증성 효과를 억제하며 MSRV-ENV만의 효과는 억제하지 않음을 분명히 입증한다.

도 24에, 각각의 HERV-W ENV 관련 단백질의 존재 하에 배양 상청액 내에 IL-6 배출 투여에 의하여 이러한 유사한 생물학적 효과의 예를 나타낸다. 이는 쥐 또는 IgG4 키메릭 항체 형태의 GNb AC1 리간드에 의해서도 억제되므로 특이한 효과이다. 이에 따라, 상이한 HERV-W ENV 관련 단백질에 대한 상기 리간드의 유사한 억제 효과가 또한 입증된다.

국소적 뇌 병변 및 염증에 수반되는 성상교세포 외에도, 인간 말초혈액 단핵세포 (PBMC, 즉 림프구 및 단핵구) 배양액 내에 전구염증성 사이토카인의 생산을 자극하는 MSRV-ENV 및 Syncytin 모두의 전신 면역 효과를 보였다.

도 25에서, PBMC에 대한 이러한 유사한 생물학적 효과의 예를 IL12 P40 (천연 면역 반응의 특징)의 검출에 의하여 검증하고, 두 HERV-W ENV관련 단백질에 대한 배양 상청액 내 동일 투여량의 IL-6 배출에 의하여 확인한다. 또한, 성상교세포를 이용한 실험에 대하여, IL-6 배출은 또한 쥐 또는 IgG4 키메릭 항체 형태의 GNb AC1 리간드에 의하여 특이적으로 억제된다.

실시예 16 : GNb AC1 리간드 및 상기 리간드를 포함하는 재조합 인간- 키메릭 IgG4 GNb AC1 항체 및 인간화된 IgG4 항체는 MSRV - ENV 및 HERV -W ENV 7q/인간 세포 글리코실화를 가지는 Syncytin 단백질 모두에 결합한다.

1. 재료 및 방법

a. ENV 박테리아 재조합 단백질을 실시예 2에 기재된 바와 같이 수득하였다.

b. 인간 글리코실화 MSRV ENV 단백질을 Geneuro, P'X therapeutics, Grenoble, France에 의하여 다음 절차에 따라 생산하였다: Syncytin으로 명명되는 HERV-W-ENV 유사 단백질을 동일 프로토콜로 생산하였다.

인간 세포 발현으로부터 ENV 글리코실화 정제된 단백질의 생산 과정

형질 감염:

HEK-비함유 세포를 10⁶ 세포/ml로 시딩하고, 293Fection 형질감염 시약을 이용하여 Env-MSRV_pMCMVHE/1로 형질감염시켰다.

수확 및 용균:

형질감염 후 3 일째에, 세포를 수확하고 원심분리하였다. 세포 펠렛을 용균 완충액 (안티-프로테아제로 보충된 PBS) 내에 재현탁시키고 초음파 처리에 의하여 세포를 파괴시켰다.

가용화 :

원심분리 후, 펠렛을 가용화 완충액 (50 mM Tris pH8, 100 mM NaCl, 2M 우레아, 2% FOS-콜린10) 내에 재현탁시키고, +4℃에서 교반 하에 밤새 가용화하였다.

정제 전 희석:

다음날, 가용화된 단백질을 희석 완충액 (50 mM Tris pH8, 100 mM NaCl) 내에 4 회 희석하고 정제 전 균질화하였다.

풀 1 EnvMSRV His tag 정제 방법: Ni 세파로오즈 친화성 크로마토그래피

Ni 세파로오즈 친화성 크로마토그래피(GE Heathcare, 4 ml)를 수행하여 His 태그된 Env-MSRV를 정제하였다.

평형과 완충액: 50 mM Tris pH8, 100 mM NaCl, 0.5% FOS-콜린10, 0.5M 우레아.

용리 완충액: 50 mM Tris pH8, 100 mM NaCl, 0.5% FOS-콜린10, 0.5M 우레아, 1M 이미다졸.

용리 단계: 30CV 0 내지 100% 용리 완충액 상에서 구배

풀 농도: Amicon 컷오프 30kDa를 이용하여 7 배

풀 2 EnvMSRV His tag 정제 방법: Ni 세파로오즈 친화성 크로마토그래피

제2 친화성 크로마토그래피를 출발 물질로서 첫번째 것의 플로우 스루를 이용하여 수행하였다 = 적재, 50 mM Tris pH8, 100 mM NaCl, 0.2% FOS-콜린10, 0.5M 우레아 희석

평형화 완충액: 50 mM Tris pH8, 100 mM NaCl, 0.2% FOS-콜린10, 0.5M 우레아.

용리 완충액: 50 mM Tris pH8, 100 mM NaCl, 0.2% FOS-콜린10, 0.5M 우레아, 1M 이미다졸.

용리 단계: 30CV 0 내지 100% 용리 완충액 상에서 구배

품질 조절:

SDS-PAGE 품질 조절 분석에 이어 Coomassie 블루 염색 및 GNb AC1 쥐 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석하였다. N-말단 시퀀싱은 정제된 단백질의 동일성을 확인하였다.

배치 투석 및 동결

10% 글리세롤을 첨가하고 액체 질소 내 동결하기 전에, Env-MSRV 2 배치를 50 mM Tris pH8, 100 mM NaCl, 0.5% or 0.2% FOS-콜린10에 대하여 투석하였다.

c. ELISA 시험을 이용한 특이적 결합 검출

모든 ENV 제제를 CaCO₂ 완충액 50mM pH9.6 내에 희석시켰다; ELISA 마이크로플레이트 내 단백질 코팅을 위하여, 이들을 Elisa 마이크로플레이트 웰 내에서 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 그럼에도 불구하고, 더 낮은 생산율로 인하여, 코팅된 Syncytin 농도는 MSRV-ENV 농도보다 떨어졌다.

검출 항체를 PBS BSA 1% 내에 희석시키고, 실온에서 1 시간 3 개의 마이크로플레이트 웰 내에서 인큐베이션하였다. 쥐 단일클론 (ref 115-035-14)에 대한 퍼옥시다아제-표지 안티-마우스 2차 항체 및 인간화 및 인간-키메릭 재조합체(ref 115-035-088)에 대한 안티-인간 2차 항체를 PBS BSA 1% 완충액 내에 희석하고 실온에서 1 시간 인큐베이션하였다. 퍼옥시다아제에 대한 OPD 발현을 30분 동안 수행한 후, 490 nm에서 광학 밀도를 판독하였다. 각 인큐베이션 단계 사이에 세척을 4,4, 및 6 세척 사이클로 각각 수행하였다.

2. 결과:

도 26에서 볼 수 있는 바와 같이, MSRV-ENV의 박테리아 및 인간-글리코실화되고 정제된 단백질 제제 상기 리간드를 가지는 모든 항체 유형(쥐, 키메릭 및 인간화)에 의하여 쉽게 검출되었으며, 발광 광학밀도 측정에 있어서 좋은 시그널을 생산하였다. 흥미롭게, 본원의 ELISA 조건에서, 인간화된 항체 GNb AC1 리간드만이 인간 글리코실화된 Syncytin의 우수한 인식을 나타낸 반면, 이러한 코팅 농도에서, 쥐 및 키메릭 항체는 Syncytin으로 낮은 시그널을 생산하였다.

이러한 결과는 본 발명의 리간드가, 표적 에피토프에의 결합을 위하여 사용되는 분자 벡터가 무엇이든 (쥐, 키메릭 IgG4 또는 인간화된 IgG4 항체), 상기 에피토프을 포함하는 모든 형태의 표적 단백질, 즉 박테리아 및 인간 글리코실화된 ENV 단백질 모두에, 특히 인간화된 항체, HERV-W 관련 단백질, Syncytin으로도 명명되는 MSRV-ENV 및 HERV-W 7q ENV 단백질 모두와 효과적으로 결합함을 분명히 보인다.

따라서, 상기 치료적 리간드는 표적 ENV 단백질의 인간 글리코실화된 형태에 결합한다.

실시예 17 : MSRV ENV 에 의하여 유도되는 정신분열증 행동 이상의 동물 모델 내에서 치료 효과를 가지는 IgG4 이소타입을 가지는 GNb AC1 키메릭 항체의 생체 내 분석.

I. 서론

실시예 8에서, 정신분열증 환자의 혈청 내 MSRV-ENV 단백질의 존재를 입증하였다. 이러한 결과는 적합한 동물 모델 내에서 ENV 단백질의 존재와 뇌 변화 및 행동 결핍 출현의 관계를 연구할 필요성을 분명히 보여준다. 정신분열증의 신경발달 이론은 상기 질환이 임상적으로 드러나기 오래전 주요 행동의 행동적 결과인 것으로 상정한다 (Weinberger and Lipska, 1995; Lewis and Levitt, 2002). 따라서, 이러한 생리 병리학적 특징을 정신분열증-관련 질환을 모방하는 적합한 동물 모델의 디자인에서 고려하여야 한다.

II. 실험 1: 초기 성년기에 ENV -유도 면역 프라이밍을 받은 래트 내에서 ENV 단백질의 측뇌실 주입 반복에 따른 행동적 및 해부학상 변화에 대한 IgG4 키메릭 항체의 영향.

A. 재료 및 방법

1. 동물

수컷 Sprague-Dawley 래트(6 내지 8주령)(n=8)를 Charles River, France로부터 구입하였다. 동물들을 음식물 및 물에 임의로 접근하도록 하면서 표준 명-암 사이클로 케이지 당 3 마리 유지하고, 8 일의 순응 기간 동안 방해하지 않았다. 모든 절차는 1986. 12. 24 European Communities Council Directive (86/609/EEC) 및 1987. 10. 19 National Council Directive (87848, Ministere de l'Agriculture et de la Foret, France)에 따른다. 사용되는 동물 및 그들의 고통을 줄이기 위하여 모든 노력을 하였다.

2. ENV-유도 쥐 프라이밍

지점 0 (P0)으로 명명되는 첫번째 날, 래트를 인산 완충 용액 (PBS)(Lonza, France)를 주입하는 위장-주입군 (n=2) 및 PBS 내 용해된 250 ng의 재조합 ENV 단백질 (His-ENVT-081206-1, PX'Therapeutics, France)를 주입하는 ENV-주입군 (n=6)으로 무작위로 배치하였다.

각각의 래트를 크실라진 10 mg/kg (Rompun® Alcyon, France) 및 케타민 80 mg/kg (Imalgene® Alcyon, France)의 혼합 용액의 i.p. 투여에 의하여 마취시켰다. 귀에서부터 눈 바로 앞에까지 털을 깎았다. 귀 플러그를 삽입하고, 동물을 이내(耳內) 선 위 5 mm에 상절치 바를 구비하는 정위 기구 내에 고정시켰다. 깎은 두피 영역을 클로르헥시딘-기제 소독 용액(Alcyon, France)으로 닦아내고, 귀 사이에서 눈 사이의 지점까지 절개하였다. 상기 피부를 집게로 집어넣고, 골막을 포함하는 그 아래 조직을 제거하여 깨끗하고 건조한 두개골 영역을 노출시켰다 (대략 15 x 18 mm).

플라스틱 캐뉼라(o.d. = 0.457 mm 및 i.d. = 0.267 mm) (Plastic One, USA)를 우측 뇌실 내에 삽입하고자 하였다. 상기 캐뉼라를 정위 기구 내에 정수리점 상에 팁을 "제로"로 맞추어 장착하였다. 측뇌실에 걸쳐 두개골을 통하여 구멍을 뚫었다 (전후 방향, 0.92 mm; 내외측, 정수리에 대하여 ±1.7 mm). 상기 캐뉼라 지점을 중심 구멍 위에 배치하여 팁을 두개골 표면과 고르게 하였다. 상기 캐뉼라를 대뇌 피질을 통하여 측뇌실 내로 3.5 mm 낮추었다.

각각의 래트에 대하여, PBS 단독 주입 또는 ENV 단백질과 함께 주입을 상기 캐뉼라의 팁 아래 0.5 mm에 배치되고 돌출한 스테인레스 스틸 주입기를 통하여 달성하였다. 상기 주입기를 폴리텐 관에 의하여 Hamilton 주사기(VWR, France)로 연결시켜, 3 분에 걸쳐 용액을 수동적으로 분배하였다. 배출 완료 3분 후에 상기 주입기를 빼내어 PBS 또는 ENV 단백질의 주입기 트랙을 따른 흐름을 방지하였다.

상처를 니들 홀더 상에 외과적 봉합을 이용하여 닫았다. 동물을 2 일의 기간 동안 개별 케이지 내에서 회복하도록 하였다. 그 다음, 동물들을 무작위로 케이지 내 세 마리씩 두고 추가적인 실험시까지 방해하지 않고 유지하였다.

3. 잠재기 후 ENV 단백질의 반복 측뇌실내 주입

8 개월 후, 반복된 뇌실내 (icv) 주입을 허용하는 뇌 캐뉼라를 모든 래트 내에 삽입하였다.

수술 일에 (P0), 각각의 래트를 크실라진 10 mg/kg (Rompun® Alcyon, France) 및 케타민 80 mg/kg (Imalgene® Alcyon, France)의 혼합 용액의 i.p. 투여에 의하여 마취시켰다. 귀로부터 눈 바로 앞쪽까지의 영역의 털을 깎았다. 귀 플러그를 삽입하고 동물을 이내(耳內) 선 위 5 mm에 상절치 바를 구비하는 정위 기구 내에 고정시켰다. 깎은 두피 영역을 클로르헥시딘-기제 소독 용액(Alcyon, France)으로 닦아내고, 귀 사이에서 눈 사이의 지점까지 절개하였다. 상기 피부를 집게로 집어넣고, 골막을 포함하는 그 아래 조직을 제거하여 깨끗하고 건조한 두개골 영역을 노출시켰다 (대략 15 x 18 mm). 두 개의 구멍은 두개골의 좌우 면 모두에 정수리 앞 대략 7 mm에, 세번째 구멍은 정수리 뒤 7 mm에, 세 개의 구멍을 뚫었다. 나일론 나사 (직경 = 0.50 mm) (Plastic One, USA)를 꿰어 상기 구멍 내로 확고히 고정시켜 치과용 시멘트에 대한 앵커로서 작용하도록 하였다. 이러한 절차에서 경뇌막을 보존하도록 주의하였다. 상기 플라스틱 캐뉼라 (o.d. = 0.457 mm 및 i.d. = 0.267 mm) (Plastic One, USA)를 우측뇌실 내에 삽입하고자 하였다. 상기 캐뉼라를 정수리 위에 팁을 제로로 맞추고 상기 제로 마크에 대하여 포인트가 0.92 mm 뒤에 및 1.7 mm 옆으로 표시되도록 정위 기구 내에 장착하였다. 상기 표시된 부위에서 드릴을 이용하여 구멍을 형성하였다. 상기 캐뉼라 지점을 중심 구멍 위에 배치하여 상기 팁을 두개골 표면과 고르게 하였다. 상기 캐뉼라를 대뇌 피질을 통하여 우측 뇌실 내로 3.5 mm 낮추었다. 상기 정위 기구의 선반 내에 유지하면서, 소량의 치과용 코크(Paladur® Heraeus Kulzer, France)를 상기 캐뉼라 및 앵커링 나사 주위에 형성하였다. 상처를 니들 홀더 상에 외과적 봉합을 이용하여 닫았다. 상기 치과용 재료가 굳어지면 상기 장착 니들을 꺼내고, 동물을 상기 정위 기구로부터 제거되도록 하였다.

PBS 또는 ENV 단백질 주입을 같은 날 (P0) 및 뇌 캐뉼라 삽입 후 25 일째에 (P25) 행하였다.

각각의 시간 지점에 대하여, PBS 단독 또는 250 ng의 재조합 ENV 단백질(His-ENVT-081206-1, PX'Therapeutics, France)을 상기 캐뉼라의 팁 아래 배치되고 0.5 mm 돌출되는 스테인레스 스틸 주입기를 통하여 투여하였다. 상기 주입기를 폴리텐 관에 의하여 Hamilton 주사기(VWR, France)로 연결시켜, 3 분에 걸쳐 용액을 수동적으로 분배하였다. 배출 완료 3분 후에 상기 주입기를 빼내어 PBS 또는 ENV 단백질의 주입기 트랙을 따른 흐름을 방지하였다.

4. IgG4 키메릭 항체의 전신 투여

ENV 단백질의 두번째 회수 다음날 (P26), ENV-주입 래트를 무작위 선별하여 PBS (n=3) 또는 PBS 내 희석된 100 ㎍의 IgG4 키메릭 항체(n=3)를 복강 내 (i.p.) 단일 주사하였다.

5. 생체 내 자기 공명 영상화 (MRI)

래트의 뇌 형태학을 생체 내 MRI에 의하여 P12 및 P37에 검사하였다. 래트를 먼저 30% 산소를 포함하는 0.6 l/분의 흐름 공기와 함께 이소플루란 3% 흡입을 이용하여 인가된 시스템(TEM Sega, France)으로 마취시켰다. 유도 후, 마취를 1.5 내지 2% 및 0.6 l/분 흐름으로 이소플루란 가스를 이용하여 유지시켰다. 순환 물 가열 패드를 이용하여 체온을 조절하고 37℃로 유지시켰다. 실험을 통하여 호흡률을 모니터링하였다. 래트를 정위 고정 기구(치아 막대 및 귀 핀)를 구비하는 플라스틱 베드 (Bruker Biospec Animal Handling Systems, Germany) 내 엎드린 자세로 놓았다. 그 다음, 22-게이지 정맥내 카테터를 연이은 주입을 위하여 래트의 꼬리 정맥 내에 배치하였다.

전송 바디 코일(o.d. = 112 mm 및 i.d. = 72 mm)을 이용하여 400mT/m 구배 세트를 구비하는 Bruker 7T Biospec system (Bruker, Germany) 상에서 스캐닝을 수행하고, 25 mm 직경 표면 코일을 시그널 접수를 위하여 사용하였다. 3 개의 직교 방향 및 5 cm 시야를 가지는 신속한 구배 에코 로컬라이저를 처음 이용하여 뇌 영역을 동정하고 이후의 스캔을 위한 고정된 공간적 좌표를 계산하도록 하였다. 축 평면에서 2 이완 증강 급속 획득 (RARE) 순서를 수행한다. 첫번째 T2-가중 이미지를 4200 ms의 반복 시간 (TR)을 이용하는 스핀-에코 펄스 시퀀싱, 36 ms의 에코 시간 (TE)으로 단일 에코, 35714 Hz 리시버 대역폭 및 4 분 스캔 시간으로 얻는다. 두번째 T2-가중 이미지를 3000 ms의 TR을 이용하는 스핀-에코 펄스 시퀀싱, 17 ms 및 51 ms로 두 개의 에코, 55555 Hz 리시버 대역폭 및 5 분 스캔 시간으로 얻는다. 두 시퀀스에 대하여, 총 30 슬라이스 (800 ㎛ 두께)를 2.56 cm의 시야 및 획득 매트릭스 크기 256 x 256로 얻어 평면 내 해상도 100 x 100 ㎛을 얻는다.

ENV 단백질을 주입한 래트 내 뇌막 및 뇌실 장벽의 역학 평가를 위하여, 가돌리늄-증진 MRI 법을 이용하였다. 조영전 관상 T1-가중 이미지를 고속 저각 영상 획득 (FLASH) 연쇄 및 반복 시간/에코 시간 = 2.2/1.4 ms로 얻었다. 총 30 슬라이스 (800 ㎛ 두께)를 2.56 cm 시야 및 획득 매트릭스 크기 256 x 192로 얻어 평면 내 해상도 100 x 133 ㎛를 얻었다. 그 후, 상기 동물들에 가돌리늄 0.5 M (Dotarem® Guerbet, France) (1 mL/kg 체중)을 급속 정맥 주사하였다. 상기와 동일 조건에서 가돌리늄 투여 10분 후에 조영후 T1 스캐닝을 수행하였다.

6. 행동 분석

P15 및 P40에, 래트를 PC 컴퓨터에 연결된 자동화 디지스캔 기구(Imetronic, Pessac, France)를 이용하여 운동 활성에 대하여 시험하였다. 운동 활성을 바닥 위 0.7 cm에 위치하는 네 개의 수평 적외선 빔(정면에 2, 후면에 2)의 열을 구비하는 광전지 시험 케이지 내에서 모니터링하여 수평 활성을 측정하였다. 빔 파괴 수를 자동적으로 기록하였다. 수평 활성을 케이지 크로스오버(즉, 케이지의 양측 상에 연속적인 파괴)로서 나타내었다. 케이지 크로스오버의 수를 연속적으로 기록하고 10분 간격으로 누적하였다.

모든 래트에 대하여, 운동 활성을 온화한 스트레스 조건에서 (즉, 새로운 환경에의 노출 후 또는 i.p. 식염 용액 주입 후) 암페타민 공격으로 평가하였다. 모든 시험을 불활성 기간 (광 주기) 동안 수행하였다. 신규성 시험을 위하여, 래트를 그들의 홈 케이지로부터 제거하고, 개별 광전지 케이지 내로 옮기고 운동 활성을 1 시간 동안 측정하였다. 그 다음, 래트에 식염수를 주입하고 (1 mL/kg, i.p.), 그들의 운동 활성을 추가적인 1 시간 동안 모니터링하였다. 최종적으로, 동물들에 D-암페타민 (설페이트 1.5 mg/kg, i.p., Sigma Aldrich, A-5880, 배치 90K3354)를 주입하고, 그들의 활성을 추가적인 두 시간 동안 기록하였다.

B. 결과

1. 생체 내 자기 공명 영상화

a) ENV 단백질의 최초 주입 후

P12에, 대부분의 동물들의 T2-가중 영상의 정성 분석은 측뇌실에 해당하는 하이퍼시그널을 보였다. 래트 뇌의 전통적인 MRI 영상과 비교하여, 본 연구에서 보여지는 하이퍼시그널의 확대는 해당 동물 내 측뇌실의 팽윤을 시사한다. 또한, 우측뇌실(즉 주입된 것)의 더 강한 팽창이 허위 및 ENV-주입 동물 모두에서 관측된다. ENV 단백질을 주입한 동물 내 관측되는 측뇌실에 상응하는 하이퍼시그널의 정도는 PBS를 주입한 동물의 것과 다르며, 이는 ENV 단백질이 신경염증성 과정을 유발하였음을 시사한다.

가돌리늄 주입 전후 획득한 T1-가중 영상의 비교는 PBS 또는 ENV 단백질을 주입한 동물 내의 차이를 나타내었다. 이러한 결과는 ENV 단백질의 뇌실 내 (icv) 주입 12일 후 뇌막 및 뇌실 장벽이 변경될 수 있음을 시사한다.

b) ENV 단백질의 두번째 주입 후

상기한 바와 같이 ENV 단백질 주입 후, 두번째 주입 (P37) 후 얻은 T2-가중 영상의 정성 분석은 대부분의 동물 내 측뇌실에 상응하는 하이퍼시그널을 나타냈다. 허위 래트에서, 유의한 하이퍼시그널이 검출되지 않았으며 (정상적으로 뇌실 내 MRI에 의하여 가시화되는 뇌척수액의 정상적인 배경 시그널 이상의 시그널의 증가를 고려하여), 이는 두 시간 지점 사이의 측뇌실에 해당하였다. 놀랍게도, ENV-주입 래트는 두번째 주입 후 이러한 하이퍼시그널의 강한 증가를 보였다. 훨씬 더 유의하게, 이러한 하이퍼시그널은 주위의 구조, 특히 해마까지 연장할 수 있었다. IgG4 키메릭 항체를 처리한 ENV-주입 래트 내에서 얻은 MR 영상은 측뇌실에 해당하는 하이퍼시그널의 강한 증가를 나타냈다.

흥미롭게도, 해마와 같은 주위 구조 내에서 이러한 T2-가중 하이퍼시그널의 연장은 IgG4 키메릭 항체 처리된 ENV-주입 래트 내에서로 한정되었다. 상기 항체를 중추신경계 -CNS- 주변으로 (복강 내) 주입하였으므로, 이러한 점은 다음 사실을 강조하는 것이다:

1. MSRV ENV 단백질의 직접적인 icv 주입을 수반하는 본 동물 모델에 대하여 사용되는 특정 프로토콜에 대한 뇌실 내 즉각적인 전구염증성 효과가 ENV icv 주입 24 시간 이상 후, 즉 국소적 뇌실 염증 후에 주입되는 IgG4 키메릭 항체 리간드에 의하여 즉시 억제되지 않는다. 국소적 뇌실 염증이 정신병 발병의 주요 특징이 아니며 본 모델 내에 신경행동학적 문제를 수반하지 않고 있음이 강조되어야 한다. 이러한 즉각적인 icv 후 국소적 염증은 따라서 본 모델의 부작용으로서 간주될 수 있다.

2. 해마의 발병 개입과 같은 정신병 발현과 관련 있는 것으로 알려진 적절한 특징들이 CNS에서 떨어져 CNS 주위 내에 ENV icv 주입 후 주입되는 인간 키메릭 IgG4 항체 형태 하에 본 발명의 치료적 리간드를 주입한 래트 내에서 억제된다. 이는 뇌실로부터 해마의 임계적 뇌 영역까지의 MRI에 의하여 관측된 하이퍼시그널의 연장의 억제에 의하여 입증된다.

가돌리늄 주입 전후 획득한 T1-가중 영상의 비교는 모든 군에 있어서 명백한 차이를 드러내지 않았다. 이러한 결과는 뇌막 및 뇌실 장벽이 ENV 단백질의 두번째 주입 후 추가로 변경되지 않은 것임을 시사한다.

첫번째 세트의 실험에서, ENV 단백질의 2회 icv 주입이 초기 성년기에 ENV=유도 면역 프라이밍을 받은 래트 내에 뇌실 및 해마 영역에서 신경염증 과정을 초래할 수 있음을 보였다. 놀랍게도, 해마의 해부학적 및 기능적 손상은 신경세포 손상 및 뇌실 확장과 관련된 장기 인식력 감퇴를 가지는 정신분열증 환자에서 보고된 (Bornstein et al., 1992) MRI 연구와 일치한다. 흥미롭게도, 반복되는 ENV 단백질 주입에 의하여 유도되는 해마 손상은, ENV-유도 발병 후, 인간 키메릭 IgG4 항체 투여에 의하여 억제되었으며, 이는 정신분열증의 예비임상적 모델 내에서 이러한 키메릭 항체 제형으로 투여시 상기 리간드의 치료 효과와 일치하는 것이다.

III. 실험 2: 래트의 해마 또는 측뇌실 내 ENV 단백질의 단일 양측 주입 후 신경행동학적 손상 평가

A. 재료 및 방법

1. 동물

수컷 Sprague-Dawley 래트 (6 내지 8주령) (N=6)를 Charles River, France로부터 구입하였다. 동물을 음식물 및 물에 임의 접근하도록 하면서 표준 명-암 사이클로 케이지 당 3 마리 유지하고, 8 일의 순응 기간 동안 방해하지 않았다. 모든 절차는 1986. 11. 24 European Communities Council Directive (86/609/EEC) 및 1987. 10. 19 National Council Directive (87848, "Ministere de l'Agriculture et de la Foret", France)를 따랐다. 사용 동물의 숫자 및 그들의 고통을 최소화하기 위한 모든 노력을 하였다.

2. 해마 또는 측뇌실 내 ENV 단백질의 양측 주입

수술 일에 (P0), 래트를 PBS (Lonza, France)를 주입한 허위군 (n=2) 및 PBS 내 용해된 250 ng의 재조합 ENV 단백질 (ENVT, batch 081206-1, PX'Therapeutics, Grenoble, France)을 icv (ENV-icv 래트, n=2) 또는 해마 내 (ENV-hipp 래트, n=2) 주입한 2 시험군으로 무작위로 배분하였다.

각각의 래트를 크실라진 1 mg/kg (Rompun® Alcyon, France) 및 케타민 80 mg/kg (Imalgene® Alcyon, France)의 혼합 용액의 i.p. 투여에 의하여 마취시켰다.

귀로부터 눈 바로 앞까지 연장되는 영역으로부터 털을 깎았다. 귀 플러그를 삽입하고, 동물을 이내선 5 mm 위에 상절치 바를 구비하도록 정위 기구 내에 고정시켰다. 상기 깎은 두피 영역을 클로르헥시딘-기제 소독 용액 (Alcyon, France)으로 닦아 내고, 귀 사이에서 눈 사이 지점까지 절개를 행하였다. 피부를 집게로 집어 넣고 골막을 포함하는 그 밑의 조직을 제거하여 깨끗하고 건조된 두개골 영역을 노출시켰다 (대략 15 x 18 mm).

플라스틱 캐뉼라 (o.d. = 0.457 mm 및 i.d. = 0.267 mm) (Plastic One, USA)를 측뇌실 또는 해마 내에 양측 삽입하고자 하였다. 상기 캐뉼라를 정수리 위에 팁을 제로로 맞추어 상기 정위 기구 내에 장착하였다. 측뇌실 (전후 방향, 0.92 mm; 내외측, = 정수리에 대하여 ±1.7 mm) 또는 해마 (전후 방향, 4.8 mm; 내외측, 정수리에 대하여 ±5.0 mm) 위에 두개골을 통하여 구멍을 뚫었다. 상기 캐뉼라 지점을 중앙 구멍 위로 배치하여 상기 팁을 두개골 표면과 고르게 하였다. 상기 캐뉼라를 대뇌 피질을 통하여 측뇌실 내로 3.5 mm 또는 해마 내로 7.5 mm 낮추었다.

각각의 래트에 대하여, PBS 단독 주입 또는 ENV 단백질과 함께 주입을 상기 캐뉼라의 팁 아래 배치되고 0.5 mm 돌출된 스테인레스 스틸 주입기를 통하여 달성하였다. 상기 주입기를 폴리텐 관에 의하여 Hamilton 주사기 (VWR, France)로 연결하여 3 분의 기간에 걸쳐 용액을 수동적으로 분배하였다. 상기 주입기를 배출 완료 3분 후 꺼내어 주입기 트랙을 따라 PBS 또는 ENV 단백질이 흐르는 것을 방지하였다.

상처를 니들 홀더 상에 외과적 봉합을 이용하여 닫았다. 동물을 개별 케이지 내에서 2 일 기간 동안 회복하도록 하였다. 그 다음, 동물들을 케이지 당 세 마리 무작위로 넣고 추가 실험 시까지 방해하지 않았다.

3. 행동 분석

래트의 운동 활성을 온화한 스트레스 조건에서 개방 장에서 세 가지 패러다임: 새로운 것, 식염수 주입 및 구속 스트레스를 이용하여 시험하였다. 새로운 것에 대한 운동 반응을 P5, P6, P7, P11 및 P12에서 시험하고, 식염수 주입 및 구속스트레스 후 운동 활성을 P11 및 P13에 각각 1회 시험하였다.

개방 장 기구는 나무로 만들어진 4각 박스 (80 x 75cm x 40cm)로 이루어졌으며, 이는 희미한 조명을 받는다. 상기 개방 장의 바닥을 동일 크기의 9 정사각형 지역으로 나누었다. 새로운 것에 대한 시험을 위하여, 래트를 개별적으로 상기 개방 장의 중심 내로 배치하고, 5 분 동안 상기 장을 탐험하도록 하였다. 그 다음, 래트를 홈 케이지로 되돌아가도록 하였다. 상기 장을 동물 사이에 식염 용액으로 세정하였다. P11에 식염수 주입 시험을 위하여, 래트에 식염수를 주입하고 (1 mL/kg, i.p.), 상기 개방 장 중심으로 즉시 배치하여 5 분 동안 상기 장을 탐험하도록 하였다. 구속 스트레스 시험을 위하여, 동물을 Plexiglas 튜브 (5.5cm x 21 cm) 내에 15 분 동안 고정화를 통하여 구속시키고, 즉시 개방 장 중심에 배치하고 5 분동안 상기 장을 탐험하도록 하였다.

모든 시험에 있어서, 실험자가 각각의 동물들의 행동을 관측하였다. 전체적인 수평 운동 활성을 5 분 기간에 걸쳐 교차된 선의 수로서 정량하였다. 또한, 뒷발로 서는 횟수 (앞다리를 허공에 또는 벽에 대고 뒷다리로 일어남)를 다음과 같이 점수화하였다: 0 = 없음, 1 = 약간, 2 = 중간, 3 = 높음, 4 = 매우 높음.

B. 결과

1. 새로운 것에 대한 운동 반응

모든 시간 지점에서, 새로운 것에 노출시킨 후, 모든 래트는 5 분의 기간 동안 개방 장 내에서 높은 정도의 수평 및 수직 운동 활성을 나타냈다.

상이한 실험 시간 지점에 걸친 새로운 것에 대한 시험의 전체적인 결과를 도 27에 제시한다. 모든 ENV-주입 동물에서, 주입 초기에 (P5) 수평 운동 활성 증가가 존재하지 않았으나, 특히 해마 내 주입을 받은 래트 내에서 (ENV-hipp 래트) 시간 경과에 따라 점진적으로 출현하였다 (도 27A). 흥미롭게도, ENV-hipp 래트만이 P12에서 지속적으로 악화되는 수평 활성을 나타냈다. 또한, 증가된 수직 운동 활성이 ENV-hipp 래트 내에서 P5 및 P6과 같이 일찍 검출된 반면, ENV-icv 래트 내에서 동일 시간 지점에서 허위 동물과 어떠한 차이도 보고되지 않았다.

2. 식염수 주입 후 운동 활성

식염수 주입에 노출 후, 모든 래트는 5 분 기간 동안 개방 장 내에서 높은 정도의 수평 및 수직 운동 활성을 나타냈다.

ENV-hipp 래트만이 허위 동물과 비교하여 분명한 수평 운동 활성 증가를 나타낸 반면 (도 28A), 모든 군의 수직 운동 활성은 유사하였다 (도 28B).

3. 구속 스트레스 후 운동 활성

구속 스트레스에 노출 후, 모든 래트는 5 분 기간 동안 개방 장 내에서 높은 정도의 수평 및 수직 운동 활성을 나타냈다. 수평 및 수직 활성 모두에 대하여, ENV-hipp 래트는 허위 동물과 비교하여 더 높은 운동 활성을 나타냈으나, 허위 및 ENV-icv 래트 사이에 분명한 차이가 탐지되지 않았다 (도 29).

두번째 세트의 실험에서, 측뇌실 또는 해마 내 ENV 단백질의 단일 양측 주입이 온화한 스트레스 조건에의 민감성을 악화시킬 수 있음을 보였다. 또한, ENV-hipp 래트 내에서 행동 변화가 유의하게 더 심각하고 지속적인 것으로 나타났다. 또한, 구속 스트레스에 대한 이상 운동 반응이 ENV-hipp 래트 내에서만 관측되었다. 예비임상적 모델 내 정신분열증 치료 연구를 위하여, ENV 단백질을 양측 해마에 주입받은 래트는 icv-주입 모델보다 적합한 모델을 제공하였다.

따라서, 이러한 최적화된 모델 내에서 인간 키메릭 IgG4 리간드의 치료 효과를 추가로 평가하였다.

IV. ENV 단백질을 래트의 해마 내에 단일 양측 주입한 후 신경행동학적 정신병적 증상에 대한 키메릭 IgG4 리간드의 치료 효과의 평가.

A. 재료 및 방법

1. 동물

본 실시예의 파트 III에서와 동일함.

2. 해마 내 또는 측뇌실 내 ENV 단백질의 양측 주입

이하 기재하는 몇몇 동물 내 항체의 추가 주입을 제외하고, 본 실시예의 파트 III에서와 동일.

각각의 래트에 대하여, 각각의 용액(PBS, ENV 및 IgG4)을 캐뉼라 팁 아래 배치되고 0.5 mm 돌출된 스테인레스 스틸 주입기를 통하여 주입하였다. 상기 주입기를 폴리텐 관에 의하여 Hamilton 주사기(VWR, France)에 연결하여 3 분 기간에 걸쳐 용액을 수동적으로 분배하였다. 상기 주입기를 배출 완료 3분 후에 꺼내어 t아기 주입기 트랙을 따라 PBS 또는 ENV 단백질이 흐르는 것을 방지하였다. IgG4-처리된 ENV 래트에 대하여, 동일한 조건에서 양쪽 반구 내에 ENV 단백질을 주입한 뒤 10 분 후, 2 ㎍의 항체를 주입하였다. 상처를 니들 홀더 상의 외과적 봉합을 이용하여 닫았다. 동물들을 2 일의 기간 동안 개별 케이지 내에서 회복하도록 하였다. 그 다음, 상기 동물들을 케이지 당 세 마리 무작위로 넣고, 추가적인 실험 시까지 방해하지 않고 유지시켰다.

3. 결과

이러한 결과는 첫째로 도 31A 내에 P12 이하에 예시되는 실시예에서와 같이, 온화한 스트레스 조건에 대한 민감성의 악화를 나타내는 ENV 단백질의 해마 내 정위 주입을 이용하는 이전의 실험의 반복을 제공한다.

놀랍게도, 12 일 후 (P12) 동물 조사를 중단한 이전의 실험에서 보이지 않았던, (미처리) ENV+ 래트의 행동적 변경이 P12에서 여전히 관측되는 온화한 스트레스에 대한 과민반응성으로부터 (도 30A의 막대 그래프 내 중간 막대에 의하여 나타내어지는) P32에서 상기 군에서 관측되는 저반응성(동결)으로 상당히 진전하는 것으로 보여졌다. 32 일째 IgG4 리간드의 치료 효과에 대한 추가적인 결과와 별도로, 상기 관측은 혈액 내 증가된 ENV 항원혈증 및 CRP의 존재와 관련있는 것으로 확인된 (실시예 8에서 입증됨) 인간 정신분열증 서브유형의 본래 임상 발달의 주요 특징: 양성 증상 (본원의 동물 모델에 있어서 스트레스에 대한 과민반응성)을 특징으로 하는 초기 이후, 인식력 감퇴 및 신경세포 손상과 관련된 "음성 증상기" (동물 모델에 있어서 스트레스에 대한 정상 미만의 반응성)의 출현,을 재현하므로 흥미롭다.

과연, 이는 신경세포 손상과 관련된 전형적인 후기 효과로, 1차 ENV icv 주입 후 9 개월 동안 취해진 래트 뇌의 연구 동안 수행된 MRI 관측에서와 같이 뇌실 확대에 의해서도 입증될 수 있다. 또, 흥미롭게, 본 실험에서와 같이 적절한 행동 시험에 의하여 객관적으로 정량된바 없으나, 이들 래트는 이러한 긴 지연 동안 현저한 반응성 저하로 점진적으로 진전하였다; 그렇다면 이는 개인적으로 지속적으로 관측될 수 있을 것이다.

적절한 정량 시험을 이용하여, 이러한 양성 증상"으로부터 "음성 증상"으로의 이동은 해마 내 ENV 단백질을 주입받은 동물 대 허위군의 P32에서의 구속 스트레스에 대한 2차 시험에 의하여 확인된다. 따라서, 이는 MSRV ENV 단백질 동시 주입 후 IgG4 리간드 처리된 유사한 동물 내에서 보고된 치료적 효과의 유의성 및 중요성을 강조하는 것이다.

도 30A에서 알 수 있는 바와 같이, IgG4로 처리한 ENV+ 동물은 P32에서 이러한 행동적 저반응성(동결)의 발현과 함께 인식력 감퇴를 나타내지 않았으며, (막대 그래프 상에 중복되는 오차 막대에 의하여 예시되는 바와 같이)이러한 시간 지점에서 허위 대조군과 구별될 수 없었던 반면, 미처리 동물과의 이러한 차이는 유의하였다 (막대 그래프 상에 오차 막대 중복 없음). 다시, 구속 스트레스 후 두번째 행동 시험은 IgG4 리간드로 처리된 ENV+ 래트와 미처리 동물 간의 이러한 차이를 상기 두 군 사이의 훨씬 더 큰 결과 차이로 재현하였다: 미처리 ENV+ 동물은 처리 동물과 비교하여 거의 절반으로 유의하게 감소된 활성을 가졌으며, 처리 동물군은 허위 대조군으로부터 구별할 수 없는 결과를 가졌다 (도 30B).

따라서, 증가된 CRP 혈청 수준을 가지는 서브타입의 정신분열증은 실시예 8에서 MSRV와 관련 있는 것으로 확인되며 인식력 감퇴 및 신경세포 손실과 관련된 "음성 징후학"의 후기를 특징으로 하므로, IgG4 리간드 처리의 예비임상적 모델 내에서의 이로운 치료적 효과의 증거는 이와 같이 극적인 징후학에서 예기치않게 입증된다; 이는, MSRV ENV 주입이 이러한 모델 내에서 적합한 발병 과정을 개시한 후, 정신분열증 형태에서 본 발명의 리간드의 단지 치료적 효과를 확인하는 것이다 (Dickerson, F., C. Stallings, et al. 2007).

실시예 18 : 인간 림프세포를 이식한 동물 암 모델 내에서 치료 효과를 가지는 IgG1 이소타입 GNb AC1 키메릭 항체의 생체 내 분석

I. 실험 1: 피하 주입된 누드 마우스 내 인간 B- 림프세포의 이동에 대한 IgG1 키메릭 GNb AC1 항체의 효과

A. 재료 및 방법

1. 동물

병원균이 없는 암컷 누드 마우스 (6 내지 8주령) (n=4)를 Charles River, France로부터 구입하였다. 동물들을 음식물 및 물에 임의 접근하도록 하면서 표준 명-암 사이클로 동일한 케이지 상에 유지하고, 8 일의 순응 기간 동안 방해하지 않았다. 모든 절차는 1986. 11. 24 European Communities Council Directive (86/609/EEC) 및 1987. 10. 19 National Council Directive (87848, "Ministere de l'Agriculture et de la Foret", France)에 따른다. 사용하는 동물 수 및 그들의 고통을 최소화하기 위한 모든 노력을 하였다.

2. 세포 배양

Akate 세포주는 Burkitt's 림프종 환자로부터 유도된 Epstein-Barr 바이러스-양성 세포주이다. 상기 세포주를 37℃에서 5% CO₂ 가습 분위기 내에서 10% 태아소혈청 (Gibco®, Invitrogen, France), ml 당 40 U의 페니실린 및 ml 당 50 ㎍의 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640 배지 (Sigma, France) 내에 유지하였다.

3. 세포 주입 및 항체 투여

P0(첫째날)에, 15 x 10⁷ 림프종 세포를 누드 마우스 내 피하주입하였다. 5 시간 지연시킨 후, 두 마리의 대조군 마우스에 인산 완충 용액 (PBS)(Lonza, France)을 i.p. 주사하고, 한 마리의 마우스에 IgG1 키메릭 항체 (100 mg/동물)을 i.p. 주사하였다. 마지막 마우스를 림프종 세포 주입 뒤 72 시간 후에 동일한 항체로 유사하게 처리하였다.

4. 조직학적 검사

P19에, 모든 마우스를 펜타바비탈을 과량투여하여 희생시키고 부검하여 해부-병리학적 이상의 존재를 평가하였다. 디지털 카메라 [모델 Coolpix S500 (i.e., 7 백만 화소), Nikon, France]로 사진을 캡쳐하여 카메라로부터 PC 컴퓨터로 옮겼다.

B. 결과

예기치 않게, 비-처리 마우스 내에서 DJej한 가시적인 피가 조직 매스 (종양)도 검출되지 않은 반면, IgG1-처리 마우스 모두 주입 부위에 국소적으로 윤곽이 드러난 매스를 보였다.

부검에서, 두 대조군 마우스 모두에서 강한 비종을 관측한 반면, IgG1-처리 마우스 모두 비장의 현미경적 변화를 나타내지 않았다. 비장 확대를 더 잘 평가하기 위하여, 비장 지수를 다음과 같이 계산하였다: [(비장 중량/체중) x 100]. 흥미롭게도, 비-처리 누드 마우스는 도 32에 도시하는 바와 같이 IgG1-처리 누드 마우스에 비하여 비장/체중 비율의 2 배 증가를 나타냈다. 또한, 약간의 간 확대 또한 IgG1-처리 마우스와 비교하여 대조군 마우스 내에서 보여졌다. 다른 기관 (심장, 폐, 신장, 뇌, 장 및 위)의 현미경적 검사는 어떠한 주요 이상을 드러내지 않았다.

C. 논의

첫번째 실험에서, 누드 마우스 내 림프아세포 피하 주사는 강한 비종에 의하여 입증되는 바와 같이 림프 기관 내 림프종 세포의 확산을 초래할 수 있는 반면, 원위치에 주입된 세포는 거의 모두 이동한 것으로 보인다. 키메릭 IgG1-처리 마우스에서, 원위치에 제한된 국소적으로 주입된 림프종 세포 매스의 지속과 관련된 비장 확대의 부재가 보고되었다.

데이터에 따르면, IgG1 키메릭 GNb AC1 항체는 그의 리간드 효과를 통하여 림프종 세포의 이동을 방지하였을 것이다. 이러한 결과는 따라서 본 발명의 리간드를 포함하는 IgG1 키메릭 항체가 ENV-양성 인간 종양 치료에 유용한 치료적 도구라는 주장이다.

II . 실험 2: SCID 마우스 모델 내 IgG1 키메릭 항체 형태의 MSRV - ENV 결합 리간드의 주입 후 인간 B-세포 림프종에 대한 세포독성의 생체 내 증거 .

A. 재료 및 방법

1. 동물

병원균이 없는 암컷 마우스 (심각한 결합 면역결핍; 기능적 T 및 B 림프구 결핍, NK 집단 감소) (6 내지 8주령) (n=5)를 Charles River, France로부터 구입하였다. 동물들을 음식물 및 물에 임의 접근하도록 하면서 표준 명-암 사이클로 동일한 케이지 상에 유지하고, 8 일의 순응 기간 동안 방해하지 않았다. 모든 절차는 1986. 11. 24 European Communities Council Directive (86/609/EEC) 및 1987. 10. 19 National Council Directive (87848, "Ministere de l'Agriculture et de la Foret", France)에 따른다. 사용하는 동물 수 및 그들의 고통을 최소화하기 위한 모든 노력을 하였다.

2. 세포 배양

상기 림프종 세포주는 Burkitt's 림프종 환자로부터 유도된 Epstein-Barr 바이러스-양성 세포주이다. 상기 Akata 세포주를 37℃에서 5% CO₂ 가습 분위기 내에서 10% 태아소혈청 (Gibco®, Invitrogen, France), ml 당 40 U의 페니실린 및 ml 당 50 ㎍의 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640 배지 (Sigma, France) 내에 유지하였다.

3. 세포 주입 및 항체 투여

P0(첫째날)에, 15 x 10⁷ Akata 림프종 세포(LC)를 모든 SCID 마우스 내 복강내 주사하였다. 24 시간 지연시킨 후, 세 마리의 대조군 마우스에 인산 완충 용액 (PBS)(Lonza, France)을 i.p. 주사하고, 두 마리의 마우스에 IgG1 키메릭 항체 (100 mg/동물)를 i.p. 주사하였다.

4. 조직학적 검사 및 세포 계수

P7에, 모든 마우스를 펜타바비탈을 과량 투여하여 희생시켰다. 그 후, 5 ml PBS 내 복막 세척 세포를 수집하였다. LC의 생존률 판단은 복수의 Trypan 블루 염색에 근거하였다. 상기 LC 및 기타 백혈 세포를 관측하고, 저출력 현미경으로 계수하였다. 인간 Burkitt 림프종 세포를 그들의 형태학에 의하여 용이하게 동정할 수 있었으며, 잠재 발현된 단백질에 대하여 특이적인 안티-Epstein-Barr 바이러스 단일클론 및 인간 B-세포 마커에 대하여 특이적인 단일클론을 이용하여 수행되는 면역세포화학에 의하여 그 특이성을 확인하였다 (도시하지 않음).

마우스를 또한 부검하여 해부-병리학적 이상의 존재를 평가하였다. 특히, 잠재적인 비장 변경을 다음과 같이 계산되는 비장/체중 비율에 의하여 평가하였다: [(비장 중량/체중) x 100].

B. 결과

모든 마우스의 현미경 검사는 감지할 수 있는 종양의 존재를 드러내지 않았으며, 이는 림프종 세포 주입 후 항체 또는 모의 주입 후 단기간의 지연 시간 내에 항체 의존성 세포독성에 접근할 필요성에 의하여 정당화되는 본 연구의 매우 짧은 기간과 일치하였다. 그러나, 비종이 두 대조군 마우스 내에서 용이하게 검출될 수 있었던 반면, 두 lgG1-처리 마우스는 비장의 현미경적 변화를 나타내지 않았다. 누드 마우스 내에 동일 세포의 피하 주입을 이용한 앞선 실험에서와 마찬가지로, 비-처리 SCID 마우스는 IgG1-처리 SCID 마우스와 비교하여 비장/체중 비율의 2-배 증가를 나타냈다 (도 32). 기타 기관 (심장, 폐, 신장, 뇌, 장 및 위)의 현미경적 검사는 주요 이상을 드러내지 않았다.

IgG1-처리 마우스의 복수 분석은 대조군 마우스와 비교하여 살아있거나 사멸한 림프종 세포 모두의 수에 있어서의 감소를 나타냈다 (도 33A). 가장 흥미로운 것은, 키메릭 GNb AC1 IgG1-처리 마우스의 복강으로부터 수집된 림프종 세포의 약 50%가 항체 주입 6 일후 사멸하였다는 것이다. 동시에, 기타 단핵 백혈 세포 (SCID 마우스 내, 주로 단핵구성 기원의 대식 세포 및 몇몇 NK 세포)의 수에 있어서의 증가가 대조군 마우스와 비교하여 IgG1-처리 마우스에서 관측되었다 (도 33B).

C. 논의

두번째 실험에서, SCID 마우스 내 Burkitt 림프종 세포의 복강 내 주사가 7 일 후 비종을 유도할 수 있음을 관측하였으며, 이는 19 일후에 동일한 것을 나타내는 누드 마우스 내에서의 앞선 연구와 일치하는 것이다. 흥미롭게도, IgG1-처리된 마우스는 이와 같은 비장 확대를 나타내지 않았다.

더욱이, (i) 비-처리 동물과 비교하여, 복강으로부터 수집된 살아 있는 림프종 세포 수의 감소, (ii) 사멸한 악성 세포의 주요 비율, 및 (iii) 기타 단핵 백혈 세포 수의 증가의 결합은 종양 세포에 대한 항체-의존적 직접적 효과 및/또는 세포-개재 세포독성 효과를 직접적으로 나타내는 것이다. 이러한 효과는 따라서 (i) 실시예 8에서 입증되는 바와 같이 인간 종양 세포 상에 노출된 MSRV-ENV 단백질 내 표적 에피토프를 발현하는 종양 세포에 결합하는 리간드의 특이성, 및 (ii) 종양 세포 파괴를 수반하는 첨가된 IgG1 이소타입-중재 체액성 면역 효과를 반영하는 것이다. 후자의 효과는 예를 들어, IgG1 활성 부위에 의한 보체 활성화 및 예를 들어, 종양 MSRV-ENV 항원에 결합된 GNb AC1 IgG1와의 FC 수용체 상호 작용을 통하여 유도되는 대식세포 종양억제 활성을 통하여 중재될 수 있다.

상기 키메릭 IgG1 항체의 효과에 관련되는 메커니즘이 무엇이든, 본 발명의 결과들은 인간 종양 세포를 가지는 예비 임상적 동물 모델 내에서 림프종 세포 증식의 억제를 입증하며, 따라서 이와 같은 ENV-양성 암의 치료에 있어서의 안티-ENV 리간드 항체의 치료적 가능성을 입증한다.

SEQUENCE LISTING <110> GeNeuro S.A. <120> Therapeutic use of specific ligand in MSRV associated disease <130> BR063581 <150> US 61/129,613 <151> 2008-07-08 <150> US 61/202,581 <151> 2009-03-13 <150> US 61/213,189 <151> 2009-05-15 <160> 66 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Gln Gln Tyr Gln Ser Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Asp Tyr Glu Met His 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Ala Val Ala Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Thr Val Val Pro Phe Ala Tyr 1 5 <210> 7 <211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ala Trp Ile Tyr 35 40 45 Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Leu Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Pro Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Val Ala Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Ala Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ser Thr Val Val Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala 115 <210> 9 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (66)..(66) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (81)..(81) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (84)..(84) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (87)..(87) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (90)..(90) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (117)..(117) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (120)..(120) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (123)..(123) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (126)..(126) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (129)..(129) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (135)..(135) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (147)..(147) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (150)..(150) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (153)..(153) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (159)..(159) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (162)..(162) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (165)..(165) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (168)..(168) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (171)..(171) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (174)..(174) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (177)..(177) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (180)..(180) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (186)..(186) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (189)..(189) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (192)..(192) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (195)..(195) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (198)..(198) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (201)..(201) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (204)..(204) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (207)..(207) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (213)..(213) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (216)..(216) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (219)..(219) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (225)..(225) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (228)..(228) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (237)..(237) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (246)..(246) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (249)..(249) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (252)..(252) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (276)..(276) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (279)..(279) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (282)..(282) <223> n is a, c, g, or t <220> 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<222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (48)..(48) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (57)..(57) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (63)..(63) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (72)..(72) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (75)..(75) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (78)..(78) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (84)..(84) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (90)..(90) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (111)..(111) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (120)..(120) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (123)..(123) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (126)..(126) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (132)..(132) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (135)..(135) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (147)..(147) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (150)..(150) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (153)..(153) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (156)..(156) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (159)..(159) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (165)..(165) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (168)..(168) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (171)..(171) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (174)..(174) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (177)..(177) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (198)..(198) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (204)..(204) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (207)..(207) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (210)..(210) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (213)..(213) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (216)..(216) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (219)..(219) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (225)..(225) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (228)..(228) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (231)..(231) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (234)..(234) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (237)..(237) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (249)..(249) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (252)..(252) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (255)..(255) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (258)..(258) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (261)..(261) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (264)..(264) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (273)..(273) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (276)..(276) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (279)..(279) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (291)..(291) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (294)..(294) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (297)..(297) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (300)..(300) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (303)..(303) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (306)..(306) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (312)..(312) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (321)..(321) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (327)..(327) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (330)..(330) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (333)..(333) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (336)..(336) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (339)..(339) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (342)..(342) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (345)..(345) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (348)..(348) <223> n is a, c, g, or t <400> 10 cargtncary tncarcarws nggngcngar ytngtnmgnc cnggngcncc ngtnacnytn 60 wsntgyaarg cnwsnggnta yacnttyacn gaytaygara tgcaytgggt naarcaracn 120 ccngtncayg gnytngartg gathggngcn gtngcnccng aracnggngg nacngcntay 180 aaycaraart tyaarggnaa rgcnacnytn acngcngcna arwsnwsnws nacngcntay 240 atggarytnm gnwsnytnac nwsngargay wsngcngtnt aytaytgyac nwsnacngtn 300 gtnccnttyg cntaytgggg ncarggnacn ytngtnacng tnwsngcn 348 <210> 11 <211> 318 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atatcctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagccagga 120 tcctccccca aagcctggat ttatcgcaca tccaacctgg cttctggagt ccctggtcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttat tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtat caaagtctcc cactcacgtt cggctcgggg 300 acaaagttgg aaataaaa 318 <210> 12 <211> 348 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 caggttcaac tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgacactg 60 tcctgcaagg cttcgggcta cacatttact gactatgaaa tgcactgggt gaagcagaca 120 cctgtgcatg gcctggaatg gattggagct gttgctcctg aaactggtgg tactgcctac 180 aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagcca aatcctccag cacagcctac 240 atggagctcc gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct attactgtac ttctacggtg 300 gtcccttttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 13 wsngcnwsnw snwsngtnws ntayatgtay 30 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <400> 14 mgnacnwsna ayytngcnws n 21 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a, c, g, or t <400> 15 carcartayc arwsnytncc nytnacn 27 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 gaytaygara tgcay 15 <210> 17 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (51)..(51) <223> n is a, c, g, or t <400> 17 gcngtngcnc cngaracngg nggnacngcn tayaaycara arttyaargg n 51 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 18 acngtngtnc cnttygcnta y 21 <210> 19 <211> 548 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Ala Leu Pro Tyr His Thr Phe Leu Phe Thr Val Leu Leu Pro Pro 1 5 10 15 Phe Ala Leu Thr Ala Pro Pro Pro Cys Cys Cys Thr Thr Ser Ser Ser 20 25 30 Pro Tyr Gln Glu Phe Leu Trp Arg Thr Arg Leu Pro Gly Asn Ile Asp 35 40 45 Ala Pro Ser Tyr Arg Ser Leu Ser Lys Gly Asn Ser Thr Phe Thr Ala 50 55 60 His Thr His Met Pro Arg Asn Cys Tyr Asn Ser Ala Thr Leu Cys Met 65 70 75 80 His Ala Asn Thr His Tyr Trp Thr Gly Lys Met Ile Asn Pro Ser Cys 85 90 95 Pro Gly Gly Leu Gly Ala Thr Val Cys Trp Thr Tyr Phe Thr His Thr 100 105 110 Ser Met Ser Asp Gly Gly Gly Ile Gln Gly Gln Ala Arg Glu Lys Gln 115 120 125 Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln Leu Thr Arg Gly His Ser Thr Pro Ser 130 135 140 Pro Tyr Lys Gly Leu Val Leu Ser Lys Leu His Glu Thr Leu Arg Thr 145 150 155 160 His Thr Arg Leu Val Ser Leu Phe Asn Thr Thr Leu Thr Arg Leu His 165 170 175 Glu Val Ser Ala Gln Asn Pro Thr Asn Cys Trp Met Cys Leu Pro Leu 180 185 190 His Phe Arg Pro Tyr Ile Ser Ile Pro Val Pro Glu Gln Trp Asn Asn 195 200 205 Phe Ser Thr Glu Ile Asn Thr Thr Ser Val Leu Val Gly Pro Leu Val 210 215 220 Ser Asn Leu Glu Ile Thr His Thr Ser Asn Leu Thr Cys Val Lys Phe 225 230 235 240 Ser Asn Thr Ile Asp Thr Thr Ser Ser Gln Cys Ile Arg Trp Val Thr 245 250 255 Pro Pro Thr Arg Ile Val Cys Leu Pro Ser Gly Ile Phe Phe Val Cys 260 265 270 Gly Thr Ser Ala Tyr His Cys Leu Asn Gly Ser Ser Glu Ser Met Cys 275 280 285 Phe Leu Ser Phe Leu Val Pro Pro Met Thr Ile Tyr Thr Glu Gln Asp 290 295 300 Leu Tyr Asn His Val Val Pro Lys Pro His Asn Lys Arg Val Pro Ile 305 310 315 320 Leu Pro Phe Val Ile Arg Ala Gly Val Leu Gly Arg Leu Gly Thr Gly 325 330 335 Ile Gly Ser Ile Thr Thr Ser Thr Gln Phe Tyr Tyr Lys Leu Ser Gln 340 345 350 Glu Ile Asn Gly Asp Met Glu Gln Val Thr Asp Ser Leu Val Thr Leu 355 360 365 Gln Asp Gln Leu Asn Ser Leu Ala Ala Val Val Leu Gln Asn Arg Arg 370 375 380 Ala Leu Asp Leu Leu Thr Ala Lys Arg Gly Gly Thr Cys Leu Phe Leu 385 390 395 400 Gly Glu Glu Arg Cys Tyr Tyr Val Asn Gln Ser Arg Ile Val Thr Glu 405 410 415 Lys Val Lys Glu Ile Arg Asp Arg Ile Gln Cys Arg Ala Glu Glu Leu 420 425 430 Gln Asn Thr Glu Arg Trp Gly Leu Leu Ser Gln Trp Met Pro Trp Thr 435 440 445 Leu Pro Phe Leu Gly Pro Leu Ala Ala Ile Ile Phe Leu Leu Leu Phe 450 455 460 Gly Pro Cys Ile Phe Asn Phe Leu Val Lys Phe Val Ser Ser Arg Ile 465 470 475 480 Glu Ala Val Lys Leu Gln Ile Val Leu Gln Met Glu Pro Gln Met Gln 485 490 495 Ser Met Thr Lys Ile Tyr Arg Gly Pro Leu Asp Arg Pro Ala Arg Leu 500 505 510 Cys Ser Asp Val Asn Asp Ile Glu Val Thr Pro Pro Glu Glu Ile Ser 515 520 525 Thr Ala Gln Pro Leu Leu His Ser Asn Ser Val Gly Ser Ser His His 530 535 540 His His His His 545 <210> 20 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Pro Pro Met Thr Ile Tyr Thr Glu Gln Asp Leu Tyr Asn His Val Val 1 5 10 15 Pro Lys Pro His Asn Lys Arg Val Pro 20 25 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for RACE PCR amplification <400> 21 cggggcggga gtcgactttt tttttttttt ttt 33 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for RACE PCR amplification <400> 22 gcctcagtcg tgtgcttctt g 21 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for RACE PCR amplification <400> 23 ccatcdgtyt atccmytg 18 <210> 24 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Ala Leu Pro Tyr His Thr Phe Leu Phe Thr Val Leu Leu Pro Pro 1 5 10 15 Phe Ala Leu Thr Ala Pro Pro Pro Cys Cys Cys Thr Thr 20 25 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CL_Ala130_retour - Primer for amplification <400> 25 caagaagcac acgactgagg c 21 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1_Pro119_retour Primer for VH amplification with R=A/G; K=G/T; H=A/T/C <400> 26 cggggcggga gtcgaccark ggatarachg atgg 34 <210> 27 <211> 373 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 ggtaccctgg atatccggag cctacggcca gatcgtgctg acccagtccc ctgccatcat 60 gtccgccagc cctggcgaga aggtgaccat ctcctgctcc gcctcctcct ccgtgtccta 120 catgtactgg tatcagcaga agcctggctc ctcccctaag gcctggatct accggacctc 180 caacctggcc tccggcgtgc ctggccggtt ctccggctcc ggcagcggca cctcctactc 240 cctgaccatc agctccatgg aggccgagga cgccgccacc tactactgcc agcagtacca 300 gtccctgcct ctgaccttcg gctctggcac caagctggag atcaagcgta cggtggcggc 360 gccatccgag ctc 373 <210> 28 <211> 6165 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1L+VL optimised sequence <400> 28 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactg 660 cgatcgcccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 720 agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc actagaagct ttattgcggt agtttatcac 780 agttaaattg ctaacgcagt cagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt 840 gactctctta aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa 900 ggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact 960 cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac 1020 aggtgtccac tcccagttca attacagctc ttaaggctag agtacttaat acgactcact 1080 ataggctagc ctcgagaatt caccatggcc ctgcagaccc aggtgttcat cagcctgctg 1140 ctgtggatat ccggagccta cggccagatc gtgctgaccc agtcccctgc catcatgtcc 1200 gccagccctg gcgagaaggt gaccatctcc tgctccgcct cctcctccgt gtcctacatg 1260 tactggtatc agcagaagcc tggctcctcc cctaaggcct ggatctaccg gacctccaac 1320 ctggcctccg gcgtgcctgg ccggttctcc 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cctggtgaag gactacttcc ctgagcctgt 540 gaccgtgagc tggaactccg gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ctgccgtgct 600 gcagtcctcc ggcctgtact ccctgtcctc cgtggtgaca gtgccttcct cctccctggg 660 caccaagacc tacacctgca acgtggacca caagccttcc aacaccaagg tggacaagcg 720 ggtggagtcc aagtacggcc ctccttgccc ttcctgccct gcccctgagt tcctgggcgg 780 accttccgtg ttcctgttcc ctcctaagcc taaggacacc ctgatgatct cccggacccc 840 tgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaggaagat cctgaggtcc agttcaattg 900 gtacgtggac ggcgtggaag tccacaacgc caagaccaag cctcgggagg aacagttcaa 960 ctccacctac cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa 1020 ggaatacaag tgcaaggtct ccaacaaggg cctgccctcc tccatcgaga aaaccatctc 1080 caaggccaag ggccagcctc gcgagcctca ggtgtacacc ctgcctccta gccaagaaga 1140 gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacatg tctggtgaag ggcttctacc cttccgacat 1200 cgccgtggag tgggagtcca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca cccctcctgt 1260 gctggactcc gacggctcct tcttcctgta ctccaggctg accgtggaca agtcccggtg 1320 gcaggaaggc aacgtctttt cctgctccgt gatgcacgag 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Glu Gln Leu Lys 130 135 140 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 145 150 155 160 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 165 170 175 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 180 185 190 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 195 200 205 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 210 215 220 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 61 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric GNbAC1 IgG4 <400> 61 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Val Ala Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Ala Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ser Thr Val Val Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 340 345 350 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 62 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric GNbAC1 Light Chain <400> 62 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ala Trp Ile Tyr 35 40 45 Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Leu Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 63 <211> 443 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Val Ala Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ser Thr Val Val Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 260 265 270 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 290 295 300 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 325 330 335 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 340 345 350 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 370 375 380 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 405 410 415 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 64 <211> 213 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Gln Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Trp Ile Tyr 35 40 45 Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Leu Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 65 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 65 atggccctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatatccgg agcctacggc 60 cagatccagc tgacccagtc cccttcctcc ctgtctgcct ccgtgggcga cagagtgacc 120 atcacctgtt ccgcctcttc cagcgtgtcc tacatgtact ggtatcagca gaagcctggc 180 aaggccccta aggcctggat ctaccggacc tccaacctgg cctccggcgt gccttccagg 240 ttctccggct ccggctctgg caccgactac accctgacca tctccagcct gcagcctgag 300 gacttcgcca cctactactg ccagcagtac cagtccctgc ctctgacctt cggcggaggc 360 accaaggtgg agatcaagcg tacggtggcg gcgccatctg tgttcatctt ccccccttcc 420 gacgagcagc tgaagtccgg caccgcctct gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctaccct 480 cgggaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctgc agtccggcaa ctcccaggaa 540 tccgtcaccg agcaggactc caaggactct acctactccc tgtcctccac cctgaccctg 600 tccaaggccg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg 660 agttctcccg tgaccaagtc cttcaaccgg ggcgagtgct ga 702 <210> 66 <211> 1389 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 66 atggactgga cctggcggat cctgtttctg gtggccgctg ccaccggtgt gcactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacctg gctcctccgt gaaggtgtcc 120 tgcaaggcct ccggctacac cttcaccgac tacgagatgc actgggtgcg ccaggctcca 180 ggacagggcc tggaatggat cggcgccgtg gctcctgaaa ccggcggcac cgcctacaac 240 cagaagttca agggcagggc caccatcacc gccgacaagt ccacctctac cgcctacatg 300 gaactgtcct ccctgcggtc tgaggacacc gccgtgtact actgcacctc caccgtggtg 360 cctttcgctt actggggcca gggcaccctg gtgaccgtgt cctccgctag caccaagggc 420 ccttccgtgt tccctctggc cccttgctcc cggtccacct ctgagtctac cgccgctctg 480 ggctgcctgg tgaaggacta cttccctgag cctgtgacag tgtcttggaa ctctggcgcc 540 ctgacctctg gcgtgcacac cttccctgcc gtgctgcagt cctccggcct gtactccctg 600 tcctccgtgg tgacagtgcc ttcctcctcc ctgggcacca agacctacac ctgtaacgtg 660 gaccacaagc cttccaacac caaggtggac aagcgggtgg agtccaagta cggccctcct 720 tgccctccat gccctgcccc tgagttcctg ggaggcccct ccgtgttcct gttccctcct 780 aagcctaagg acaccctgat gatctcccgg acccctgaag tgacctgcgt ggtggtggac 840 gtgtcccagg aagatcctga ggtccagttc aattggtacg tggacggcgt ggaggtgcac 900 aacgccaaga ccaagcctag agaggaacag ttcaactcca cctaccgggt ggtgtccgtg 960 ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaagaat acaagtgcaa ggtgtccaac 1020 aagggcctgc cctcctccat cgaaaagacc atctccaagg ccaagggcca gcctcgggaa 1080 cctcaggtgt acaccctgcc tccctctcag gaagagatga ccaagaacca ggtgtccctg 1140 acctgtctgg tgaagggctt ctacccttcc gatatcgccg tggagtggga gtctaacggc 1200 cagcctgaga acaactacaa gaccacccct cctgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctgtactcca ggctgaccgt ggacaagtcc cggtggcagg aaggcaacgt cttttcctgc 1320 tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac tacacccaga agtccctgtc cctgtctctg 1380 ggcaagtga 1389

Claims

SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 및 SEQ ID No. 6의 서열로 나타내어지는 각 상보성 결정 영역(CDRs)을 포함하는 리간드로서,
상기 리간드는 SEQ ID No. 20 또는 SEQ ID No. 32의 안티-리간드에 결합하는 것인, 리간드.
- 아미노산 서열 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 및 SEQ ID No. 3 의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 (VL), 및
- 아미노산 서열 SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 및 SEQ ID No. 6 의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 (VH)
을 포함하는 리간드로서,
상기 리간드는 SEQ ID No. 20 또는 SEQ ID No. 32의 안티-리간드에 결합하는 것인, 리간드.
- SEQ ID No. 7의 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변영역 (VL), 및
- SEQ ID No. 8의 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변영역 (VH)
을 포함하는 리간드로서,
상기 리간드는 SEQ ID No. 20 또는 SEQ ID No. 32의 안티-리간드에 결합하는 것인, 리간드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드을 포함하는 ScFV 단편.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드을 포함하는 Fab 단편.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드을 포함하는 항체.
제6항에 있어서,
상기 항체는 키메릭 항체, 엔지니어링된 항체, 또는 인간화된 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제6항에 있어서, 상기 항체는 IgG인 항체.
제8항에 있어서, 상기 항체는 인간 IgG1 또는 IgG4인 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 코딩하는 핵산.
제10항에 있어서, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, 및 SEQ ID No. 18에 기재된 각 서열을 포함하는 핵산; 또는
SEQ ID No. 10 또는 12에 기재된 적어도 하나의 전장서열 및 SEQ ID No. 9 또는 11에 기재된 적어도 하나의 전장서열을 포함하는 핵산.
제10항의 핵산을 포함하는 벡터.
제11항의 핵산을 포함하는 벡터.
제10항의 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
제11항의 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 ScFV 단편, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 Fab 단편, 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 항체를 생산하는 방법으로서,
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 리간드, ScFV 단편, Fab 단편, 또는 항체의 합성을 허용하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 ScFV 단편, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 Fab 단편, 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 항체를 생산하는 방법으로서,
SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, 및 SEQ ID No. 18에 기재된 각 서열을 포함하는 핵산, 또는 SEQ ID No. 10 또는 12에 기재된 적어도 하나의 전장서열 및 SEQ ID No. 9 또는 11에 기재된 적어도 하나의 전장서열을 포함하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 리간드, ScFV 단편, Fab 단편, 또는 항체의 합성을 허용하는 조건하에 배양하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드;
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 ScFV 단편;
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 Fab 단편;
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 항체; 또는
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 ScFV 단편, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 Fab 단편, 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 항체의 약학적으로 허용가능한 형태를 포함하는,
다발성 경화증, 정신분열증, 임상적 독립 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 간질, 건선, 암, 염증성 췌장염 및 당뇨병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 MSRV-관련 질환의 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 ScFV 단편, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 Fab 단편, 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 항체를 이용하여 생물학적 표본 내에서 안티-리간드를 검출하는 방법으로서,
(a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 ScFV 단편, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 Fab 단편, 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는항체를 상기 표본과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 표본 내에서 상기 안티-리간드의 존재를 검출하는 단계
를 포함하는 방법.
제19항에 있어서,
(c) 상기 표본을 GAG 항원에 특이적으로 결합하는 리간드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 안티-리간드의 검출 방법.
생물학적 표본 내에 안티-리간드의 검출을 위한 면역분석 키트로서,
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 ScFV 단편, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 Fab 단편, 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 리간드를 포함하는 항체, 및
상기 안티-리간드의 상기 리간드, ScFV 단편, Fab 단편, 또는 항체에의 특이적 결합을 검출하기 위한 시약을 포함하는 키트.
제21항에 있어서,
상기 키트는 GAG 항원에 특이적으로 결합하는 리간드를 추가로 포함하는 것인 생물학적 표본 내에 안티-리간드의 검출을 위한 면역분석 키트.
제21항에 있어서,
다발성 경화증, 정신분열증, 임상적 독립 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 간질, 건선, 암, 염증성 췌장염 및 당뇨병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 MSRV-관련 질환의 검출을 위한 면역분석 키트.
제22항에 있어서,
다발성 경화증, 정신분열증, 임상적 독립 증후군, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 간질, 건선, 암, 염증성 췌장염 및 당뇨병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 MSRV-관련 질환의 검출을 위한 면역분석 키트.
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