CN105132509B - 从花生粕中提取强抗氧化蛋白多肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从花生粕中提取强抗氧化蛋白多肽的方法，该方法包括以下步骤：花生粕加水灭菌后接种曲精和葡糖糖，发酵后得到花生粕发酵曲料；发酵曲料加入水和蛋白酶酶解，离心分离后得到酶解液；酶解液浓缩后经两次醇提得到强抗氧化蛋白多肽。本发明以花生粕为发酵底物进行发酵诱导产酶，并联合商业酶水解花生粕，既可以利用生物发酵法获得与原料特性吻合、专一性较高的酶，又结合了商业酶高酶活特性，实现控制酶解，提高原料利用率，降低生产成本，最大程度释放抗氧化特性的多肽组分。

Description

从花生粕中提取强抗氧化蛋白多肽的方法

技术领域

本发明属于花生粕深加工领域，具体涉及一种从花生粕中提取具有强抗氧化特性的蛋白多肽的方法。

背景技术

自由基又称游离基，是指外层轨道上含有一个以上未配对电子的分子、原子、离子或基团。自由基极其活泼，可攻击所有的细胞成分，从而导致核酸、蛋白质、脂肪、糖类和生物膜发生改变，引起细胞的损坏和老化，加速人体的衰老。

在机体内，生物合成的抗氧化酶和其他内源性抗氧化剂可清除活性氧，减缓自由基的作用，但当自由基产生过多(剧烈运动)或机体消除能力降低时(机体免疫力低下)，未能被及时清除的自由基仍会损伤机体重要生物大分子，造成机体伤害。因此，可通过补充外源性抗氧化剂及适当的运动来提高机体抗氧化水平，抵御自由基的损害。

在我们日常生活中，机体主要通过膳食来获得各种营养补充体内的代谢所需，而当我们在考虑膳食营养合理时，也应注重对自由基具有一定清除作用的食物。除了医药类特殊抗氧化剂，食物中抗氧化物质大致分为：维生素类、植物来源提取物类、微量元素类和蛋白质多肽氨基酸类。其中多肽是一种分子结构介于氨基酸与蛋白质之间的化合物，其拥有与蛋白质和氨基酸相迥异的功能特性，不仅具有更佳的吸收机制，同时也具有蛋白质或其组成氨基酸所没有的生理功能，如抗氧化和降高血压等特性，而且随着科技的发展，越来越多的新功能蛋白多肽被发现。

花生是全球最重要的四大油料作物之一，我国50-60％的花生用于榨油，榨油后所得花生粕为富含蛋白质的营养基料，其蛋白含量高达40-50％，氨基酸组成比较合理，接近联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)的推荐值。但我国花生榨油多采用机械压榨和有机溶剂浸提相结合，导致提油后残余花生粕的蛋白质高度变性，营养和风味也均发生劣变，因此目前大多用作饲料或燃料，产品附加值低，资源浪费严重。

采用生物酶解和生物发酵技术可以对大宗低值蛋白资源进行深度开发和利用，该法具有安全性较高、条件温和，且水解过程容易控制的优点。发酵和酶解均可将大分子的蛋白质水解为小分子的多肽或氨基酸，进而改善原始蛋白的吸收特性、营养特性和功能特性等；目前活性多肽的应用早已深入市场，如日本公司制造的抗氧化肽和降血脂肽应用于健康食品，畅销欧美市场。因此，以低值大宗的花生粕为原料，结合生物发酵和酶解技术提取花生蛋白中的强抗氧化肽，具有较大的经济和社会意义。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种从花生粕中提取强抗氧化蛋白多肽的方法，该方法结合生物发酵-酶解技术最大程度释放花生粕蛋白质中的抗氧化肽，然后通过醇沉分级作用，调控花生蛋白酶解产物中的抗氧化多肽的分布情况，富集具有抗氧化特性的蛋白多肽，此方法回收率高、安全，适宜大规模生产。

本发明的另一目的在于提供由上述方法制得的强抗氧化蛋白多肽。

本发明的再一目的在于提供上述的强抗氧化蛋白多肽的用途。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种从花生粕中提取强抗氧化蛋白多肽的方法，包括以下步骤：

(1)花生粕曲料的制备：按花生粕重量加入0.5-1.0倍去离子水并混合均匀，将混匀的湿润花生粕灭菌后冷却至常温，然后将曲精与葡萄糖混合均匀，并接种至冷却好的灭菌花生粕上，搅拌均匀；在湿度为90-95％、温度为28-32℃条件下发酵36-40h，得花生粕发酵曲料；以灭菌后的花生粕质量为计算基准，曲精的加入量占0.05-0.1％，葡萄糖加入量占0.2-0.5％；

(2)花生粕发酵曲料的控制酶解：按重量取花生粕发酵曲料1份和去离子水5-8份混合均匀，加入蛋白酶，在50-60℃的条件下酶解，当水解度达到15-20％时，灭酶，离心分离，得到的上清液为富含抗氧化肽的花生粕酶解液；以花生粕发酵曲料的质量为计算基准，蛋白酶的加入量占0.3-0.6％；

(3)两步醇沉分离富集抗氧化肽：真空浓缩花生粕酶解液至固形物含量30-45％，加入无水乙醇，使得溶液体系乙醇含量达到10-20％(按质量计)，恒温匀速搅拌1h后，离心，取上清液，得到第一次醇沉上清液；往第一次醇沉上清液中继续加无水乙醇使得乙醇含量为40-50％，恒温匀速搅拌1h后，离心取沉淀部分，去除沉淀部分残余乙醇，冻干，得到强抗氧化蛋白多肽；

步骤(1)所选用的花生粕为油脂含量不超过10％的高温压榨和/或溶剂提油后的花生饼/粕；

步骤(1)所述的灭菌是在121℃下灭菌10分钟；

步骤(1)所述的曲精为酱油发酵专用曲精，优选沪酿3.042米曲霉菌种发酵所得的曲精；

步骤(2)所述的蛋白酶为商业用的胰酶和碱性蛋白酶，胰酶的加入量占总酶量的20-40％，碱性蛋白酶占总酶量的60-80％；

步骤(3)所述的恒温匀速搅拌是加入无水乙醇后在常温下200-400r/min转速下匀速搅拌1h；

步骤(3)所述去除沉淀部分残余乙醇是用去离子水复溶后真空条件下浓缩，温度为50-60℃。

步骤(2)和(3)所述的离心采用常温离心，一般为5000-8000r/min保持15-30min。

由上述方法制得的强抗氧化蛋白多肽可用于药品、保健品或食品中。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明以花生粕为发酵底物进行发酵诱导产酶，并联合商业酶水解花生粕，既可以利用生物发酵法获得与原料特性吻合、专一性较高的酶，又结合了商业酶高酶活特性，实现控制酶解，提高原料利用率，降低生产成本，最大程度释放抗氧化特性的多肽组分。

(2)本发明采用两次醇沉法，通过不同浓度的乙醇处理去除弱抗氧化特性组分、富集强抗氧化特性组分，一方面可以高效分离目标肽，富集分子量在1000-5000Da之间的肽，同时达到高效浓缩目标肽的目的，简化了工艺流程。

(3)本发明所用乙醇可以通过回收循环利用，经济安全无污染。

(4)本发明工艺操作简单、生产成本低、没有任何污染、蛋白回收率高，所得抗氧化肽的抗氧化活性强，可广泛应用于食品领域中。

附图说明

图1是实施例和对比例所得多肽的分子量分布图；

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

以下实施例中，各试验指标的测定方法如下：

还原力的测定：

采用铁氰化钾还原体系，700nm处测定样品的还原力。将制备的样品以蛋白浓度进行梯度稀释，取样品液2mL于试管中，加2mL浓度为0.2mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 6.6)和2mL浓度为1％(m/V)的六合铁氰化钾溶液，混合均匀于50℃恒温水浴锅中保温20min，加2mL浓度10％的TCA，充分混匀。取上清液2mL于试管中，加2mL蒸馏水及0.4mL浓度0.1％的FeCl₃，充分混匀后静置10min，在波长为700nm处测定其吸光度。每个样品按上述步骤操作，平行测定三次(还原力IC50值指当A_700nm＝0.5时，样品的蛋白浓度，单位为mg/mL)。

DDPH自由基抑制率的测定：

将2mL DPPH自由基溶液(0.2mmol/L，95％乙醇溶解)置于试管中，加入2mL不同浓度梯度的酶解液，振荡混匀，室温避光放置30min后，在517nm处测其吸光值(A_i)，用2mL95％乙醇混合2mL蒸馏水调零，对照为2mL DPPH自由基溶液加上2mL 95％乙醇在测定波长下的吸光值(A_c)，2mL酶解液和2mL95％乙醇混合后在测定波长的吸光值为A_j。酶解液对DPPH自由基的清除能力用抑制率R表示(DPPH自由基抑制IC50值是指当样品DDPH自由基抑制率R为50％时样品的蛋白浓度，单位为mg/mL)：

R/％＝[1-(A_i-A_j)/A_c]×100％

ABTS自由基抑制率的测定：

ABTS^·+储备液的制备：以去离子水将ABTS和过硫酸钾K₂S₂O₈分别溶解并混合，使其终浓度分别为7mmol/L和2.45mmol/L，在室温避光条件下静置12-16h。测定时，将ABTS^·+储备液以磷酸盐缓冲液(0.2M,pH 7.4)稀释，使其在734nm时吸光度达0.70±0.02，形成ABTS^·+测定液。取4.0mL ABTS^·+测定液，加入40μL样品稀释液或Trolox标准液，准确振荡30s，测定反应6min后在734nm处的吸光值。Trolox浓度在0-4mmol/L时具有较好的线性关系。每个样品至少测定三个浓度并呈线性关系，计算平均Trolox当量，即TEAC值。

亚铁离子螯合率的测定：

分别取1mL待测溶液加入0.05mL FeCl₂(2mmol/L)中，混匀后加入0.2mLFerrozine(5mmol/L)试剂启动反应，将混合物剧烈摇动混匀后于室温下静置10min，于562nm处测定溶液的吸光值。对照管以去离子水代替样品，待测物抑制Ferrozine-Fe²⁺复合物形成的百分率通过式计算(亚铁离子螯合IC50值是指当样品DDPH自由基抑制率R为50％时样品的蛋白浓度，单位为mg/mL)：

亚铁离子螯合率(％)＝[(A_对照—A_样品)/A_对照]×100％

实施例1

从花生粕中提取强抗氧化蛋白多肽的方法，包括以下步骤：

(1)花生粕曲料的制备：加入花生粕重量1.0倍去离子水并混合均匀，将均匀混合后的湿润花生粕在121℃下灭菌10分钟后冷却至常温，然后将灭菌花生粕重量0.05％的曲精和0.5％的葡萄糖混合均匀，并加入到冷却好的灭菌花生粕上，搅拌均匀。在湿度为90％，温度为30℃条件下发酵38h，得花生粕发酵曲料；

(2)花生粕发酵曲料的控制酶解：按重量取花生粕发酵曲料1份和去离子水8份混合均匀，加入花生粕曲料质量0.24％的胰酶和0.36％的碱性蛋白酶，然后在55℃下酶解，当水解度达到20％时，灭酶，离心(8000r/min，15min)分离，得到上清液为富含抗氧化肽的花生粕酶解液；

(3)两步醇沉分离富集抗氧化肽：真空浓缩花生粕酶解液至固形物含量35％，加入无水乙醇，使得溶液体系乙醇含量达到15％(按质量计)，恒温匀速(200r/min)搅拌1h后，离心(5000r/min，30min)，取上清液，得到第一次醇沉上清液；往第一次醇沉上清液中继续加无水乙醇使得乙醇含量为50％，恒温匀速(200r/min)搅拌1h后，离心(5000r/min，30min)取沉淀部分，然后加入去离子水复溶，在50℃下真空浓缩去除沉淀部分残余乙醇，再冷冻干燥，得抗氧化肽1。

实施例2

从花生粕中提取强抗氧化蛋白多肽的方法，包括以下步骤：

(1)花生粕曲料的制备：加入花生粕重量0.5倍去离子水并混合均匀，将均匀混合后的湿润花生粕在121℃下灭菌10分钟后冷却至常温，然后将灭菌花生粕重量0.1％的曲精和0.2％的葡萄糖混合均匀，并加入到冷却好的灭菌花生粕上，搅拌均匀。在湿度为95％，温度为32℃条件下发酵36h，得花生粕发酵曲料；

(2)花生粕发酵曲料的控制酶解：按重量取花生粕发酵曲料1份和去离子水5份混合均匀，加入花生粕曲料质量0.06％的胰酶和0.24％的碱性蛋白酶，然后在50℃下酶解，当水解度达到15％时，灭酶，离心(5000r/min，30min)分离，得到上清液为富含抗氧化肽的花生粕酶解液；

(3)两步醇沉分离富集抗氧化肽：真空浓缩花生粕酶解液固形物含量至30％，加入无水乙醇，使得溶液体系乙醇含量达到20％(按质量计)，恒温匀速(200r/min)搅拌1h后，离心(6000r/min，20min)，取上清液，得到第一次醇沉上清液；往第一次醇沉上清液中继续加无水乙醇使得乙醇含量为40％，恒温匀速(200r/min)搅拌1h后，离心(6000r/min，20min)取沉淀部分，然后加入去离子水复溶，在60℃下真空浓缩去除沉淀部分残余乙醇，再冷冻干燥，得抗氧化肽2。

实施例3

从花生粕中提取强抗氧化蛋白多肽的方法，包括以下步骤：

(1)花生粕曲料的制备：加入花生粕重量0.8倍去离子水并混合均匀，将均匀混合后的湿润花生粕在121℃下灭菌10分钟后冷却至常温，然后将灭菌花生粕重量0.07％的曲精和0.4％的葡萄糖混合均匀，并加入到冷却好的灭菌花生粕上，搅拌均匀。在湿度为92％，温度为28℃条件下发酵40h，得花生粕发酵曲料；

(2)花生粕发酵曲料的控制酶解：按重量取花生粕发酵曲料1份和去离子水7份混合均匀，加入花生粕曲料质量0.15％的胰酶和0.35％的碱性蛋白酶，然后在60℃下酶解，当水解度达到18％时，灭酶，离心(6000r/min，20min)分离，得到上清液为富含抗氧化肽的花生粕酶解液；

(3)两步醇沉分离富集抗氧化肽：真空浓缩花生粕酶解液固形物含量至45％，加入无水乙醇，使得溶液体系乙醇含量达到10％(按质量计)，恒温匀速(200r/min)搅拌1h后，离心(8000r/min，15min)，取上清液，得到第一次醇沉上清液；往第一次醇沉上清液中继续加无水乙醇使得乙醇含量为45％，恒温匀速(200r/min)搅拌1h后，离心(8000r/min，15min)取沉淀部分，然后加入去离子水复溶，在55℃下真空浓缩去除沉淀部分残余乙醇，再冷冻干燥，得抗氧化肽3。

对比例1

一种从花生粕中提取蛋白多肽的方法，包括以下步骤：

(1)按重量取花生粕1份和去离子水8份混合均匀，加入花生粕质量0.24％的胰酶和0.36％的碱性蛋白酶，然后在55℃下酶解，当水解度达到20％时，灭酶，离心(8000r/min，15min)分离，得到上清液为花生粕酶解液；

(2)真空浓缩花生粕酶解液固形物含量至35％，加入无水乙醇，使得溶液体系乙醇含量达到15％(按质量计)，恒温匀速(200r/min)搅拌1h后，离心(8000r/min，15min)，取上清液，得到第一次醇沉上清液；往第一次醇沉上清液中继续加无水乙醇使得乙醇含量为50％，恒温匀速(200r/min)搅拌1h后，离心(8000r/min，15min)取沉淀部分，然后加入去离子水复溶，在50℃下真空浓缩去除沉淀部分残余乙醇，再冷冻干燥，得花生蛋白肽A。

对比例2

一种从花生粕中提取蛋白多肽的方法，包括以下步骤：

(1)加入花生粕重量0.8倍去离子水并混合均匀，将均匀混合后的湿润花生粕在121℃下灭菌10分钟后冷却至常温，然后将灭菌花生粕重量0.07％的曲精和0.4％的葡萄糖混合均匀，并加入到冷却好的灭菌花生粕上，搅拌均匀。在湿度为92％，温度为28℃条件下发酵40h，得花生粕发酵曲料；

(2)花生粕发酵曲料的控制酶解：按重量取花生粕发酵曲料1份和去离子水8份混合均匀，加入花生粕曲料质量0.24％的胰酶和0.36％的碱性蛋白酶，然后在55℃下酶解，当水解度达到20％时，灭酶，离心(5000r/min，30min)分离，得到上清液为花生粕酶解液；冷冻干燥，得花生蛋白肽B。

表1多肽的各项基本指标

*在固形物浓度为5％时进行测量

肽含量＝(酸溶蛋白含量-游离氨基酸)/上清液总蛋白含量×100％

(GB/T22492-2008)

表2多肽的各项抗氧化指标

a抗氧化能力为50％时样品的蛋白浓度mg/ml

b当蛋白浓度为0.1mg/ml时以Trolox当量计(uM)

由表1可以发现，采用本发明的方法对花生粕发酵曲料进行水解和分离时，可以得到蛋白含量较高的水解液(5％固形物浓度水解液的蛋白含量为18.81mg/ml以上)，同时水解物中的肽含量达到47.77％以上。

对比例1和对比例2的最大区别是：对比例2使用了本发明中的创新技术之一——结合生物发酵-酶解技术，表1中对比例2(花生蛋白肽B)具有更高的蛋白、肽含量以及总糖，说明了尽管商业酶酶活较高，但与发酵产酶相比缺乏专一性，且蛋白多与花生粕中多糖或纤维紧密结合阻碍了蛋白酶的水解，而生物发酵过程产的纤维素酶和糖化酶可以水解纤维和多糖等，使蛋白脱落增加被水解的几率从而提高水解效率。

表2为各个实施例对比例所得多肽以不同抗氧化方法评价所得抗氧化特性结果。可以看出本发明水解所得多肽其抗氧化性综合最优，有的指标甚至是非本发明方法所得多肽的5倍以上。

本发明通过乙醇可以起到一定的富集和分离抗氧化多肽的效果，其原理主要为：(1)改变了介电常数；水是高介电常数乙醇是低介电常数因此有机溶剂加入使水溶液的介电常数降低，从电学库伦定律可知，介电常数降低增加两个相反电荷之间的吸引力。这样，蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了分子的聚集和沉淀。(2)可能与盐析相似，有机试剂与蛋白类物质直接争夺水化水，致使分子聚集而沉淀。同时乙醇安全性较其他有机物高，沸点为78摄氏度，易挥发，在工业生产中可以广泛运用。

本发明所得多肽分子量分布均匀，用乙醇清除和富集之后集中在5000-3000Da，也有大量的文献表明该分子量间的肽段抗氧化值较强，而采用非本发明方法得到的水解物(花生蛋白肽A和花生蛋白肽B)以小于1000Da的肽为主，因此抗氧化值较低。

图1为各实施例中花生粕酶解产物的肽分子量分布，由表中可知，采用本发明方法获得的花生粕酶解产物(实施例1、2、3)的肽分子量主要分布在5000-3000Da，而采用常规的酶解方法和未使用醇沉手段(对比例1、2)得到的水解产物分子量分布不均，且较极端，或以大于10000Da为主或以小于1000Da为主。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种从花生粕中提取强抗氧化蛋白多肽的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)花生粕曲料的制备：按花生粕重量加入0.5-1.0倍去离子水并混合均匀，将混匀的湿润花生粕灭菌后冷却至常温，然后将曲精与葡萄糖混合均匀，并接种至冷却好的灭菌花生粕上，搅拌均匀；在湿度为90-95％、温度为28-32℃的条件下发酵36-40h，得花生粕发酵曲料；以灭菌后的花生粕质量为计算基准，曲精的加入量占0.05-0.1％，葡萄 糖加入量占0.2-0.5％；

(2)花生粕发酵曲料的控制酶解：按重量取花生粕发酵曲料1份和去离子水5-8份混合均匀，加入蛋白酶，在50-60℃的条件下酶解，当水解度达到15-20％时，灭酶，离心分离，得到的上清液为富含抗氧化肽的花生粕酶解液；以花生粕发酵曲料的质量为计算基准，蛋白酶的加入量占0.3-0.6％；

(3)两步醇沉分离富集抗氧化肽：真空浓缩花生粕酶解液至固形物含量30-45％，加入无水乙醇，使得溶液体系乙醇含量达到10-20％(按质量计)，恒温匀速搅拌1h后，离心，取上清液，得到第一次醇沉上清液；往第一次醇沉上清液中继续加无水乙醇使得乙醇含量为40-50％，恒温匀速搅拌1h后，离心取沉淀部分，去除沉淀部分残余乙醇，冻干，得到强抗氧化蛋白多肽；

步骤(1)所述的曲精为沪酿3.042米曲霉菌种发酵所得的曲精；

步骤(2)所述的蛋白酶为胰酶和碱性蛋白酶，胰酶的加入量占总酶量的20-40％，碱性蛋白酶占总酶量的60-80％。

2.根据权利要求1所述的从花生粕中提取强抗氧化蛋白多肽的方法，其特征在于：步骤(1)所选用的花生粕为油脂含量不超过10％的高温压榨和/或溶剂提油后的花生饼/粕。

3.根据权利要求1所述的从花生粕中提取强抗氧化蛋白多肽的方法，其特征在于：步骤(1)所述的灭菌是在121℃下灭菌10分钟。

4.根据权利要求1所述的从花生粕中提取强抗氧化蛋白多肽的方法，其特征在于：步骤(3)所述的恒温匀速搅拌是加入无水乙醇后在常温下200-400r/min转速下匀速搅拌1h。

5.根据权利要求1所述的从花生粕中提取强抗氧化蛋白多肽的方法，其特征在于：步骤(3)所述去除沉淀部分残余乙醇是用去离子水复溶后真空条件下浓缩，浓缩温度为50-60℃。

6.一种强抗氧化蛋白多肽，其特征在于：是由权利要求1-5任一项所述的方法制备得到。

7.权利要求6所述的强抗氧化蛋白多肽在制备食品和抗氧化保健品中的应用。

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