CN111363773A

CN111363773A - 大鲵活性肽

Info

Publication number: CN111363773A
Application number: CN202010315185.0A
Authority: CN
Inventors: 李伟; 佟长青
Original assignee: Zhangjiajie Jinchi Tianwen Agricultural Technology Co ltd
Current assignee: Zhangjiajie Jinchi Tianwen Agricultural Technology Co ltd
Priority date: 2020-04-21
Filing date: 2020-04-21
Publication date: 2020-07-03

Abstract

本发明公开一种大鲵活性肽，是以大鲵肉为原料，通过海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶组成的复合酶进行酶解，然后加入缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸混合物，再利用海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.进行酶解、膜分离获得大鲵活性肽。该大鲵活性肽有效提高了清除自由基及机体免疫力，在食品、医药和化妆品领域中有广阔的应用前景。

Description

大鲵活性肽

技术领域

本发明属于大鲵制品，尤其涉及一种可有效提高清除自由基能力及机体免疫力的高F值大鲵活性肽。

背景技术

肽链中支链氨基酸（Leu、Ile、Val）与芳香族氨基酸（ Phe、Trp、Tyr）的比值称为F值。研究表明，高F值（大于20）的寡肽能够显著延长大鼠负重游泳力竭时间，具有延缓疲劳的作用，具有较高的抗氧化活性。目前，利用植物来源的蛋白质进行酶解获得高F值寡肽的报道较多，主要从玉米蛋白中获得；而利用动物来源的蛋白质进行酶解获得高F值寡肽的研究不多。

大鲵的肌肉含有丰富的蛋白质、氨基酸及微量元素等，对大鲵肌肉蛋白进行深加工，可以获得一系列益于人类生命活动且易于吸收的大鲵生物活性肽。大鲵生物活性肽多是以大鲵的肌肉、皮肤、血液为原料，通过酶解、分离等技术制备而成，使用不同的酶解方法，所得到活性肽的分子量、功能及F值均不相同。

中国专利号为ZL201610314751.X的发明专利公开了一种大鲵活性肽，是按照如下步骤制备：

a. 将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入1~3倍体积pH 7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为0.1~1%的复合酶，酶解12~48 h；所述复合酶为海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按活力单位比为7:3比例混合；

b. 离心取上清，采用截留分子量为4000 Da以下用物理吸附法制备的胰蛋白酶固定超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体；

c. 通过Sephadex LH-20分子筛层析柱，按每管1ml收集层析产物，取第30~36管层析产物进行冷冻干燥；

d．将c步骤所得到的冷冻干燥物制备成10~50mg/ml的去离子水溶液，8000 rpm、4℃条件下离心10 min，用0.22 µm水膜过滤，得到上样上清液；

e. 使用ddH₂O 配制5%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm水膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相A，使用ddH₂O 配制95%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm油膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相B；使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件：流速为1ml/min，洗脱梯度分配：0~20min，流动相A100%；20.5~40min，流动相A50%，流动相B50%；40.5~60min, 流动相B100%；将上液上清液注入C₁₈柱高效液相色谱仪进样口，收集紫外检测波长280 nm的吸收峰；

f. 挥发收集物中的甲醇后真空冷冻干燥，得到大鲵肽制品。

虽然所制备的大鲵活性肽同时具备可清除自由基、提高机体免疫力以及促皮肤纤维原细胞生长作用，但是其F值并不高，清除自由基及提高机体免疫力的作用均有待提高。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可有效提高清除自由基能力及提高机体免疫力的高F值大鲵活性肽。

本发明的技术解决方案是：一种大鲵活性肽，其特征在于依次按照如下步骤制备：

a. 将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入1~3倍体积pH 4~5的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为0.1~1%的复合酶，在37℃条件下，酶解12~48 h；所述复合酶为海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.：胃蛋白酶：木瓜蛋白酶按活力单位比为6：3：1；

b. 离心取上清液A，采用截留分子量为3000 Da超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体，冷冻干燥，得到冻干粉A；

c. 以冻干粉A为原料加入缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸构成混合物，向混合物中加入1~3倍体积pH 4~5的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与冻干粉A质量比为0.1~1%的海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.，在37℃条件下酶解12~48 h后，迅速在95℃水浴中灭酶15min，冷却至室温后，在6000rpm条件下离心20min，得到上清液B；所述缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸的质量比为1：1：1，所述缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸之和与冻干粉中总游离氨基酸质量之比为0.5，所述海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.的活力单位为≥2500U/mg；

d. 将上清液B经过截留分子量为2000 Da超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体，冷冻干燥，得到冻干粉B，即高F值的大鲵活性肽。

本发明是以大鲵肉为原料，通过海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶组成的复合酶进行酶解，然后加入缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸混合物，再利用海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.进行酶解、膜分离获得F值高达45.7的大鲵活性肽。该大鲵活性肽与现有大鲵活性肽相比，有效提高了清除自由基能力及机体免疫力，在食品、医药和化妆品领域中有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例3大鲵活性肽清除DPPH自由基的能力与现有技术对比示意图。

图2是本发明实施例3大鲵活性肽清除ABTS自由基的能力与现有技术对比示意图。

图3是本发明实施例3大鲵活性肽提高小鼠免疫能力与现有技术对比示意图。

具体实施方式

实施例1：

本发明的大鲵活性肽，依次按照如下步骤制备：

a. 将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入3倍体积pH4的0.1M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为1%的复合酶，在37℃条件下，酶解12h；所述复合酶为海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.：胃蛋白酶：木瓜蛋白酶按活力单位比为6：3：1；

c. 以冻干粉A为原料加入缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸构成混合物，向混合物中加入3倍体积pH4的0.1M磷酸缓冲液及与冻干粉A质量比为1%的海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.，在37℃条件下酶解12h后，迅速在95℃水浴中灭酶15min，冷却至室温后，在6000rpm条件下离心20min，得到上清液B；所述缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸的质量比为1：1：1，所述缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸之和与冻干粉中总游离氨基酸质量之比为0.5，所述海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.的活力单位为≥2500U/mg；

d. 将上清液B经过截留分子量为2000 Da超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体，冷冻干燥，得到冻干粉B。经检测，所得冻干粉B为F值42.5的大鲵活性肽。

实施例2：

本发明的大鲵活性肽，依次按照如下步骤制备：

a. 将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入1倍体积pH5的0.01M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为0.1%的复合酶，在37℃条件下，酶解48 h；所述复合酶为海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.：胃蛋白酶：木瓜蛋白酶按活力单位比为6：3：1；

c. 以冻干粉A为原料加入缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸构成混合物，向混合物中加入1倍体积pH 5的0.01M磷酸缓冲液及与冻干粉A质量比为0.1%的海洋酸性蛋白酶Aspergillussp.，在37℃条件下酶解48 h后，迅速在95℃水浴中灭酶15min，冷却至室温后，在6000rpm条件下离心20min，得到上清液B；所述缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸的质量比为1：1：1，所述缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸之和与冻干粉中总游离氨基酸质量之比为0.5，所述海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.的活力单位为≥2500U/mg；

d. 将上清液B经过截留分子量为2000 Da超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体，冷冻干燥，得到冻干粉B。经检测，所得冻干粉B为F值40.6的大鲵活性肽。

实施例3：

本发明的大鲵活性肽，依次按照如下步骤制备：

a. 将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入2倍体积pH 4.5的0.05M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为0.5 %的复合酶，在37℃条件下，酶解30h；所述复合酶为海洋酸性蛋白酶Aspergillussp.：胃蛋白酶：木瓜蛋白酶按活力单位比为6：3：1；

c. 以冻干粉A为原料加入缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸构成混合物，向混合物中加入2倍体积pH 4.5的0.05M磷酸缓冲液及与冻干粉A质量比为0.5 %的海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.，在37℃条件下酶解30h后，迅速在95℃水浴中灭酶15min，冷却至室温后，在6000rpm条件下离心20min，得到上清液B；所述缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸的质量比为1：1：1，所述缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸之和与冻干粉中总游离氨基酸质量之比为0.5，所述海洋酸性蛋白酶Aspergillus sp.的活力单位为≥2500U/mg；

d. 将上清液B经过截留分子量为2000 Da超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体，冷冻干燥，得到冻干粉B。经检测，所得冻干粉B为F值45.7的大鲵活性肽。

实验：

一．本发明实施例大鲵活性肽清除自由基能力

1．本发明实施例大鲵活性肽清除DPPH 自由基能力

实验组：将本发明实施例3所得大鲵活性肽用去离子水配成不同浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml）的样品溶液，分别取2ml不同浓度样品溶液于试管中，加入2ml所配置的DPPH溶液（0.004g DPPH粉末加到50mL容量瓶，用95%乙醇定容，4℃下避光保存），混合均匀，室温避光30min。在10000rpm离心10min，取上清于517nm下测定吸光度Aj，同时测2ml不同样品溶液加2ml的95%乙醇的吸光度Ai，2mlDPPH加2mL蒸馏水的吸光度A0。

DPPH自由基清除率（%）=[A0-(Aj-Ai)]/A0×100%

式中：A0空白对照的吸光值； Aj样液的吸光值；Ai本身的吸光值。

对比组：为中国专利号为ZL201610314751X的发明专利所公开的大鲵活性肽，方法与实验组一致。

结果如图1所示：本发明大鲵活性肽清除DPPH自由基的能力随着大鲵活性肽浓度的增加而增加，本发明大鲵活性肽清除DPPH自由基的能力强于对比组。

2．本发明实施例大鲵活性肽清除ABTS自由基的能力

实验组：用蒸馏水配置 ABTS使浓度为7.4mmol/L，然后与2.6 mmol/L的K₂S2O8均匀混合，黑暗室温放置12 h。用95%乙醇溶液稀释，使其能在波长为734 nm处的吸光度值为0.70±0.02A，即得到ABTS自由基储备液。在试管中加入0.9ml不同浓度（20、60、100、140、180µg/ml）的本发明实施例3大鲵活性肽溶液和2ml的ABTS自由基储备液，在室温条件下放置6min，随后在转速 10000rpm下离心10min，取上清液在波长734nm处进行测定。

ABTS自由基清除率（%）=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

式中：A0 空白对照的吸光值； Ai 样液的吸光值； Aj 本身的吸光值。

结果如图2所示：本发明大鲵活性肽清除ABTS自由基的能力随着大鲵活性肽浓度的增加而增加。同时，本发明大鲵活性肽清除ABTS自由基的能力强于对比组。

二．本发明实施例大鲵活性肽提高小鼠免疫能力的测定

清洁级昆明种小鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，于12 h黑暗，12 h光亮的塑料饲养箱内饲养，室温20±2℃，湿度40% ~ 60%，自由采食和饮水。32只小鼠随机分为7组：对照组以及低、中、高3个剂量实验组及低、中、高3个剂量对比组。每天定时等体积灌胃1次，连续灌胃8 d。对照组灌胃盐水；低、中、高3个剂量实验组分别灌胃将本发明实施例3的大鲵活性肽溶于生理盐水中的溶液，浓度分别为0.01、0.05、0.1 g/（kg·bw）；低、中、高3个剂量对比组分别灌胃将中国专利号为ZL201610314751X的发明专利所公开的大鲵活性肽溶于生理盐水中的溶液，浓度分别为0.01、0.05、0.1 g/（kg·bw）。最后一次灌胃后1 h，摘眼球取血。将采集的全血于37℃恒温30 min，然后于4℃冰箱中1h，在3000rpm下离心3 min，分离血清。将抗小鼠IgG单抗溶液包被于酶标板上，每孔中加入100μl待测血清，37℃孵育2 h。PBS洗板3次后，每孔中加入生物素标记的抗小鼠IgG单抗100μl，37℃孵育1 h。PBS洗板3次后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Streptavidin）与生物素结合，加入酶底物（0.4mg/ml邻苯二胺和0.1 M的柠檬酸-磷酸缓冲液中的0.01%H₂O₂，pH 5.0）。反应10 min后，每孔加入50μl0.2 M的H₂SO₄终止反应。在492nm处测定吸光值。通过标准曲线求出对应的IgG值，IgG起着激活补体、中和多种毒素的作用，同时也是反应机体免疫状态的重要指标。

结果如图3所示：与对照组相比，低、中、高剂量实验组小鼠血清中IgG数量差异显著（P<0.05），其中0.05g/kg剂量组高出对照组的2.5倍以上。同时，各剂量组IgG值均优于对比组。结果表明：本发明大鲵肽可以显著增加小鼠的IgG数量，具有对正常小鼠体液免疫功能的促进作用。

Claims

1.一种大鲵活性肽，其特征在于依次按照如下步骤制备：