BRPI0718698A2

BRPI0718698A2 - Anticorpos de epítopo binário e estimulantes imunes de superantígeno de célula b.

Info

Publication number: BRPI0718698A2
Application number: BRPI0718698-3A
Authority: BR
Inventors: Sudhir Paul; Yasuhiro Nishiyama; Stephanie Planque
Original assignee: Sudhir Paul; Yasuhiro Nishiyama; Stephanie Planque
Priority date: 2006-11-09
Filing date: 2007-11-09
Publication date: 2013-12-31
Also published as: CA2669049A1; AU2007352380A1; JP2010509340A; WO2008133652A3; EP2091973A2; EP2091973A4; ZA200903738B; WO2008133652A2; US20090117115A1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS DE EPÍTOPO BINÁRIO E ESTIMULANTES IMUNES DE SUPERAN- TÍGENO DE CÉLULA B".

Legenda de Financiamento Federal A presente invenção foi produzida em parte usando fundos obti-

dos através das cessões A1058865, A1067020, A1071951 e A1062455 do National Institutes of Health. Consequentemente, o governo federal tem de- terminados direitos sobre a presente invenção. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção

A presente invenção refere-se aos campos de imunologia, viro- Iogia e medicina. Especificamente, a presente invenção se refere a anticor- pos reativos com epítopo binário a polipeptídeos superantigênicos de célula Bea estimulantes imunes que induzem à produção de tais anticorpos e mé- todos e reagentes que permitem a identificação e indução dos anticorpos reativos com epítopo binário com a capacidade de catalisar a hidrólise do polipeptídeo superantigênico ou se ligar ao polipeptídeo com caráter cova- lente.

Descrição da Técnica Relacionada Diferente dos antígenos convencionais, polipeptídeos superanti-

gênicos de célula B são reconhecidos por anticorpos (imunoglobulinas) pre- sentes no repertório pré-imune sem o requisito de exposição prévia ao antí- geno. Isso é porque a propriedade de reconhecimento de superantigênico é codificada por genes de região variável (V) hereditários que são utilizados para sintetizar os domínios V de anticorpos. Reconhecimento de antígeno convencional por anticorpos requer diversificação de seqüência adaptativa dos domínios V que ocorrem durante o curso de células B que são estimula- das com antígenos. O reconhecimento de antígenos convencionais ocorre principalmente nas regiões de determinação de complementaridade (CDRs) dos domínios V. Acredita-se que o reconhecimento de superantígeno por anticorpos ocorra sem o requisito de diversificação adaptativa do domínio V e acredita-se que o processo de reconhecimento ocorra principalmente em 1 regiões de framework de domínio V (FRs).

Aperfeiçoamento da capacidade de reconhecimento de antígeno dos anticorpos é acionado através de contato do antígeno com imunoglobu- Iina expressa sobre a superfície de linfócitos B como um componente do re- ceptor de célula B (BCR) o qual, por sua vez, aciona a divisão celular e var- redura clonal de célula B. Contato de superantígeno com o BCR, por outro lado, pode acionar as células B à via de morte celular programada após uma fase proliferativa transitória. Não existem relatos de aperfeiçoamento adapta- tivo de reconhecimento de superantígeno por anticorpos. Evidentemente, o sistema imune é incapaz de montar respostas adaptativas protetoras aos efeitos prejudiciais de polipeptídeos superantigênicos. Os anticorpos presen- tes no repertório pré-imune reconhecem superantígenos com afinidade mo- derada a baixa e eles oferecem apenas defesa limitada contra os efeitos pre- judiciais do superantígeno. Polipeptídeos que podem ser classificados como superantígenos

de célula B incluem as proteínas de HIV gp120 e Tat, a Proteína A de Sta- phylococcus aureus e a Proteína L de Streptococcus. Espera-se que a lista de polipeptídeos superantigênicos de célula B prejudiciais cresça à medida que antígenos adicionais são estudados e a sensibilidade do ensaio imuno- lógico é aperfeiçoada.

A proteína gp120 do envoltório do HIV é um alvo para vacinas experimentais que tentam induzir à síntese de anticorpos de neutralização (Abs). A maioria dos Abs induzidos através de imunização com gp120 são dirigidos à regiões altamente mutáveis da proteína, particularmente o tercei- ro domínio variável (domínio V3). Esses Abs neutralizam a cepa viral infec- ciosa. Contudo, os domínios V do gp120 sofrem mutação durante o curso de infecção, resultando em mutantes virais de escape resistentes à neutraliza- ção pelos Abs. Além disso, os domínios V do gp120 de várias cepas de HIV responsáveis pela pandemia em diferentes partes do mundo são altamente divergentes e os Abs induzidos através de imunização com gp120 usual- mente falham em neutralizar cepas de HIV heterólogas. Isso levou à busca por epítopos neutralizados estruturalmente conservados expressos pelo gp120. Epítopos candidatos são as regiões comparativamente conservadas de gp120 envolvidas na ligação de HIV a receptores de células hospedeiras, isto é, CD4 e receptores de quimiocina. Lamentavelmente, esses epítopos são pobremente imunogênicos. Raros Abs monoclonais (MAbs) dirigidos à regiões próximas dos sítios de ligação do receptor de CD4 e quimiocina do gp120 foram identificados usando protocolos experimentais complexos. Es- ses MAbs neutralizam muitas, mas nem todas as cepas do ciado B de HIV-1.

Acredita-se que o sítio de ligação de CD4 (CD4bs) seja um de- terminante descontínuo composto dos resíduos 256, 257, 368-370,421-427 e 457. É sugerido que os CD4bs sofrem (uma) transição(ões) conformacio- nal(is) quando o gp120 trimérico expresso sobre a superfície viral é criado como monômeros solúveis e Abs aos CD4bs monoméricos são, com freqüên- cia, pobremente reativos com os CD4bs triméricos. Além disso, a região dos peptídeos 421-427 dos CD4bs é um componente importante do sítio superan- tigênico de linfócito B do gp120 (gp120SAq; definido como um sítio no qual os Abs estão presentes no repertório pré-imune sem o requisito de diversificação de seqüência adaptativa dos domínios variáveis do Ab). Conforme no caso de outros superantígenos de células B, acredita-se que a ligação de gp120SAg à Ig expressa como parte de receptores de célula B (BCRs) induz à apoptose de célula B e não há evidencia de amplificação adaptativa de Abs de ligação ao gp120SAg em indivíduos infectados pelo HIV. Pelo contrário, indivíduos in- fectados pelo HIV expressam níveis diminuídos de VH3+ Igs no soro; acredi- ta-se que a família VH se liga ao gp120SAq preferencialmente.

Nenhuma vacina ou terapia imune para infecção pelo HIV está disponível atualmente. Assim, uma necessidade reconhecida ainda está pre- sente na técnica por produtos profiláticos imunes e produtos terapêuticos para o HIV. Especificamente, a técnica é deficiente em anticorpos com es- pecificidade por epítopo binário tendo atividade de neutralização de vírus aumentada e métodos de produção dos mesmos. A presente invenção pre- enche essa necessidade há muito esperada na técnica. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção descreve uma propriedade até agora ines- * perada de determinados anticorpos, a capacidade de reconhecer dois epíto- pos distintos de gp120. Essa propriedade do anticorpo é, aqui depois, desig- nada "especificidade por epítopo binário".

A presente invenção também é dirigida a um polipeptídeo ou análogo eletrofílico do mesmo que compreende um epítopo superantigênico e pelo menos um outro epítopo eficaz para induzir à produção de anticorpos com especificidade binária pelos epítopos correspondentes sobre um antí- geno polipeptídico. Em um aspecto relacionado da invenção, o polipeptídeo ou análogo eletrofílico do mesmo ainda compreende um ou mais grupos ele- trofílicos no mesmo, onde os grupos eletrofílicos eficazes para induzir a anti- corpos binários específicos com reatividade nucleofílica intensificada. Anti- corpos convencionais se ligam a antígenos reversivelmente através de me- canismos não-covalentes. Assim como anticorpos convencionais, anticorpos quimicamente reativos inicialmente reconhecem o antígeno através de meios não-covalentes. Contudo, sítios nucleofílicos localizados nos domínios V de anticorpos quimicamente reativos, então, processem para reconhecer cen- tros de reação eletrofílicos no antígeno. Isso tem duas conseqüências, for- mação de complexos imunes irreversíveis com pareamento covalente de nucleófilo-eletrófilo e, se uma molécula de água está disponível no centro de reação, a hidrólise do antígeno pelo anticorpo. A propriedade de ligação irre- versível intensifica a potência do anticorpo, porque ela exclui a regeneração de antígeno ativo através de dissociação dos complexos imunes. Similar- mente, a etapa de hidrólise catalítica resulta em inativação irreversível de antígeno, uma vez que os fragmentos antigênicos usualmente não expres- sam atividade biológica similar ao antígeno precursor.

A presente invenção também é dirigida a um método para pro- dução de anticorpos com epítopo binário específicos a um superantígeno polipeptídico de célula Β. O método compreende administração de um ou ambos do construto polipeptídico ou um análogo polipeptídico eletrofílico do mesmo descrito aqui a um animal vivo. A inclusão de dois epítopos no cons- truto polipeptídico pode estimular a produção de células B de anticorpos que reconhecem um dos epítopos através de interações em regiões de determi- nação de complementaridade (CDRs) do anticorpo e do segundo epítopo, através de interações nas regiões de framework (FRs). Reconhecimento do primeiro epítopo é acionado através de processos de varredura clonal de célula B convencionais. O sinal proliferativo celular gerado através de intera- ção das CDRs é suficiente para superar o efeito negativo de interações do segundo epítopo superantigênico nas FRs. Isso resulta na produção de anti- corpos que expressam especificidade por epítopo binário.

Em um aspecto relacionado da invenção, o método compreende uma outra etapa de administração de um ou mais adjuvantes imunológicos eficazes para estimular a produção de anticorpo de célula B independente de célula T ou dependente de célula T no animal vivo.

A presente invenção é ainda dirigida a um método para produ- ção de anticorpos que reconhecem o sítio superantigênico de célula B de gp120 de HIV. O método compreende administração, a um animal vivo, de uma combinação de um polipeptídeo com epítopo duplo e um análogo ele- trofílico do mesmo. Em um aspecto relacionado da invenção, o método com- preende uma outra etapa de administração de um ou mais adjuvantes efica- zes para estimular a produção de anticorpo de célula B independente de cé- lula T ou dependente de célula T ao animal vivo. A presente invenção é ainda dirigida a um método para estimu-

lação de produção aumentada de anticorpos aos superantígenos encontra- dos no repertório pré-imune de organismos vivos. O método compreende administração de um ou ambos de um estimulante policlonal de célula B ou um análogo eletrofílico do mesmo a um animal vivo. A presente invenção é dirigida ainda aos anticorpos produzidos

através dos métodos descritos supra. A invenção relacionada é dirigida a métodos de tratamento de infecção HIV em um indivíduo. Os métodos com- preendem administração de uma quantidade imunologicamente eficaz dos anticorpos descritos aqui ao indivíduo. A presente invenção é ainda dirigida a um método para isola-

mento de um anticorpo individual ou fragmento de anticorpo do mesmo ten- do uma seqüência única e especificidade por epítopo binário de um repertó- rio de anticorpo. O método compreende visualização do repertório de anti- corpo sobre a superfície de partículas de fago e varredura do repertório de anticorpo com um polipeptídeo ou um análogo polipeptídico eletrofílico do mesmo ou um estimulante ou um análogo estimulante eletrofílico do mesmo, em que um anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo que reage com o polipeptídeo, o estimulante ou os análogos eletrofílicos dos mesmos, desse modo, isola o anticorpo com epítopo binário específico ou fragmento de anti- corpo do mesmo do repertório de anticorpo.

A presente invenção é dirigida ainda a análogos eletrofílicos de polipeptídeos ou lipídios, polissacarídeos e lipopolissacarídeos ou oligonu- cleotídeos tendo a estrutura:

L

X··

L

m

L'

I

Y"

Y' Y

η

Em um análogo polipeptídico eletrofílico, L1...Lx...Lm são com- ponentes que definem um determinante antigênico, onde Lx é um aminoáci- do componente do determinante antigênico, L' é um grupo funcional de Lx, Y" é uma molécula, uma ligação covalente ou um ligante, Y' é um grupo neu- tro ou carregado opcional, Y é um grupo eletrofílico que reage covalente- mente com um anticorpo que se liga ao referido determinante antigênico, η é um número inteiro de 1 a 1000 e m é um número inteiro de 1 a 30. Em um análogo eletrofílico de lipídío, polissacarídeo e lipopolissacarídeo, Li...Lx...Lm são componentes que definem um determinante de ligação a receptor, onde Lx é um açúcar ou lipídio do determinante de ligação a recep- tor, L' é um grupo funcional de Lx, Y" é uma molécula, uma ligação covalente ou um ligante, Y' é um grupo neutro ou carregado opcional, Y é um grupo eletrofílico que reage covalentemente com um receptor celular que se liga ao referido determinante de ligação a receptor ou um grupo acila; em que, op- cionalmente, Y", Y' ou Y compreende um grupo de ligação à água como um componente interno ou terminal, η é um número inteiro de 1 a 1000 e m é um número inteiro de 1 a 1000. Em um análogo eletrofílico nucleotídico, L1l--Lx-^Lm são componentes que definem um determinante de ligação a receptor, onde Lx é um nucleotídeo componente do determinante de ligação a receptor, L1 é um grupo funcional de Lx, Y" é uma molécula, uma ligação covalente ou um ligante, Y' é um grupo neutro ou carregado opcional, Y é um grupo eletrofílico que reage covalentemente com um receptor celular que se liga ao referido determinante de ligação a receptor ou um grupo acila; em que, opcionalmente, Y", Y1 ou Y compreende um grupo de ligação à água como um componente interno ou terminal, η é um número inteiro de 1 a 1000 e m é um número inteiro de 1 a 1000.

Esses e outros aspectos, características e vantagens da presen- te invenção se tornarão evidentes a partir da descrição das modalidades presentemente preferidas da invenção, fornecidas para fins de divulgação. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

De modo que o assunto no qual as características, vantagens e objetivos da invenção mencionados acima, bem como outros os quais se tornarão claros, sejam obtidos e possam ser entendidos em detalhes, des- crições mais particulares e determinadas modalidades da invenção rapida- mente resumidas acima são ilustradas nos desenhos em anexo. Esses de- senhos formam parte da especificação. Deve ser notado, contudo, que os desenhos em anexo ilustram modalidades preferidas da invenção e, portan- to, não devem ser considerados como limitando seu escopo. A figura 1 representa um modelo de reconhecimento de epítopo

duplo. É mostrada uma representação esquemática do reconhecimento pro- posto pela IgG do tronco V3 (301-311) e a região peptídica SAg (421-433), respectivamente, por CDRs adaptativamente amadurecidas e FRs conser- vadas. Nü= resíduo de nucleofílica.

As figuras 2A-2B mostram imunogênios E-gp120. A figura 2A representa estruturas esquemáticas de E-gp120. Grupos fosfonato eletrofíli- cos foram colocados sobre cadeias laterais de Lys do gp120 usando dois Iigantes alternativos. Biotina (~0,7/mol de gp120) foi introduzida no gp120 antes de introdução de fosfonato. A figura 2B mostra blots coradas com es- treptavidina-peroxidase de géis de SDS mostrando oligômeros E-gp120. As fileiras 1-3 mostram preparados de E-gp120 (incubados durante 4 horas em um tampão com pH neutro; biotinilado) com proporções de fosfonato/gp120 de 4,4, 14,2 e 23,4, respectivamente.

A figura 3 demonstra a neutralização de HIV-1 pelos MAbs YZ18 e YZ23. CRL1689 de IgG é um isotipo de IgG pareado. Cepa ZA009 de HIV, ciado C, R5-dependente. Hospedeiros de célula mononuclear de sangue periférico. A neutralização foi computada como % em diminuição nas con- centrações de p24 em poços contendo MAb comparado com controle de veículo.

A figura 4 demonstra a inibição de ligação gp120-MAb por frag- mentos peptídicos de gp120. Ensaios ELISA foram conduzidos usando MAbs (5 μg/mL) em lâminas revestidas com gp120 (YZ23) ou E-gp120 1a (YZ18) (40 ng/poço) na presença ou ausência dos peptídeos competidores indicados. A ligação dos MAbs foi medida usando IgG-peroxidase antica- mundongo. Os peptídeos 301-315 e 417-431 inibiram a ligação com potência equivalente ao 297-311 e 421-433, respectivamente (não-mostrado). Tam- bém são mostrados os resultados do ELISA usando MAb SK-T03 (0,2 μg/mL) e gp120 imobilizado na presença ou ausência de peptídeo 465-479. Um peptídeo de controle não ínibitório é mostrado em cada painel.

As figuras 5A-5D demonstram a ligação a epítopo duplo por MAbs anti-E-gp120. A figura 5A mostra estruturas de sondas eletrofílicas usadas para estudos de ligação dupla. São mostrados E-293-311, E-421- 133 e sondas de hapteno eletrofílicas. O controle é E-VIP. A figura 5B de- monstra a ligação de E-421-433 e E-293-311 pelas IgGs YZ18. Blots cora- das com estreptavidina-peroxidase de géis de SDS reduzidos mostrando complexos formandos através de incubação de (6 h) IgG YZ18 (0,5 μΜ) com sondas de E-peptídeo ou E-hapteno (10 μΜ/ A figura 5C demonstra o reco- nhecimento de 421-433-CRA e 293-311-CRA pelas IgGs YZ23. Dados de ELISA usando IgG YZ23 e sondas de peptídeo biotiniladas (imobilizados sobre lâminas de estreptavidina; 0,4 μg/poço). Após incubação com IgG, os poços foram tratadas com PBS (ligação total) ou tampão contendo SDS a 2% (ligação resistente a SDS). Uma IgG irrelevante de isotipo equivalente (clone CRL1689) não mostra ligação detectável (27 μg/mL, 0,04 ± 0,01). A figura 5D representa a formação de complexo ternário de IgG YZ23 com E- 293-311 e E-421-433. É mostrado no painel esquerdo o curso de tempo de ligação de E-293-311 pela IgG YZ23. IgG YZ23, 1 μΜ; E-293-311, 10 μΜ. As misturas de reação foram submetidas à SDS-eletroforese e o teor de biotina nos complexos de E-293-311/lgG foi determinado através de densitometria das blots coradas com estreptavidina-peroxidase. No painel direito é mostra- da a ligação de E-421-433 pelos complexos de IgG YZ23-E-293-311. IgG YZ23 foi deixada reagir com E-293-311 até próximo da saturação (3 h), en- tão, com E-421-311 (10 μΜ) durante 8 h. O teor de biotina nos complexos foi determinado conforme no painel esquerdo. As figuras 6A-6D demonstram a base estrutural de anticorpo pa-

ra reconhecimento de epítopo duplo. A figura 6A mostra o resíduos 301-311 (amarelo) e 421-433 (verde) na estrutura de cristal do gp120 (PDB 2B4C). As duas regiões peptídicas estão distantes uma da outra e expostas sobre as diferentes superfícies do gp120. A figura 6B mostra o alimento de se- quências VH dos MAbs YZ18 e YZ23 com 4 Abs da família VH3 que reco- nhecem o gp120 como um superantígeno. Estão sublinhadas as CDRs. Nú- mero superior, numeração linear de 18/2; número inferior, numeração linear de YZ18. Em negrito, resíduos de VH putativos envolvidos em interações do superantígeno gp120 (Karray e e outros, Jl 1998, 161, 6681). Os resíduos YZ18 YZ23 realçados em vermelho representam identidades aos resíduos de ligação de gp120SAg em um Ab VH3; realçadas em ciano, alterações conservadas (seguindo a definição de homologia de aminoácido de Karray e e outros). A figura 6C mostra os poços de ligação dupla putativas no MAb YZ23. Dados de difração de raios X para o cristal Fab YZ23 foram coletados de uma fonte de radiação Synchrotron e sua estrutura foi decomposta atra- vés do método de substituição molecular em uma resolução de 2,5 Â. O po- ço de ligação de antígeno 301-311 putativa (poço Ag; verde) é formada pe- las CDRs do Ab. O poço de ligação 421-433 (poço SAg; branco) é formada pelos resíduos de framework reportados como sendo responsáveis pela li- gação de SAg ao gp120. A figura 6D representa um modelo de reconheci- mento de epítopo duplo. O epítopo de tronco V3 (301-311) e o epítopo SAg (421-433) são reconhecidos, respectivamente, pelas CDRs adaptativamente amadurecidas (poço Ag) e FRs conservadas (poço SAg). Nu1 resíduo de nu- cleotídeo. O modelo é praticável de dois sub-sítios de ligação de Ab estão simultaneamente em registro com as duas regiões do gp120. A flexibilidade da região de ligação de gp120 ao tronco V3 e à região peptídica SAg pode ser importante nesse modelo. O Ioop V3, particularmente a coroa, é altamen- te flexível. O pareamento de eletrófilo de gp120-nucleófilo de Ab resulta em formação de complexo irreversível ou clivagem proteolítica.

As figuras 7A-7C representam a base estrutural de imunogênio para reconhecimento de epítopo duplo. A figura 7A mostra a oligomerização covalente de E-gp120. São apresentados no painel esquerdo géis de SDS- eletroforese corados com prata mostrando a presença de oligômeros cova- Ientes em E-gp120 (fileira 1), a fração enriquecida em trímero de cromato- grafia por filtração em gel sobre Superose 6 (fileira 2) e o gp120 de controle desprovido de grupos fosfonato (fileira 3). É mostrado no painel direito um cromatograma de filtração em gel, no qual a área hachurada representa a fração enriquecida em trímero usada para a fileira 2 no painel esquerdo. A figura 7B demonstra o efeito inibitório de E-gp120 na ligação ao HIV por MAbs dirigidos ao sítio de ligação aos epítopos de CD4 (b12), V3 apex (447- 52D) e carboidrato (2G12) conformacionais. MAbs (b12, 45 μg/mL; 447-52D, 0,8 μg/mL; 2G12, 7,5 μg/mL) foram incubados com HIV (MN, 1,6 χ 103 TCIDso/mL) na presença ou ausência de gp120, E-gp120 1a (32 grupos fos- fonato/gp120), EGF ou E-EGF (0,5 μΜ) durante 20 h. Vírions ligados ao MAb foram capturados em poços revestidos com proteína G (1 μρ/ροςοε; 1 h), submetidos à Iise com Triton X100 a 10% e HIV p24 nos Iisatos foram medi- dos através de ELISA. A figura 7C mostra a ligação de E-gp120 pelos MAbs dirigidos ao sítio de ligação dos epítopos de CD4 (b12), V3 apex (447-52D) e carboidrato (2G12) conformacionais. Lâminas de ELISA foram revestidas com E-gp120 1a, o preparado enriquecido em trímero de 1a (purificado atra- vés de filtração em gel) ou gp120 de controle (40 μg/poço) e os MAbs liga- dos detectados através de IgG-HRP anti-humana.

A figura 8 demonstra a atividade de neutralização de MAbs de ligação dupla e não-ligação dupla. O painel com MAb anti-E-gp120 (n = 17) foi avaliado com relação às atividades de ligação a epítopo duplo e neutrali- zação de HIV. A atividade de ligação dupla foi examinada através do ensaio de eletroforese usando E-293-311 e E-421-33, conforme na figura 5B (IgG, 0,5 μΜ; E-peptídeos, 10 μΜ; 3 h). MAbs positivos para ligação de E-293-311 e ligação de E-421-433 foram definidos como aqueles que proporcionam intensidades de banda >18220 e >9110 AVU (unidade de volume arbitrária), respectivamente (intensidade média de banda de adutos de sonda de con- trole de 17 MAbs, 1822 AVU). A neutralização de HIV foi estudada usando o isolado primário de ciado C ZA009 e PBMCs como células hospedeiras. MAbs que mostraram neutralização >50% a <30 μg/mL foram considerados positivos.

As figuras 9A-9C demonstram ligação irreversível ao gp120 pe- los MAbs anti-E-gp120. A figura 9A representa um ELISA mostrando a liga- ção ao gp120 SDS-resistente pelos MAbs anti-E-gp120 (série YZ1 75 ^g/ml; SKT03, 1 μς/ιτιΙ). Três MAbs de controle anti-V3 (IgG n°1121, 75 μς/ιηΙ, Im- munodiagnostics Inc.; 257-D IV, 1 μρ/ηιΙ; 268-D IV, 15 μg/ml) e um MAb de controle anti-CD4bs b12 (10 μg/ml) também são mostrados. Os valores (mé- dias de 3 réplicas) representam ligação residual SDS-resistente (lâminas lavadas com SDS a 2% após ligação do MAb ao gp120 imobilizado) expres- sa como % da ligação total (lâminas lavadas com PBS, pH de 7,4, após liga- ção do MAb ao gp120). 40 μg de gp120/poço. A figura 9B demonstra a liga- ção ao gp120 SDS-resistente pelo MAb SK-T03. São mostradas blots cora- * das com estreptavidina-peroxidase (fileiras 1-3) e coradas com peroxidase anti-lgG de camundongo (fileiras 4-6) de géis de SDS-eletroforese de não- redução mostrando adutos SDS-resistentes formados através de tratamento de gp120 com MAb SK-T03. Fileiras 1 e 4, MAb SK-T03 incubados com Bt- gp120; fileira 2, MAb de controle de isotipo equivalente MOPC21 incubado com Bt-gp120; fileiras 3 e 5, Bt-gp120 de controle apenas incubado no dilu- ente; fileira 6, MAb SK-T03 sozinho incubado no diluente. Ab, 75 (fileiras 1-3) ou 15 μg/mL (fileiras 4-6); Bt-gp120, 5 (fileiras 1-3) ou 27 μg/mL (fileiras 4-6); Incubações durante 17 h. Os pesos moleculares nominais computados atra- vés de comparação com proteínas padrões são indicados. A figura 9C de- monstra a estabilidade dos complexos imunes de MAb SK-T03 em solução de não-desnaturação. Complexos imunes foram formados através de incu- bação de MAb SK-T03 (20 Mg/ml_) ou MAb 268-D IV (1 μg/mL) com Bt- gp120 (0,2 pg/mL) durante 12 h. Os complexos foram capturados sobre pro- teína G-Sepharose, gp120 livre removido através de lavagem e a resina foi ainda incubada na presença de peptídeo 465-479 de gp120 (MAb SK-T03; Mg/mL) ou peptídeo 309-323 (MAb 268-D IV; 10 Mg/mL). Alíquotas foram extraídas a 0, 4, 30, 73, 121 e 239 h e os complexos imunes residuais foram detectados usando um conjugado de estreptavidina-peroxidase. Os valores - 20 são expressos com relação à ligação no t = 0 (A490 para MAb SKT-T03 e MAb 268-D IV, respectivamente, 1,05 ± 0,08 e 1,78 ± 0,07) e são corrigidos para a ligação de base observada usando um MAb irrelevante (MOPC 21; 20 μg/mL), o qual era quase constante em todos os pontos de tempo estudados (A490, 0,23 ±0,01).

As figuras 10A-10B representam a clivagem de gp120 pela IgG

YZ18. A figura 10A é uma blot corada com estreptavidina-peroxidase de géis de SDS mostrando a clivagem tempo-dependente de gp120 biotinilado pela IgG YZ18 e a falta de clivagem pela IgG YZ19. IgG, 1 μΜ; Bt-gp120, 0,2 μΜ; 22 h de incubação. OE, fileiras super-expostas mostrando Bt-gp120 incuba- do durante 22 h em diluente ou IgG YZ18 IgG (1 μΜ). Bandas de produto a 27 kDa e 15 kDa são visíveis além das principais bandas de 50-55 kDa. A figura 10B é uma blot corada com anti-gp120-peroxidase de um gel de SDS mostrando gp120 incubado com diluente ou IgG YZ18 IgG. IgG, 1 μΜ; gp120, 1 μΜ; 24 h de incubação.

A figura 11 representa um mecanismo de reação proposto de Abs nucleofilicos: hidrólise de antígeno (superior) e ligação irreversível (infe- rior). O Ab forma o complexo não-covalente inicial através de interações de epítopo-parátopo convencionais. Em proteólise, o complexo não-covalente inicial, o nucleófilo do sítio ativo ataca a carbonila da banda passível de ci- são no antígeno para formar o complexo em estado de transição tetraédrico. O fragmento antigênico C-terminal é liberado e o complexo de acila-Ab é formado. Hidrólise do complexo de acila-Ab (deacilação) libera o fragmento de antígeno N-terminal e regenera o Ab catalítico. Em ligação irreversível, acúmulo do complexo tetraédrico (IC) ou do complexo trigonal de acila-Ab (IC50, após liberação do fragmento antigênico C-terminal) pode ocorrer em virtude de estabilidade aumentada da ligação formada através de ataque do nucleófilo ou suporte deficiente para a(s) etapa(s) após término de ataque do nucleófilo. NuH, nucleófilo; Ag1-NH-CH(R)-CO2H, fragmento antigênico N- terminal; NH2-Ag2, fragmento antigênico C-terminal.

A figura 12 mostra uma representação hipotética da resposta imune ao construto com epítopo duplo. As figuras 13A-13D mostram construtos com epítopo duplo. A

figura 13A é (301-311)-GMB-GGS-(E-421-433); GMB1 γ-maleimidobutirila. A figura 13B é 7-(301-311)-GMB-GGS-(E-c421-433); O1 ornitina. É mostrada uma variante E-421-433 restrita como um componente do construto com epí- topo duplo. O T-epítopo (T) é mostrado dentro do retângulo. A figura 13C é KLH-(301 -311 )-GMB-GGS-(E-c421 -433). É mostrado um construto com epí- topo duplo KLH-conjugado contendo 301-311 e E-421-433 restrito (Ec421- 433) conectados através de um Iigante GMB-GGS. A figura 13D é E-HIV. Partículas de HIV inativadas com psoraleno com fosfonatos colocados sobre resíduos de Lys. A figura 13E representa uma partícula viral inteira mostran- do as proteínas do envoltório modificadas para mostrar grupos fosfonato ele- trofílicos.

A figura 14 é um diagrama esquemático de versões de anticorpo natural e manipulado. IgA e IgG monoméricas são distinguidas por seus do- mínios constantes (preto) e (cinza). IgA secretória é composta de IgA diméri- ca e polimérica estabilizada pela cadeia J (a qual se liga ao pedaço da cau- da) e o componente secretório. IgM é um pentâmero dissulfeto-ligado con- tendo o domínio constante. Ligação de antígeno e clivagem catalítica ocor- rem nas regiões variáveis das cadeias leve e pesada (vermelho e azul, res- pectivamente). Os domínios variáveis ligados por um Iigante peptídico são referidos como um Fv com uma única cadeia.

As figuras 15A-15C demonstram a clivagem de gp120 biotinilado pela IgA salivar e de soro de seres humanos sem infecção pelo HIV. A figura 15A mostra blots coradas com estreptavidina-peroxidase de géis de SDS de redução mostrando a clivagem tempo-dependente de Bt-gp120 (0,1 μΜ) in- cubado com IgA de soro policlõnal empoçada (160 μg/ml) e IgA salivar (32 μg/ml) de 4 seres humanos. Volume de reação, 0,02 ml. Fileira com diluente, gp120 incubado com diluente ao invés de IgA. OE, fileira superexpressa mostrando Bt-gp120 incubado durante 46 h com IgA salivar. A figura 15B mostra a atividade comparativa de clivagem de gp120 de IgA salivar (32 μg/ml) e IgA de soro (144 μg/ml) de 4 seres humanos expressa por massa de Ab equivalente. Condições de reação: 17 h, Bt-gp120 a 0,1 μΜ. A figura 15C mostra a atividade comparativa de clivagem de gp120 de IgA de soro e IgG (144 μg/ml) expressa por massa de Ab equivalente. IVIG1 preparados de IgG comerciais (os 3 pontos de dados correspondem aos seguintes prepara- dos de IVIG: Intratect, Gammagard, Inveegam). Cada ponto de IgA e IgG representa Abs de um ser humano diferente. As figuras 16A-16C representam interações de EP-hapteno 1

com IgA. A figura 16A mostra a estrutura do EP-hapteno 1. O hapteno 2 de ácido fosfônico de controle não eletrofílico é estruturalmente idêntico ao hap- teno 1, exceto quanto os grupos fenila ausentes. A figura 16B demonstra a inibição de catálise e ligação irreversível pelo EP-hapteno 1. gp120 (0,1 μΜ) foi reagido com IgA salivar (2 ng/ml) ou IgA de soro (160 μς/ηηΙ) na ausência ou presença de EP-hapteno 1 e hapteno 2 de controle (1 mM) durante 8 h antes de incubação com gp120 não biotinilado durante 16 h. Os dados são de géis de SDS-eletroforese corados com anti-gp120 policlonal peroxidase- conjugado. % em inibição = [(100-gp120 clivado na presença de inibi- dor)/(gp120 clivado na ausência de inibidor)] χ 100], Os valores são as mé- dias de duplicatas. A figura 16C mostra blots coradas com estreptavidina- peroxidase de géis de SDS de redução mostrando o EP-hapteno 1 e hapte- no 2 tratados com IgA salivar e IgA de soro. HeL denotam bandas de subu- nidade de cadeias pesada e leve, respectivamente.

A figura 17 demonstra a clivagem preferencial de gp120 pela IgA e slgA. Proteínas biotiniladas (Bt) estudadas são gp120, receptor de fator de crescimento epidérmico solúvel (sEGFR), albumina de soro bovino (BSA), domínio C2 de fator Vlll de coagulação humano (C2) e HIV Tat. São mostra- das blots coradas com estreptavidina-peroxidase de géis de SDS de redução das proteínas (0,1 μΜ) incubadas (17 h) com IgA de soro, IgA salivar (ambas a 160 μg/ml) ou diluente.

As figuras 18A-18C representam a inibição de hidrólise de gp120SAq e ligação irreversível de IgA pelo EP-421-433. A figura 18A de- monstra a inibição preferencial de clivagem de gp120 catalisada por IgA pelo EP-421-433. IgA salivar (16 μς/ιτιΙ) ou IgA de soro (160 μς/ηιΙ) foram pré- incubadas (6 h) com EP-421-433 ou EP-VIP (100 μΜ), as misturas de rea- ção foram incubadas adicionalmente durante 16 h após a adição de gp120 (0,1 μΜ). Inibição de clivagem de gp120 determinada conforme na figura 3. A figura 18B demonstra a ligação irreversível de EP-421-433 pela IgA de soro e IgA salivar. São mostradas blots coradas com estreptavidina- peroxidase de géis de eletroforese de redução de IgA (80 μg/ml) incubada com EP-421-433, EP-VIP ou EP-hapteno 1 (10 μΜ; tempo de reação de 21 h). H e L denotam bandas de cadeias pesada e leve. A figura 18C demons- tra a inibição de ligação lgA:EP-421-433 irreversível pelo peptídeo 421-435 de gp120. IgA salivar (80 μς/ιηΙ) foi tratada com peptídeo 421-435 de gp120 (100 μΜ) ou diluente, seguido pela adição de EP-421-433 (10 μΜ) e incuba- ção durante 21 h. Adutos de EP-421-433 foram detectados. São plotadas as intensidades de agregado das subunidades de cadeias pesada e leve de- terminadas através de densitometria. A figura 19 identifica ligações peptídicas clivadas pela IgA sali- var. São mostradas as fileiras de eletroforese em gel-SDS coradas com azul Coomassie de gp120 (270 μg/ml) incubado durante 9 h em diluente (fileira 1) ou com IgA (80 pg/ml) (fileira 2). A fileira 3 mostra o perfil eletroforético da mistura de reação de gp120-lgA após uma digestão mais prolongada (46 h). Os rendimentos do aminoácido indicado foram de 0,3 - 1,5 pmoles. Uma mistura de PTH-aminoácidos (2 pmoles cada; Applied Biosystems) foi em- pregada como padrão (sensibilidade de detecção de aminoácidos individuais de 0,04-0,10 pmoles). As figuras 20A-20C demonstram a neutralização de HIV pelos

Abs de seres humanos soro-negativos para HIV. A figura 20A mostra a po- tência de neutralização de Abs de IgA e IgG purificados de soro empoçado ou saliva de 4 seres humanos. IVIG, Gammagard S/D. Cepa de HIV-1, 97ZA009; células hospedeiras, PBMCs estimuladas com fitohemaglutinina. Os Abs foram incubados com o vírus durante 24 h. Os valores são expres- sos como redução percentual das concentrações de p24 em culturas de tes- te comparado com culturas que receberam diluente ao invés dos Abs (mé- dias ± s.d. de 4 réplicas). A figura 20B mostra a inibição de atividade de neu- tralização de IgA (empoçada de 34 doadores) pelo EP-421-433. IgA purifica- da de soro humano (2 μς/ιτιΙ) foi pré-incubada (0,5 h) com EP-421-433 (100 μΜ), EP-VIP de controle ou diluente e a atividade de neutralização foi deter- minada conforme no painel A. A figura 20C demonstra a atividade de neutra- lização de HIV tempo-dependente. HIV foi pré-incubado com a IgA salivar ou de soro durante 1 h e a atividade de neutralização medida conforme na figu- ra 20A.

A figura 21 mostra a atividade de clivagem de gp120 de Abs de camundongos imunizados com E-421-433 conjugado à KLH. Os camundon- gos foram imunizados com KLH-E-421-433 intraperitonealmente com adju- vante RIBI ou intranasalmente com adjuvante IL12/CTB ou adjuvante LTm. A atividade de clivagem de gp120 de Abs purificados foi determinada através do ensaio de eletroforese usando Bt-gp120 (0,1 μΜ) como um substrato.

As figuras 22A-22D ilustram a ligação, resposta catalítica e de neutralização à imunização intranasal com E-421-433 conjugado à KLH. A figura 22A mostra a resposta catalítica. É mostrada a atividade de clivagem de gp120 específica (nM/h^g de Ig) de Abs purificado do soro, saliva e lava- gem vaginal de camundongos pré-imunes e camundongos imunizados na- salmente com E421-433 conjugado à KLH (adjuvante LTm; 4 imunizações nasais, amostras obtidas 1 semana depois). Blots coradas com estreptavidi- na-peroxidase de géis de SDS mostrando Bt-gp120 (0,1 μΜ) incubado na presença ou ausência de IgA vaginal hiperimune (3 ng/mL) durante 17 h. A figura 22B mostra a resposta de ligação. Os valores de ELISA para ligação de E-421-433 pelos Abs purificados de camundongos pré-imunes e hiperi- munes (imunização nasal, amostras de soro conforme na figura 22A) detec- tados através de conjugados de peroxidase de IgG, IgM ou IgA anticamun- dongo. A figura 22C mostra a resposta de neutralização de IgM. IgMs purifi- cadas de soro de camundongos pré-imunes e imunizados com E-421-433 (imunizações intraperitoneais ou nasais nos adjuvantes indicados) foram analisadas com relação à atividade de neutralização de HIV usando o isola- do ZAOO9 primário do ciado C e PBMCs hospedeiras. A figura 22D mostra as respostas de neutralização de IgG e IgA. IgGs e IgAs são purificadas de soro de camundongos pré-imunes e imunizados com E-421-433 (imuniza- ções nasais com LTm como adjuvante) foram analisadas com relação à ati- vidade de neutralização de HIV usando o isolado ZA009 primário do ciado C e PBMCs hospedeiras.

As figuras 23A-23B ilustram a ligação e resposta catalítica à i- munização sistêmica com E-421-433 conjugada à KLH. A figura 23A mostra a resposta de ligação e catalítica em IgA salivar e IgA vaginal. O eixo es- querdo de cada painel mostra a atividade de clivagem de gp120 (nM/h^g) de IgAs purificadas por afinidade de camundongos imunizados intraperitone- almente com E-421-433 conjugado à KLH (RIBI como adjuvante). IgA, 3 μ9/ιτιΙ, Bt-gp120 0,1 μΜ, 16h. O eixo direito mostra os valores de ELISA para ligação de E-421-433 à IgA de saliva (1:8) e lavagem vaginal (1:10) recupe- rada dos mesmos camundongos detectados através de conjugados de pero- xidase de IgA anticamundongo. As setas indicam o esquema de injeção. A figura 23B mostra a resposta de ligação no soro. Os valores de ELISA para ligação de E-421-433 pela IgG de soro (1:5000), IgM (1:1000) e IgA (1:100) de camundongos imunizados intraperitonealmente com E-421-433 conjuga- do com KLH (RIBI como adjuvante) detectados por conjugados de peroxida- se de IgG, IgM ou IgA anticamundongo. As setas indicam o esquema de in- jeção.

As figuras 24A-24C demonstram a estimulação de síntese de ligação de gp120 à IgM pela Proteína A. A figura 24A mostra a indução de ligação de gp120 à IgM em camundongos estimulados com Proteína A. São mostradas as titulações de IgM no soro em camundongos pré-imunes e ca- mundongos estimulados com Proteína A (dia 30; 1 mg de Proteína A i.v. nos dias indicados pelas setas no painel B; diluição a 1:1000) determinadas u- sando lâminas revestidas com gp120 (0,2 μg/poço). A IgM ligada foi detecta- da com IgM anticamundongo biotinilada (específica para a cadeia K; 1:1000) e estreptavidina peroxidase-conjugada (1:1000). Ensaios idênticos sem re- vestimento com gp120 proporcionaram valores A490 de 0,046 ± 0,002 (dia 0) e 0,027 ± 0,001 (dia 30). A figura 24B é um curso de tempo de respostas de ligação de IgM ao gp120 em camundongos estimulados com Proteína A. Proteína A (1 mg, i.p. em PBS) administrada nos dias indicados pelas setas.

- 20 São mostrados dados de ELISA para soros obtidos em vários pontos de tempo. A IgG e IgM ligadas foram detectadas, respectivamente, com IgG anticamundongo de cabra peroxidase-conjugada (Fc específica; 1:500) e IgM anticamundongo de cabra ( -cadeia específica; 1:500).

As figuras 25A-25C demonstram a especificidade de ligação de IgM a gp120 induzida através de estimulação com proteína A. A figura 25A mostra a inibição de ligação gp120-lgM pelo gp120. São mostrados dados de ELISA de ligação de gp120 na presença e ausência de gp120 (0,5 μΜ). Soro: dia 35, diluição a 1:100 em leite desnatado a 1%/PBST. Outras condi- ções são conforme na figura 2B. A figura 25B mostra a ligação de E-421-433 específica pela IgM. São mostrados géis de SDS-redução corados com es- treptavidina-peroxidase de IgM incubada com E-gp120421-433 (fileira 1), uma sonda de controle eletrofílica contendo uma seqüência embaralhada de gp120421-433 (fileira 2) e E-hapteno (fileira 3). IgM1 56 μρ/Γηί; E-gp120421-433 e sondas de controle, 1 μΜ; 37°C, 1 h. Além da banda de cadeia-μ de 70- kDa e da banda κ/λ de 25-kDa, uma banda de 50 kDa era evidente na fileira 1, identificada anteriormente como um fragmento de cadeia-μ baseado em coloração com anticorpo anti-μ (36). A figura 25C representa as estruturas de sondas usadas na figura 25BB. LC, Iigante de aminohexanoíla.

As figuras 26A-26B representam a base estrutural compartilhada para propriedades superantigênicas de células B de Proteína A estafilocóci- ca e gp120 de HIV. A figura 26A é uma representação esquemática do com- plexo entre o domínio D de Proteína A estafilocócica (SpA-D) e Fab 2A2 de IgM humana (PDB IDEE). É mostrada uma vista ampliada da interface de SpA-D (fita tracejada) e Fab 2A2 (fita sólida). Aminoácidos de anticorpo re- portados como interagindo com SpA [Graille M. e e outros, 2000] ou gp120 [Karray S. e e outros, 1998] são mostrados no estilo Corey, Pauling e Koltun (CPK) - resíduos de GPK em vermelho representam aminoácidos que inte- ragem com gp120 e SpA-D; azul, aminoácidos que interagem com gp120 apenas; verde, aminoácidos que contatam SpA-D apenas. A figura 26B é uma representação esquemática de SpA-D e resíduos 421-433 de gp120 superimpostos. São mostrados os resíduos 421-433 de gp120 na forma de hélice (fita verde; uma estrutura energia-minimizada obtida através de mode- Iamento com CHARMm/DS 1.7 (AccereIys)) superimpostos sobre a hélice Il de SpA-D (fita em cinza claro; extraída da estrutura de cristal, PDB IDEE), onde aminoácidos que interagem com aminoácidos que contatam gp120 de Fab 2A2 são agrupados (mostrados no estilo de esfera e bastão; uma esfera azul representa um átomo de nitrogênio; vermelho, átomo de oxigênio; áto- mos de carbono e ligações são mostrados em cores principais). RMSD, 0,88 A.

A figura 27 representa Ε-Proteína A. O estimulante Ε-Proteína A contém os grupos fosfonato eletrofílicos sobre os grupos amino da cadeia lateral de Lys.

As figuras 28A-28B são um exemplo de estimulantes de células B policlonais que não utilizam BCR. A figura 28A mostra E-LPS. É mostrado E-LPS derivado de Re LPS de E. coli. Dois grupos eletrofílicos são coloca- dos sobre o grupo carboxílico de resíduos de ácido 2-ceto-3- deoxioctolusônico. A figura 28B é E-CpG. É mostrado E-CpG derivado de CpG ODN2006, TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT ligado através de ligações de fosforotioato. Os grupos eletrofílicos são colocados via 4'- aminometil-4,5',8-trimetil psoraleno (AMT), o qual reage preferencialmente com resíduos de timidina (Τ). O sítio primário de fixação de timidina-AMT está entre a ligação dupla 5,6 da timidina em CpG e as ligações duplas 4',5' do psoraleno (seta a). Reação adicional com outra timidina (seta b) é possí- vel que ocorra, formando uma ligação cruzada inter- ou intra-fita. O grupo eletrofílico di(4-nitrofenil) suberoilamino (4-amidinofenil) metano fosfonato está ligado ao grupo amino de AMT (unidade T-PsP). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Conforme usado aqui, o termo "um" ou "uma", quando usado em conjunto com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou na especifi- cação, pode se referir a "um(a)", mas também é consistente com o significa- do de "um(a) ou mais", "pelo menos um(a)" e "um(s) ou mais de um(a)". Al- gumas modalidades da invenção podem consistir ou consistir essencialmen- te de um ou mais elementos, etapas de método e/ou métodos da invenção. Considera-se que qualquer composto, composição ou método descrito aqui pode ser implementado com relação a qualquer outro dispositivo, composto, composição ou método descrito aqui.

Conforme usado aqui, o termo "ou" nas reivindicações se refere a "e/ou", a menos que explicitamente indicado como se referindo à alternati- vas apenas ou à alternativas mutuamente exclusivas, embora a divulgação suporte uma definição que se refere apenas à alternativas e "e/ou".

Conforme usado aqui, o termo "animal" se refere a um mamífero, de preferência um ser humano.

Conforme usado aqui, o termo "indivíduo" se refere a qualquer recipiente de um anticorpo com epítopo binário específico administrado para tratar HIV.

Em uma modalidade da presente invenção, é proporcionado um 10

15

polipeptídeo ou análogo eletrofílico do mesmo compreendendo um epítopo superantigênico e pelo menos um outro epítopo eficaz para induzir à produ- ção de anticorpos com especificidade binária pelos epítopos sobre um antí- geno polipeptídico. Em uma outra modalidade, um ou ambos os epítopos ainda compreendem um ou mais grupos eletrofílicos nos mesmos, onde os grupos eletrofílicos são eficazes para induzir à síntese dos anticorpos biná- rios específicos.

Em ambas as modalidades, o análogo eletrofílico pode ser gp120 covalentemente oligomerizado. Também, o polipeptídeo ou análogo eletrofílico do mesmo pode compreender o epítopo gp120 superantigênico ligado a outro epítopo gp120 através de um Iigante peptídico. Particularmen- te, o análogo superantigênico pode compreender os resíduos de aminoácido 421-433 e o outro epítopo pode compreender os resíduos de aminoácido 301-311 de gp120. Também, o Iigante peptídico tem um número suficiente de aminoácidos, de modo que o comprimento do Iigante se aproxima da dis- tância entre os dois epítopos no gp120 nativo.

Também, em ambas as modalidades, um ou ambos os epítopos compreendendo o análogo eletrofílico tem a fórmula estrutural:

L-

L

m

L' Y"

Y' Y

η

onde Li...Lx...Lm são componentes que definem um determinante antigêni- co; Lx é um aminoácido componente do determinante antigênico; L' é um grupo funcional de Lx; Y" é uma molécula solúvel, uma ligação covalente ou um ligante; Y1 é um grupo neutro ou carregado opcional; Y é um grupo ele- trofílico que reage covalentemente com um anticorpo que se liga ao referido determinante antigênico; η é um número inteiro de 1 a 1000; e m é um nú- mero inteiro de 4 a 30. Além disso, em ambas as modalidades, Y", Y' ou Y ainda pode compreender um grupo de ligação à água como um componente terminal ou interno. Particularmente, o grupo de ligação à água se liga a um íon de metal que quela uma ou mais moléculas de água. Exemplos do grupo de ligação de metal são -(His)n-, onde η = 2 ou mais ou -Cys-X-Cys-Cys- ou - Cys-X-Cys-, onde X é um resíduo de aminoácido, ácido etileno diamina te- tra-acético ou diaminometil piridina. Exemplos do metal são zinco, cobre, níquel, cobalto, cálcio ou magnésio.

Em outra modalidade da presente invenção, é proporcionado um método para a produção de anticorpos com epítopo binário específicos a um antígeno polipeptídico de célula B compreendendo administração de um ou mais construtos polipeptídicos descritos supra ou um ou mais de um análogo polipeptídico eletrofílico do mesmo a um animal vivo. Ainda, nessa modali- dade, o método compreende administração de um ou mais adjuvantes imu- - 20 nológicos eficazes para estimular a produção de anticorpo de célula inde- pendente de célula T ou dependente de célula T ao animal vivo.

Em ambas as modalidades, o antígeno polipeptídico pode ser gp120 de HIV, Tat, Proteína A ou Proteína L. Também, os anticorpos podem reconhecer os resíduos de aminoácido 421-433 e os resíduos 301-311 de epítopos gp120 de HIV. Além disso, os anticorpos com epítopo binário espe- cíficos catalisam a hidrólise do antígeno polipeptídico nativo ou se ligam co- valentemente ao antígeno polipeptídico nativo, por exemplo, gp120, expres- so sobre a superfície do HIV, desse modo, neutralizando o HIV.

Em uma modalidade relacionada, é proporcionado um anticorpo com especificidade binária a um antígeno polipeptídico de célula B produzido através do método descrito supra. Em outra modalidade relacionada, é pro- porcionado um método para tratamento de HIV em um indivíduo compreen- dendo administração de uma quantidade imunologicamente eficaz do anti- corpo descrito supra ao indivíduo.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, é proporcio- nado um método para aumento da produção de anticorpos que reconhecem o sítio superantigênico de célula B de gp120 de HIV compreendendo admi- nistração de um ou ambos de um estimulante de célula B policlonal ou um análogo eletrofílico do mesmo a um animal vivo. Ainda, nessa modalidade, o método compreende administração de um ou mais adjuvantes imunológicos eficazes para estimular a produção de anticorpo de célula B independente de célula T no animal vivo.

Em ambas as modalidades, o estimulante de célula B policlonal pode ser um ou mais de um mitógeno de ombu, lipopolissacarídeo, fitohe- maglutinina ou CpG. Também, o estimulante de célula B policlonal pode ser Proteína A Estafilocócica. Particularmente, o estimulante de célula B policlo- nal pode ser um domínio superantigênico de Proteína A, um oligômero do domínio superantigênico de Proteína A ou Proteína A rotulada com iodo. A- lém disso, o estimulante ainda pode compreender grupos eletrofílicos que estimulam a produção de anticorpos eficazes para catalisar a hidrólise de gp120 ou se ligar covalentemente ao gp120. Além disso, análogo eletrofílico do estimulante de célula B policlonal tendo um ou mais epítopos pode ter a estrutura descrita supra.

Em uma modalidade relacionada, é proporcionado um anticorpo que reconhece o sítio superantigênico de célula B de gp120 de HIV produzi- do através do método descrito supra. Em outra modalidade relacionada, é proporcionado um método para tratamento de HIV em um indivíduo compre- endendo administração de uma quantidade imunologicamente eficaz do an- ticorpo descrito supra ao isolamento.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, é proporcio- nado um método para estimulação de produção aumentada de anticorpos compreendendo administração, a um animal vivo, de uma combinação de um polipeptídeo com epítopo duplo e um análogo eletrofílico do mesmo com um análogo eletrofílico de um estimulante de célula B policlonal. Em ainda outra modalidade da presente invenção, é proporcio- nado um método para isolamento de um anticorpo ou fragmento de anticor- po do mesmo tendo uma seqüência única e especificidade por epítopo biná- rio de um repertório de anticorpo compreendendo visualização do repertório de anticorpo sobre a superfície de partículas de fago; e varredura do repertó- rio de anticorpo com um polipeptídeo ou um análogo polipeptídico eletrofílico do mesmo, em que um anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo rea- ge com o polipeptídeo ou análogos eletrofílicos dos mesmos para, desse modo, isolar o anticorpo com epítopo binário específico ou fragmento de an- ticorpo do mesmo do repertório de anticorpo.

Em ainda outra modalidade da presente invenção, são propor- cionados análogos eletrofílicos de um lipídio, um polissacarídeo ou um Iipo- polissacarídeo tendo a estrutura de análogo polipeptídico eletrofílico geral conforme descrito supra, onde L1...Lx...Lm são componentes que definem um determinante de ligação a receptor; onde Lx é um açúcar ou lipídio com- ponente do determinante de ligação a receptor; L' é um grupo funcional de Lx; Y" é uma molécula, uma ligação covalente ou um ligante; Y1 é um grupo neutro ou carregado opcional; Y é um grupo eletrofílico que reage covalen- temente com um receptor celular que se liga ao referido determinante de ligação a receptor ou um grupo acila; em que, opcionalmente, Y", Y' ou Y compreende um grupo de ligação à água como um componente terminal ou interno; η é um número inteiro de 1 a 1000; e m é de 1 a 1000.

Em ainda outra modalidade da presente invenção são propor- cionados análogos eletrofílicos de um nucleotídeo tendo a estrutura de aná- logo polipeptídico eletrofílico geral conforme descrito supra, onde Li...Lx...Lm são componentes nucleotídicos componentes que definem um determinante de ligação a receptor; Lx é um nucleotídeo componente do determinante de ligação a receptor; L' é um grupo funcional de Lx; Y" é uma molécula, uma ligação covalente ou um ligante; Y' é um grupo neutro ou carregado opcio- nal; Y é um grupo eletrofílico que reage covalentemente com um receptor celular que se liga ao referido determinante de ligação a receptor, em que, opcionalmente, Y", Y1 ou Y contém um grupo de ligação à água como um componente terminal ou interno; η é um número inteiro de 1 a 1000; e m é de 1 a 1000.

A presente invenção descreve meios para superar as barreiras que limitam respostas adaptativas de anticorpo capazes de proteger contra os efeitos de polipeptídeos superantigênicos, por exemplo, mas não limitado a, a proteína gp120 do envoltório de HIV. O sítio superantigênico gp120 de HIV é relativamente conservado e contribui com amínoácidos que são críti- cos para a ligação do vírus a receptores de CD4 sobre células hospedeiras e a infecção pelo mesmo. Consequentemente, considera-se que anticorpos a esse sítio são eficazes para neutralizar diversos isolados de HIV pertencen- do a diferentes ciados.

A presente invenção também descreve uma propriedade até a- gora inesperada de determinados anticorpos, isto é, a capacidade de reco- nhecer dois epítopos distintos de gp120. Essa propriedade do anticorpo, de- signada "especificidade por epítopo duplo", resulta em neutralização da in- fecção HIV, conforme testado em cultura tecidual. Além disso, a capacidade de vários construtos polipeptídicos de induzir à síntese de anticorpos com especificidade por epítopo binário e atividade de neutralização de HIV é di- vulgada. É demonstrado aqui como a inclusão de dois epítopos no construto polipeptídico pode estimular a produção, por células B, de anticorpos que reconhecem um dos epítopos através de interações nas CDRs e do segundo epítopo, através de interações nas FRs. Reconhecimento do primeiro epíto- po na presente invenção é acionado por processos de varredura clonal de célula B convencionais. O sinal proliferativo celular gerado através de intera- ção nas CDRs é suficiente para superar o efeito negativo de interações do segundo epítopo superantigênico nas FRs, resultando em produção de anti- corpos que expressam especificidade por epítopo binário. Essas considera- ções são importantes para criação de uma vacina eficaz contra o HIV que induz a anticorpo protetores ao vírus com especificidade por epítopo binário.

Também proporcionados aqui são métodos para gerar anticor- pos com especificidade por epítopo binário com atividade aumentada de neutralização de vírus. O aumento na atividade de neutralização é derivado da reatividade química dos anticorpos. Anticorpos convencionais se ligam a antígeno reversivelmente através de mecanismos não-covalentes. Assim como anticorpos convencionais, anticorpos quimicamente reativos inicial- mente reconhecem o antígeno através de meios não-covalentes. Contudo, sítios nucleofílicos localizados nos domínios V de anticorpos quimicamente reativos podem, então, prosseguir para reconhecer centros de reação eletro- fílicos no antígeno.

Isso tem duas conseqüências: a formação de complexos imunes irreversíveis com pareamento covalente de nucleófilo-eletrófilo e, se uma molécula de água está disponível no centro de reação, a hidrólise do antíge- no pelo anticorpo. A propriedade de ligação irreversível intensifica a potência do anticorpo, porque ela exclui a regeneração de antígeno ativo através de dissociação dos complexos imunes. Similarmente, a etapa de hidrólise cata- lítica resulta em inativação irreversível de antígeno, uma vez que os frag- mentos antigênicos usualmente não expressam atividade biológica similar ao antígeno precursor. A invenção divulga construtos polipeptídicos com epíto- po duplo nos quais grupos fortemente eletrofílicos são incorporados através de meios químicos. Os grupos eletrofílicos induzem ao fortalecimento adap- tativo de reatividade nucleofílica de anticorpo e, assim, aumentam a capaci- dade dos construtos polipeptídicos de induzir à síntese de anticorpos prote- tores com especificidade por epítopo binário.

Assim, os construtos polipeptídicos com epítopo duplo forneci- dos aqui podem ser empregados como uma vacina profilática ou imunotera- pêutica. No caso de HIV, por exemplo, um polipeptídeo ou análogo eletrofíli- co do mesmo contendo pelo menos os dois epítopos de gp120, pode ser administrado repetidamente a um organismo vivo para induzir à síntese de anticorpos protetores, incluindo anticorpos produzidos por células B de me- mória.

Particularmente, o análogo eletrofílico de um polipeptídeo com epítopo duplo, onde um ou ambos os epítopos podem ter a estrutura: Lx

L'

Y

Y'

η

γ

Nessa estrutura, Li...Lx...Lm são componentes que definem um

determinante antigênico, onde Lx é um aminoácido componente do determi- nante antigênico, L' é um grupo funcional de Lx1 Y" é uma molécula, uma ligação covalente ou um ligante, Y' é um grupo neutro ou carregado opcio- nal, Y é um grupo eletrofílico que reage covalentemente com um anticorpo que se liga ao referido determinante antigênico, η é um número inteiro de 1 a 1000 e m é um número inteiro de 4 to 30. Opcionalmente, qualquer um de Y", Y' ou Y ainda pode compreender um grupo de ligação à água como um componente terminal ou interno eficaz para se ligar a (uma) molécula(s) de água que quela metal, tal como zinco, cobre, níquel, cobalto ou magnésio. Os grupos de ligação a metal podem ser uma poli-histidina, -(His)n-, onde η = 2 ou mais. Alternativamente, os grupos de ligação a metal podem ser -Cys- X-Cys-Cys- ou -Cys-X-Cys-, onde X é um resíduo de aminoácido, ácido eti- Ieno diamina tetra-acético (EDTA) ou diaminometil piridina. Também, é pro- porcionado um análogo eletrofílico de um polissacarídeo ou um Iipopolissa- carídeo tendo a mesma estrutura geral, onde L1^Lxl--Lm são componentes que definem um determinante de ligação a receptor, Lx é um açúcar ou lipí- dio componente do determinante de ligação a receptor e m é um número inteiro de 1 a 1000. Além disso, é proporcionado um análogo eletrofílico de um oligonucleotídeo, onde L1...Lx...Lm são componentes nucleotídicos que definem um determinante de ligação a receptor, Lx é um nucleotídeo com- < ponente do determinante de ligação a receptor e m é um número inteiro de 1 a 1000.

A administração da vacina pode ser conduzida através de qual- quer via que é eficaz, por exemplo, as vias intramuscular, intravenosa, intra- peritoneal e mucosal. O HIV é, freqüentemente, transmitido através da via mucosal. Portanto, vacinação mucosal é uma modalidade preferida da in- venção, uma vez que essa via maximiza a produção de anticorpos de IgA protetores nas superfícies mucosais. Também, a dose ou dosagem de anti- corpos administrados é facilmente determinada por aqueles habilitados na técnica. Adicionalmente, é bem estabelecido administrar os anticorpos em uma composição imunogênica compreendendo adjuvantes e/ou diluentes conhecidos na técnica.

A presente invenção também demonstra a capacidade inespera- da de outro superantígeno, Proteína A, de estimular a síntese de anticorpos ao gp120 de HIV. Embora as seqüências dos sítios superantigênicos da Pro- teína A e gp120 sejam divergentes, há similaridade conformacional suficien- te para que síntese de anticorpo cruzadamente reativa seja permissível. Considera-se que a produção de anticorpo anti-gp120 é permissível a des- peito de se a síntese de anticorpos à Proteína A em si ocorre. Baseado nes- ·■ 20 sa descoberta inesperada, pode ser previsto que a administração de Proteí- na A pode ser útil para dirigir a resposta de célula B inicial ao sítio superanti- gênico gp120. Também, a administração de Proteína A pode ser combinada com gp120 ou os construtos polipeptídicos com epítopo duplo precedentes para superar as barreiras naturais que limitam a síntese de anticorpo ao sítio superantigênico gp120.

Além disso, a presente invenção proporciona métodos usando estimulantes de célula B policlonais ou ativadores apropriados sozinhos ou em conjunto com os construtos polipeptídicos com epítopo duplo para a in- dução dos anticorpos protetores ao HIV. Tais ativadores interagem com re- ceptores não-BCR para induzir à ativação de proliferação de múltiplas sub- populações de célula B, a despeito de sua especificidade antigênica. Exem- plos não Iimitativos são lipopolissacarídeo, enterotoxina termicamente lábil de Ε. coli, toxina B do cólera, várias interleucinas, citocinas, CpG e seme- lhantes. Uma vez que a síntese de anticorpos de neutralização ao sítio supe- rantigênico gp120 é uma propriedade de células B que não requer sua matu- ração adaptativa acionada pelo superantígeno, ativação de células B policlo- nais pode resultar em produção intensificada de anticorpo protetor. Quando o ativador de células B policlonais é administrado combinado com um imu- nogênio adequado, considera-se que o processo imune adaptativo pode me- lhorar a especificidade do anticorpo e a reatividade química do anticorpo.

A síntese de anticorpos com especificidade por epítopo binário foi observada em resposta à imunização de animais experimentais com um análogo eletrofílico de gp120 de comprimento total na presente invenção. Anticorpos monoclonais e fragmentos dos mesmos podem ser preparados prontamente a partir do baço ou outros tecidos Iinfoides de animais experi- mentais através de métodos de rotina bem conhecidos e disponíveis na téc- nica, por exemplo, a tecnologia de hibridoma e a tecnologia "phage display". Similarmente, anticorpos monoclonais e fragmentos dos mesmos podem ser preparados a partir de células B de seres humanos imunizados com os cons- trutos de polipeptídeo duplo ou gp120 eletrofílico fornecidos aqui. Assim, a presente invenção proporciona métodos para imunização passiva de seres humanos com infecção pelo HIV usando anticorpos monoclonais ou frag- mentos dos mesmos com especificidade por epítopo binário e atividade de neutralização de HIV.

A presente invenção ainda demonstra que gp120 de comprimen- to total expresso sobre a superfície do vírus induz à síntese de anticorpos protetores com especificidade por epítopo binário, embora apenas raramente e, de preferência, em indivíduos infectados pelo HIV com uma resistência imune natural ao HIV. Considera-se que seres humanos com infecção pelo HIV prolongada e nenhuma progressão para síndrome de imuno deficiência adquirida (AIDS) produzem anticorpos catalíticos aumentados ao sítio supe- rantigênico de gp120. Além disso, conforme apresentado aqui, anticorpos com especificidade por epítopo binário são isolados de tais indivíduos infec- tados usando métodos de hibridoma, imortalização de células B usando ví- ' rus de Epstein Barr e construção de bibliotecas de anticorpos ou seus frag-

mentos a partir do repertório de células B expresso. Esses métodos são roti- na na técnica. Nesses métodos, os construtos polipeptídicos reativos duplos são utilizados para identificar a sub-população de células B ou anticorpos 5 visualizados sobre um vetor adequado, por exemplo, um vetor de "phage display", que expressa a especificidade por epítopo binário. Considera-se que tais anticorpos são úteis para imunoterapia passiva em seres humanos com infecção pelo HIV.

O(s) exemplo(s) a seguir é(são) fornecido(s) para fins de ilustra- 10 ção de várias modalidades da invenção e não se destinam a limitar a pre- sente invenção de qualquer modo.

EXEMPLO 1

Especificidade por epítopo binário de MAbs nucleofílicos estimulados através de imunização com análogos eletrofílicos de qp120 de HIV 15 A proteína do envoltório de HIV gp120 é um alvo para vacinas

experimentais que tentam induzir à síntese de anticorpos de neutralização (Abs) (1, 2). A maioria dos Abs induzidos por imunização com gp120 são dirigidos às regiões altamente mutáveis da proteína, particularmente o tercei- ro domínio variável (domínio V3). Esses Abs neutralizam a cepa viral infec- 20 ciosa (4). Contudo, os domínios V de gp120 sofrem mutação durante o curso de infecção, resultando em mutantes de escape viral resistentes à neutrali- zação pelos Abs (5). Além disso, os domínios V de gp120 das várias cepas de HIV responsáveis pela pandemia em diferentes partes do mundo são al- tamente divergentes e os Abs induzidos através de imunização com gp120 25 usualmente falham em neutralizar cepas de HIV heterólogas (6). Isso levou à pesquisa por epítopos neutralizados estruturalmente conservados expressos pelo gp120. epítopos candidatos são as regiões comparativamente conser- vadas de gp120 envolvidas na ligação de HIV a receptores na célula hospe- deira, isto é, CD4 e receptores de quimiocina. Infelizmente, esses epítopos 30 são pobremente imunogênicos. Raros Abs monoclonais (MAbs) dirigidos à regiões próximas dos sítios de ligação de CD4 e receptor de quimiocina de gp120 foram identificados usando protocolos experimentais complexos (7-9). O A ο 1

Esses MAbs neutralizam muitas, mas nem todas as cepas de HIV-1 do ciado B (10).

Acredita-se que o sítio de ligação de CD4 (CD4bs) seja um de- terminante descontínuo composto dos resíduos 256, 257, 368-370, 421-427 e 457 (11-14). É sugerido que o CD4bs sofra (uma) transição(ões) confor- macional(is) quando o trímero de gp120 expresso sobre a superfície viral é liberado como monômeros solúveis e Abs aos CD4bs monoméricos são, com frequência, pobremente reativos com os CD4bs triméricos (15). Além disso, a região dos peptídeos 421-427 dos CD4bs é um componente impor- tante do sítio superantigênico de linfócito B do gp120 (16) (gp120SAq; defini- do como um sítio ao qual os Abs estão presentes no repertório pré-imune sem o requisito de diversificação de seqüência adaptativa dos domínios va- riáveis do Ab). Conforme no caso de outros superantígenos de células B, acredita-se que a ligação de gp120SAq à imunoglobulina (Ig) expressa como parte dos receptores de células B (BCRs) induza à apoptose de células B (17-19) e não há evidencia de amplificação adaptativa de ligação de gp120sAg a Abs em indivíduos infectados pelo HlV. Pelo contrário, indivíduos infectados pelo HIV expressam níveis diminuídos de Igs VH3+ no soro, a família que se acreditar se ligar preferencialmente ao gp120SAg- A despeito de evidentes dificuldades, argumentos poderosos que sustentam a objetiva- ção de CD4bs permanecem. Esses são: (a) A ligação de gp120sAg por Abs da classe IgG em seres humanos sem infecção está correlacionada à inci- dência reduzida de subsequente infecção pelo HIV (21); (b) Abs da classe IgA e IgM com afinidade moderada em seres humanos não infectados catali- sam a hidrólise de gp120, com especificidade da reação derivada de reco- nhecimento da região 421-433 (22, 23) e recentemente foi observado que Abs da classe IgA neutralizam o HIV (23) e (c) pacientes com Iupus eritema- toso sistêmico, uma doença autoimune que é coexistente com infecção pelo HIV apenas raramente (24) produzem Abs ao peptídeo sintético 421-433 em níveis aumentados (25) e um fragmento Fv com uma única cadeia que reco- nhece 421-433 (domínios variáveis das subunidades do Ab de cadeia pesa- da e leve unidas por um peptídeo ligante) isolado de uma biblioteca de Ab de <■ Iupus neutraliza diversas cepas de HIV primárias em cultura tecidual (26).

Junto com sua especificidade por epítopo determinada através de forças de ligação não-covalentes, Abs produzem nucleófilos localizados dentro de seus sítios de combinação em proximidade com grupos eletrofíli- 5 cos nos antígenos (27, 28). Enzimas utilizam interações de nucleófilo- eletrófilo similares para formar intermediários de reação covalente com subs- tratos que são subsequentemente hidrolisados através de ataque pela água sobre o complexo de acila-enzima (29). Supondo que processos imunes a- daptativos podem fortalecer a reatividade nucleofílica do Ab1 nós estudamos 10 MAbs da classe IgG estimulados através de imunização com gp120 conten- do diésteres de fosfonato eletrofílicos (E-gp120) (30). Dois tipos de reativi- dades químicos de MAb atribuíveis à indução da reatividade nucleofílica in- tensificada foram deduzidas, proteólise gp120-específica (30) e a formação de complexos imunes usualmente instáveis com gp120 mostrando um cará- 15 ter covalente (31). Aqui, nós descrevemos a especificidade por epítopo biná- rio dos MAbs nucleofílicos estimulados através de imunização com E-gp120. Diferente dos MAbs convencionais ao gp120, os MAbs anti-E-gp120 reco- nheceram dois epítopos de gp120 espacialmente distantes localizados no tronco do Ioop V3 e na região superantigênica sobreposta com CD4bs con- 20 servados. A despeito da natureza heteróloga do imunogênico E-gp120 do ciado B, os MAbs epítopo binário-reativos neutralizaram HIV primário per- tencendo aos ciados A e C. As propriedades dos MAbs sugerem novas for- mas para induzir a Abs de neutralização aos CD4bs de gp120.

Imunogênios E-gp120 25 Imunogênios E-gp120 foram obtidos colocando grupos difenil

diéster de fosfonato eletrofílicos em cadeias laterais Lys de gp120 recombi- nante (cepa MN) usando dois Iigantes alternativos (figura 2A). Próximo ao fosfonato está o substítuinte 4-amidinofenila, um grupo positivamente carre- gado que imita a capacidade de reconhecimento de resíduo de flanquea- 30 mento Lys/Arg dos sítios nucleofílicos de Ab que ocorrem naturalmente. Múl- tiplos fosfonatos estavam disponíveis por molécula de gp120 (30-46 fosfona- tos/gp120), permitindo a apresentação dos eletrófilos em conjunto com di- versos epítopos antigênicos. O fosfonato imita o grupo carbonila na ligação peptídica suscetível a ataque nucleofílico enzimático. Eletroforese de desna- turação de E-gp120 revelou a presença de dímeros e trímeros de E-gp120 covalentes junto com o monômero (figura 2B). A oligomerização não é uma 5 reação indiscriminada, uma vez que derivados eletrofílicos de outras proteí- nas, por exemplo, o receptor de fator de crescimento epidérmico, não oligo- merizam detectavelmente.

Preparo de MAb

Três imunizações distintas de camundongos foram conduzidas 10 usando dois imunogênios E-gp120 alternativos (30-46 fosfonatos/gp120; as proporções de monômero e oligômero em diferentes preparados eram, res- pectivamente, 20-50% e 50-80%) e hibridomas foram preparados. Seleção de MAbs em sobrenadantes de cultura foi através de um protocolo de ELISA covalente, no qual os Abs que se ligam não-covalentemente ao imunogênio 15 imobilizado foram removidos através de lavagem com SDS a 2% antes de detecção de complexos imunes. Trinta e nove de 705 poços de hibridoma que secretam IgG e 15 de 373 poços de hibridoma que secretam IgM mos- traram ligação SDS-resistente detectável ao E-gp120 imobilizado (A490 >

0,2; faixa de 0,2-2,9, valores de base com média < 0,1).

Neutralização de HIV

Os MAbs foram ensaiados com relação à neutralização de isola- dos de HIV-1 primários usando células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) hospedeiras (imunoensaio de enzima p24). Os isolados de HIV-1 estudados foram cepas R5 do ciado B (SF162, JR-CSF, W61D), cepas R5 25 do ciado C (BR004, ZA009) e uma cepa X4 do ciado D (UG046). Controles incluíam o MAb irrelevante equivalentemente purificado CRL1689 com o

mesmo isotipo que os MAbs anti-E-gp120 YZ18, YZ22 e YZ23 (lgG2a,_).

IgG foi purificada através de cromatografia em proteína G-Sepharose. Os MAbs anti-E-gp120 não eram citotóxicos para PBMCs, determinado através de ensaios de viabilidade na ausência de HIV. Dezessete MAbs de IgG com atividade de ligação ao E-gp120 foram testados com relação à neutralização da cepa ZA009 de HIV. Dez MAbs de IgG mostraram atividade de neutrali- zação de HIV reproduzível e dose-dependente (exemplos na figura 3). Em contraste, nenhum dos MAbs de IgM de ligação ao E-gp120 neutralizou o vírus. Dois clones de IgG foram ainda estudados (clones YZ18 e YZ23). Am- bas as IgGs neutralizaram todas as cepas de HIV estudadas, exceto a cepa 5 do ciado D (Tabela 1). Neutralização de cepas do ciado C é interessante porque os MAbs descritos anteriormente neutralizam cepas do ciado C po- bremente ou nem isso (10). Com uma cepa do ciado B, a potência de IgG YZ23 era comparável ou superior ao MAb de referência, clone b12. Ambas as tgGs também neutralizaram a cepa SHIV (SF162P3) e a atividade de 10 neutralização era comparável na ausência de fluido de lavagem cervico- vaginal de macacos rhesus (20% v/v; não-mostrado).

Tabela 1. Atividade de neutralização dos MAbs YZ18 e YZ23. PBMC hospe- deiras estimuladas com PHA. Neutralização computada como % de redução da concentração de P24 ou P27 (CEPA SHIV) em poços contendo Mab. Os dados são de curvas respostas de dose de MAb._

Cepa ciado IC80, g/mL MAb YZ23 MAb YZ18 MAb b12 B_SF162 4,8 2,7 14,1 BJ R-CS F 30 NT NT B_W61D 25 NT NT C_BR004 5,3 6,5 >20 C_ZA009 15 19 >20 DUG046 >200 NT NT SHIV (SF162P3) 5,0 <1,9 NT Reatividade de epítopo binário

A reatividade de epítopo das duas IgGs de neutralização (YZ18 e YZ23) e uma IgG de não-neutralização (SK-T03) foi testada usando peptí- deos de 15-mer, correspondendo aos resíduos 27-512 de gp120 como inibi- 20 dores competitivos. As lâminas de ELISA continham gp120 imobilizado (IgG YZ23, SK-T03) ou E-gp120 (IgG YZ18 de ligação; para evitar perda de gp120 através de clivagem catalítica; veja descrição de atividade proteolítica abaixo). Inibição dose-dependente da ligação de IgG YZ18 e YZ23 através de duas regiões peptídicas foi observadas, resíduos 297-315 e 417-435 (Fig 4). O clone de não-neutralização SKT03 mostrou uma reatividade de epítopo diferente. Apenas um peptídeo, resíduos 465-479, inibiu a ligação de IgG- gp120 competitivamente. Para ambas as IgGs de neutralização, os peptí- 5 deos 297-311 e 301-315 foram inibidores equipotentes, sugerindo a região de sobreposição 301-311 como um elemento de reconhecimento. Similar- mente, os peptídeos 417-431 e 421-435 inibiram a ligação com potência quase equivalente, sugerindo 421-431 como o segundo elemento de reco- nhecimento importante. A reatividade de epítopo binário foi confirmada atra- 10 vés de eletroforese e ensaios ELISA usando derivados eletrofílicos de peptí- deos biotinilados correspondendo aos resíduos 293-311 (E-293-311) e 421- 433 (E-421-433) (figura 5A). Esses análogos eletrofílicos são sondas sensí- veis para ligação de antígeno-Ab, determinado a partir da formação de com- plexos imunes covalentes em SDS-PAGE. A estrutura e reatividade de E- 15 421-433 são publicadas (28). E-293-311 foi obtido similarmente colocando os grupos fosfonato nas cadeias laterais de Lys308 e Lys310. ambos os E- peptídeos formaram complexos com as IgGs YZ18 e YZ23 em níveis acima da sonda de peptídeo eletrofílico irrelevante E-VIP (27) (exemplo com YZ18 mostrado na figura 5B). O curso de tempo de ligação de E-293-311 pela IgG 20 YZ23 estava em concordância com o modelo de ligação exponencial em um- Iocal (Ligação % = 100(1 - e"w); k, a constante de primeira grandeza), com o tempo de saturação de 50% de 43 min (figura 5C, painel esquerdo). Após a quase saturação do sítio de ligação E-293-311, a IgG YZ23 ainda era capaz de ligação à quantidade equimolar de E-421-433 (figura 5C, painel direito), 25 indicando que os sub-sítios independentes do MAb são responsáveis pelo reconhecimento de 293-311 e 421-433 e a simultânea ocupação dos dois sítios de ligação no MAb.

Base estrutural para reconhecimento de epítopo duplo

Os resíduos 301-311 e 421-433 estão localizados em uma dis- tância considerável nos modelos estruturais tridimensionais do monômero gp120 humano (figura 6A) e gp120 trimérico de símios (não-mostrado) de- duzido a partir de cristalografia de raios X. É improvável que as duas regiões < peptídicas, portanto, formem um único epítopo contínuo.

Os domínios V das IgGs YZ18 e YZ23 foram sequenciados u- sando cDNA amplificado por RT-PCR a partir das células de hibridoma. No- ve mutações de substituição eram evidentes nas regiões do gene Vh e Vl de 5 cada IgG e numerosas adições/deleções foram observadas nas junções V- D-J e V-J (comparado com os genes de linhagem germinativa). De modo interessante, as distribuições de mutações em Vh tendiam a favor das FRs e todas as mutações de FR estavam localizadas em posições previamente sugeridas (32) como sendo importantes na ligação de SAg a gp120 (figura 10 6B). Nós deixamos em aberto a possibilidade, portanto, de que mutações na FR podem aprimorar o reconhecimento de gp120.

Nós decompomos a estrutura de cristal do fragmento Fab do MAb YZ18 (figura 6C) em uma resolução de 2,4 Â (fator R de 0,33). As se- guintes são as conclusões: (a) várias díades contendo nucleófilos ativados 15 potenciais eram evidentes (uma hidroxila de Ser, Thr ou Tyr que pode se aproximar de uma base geral dentro da faixa de distância de uma ligação de hidrogênio; um corte de 3 Λ foi empregado aqui); (b) Uma díade continha um aminoácido de framework sugerido como contribuindo para a ligação de Ab ao sítio SAg de gp120 (díade Vh Ser84 0_-Ser84, estrutura principal de O, 20 distância internuclear de 2,47 Á); e (c) As características de superfície do sítio combinado são consistentes com o modelo de reconhecimento duplo, isto é, o poço formada pelas CDRs é flanqueada por outro poço mais raso composto, em parte, por determinados aminoácidos previamente sugeridos como contribuindo para a ligação ao sítio SAg de gp120 (33). Essas desco- 25 bertas sugerem um modelo de reconhecimento de gp120 no qual os resí- duos 301-311 são reconhecidos nas CDRs e os resíduos 421-433, princi- palmente nas FRs (figura 6D).

Conforme descrito acima, imunogênios E-gp120 contêm oligô- meros covalentes (figura 2B). Os oligômeros E-gp120 eram estáveis à ebuli- ção durante 10 min e cromatografia por filtração em gel (figura 7A). Nós re- portamos anteriormente que o gp120 contém um resíduo nucleofílico ativado covalentemente reativo com o hapteno eletrofílico (34). A provável reação que fundamenta a oligomerização covalente, portanto, é a ligação covalente entre uma porção fosfonato e um aminoácido nucleofílico que ocorre natu- ralmente de gp120. gp120 que não foi derivatizado com grupos fosfonato não forma oligômeros covalentes. A oligomerização de E-gp120 pode ser um fator responsável pelas características de epítopo únicas dos MAbs anti-E- gp120. Nós estudamos a expressão de determinados epítopos relevantes para neutralização conhecidos em E-gp120. Isso foi feito através de um mé- todo ELISA de competição usando MAbs dirigidos a um epítopo de sítio de ligação a CD4 (b12; ref. (7)), um epítopo carboidrato-dependente conforma- cional (2G12; ref. (35, 36)) e um epítopo V3 apex conservado (447-52D; ref. (37)). Ligação de HIV intacto pelos MAbs b12 e 2G12, mas o MAb anti-V3 447-52D, foi inibida por E-gp120 (figura 7B), sugerindo que o epítopo V3 a- pex (GPGR) não é visualizado pelo E-gp120. Isso foi confirmado através de um ELISA de ligação direto no qual gp120 ou E-gp120 foi imobilizado. E- gp120 não foi ligado pelo MAb 268-D IV (epítopo, HIGPGR) em uma concen- tração que proporciona ligação de gp120 prontamente detectável (figura 7C).

Trímeros de E-gp120 foram enriquecidos através de filtração em gel para outros estudos estruturais, por exemplo, através de cristalização, para revelar a orientação espacial relativa dos dois epítopos responsáveis pela especificidade por epítopo binário.

Reconhecimento de epítopo duplo como uma modalidade de vacina protetora

Nós analisamos a especificidade por epítopo binário de um pai- nel de MAbs anti-E-gp120 consistindo de 10 MAbs de neutralização de HIV e 7 MAbs desprovidos de atividade de neutralização. Conforme na figura 5B, os MAbs foram deixados reagir com E-293-311 e E-421-433 e os adutos de MAb-peptídeo detectados através de SDS-eletroforese, seguido por colora- ção com estreptavidina-peroxidase das blots. Sondas eletrofílicas contendo seqüências peptídicas irrelevantes (VIP e peptídeo 421-433 de gp120 mistu- rados) foram usadas como controles. Dos 17 MAbs anti-E-gp120 estudados, mostraram ligação detectável a ambos os peptídeos. Dos 10 MAbs de ligação dupla, 6 mostraram atividade de neutralização da cepa ZA009 de HIV (IC5o <30 μρ/ιπΙ; figura 8). Uma vez que MAbs convencionais neutrali- zam cepas de HIV heterólogas apenas raramente, é evidente que a especifi- cidade por epítopo binário intensifica a probabilidade de neutralização de HIV.

Usando um ELISA de competição, nós examinamos a possibili-

dade de que nossas IgGs de neutralização se ligam a epítopos similar a de- terminados MAbs de neutralização de referência (MAbs de ligação a CD4bs b12 e F105; MAbs de ligação a CD4 epítopo-induzível 17b e 48d, ligação estudada na presença de CD4 solúvel; um MAb de ligação a epítopo carboi- 10 drato-dependente, 2G12). IgG YZ18 e YZ23 não interferem com a ligação de gp120 pelos MAbs de referência, indicando que a especificidade por epítopo binário é uma propriedade única de nossos MAbs.

Conservação da seqüência dos resíduos 421-433 em HIV exce- de a 90% (Tabela 2; todas as cepas disponíveis no banco de dados Los A- 15 lamos; ciados A, B, C, D, F, G e a forma CR). Exceto para o ciado D, con- servação dos resíduos 301-311 excede a 86%. Isso sugere a base potencial para a resistência à neutralização da cepa do ciado D na Tabela 1 (essa ce- pa possui apenas 45% de identidade com a seqüência 301-311 de consen- so).

Tabela 2. Conservação percentual de resíduos 301-311 e 421-433. Número de cepas de HIV analisado, 550; seqüências tomadas do Banco de Dados Los Alamos. Para cada cepa, o número de identidades com os resíduos de consenso no epítopo 301-311 (CTRPNNNTRKS) e no epítopo 421-433 (K-Q- l-l/V-N-M-W-Q-E/R/G-V-G-K/Q/R-A) foi contado. As identidades % foram 25 calculadas como 100 x (número de identidades)/número total de resíduos no

peptídeo._

Cladoa _Identidade % (média ± SD)_

_301-311_421-433_

A (54) 88 ± 11 93 ±6

B (155) 90 ±11 95 ±6

C (111) 92 ±7 97 ±5

D (20) 62 ±14 96 ±11 F (10) 92 ±9 93 ±8

G (11) 91 ±7 90 ±4

CRF (189)_86 ±15_94 ±7_

a) Números entre parênteses são o número de cepas analisa- das.

Ligação irreversível e atividades proteolíticas

Todas as dezessete IgGs com atividade de ligação a E-gp120 5 SDS-resistente testadas também mostraram ligação SDS-resistente ao gp120 imobilizado desprovido de porções fosfonato (a figura 9A mostra um experimento exemplificatívo usando 8 IgGs). O tratamento com SDS causou remoção quase completa de IgGs anti-gp120 de controle (dirigidas ao domí- nio V3). Complexos de IgG e gp120 também eram evidentes através de 10 SDS-eletroforese (figura 9B). Fragmentos Fab também formaram complexos SDS-resistentes, excluindo um defeito relacionado à avidez. A dissociação em uma solução de não desnaturação foi estudada distinguindo entre os estados dissociáveis e pobremente díssociáveis usando os seguinte peptí- deos como inibidores competitivos: MAb YZ23, peptídeo 297-311; MAb SK- 15 T03, peptídeo 465-479. A inclusão de peptídeo competidor em excesso na mistura de reação no tempo zero inibiu a ligação de IgG ao gp120 quase completamente. A adição de peptídeo competidor em vários pontos de tem- po após início de incubação com gp120 resultou em níveis progressivamente diminuídos de dissociação dos complexos, refletindo a formação de comple- 20 xos pobremente dissociáveis como uma função do tempo. As constantes de segunda grandeza para a reação irreversível dos MAbs YZ23 e SK-T03 fo- ram, respectivamente, de 2,1 x 106 e 2,1 x 107 M'1 min'1. A taxa de dissocia- ção foi estudada através de mistura de gp120 biotinilado e IgG1 captura dos complexos imunes sobre glóbulos de proteína G, seguido por incubação dos 25 glóbulos durante períodos de tempo variados em diluente contendo peptídeo competidor em excesso (figura 9C). Dissociação rápida e quase completa de gp120 do MAb de controle (268-DIV) foi evidente (t_ 4,8 horas). A dissocia- ção de complexos formados pela IgG SK-T03 era muito lenta e >50% dos complexos imunes permaneceram intactos no ponto de tempo final exami- < nado (10 dias; nominal t_ 18,5 dias; em comparação, t_ para o complexo de

biotina-estreptavidina é de 1,4-3,3 dias).

Uma das conseqüências da nucleofilicidade intensificada induzi- da através de imunização com o E-gp120 é a capacidade de catalisar a cli- 5 vagem de gp120. Ensaio de eletroforese revelou que 3 IgGs anti-E-gp120 clivam gp120 (clones YZ18, YZ20 e YZ24) (a figura 10 mostra um experi- mento exemplificativo usando IgG YZ18).

A nucleofilicidade dos MAbs é remanescente daquela mostrada por proteases de serina convencionais, nas quais interações intramolecula- 10 res conferem reatividade nucleofílica para ativar o resíduo de serina no sítio ativo, permitindo ataque sobre centros de reação deficientes de elétrons no substrato polipeptídico, por exemplo, o grupo carbonila da ligação peptídica. Inibidores de proteases de serina inibem a atividade catalítica dos MAbs an- ti-E-gp120 (30). Mutagênese sítio-dirigida (38) e estudos de cristalografia 15 (39) de outros MAbs catalíticos revelaram sítios nucleofílicos análogos ao sítio catalítico Ser-His-Asp de proteases de serina. A especificidade dos MAbs nucleofílicos é assegurada através de reconhecimento não-covalente de epítopos peptídicos em coordenação com ataque nucleofílico sobre o an- tígeno (figura 11).

MATERIAIS E MÉTODOS

Preparo de E-gp120 e sondas eletrofílicas. Preparo de E-gp120 1a foi através de acilação de grupos amino acessíveis na superfície com o succinimidil éster de difenil suberoilamino (4-amidinofenil)metano fosfonato, conforme descrito anteriormente (30). E-gp120 1b foi preparado através de 25 acilação de gp120 com éster de N-(_-maleimidobutirilóxi)succinimida, segui- do pela adição nucleofílica da _-carboxamida de Cys-Glu-Tris (Tris, tris(hidróxi metil )aminometano) e difenil amino (4-amidinofenil) metano fos- fonato [m/z (ESI) 717,4 (MH+; MH+ calc. para C32H4IN6O9PS, 717,2)]. Com- posições de monômero/oligômero foram determinadas através de densito- 30 metria de géis de SDS-eletroforese corados com prata. Para enriquecimento de trímero, E-gp120 1a foi submetido à cromatografia por filtração em gel sobre uma coluna Superose 6 (GE Healthcare; HEPES a 10 mM-NaCI a 0,15 Μ, ρΗ de 6,5, contendo CHAPS a 0,1 mM). O efluente foi coletado em fra- ções de 0,3 mL e as frações correspondendo ao volume de retenção de 11,3-12,2 mL foram combinadas. O preparo de E-421-433 foi descrito anteri- ormente (28) e a sonda de controle contendo a seqüência de aminoácido 5 misturada de 421-433 (E-S421-433) foi preparada essencialmente da mes- ma maneira. E-293-311 foi preparado a partir de 293-311 biotinilado (bioti- namidohexanoil-LNESVQINCTRPNYNKRKR; C', S-acetamidometil-Cys; Genemed Synthesis) através de per-acilação com o succinimidil éster de difenil suberoilamino (4-amidinofenil) metano fosfonato (27), seguido por pu- 10 rificação por HPLC [m/z através de ESI-MS, 1298,6 (3+; calc., 1299,8), 974,8 (4+; calc., 975,1), 779,6 (5+; 780,3)]. O preparo de E-VIP e E-hapteno foi descrito anteriormente (27,40).

MAbs. MAbs foram preparados a partir de camundongos imuni- zados com E-gp120 1a ou 1b. O adjuvante foi emulsão de lipídio monofosfo- 15 ril lipídio A-dicorino micolato de trealose (adjuvante Ribi; Sigma). Os hibri- domas foram preparados através de fusão de esplenócitos com a linhagem de célula de mieloma (NS-1; Ref: (41)). Seleção de IgGs em sobrenadantes de cultura através de um protocolo ELISA covalente, no qual os Abs que se ligam não-covalentemente ao imunogênio imobilizado (40-100 ng/poço) fo- 20 ram removidos através de lavagem com SDS a 2% antes de detecção de complexos imunes (30), identificou MAbs nucleofílicos específicos ao gp120, incluindo os seguintes 17 MAbs de IgG: YZ18 (1a), YZ19 (1a), YZ20 (1a), YZ21 (1a), YZ22 (1a), YZ23 (1a), YZ24 (1a), SK-T01 (1a), SK-T02 (1a), SK- T03 (1a), SK-T04 (1a), 6B11 (1b), 2F2 (1b), 7H3 (1b), 1F4 (1b), 3A5 (1b), 25 5E11 (1b). IgG foi purificada a partir de sobrenadantes de cultura tecidual contendo MAbs através de cromatografia por afinidade sobre proteína G i- mobilizada (42). MAbs de controle (clone CRL 1689 de antígeno antivírus da febre amarela; ATCC) foram purificados da mesma maneira.

Estrutura do MAb. Cristais de Fab YZ23 foram crescidos em Fab em temperatura ambiente através de difusão a vapor em gotas penduradas. Dois μί da solução de estoque de Fab (4 mg/mL em Tris a 10 mM, pH de 7,5) foram misturados com 2 μί da solução de reservatório (polietileno glicol < 6000 a 16% peso/v, HEPES a 0,1 M, pH de 7,4). Cristais em formato de bas- tão pareciam pertencer ao grupo espacial P2.2.2, com parâmetros de célula unitária a = 52,29 Á, b = 62,92 Á, c = 135,17 A e um Fab por unidade assi- métrica. Os cristais foram crio-protegidos em glicerol a 25% e congelados em nitrogênio líquido. Dados de difração em uma resolução de 2,5 Â foram coletados a 100 K na Advanced Light Source, linha de feixe 4.2.2, Berkeley. A estrutura foi decomposta através de substituição molecular e refinada ao fator R cristalográfico de 0,223 usando 95% dos dados entre os limites de resolução de 20-2,5 Â. O fator R livre foi de 0,277 para os 5% restantes das reflexões aleatoriamente excluídas. O modelo final consistia de 430 resíduos de aminoácido e 70 moléculas de água. O fator B médio foi de 31,4 A2 para a proteína e 27,4 A2 para moléculas de água. Os desvios dos comprimentos de ligação padrões e ângulos de ligação foram de 0,0054 A e 1,22°, respec- tivamente. Plotagem de Ramachandran mostrou 89,3% dos resíduos de a- minoácido na maioria das regiões favorecidas.

Neutralização de HIV. Infecção de células mononucleares de sangue periférico por isolados primários de HIV foi medida (26) através de tratamento do vírus (TCID50 de 100; TCID50, dose infecciosa de cultura teci- dual de 50%) com um volume igual de concentrações crescentes de MAbs ^ 20 purificados em proteína G durante 1 h. Células estimuladas com fitohema- glutinina de doadores humanos saudáveis foram adicionadas e as culturas incubadas durante 3 dias; as células foram lavadas, incubadas em RPMI fresco durante 24 h, submetidas à Iise com Triton X-100 e p24 nos sobrena- dantes foi medido. Concentrações que proporcionam 50% e 80% de neutra- 25 lização (IC50 e ICs0) foram determinadas a partir de adaptações de mínimos quadrados à equação: neutralização % de HIV = 100%/[1 + 10((log IC50'concen'

tração de Ab) X declínio de Hillj

Identificação de epítopo. Em ensaios de competição de peptí- deo, os MAbs foram deixados se ligar à lâminas revestidas com E-gp120 30 (MAb YZ18) ou gp120 (outros MAbs) (40 ng/poço) na presença ou ausência de peptídeos de fragmento de gp120 de 15-mer (50 μς/ιηί; NIH AIDS Rese- arch and Reference Reagent Program) a 37 0C durante 2h em DB8 contendo Tween20 a 0,05% e BSA a 0,25% e os MAbs ligados medidos através de conjugado de HRP-IgG anticamundongo de cabra (diluição de 1:1000; Fc- específico) e OPD como um substrato (490 nm). Para comparar as especifi- cidades de epítopo, os MAbs de referência (IgGs b12, 447-52D, 2G12, 17b, 5 47d) foram deixados se ligar ao gp120 imobilizado usando Ab de ovelha diri- gido aos resíduos 497-511 de gp120 (CIiniqa) na presença ou ausência de MAbs anti-E-gp120 e os MAbs de referência ligados foram detectados com IgG-anti-humana de cabra HRP-conjugada (1:1000). O ensaio de SDS- eletroforese para identificação de MAbs específicos para epítopo binário foi 10 conduzido usando duas sondas peptídicas E-421-433 e E-293-311 e duas sondas de controle E-S421-433 e E-VIP. MAbs (75 μg/mL) incubados com E-peptídeos (10 μΜ) durante 3 h foram submetidos à SDS-eletroforese e adutos de MAb-peptídeo foram detectados através de coloração com estrep- tavidina-HRP das blots. As íntensidades de banda foram determinadas atra- 15 vés de densitometria e expressas em unidades de volume arbitrário (AVUs). Para analisar a expressão de vários epítopos pelo E-gp120, MAbs (b12, 45 μg/mL; 447-52D, 0,8 μg/mL; 2G12, 7,5 μg/mL) foram incubados com HIV (MN, 1,6 x 103 TCIDso/mL) na presença ou ausência de E-gp120 1a (32 gru- pos fosfonato/gp120) ou gp120 de controle, EGF ou E-EGF (0,5 μΜ) durante 20 20 h a 4 °C. Virions ligados ao MAb foram capturados em poços revestidas com proteína G (1 μg/poço; 1 h), submetidos a Iise com Triton X100 a 10% (15 min) e HIV p24 nos Iisatos (diluição a 1:3 em PBS) foi medido ao kit Beckman-Coulter HIV p24 Antigen EIA. A ligação de E-gp120 pelos MAbs de referência foi estudada através de ELISA, no qual as lâminas foram revesti- 25 das com E-gp120 1a, preparado enriquecido com trímero de gp120 1a ou de controle (40 ng/poço) e os MAbs ligados detectados pela IgG-HRP anti- humana (Fc-específico; 1:1000).

EXEMPLO 2

Construtos polipeptídicos com epítopo duplo A estrutura mínima de imunogênios de peptídeo duplo é expres-

sa como (Ag)-Li-(SAg), onde Ag, SAg e Li representam, respectivamente, um determinante antigênico convencional, um epítopo superantigênico e um < Iigante que conecta os dois componentes epitópicos. O comprimento e cons- tituição do Iigante deverão ser tais que os componentes SAg e Ag admitam conformações similares ou idênticas às regiões correspondentes do polipep- tídeo superantigênico nativo. Os imunogênios duplos podem conter elemen- 5 tos adicionais, tais como proteínas veículo para aumentar a imunogenicida- de, grupos eletrofílicos para promover a síntese de anticorpos nucleofílicos (Abs) e grupos acessórios para ajudar o SAg e Ag a assumir a configuração desejado.

Foi concebido um imunogênio de epítopo duplo contendo o epí- 10 topo SAg que interage com as regiões de framework de BCR (FRs) e outro epítopo antigênico convencional que interage com as regiões de determina- ção de complementaridade (CDRs) acionarão a diferenciação de células B em uma via favorável, resultando em síntese aperfeiçoada dos Abs proteto- res (figura 12). A hipótese é baseada em descobertas de que MAbs de neu- 15 tralização ao E-gp120 de comprimento total frequentemente mostram reco- nhecimento duplo de peptídeo composto de resíduos 421-433 e resíduos 301-311 de gp120. Exemplos de construtos com epítopo duplo compostos desses dois epítopos são mostrados na figura 13.

Os epítopos SAg e Ag não precisam estar limitados às regiões

- 20 421-433 e 301-311 descritas no Exemplo 1. Em princípio, qualquer epítopo SAg e qualquer epítopo convencional são adequados para a construção dos construtos com epítopo duplo, contanto que eles sejam suficientemente imu- nogênicos.

Além dos construtos peptídicos sintéticos descritos acima, prote- 25 ínas de comprimento total purificadas e as proteínas expressas sobre a su- perfície de membranas virais ou celulares podem ser usadas para induzir à síntese de Abs específicos com epítopo binário. A produção dos Abs dese- jados é possível se os dois epítopos, o Ag e SAg, são reconhecidos em co- mum pelas CDRs e FRs, respectivamente.

30 Construtos com epítopo duplo exemplificativos: Um exemplo de

tais construtos consiste dos oligômeros de gp120 covalentes descritos no Exemplo 1. Exemplos adicionais de construtos polipeptídicos com epítopo duplo são descritos como segue usando gp120 de HIV como o exemplo-alvo dos Abs específicos com epítopo binário.

(a) (301-311)-GMB-GGS-(E-421 -433): Esse construto com epí- topo duplo é composto dos resíduos 301-311 de gp120 como uma unidade 5 Ag, 421-433 como a unidade SAg e o Iigante GMB-GGS (_-maleimidobutiril]- Gly-Gly-Ser) (figura 13A). O componente SAg contém o grupo eletrofílico no C-término para estimulação da síntese de anticorpos nucleofílicos.

Γ-(301-311)-GMB-GGS-(E-415-436): Esse exemplo contém um epítopo T definido no N-término (T, 15 resíduos de peptídeo de toxoide do tétano QYIKANSKFIGITEL; ref. (1)) como um epítopo T "universal" (figura 13B). O componente SAg é E-415-436, que se presume assumir a confor- mação de neutralização relevante de 421-433. A partir de estudos de RMN e CD (2-4), os resíduos 416-419 foram identificados como uma região chave que inclui uma conformação helicoidal na região 421-433 com atividade de ligação aprimorada a CD4. Os términos peptídicos são usualmente mais fle- xíveis do que os componentes peptídicos internos e a inclusão dos 434-436 resíduos adicionais no C-término poderia ter um impacto maior sobre a rigi- dez da região 421-433 objetivada. O grupo eletrofílico está colocado sobre a cadeia lateral de Lys432. Esse grupo goza de liberdade especialmente em virtude da flexibilidade do ligante, permitir que o mesmo emparelhe com nu- cleófilos que podem estar potencialmente localizados em posições variáveis dentro do sítio de ligação antigênico BCR.

(b) Γ-(301-311)-GMB-GGS-(E-c421-433): Esse construto contém um análogo conformacionalmente restrito dos resíduos 421-433 de gp120 25 (figura 13C). A finalidade de restrição da região 421-433 é reduzir a flexibili- dade e se aproximar de uma conformação em β-folha potencial. Restrições de ciclização frequentemente obtêm sucesso no caso de regiões peptídicas de β-folha. A formação de β-folha nessa região de gp120 e um giro nos resí- duos 427-430 são evidentes na estrutura de cristal publicada do monômero 30 gp120 (5) e a distância entre os _-carbonos de Met425 e Gly431 é compará- vel à distância entre os _-carbonos do dipeptídeo cadeia Iateral-Iigado Orn- Asp (Orn, ornitina). Tal estrutura pode ser simulada substituindo os resíduos 1 Met425/Gly431 por Orn/Asp para ciclizar o peptídeo.

(c) KLH-(301-311)-GMB-GGS-(E-c421-433): Esse exemplo con- tém a proteína veículo Hemocianina do caramujo Megathura crenulata (KLH) (figura 13D). KLH contém múltiplos epítopos de células T e é um veículo

5 comumente usado para a produção de anticorpo na conjugação com peptí- deos pobremente imunogênicos.

(d) Oligômeros E-gp120 e E-HIV: E-gp120 covalentemente esta- bilizado expressando os epítopos 301-311 e 421-433 em uma forma sufici- entemente imunogênica é descrito no Exemplo I. E-HIV é um preparado aná-

10 logo consistindo de partículas virais inteiras nas quais as proteínas do envol- tório são modificadas para mostrar grupos fosfonato eletrofílicos (figura 13E). A principal vantagem do E-HIV é que ele contém o gp120 oligomérico nativo. A arquitetura do gp120 oligomérico é concebida para ser estabilizada atra- vés de ligação cruzada covalente entre o grupo eletrofílico e o nucleófilo 15 gp120 natural (6). Além disso, a associação gp120-gp41 pode também ser estabilizada através do mesmo mecanismo. Preparados de E-HIV podem ser prontamente inativados por psoraleno para eliminar a infectividade viral (7). O psoraleno se liga ao RNA viral covalentemente e inativa o HIV com desna- turação mínima de proteína. Embora cepas de HIV adaptadas em laboratório 20 possam ser crescidas em alta titulação em linhagens de célula contínuas, foi mostrado que picos de glicoproteína são mais estáveis e em maior densida- de sobre isolados primários. Um vírus primário do ciado C (cepa 97ZA012) pode ser crescido em altas titulações em uma linhagem de célula T humana contínua (PM-1) altamente permissiva a isolados primários de HIV. Produ- 25 zindo o vírus em bioreatores de perfusão de fluxo contínuo Cellmax (fibra oca), titulações infecciosas de até 6,25 log/ml e rendimentos de gp120 de aproximadamente 900 ng/ml são rotineiramente obtidas. Os vírus coletados podem ser ainda purificados empelotando através de sacarose sem perda significativa de env.

30 Grupo eletrofílico: Os grupos eletrofílicos podem estar localiza-

dos em um dos dois epítopos dos construtos com epítopo duplo ou em epí- topos (epítopos Ag e SAg). Os exemplos na figura 13 contêm o grupo difenil éster de fosfonato como um componente eletrofílico no C-término ou na ca- deia lateral de Lys do componente SAg. Outros grupos eletrofílicos adequa- dos para a indução de Abs específicos como epítopo binário com reatividade nucleofílica intensificada incluem mono- e diésteres de ácidos fosfônicos e 5 vários álcoois de arila e alquila, _-ceto ácidos e haloalquil cetonas. O grupo eletrofílico pode também conter uma funcionalidade adicional que captura uma molécula de água em proximidade com o centro eletrofílico.

Ligante: As estruturas peptídicas sintéticas exemplificativas mos- tradas aqui contêm o ligante GMB-GGS (GMB, _-maleimidobutirila; GGS, Gly-Gly-Ser). Outros Iigantes podem ser concebidos para otimizar a estrutu- ra dos construtos com epítopo duplo, de modo que as combinações de SAg e Ag estejam presentes na relação espacial correta um com o outro. Seleção da estrutura ligante pode ser feita através de modelamento molecular ou a- través de meios empíricos para identificar o melhor ligante. O comprimento do ligante GMB-GGS completamente estendido é de 21,3 A. Na estrutura de cristal de gp120 monomérico publicada (5), O N-término 301-311 está locali- zado 14,8 A do N-término 421-433. Deleção de cada resíduo de aminoácido diminuirá o comprimento do ligante em 3,7 A. Assim, Iigantes com um com- primento de 17,6, 13,9 e 10,2 A podem ser preparados através de deleção de 1, 2 e 3 resíduos, respectivamente, produzindo construtos com epítopo duplo com distâncias inter-término variáveis. Similarmente, a adição de um resíduo de aminoácido aumentará o comprimento do ligante em 3,7 A e construtos com distâncias inter-epítopo de 25,0, 28,7 e 32,4 A podem ser preparados através da adição de 1, 2 e 3 resíduos, respectivamente. Uma abordagem de design similar foi usada anteriormente para desenvolver Ii- gantes para união dos domínios Vl/Vh nos construtos Fv com uma única ca- deia (8).

Os construtos com epítopo duplo contendo vários Iigantes tam- bém podem ser ancorados através de modelamento molecular nos dois sí- tios de ligação de um Ab específico com epítopo binário (por exemplo, o MAb de neutralização YZ23 descrito no Exemplo 1; a estrutura desse MAb foi determinada através de cristalografia). Isso eliminará conflitos estéricos * óbvios. O processo de busca consiste em deslocamentos de corpo rígido e rotações permitidas em torno de ligações simples de acordo com o banco de dados de rotâmero. Opções de escore de consenso são usadas para identi- ficar conformação de ancoragem que têm a maior classificação em mais de uma das funções de escore. Módulos de software usados para chegar às estruturas finais são LigScore2, PLP, Jain, PMF e LUDI (Accelrys). O softwa- re de ancoragem flexível também está disponível em nosso laboratório (Li- gandFít). Os construtos com epítopo duplo desprovidos de conflitos estéricos são selecionados com relação à reatividade com o Ab de neutralização de referência (por exemplo, MAb YZ23). Esse procedimento ajuda a assegurar que os epítopos estão em sua "conformação neutralização-relevante". A rea- tividade dupla pode ser determinada, por exemplo, através dos seguintes ensaios: [aI ligação total (não-covalente + covalente) através de ELISA; e (_b} ligação irreversível através de eletroforese em gel de SDS (veja Exemplo 1 para métodos).

Síntese química: A síntese dos construtos com epítopo duplo é direta. Primeiro, o peptídeo ligante GMB e a região E-421-433 são prepara- dos como uma única unidade. Essa unidade é ligada à cadeia lateral -SH do resíduo 301 no peptídeo 301-311, proporcionando o imunogênio desejado, o 20 qual pode ser purificado através de HPLC até homogeneidade cromatográfi- ca e caracterizado através de espectrometria de massa por eletro- pulverização (e RMN se necessário). O análogo Orn425-Asp431 ciclizado pode ser sintetizado através de ciclização régio-seletiva e introdução de fos- fonato como segue: (a) Montagem de peptídeo sobre a resina de Wang u- 25 sando grupos de proteção resistentes a TFA, exceto Orn425 (4-metiltritila, Mtt) e Asp431 (2-fenil-isopropila, 2-PhiPr); (b) remoção dos grupos de prote- ção Orn e Asp usando ácido trifluoroacético a 1% (TFA); (c) ciclização na- resina usando o reagente de acoplamento HATU, clivagem de peptídeo com TFA e condensação com o precursor aminofosfonato; e (d) desproteção com 30 ácido trifluorometano-sulfônico a 1M. As reações de ciclização podem ser conduzidas em vários resíduos vizinhos alternativos para testar os constru- tos resultantes com relação à reatividade com nossos Abs de neutralização disponíveis para selecionar o melhor composto para imunização.

O preparo de E-HIV é como segue. O vírus é inativado com ami- nometil trimetilpsoraleno (10 μg/ml) junto com ácido ascórbico (0,5 mM) para resfriar reações oxidativas secundárias. O preparado é exposto a 3 Joules (3 min) de Iuz ultravioleta (UVA) [comprimento de trajeto = 3 mm] em dois ciclos de tratamento. Nenhum vírus infeccioso pôde ser detectado após esse tra- tamento em preparados concentrados em ensaios de PBMC (redução na infectividade > 6 logs). O preparado pode ser ainda purificado através de filtração em gel (coluna Superose-6), permitindo a recuperação do vírus no volume de vazio (isso ajuda a remover as proteínas da célula hospedeira). Derivatização com os grupos diéster de fosfonato é feita através de incuba- ção dos vírus inativados com o éster ativo de difenil N-suberoil-amino (4- amidinometil) metanofosfonato. Outra filtração em gel é feita para remover fosfonatos livres, junto com qualquer gp120 liberado (teor de gp120 livre no imunogênio será minimizado tão logo seja possível). O teor de gp120 no preparado padrão é medido através de um imunoensaio enzimático. Espera- se que derivatização com os grupos fosfonato estabilize o envoltório, uma vez que os fosfonatos tornarão as proteínas mais reativas com eletrófilos naturais encontrados em suas proteínas de ligação (análogos à reação de fosfonato com Abs).

Imunizações de murino: Os construtos de vacina candidatos são validados conduzindo imunização usando, por exemplo, camundongos BALB/c hospedeiros (10/grupo, 4-6 semanas de idade). Um adjuvante apro- priado é selecionado. O adjuvante é crítico na determinação da classe de 25 Abs produzidos pelas células B1 da magnitude da resposta do Ab, padrões de migração de célula B e mesmo a especificidade dos Abs induzidos. O adjuvante influencia as respostas T-independentes e T-dependentes via in- dução de citocina e interações diretas com receptores de reconhecimento de padrão celular, incluindo receptores toll-semelhantes (TLRs). Por exemplo, 30 para obter indução preferencial dos Abs desejados através de imunização mucosal, imunizações nasais são conduzidas com vários adjuvantes: (a) Ii- popolissacarídeo (LPS; estimula respostas T-dependentes e independentes, *■ estimulante de TLR4); (b) CpG (favorece a resposta de TH1, sinaliza através de TLR9); e (c) toxina de edema do Anthrax (resposta de TH2, induz à res- postas de Ab vaginal, super-regula moléculas co-estimulatórias). A via ótima da imunização é também determinada empiricamente, por exemplo, nasal, 5 vaginal, oral, intramuscular, intraperitoneal e intravenosa. Em uma modali- dade preferida da invenção, foi mostrado que a via nasal estimula eficaz- mente uma resposta de Ab às vacinas candidatas (veja Exemplo III). A dose do imunogênio é variada (10-200 μg de equivalentes peptídicos/kg) para de- terminar a dose ótima. Imunizações repetidas são conduzidas para estimular 10 respostas de células B de memória, por exemplo, 3-4 imunizações em inter- valos de 2-4 semanas.

Cinco dias após cada imunização, sangue e fluido de lavagem cervico-vaginal (CVLF) são coletados, os Abs presentes no soro (IgM, IgG e IgA) e CVLF (slgA, IgG) são purificados até homogeneidade eletroforética 15 através de cromatografia por afinidade usando Abs anti-lgM imobilizados, Proteína G e Abs anti-lgA, conforme nesses estudos anteriores (6, 9, 10) e estudados como segue.

(a) Catálise e ligação. Os seguintes substratos são testados: (a) vírions intactos; e (b) gp120 monomérico recombinante (cepa MN). Vírions

- 20 intactos (cepa ZA009, ciado C, isolado primário, R5 dependente) e MN (cia- do B, adaptado em laboratório, X4 dependente) são obtidos através de cres- cimento em PBMC humana, quantificados através de ensaios de infectivida- de e purificados através de filtração em gel. Após incubações dos Abs (1- 100 nM) com os preparados de vírion (~103 TCID50), hidrólise de gp120 viral 25 é medida através de um método similar aos ensaios de hidrólise de gp120 monomérico publicados, isto é, SDS-eletroforese de redução e imunoblotting com Abs anti-gp120 (6). A hidrólise de gp120 é evidente como depleção da banda de gp120 intacta e aparecimento de fragmentos de baixa massa. Se necessário, gp120 viral é rotulado com 35S-Met para detecção intensificada 30 (através de infecção de PBMCs com HIV em meio contendo 35S-Met). Hidró- lise de polipeptídeos não relacionados é determinada através de eletroforese para confirmar a falta de atividade catalítica promíscua [ref. (11); por exem- pio, albumina biotinilada, ovalbumina, calmodulina, FatorVIII]. Dados da taxa de hidrólise são obtidos em concentrações variadas do melhor conjunto de Abs hiperimunes. A Km evidente e Vmax são computadas conforme na ref. (11).

5 A ligação Abs-vírus também pode resultar em neutralização viral.

Ligação de Ab ao gp120 monomérico é determinada através de ELISA (6,

12). Para ligação de vírus intacto, vírions (~103 TCID50; cepas ZA009 e MN) são incubadas com concentrações variadas de Ab para determinar as con- centrações que proporcionam uma reação detectável. Abs pré-imunes, MAb SKT03 (o qual se liga irreversivelmente a um epítopo de não neutralização) e um MAb de ligação reversível (por exemplo, clone 257DIV) são incluídos como controles. Complexos de MAb-vírion são capturados usando proteína G imobilizados e vírions não ligados são lavados. p24 é solubilizado usando Triton X-100 e medido através de ELISA de p24. Para medir a estabilidade, os Abs são reagidos com os vírions durante um período de tempo adequado e gp120 recombinante em excesso (1 μΜ) é adicionado para induzir à disso- ciação de complexos não-covalentemente associados. As misturas de rea- ção são submetidas à filtração em gel (13, 14). O detergente Empigen é u- sado para romper vírions sem dissociação dos complexos imunes (15). Um Ab à região C-terminal de gp120 é empregado para capturar os complexos de gp120-Ab e a reação é desenvolvida usando um Ab anti-cadeia L de ca- mundongo peroxidase-conjugado. Para medir t_, a mistura de reação é in- cubada durante períodos prolongados, complexos imunes não dissociados residuais são medidos e t_ obtido através de adaptação dos dados à equa- ção de primeira grandeza.

(b) Neutralização. Inicialmente, soro não purificado e CVLF de camundongos pré-imunes e hiperimunes são usados para determinar a neu- tralização da cepa ZA009 do ciado C (Independente; isolado primário) em culturas de PBMC. Ensaios repetidos são feitos usando Abs purificados de 30 soro e CVLF (slgA, IgM, IgA e IgG). Ensaios de neutralização são feitos con- forme descrito (16, 17). Estoques de vírus (100 TCIDso/poço) e Abs (ng/ml- μg/ml) são incubados durante um curto período, quando do que o vírus é * deixado infectar PBMCs PHA-estimuladas. A infecção viral é quantificada medindo-se o p24 através de EIA. A titulação de endpoint para neutralização é definida como a titulação interpolada na qual há 50% ou 80% de inibição de expressão de p24 com relação aos controles incubados sem Ab. Contro- 5 Ies incluem Abs equivalentemente purificados de camundongos não imunes. A citotoxicidade não específica é analisada usando PBMCs tratadas com Abs sem vírus através de microscopia e coloração vital das células. A ampli- tude de neutralização é estudada usando um painel de cepas que incluem as cepas R5, X4 e R5X4. Os resíduos 421-433 são comparativamente con- 10 servados, mas algumas cepas mostram divergências. Cepas com diferenças de seqüência em posições 421-433 definidas são também incluídas: por e- xemplo, as cepas 98BR004, 98IN022 e 97ZA012. Quatro a 6 cepas retiradas dos ciados A1 B, C, D, E (recombinação env EA) são estudadas para estabe- lecer a neutralização de diversas cepas de HIV.

15 Validação de primata não-humano: Diferente de outros animais

experimentais, macacos são suscetíveis à infecção por cepas de SIV ex- pressando as proteínas de HIV, por exemplo, SHIVSfi62P3 contém as se- qüências env, tat, rev e vpu da cepa de HIV primária CCR5-trópica (R5) SF162 (ciado B) clonada no genoma de SIVmaC239· Candidatos à vacina po-

- 20 dem ser prontamente testadas em macacos rhesus usando tais cepas mode-

lo. Descrições detalhadas dos métodos estão disponíveis (por exemplo, refs. (18-22). Resumidamente, grupos de macacos rhesus são imunizados repeti- damente através da via apropriada com a vacina candidata em combinação com o adjuvante apropriado em vários intervalos de tempo. Após indução de 25 Abs de neutralização de HIV no soro e CVLF ter sido confirmada, os maca- cos são estimulados vaginalmente com uma dose infecciosa de SHIVsfi62P3- Infecção pelo SHIV é monitorada durante 5-9 meses no sangue e CVLF a- través de métodos de RT-PCR de rotina. Na necropsia, a presença de reser- vatórios de HIV em vários tecidos é monitorada. As cargas virais médias e 30 contagens de células CD4 em animais imunizados e de controle são compu- tadas e a significância estatística das diferenças é estimada usando testes apropriados. Os macacos são também examinados com relação a sinais de doença clínica, incluindo monitoramento de postura, mobilidade, consumo de alimento, comportamento, peso corporal e problemas vaginais ou sistêmicos. Amostras de sangue são analisadas através de CBC, hematócrito, química do soro, testes de creatinina, fosfatase alcalina e transferase aspártica no 5 soro. Quando de eutanásia, uma necropsia completa será feita, incluindo histopatologia de tecidos linfoides.

EXEMPLO 3

Anticorpos proteolíticos que ocorrem naturalmente ao sítio superantiaênico qp120 e sua capacidade de indução Uma vacina eficaz ao HIV deve induzir a respostas de anticorpo

policlonal (Ab) robustas a um ou mais epítopos conservados que neutralizam a infecção viral. Embora alguns anticorpos monoclonais (MAbs) a epítopos comparativamente conservados do HIV sejam conhecidos, não existem rela- tos de imunogênios que induzem a Abs com atividade de neutralização de 15 HIV suficientemente robusta atribuível ao reconhecimento de um epítopo conservado de HIV e detectável em Abs policlonais encontrados em sítios de infecção pelo HIV. Foi testada a capacidade de um análogo eletrofílico de resíduos 421-433 de gp120 (E-421-433) de induzir à respostas de Abs poli- clonais catalíticas e de neutralização em camundongos. Conforme notado 20 anteriormente, os resíduos 421-433 expressam um caráter superantigênico, uma propriedade que pode limitar a resposta de células B adaptativa a essa região de gp120. Além disso, peptídeos sintéticos podem assumir várias conformações que podem divergir da conformação nativa do peptídeo na proteína de comprimento total, com o resultado de que os Abs induzidos não 25 podem reconhecer a proteína de comprimento total. Inesperadamente, foi observada uma resposta favorável a esse imunogênio em Abs da classe IgM e Abs da classe IgA (slgA) secretórios que podem ser concebidos como a base de uma vacina eficaz contra o HIV.

Abs de hidrólise de gp120 em seres humanos sem infecção pelo HIV: Esses estudos sobre Abs proteolíticos em seres humanos sem infecção pelo HIV forneceram uma informação inesperada que é valiosa para criação de uma vacina contra o HIV. O repertório de Ab é gerado a partir de genes 1 de domínio constante (_, e V (genes V, D, J) (figura 14). Atividade

proteolítica de Ab promíscuo é um traço hereditário, sugerido por estudos sobre um domínio V de linhagem germinativa (1). Consequentemente, sob pressões de varredura favoráveis, a emergência de Abs proteolíticos antíge- 5 no-específicos é possível. Abs da classe IgM que clivam gp120 são encon- trados no repertório pré-imune de seres humanos e camundongos que não foram expostos ao HIV (2). Os Abs puderam expressar atividade proteolítica intensificada ou diminuída durante o curso de maturação de células B perti- nente à diversificação de CDR ou seqüência FR ou recombinação com troca 10 de classe de IgM para células B que produzem IgG ou IgA.

Recentemente, foi observado (3) que cada preparado de IgA purificado da saliva e soro de 4 seres humanos sem infecção pelo HIV cliva- va gp120 biotinilado (Bt-gp120), avaliado através de depleção da banda de gp120 precursora e aparecimento de fragmentos de menor massa em géis 15 de eletroforese (figura 15A). Os perfis de produto Bt-gp120 observados u- sando IgA secretória (slgA) de saliva e IgA do soro como catalisadores eram essencialmente idênticos (produtos com massa nominal de 80, 55, 39, 32, 25 e 17 kD). O número de sítios de combinação por molécula de Ab pode variar (2 sítios/lgA e IgG monomérico; 4 sítios/dímero de IgA salivar). Contu- 20 do, o número de sítios de combinação por massa unitária e agregados é comparável (um sítio de combinação por -75-100 kD) e normalização dos dados de atividade à concentração constante (mg/ml) permite uma compa- ração válida de suas atividades. A atividade proteolítica média de slgA dos 4 indivíduos foi 15,4 vezes maior do que a IgA no soro [médias ± s.d. respecti- 25 vãmente, 128,6 ± 23,3 e 7,2 ± 3,3 nM de gp120/hora/(mg de IgA/ml); figura 15B], As concentrações de slgA e IgA no soro que proporcionam atividade catalítica detectável são cerca de 2 ordens de magnitude menor do que as concentrações fisiológicas de IgA no soro (1,5-2,6 mg/ml)(4) e saliva (110- 300 μg/ml) (5, 6). Frações de IgG no soro eram desprovidas de atividade 30 detectável (figura 15C). Resultados essencialmente idênticos foram obtidos usando IgA no soro e IgG purificada dos soros empoçados de 34 seres hu- manos soro-negativos para o HIV (gp120 a 941 nM clivado/h/mg de IgA; cli- vagem indetectável de gp120 em concentração equivalente de IgG.

EIetroforese-SDS de redução de IgA no soro obtida através de cromatografia por afinidade revelou as subunidades de cadeia pesada (60 kD) e cadeia leve (25 kD). A IgA salivar continha essas bandas junto com a 5 banda adicional corada com Ab de componente anti-secretório (85 kD). Para testar proteases de contaminação convencionais, preparados de IgA salivar e do soro purificados através de cromatografia por afinidade usando a colu- na anti-lgA foram submetidos à filtração em gel-FPLC adicional em um sol- vente de desnaturação (cloridrato de guanidina a 6 M). IgAs podem formar

multímeros não-covalentes e S-S ligados (7). Conforme reportado anterior- mente, picos correspondendo à IgA polimérica, dimérica e monomérica eram evidentes (massa nominal, respectivamente, 915 kD, 433 kD e 153 kD) (8). Cada uma dessas frações de IgA mostrou, através de eletroforese em gel- SDS de redução, perfis idênticos àqueles da IgG purificada por afinidade 15 inicial carregada sobre a coluna. IgA monomérica era a espécie de IgA pre- dominante no soro recuperada da coluna (82%; R, 55,2 min). Noventa por cento da IgA salivar eluiu como dímeros (R, 42,7 min) e agregados de maior grandeza (R, 33,7 min). Após reduplicação através de remoção do cloridrato de guanidina, a espécie de IgA monomérica no soro recuperada da coluna 20 mostrou atividade de clivagem de gp120 idêntica, quanto à magnitude, ao preparado de IgA purificado por afinidade carregado sobre a coluna (respec- tivamente, 630 ± 167 e 823 nM ± 130 de gp120/h/mg de IgA), preenchendo o critério de purificação até atividade específica constante. Os agregados de IgA salivar diméricos e de maior grandeza reduplicados que eluíram da colu- 25 na também mostraram atividade de clivagem de gp120, confirmando que a forma predominante de IgA secretória é cataliticamente ativa.

Um diéster de fosfonato eletrofílico (E-hapteno 1, figura 16A) conhecido por se ligar a sítios nucleofílicos covalentemente (9) inibiu a ativi- dade catalítica de IgA salivar e no soro (figura 16B). Inibidores classe- seletivos de metaloproteases (EDTA, 2 mM) e 1,10 fenantrolina (1 mM), pro- teases de cisteína (iodoacetamida, 100 μΜ) e proteases ácidas (pepstatina

A, 1 μΜ) não inibem detectavelmente a hidrólise de gp120 pela IgA salivar e 11 de soro empoçada. As preparações de IgA salivar e de soro formaram adu- tos com o E-hapteno 1 estáveis ao aquecimento (1OO0C1 5 min) e desnatura- ção com SDS1 correspondendo à banda de aduto de cadeia pesada de -60 kD dominante e à banda de aduto de cadeia leve de -25 kD mais fraco mos- trados na figura 16C.

Tratamento de Bt-BSA1 domínio C2 de Bt-FVIII1 Bt-Tat ou Bt- sEGFR com IgA salivar ou IgA de soro humano não resultou em depleção perceptível das bandas de eletroforese correspondendo à forma de compri- mento total dessas proteínas (figura 17). Sob essas Gondições, clivagem 10 prontamente detectável de Bt-gp120 foi observada, indicando que a reação catalítica é seletiva para gp120.

Peptídeos sintéticos contendo resíduos 421-433 de gp120 são reportados como inibindo a ligação de Ab não-covalente ao gp120sAg com- petitivamente (10, 11). Aumento das concentrações de E-421-433 (10-100 μΜ), o análogo eletrofílico de resíduos 421-433 de gp120 contendo os gru- pos diéster de fosfonato e biotina, inibiu progressivamente a clivagem de Bt- gp120 pela IgA salivar (em 21-85%) e a IgA no soro (em 41-91%). O efeito inibitório de E-421-433 foi mais forte do que a sonda de controle irrelevante E-VIP (figura 18A). Similarmente, E-421-433 mostrou ligação irreversível su- ' 20 perior às IgAs comparado com E-VIP de controle, estimado através de esti- mativa eletroforética dos adutos (figura 18B). Inclusão do peptídeo 421-435 de gp120 desprovido do grupo fosfonato nas misturas de reação inibiu a formação dos adutos de lgA:E-421-433 (figura 18C). Essas observações sugerem um mecanismo nucleofílico de catálise de IgA1 no qual o reconhe- cimento não-covalente da região peptídica 421-433 contribui para a seletivi- dade observada pelo gp120.

Para identificar os sítios de clivagem, gp120 foi digerido pela IgA salivar policlonal e os fragmentos de gp120 obtidos através de SDS- eletroforese foram submetidos a sequenciamento de aminoácido N-terminal. 30 Bandas de produto a 55, 39 e 17 kD e uma banda desbotada a 32 kD eram evidentes (figura 19). O fragmento de 55 kD proporcionou uma seqüência correspondendo ao N-término de gp120. Os fragmentos restantes proporcio- naram seqüências N-terminais correspondendo aos resíduos 84-88, 322-326 e 433-437 de gp120, indicando clivagem nas seguintes ligações peptídicas: Val83-Glu-84 (localizada no domínio C1 de gp120), Tyr321-Thr322 (domínio V3) e Lys432-Ala433 (domínio C4).

5 Foi estudado, o efeito dos Abs sobre a infecção de PBMCs hu-

manas pela cepa 97ZA009 de HIV-1 (ciado C, co-receptor de quimiocina R5 dependente). A seqüência dos resíduos 421-433 de gp120 nessa cepa viral e o gp120 recombinante empregado em estudos de catálise são idênticos, exceto quanto a uma substituição Arg/Lys conservativa (KQ11NMWQEV- 10 GR/KA). IgA de soro e IgA salivar empoçadas de doadores não infectados mostraram atividade de neutralização reproduzível e dose-dependente, res- pectivamente, em cada um de 5 e 8 ensaios conduzidos com esses prepa- rados de anticorpo (concentração média meio máxima eficaz (EC5o) ± s.e.m, IgA no soro 62,0 ± 38,3 μς/ιηΙ; IgA salivar 48,5 ± 14,5 μg/ml). A figura 20A 15 reporta a atividade de neutralização de IgA no soro e IgA salivar estudadas em paralelo (preparado viral idêntico, preparado de PBMCs hospedeiras i- dêntico). Diferente das IgAs, a IgG no soro preparada no laboratório e prepa- rados de IgG comerciais (IVIGs; Gammagard S/D, Inveegam EN e Intratect) não mostram atividade de neutralização detectável. Conforme esperado, a 20 atividade de neutralização foi mantida através de tratamento da IgA com a sonda irrelevante E-V1P, mas inclusão de E-421-433 na mistura de IgA-vírus resultou em inibição da atividade de neutralização (figura 20B). Neutraliza- ção viral pela IgA salivar foi reproduzivelmente observada após incubação comparativamente curta (1 h) com HIV, enquanto que neutralização pela IgA 25 no soro era evidente apenas quando de incubações prolongadas de IgA- vírus (24 h; figura 20C). Um segundo isolado de HIV primário, 92BR020 (ciado B, R5-dependente) também foi neutralizado pelo preparado de IgA salivar empregado na figura 20C (EC50, 5,0 ± 2,1 ng/ml).

A partir desses estudos, é evidente que Abs da classe IgA (e os Abs da classe IgM anteriormente publicados, ref. (2)), mas não Abs da clas- se IgG podem hidrolisar gp120 e neutralizar o HIV através de reconhecimen- to do sítio superantigênico gp120. As seguintes considerações são relevan- * tes para interpretação dessas observações. Primeiro, acredita-se que o en- caixe BCR-antígeno acione a divisão de células B. Clivagem de gp120 BCR- catalisada resultará em liberação de fragmentos antigênicos, privando as células do sinal proliferativo. Portanto, a atividade catalítica pode melhorar 5 adaptativamente apenas até o ponto em que liberação de produto ocorre mais lentamente do que a sinalização transmembrana responsável pela es- timulação de divisão celular. Nesse caso, a atividade catalítica superior de IgMs/lgAs pode ser em virtude de uma sinalização transmembrana mais rá- pida por μl_-BCRs comparado com _-BCRs. Segundo, a catalise de BCR 10 pode ser um sinal proliferativo em si. Clivagem de ligação peptídica libera uma grande quantidade de energia (~ _70 kcal/mol) comparado com as e- nergias muito menores disponíveis a partir de encaixe de BCR-antígeno não- covalente. É concebível que um pouco de energia seja empregada para in- duzir a uma transição de conformação de BCR produtiva necessária para 15 transdução de sinal ou aumento da taxa de difusão de BCR na bicamada lipídica, assim, aumentando a probabilidade de ligação cruzada de BCR. Terceiro, a clivagem de gp120 BCR-catalisada pode aliviar o efeito apoptóti- co de célula B que resulta de interação do sítio superantigênico gp120 nas FRs do BCR (abortando a transdução de sinal apoptótico em virtude de Iibe- 20 ração dos fragmentos antigênicos). Clivagem catalítica prontamente detectá- vel de gp120 por um Ab VH2+ que não se liga ao gp120 apreciavelmente estava evidente em nossas mãos (2) e síntese aumentada de determinadas famílias não-VH3 foi descrita após infecção pelo HIV (12). A partir desse ra- ciocínio, pode se supor que a síntese de Abs proteolíticos específicos para o 25 sítio superantigênico gp120 pode ser menos restrita do que aquela de Abs que se ligam apenas ao sítio.

Abs induzidos através de imunização com E-421-433: Anterior- mente, foi reportado um conjugado de hemocianina do caramujo Megathura crenulata (KLH) do peptídeo 421-436 desprovido dos Abs eletrofílicos indu- 30 zidos que reconhecem o gp120 de comprimento total (13). Aqui, grupos de camundongos foram imunizados com o E-421-433 conjugado à KLH no ad- juvante LTm ou subunidade B/IL12 de toxina do cólera através da via nasal. LTm é um mutante R192G de enterotoxina de E. coli termicamente lábil co- nhecida por estimular respostas de Ab mucosais vigorosas (14); fornecida pelo Dr. Clements). A mutação torna a proteína não tóxica através de knoc- king out da capacidade de interagir com a transdução de sinal Gs-mediada.

5 1725 moles de E-421-433 estavam presentes por mol de KLH no imunogê- nio. Os seguintes ensaios foram conduzidos usando soro, saliva ou fluido vaginal coletado dos camundongos imunizados: (a) ligação de E-421-433 através de ELISA; (b) hidrólise de gp120 através de eletroforese; e (c) neu- tralização da cepa ZA009 de HIV (hospedeiro PBMC). De modo importante, 10 esses ensaios podem refletir a atividade de diferentes sub-populações de Ab. O ensaio de ligação detecta Iigantes de análogo peptídico a despeito da atividade de neutralização e pode não detectar catálise ou Iigantes específi- cos ao gp120 viral (trimérico). O ensaio de catálise que detecta catalisadores que hidrolisam o gp120 monomérico a despeito da atividade de neutraliza- 15 ção não detecta Iigantes e pode não detectar catalisadores específicos ao gp120 viral. O ensaio de neutralização detecta apenas Iigantes e catalisado- res que reconhecem o gp120 viral e interferem com a infecção viral.

As imunizações nasais resultaram em hidrólise aumentada de gp120 por Abs da classe IgM purificados do soro. Além disso, catálise forte- 20 mente aumentada pela slgA salivar e vaginal era evidente (comparado com Abs pré-imunes correspondentes; figuras 21 e 22A). Contudo, o efeito favo- rável de imunização não era um generalizado e hidrólise de gp120 pela IgA e IgG no soro foi reduzida comparado com pré-imune. Imunização sistêmica em Ribi resultou em atividade catalíticas reduzidas dos Abs purificados de 25 sangue (incluindo IgM) e um aumento modesto na atividade hidrolítica de slgA vaginal (figura 23A). Respostas de Ab que se ligam ao E-421-433 foram observadas em todos os tipos de imunizações no soro, saliva e CVLF (figu- ras 22B e 23B).

A atividade catalítica aumentada das IgMs após imunização na- sal foi acompanhada por neutralização de HIV fortemente aumentada (figura 22C). As atividades de neutralização de IgA e IgG no soro estavam essenci- almente inalteradas (figura 22D). < A partir desses resultados, parece que a imunização nasal com

E-421-433 conjugado à KLH induz à respostas de IgM e slgA catalíticas fa- voráveis. Pequenos peptídeos flexíveis assumem conformações que são altamente dependentes de seu microambiente (incluindo contatos com prote- 5 ínas veículo e epítopos de células T incorporados em imunogênios peptídi- cos). A partir dos dados de neutralização obtidos usando IgMs dos camun- dongos imunizados, pode ser concluído que pelo menos algumas das molé- culas peptídicas no conjugado de KLH devem assumir a conformação 421- 433 neutralização-relevante que imita a conformação nativa dessa região em 10 gp120 viral.

Referente ao efeito favorável da via de imunização, imunização nasal resulta em transporte de antígeno pelas células M para células dendrí- ticas, seguido por apresentação de antígeno à células T e diferenciação de células B T-dependente no tecido linfocítico nasal associado (NALT). As cé- 15 lulas B drenam através da via linfática, eventualmente migrando para os vá- rios órgãos Iinfoides e sítios efetuadores, incluindo o trato reprodutivo. Célu- las B expressando receptores de IgM podem sofrer recombinação com troca de classe (CSR) para células expressando IgA dentro da mucosa sob a in- fluência de citocinas derivadas de epitélio. A partir dos resultados com slgA, 20 parece que CSR que ocorre em tecidos mucosais sustente a retenção e a- perfeiçoamento da atividade de hidrólise de gp120. A partir dos dados de IgA e IgG no soro, parece que CSR que ocorre em tecidos Iinfoides sistêmicos durante a reação no centro germinal clássica não resulta em aperfeiçoamen- to da atividade catalítica. Os dados também levantam a probabilidade de que 25 diferentes sub-populações de células B podem ser responsáveis pela sínte- se dos Abs de neutralização desejados. Por exemplo, células B-1 e células B-2 são conhecidas por produzirem Abs com diferentes capacidades de re- conhecimento de antígeno, presumivelmente em virtude da influência de seu milieu local no qual Iigantes responsáveis pela ativação das células são en- 30 contrados em concentrações variadas (por exemplo, citocinas). Uma vacina contra o HIV ideal deverá, de preferência, estimular a síntese de Abs secre- tórios e sistêmicos com atividade de hidrólise de gp120 e neutralização de HIV. A despeito das limitações óbvias do esquema de imunização descrito no presente exemplo, permanece que esses estudos proporcionam a primei- ra evidência concreta que sustenta a possibilidade de desenvolvimento de uma vacina baseada em peptídeo mucosal que induz a Abs protetores a um 5 epítopo de gp120 conservado. Foi concebido que as limitações de E-421- 433 serão superadas pelos construtos com epítopo duplo descritos no E- xemplo II. Os construtos com epítopo duplo são criados para estimular uma reação em centro germinal clássica que permite ampliar a resposta imune a todas as classes de Abs1 isto é, as classes IgM, IgG e IgA. Os seguintes são 10 exemplos adicionais de imunogênios que são concebidos como auxiliando na indução de aprimoramentos na qualidade da resposta de Ab.

Construtos peptídicos superantigênicos multiméricos: Acredita- se que ligação cruzada ao BCR sejam essencial para a indução de respos- tas robustas de Ab. Antígenos multiméricos podem obter eficazmente Iiga- 15 ção cruzada ao BCR na membrana de células B e induzir à respostas de Ab intensificadas. Isso é igualmente verdadeiro para antígenos e superantíge- nos convencionais (15). Um exemplo de um imunogênio peptídico de gp120 concebido para intensificar a síntese de Abs protetores é (T-E-416-433)3. T nessa estrutura significa um epítopo de célula T universal, tal como o peptí- 20 deo de epítopo T descrito no Exemplo II. A unidade E-416-433 em (T-E-416- 433)3 é sintetizada de uma maneira similar ao E-421-433 conforme descrito nessa publicação anterior (16), isto é, condensação de T-416-431 protegido e difenil amino (4-amidinofenil) metano fosfonato (mímico de Lys432- Ala433), seguido por desproteção com ácido trifluoroacético. O T-E-416-433 25 monomérico é conjugado a um núcleo de peptídeo antigênico múltiplo co- mercialmente disponível usando um ligante de bicarboxilato para proporcio- nar o T-E-416-433 trimérico. Inclusão dos resíduos 416-419 no peptídeo aumenta a propensão à duplicação em uma conformação helicoidal (17-19). A formulação peptídica pode ainda ser incorporada em uma emulsão com- 30 posta de fosfolipídios neutros e negativamente carregados em uma propor- ção molar de 1:3 (por exemplo, fosfatidil glicerol/fosfatidil colina) para induzir à formação de _-hélice. Para aumentar a capacidade de formação de hélice < do peptídeo, seqüências de nucleação de hélice metal-dependentes podem ser incluídas no N-término, por exemplo, DKDGDGYISAAE (tomada do Ioop de ligação a cálcio da calmodulina). Quando de coordenação com íons de lantanídeo, a região AAE forma uma conformação alfa-helicoidal muito está- 5 vel (completamente helicoidal a partir de 4-65°C) e proporciona um sítio de nucleação de hélice para segmentos peptídicos presos a seu C-término (20).

Imunizações, adjuvantes e validação de atividade de Ab: Valida- ção dos construtos de vacina contra HIV candidatos é feita essencialmente conforme no Exemplo II. Isso requer a administração das quantidades apro- 10 priadas dos construtos imunogênicos (10-200 μg de equivalentes peptídi- cos/kg) a animais experimentais (camundongos, macacos rhesus) através de diversas vias (nasal, vaginal, oral, intramuscular, intraperitoneal, intrave- nosa) em intervalos apropriados (por exemplo, 2-4 semanas). Imunizações repetidas são conduzidas para estimular respostas de células B de memória. 15 Adjuvantes apropriados são co-administrados com o imunogênio para induzir à maturação eficiente de células B e troca de classe de Ab conforme no E- xemplo II. Testes para imunogenicidade incluem medição de ligação de antí- geno (o imunogênio, gp120, E-gp120, partículas de HIV intactas) através dos Abs purificados (IgM, IgG, IgA, slgA) do soro, saliva e fluido de lavagem va-

- 20 ginal, testes de hidrólise catalítica de gp120 pelos Abs e testes de neutrali- zação de diversas cepas de HIV em cultura tecidual usando hospedeiros PBMC. Testes in vivo de eficácia de Ab são conduzidos através de imuniza- ção de macacos rhesus com a vacina candidata, estímulo com uma cepa de SHIV apropriada e medição da infecção por SHIV em células sanguíneas e 25 tecidos linfoides, conforme no Exemplo II.

EXEMPLO 4

Estimulação de síntese de anticorpo por ativadores de células B policlonais A ligação de antígeno ao receptor de antígeno (BCR, imunoglo- bulina na superfície em complexo com moléculas de transdução de sinal) é 30 uma via principal à varredura clonal de células B, resultando eventualmente na síntese de Abs específicos para o antígeno. Outros Iigantes interagem com receptores de células B, tais como os TLRs e estimulam a ativação po- Iiclonal de sub-populações de células B expressando esses receptores em altos níveis. A capacidade de sintetizar Abs proteolíticos de neutralização dirigidos ao sítio superantigênico gp120 é uma propriedade de células B pré- imunes (Exemplo III). Apenas uma sub-população de Abs pré-imunes ex- 5 pressa as atividades de hidrólise de gp120 e neutralização de HIV deseja- das, indicando que as sub-populações individuais de células B pré-imunes sintetizam os Abs desejados em níveis variáveis. Uma modalidade da pre- sente invenção consiste em estimulação da síntese dos Abs desejados atra- vés de estimulação policlonal das células B, a despeito se isso é realizado 10 através de um ligante que é estruturalmente relacionado ao gp120.

Considera-se que dois tipos de Iigantes realizam a síntese au- mentada de Abs de neutralização de HIV no presente exemplo: (a) outros Iigantes superantigênicos que não gp120 que atuam através do BCR; e (b) Iigantes da classe adjuvante que atuam através de outros receptores que 15 não o BCR, por exemplo, os TLRs e receptores de citocina e estimulam as células B na ausência de Iigantes de BCR-estimulação.

Estimulantes de superantígeno (SAgs). Os SAgs de células B conhecidos (por exemplo, Proteína A Estafilocócica, Proteína L Pepto- estreptocócica) não expressam similaridade de seqüência apreciável ao gp120. Contudo, assim como o sítio SAg de gp120, o sítio SAg de Proteína A é reconhecido, de preferência, por imunoglobulinas (Igs) da família VH3+ e reconhecimento dos sítios SAg de ambas as proteínas é dominado por con- tatos nas regiões de framework (FRs). Aqui, foi descrita a observação ines- perada de que a administração de Proteína A estimulou a formação de Abs que reconhecem o gp120. Isso é importante porque proporciona uma nova maneira de superar as barreiras ao aprimoramento adaptativo de Abs prote- tores dirigidos ao sítio SAg gp120. Por exemplo, considera-se que a adminis- tração de Proteína A a seres humanos intensifica a síntese de Abs proteto- res ao gp120 encontrado no repertório pré-imune e, desse modo, aumenta o nível de resistência imunológica à infecção pelo HIV.

(a) Ligação de gp120 por anticorpos de IgM estimulados através de administração de Proteína A. A administração intraperitoneal de Proteína < A sem adjuvante nos dias 0, 3, 6, 9, 20 e 30 resultou em ligação aumentada de gp120 pela fração de IgM (figura 24A). IgM pré-imune mostrou sinais de ligação ao gp120 fracos, mas significativos (figura 24A, dia 0). A administra- ção de Proteína A misturada com RIBI resultou em uma resposta de IgM de ligação ao gp120 similar à Proteína A administrada em solução salina tam- ponada com fosfato (PBS). A ligação de gp120 pelas frações de IgG perma- neceu indetectável após administração de Proteína A (figura 24B). A respos- ta de IgM à Proteína A foi dose-dependente, com maiores ligações de IgM ao gp120 observadas usando 1 mg/injeção e pouca ou nenhuma resposta a 20 μg de Proteína A/injeção (administrada de acordo com o esquema indica- do pelas setas na figura 24B). A resposta de ligação de IgM ao gp120 foi também observada quando a Proteína A foi administrada através da via in- travenosa. lodinação de Proteína A elimina sua atividade de ligação a Fc (1). Imunização com Proteína A iodinada (Proteína Ai; preparada nesses estudos anteriores, ref. 5) também resultou em ligação de IgMs ao gp120 aumenta- da, indicando que a atividade de ligação a Fc da proteína não era um fator na resposta imune observada. A ligação de Proteína Ai pela fração de IgM tendia a diminuir abaixo dos níveis de IgM pré-imune nos pontos de tempo iniciais (3 dias) e foi restaurada para os níveis pré-imunes em torno do dia 6. A ligação de gp120 imobilizado pelas IgMs Proteína A-induzidas

foi inibida de modo virtualmente completo pelo gp120 solúvel (figura 25A), indicando uma reação saturável. A ligação foi observada na presença de proteínas irrelevantes em excesso (leite desnatado a 1%), indicando que o reconhecimento de gp120 pelas IgMs é um fenômeno específico. Reconhe- 25 cimento dos peptídeos 421-433 do SAg gp120 foi estudado através de um ensaio de eletroforese usando o análogo de fosfonato eletrofílico do peptí- deo (E-421-433; síntese e reatividade de Ab dessa sonda são descritas na ref. (2, 3) e Exemplos precedentes). O ensaio conta com o reconhecimento não-covalente do antígeno, seguido por ligação covalente do eletrófilo nos 30 sítios nucleofílicos do Ab. Conforme reportado anteriormente (3), tais sítios nucleofílicos estão presentes em todos os Abs, a despeito de sua atividade catalítica. Conforme mostrado na figura 25B, E-421-433 formou complexos com as IgMs induzidos através de administração de Proteína A em níveis acima das sondas de controle eletrofílicas contendo a seqüência 421-433 embaralhada (Es-421-433; figura 25C) ou nenhuma seqüência peptídica (E- hapteno; para a estrutura de E-hapteno veja ref. (3)). Pode ser concluído, a 5 partir dessas observações, que a Proteína A estimula a síntese de Abs diri- gidos ao sítio SAg gp120.

(b) Base estrutural compartilhada para propriedades superanti- gênicas de células B de Proteína A estafilocócica e gp120 de HIV. Estudos de cristalografia indicam que o sítio SAg da Proteína A está localizado nas 10 hélices Il e Ill do domínio Deo sítio SAg se liga aos Abs estabelecendo con- tatos nos seguintes resíduos de framework de domínios VH: Gly-Hl5, Ser- H17, Arg-Hl9, Lys-H57, Tyr-H59, Lys-H64, Gly-H65, Arg-H66, Thr-H68, Ser- H70, Gln-H81, Asn-H82a e Ser-H82b (PDB, IDEE; (4)). Estudos por nosso grupo (5, 6) e esses investigadores (7, 8) indicaram que a região 421-433 de 15 gp120 é um componente essencial do sítio SAg de células B expresso por essa proteína. Seis resíduos de framework de Vh importantes em ligação de SAg da Proteína (em negrito acima) foram deduzidos como sendo críticos para ligação de Ab ao sítio SAg gp120 (mostrado em vermelho na Fig 26A; (9)). Os resíduos de Proteína A cognatos que interagem com os seis resí- 20 duos de Vh são agrupados na hélice Il (Gln-32, Ser-33, Asp-37). Dicroísmo circular e estudos de RMN revelaram que a região 421-433 de gp120 pode adotar duas estruturas secundárias diferentes, β-folha e α-hélice e foi suge- rido que a forma de α-hélice é dominante no estado ligado ao receptor de CD4 (10-12). A forma α-helicoidal de 421-433 de gp120 é passível de supe- 25 rimpossível sobre a hélice Il do sítio SAg de Proteína A (desvio de raiz qua- drada médio para C-α carbonos de 0,88A; figura 26B). No modelo superim- posto, as cadeias laterais de Gln-8 e Glu-9 em 421-433 de gp120 estão loca- lizadas em proximidade aos resíduos da hélice Il de Proteína A responsáveis pelo estabelecimento de contatos com Abs (Gln32 e Ser33) e a carbonila 30 Ala13 de 421-433 de gp120 está localizada próximo da Asp37 _-carboxila da hélice Il de Proteína A. Essas considerações sugerem que os determinantes de SAg de Proteína A e gp120 contêm elementos estruturais em comum. < (c) Estimulantes de E-Proteina A: Assim como a Proteína A,

considera-se que o derivado eletrofílico de Proteína A induz a Abs que reco- nhecem gp120. Assim como os derivados eletrofílicos de gp120, considera- se que derivados eletrofílicos de Proteína A induzem à síntese de Abs com 5 reatividade nucleofílica intensificada, desse modo, conferindo aos Abs a ca- pacidade de se ligar ao gp120 com caráter covalente e catalisar a hidrólise de gp120. A presença de epítopos repetidos capazes de interações multiva- Ientes com BCRs pode facilitar a estimulação produtiva de células B. E- Proteína A e Proteína A de controle desprovida do grupo eletrofílico E (figura 10 27) são utilizadas como os estimulantes. O preparo de E-Proteina A é feito, por exemplo, através dos métodos usados para E-gp120 e E-421-433 (3,

13), isto é, acilação dos grupos amino da cadeia lateral de Lys com o grupo precursor contendo fosfonato. Incorporação de fosfonato (mol de fosfona- to/mol de proteína) é determinada medindo os grupos amino residuais com 15 fluorescamina. Um material inicial adequado é Proteína A recombinante (ex- pressa em E. coli). Fragmentos menores de Proteína A contendo seu sítio SAg e multímeros manipulados desses fragmentos podem ser também usa- dos. E-Proteina A é estudada como estimulantes imunes em grupos de 5 camundongos BALB/c cada. Adjuvantes que influenciam a qualidade e mag-

- 20 nitude de respostas de Ab e induzem à troca de classe de IgM para IgA e IgG são testados (14). Nenhum adjuvante é necessário para indução de li- gação de gp120 às IgMs após administração de Proteína A. Por exemplo, os adjuvantes/co-estimuladores LPS, CD40L, IL4, C3dg e IL12 podem ser úteis para intensificar a resposta imune a antígenos T-independentes e ajudar a 25 induzir à troca de classe. A administração de E-Proteina A é conduzida, por exemplo, nos dias 0, 2, 5, 10 e 20 (por exemplo, usando uma dose de 50 e 100 Mg).

Proteína A e E-Proteina podem ser concebidas como estimulan- tes imunes que ajudam a superar a barreira inicial à montagem de respostas de Abs protetores ao sítio SAg de gp120. A administração de E-Proteina A ou Proteína A aos animais experimentais pode ser combinada com os imu- nogênios descritos nos Exemplos I, Il e Ill para amplificar a síntese dos Abs anti-gp120 e melhorar sua especificidade pelo HIV. Por exemplo, os constru- tos polipeptídicos com epítopo duplo do Exemplo Il podem ser co- administrados com a E-Proteina A ou administrados após a administração inicial de E-Proteina A para aumentar a magnitude e especificidade de res- posta do Ab. Validação dos estimulantes imunes candidatos é feita essenci- almente conforme nos Exemplo Il estudando a ligação de gp120 e HIV pelos Abs presentes em vários fluidos biológicos, testes de hidrólise catalítica de gp120 pelos Abs e testes de neutralização de diversas cepas de HIV em cul- tura tecidual usando PBMC hospedeiras. Testes in vivo de eficácia de esti- mulante imune podem ser conduzidos usando macacos rhesus estimulados com uma cepa de SHIV conforme no Exemplo II.

Ligantes de classe adjuvante. Considera-se que a ativação poli- clonal direta de células B independente de BCR estimula a capacidade pré- existente das células de sintetizar Abs protetoras ao sítio SAg de gp120. E- xemplos clássicos desse tipo de ativação de células B policlonais são forne- cidos por substâncias comumente classificadas como adjuvantes. Por e- xemplo, estimulação de esplenócitos com CpG resulta em um aumento de 5 vezes de células que produzem IgM (15). Essas substâncias podem ser for- mulações homogêneas ou misturas complexas de produtos microbianos. Determinadas toxinas bacterianas, tais como enterotoxina de E. coli termi- camente lábil e toxina do cólera e seus análogos menos tóxicos, são ativa- dores de células B policlonais. Estudos recentes demonstraram que recepto- res Toll-semelhantes (TLRs) são o elo crítico entre a imunidade inata e a- daptativa. Ligantes de TLR sintéticos bem definidos foram identificados co- mo adjuvantes para vacina. Exemplos incluem imidazoquinolinas (agonistas de TLR7), oligodeóxinucleotídeos de CpG (agonistas de TLR9) e análogos de lipídio A (agonistas de TLR4). Esses compostos ativam diretamente célu- las B e células dendríticas plasmacitoides, desse modo, promovendo a proli- feração de células Bea maturação/ativação de células que apresentam an- tígeno profissionais.

Além de estimulantes de célula B policlonais não derivatizados, análogos eletrofílicos dessas substâncias (E-estimulantes) são concebidos * como sendo úteis na presente invenção para amplificar a síntese de Abs protetores anti-HIV. Os E-estimulantes são concebidos para se ligar a seus receptores expressos sobre células B irreversivelmente. Isso segue a partir das observações de que várias proteínas de receptor não enzimático podem 5 expressar sítios nucleofílicos (6). A ligação irreversível exclui a dissociação do ligante do receptor. Isso é concebido como conferindo uma potência bio- lógica superior aos E-estimulantes comparado com suas contra-partes de ligação reversível. Os E-estimulantes podem ser administrados a um orga- nismo vivo sozinhos ou em combinação com os imunogênios descritos nos 10 Exemplos I, Il e Ill para obter uma resposta protetora superior ao HIV. Se- guem exemplos dos E-estimulantes.

(a) E-LTm: LTm é um mutante de R192G de enterotoxina de E. coli termicamente lábil conhecido por estimular respostas de Ab mucosais vigorosas (17). A mutação torna a proteína não tóxica através de knocking

out da capacidade de interagir com a transdução de sinal GS_-mediada. A introdução dos grupos eletrofílicos pode ser feita através do mesmo método conforme o preparo de E-gp120 (13), isto é, acilação de LTm com o N- hidróxi-succinimda éster de difenil suberoilamino (4-amidinofenil) metano fosfonato. O E-LTm resultante pode, então, ser purificado através de um mé- 20 todo cromatográfico apropriado.

(b) E-PWM: Mitógeno de ombu (PWM) é uma Iectina com ativi- dades mitogênicas, extraída de raízes de ombu, Phytolacca americana. PWM induz à produção de imunoglobulina policlonal em linfócitos humanos. A introdução dos grupos eletrofílicos em PWM pode ser feita através do

mesmo método conforme com E-gp120.

(c) E-LPS: LPS é um análogo de lipídio A que estimula respostas T-dependentes e independentes. É mostrado na figura 28A um E-LPS e- xemplificativo derivado de Re LPS de E. coli. A introdução dos grupos eletro- fílicos em LPS pode ser feita através da condensação de LPS e difenil amino

30 (4-amidinofenil) metano fosfonato.

(d) E-CpG: É mostrado na figura 28B um E-CpG exemplificativo derivado de CpG QDN2006, um agonista de TLR9. A introdução dos grupos eletrofílicos em CpG pode ser feita através de adição covalente fotoativada de aminometil psoraleno, seguido por acilação com o éster de N-hidróxi- succinimida de di(4-nitrofeni!) suberoilamino (4-amidinofenil) metano fosfona- to.

5 Os estimulantes precedentes podem ser administrados a um

organismo vivo sozinhos ou junto com os imunogênios descritos nos Exem- plos I, Il e Ill para amplificar a síntese dos Abs anti-gp120 e aprimorar sua especificidade pelo HIV. Por exemplo, os construtos polipeptídicos com epí- topo duplo do Exemplo Il podem ser co-administrados com o E-LTm ou ad- 10 ministrados após a administração inicial de E-LTm para aumentar a magni- tude e especificidade de resposta do Ab.

Validação dos estimulantes candidatos é feita essencialmente conforme no Exemplo Il estudando a ligação de gp120 e HIV pelos Abs pre- sentes em vários fluidos biológicos, testes de hidrólise catalítica de gp120 15 pelos Abs e testes de neutralização de diversas cepas de HIV em cultura tecidual usando hospedeiros PBMC. Testes in vivo de eficácia de estimulan- te podem ser conduzidos usando macacos rhesus estimulados com uma cepa de SHIV conforme no Exemplo II.

EXEMPLO 5

Isolamento de anticorpos específicos com epítopo binário homogêneos ao qp120

Abs com atividade de neutralização de HIV clado-cruzado e po- tente podem ser administrados a pacientes infectados pelo HIV como rea- gentes imunoterapêuticos passivos. Além disso, aplicação tópica dos Abs na 25 vagina ou reto antes de intercurso sexual pode ser feita para bloquear a transmissão de HIV. Os Abs específicos com epítopo binário descritos no Exemplo I mostram a capacidade de neutralizar diversas cepas de HIV e são reagentes protótipos com uso clínico potencial. O presente Exemplo descre- ve a varredura e triagem de grandes números de Abs usando os análogos 30 polipeptídicos com epítopo duplo do Exemplo Il como o meio para identificar Abs de neutralização de HIV de alta potência.

Fontes de Abs. Em uma modalidade da invenção, a fonte de Ab * é animais experimentais ou seres humanos imunizados com os imunogênios polipeptídicos descritos nos Exemplos I e II. Esses imunogênios contêm o epítopo superantigênico (SAg) reconhecido principalmente nas regiões de framework (FRs) do Ab junto com pelo menos um epítopo que pode ser re- 5 conhecido pelas regiões de determinação de complementaridade (CDRs). Nos Exemplos I e II, os procedimentos de imunização são concebidos para estimular a síntese vigorosa de Abs com especificidade por epítopo binário. Usando métodos que são conhecidos na técnica e descritos resumidamente abaixo, preparados homogêneos de Abs com especificidade por epítopo bi- 10 nário e atividade de neutralização de HIV podem ser prontamente isolados usando células B de animais experimentais ou seres humanos imunizados.

Seleção de bibliotecas de Ab em fago. A ref. (1) descreve méto- dos exemplificativos para o preparo e caracterização das bibliotecas de fago expressando os construtos de Fv com uma única cadeia (scFv) clonados a 15 partir dos repertórios de Ab expressos de seres humanos e camundongos. O cDNA para os construtos de scFv é obtido através de amplificação por rea- ção de polimerase-transcriptase reversa de mRNA do Ab a partir de células B. Construtos de scFv são compostos dos domínios VL e VH de Ab ligados através de um ligante peptídico curto e flexível. Semelhante aos Abs não ‘ 20 catalíticos, Abs de peptidase são capazes de ligação a antígeno com alta especificidade mediada através de contatos em resíduos dos domínios VL e VH (2). Outros repertórios de fragmento de Ab também podem ser gerados usando métodos similares, por exemplo, repertórios de subunidade de ca- deia leve (1). Repertórios de scFv compostos de tanto quanto IO8-IO9 clones 25 podem ser preparados e visualizados sobre a superfície de partículas de fago e bibliotecas de visualização de ribossoma permitem a visualização de números ainda maiores de fragmentos de Ab. Outros métodos de visualiza- ção, tais como visualização bacteriana e em levedo, também podem ser a- plicados para identificar os Abs desejados.

Uma vez que o repertório visualizado em fago tenha sido cons-

truído, as partículas de fago são contatadas com os polipeptídeos com epí- topo duplo para selecionar e isolar construtos de scFv de fago com especifi- cidade por epítopo binário. O reagente de varredura de polipeptídeo com epítopo duplo pode ser, por exemplo, (301-311)-GMB-GGS-(E-421 -433) ou outros polipeptídeos com epítopo duplo descritos nos Exemplos I e II. A in- clusão do grupo fosfonato eletrofílico no reagente de varredura é opcional e permite o isolamento de fragmentos scFv que se ligam ao gp120 com cará- ter covalente ou catalisam a hidrólise de gp120. Métodos para a varredura em fago são similares àqueles descritos nessas publicações (3, 4). Por e- xemplo, foram isolados, catalisadores gp120-específicos usando E-421-433 e E-gp120 de comprimento total descrito no Exemplo I. Os reagentes de var- redura capturam catalisadores específicos combinando a reação de ligação covalente com a ligação não-covalente tradicional que ocorre na interface epítopo-paratopo. Usando E-421-431, foi isolado um fragmento de cadeia leve de Ab específico que hidrolisa gp120 dessa biblioteca de fago humano (4). Um grupo biotina é incluído no reagente de varredura em fago. Comple- xos de fago-sonda são encerrados sobre uma coluna de estreptavidina e, então, eluídos através de clivagem da ligação S-S localizada entre as por- ções de biotina e fosfonato. Preparados purificados do scFv ou outros frag- mentos de Ab são obtidos através de cromatografia por afinidade a metal. Ensaios de catálise podem utilizar vários substratos, incluindo gp120, partí- cuias de HIV intactas com peptídeos sintéticos de gp120 contendo um grupo fluorescente repórter. A especificidade é confirmada pela falta de clivagem de polipeptídeos irrelevantes estudados em paralelo (albumina, domínio ex- tracelular de EGFR). No exemplo publicado de uma cadeia leve de hidrólise de gp120 isolada através desses procedimentos, a cadeia leve mostrou a capacidade de se ligar ao E-421-433 covalentemente. Peptídeo 421-436 sin- tético desprovido da porção fosfonato eletrofílica inibiu a ligação covalente de E-421-433, sugerindo que o nucleófilo catalítico está localizado próximo do sítio responsável pelo reconhecimento não-covalente. Construtos de scFv, que hidrolisam gp120, foram isolados de uma biblioteca de scFv hu- mana previamente descrita (1) usando E-gp120 de comprimento total como

o reagente de varredura em fago. Nesse caso, Ab antibiotina imobilizado foi usado para capturar fagos em complexo com E-gp120, seguido por uma e- * tapa de eluição em baixo pH para eluir os fagos. Vinte e quatro fragmentos scFv purificados obtidos da fração de fago ligada foram selecionados para clivagem de gp120 biotinilado através de eletroforese. Oito clones de scFv catalíticos foram identificados (Pedido de Patente Internacional Número 5 PCT/US2004/009398 e Publicação Número W02004/087735).

Uma vez que os fragmentos de Ab específico com epítopo biná- rio são obtidos das bibliotecas de fago, eles podem ser transferidos para ve- tores expressando os domínios constantes de Ab apropriados para obter Abs de comprimento total através de métodos padrões de engenharia de 10 anticorpo (5). Os Abs específicos com epítopo binário de comprimento total podem ser de qualquer classe desejada, por exemplo, IgG, IgA ou IgM. Os vetores estão comercialmente disponíveis, por exemplo, da Lonza. Os veto- res contêm domínios constantes de Ab humano flanqueados por sítios de restrição para inserção de domínios V estranhos. Os domínios constantes 15 conferem aos Abs determinadas funções efetuadoras, por exemplo, a capa- cidade de se fixar a complemento, mediar a citotoxicidade celular Ab- dependente e se ligar a receptores de Fc expressos sobre células que apre- sentam antígeno. A possibilidade de obtenção de Abs de grau terapêutico através desses métodos é mostrada pelo desenvolvimento de um construto ' 20 de scFv humano contra fator de necrose de tumor usando uma biblioteca de fago preparada a partir de seres humanos imunizados. Reclonado como IgG de comprimento total, esse construto foi recentemente aprovado para o tra- tamento de artrite reumatoide (6).

Abs monoclonais de células B. Abs de comprimento total tam- 25 bém podem ser clonados diretamente a partir das células B de organismos vivos, por exemplo, seres humanos imunizados com os construtos polipeptí- dicos com epítopo duplo dos Exemplos I e II. Por exemplo, os Abs podem ser feitos usando uma técnica de varredura em linfócito que identifica células que se ligam a um construto binário com epítopo duplo. Os linfócitos poderi- 30 am ser obtidos de células de sangue periférico ou tecidos mucosais, por e- xemplo, tonsilas ou tecido Iinfoide intestino-associado (de tonsilectomia por outras razões ou de cadáveres na autópsia). Sangue periférico oferece a vantagem de viabilidade celular assegurada e pronta disponibilidade. Linfóci- tos B mucosais sofrem recirculação e migração para locais distantes. Por exemplo, imunizações intranasais induzem a slgAs/lgAs prontamente detec- táveis no sangue e locais mucosais distantes, incluindo a vagina (7, 8). É 5 provável que o sangue contenha pelo menos uma sub-população dos linfóci- tos que recircula a partir de tecidos mucosais. Uma vez que o método pro- posto de varredura de células B pode selecionar raros linfócitos B que pro- duzem os Abs desejados, sangue de um doador bem caracterizado expres- sando os Abs específicos com epítopo binário desejados no soro pode ser 10 usado como a fonte dos Abs monoclonais.

Como um exemplo, células B são isoladas de sangue periférico (200 ml) através de fracionamento de Ficoll-Hypaque e procedimentos de varredura negativa sobre glóbulos magnéticos (kit de isolamento de células B, Miltenyi Biotec). Para isolar as células B desejadas, o preparado é incu- 15 bado (60 min) com o reagente de varredura de epítopo duplo, por exemplo, (301-311 )-GMB-GGS-(E-421-433) biotinilado ou outros polipeptídeos com epítopo duplo descritos nos Exemplos I e II, seguido por análise citométrica de fluxo para coloração com estreptavidina-peroxidase. Uma sonda peptídi- ca eletrofílica irrelevante (por exemplo, E-VIP) é usada para definir o nível de 20 reatividade de base. Células mostrando a maior coloração com o reagente de varredura de epítopo duplo (células coradas a 1%; ~103 células) são es- colhidas através de citometria de fluxo para produção de Ab monoclonal. Uma alternativa à varredura por fluxo é o uso de glóbulos magnéticos reves- tidos com estreptavidina, mas esse procedimento proporciona menos contro- 25 Ie sobre a identificação de células com a maior reatividade de SAg. As célu- las são, então, imortalizadas através de um método de transformação em EBV recentemente publicado (9). Resumidamente, as células são distribuí- das em lâminas com 96 poços (por exemplo, 10 células/poço; 500 poços) e transformadas com vírus de Epstein Barr (EBV, 30% do sobrenadante de 30 células B95 infectadas) na presença de PBMCs alimentadoras irradiadas, ciclosporina A e CpG2006 em FCS desprovido de Ig a 10%. Em 2-4 sema- nas, os sobrenadantes podem ser selecionados para a produção dos Abs < desejados. Apenas 50-60% dos poços mostram crescimento, assegurando uma probabilidade razoável de que os poços contenham células monoclo- nais. Os níveis de expressão são de até 12 μg de Ig/ml usando um ensaio de dot blot. Seleção é feita, por exemplo, usando IgMs de sobrenadantes purifi- 5 cados sobre colunas anti-lgM imobilizadas. As IgMs purificadas são incuba- das com Bt-gp120 e submetidas à SDS-eletroforese para detecção da rea- ção de clivagem. Uma vez que células B transformadas com EBV podem mostrar perda de produção de Ab (10), os genes de domínio V de Abs espe- cíficos com epítopo binário de interesse são resgatados usando uma reação

de PCR com transcriptase reversa (RT-PCR) e clonados em vetores de ex- pressão de mamífero apropriados para proporcionar uma fonte estável dos Abs.

Aprimoramento de Abs através de engenharia. Vários métodos de engenharia de proteína estão disponíveis para melhorar a afinidade de ligação, atividade catalítica e atividade de neutralização de HIV de Abs. Es- ses são descritos extensivamente na literatura (por exemplo, Pedido de Pa- tente Internacional número PCT/US2004/009398 e Publicação número W02004/087735) e podem ser aplicados conforme necessário para aprimo- rar as propriedades funcionais dos Abs específicos com epítopo binário. Por exemplo, avidez aumentada de reconhecimento de HIV-1 pode ser obtida através de formação de multímeros de scFv. Fragmentos de anticorpo tetra- valentes podem ser gerados colocando um peptídeo de auto-agregação de 33 aminoácidos derivado da proteína GNC4 no C-término de um construto de scFv (11). O comprimento e constituição do peptídeo ligante podem variar para aprimorar o emparelhamento interfacial VL-VH em construtos de scFv. A metodologia de ligante também pode ser aplicada para gerar anticorpos biespecíficos, isto é, anticorpos compreendidos de dois componentes scFv com diferente especificidade antigênica. Nesse caso, a meta é objetivar dois antígenos distintos, por exemplo, é mostrado que um construto biespecífico dirigido ao receptor de transferrina e CD3 direciona células T CD3+ a sub- meter à Iise células expressando o receptor de transferrina. Aprimoramentos também podem ser obtidos através de introdução de mutações aleatórias nas CDRs usando iniciadores mutagênicos, seguido por varredura em fago para identificar os melhores Abs com especificidade por epítopo binário. Al- ternativamente, mutações favoráveis podem ser introduzidas nos domínios V em uma base racional para aprimorar a ligação e atividades catalíticas, par- 5 ticularmente se informação estrutural está disponível sobre o complexo de antígeno-anticorpo. Por exemplo, aminoácidos candidatos adequados para mutagênese podem ser identificados através de modelamento molecular ou informação por cristalografia de raios X. Modelamento molecular dos domí- nios V de anticorpo é realizado usando algoritmos de homologia e ab initio 10 combinados e programas de computador com forte valor prognóstico para rastreamento de topografia da estrutura principal peptídica estão disponíveis. REFERÊNCIAS PARA O EXEMPLO 1

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Quaisquer patentes ou publicações mencionadas no presente relatório descritivo são indicativas dos níveis daqueles versados na técnica à qual a invenção pertence. Essas patente e publicações são incorporadas por 30 referência aqui até o mesmo ponto como se cada publicação individual fosse incorporada por referência específica e individualmente. Aqueles versados na técnica apreciarão que a presente invenção é bem adaptada para realizar os objetivos e obter as finalidades e vantagens mencionadas, bem como aqueles objetivos, finalidades e vantagens inerentes à mesma. Alterações na mesma e outros usos os quais são abrangidos dentro do espírito da inven- ção, conforme definido pelo escopo das reivindicações, ocorrerão para aque- Ies versados na técnica.

Claims

1. Polipeptídeo ou análogo eletrofílico do mesmo compreenden- do: um epítopo superantigênico e pelo menos um outro epítopo eficaz para induzir à produção de anticorpos com especificidade binária pelos epítopos sobre um antígeno polipeptídico.

2. Polipeptídeo ou análogo eletrofílico do mesmo de acordo com a reivindicação 1, em que o análogo eletrofílico é gpl20 covalentemente oli- gomerizado.

3. Polipeptídeo ou análogo eletrofílico do mesmo de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptídeo ou análogo eletrofílico do mesmo compreende o epítopo gpl20 superantigênico ligado a outro epítopo gpl20 através de um Iigante peptídico.

4. Polipeptídeo ou análogo eletrofílico do mesmo de acordo com a reivindicação 3, em que o epítopo superantigênico compreende os resí- duos de aminoácido 421-433 de gpl20 e o outro epítopo compreende os re- síduos de aminoácido 301-311 de gpl20.

5. Polipeptídeo ou análogo eletrofílico do mesmo de acordo com a reivindicação 3, em que o Iigante peptídico tem um número suficiente de aminoácidos, de modo que o comprimento do Iigante se aproxima da distân- cia entre os dois epítopos no gpl20 nativo.

6. Polipeptídeo ou análogo eletrofílico do mesmo de acordo com a reivindicação 1, em que um ou ambos os epítopos ainda compreendem um ou mais grupos eletrofílicos nos mesmos, os referidos grupos eletrofílicos eficazes para induzir à síntese dos anticorpos específicos binários.

7. Polipeptídeo ou análogo eletrofílico do mesmo de acordo com a reivindicação 6, em que um ou ambos os epítopos compreendendo o aná- logo eletrofílico tem a fórmula estrutural: <formula>formula see original document page 92</formula> em que Lv^Lx-.-Lm são componentes que definem um determinante antigênico; Lx é um aminoácido componente do determinante antigênico; L' é um grupo funcional de Lx; Y" é uma molécula, uma ligação covalente ou um ligante; Y' é um grupo neutro ou carregado opcional; Y é um grupo eletrofílico que reage covalentemente com um anticorpo que se liga ao referido determinante antigênico; n é um número inteiro de 1 a 1000; e m é um número inteiro de 4 a 30.

8. Polipeptídeo ou análogo eletrofílico do mesmo de acordo com a reivindicação 7, em que Y", Y' ou Y ainda compreende um grupo de ligação à água como um componente interno ou terminal.

9. Polipeptídeo ou análogo eletrofílico do mesmo de acordo com a reivindicação 7, em que o grupo de ligação à água se liga a um íon de metal que quela uma ou mais moléculas de água.

10. Polipeptídeo ou análogo eletrofílico do mesmo de acordo com a reivindicação 7, em que o grupo de ligação de metal é -(His)n-, em que n = 2 ou mais ou -Cys-X-Cys-Cys- ou -Cys-X-Cys-, em que X é um resíduo de aminoácido, ácido etileno diamina tetra-acético ou diaminometil piri-dina.

11. Polipeptídeo ou análogo eletrofílico do mesmo de acordo com a reivindicação 7, em que o metal é zinco, cobre, níquel, cobalto, cálcio ou magnésio.

12. Método para produção de anticorpos de epítopo binário es- pecíficos a um antígeno de polipeptídeo de célula B compreendendo: administração de um ou mais dos construtos polipeptídicos co- mo definidos na reivindicação 1 ou um ou mais de um análogo polipeptídico eletrofílico dos mesmos a um animal vivo.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, ainda compreen- dendo: administração de um ou mais adjuvantes imunológicos eficazes para estimular a produção de anticorpo de célula B dependente de célula T ou independente de célula T.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o antíge- no polipeptídico é gpl20 de HIV, Tat, Proteína A ou Proteína L.

15. Método de acordo com a reivindicação 12, em que os anti- corpos reconhecem os resíduos de aminoácido 421-433 e resíduos 301-311 de epítopos gpl20 de HIV.

16. Método de acordo com a reivindicação 12, em que os referi- dos anticorpos de epítopo binário específicos catalisam a hidrólise do antí- geno polipeptídico nativo ou se ligam covalentemente ao antígeno polipeptí- dico nativo, por exemplo, gpl20 expresso sobre a superfície do HIV, desse modo, neutralizando o HIV.

17. Anticorpo com especificidade binária a um antígeno polipep- tídico de célula B produzido através do método como definido na reivindica- ção 12.

18. Método para tratamento de infecção HIV em um indivíduo compreendendo: administração de uma quantidade imunologicamente eficaz do anticorpo como definido na reivindicação 17 ao indivíduo.

19. Método para aumento da produção de anticorpos que reco- nhecem o sítio superantigênico de célula B de gpl20 de HIV compreenden- do: administração de um ou ambos de um estimulante de célula B policlonal ou um análogo eletrofílico do mesmo a um animal vivo.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, ainda compreen- dendo: administração de um ou mais adjuvantes imunológicos eficazes para estimular a produção de anticorpo de célula B independente de célula T ao animal vivo.

21. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o estimu- Iante de célula B policlonal é um ou mais de um mitógeno de ombu, Iipopo- lissacarídeo, fitohemaglutinina ou CpG.

22. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o estimu- lante de célula B policlonal é um superantígeno que não é gpl20, mas pode se ligar a alguns ou todos os aminoácidos de domínio variável de anticorpo que se ligam ao gpl20.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o estimu- lante de célula B é Proteína A Estafilocócica.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o estimu- lante de célula B policlonal é um domínio superantigênico de Proteína A, um oligômero do domínio superantigênico de Proteína A ou Proteína A rotulada com iodo.

25. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o estimu- lante ainda compreende grupos eletrofílicos que estimulam a produção de anticorpos eficazes para catalisar a hidrólise de gpl20 ou se ligar ao gpl20.

26. Método de acordo com a reivindicação 19 em que o análogo eletrofílico do estimulante de célula B policlonal tem um ou mais epítopos tendo a estrutura: <formula>formula see original document page 95</formula> em que: Li...Lx...Lm são componentes que definem um determinante antigênico; Lx é um aminoácido componente do determinante antigênico; L' é um grupo funcional de Lx; Y" é uma molécula, uma ligação covalente ou um ligante; Y' é um grupo neutro ou carregado opcional; Y é um grupo eletrofílico que reage covalentemente com um anticorpo que se liga ao referido determinante antigênico; n é um número inteiro de 1 a 1000; e m é um número inteiro de 4 a 30.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que Y", Y' ou Y ainda compreende um grupo de ligação à água como um componente in- terno ou terminal.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, em que o grupo de ligação à água localizado em Y", Y' ou Y é composto de um sítio que se liga a um íon de metal que quela uma ou mais moléculas de água.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, no qual o grupo de ligação de metal é selecionado de: -(His)n-, em que n = 2 ou mais, -Cys- X-Cys-Cys- ou -Cys-X-Cys-, em que X é um resíduo de aminoácido, ácido etileno diamina tetra-acético ou diaminometíl piridina.

30. Anticorpo que reconhece o sítio superantigênico de célula B de gpl20 de HIV produzido através do método como definido na reivindica- ção 19.

31. Método para tratamento de infecção HIV em um indivíduo compreendendo: administração de uma quantidade imunologicamente eficaz do anticorpo como definido na reivindicação 30 ao antígeno.

32. Método de estimulação de produção aumentada de anticor- pos compreendendo: administração, a um animal vivo, de uma combinação de um po- lipeptídeo de epítopo duplo e um análogo eletrofílico do mesmo com um análogo eletrofílico de um estimulante de célula B policlonal.

33. Método para isolamento de um anticorpo individual ou frag- mento de anticorpo do mesmo tendo uma seqüência única e especificidade de epítopo binário de um repertório de anticorpo compreendendo: visualização do repertório de anticorpo sobre a superfície de par- tículas de fago; e varredura do repertório de anticorpo com um polipeptídeo ou um análogo polipeptídico eletrofílico do mesmo ou um análogo eletrofílico esti- mulante do mesmo, em que um anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo reage com o polipeptídeo, o estimulante ou os análogos eletrofílicos do mesmo para, desse modo, isolar o anticorpo de epítopo binário específico ou fragmento de anticorpo do mesmo do repertório de anticorpo.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o polipep- tídeo ou análogo polipeptídico eletrofílico do mesmo é gpl20 covalentemente oligomerizado.

35. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o polipep- tídeo ou análogo polipeptídico eletrofílico do mesmo compreende um epítopo gpl20 superantigênico ligado a outro epítopo gpl20 através de um Iigante peptídico.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que o epítopo superantigênico compreende os resíduos de aminoácido 421-433 de gpl20 e o outro epítopo compreende os resíduos de aminoácido 301-311 de gpl20.

37. Método de acordo com a reivindicação 35, em que Iigante peptídico tem um número suficiente de aminoácidos, de modo que o com- primento do Iigante se aproxima da distância entre os dois epítopos no gp!20 nativo.

38. Método de acordo com a reivindicação 35, em que um ou ambos os epítopos ainda compreendem um ou mais grupos eletrofílicos nos mesmos, os referidos grupos eletrofílicos eficazes para reagir com os anti- corpos binários específicos.

39. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o estimu- lante é um superantígeno que não é gpl20, mas pode se ligar a alguns ou todos os aminoácidos de domínio variável de anticorpo que se ligam ao g- pl20.

40. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o estimu- Iante é Proteína A Estafilocócica.

41. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o estimu- lante é um domínio superantigênico de Proteína A, um oligômero do domínio superantigênico de Proteína A ou Proteína A rotulada com iodo.

42. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o estimu- Iante ainda compreende grupos eletrofílicos que estimulam a produção de anticorpos eficazes para catalisar a hidrólise de gpl20 ou se ligar covalente- mente ao gpl20.

43. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o análogo polipeptídico eletrofílico e o análogo eletrofílico estimulante compreendem epítopos tendo a estrutura: <formula>formula see original document page 98</formula> em que: em que: Li...Lx...Lm são componentes que definem um determinante antigênico; Lx é um aminoácido componente do determinante antigênico; L' é um grupo funcional de Lx; Y" é uma molécula, uma ligação covalente ou um ligante; Y' é um grupo neutro ou carregado opcional; Y é um grupo eletrofílico que reage covalentemente com um anticorpo que se liga ao referido determinante antigênico; n é um número inteiro de 1 a 1000; e m é um número inteiro de 4 a 30.

44. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o repertório de anticorpo compreende células B de um organismo vivo que produz os anticorpos de epítopo binário específicos ou genes que codificam os anticorpos isolados das células B.

45. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo do mesmo se liga reversivelmente a um antí-geno, se liga covalentemente a um antígeno ou catalisa a hidrólise do antí-geno.

46. Método de acordo com a reivindicação 33, em que os anticorpos reconhecem o antígeno gpl20 de HIV.

47. Análogo eletrofílico de um lipídio, um polissacarídeo ou um lipopolissacarídeo tendo a estrutura: <formula>formula see original document page 99</formula> em que: L-ι...Lx...Lm são componentes que definem um determinante de ligação a receptor; Lx é um açúcar ou lipídio componente do determinante de ligação a recep- tor; L’ é um grupo funcional de Lx; Y" é uma molécula, uma ligação covalente ou um ligante; Y1 é um grupo neutro ou carregado opcional; Y é um grupo eletrofílico que reage covalentemente com um receptor celular que se liga ao referido determinante de ligação a receptor ou um grupo acila; em que, opcionalmente, Y", Y' ou Y compreende um grupo de ligação à água como um componente interno ou terminal; n é um número inteiro de 1 a 1000; e m é de 1 a 1000.

48. Análogo eletrofílico de um oligonucleotídeo tendo a estrutura: <formula>formula see original document page 100</formula> em que: Li...Lx...Lm são componentes nucleotídicos que definem um determinante de ligação a receptor; Lx é um nucleotídeo componente do determinante de ligação a receptor; L' é um grupo funcional de Lx; Y" é uma molécula, uma ligação covalente ou um ligante; Y' é um grupo neutro ou carregado opcional; Y é um grupo eletrofílico que reage covalentemente com um receptor celular que se liga ao referido determinante de ligação a receptor em que, opcio- nalmente, Y", Y1 ou Y compreende um grupo de ligação à água como um componente interno ou terminal; n é um número inteiro de 1 a 1000; e m é de 1 a 1000.