CN112245563A - 可降尿酸的鲟鱼肽复合粉 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种可降尿酸的鲟鱼肽复合粉,是以鲟鱼肉及软骨为原料,通过复合酶进行酶解、超滤膜分离器分离及干燥后得到中间产物,然后利用酶解反应的逆反应及谷氨酸对中间产物进行改进,获得能够显著抑制黄嘌呤脱氢酶(氧化酶)活性的鲟鱼肽复合粉,具有降尿酸作用,在食品、医药和化妆品领域中有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种以鲟鱼肉及软骨为原料深加工产品,尤其是一种可降尿酸的鲟鱼肽复合粉。
背景技术
高尿酸血症是由于嘌呤代谢异常等所引起的代谢性疾病,以血尿酸升高为主要特征。研究表明,长期高尿酸症状对血管、心脏、肝脏、肾脏都会产生损害,并常伴有高血压、高血脂、肥胖等疾病。目前,临床常用的药物主要有别嘌呤醇等黄嘌呤氧化酶抑制剂,长期服用会导致肝肾损害。
鲟鱼(Sturgeon)具有丰富的营养成分,是一种对人体极为有益的水产品。据《本草拾遗》记载:“鲟鱼,肉味甘,平,无毒。主治补虚益气,令人肥健。煮汁饮,治血淋。鼻肉主治补虚下气。子主治食之肥美,杀腹内小虫”。《中国药用动物原色图鉴》写道:肉滋补强壮,益气补虚,补血。用治脾虚泄泻、营养不良、气虚筋骨无力、病后体弱、贫血、营养不良、血淋刺痛、前列腺炎、淋巴结肿大。目前有报道鲟鱼肉可以通过酶解手段制成益于人体吸收的鲟鱼肽,不同的酶解方法使得所制备的鲟鱼肽具有不同的生物活性,如有效清除自由基、提高机体免疫力,抑制血管紧张素转移酶(ACE)活性及保护肝脏等等。
专利号为ZL2016112086708的中国发明专利公开了一种鲟鱼复合粉、鲟鱼骨酒及应用,其中的鲟鱼复合粉是按如下步骤制备:
a. 将宰杀后的鲟鱼洗净,取鲟鱼肉及鲟鱼软骨冷冻干燥至水分小于1%,将冻干的鲟鱼肉及鲟鱼软骨粉碎成500~5000目的鲟鱼超微粉;
b. 将鲟鱼超微粉球磨成50~200 nm的鲟鱼纳米粉;
c. 向鲟鱼纳米粉中加入pH 7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及复合酶,酶解12~48 h;所述鲟鱼纳米粉与磷酸缓冲液的质量比为1:1~10,所述复合酶添加量为10~25活力单位:1克鲟鱼纳米粉,所述复合酶为将枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶按活力单位比为3:3:4比例混合;
d. 离心取上清,采用截留分子量为10000 Da以下的超滤膜分离器分离,收集透过超滤膜的液体,将所收集的液体通过HPD系列大孔吸附树脂及活性炭后喷雾干燥,制得鲟鱼复合粉。
所获得的鲟鱼复合粉的肽结构是在酶的作用下随机产生的片段,具有有效清除自由基、提高机体免疫力的作用。迄今为止,并没有关于可降尿酸的鲟鱼肽复合粉的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题,提供一种可降尿酸的鲟鱼肽复合粉。
本发明的技术解决方案是:一种可降尿酸的鲟鱼肽复合粉,按照如下步骤制备:
a. 将宰杀后的鲟鱼洗净,取鲟鱼肉及鲟鱼软骨冷冻干燥至水分小于1%,将冻干的鲟鱼肉及鲟鱼软骨粉碎成500~5000目的鲟鱼超微粉;
b. 将鲟鱼超微粉球磨成50~200 nm的鲟鱼纳米粉;
c. 向鲟鱼纳米粉中加入pH 7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及复合酶,酶解12~48 h;所述鲟鱼纳米粉与磷酸缓冲液的质量比为1:1~10,所述复合酶添加量为10~25活力单位:1克鲟鱼纳米粉,所述复合酶为将枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶按活力单位比为3:3:4比例混合;
d. 离心取上清,采用截留分子量为10000 Da以下的超滤膜分离器分离,收集透过超滤膜的液体,真空冷冻干燥,制得中间产物;
e. 将中间产物与水配制成质量份数为40%的溶液A,加入溶液A质量份数1.5%的海洋酸性蛋白酶及溶液A质量份数1%的谷氨酸,所述海洋酸性蛋白酶的活力单位≥2500U/mg,调节pH=4.8,于37℃酶解2h,真空冷冻干燥,得到鲟鱼肽复合粉。
本发明是以鲟鱼肉及软骨为原料,通过复合酶进行酶解、超滤膜分离器分离及干燥后得到中间产物,然后再利用酶解反应的逆反应及谷氨酸对中间产物进行改进,进而获得能够显著抑制黄嘌呤脱氢酶(氧化酶)活性的鲟鱼肽复合粉,具有降尿酸作用,在食品、医药和化妆品领域中有广阔的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例所得鲟鱼肽复合粉的一级质谱图。
图2~图5是本发明实施例所得鲟鱼肽复合粉的二级质谱图。
具体实施方式
实施例1:
一种可降尿酸的鲟鱼肽复合粉,按如下步骤制备:
a. 将宰杀后的鲟鱼洗净,取鲟鱼肉及鲟鱼软骨冷冻干燥至水分小于1%,将冻干的鲟鱼肉及鲟鱼软骨粉碎成500~5000目的鲟鱼超微粉;
b. 将鲟鱼超微粉球磨成50~200 nm 的鲟鱼纳米粉;
c. 向鲟鱼纳米粉中加入pH 7~8的0.05M磷酸缓冲液及复合酶,酶解30 h;所述鲟鱼纳米粉与磷酸缓冲液的质量比为1:5,所述复合酶添加量为15活力单位:1克鲟鱼纳米粉,所述复合酶为将枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶按活力单位比为3:3:4比例混合;
d. 离心取上清,采用截留分子量为10000 Da以下的超滤膜分离器分离,收集透过超滤膜的液体,真空冷冻干燥,制得中间产物;
e. 将中间产物与水配制成质量份数为40%的溶液A,加入溶液A质量份数1.5%的海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.及溶液质量份数1%的谷氨酸,所述海洋酸性蛋白酶Aspergillussp.的活力单位≥2500U/mg,用稀盐酸调节pH=4.8,于37℃酶解2h,真空冷冻干燥,得到鲟鱼肽复合粉。
实施例2:
一种可降尿酸的鲟鱼肽复合粉,按如下步骤制备:
a. 将宰杀后的鲟鱼洗净,取鲟鱼肉及鲟鱼软骨冷冻干燥至水分小于1%,将冻干的鲟鱼肉及鲟鱼软骨粉碎成500~5000目的鲟鱼超微粉;
b. 将鲟鱼超微粉球磨成50~200 nm 的鲟鱼纳米粉;
c. 向鲟鱼纳米粉中加入pH 7~8的0.1M磷酸缓冲液及复合酶,酶解12 h;所述鲟鱼纳米粉与磷酸缓冲液的质量比为1:10,所述复合酶添加量为25活力单位:1克鲟鱼纳米粉,所述复合酶为将枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶按活力单位比为3:3:4比例混合;
d. 离心取上清,采用截留分子量为10000 Da以下的超滤膜分离器分离,收集透过超滤膜的液体,真空冷冻干燥,制得中间产物;
e. 将中间产物与水配制成质量份数为40%的溶液A,加入溶液A质量份数1.5%的海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.及溶液质量份数1%的谷氨酸,所述海洋酸性蛋白酶Aspergillussp.的活力单位≥2500U/mg,用稀盐酸调节pH=4.8,于37℃酶解2h,真空冷冻干燥,得到鲟鱼肽复合粉。
实施例3:
一种可降尿酸的鲟鱼肽复合粉,按如下步骤制备:
a. 将宰杀后的鲟鱼洗净,取鲟鱼肉及鲟鱼软骨冷冻干燥至水分小于1%,将冻干的鲟鱼肉及鲟鱼软骨粉碎成500~5000目的鲟鱼超微粉;
b. 将鲟鱼超微粉球磨成50~200 nm 的鲟鱼纳米粉;
c. 向鲟鱼纳米粉中加入pH 7~8的0.01M磷酸缓冲液及复合酶,酶解48 h;所述鲟鱼纳米粉与磷酸缓冲液的质量比为1:1,所述复合酶添加量为10活力单位:1克鲟鱼纳米粉,所述复合酶为将枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶按活力单位比为3:3:4比例混合;
d. 离心取上清,采用截留分子量为10000 Da以下的超滤膜分离器分离,收集透过超滤膜的液体,真空冷冻干燥,制得中间产物;
e. 将中间产物与水配制成质量份数为40%的溶液A,加入溶液A质量份数1.5%的海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.及溶液质量份数1%的谷氨酸,所述海洋酸性蛋白酶Aspergillussp.的活力单位≥2500U/mg,用稀盐酸调节pH=4.8,于37℃酶解2h,真空冷冻干燥,得到鲟鱼肽复合粉。
将实施例1所得到的冷冻干燥物制备成8mg/ml的去离子水溶液,使用液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪,一级质谱图如图1所示,二级质谱图如图2~图5所示。在NCBI上进行BLAST的分析,得到m/z为821.4062氨基酸序列为CEEEIAK、m/z为834.3734氨基酸序列为SQEVEDK、m/z为882.4296氨基酸序列为VEHEKLK以及m/z为887.4255氨基酸序列为EMTNHQK的四个肽。
实验例:
选取40只清洁级昆明种小鼠,体质量18~22 g,雌雄各半,于12 h黑暗、12 h光亮的塑料饲养箱内饲养,室温20±2℃,湿度40% ~ 60%,自由采食和饮水,适应性饲养3d后,随机分为4组,分别为空白组、模型组、别嘌醇阳性组、本发明实施例1组,每组10只。其中模型组、别嘌醇阳性组及本发明实施例1组腹腔注射以0.5%羧甲基纤维素钠为溶剂的氧嗪酸钾(PO)溶液(浓度300mg/kg),0.2mL/10g连续注射15d,建立高尿酸血症模型。空白组注射0.5%羧甲基纤维素钠(0.2mL/10g)。造模成功后,别嘌醇阳性组与本发明实施例1组每天给药1次(0.1mL/10g),连续灌胃15d,别嘌醇阳性组给药为allopurinol, APL, 浓度5 mg/kg,本发明实施例1组给药为实施例1所得鲟鱼肽复合粉,浓度80mg/kg;空白组及模型组给予等体积蒸馏水灌胃。末次给药后禁食24h后,用水合氯醛麻醉小鼠,眼眶后静脉取血,将采集的全血于37℃恒温30 min,然后于4℃冰箱中1h,在3000rpm下离心3 min,分离血清。测定血清中尿酸(UA)及黄嘌呤氧化酶(XOD)的含量,如表1。
表1
取50μl本发明实施例1组小鼠血清和模型组小鼠血清,均采用去血清高丰度亲和色谱柱Agilent Multiple Affinity Removal LC Column-Mouse 3获得小鼠血清中低丰度蛋白组分。各样品血清低丰度蛋白组分经过超滤浓缩后加入等体积SDT裂解液,沸水浴裂解15min,于14000×g条件下离心20 min。采用BCA法对上清液进行定量,分别为样品1、样品2。
采用Filter aided proteome preparation (FASP)方法对样品1、2进行酶解:取样品1和样品2各30 μL,分别加入0.003 mmol DTT,沸水浴5 min后冷却至室温;加入200 μL尿素缓冲液(8 mol/L尿素,150 mmol/L Tris-HCl,pH8.0)混匀后,在10 kD超滤离心管中于14000×g离心15 min,弃滤液,重复该步骤一次。加入100 μL 100 mM IAA缓冲液(以尿素缓冲液溶解),在600 rpm条件下振荡1 min,室温避光30 min后于相同离心条件下进行离心;重复该步骤一次。加入100 μL 25 mM NH4HCO3溶液,相同离心条件下离心两次。加入40 μL0.1 g/L胰蛋白酶缓冲液(以100 mM NH4HCO3溶液配制),600 rpm振荡反应1 min,37℃静置16 h。换新收集管,相同离心条件下离心;再加入40 μL 25 mM NH4HCO3,在相同离心条件下离心并收集滤液。通过C18 Cartridge脱盐冻干后以40 μL 0.1%甲酸溶液复溶,测定280 nm吸光值。
根据FASP酶解后样品OD280定量结果,各取2 μg酶解后的样品1及样品2进行LC-MS/MS分析。样品先经过RP-C18毛细管高效液相色谱柱(Thermo EASY column SC200 150 μm×100 mm)的纳升流速HPLC液相系统EASY-nLC1000,以甲酸乙腈水溶液进行梯度分离。预柱为RP-C18 Thermo EASY column SC001 traps 150 μm×20 mm。A液为0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为2%),B液为0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为84%)。梯度条件为:0~100 min,B液线性梯度0%~45%;100~108 min,B液线性梯度45%~100%;108~120 min,B液维持在100%。分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。预分析时长60min, 正式分析时长120min。
质谱分析原始数据为RAW文件,采用MaxQuant软件(版本号1.3.0.5)进行查库鉴定,并根据Label free算法进行定量分析,结果如表2所示。
表2
结果表明,本发明实施例1组小鼠血清和模型组小鼠血清相比,其中胞质中C-1-四氢叶酸合成酶(C-1-tetrahydrofolate synthase, cytoplasmic,AC:Q922D8)和肌肉中糖原磷酸化酶显著增加,黄嘌呤脱氢酶(氧化酶)(Xanthine dehydrogenase/oxidase,AC:Q00519)显著减少,表明本发明的鲟鱼肽复合粉具有较强的降尿酸作用。
序列表
<110> 古鲟(大连)生物科技发展有限公司
<120> 可降尿酸的鲟鱼肽复合粉
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 鲟鱼(Sturgeon)
<400> 1
Cys Glu Glu Glu Ile Ala Lys
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 鲟鱼(Sturgeon)
<400> 2
Ser Gln Glu Val Glu Asp Lys
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 鲟鱼(Sturgeon)
<400> 3
Val Glu His Glu Lys Leu Lys
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 鲟鱼(Sturgeon)
<400> 4
Glu Met Thr Asn His Gln Lys
1 5
Claims (1)
1.一种可降尿酸的鲟鱼肽复合粉,其特征是按照如下步骤制备:
a. 将宰杀后的鲟鱼洗净,取鲟鱼肉及鲟鱼软骨冷冻干燥至水分小于1%,将冻干的鲟鱼肉及鲟鱼软骨粉碎成500~5000目的鲟鱼超微粉;
b. 将鲟鱼超微粉球磨成50~200 nm的鲟鱼纳米粉;
c. 向鲟鱼纳米粉中加入pH 7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及复合酶,酶解12~48 h;所述鲟鱼纳米粉与磷酸缓冲液的质量比为1:1~10,所述复合酶添加量为10~25活力单位:1克鲟鱼纳米粉,所述复合酶为将枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶按活力单位比为3:3:4比例混合;
d. 离心取上清,采用截留分子量为10000 Da以下的超滤膜分离器分离,收集透过超滤膜的液体,真空冷冻干燥,制得中间产物;
e. 将中间产物与水配制成质量份数为40%的溶液A,加入溶液A质量份数1.5%的海洋酸性蛋白酶及溶液A质量份数1%的谷氨酸,所述海洋酸性蛋白酶的活力单位≥2500U/mg,调节pH=4.8,于37℃酶解2h,真空冷冻干燥,得到鲟鱼肽复合粉。
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贺江等: "草鱼鱼鳞胶原蛋白提取及活性肽制备研究", 食品研究与开发, no. 05, pages 42 - 55 * |
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