CN100358920C - 蛋白水解抗体的诱导物和抑制物的鉴定方法、组合物及其应用 - Google Patents

蛋白水解抗体的诱导物和抑制物的鉴定方法、组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本文公开了共价反应性抗原类似物。可以使用本发明的抗原刺激催化性抗体的产生，所述催化性抗体对预定的与特定医学疾病相关的抗原是特异性的。也可以使用所述抗原类似物使内源产生的催化性抗体永久性失活，所述催化性抗体在某些自身免疫病以及在某些淋巴组织增生疾病中产生。

Description

蛋白水解抗体的诱导物和抑制物的鉴定方法、组合物及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学、分子生物学和医学领域。更具体地说，本发明提供刺激产生新催化性抗体及其抑制物的新方法和组合物。本发明也提供鉴别和分离天然产生的由种系基因表达的催化性抗体的方法。最后，本发明提供合成共价反应性抗原类似物的方法，所述共价反应性抗原类似物刺激产生催化性抗体和/或不可逆地抑制其活性。
背景技术
为了更充分地描述本发明所属领域的状况，在本申请中通过括号中的数字引用了几个出版物。这些出版物每一个的说明书都通过引用结合到本文中。
关于来自气喘患者的抗体切割血管活性肠肽(VIP)的发现提供了抗体可能具有肽酶活性的早期证据[1，2]。该发现已经由Suzuki等人[3]独立地再现。自身抗体催化不限于对VIP的催化。在Hashimoto甲状腺炎中的自身抗体催化甲状腺球蛋白的切割[4]。对狼疮患者抗体中的DNA酶活性的报道[5，6]，已经提供了关于自身抗体催化的进一步的证据。具有自身免疫病遗传素因的小鼠品系当与对照小鼠品系相比时，产生较高水平的对用过渡态类似物免疫应答的酯酶抗体[7]，这一发现支持对自身免疫病中的催化性抗体合成的看法。
同非催化性抗体一样，肽酶抗体能够在VL和VH区的残基上结合通过接触介导的高度特异性的抗原。纯化的H和L亚基尽管亲合性低于亲代抗体，但已知它们能够非依赖性地结合抗原。抗体-抗原复合物的X射线晶体学已经表明，VL和VH区都参与结合抗原[8]。在个别的抗体-抗原复合物中所述两个V区所起的准确作用有所不同，但VH区可能以略高的水平起作用，因为CDRH3与CDRL3相比在序列上有更长和更易变的趋势。
肽酶抗体首先与多肽抗原复合，接着切割一个或多个肽键。就在切割前，以过渡态的肽键建立与所述抗体的催化性残基的接触。水解肽键的能力似乎存在于VL区。此结论是基于由多克隆自身抗体的L链、由多发性骨髓瘤患者中分离出的单克隆L链及其重组VL区和通过用VIP免疫产生的重组L链切割VIP。针对VIP的多克隆抗体和单克隆抗体的H链能够结合VIP，但没有催化活性[9]。不过VH区仍可以通过“遥控”影响肽酶活性，因为在结合远离切割位点的VIP时，所述VH区可以影响显示FV构成物的肽酶活性的结合位点的构象，所述FV构成物由与其VH区连接的催化性抗-VIP VL区组成。所述抗-VIP VH区对催化活性发挥有益的作用，而不相关的VH区对催化活性施加有害作用，这由VIP结合亲合力值和催化效率值评价。所提出的在催化性抗体中存在的特殊催化亚位点(subsite)和抗原结合亚位点符合以下资料：即抗体通常含有大的结合位点，能够容纳多肽底物的15-22个氨基酸[8]，并且抗体识别远离所述切割位点的底物区。因此，所述VH区提供了控制催化部位特异性的方法。
L链的分子模型表明，其Asp1、Ser27a和His93被合适地定位，用作催化三联体[10]。通过定点诱变，用Ala残基置换Ser27a、His93或Asp1，使VIP的水解减少超过90％[12]。一种丝氨酸蛋白酶抑制剂二异丙基氟磷酸(DFP)选择性地抑制野生型蛋白的催化活性，但该Ser27a突变体的残余活性是耐DFP的。在Ser27a、His93和Asp1上突变未影响VIP野生型L链的Km(130nM)。相反，在形成L链的延伸的活性位点的残基(Ser26、H27d/Asp28)上诱变引起Km值增加(达10倍)和周转(turnover)增加(达10倍)。这些结果可以被解释为是由于减小了基态稳定性。随之发生的ΔG+ 催化的降低引起周转增加。因此，已经鉴定了两种类型的参与L链催化的残基。Ser27a和His93是催化必需的，但不是与VIP基态的初始高亲合性复合必需的。Ser26和His27d/Asp28参与VIP基态结合，并间接限制周转。参阅图1。
在反应的早期VIP酶L链显示突发的动力学，表明在丝氨酸蛋白酶切割肽键的过程中发生了共价酰基-L链中间体的形成。在混合所述L链和底物Pro-Phe-Arg-MCA后，监测随时间变化的荧光强度。荧光立刻增加，表示形成共价中间体，接着荧光增加较慢，表示建立了稳定速率。通过与标准氨基甲基香豆素产生的荧光相比较，根据裂解的程度计算活性位点的数目。估计催化部位的浓度为114nM，相当于用Bradford法测定的L链浓度(125nM)的大约90％。
抗-VIP VL区中的催化残基(Ser27a、His93、Asp1)也存在于其种系VL区对应物中(所述种系VL基因的GenBank登录号为Z72384)。抗-VIP VL区与其种系序列相比包含4个氨基酸置换。它们是His27d：Asp、Thr28e：Ser、Ile34：Asn和Gln96：Trp。通过引入如前所述的四个所需的突变构建抗-VIP L链的种系构型蛋白[12]。纯化的种系蛋白表达的催化活性(通过切割Pro-Phe-Arg-MCA底物测定)的水平比成熟L链低约3.5倍(330±23 FU/0.4μM L链/20分钟；底物浓度50μM)。所述资料表明，起因于体细胞突变的残基的远程作用不是催化活性所必需的。
本发明提供用于刺激产生催化性抗体及其片段的新的组合物和方法。具有对与预先确定的疾病相关的抗原特异性的催化性抗体提供了一种用于临床应用的有价值的治疗工具。本文提供的方法用于鉴定、分离和精制天然产生的用于治疗各种医学疾病和失调的催化性抗体，所述疾病包括但不限于传染病、自身免疫病和肿瘤疾病。这种催化性抗体也将用于兽医学、工业和临床研究和皮肤病学领域。
发明内容
按照本发明的一个方面，本文提供用于刺激针对预先确定的靶抗原的催化性抗体产生的方法和组合物，所述靶抗原包括但不限于那些涉及致病过程和瘤形成过程的抗原。描述了共价反应性抗原类似物(CRAA)，其刺激产生在治疗各种医学疾病中具有治疗价值的催化性抗体，所述医学疾病包括自身免疫病、微生物疾病、淋巴组织增生疾病和癌症。本发明的催化性抗体也可以预防性地用于预防某些医学疾病，包括但不限于脓毒性休克、系统性炎症疾病和急性呼吸窘迫综合症。
本发明的共价反应性抗原类似物(CRAA)包含三种基本元件，并具有下式：X1-Y-E-X2。E是用来与某些氨基酸的亲核性侧链共价反应的亲电子反应中心；Y是在P1位(在所述反应中心的N端侧的第一个氨基酸)的碱性残基(Arg或Lys)；而X1和X2包含三至十个在所述反应中心的N端侧和C端侧的侧翼氨基酸。产生的CRAA代表单个结构元件的新组合，所述元件协同起作用，以(a)化学结合由某些丝氨酸蛋白酶类型的催化性抗体的种系基因编码的反应性丝氨酸残基(以及可能通过种系基因的体细胞序列的多样化获得其化学反应性的诸如Thr和Cys的残基)；(b)使用离子配对和非共价力结合诸如带正电荷的Asp/Glu残基的结构，所述结构负责种系编码的催化部位的碱性残基切割特异性；和(c)通过离子配对和非共价力在多个氨基酸上结合抗体结合部位。
在本发明的一个方面，将CRAA给予患病的活生物，CRAA籍此刺激产生特异性的催化性抗体。然后纯化所述催化性抗体。接着将如此纯化的抗体以足以使与预先确定的医学疾病相关的抗原失活的量给予需要这种治疗的患者。
按照本发明的另一方面，公开了将免疫原性量的CRAA和免疫原性量的常规过渡态类似物(TSA)联合给予、以进一步刺激催化性抗体产生的方法和组合物。
按照本发明的另一方面，提供了一种治疗与内源表达的催化性抗体的存在有关的病理学病症的方法。这种异常的病理学病症的实例是某些自身免疫病以及淋巴组织增生疾病。所述方法包括给予患有这种病理学病症的患者一种药用制剂，该制剂包含能够不可逆地结合内源产生的催化性抗体的共价反应性抗原类似物，其给予量足以抑制所述抗体的活性，从而缓解所述病症。在此实施方案中，所述CRAA只包含一个使CRAA免疫原性最小化的最小的B表位。
按照本发明的另一方面，提供了一种治疗与内源产生的催化性抗体存在有关的病症的药用制剂。该药用制剂包含在生物相容性介质中的CRAA。内源产生的催化性抗体在暴露于CRAA时被不可逆地结合和失活。所述制剂以足以抑制所述催化性抗体活性的量给予。
在本发明的另一方面，提供了一种用催化性抗体制剂被动免疫患者的方法。将催化性抗体输注到患者体内，其作用是使靶疾病相关抗原失活。在另一个可选的实施方案中，倘若患者感受到有害的副作用，则可以通过给予所述患者免疫性CRAA，使输注的催化性抗体的活性不可逆地失活。再者，在该实施方案中的CRAA的免疫原性可以通过包含最小免疫原性B细胞表位来降低。在此CRAA中T细胞通用表位可以被忽略。
在再一个可选的实施方案中，本发明的催化性抗体可以和p53的反义寡核苷酸共同给予。这种联合疗法在癌症治疗中应当证明是有效的。
在本发明的又一个方面，通过给予待免疫患者在CRAA-佐剂复合物中的本发明的CRAA，实现对患者的自动免疫。随后还将以4周的间隔给予至少两次的CRAA-佐剂复合物加强注射。在此步骤后，评估患者血清中预防性的催化性抗体的存在。
本发明的方法和CRAA具有明显超过现时可获得的用于刺激对预定靶抗原特异性的催化性抗体的化合物和方法的优势。因此，本发明公开的化合物和方法提供了用于治疗疾病的有价值的临床试剂。
附图说明
图1是一幅涉及底物基态(ΔGS)和底物过渡态(ΔGTS)的稳定化的抗体催化的自由能曲线图。ΔG+ 未催化和ΔG+ 催化分别相当于未催化反应和催化反应的活化能。Km是基态稳定化(ΔGS)程度的函数。K催化/Km是相对于催化剂-底物基态复合物的过渡态稳定化程度的函数。
图2是一幅表示表皮生长因子受体(EGFR)蛋白的结构域结构的示意图。配体为主要在结构域III发现的配体结合区；TM为跨膜域；CYS为半胱氨酸富集域；而SP是单肽。
图3是一幅建议用于制备抗EGFR催化性抗体的克隆策略的示意图。
图4描述了CRAA-EGFR肽的结构。
图5是一幅描述通过重叠延伸构建FV的示意图。
图6显示了丝氨酸蛋白酶反应性氟磷酸过渡态类似物固定化的示意图。(a)三乙胺、CH2Cl2；(b)水、THF；(c)DAST；(d)戊二酐、吡啶；(e)DCC、DMAP、三乙胺、荧光素。
图7显示了一幅表示gp120结构的示意图。V，可变区；PND，主中和决定簇；箭头，为使用本发明的方法产生的催化性抗体靶的切割位点。
图8是DFP与亲核丝氨酸残基反应的示意性描绘。
图9是显示与生物素(顶部结构)缀合的二异丙基氟磷酸不可逆地抑制L链肽酶活性的条线图。来自克隆U19的L链(1μM)与所述抑制剂一起温育30分钟。通过凝胶过滤去除未结合的抑制剂。用放射性标记的VIP底物检测20nM L链下的肽酶活性。数据表示为相对于经受凝胶过滤的未用抑制剂预处理的L链活性(约15,000cpm)的抑制百分比。
图10描述了设想用于本发明的示范性的免疫原结构。框注显示了在靶切割位点(Lys432-Ala433)周围的结构。在所述三个免疫原中的侧翼残基是一致的。氨基酸号码是在全长gp120中的氨基酸号码。
图11是一幅非还原性凝胶的放射自显影图，其显示与50nM来自狼疮患者的IgG(泳道2，左板)和11nM的来自MRL/lpr小鼠的L链(泳道2，右板)一起温育的125I-gp120(100nM)的水解。在左板和右板中的泳道1表示和来自HIV阳性受试者的非催化性IgG温育以及和来自BALB/c小鼠的L链温育的等量的底物。温育于37℃进行2小时。
图12图示了抗体对与未加入和加入DFP(10μM)的狼疮IgG(50nM)温育1小时的125I-gp120的催化切割。(B)为与L链Lay2(1μM)温育2小时的来自不同品系的125I-gp120。
图13是还原性SDS-凝胶的免疫印迹，显示L链Lay2(20μM)水解未标记的gp120(11μM；SF2，Chiron)(泳道2)。
图14是在丝氨酸蛋白酶切割肽键的过程中，形成假定的酰基酶过渡态的示意图。所述酰基酶复合物(右边结构)由攻击性水分子去酰化。
图15是用来激发针对TNFα的催化性抗体的示范性CRAA。
图16是用来激发针对IL-1β的催化性抗体的示范性CRAA。
图17是用来激发针对IL1-β的催化性抗体的示范性CRAA。在此CRAA中，亲电子反应中心包含一个硼酸(boronate)分子。
图18是参与p53介导的信号事件的细胞分子的示意图。
图19A和图19B列表描述了为常规单克隆抗体靶的显示出有临床前景的抗原。这种抗原是本发明的催化性抗体的合适的靶。
具体实施方式
公开了用于刺激免疫系统合成预定的特异性的催化性抗体的方法。在本发明的一个实施方案中，提供了产生针对选择的肽抗原的催化性抗体的组合物和方法。在另一个实施方案中，提供了以被动免疫治疗形式用于治疗癌症和其它医学疾病的组合物和方法。在本发明中，也考虑使用治疗其中TNFα和ILβ1起关键作用的疾病的催化性抗体。这些疾病包括但不限于局部缺血和再灌输伤害、脓毒性休克、SIRS、急性呼吸窘迫综合症、类风湿性关节炎、炎症性肠病、多发性硬化病和神经营养性疼痛。
在本发明的另一个实施方案中，描述了激发针对预定病毒或致病抗原的催化性抗体产生的疫苗接种方法。公开的共价反应性抗原类似物优先刺激催化性抗体的产生。这种抗体由于存在导致靶抗原永久失活的抗靶抗原的催化作用，因此具有优越的抗感染保护。另外，与可逆地和化学计量地结合抗原的非催化性抗体相比，单个催化性抗体分子可以再使用，以使多个抗原分子失活。
已经提议将TSA免疫[1]作为得到可以结合所述过渡态、并因此降低阻碍所述反应的活化能的抗体的方法。通常使用的膦酸(phosphonate)类似物包含一个四面体的三价磷原子和一个连接于所述磷上的带负电荷的氧原子。据认为，肽键切割过渡态的形成涉及在切割位点上的三角形碳原子转变为四面体形态，以及羰基上的氧获得负电荷。因此，常规的膦酸TSA可以诱导合成能够结合氧阴离子结构和所述过渡态的四面体构型的抗体。然而，针对这些TSA的抗体尽管能够加速相对要求不高的酰基转移反应，但其不能有效催化肽键切割。最近已经报道了针对亚磷酸(phosphinate)TSA的抗体缓慢切割稳定的伯酰胺[11]。可能的是，与更普通的抗膦酸抗体相比，所述抗亚磷酸酯抗体可以使质子较多地转移至在易裂键上的酰胺氮，这可能是其催化活性较好的原因。
大部分酶学专家相信，膦酸TSA不能激发有效的催化性抗体，因为它们是差的过渡态模拟物，并且因为涉及多种过渡态。酶使用活化的氨基酸侧链催化肽键切割。例如，由于形成丝氨酸、组氨酸和门冬氨酸残基的分子内氢键网，所以丝氨酸羟基获得了增强的亲核性和介导共价催化的能力。所述膦酸类似物不含有结合亲核性反应中心所必需的结构元件。因此，使用常规的膦酸TSA难以实现对抗体中共价催化能力的诱导。此外，这些TSA不能利用在抗体中存在的种系编码的丝氨酸蛋白酶位点。
公开了制备能够与催化性抗体的亲核性丝氨酸残基反应的亲电子CRAA的方法。这些新的抗原类似物将用于从抗体文库中选择催化剂。此策略合理的外延是准备强制利用丝氨酸蛋白酶位点合成对个别靶抗原(诸如EGFR)特异性的抗体。这可以通过用前述的亲电子CRAA免疫来实现。这种CRAA有助于在细胞表面上表达种系编码的丝氨酸蛋白酶位点的B细胞的克隆选择。而且，例如通过加入合适的EGFR抗原表位(将位于共价反应性抗原类似物结构的侧翼)，将确保对EGFR的特异性。
已经记载了在自身免疫病中催化性抗体合成[2，4]。而且，免疫系统能够产生催化切割内源性抗原(包括切割HIV蛋白gp120)的抗体。然而，感染病毒的患者不产生针对gp120的催化性抗体应答。本文论述的HIV CRAA将迫使免疫系统合成针对HIV的保护性的催化性抗体。本文列出的资料支持此方案。选择gp120作为靶抗原有以下理由：(a)它是HIV-1对宿主细胞生产性感染的必需组分；(b)作为病毒表面蛋白，gp120容易为抗体接近；和(c)已经表明某些抗gp120抗体抑制HIV感染。
通过用本发明的CRAA免疫，可以募集用于合成HIV特异性的催化性抗体的催化剂VL基因。所述类似物能够结合亲核性的种系编码的催化部位，并因此优先刺激产生催化性抗体的B细胞的克隆扩充。在需要时，膦酸TSA可以和CRAA一起诱导催化性抗体，所述催化性抗体除了亲核性化学反应性之外，还包含一个氧阴离子空穴。
合成与丝氨酸蛋白酶样催化剂的关键结构元件反应的CRAA，它包含一个参与CD4结合的gp120的模型B细胞表位(残基421-436)。用所述B表位及其CRAA，使用本领域那些技术人员熟知的步骤免疫自身免疫小鼠和非自身免疫的小鼠。将一个T辅助细胞表位也加入到CRAA中。通过在所述TSA中加入以下特征：亲电子的四面体膦酸酯(phosphonate ester)或位于B表位残基侧翼的带负电荷的膦酸，在激发的抗体中募集已知有助于丝氨酸蛋白酶催化的各个结构特征，即亲核性丝氨酸残基、形成氧阴离子空穴的残基、与易裂键四面体几何形状互补的形状和对底物中侧翼残基的识别。
本发明的CRAA和产生的催化性抗体具有至少三个主要用途。第一个用途涉及在或人或动物中，在用设计用于特定医学疾病的CRAA免疫后，产生催化性抗体。然后将如此产生的催化性抗体给予患者，以使靶抗原部分失活。在此情况下，倘若患者出现不良副作用，那么可以给予免疫性CRAA，以使所述催化性抗体不可逆地失活。为了使免疫原性最小化，在此实施方案中可以合成只具有一个B细胞表位的CRAA。
在第二个用途中，为了针对特定病理自动免疫患者，以产生保护性免疫状态的目的，可以给予所述患者CRAA。这些CRAA应当作为CRAA-佐剂复合物给予。
最后，本发明的CRAA可以给予现时正表达与医学疾病(诸如自身免疫病或多发性骨髓瘤)相关的催化性抗体的患者。可以设计与存在的抗体特异性反应的CRAA。抑制催化作用应当导致疾病状态的改善。再者，这些CRAA设计仅包含一个最小免疫原性的B细胞表位。
以下阐明的详述描述了实施本发明的优选方法。描述了选择和制备CRAA的方法，刺激产生针对预定疾病抗原的催化性抗体的方法，以及描述了用于体内给予CRAA或催化性抗体的方法。
I.选择和制备CRAA
使用常规有机合成方案制备本发明的共价反应性抗原类似物。本发明的新CRAA包含一个位于衍生自蛋白的肽残基侧翼的亲电子中心，所述蛋白与作为切割靶的特殊肽抗原和CRAA的预期用途有关。
根据作为切割靶的特定肽抗原选择合适的侧翼氨基酸序列。例如，病毒外壳抗原、某些细胞因子和肿瘤相关抗原包含许多不同的表位。这些表位中许多已经使用常规的基于单克隆抗体的方法绘出图谱。这些知识有助于有效的共价反应性抗原类似物的设计，所述抗原类似物可用作催化性抗体抑制剂以及用作具有抗预定靶抗原的催化活性的催化性抗体的诱导物。
位于反应中心侧翼的氨基酸代表在所定义多肽中的靶表位的序列，所述多肽在疾病中起作用，或在疾病中产生针对其的自身抗体。
CRAA的结构特征用来使其特异性和共价结合不成熟的种系编码的抗体以及特异性识别靶表位的成熟抗体。根据克隆选择理论的宗旨，CRAA也用来募集编码催化性抗体的种系基因，用于合成针对靶表位的成熟抗体。
作为靶的多肽包括可溶性配体和这些配体的膜结合受体。
微生物蛋白也用作本发明抗体催化的靶。它们包括但不限于gp120、gp160、Lex1阻抑物、gag、pol、乙型肝炎表面抗原、细菌外毒素(白喉毒素、破伤风梭菌(C.tetani)毒素、肉毒梭菌(C.botulinum)毒素、百日咳毒素)。
也将肿瘤抗原加入到治疗有益的CRAA中。这些抗原包括但不限于EGF、TGFα、p53产物、前列腺特异性抗原、癌胚抗原、促乳素、人绒毛膜促性腺激素、c-myc、c-fos、c-jun、p-糖蛋白、多种药物抗性相关蛋白、金属蛋白酶和血管生成因子。
肿瘤抗原的受体也将是抗体介导的催化的靶。这些受体包括EGFR、EGFR突变体、HER-2、促乳素受体和类固醇受体。
炎症介质也是合适的催化靶。其中的示范性分子包括TNF、IL-1β、IL-4以及它们的相关受体。
在自身免疫病和淋巴组织增生疾病中发现了先有的催化性抗体。通过给予患者CRAA抑制这些催化性抗体的有害作用。将给予设计为免疫原性弱的、与抗体亚基共价反应的CRAA，所述抗体亚基具有对VIP、Arg-血管升压素、甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶、IL-1、IL-2、干扰素、蛋白酶-3、谷氨酸脱羧酶的特异性。
为了使选择性最大化，所述侧翼肽序列包含一个为切割靶的表位。例如，将一个存在于表皮生长因子受体中的表位加入到本发明的CRAA中。在本发明的另一个实施方案中，将存在于HIV gp120中的一个表位加入到CRAA中。用于治疗HIV感染的示范性的CRAA包含一个B细胞表位和一个T细胞表位，以使所述CRAA的免疫原性最大化。本文例举的其它CRAA包括那些适于产生针对TNF和IL-1β的催化性抗体的CRAA。
II.给予CRAA
如本文所述的CRAA一般作为药用制剂给予患者。本文使用的术语“患者”是指人类受治疗者或动物受治疗者。
方便地配制包含本发明的CRAA的药用制剂，以用于与可接受的介质一起给予，所述介质诸如水、缓冲盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇和诸如此类的物质)、二甲基亚砜(DMSO)、油、去污剂、悬浮剂或它们的合适的混合物。在选定介质中CRAA的浓度取决于所述介质的疏水性质或亲水性质，以及CRAA的其它特性。本领域的技术人员可以轻易确定溶解度界限。
本文所用的“生物学上可接受的介质”包括如在前述段落中作为范例的任何的和所有的溶剂、分散介质和诸如此类的物质，它们可能适于所述药用制剂的理想的给药途径。这种介质用于药用活性物质的用途是本领域已知的。除非因为任何常规培养基或介质与要给予的CRAA不相容的，否则也考虑了其在药用制剂中的应用。
常规的免疫方法将用于诱导催化性抗体的合成。三次腹膜内注射和一次静脉注射给予免疫原(每次约100μg肽)。静脉内进行最后的免疫。在动物研究中使用RIBI。对于人类应用，将使用明矾作为佐剂。明矾被批准用于人类用途，先前已经表明明矾激发针对B-T表位(类似于本发明提出的那些B-T表位)的抗体合成。RIBI是弗氏完全佐剂的低毒性替代物，并可再现地促进针对各种抗原产生良好的抗体应答。分析两种佐剂是有利的，因为佐剂通过由其募集的细胞因子和TH亚群对B细胞的作用，影响抗体对疫苗应答的质和量。
可以通过静脉注射到血流中，或通过皮下注射、肌内注射或腹膜内注射，胃肠外给予CRAA。用于胃肠外注射的药用制剂是本领域普遍知道的。如果选择胃肠外注射作为给予本发明所述分子的方法，那么必须采取步骤确保足够量的所述分子到达其靶细胞，发挥生物学作用。
将所述药用制剂配制成易于给予和剂量均一的剂量单位形式。本文所用的剂量单位形式是指适于经受治疗的患者的药用制剂的物理上分离的单位。每个剂量应当包含一定量的计算产生与选择的药用载体相关的所需效应的活性成分。测定合适剂量单位的步骤是本领域那些技术人员熟知的。
可以以合适的间隔给予包含所述CRAA的药用制剂，例如一天两次直至病理症状减轻或缓解，此后所述剂量可以减至维持水平。在特定情况下合适的间隔一般应当取决于在患者中设法要治疗的病症和致病状态。
III.给予催化性抗体
本文所述的催化性抗体一般作为药用制剂给予患者。
将包含本发明的催化性抗体的药用制剂和可接受的介质方便地配制用于给予，所述介质诸如水、缓冲盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇和诸如此类的物质)、二甲基亚砜(DMSO)、油、去污剂、悬浮剂或它们的合适的混合物。在选定的介质中催化性抗体的浓度将取决于所述介质的疏水性质或亲水性质，以及所述催化性抗体的其它特性。本领域的技术人员可以轻易确定溶解度界限。
本文所用的“生物学上可接受的介质”包括任何和所有的如在前述段落中作为范例的溶剂、分散介质和诸如此类的物质，它们可能适于所述药用制剂的所需给药途径。这种介质用于药用活性物质的用途是本领域已知的。除非因为任何常规培养基或介质与要给予的催化性抗体不相容，否则也考虑了其在药用制剂中的用途。
在给予本发明的催化性抗体时，将使用常规的被动免疫方法。在一个优选的实施方案中，抗体将静脉输注到患者体内。对于治疗某些医学疾病，必须采取步骤确保足够量的所述分子到达其靶细胞以发挥生物学作用。可能不得不增加所述分子或其中传递所述分子的药用制剂的亲脂性，以使所述分子可以抵达它们的靶位置。而且，可能不得不在以细胞为靶的载体中传递本发明的催化性抗体，以使足够数目的分子到达靶细胞。增加亲脂性和治疗分子导向的方法，包括将本发明的催化性抗体胶囊化为镶嵌抗体的脂质体，是本领域已知的。
为本发明主题的催化性抗体可以作为抗体片段或完整的抗体使用，或者它们可以加入到重组分子中或与诸如聚乙二醇的载体缀合。另外，可以任何这种片段或完整抗体结合至如上所述的能够引起所述抗体或片段穿越细胞膜的转移的载体。该类型载体包括但不限于由(Cruikshank等，the Journal of Acquired Immune DeficiencySyndromes and Human Retrovirology，1997年3月)描述的那些载体。
将所述药用制剂配制成易于给予和剂量均一的剂量单位形式。本文所用的剂量单位形式是指适于经受治疗的患者的药用制剂的物质上分离的单位。每种剂量应当包含计算产生与选择的药用载体有关的所需作用的量的活性成分。测定合适剂量单位的步骤是本领域的那些技术人员熟知的。例如，在人类中同源IgG的半寿期约为20天。在此期间，一种周转为2.1次/分钟的抗体的一个分子将切割60,480个抗原分子(所述周转是由噬菌体呈现文库分离出的人抗-VIP L链的周转[14])。因此可以看出，所述肽酶抗体可以表达比化学计量的可逆结合的分子多得多的有效抗原中和活性。请注意，选择本文论述的抗体轻链是根据其抗原结合亲和力、有利于紧密结合所述抗原但不选择具有最佳周转的催化剂的步骤。本文公开的用CRAA免疫产生的并通过合适的选择方法分离的抗体，将显示出大得多的周转。可以使用这种催化性抗体，以比相应的非催化性抗体低得多的剂量治疗疾病。
可以以合适的间隔给予包含所述催化性抗体的药用制剂，例如一周两次直至病理症状减轻或改善，此后可以将剂量降低至维持水平。在特殊情况下，合适的间隔一般应当取决于在患者中设法治疗的病症和致病状态。
选择将产生用于被动免疫治疗或自动免疫治疗的催化性抗体的CRAA，所述催化性抗体将满足以下的可接受的预防性或治疗性药物的标准规范：(1)催化性抗体对靶肽抗原的切割将通过或者以功能方式活化靶肽抗原，或者以功能方式使靶肽抗原失活，导致在病理过程中的有益变化；和(2)给予所述催化性抗体或者利用CRAA免疫诱导其在体内产生，将产生良好的治疗指数，使得获得的临床利益比与任何副作用相关的发病更重要。关于如何确立本领域常见的这种预防性或治疗性药物的可接受性的规范的论述，可以在诸如BertSpilker，Raven Press，纽约，1991的 临床实验指引Guide to clinical Trials的教科书中查找。
用于实施本发明的预防性或治疗性的靶肽抗原的合适的种类包括但不限于：细胞因子、生长因子、细胞因子受体和生长因子受体、参与由生长因子受体起动的刺激物转导的蛋白、凝血因子、整联蛋白、抗原受体、酶、特别是那些参与细胞程序(分化、增生和程序性细胞死亡)控制的转录调节物、这些细胞程序的其它诱导物、能够排出抗癌剂的细胞泵、微生物和病毒肽抗原。
常规的起抑制特定靶分子功能作用的单克隆抗体是最普通类型的治疗剂之一，所述治疗剂处于生物技术公司和医药公司临床应用研究之中。其中一些已经显示了实质性的临床前途，并因此显示为上述分子功能单位一部分的任何暴露的肽靶抗原特别适合作为本发明主题的催化性抗体的潜在的靶。本发明设想的催化性抗体由于它们的仅一个抗体就对许多靶分子起作用的能力，以及由于所产生的治疗成本的急剧下降，形成了对这种常规单克隆的较大改进。利用在本领域完全确立的方法可以测定在这些靶抗原中的肽键的可利用性，所述方法包括但不限于在暴露于蛋白水解酶和能够切割各种肽键的催化性轻链后证实切割。
在图19A和19B中列表显示了一些为常规单克隆抗体靶的、显示了临床前途和相应的医学适应症的抗原。
因此，本发明的一个目的是提供共价反应性抗原类似物和生产其的方法，所述共价反应性抗原类似物能够1)激发产生对预定的本发明的抗原特异性的催化性抗体和/或2)不可逆地抑制与自身免疫病和某些淋巴组织增生疾病相关的催化性抗体的催化作用。其它目的在于提供制备抗原及其相应的抗体的方法，以及提供使用这些抗体作为有益的治疗剂的测定和方法。
实施例IA
用于肿瘤免疫治疗的催化性抗体
在本实施例中描述了生产适于治疗癌症的催化性抗体(Ab)的方法。这种抗体依靠催化功能提供了优越的用于癌症治疗的免疫治疗选择方法，因为对靶抗原的切割应当导致其永久失活。而且，可以再利用单个的抗体分子，以使多个抗原分子失活。相比之下，非催化性抗体化学计量地结合抗原，且所述结合是可逆的。在由复合物解离时，所述抗原可以恢复其生物学功能。
将使用肿瘤相关抗原、表皮生长因子受体(EGFR)合成一种适于刺激产生具有酶活性的抗体的示范性抗原。先前的关于肽酶抗体的研究已经揭示，1)某些抗体能够将结合个别肽抗原的能力和肽键切割活性结合在一起；2)肽酶位点在结构上类似于非抗体的丝氨酸蛋白酶的活性位点。此位点位于VL区，并由种系V区一个或多个基因编码；和3)在自身免疫病中发生的肽酶抗体合成的水平增加。
在细胞分化和有丝分裂必需的信号转导中EGFR起极为重要的作用。参阅图2。而且，经由EGFR转导的信号已经涉及肿瘤入侵和转化。EGF或TGFα与EGF受体的结合刺激了受体酪氨酸激酶活性和自磷酸化活性。受体活化导致了一连串的细胞内事件，其在增加的细胞增生中达到顶点。
EGFR基因的过量表达与许多肿瘤有关，包括腺癌和肺鳞状细胞癌、乳癌、结肠妇科癌和膀胱癌、神经胶质瘤、肝细胞癌和胰腺癌以及前列腺癌。在某些肿瘤中的过量表达已经归因于EGFR基因的扩增[15]。
EGFR是合适的肿瘤抗原，因为它在肿瘤中表达的水平比在正常组织中高得多。因此，针对EGFR的抗体是抗肿瘤药剂的合适侯选者。针对受体相互之间不竞争结合EGFR的特异性表位，已经产生了许多针对EGFR的单克隆抗体(Mab)[例如16]。Mendelsohn和同事们已经描述了使用人A431表皮样癌细胞的EGF受体蛋白作为免疫原产生的小鼠单克隆抗体。抑制EGF结合EGFR的单克隆抗体还抑制EGF刺激的酪氨酸蛋白激酶活性，该活性使用完整的细胞或溶解的膜和一种外源肽底物测定。而且，这些单克隆抗体在组织培养物中抑制A431细胞的增生，而那些不能阻断EGF结合EGFR的单克隆抗体没有影响细胞增生。进一步的研究表明，给予抗EGF受体单克隆抗体在无胸腺小鼠中可以抑制A431细胞形成肿瘤。已经表明不同同种型的单克隆抗体在小鼠中抑制肿瘤生长，这说明在观察到的抗增生活性中，恒定区效应子功能很可能不是关键。只要给予足够量的抗体，就可以观察到在体内对肿瘤生长的完全抑制。几乎没有坚持连续表达EGFR的肿瘤，这表明它们的幸存是由于所述细胞没有足够地暴露于抗体[17]。
使用乳癌细胞系作为免疫原，Modjtahedi等人[16]产生了几种抗EGFR的单克隆抗体，其中一些阻断生长因子与EGFR的结合，并抑制人鳞状癌细胞系的生长。已经使用纯化的EGF受体或表达高水平EGFR的细胞作为免疫原，制备了几种另外的EGFR特异性单克隆抗体[18]。治疗恶性神经胶质瘤[19，20]、头颈癌和肺癌的抗EGFR抗体的一期临床实验正在进行中。
资料表明，在研制对表达EGFR的肿瘤免疫治疗有效的药物时，可以使用能够破坏EGF结合EGFR的抗体。已经注意到在EGFR表达和BCL-2水平之间的负相关，所述BCL-2是一种在最重要的程序性细胞死亡(凋亡)中起重要作用的蛋白。已经表明，在一定条件下EGFR的配体结合保护肿瘤细胞，使之免于c-myc诱导的凋亡。用突变EGFR转染的恶性胶质瘤细胞显示凋亡下降[21]。因此，原则上抗EGFR的抗体可能能够在肿瘤细胞中诱导凋亡。如果这种可能性成立，那么在用EGFR抗体治疗后通过凋亡(apoptotic)途径肿瘤完全退化的可能性将增强。
能够切割EGFR的抗体与其非催化性对应物相比，包含优越的免疫治疗剂，其原因在于：(a)于合适的肽键处切割EGFR应当使生物活性永久丧失，而非催化性抗体结合EGFR可以是可逆的，并且所述抗体的解离将再生EGFR的生物功能；和(b)单个催化剂分子可以切割多个底物分子，而非催化性抗体仅能化学计量地起作用。
本文公开了三个制备催化性抗体的策略。第一个策略利用具有肽酶活性的克隆的抗体轻链的可用性。先前的研究已经表明，VH区的抗原结合特异性可以操纵存在于VL区的非特异性肽酶活性。产生包含连接至结合EGFR的VH区的可利用的VL区的杂种FV构成物。在合适的表达系统中合成和表达后，评价所述FV构成物的特异性EGFR切割活性。
第二个克隆策略是根据以下观察：在自身免疫病中表达的某些抗体使用由种系VL基因编码的丝氨酸蛋白酶催化部位。用EGFR表达细胞免疫具有自身免疫病背景的小鼠。在免疫后，由噬菌体呈现文库中分离出催化性FV区。通过结合与亲核性丝氨酸残基反应的共价反应性抗原类似物(CRAA)，然后通过结合EGFR的胞外域，选择将种系编码的催化活性和体细胞获得的对EGFR的特异性结合在一起的催化剂。
第三个策略是根据以下假设：可以迫使免疫系统使用种系编码的催化部位合成抗EGFR的抗体。用能够优先刺激催化性抗体合成的EGFR肽的亲电子CRAA免疫小鼠。使用各种对本领域那些技术人员来说已知的方法，评价如此产生的抗体催化剂在体内对表达EGFR的人细胞系的肿瘤发生性的抑制作用，即抑制EGF刺激的EGFR自磷酸化作用和抑制肿瘤细胞生长。
本文公开的组合物和方法简化了适于癌症免疫治疗的特异性和有效催化EGFR切割的抗体的制备。图3概括了采用的方法。先前的研究已经证实了分离能够催化切割某些抗原(即VIP、甲状腺球蛋白和gp120)的抗体的可行性。得自这些研究的信息已经应用于本发明，产生了制备抗EGFR的催化性抗体的公开的策略。
提供以下的材料和方法是为了便于实施本发明。
材料和方法
免疫：如先前所述，用EGFR表达细胞超免疫六只MRL/lpr小鼠。简而言之，利用组织培养瓶的胰蛋白酶消化，回收约107A431细胞，在PBS中重悬浮，并在RIBI佐剂中腹膜内给予所述小鼠。使用约5×106细胞以十天的间隔进行三次加强免疫。如果没有达到高水平的抗体效价，则用可溶性的表皮生长因子受体的胞外域(exEGFR)(25μg)给予加强注射。为推动免疫系统产生催化性抗体，按照以上流程，同样用在RIBI中的与匙孔血蓝蛋白(KLH)缀合的TSA-EGFR(50μg蛋白)腹膜内超免疫六只MRL/lpr小鼠。以十天的间隔由眶后血管丛获得血液。
表达和纯化exEGFR：如先前所述[22]，由杆状病毒表达系统中纯化EGFR的胞外域(exEGFR，由EGFR的残基1-621组成)。在Sf9昆虫细胞中进行exEGFR的表达，所述昆虫细胞分泌约2mg/ml的exEGFR到培养物上清液中[22]。通过两步离子交换层析步骤纯化，可回收蛋白的均一性用SDS-PAGE测定约为95％[22]。
制备和纯化EGFR-CRAA肽：所述CRAA由以下三个基本元件组成：一个亲电子膦酸酯，EGFR残基294-303(所述膦酸酯位于其N端侧翼)和EGFR残基304-310(所述膦酸酯位于其C端侧翼)。参阅图4。亲电子性存在于三价磷原子上是用来捕获存在于抗体中的亲核性丝氨酸残基。已经描述了合成这种CRAA的基本的合成流程[23]。简而言之，包含赖氨酸的等排物(EGFR残基303)的亚磷酸酯连接于合适的侧翼肽序列上。由次磷酸的二苯甲胺盐和6-氨基己醛制备所述等排物，接着除去酸中的二苯甲基[24]。通过常规的固相肽合成技术制备所需的侧翼肽，只是对应于EGFR残基304-310的肽包含2-羟基-6-氨基己酸，而不是N末端的赖氨酸。通过经典的溶液相肽合成法，使侧链保护肽连接于亚磷酸酯结构上。所述亚磷酸酯结构通过与苯酚氧化偶合，转变为磷酸苯酯。侧链保护的CRAA-EGFR肽的N末端将通过戊二醛法偶合KLH。反应混合物通过凝胶过滤分离，并在用高氯酸完全消化之后，分析在较低的分子部分中残留的未结合肽的无机三价磷。这将用来评价结合效率。
exEGFR和EGFR-CRAA ELISA：用exEGFR或CRAA-EGFR(100ng/ml)包被PVC 96孔平板，过量的蛋白结合位点用5％白蛋白封闭，检测适当稀释的血清抗体与固定化抗原的结合。通过用以过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG处理，检测反应的程度。对照包括和免疫前血清以及和过量的可溶性竞争者exEGFR一起温育。检测克隆的FV构成物结合exEGFR和CRAA-EGFR的步骤基本同上，除了用小鼠抗-c-myc抗体(该重组蛋白含有10个残基的c-myc标记)和以过氧化物酶标记的抗小鼠IgG处理来显示该反应。
FV的制备：如下文概述，使用在先前出版物[10，14，15]中描述的有一定改编的方法。也参阅图5。如下进行FVcDNA文库的构建：通过标准方法由免疫小鼠的脾细胞制备总RNA，同时使RNA酶的污染最小。使用逆转录酶和合适的VL或VH正向引物(它们分别包含一个克隆到所述载体中的SfiI限制位点和一个编码肽接头的反义序列)，由RNA模板生产VL cDNA文库(残基1-113)和VH cDNA文库(残基1-123)。使用Taq、dNTP和如在图5中所示的合适的引物，通过PCR扩增所述cDNA。反向引物是基于FR1区中编码保守的N末端氨基酸的序列。在所述引物中已经引入了限制性的简并，以允许扩增密切相关的V基因家族(例如κ家族2，3，6)。需要6个反向VL引物、8个VH反向引物、1个VL正向引物和2个VH正向引物。设计正向引物以使其退火至接近V区3′末端的恒定区序列[26]。所述VH和VL反向引物包含一个用于克隆的NotI位点和一个编码接头的有义序列。所述接头是14个残基的柔性肽。SfiI和NotI位点是难得的切割体，在限制酶切消化步骤中使文库多样性的损失最小。在完成PCR之后，从琼脂糖凝胶上切下正确尺寸的扩增cDNA带，使用Geneclean II(BIO 101)提取，并通过EtBr荧光(λem为590nm，λex为302nm)定量测定。通过重叠延伸连接VL cDNA种和VH cDNA种类，即退火接头的有义序列和反义序列，并用Taq补平两条链。在进行连接反应之前，通过琼脂糖凝胶电泳和Wizard试剂盒(Promega)纯化单个的cDNA种类。
克隆和噬菌体呈现：然后将所述文库克隆到噬菌粒载体pCANTABhis6中[27]。所述载体包含以下序列元件：限制位点、一个信号肽、一个基因3结构肽、在插入片段和基因3之间的一个终止密码子(琥珀密码子)、一个c-myc肽标记、组氨酸六聚体、一个IPTG可诱导的lac启动子和一个氨苄青霉素抗性基因。所述琥珀密码子根据宿主株系(HB2151细胞识别琥珀密码子为终止密码子和TG1细胞识别琥珀密码子为Glu)，允许可溶性V区分泌，或者允许其在噬菌体表面作为p3-融合蛋白表达。用SfiI和NotI顺序消化所述cDNA和所述载体，接着使用T4 DNA连接酶连接。通过电穿孔转化宿主细胞，在卡那霉素中选择克隆，使用位于插入片段的载体上游和下游的引物，通过PCR证实在单独的菌落中所述插入片段的存在，所述插入片段在0.7kb产生EtBr染色的带。加入辅助噬菌体(VCSM13)使得可以由TG1细胞培养物包装噬菌体颗粒。在所述培养物上清液中的颗粒用4％PEG沉淀两次，产生准备用于下文描述的选择步骤的噬菌体。
选择结合EGFR的Fv：以在PBS中约5μg/ml的浓度用exEGFR包被聚苯乙烯平板。在除去未结合蛋白并饱和非特异性蛋白结合位点之后，将所述平板和所述噬菌体制备物温育。通过大量的洗涤除去未结合的噬菌体，使用pH3.0的缓冲液洗脱结合的噬菌体颗粒。
催化性VL区和杂种FV文库：通过连接VL区和来自结合EGFR的FV文库的VH区，制备杂种FV文库，所述VL区已经证实具有分离自未免疫小鼠的催化活性(克隆U24[15])。如上通过PCR再扩增VL区cDNA，只是所述正向引物包含引导克隆到所述载体中的一个NotI位点。使用上述的VH引物，由结合EGFR的FVcDNA文库再扩增VH区，除了所述正向引物包含一个接头反义序列。如上进行VL/VH连接。
可溶性FV的表达和纯化：在HB2151细胞中培养来自选择的克隆的噬菌粒DNA。周质提取物包含2-10mg/l的重组蛋白。在镍琼脂糖凝胶(Qiagen)上层析。用0.5M的NaCl缓冲液除去未结合的蛋白。于pH5或用咪唑洗脱重组抗体。第二轮的金属亲和层析提供纯的重组蛋白，通过SDS电泳、等电聚焦、Mono-Q层析和N末端氨基酸测序对其评价。通过凝胶过滤(Superose 12柱)，并通过用固定化抗-c-myc抗体免疫吸附[14]，来分析每批的纯化蛋白，以证实催化活性属于所述抗体片段。使用梯度FPLC系统进行层析步骤。在内布拉斯加大学医疗中心的蛋白质结构中心研究室(Protein Structure Core Facility)使用电泳凝胶印迹，进行氨基酸测序。
催化剂选择试剂：制备两种能够与亲核性丝氨酸残基共价反应的化合物。第一种化合物氟磷酸(FP)双功能试剂类似于在先前的研究中列出的抑制抗体催化活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂DFP。因为DFP在水中的稳定性差，所以其直接连接于用于噬菌体吸附的固相支持体上是不实际的。使用包含FP基团(其与类似于生物素的亲和性标记缀合)的双功能试剂，该试剂允许在抗生物素蛋白包被的固相上的缀合物固定化。FP酯与用N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素蛋白(NHS-LC生物素蛋白II，Pierce Chemical Co.，图6中的1)反应，所述生物素蛋白还引入了长间隔区，以使位阻作用最小化。通过用NHS-LC生物素蛋白II(1)酯化磷酸二酯2进行合成。通过用二氯异丙基磷酸磷酸化4-三异丙基甲硅烷氧基-2-丁醇，接着对一氯磷酸中间体水解和去保护，得到化合物2。在最后一步通过用二乙基氨基磺酰基三氟化物(DAST)处理，实现向氟磷酸3的转化。试剂3应当被保存在二烷或其它有机溶剂中，以减少自反应的可能性。然后将等份的有机溶液转移到含有噬菌体的水溶液中，以获得有效浓度为0.1至0.5mM的3。在试剂3的化学自反应性对于实际应用太严重时，我们也可以考虑荧光素标记作为生物素蛋白的一个替代方法。荧光素包含一个酚羟基和一个羧酸酯，其应当与氟磷酸相容。用磷酸衍生物4(通过用戊二酸酐处理2可获得)酰化荧光素，以形成一个与其苯胺基的酰胺键合。通过用DAST处理实现在磷上的氟化，以获得5。参阅图6。
还制备了一种肽醛基质作为捕获丝氨酸蛋白酶位点的工具。用碳化二亚胺活化市售可得的含精氨醛(arginal)的配体抗蛋白酶(N-[-N-羰基-Arg-Val-Arg-al]-Phe)，并通过Phe残基的羧基使其共价连接到AH-Sepharose 4B(Pharmacia)的氨基残基上。合成方法是常规的，已经由Pharmacia详细说明。
催化性FV的选择：使FV噬菌体文库通过上文所述的固定化丝氨酸蛋白酶捕捉试剂。通过大量的洗涤除去未结合的噬菌体。用0.1M的甘氨酸-HCl，pH2.2(其足以破坏生物素-抗生物素蛋白和荧光素-抗荧光素的相互作用)进行结合噬菌体的洗脱。也可以使用0.1-1M的羟胺进行洗脱，以解离磷酸-丝氨酸键合。用弱酸性缓冲液(pH4.5)进行所述肽醛基质的洗脱，该缓冲液有助于分解半缩醛加合物。通过在TG1细胞中培养，扩增由丝氨酸蛋白酶结合基质中回收的噬菌体颗粒，然后如同上文对选择结合EGFR的FV的描述，对结合固定化exEGFR的噬菌体颗粒进行选择。
筛选催化活性：筛选切割exEGFR、CRAA-EGFR肽和非特异性肽酶底物Pro-Phe-Arg-甲基香豆酰胺(MCA)的FV片段。已经开发了一种根据其金属结合能力容易纯化大量抗体克隆的方法。在配有硝化纤维素滤膜的96孔平板中温育细菌上清液和镍-琼脂糖凝胶，通过用中性pH缓冲液洗涤去除未结合物质，并用pH为5的缓冲液将结合的V区洗脱到捕捉板中。Millipore多筛选设备可以快速处理。中和洗出液，并加入Pro-Phe-Arg-MCA(500μm)、[125I]exEGFR或[125I]EGFR(tyr，294-310)(约30,000cpm)。使用读板仪(λex为360nm，λem为470nm；切割连接Arg至氨甲基香豆素的酰胺键产生增加的荧光)测定肽-MCA底物的水解。所述肽-MCA底物可从市场上购买。EGFR(tyr，294-310)是对应于EGFR的残基294-310和一个酪氨酸残基的19个残基的合成肽，所述酪氨酸残基置于N末端，以便允许125I放射性标记。通过标准的氯胺-T法制备125IexEGFR或[125r]EGFR(tyr，294-310)。分别在一次性凝胶过滤柱上或在反向HPLC柱上除去游离的125I。通过使用PHAST系统(Pharmacia)经非还原性SDS-电泳(4-15％凝胶)，接着通过使用Kodak XAR胶片的放射自显影和使用程序造影定量扫描条带面积，测定exEGFR切割。该反应明显没有105kD的条带，而出现较小的放射性片段。只是在定量测定处于X光胶片的线性响应范围内的条带时务必仔细。通过检测表现为溶于10％三氯乙酸中的放射性，测定[125I] EGFR(tyr，294-310)的切割。TCA沉淀步骤类似于先前描述的测定VIP切割的步骤[3]。通过与在C-18柱上的反向HPLC对比验证所述方法。如果遇到困难，则可以在25％PAGE凝胶上进行电泳，以区分完整的肽和其片段，如同先前对VIP的描述[28]一样。对照为来自用没有cDNA插入片段的载体或编码非催化性FV的cDNA转化的细菌的洗出液。如在[25]中描述的使用抗-c-myc抗体的斑点印迹法可以定量测定所述重组蛋白。
根据对EGF结合的抑制进行筛选：在96孔平板上使用我们先前公开的方法[15，18]，筛选影响125I标记的EGF与A431细胞结合的选择的克隆：将所述细胞(1×105细胞/孔)放置于孔中，并使其附着于固相，加入125I标记的EGF (Amersham)和FV溶液(约1nM)，将反应混合物温育60分钟，在冰冷的结合缓冲液中洗涤各孔三次，对各孔进行结合的125I标记的EGFR的计数。对照包括在没有FV的情况下和在过量竞争者exEGFR存在下进行的结合测定。
评价催化特性
进行免疫印迹切割测定，以证实所述切割反应不是由于与exEGFR的放射性标记相关的假象。用所述催化剂处理约1μg纯化的exEGFR一段合适的时间长度，接着进行SDS-PAGE。将凝胶印迹到硝化纤维素上，并用多克隆兔抗-exEGFR继之以抗兔IgG-过氧化物酶染色。可免疫染色的完整exEGFR的缺乏和可免疫染色的exEGFR片段的出现表明exEGFR切割。
动力学：根据通过SDS电泳和放射自显影看到的条带强度，计算与增加量的未标记的exEGFR混合的放射性标记的exEGFR的抗体催化水解的初始速率。由完整底物条带的强度测定exEGFR切割的速度，而由每个产物条带的强度测定单个反应的速度。由适合Michaelis-Menten公式{v＝(Vmax×[S])/(Km+[S])}的速率数据计算动力学常数(Km，kcat)。还使用合成exEGFR肽(一种其中只有一个单一肽键被切割的肽)作为底物进行动力学研究。使用这样一种底物将消除与多个同时反应相关的复杂度。如上所述测定这种底物水解的动力学，除了使用反向HPLC分离产物。通过测定在214nm观察到的产物峰之下的面积进行定量测定。
切割位点：为鉴定由抗体切割的肽键，电泳纯的exEGFR与所述催化剂温育一段时间，使其足以产生约100皮摩尔的产物片段，该片段通过聚酰胺凝胶电泳分离，在PVDF膜上印迹，并在UNMC蛋白质结构中心研究室通过N端Edman降解对固定化蛋白测序。对照包括与无活性的FV温育的exEGFR和没有与FV温育的exEGFR。每个片段鉴定至少5个N端残基，以使所述切割位点明确排布。如果必要，即如果N端被封闭，则考虑用胰蛋白酶绘图和FAB-质谱测定法鉴定产生的片段。
底物特异性：测试以下底物连同exEGFR的切割：(a)125I-溶菌酶；(b)125I-甲状腺球蛋白；(c)125I-IgG；(d)125I-VIP；和(e)各种肽-MCA缀合物。测定这些底物水解的方案是相称的。通过氯胺-T法用125I标记纯化的人甲状腺球蛋白、母鸡溶菌酶(Sigma)和来自血清的人IgG，并通过凝胶过滤纯化[2，4]。在放射性标记的蛋白与所述抗体温育后，对反应混合物电穿孔。放射自显影使产物显现为较小尺寸的条带(完整的甲状腺球蛋白(单体)、溶菌酶和IgG的质量分别为：330kD、15kD和150kD)。以表现为溶于TCA中的放射性的量检测VIP切割，或通过反向HPLC分离[2]检测VIP切割。通过荧光测定法检测包含与带电氨基酸(Arg、Lys、Asp)、不带电氨基酸(Leu、Ala)和大氨基酸(Phe)连接的MCA的底物的切割。
从用EGFR肽的共价反应性抗原类似物免疫的小鼠中分离特异性EGFR切割催化剂
如先前所述，在自身免疫病中催化性抗体合成增加。为产生高效的催化剂，通过用EGFR肽的共价反应性抗原类似物CRAA(EGFR-CRAA)免疫，进一步攻击免疫系统。该抗原类似物用来增加种系V基因编码位点的募集，以合成EGFR特异性催化抗体。而且，CRAA-EGFR还将根据由体细胞法(即V/D/J重排和体细胞超变)形成的任何丝氨酸蛋白酶样催化部位进行选择。
CRAA-EGFR的关键结构特征为：(a)在催化性抗体中能够结合亲核性丝氨酸残基的四面体的亲电子三价磷原子；和(b)在所述三价磷原子的N端侧的赖氨酸残基，所述磷原子能够结合特化以在所述碱性残基的C端侧切割的催化部位；和(c)分别在CRAA结构的N端侧和C端侧的10个和7个氨基酸，对应于EGFR的残基294-310的序列。
所述三价磷原子用作连接EGFR中残基303和304的易裂肽键碳原子的类似物。在图4中显示的苯酯结构中，所述磷原子获得部分正电荷，就象所述易裂肽键碳原子具有其与亲核性丝氨酸残基反应所需的部分正电荷。先前已经描述了肽的邻苯基磷酸酯能够通过与活性部位丝氨酸残基的氧原子形成共价键，使各种丝氨酸蛋白酶不可逆地失活[29]。Sampson和Bartlett[23]已经建立了在所述三价磷原子上制备苯酯以及连接位于膦酸酯侧翼的肽序列的化学合成方法。
应当注意到，以上描述的CRAA-EFGR不同于先前的用于产生酯酶抗体的膦酸TSA[13]。常规的膦酸TSA包含连接于所述三价磷上的阴离子氧，它能够结合在所述催化剂中发现的氧阴离子空穴。然而所述膦酸TSA不与在催化部位中的亲核性丝氨酸残基反应。
在CRAA-EGFR的P1位加入碱性残基，以利用存在于抗体中的种系编码的碱性残基特异性的催化部位。存在所述碱性残基与磷酸苯酯结构一起促进与催化部位的紧密结合，并因此提高了CRAA-EGFR选择性刺激合成催化部位的B细胞克隆增生的能力。
在CRAA-EGFR中加入EGFR残基294-310，以促进具有EGFR特异性催化活性的抗体的合成，这与非特异性催化活性相反。已经选择了这个表位，因为它是EGFR的结构域III的一个元件，是组成EGF结合位点的残基的主要组成部分[30]。参阅图4。而且，描述了在此序列N端区的插入诱变导致EGF结合降低。正如先前所论述，所述EGF结合位点由非连续的残基组成。因此，由在位置303-304的预期切割引起的构象破坏可能还间接导致损害EGFR功能。
由用CRAA-EGFR超免疫的MRL/lpr小鼠制备FV噬菌体呈现文库。通过ELISA检测能够结合CRAA-EGFR的高亲和性血清抗体的存在，以证实小鼠建立了强烈的抗体应答。FV文库的制备和选择基本上如[25]所述，除了使用固定化CRAA-EGFR进行噬菌体的选择。如上文所述进行催化活性的筛选。所述底物是一种18个残基的肽，它包含在N端的一个酪氨酸残基，继之以对应于EGFR的位置294-310的17个残基。在远离预期切割位点的位置定位所述酪氨酸残基，以使对FV识别的干扰最小化。另外，使用存在于功能性EGFR蛋白的残基294-310的构象表位进行exEGFR切割的筛选。
通过ELISA测定所述催化剂对CRAA-EGFR的结合亲和性。测定增加浓度的CRAA-EGFR对EGFR(294-310)切割的抑制。CRAA-EGFR将用作竞争性替代底物，其Ki值接近于由结合测定评价的Kd值。
鉴定通过切割EGFR(294-310)和切割exEGFR产生的产物片段，来推断切割位点。如果发生催化活性的募集主要是由于CRAA-EGFR中的苯基磷酸酯(phenylphosphonate ester)结构，那么两种底物都应该主要在连接残基304和304(Lys-Lys)的肽键处被切割。如上所论述，通过用基态抗原免疫可以合成抗原特异性催化剂。因此，也应当鉴别能够在不是303-304键的肽键处切割EGFR(294-310)的催化剂。在Arg300-Lys301键处发现了一个可能的切割靶位，因为存在于预免疫的所有组成成分中的种系编码的活性识别碱性残基。
以上描述的方法提供了一系列高亲和性、高周转的催化性抗体，所述抗体于残基303-304处识别和切割EGFR，并诱导EGF结合活性的丧失。在免疫原中包含EGFR残基294-310确保了对EGFR高亲和性的抗体的募集。苯基磷酸酯(phenylphosphonate ester)结构的包括诱导具有在结构上最佳化的丝氨酸蛋白酶催化部位的抗体的克隆选择。因此，通过实行本文概述的EGFR-CRAA策略，合成优于在MRL/lpr小鼠中产生的那些催化剂的催化剂。
体内的生物分布和抗肿瘤作用
为评价体内的生物分布和生长作用，已经使用带有人肿瘤的无胸腺小鼠作为模型研究肿瘤定位和各种药物、毒素和抗体的抗肿瘤作用。
比较六个最有希望的催化性FV构成物和一个在带有肿瘤的小鼠中的非特异性FV构成物的生物分布。在初步研究中证实125I放射性标记的FV构成物结合和切割靶抗原的能力。计算所述FV构成物的组织对血液比率和肿瘤对血液的比率。进行成象研究，以对FV制备物的肿瘤特异性作进一步评价。在FV构成物中存在的催化功能可能导致它们由肿瘤细胞表面的解离增加，因为所述靶抗原的产物片段与催化剂的结合相比于完整的抗原很可能较弱。这可能造成所述催化剂的肿瘤：血液比率与非催化性FV相比较低。另一方面，如果FV内化到肿瘤细胞中的速率很快，则所述催化功能可能不影响FV的生物分布型式。进行肿瘤切片的放射自显影，以测定由肿瘤细胞内化FV构成物的程度。
评价具有良好生物分布型的靶抗原切割催化剂和非催化性FV和不相关的FV在无胸腺小鼠中抑制肿瘤细胞生长的能力。需注意肿瘤形成的时间(潜伏期)、发展成肿瘤的小鼠的数目和肿瘤的大小。通过细胞增生和细胞死亡的相对比率测定肿瘤生长。在细胞死亡中凋亡和坏死是截然不同的过程。EGFR被认为是程序性细胞死亡的重要调节物。用催化性FV构成物治疗可能导致肿瘤的完全退化，因为所述细胞可能免受EGFR对凋亡的负调节。通过免疫组织化学方法，检测由所述动物回收的肿瘤的恒冷切片的增生和凋亡标记，即ki-67、bcl2和bax。ki-67是存在于整个细胞周期中的增生相关抗原，是用于评价肿瘤细胞群生长部分的可靠标记。bcl2和bax标记有助于评价所述细胞是否注定要通过凋亡经历死亡。
总而言之，本发明的催化性抗体代表了一种用于治疗肿瘤疾病的有益的治疗剂。
实施例IB
在联合化学疗法方案中给予催化性抗体和反义p53
当细胞遭受到对其基因组的损伤时，在细胞中具有相称的机制，将决定所述细胞是否将尝试自我修复，或是否将经历程序性细胞死亡。为了使增生细胞有效进行基因组修复，必须使它们离开周期。这可以利用所谓的“细胞周期关卡”实现，它给予增生细胞修复基因组损伤的时间，而不是将其传递到子细胞。
图18说明了正常(野生型)p53在诱导细胞对基因组损伤的这两种可能反应的一种或另一种中的核心作用。对基因组的损伤导致p53的表达增加，这进而使得各种对该损伤产生特异性细胞响应的其它事件开始。
根据这些关系，有理由预期某些抑制p53功能的因子，诸如按照本发明制备的并和可以使抗体或抗体片段穿过细胞膜的方法共同使用的p53寡聚物(oligo)或p53催化性抗体，既可以阻断程序性细胞死亡，又可以根据可能天然发生的事件阻止细胞周期关卡的活化。使用作用于p53的上游或下游的抑制剂尝试阻断这两种细胞响应中的任一种由于涉及多重因素而成问题，参阅图18。
这些重要的认识形成了所提出的p53寡聚物和催化性抗体治疗癌症、局部缺血-再灌输伤害和脓毒性休克/SIRS的治疗用途的科学基础。
细胞机制的描述
在细胞分裂过程中，必须协调三个基本的过程并修复任何有关的错误：(1)必须复制中心体，然后分离；(2)必须形成有丝分裂纺锤体，使其附着于染色体并在分裂后期启动延伸和姐妹染色单体的分离；和(3)必须复制DNA和凝缩染色体，然后通过所述有丝分裂纺锤体将所述染色体分开至马上成为子细胞细胞相反的两端。
当监督系统检测到对基因组的损伤或潜在的损伤，包括任何在刚描述的天然过程中遭受的伤害时，它利用关卡在适当的位置中断细胞分裂。Hartwell和Weinhert如下操作性地定义了细胞周期关卡：当细胞周期事件B的发生依赖于先前的细胞周期事件A的完成时，如果可以发现减低所述依赖性的遗忘功能(loss-of-funetion)突变，则所述依赖性归因于关卡。
这种操作性定义已经在酵母细胞的研究中严格证实，其中已经描述了三个关卡：DNA损伤关卡、纺锤体关卡和纺锤极体(中心体等价物)关卡。所述DNA损伤关卡在细胞周期中的三个不同位置起作用，以便当检测到损伤时使增生停滞：Gl/S过渡(transition)和G2/M过渡，以及另一个监视通过S进展的位置。遗传研究已经鉴定了许多在酵母中的关卡组分，但是涉及的蛋白已被证明在功能上是多效性的，使其难以建立简单的因果关系。例如，正如Paulovich等人(1997)指出，DNA损伤关卡所需的基因也参与DNA修复、程序性细胞死亡和转录调节。酵母研究的结果随后外推至哺乳动物细胞，其中发现了同源组分(Hartwell等，1994)。
在一个关卡上细胞周期停滞所必需的许多基因在另两个关卡中的一个或两个中也是必需的。例如已经表明p53在所有三个关卡中都起关键作用(Cross等，1995；Fukasawa等，1996；Levine 1997)。Kastan和他的同事们(1991)首先证实了p53在响应于DNA损伤的G1/S过渡时刺激细胞周期停滞中的决定性作用，并由此得到广泛研究。Kastan研究小组检测到人ML-1成髓细胞性白血病细胞系似乎表达野生型p53(对外显子5至9测序，并表明是正常的)。用非致死量的γ辐射或放线菌素D治疗这些白血病细胞，引起G1/S和G2/M都停滞，这也适用于正常细胞。在ML-1细胞中，G1/S停滞与进行细胞周期停滞的p53水平瞬时增加3至5倍有关。发现咖啡因治疗既阻断对p53表达的诱导，也阻断Gl/S细胞周期停滞，这表明p53可能在响应于DNA损伤的Gl/S停滞中起作用。与此假说一致的是，没有野生型p53的细胞在γ辐射后不显示G1/S停滞。
在随后的研究中，Kastan研究小组使用实体瘤细胞系加强他们的假说(Kuerbitz等，1992)。在没有p53表达的癌细胞系中，在诱导型启动子的控制下引入野生型p53表达，使细胞在γ辐射后经历G1/S细胞周期停滞。另外已经表明，引起DNA链断裂的因子诱导p53和周期停滞，但仅掺入到DNA中的诸如抗代谢物的因子并不能诱导p53和周期停滞(Nelson和Kastan 1994)。
Kastan研究小组和其他人的研究已经清楚表明，一类医学上重要的因素可以引起活性氧种类(ROS)的产生，所述活性氧种类通过引起DNA链断裂导致p53依赖性过程的激活。这些因素包括各种抗癌疗法，诸如电离辐射和阿霉素，以及包括一氧化氮的天然介质。
已经研究了有丝分裂纺锤体抑制剂(包括某些癌症化疗剂)对取自具有p53基因剔除的小鼠的细胞的作用。在处理后，细胞由于经受多轮DNA合成而没有完成染色体分开，成为四倍体或八倍体。相反，正常小鼠细胞在处理后经受G2/M细胞周期停滞。在没有纺锤体抑制剂的情况下，来自p53基因剔除小鼠(而不是正常小鼠)的细胞的50％通过7次传代成为四倍体。对p53基因剔除小鼠的组织的检查也显示四倍体细胞的存在，这证明了用来自这些小鼠的细胞体外研究获得的结果不是一种培养假象。这些观察结果证实了较早的表明p53的丢失或失活和四倍性或非整倍性之间有关联的报道。同样地，Fuksaswa等人(1996)证明了来自p53基因剔除小鼠的细胞产生不正常数目的中心体。这似乎解释了为什么来自p53基因剔除小鼠的培养细胞会在培养中越来越多地成为非整倍体，而在相同的时间段，来自具有完整p53的小鼠中的细胞仍为二倍体。Brown等人(1994)发现p53与分离自培养细胞的中心体共纯化，这表明p53可能在这些细胞器的调节中起直接作用。
如图18所示，p21是响应于基因组损伤的p53依赖型细胞周期停滞的关键介质。p21结合至许多细胞周期蛋白和依赖于细胞周期蛋白的激酶(cdk)复合物，以及结合至增殖细胞核抗原(PCNA)。正常水平的p21对于形成细胞周期蛋白-cdk复合物似乎是必需的，该复合物又对于细胞周期前进(progression)是必需的(El-Deiry等，1993)。然而，增加由p53活化产生的p21水平，通过干扰这些复合物的功能和干扰PCDA，阻断了细胞周期前进。至少在某些情况下，响应于基因组损伤的、由p53正调节的另一个基因GADD45，也可以在G1/S过渡点实行细胞周期停滞(Marhin等，1997)。
另一方面，基因组损伤可以导致依赖于p53的程序性细胞死亡诱导，而不是细胞周期停滞和修复。例如，Clarke等人(1993)已经表明，取自组成上纯合的p53基因缺失小鼠的胸腺细胞抵抗由γ辐射或鬼臼亚乙苷对程序性细胞死亡的诱导，而不抵抗由糖皮质激素或钙对程序性细胞死亡的诱导。p53缺失杂合的小鼠相对来说也抵抗引起DNA链断裂的介质，但低于纯合子。相反，来自具有完整p53的小鼠的胸腺细胞响应于所有这些处理经受程序性细胞死亡。
如果用实验方法引入野生型p53蛋白表达，那么经常发现不表达野生型p53的癌细胞经受程序性细胞死亡。为尝试获得关于p53怎样能够诱导程序性细胞死亡的机械论解释，已经提供了一个模型系统。然而，必须考虑到使用下述细胞系可能产生使人误解的结论，该细胞系已经消除了野生型p53功能，其后具有用实验方法组成型表达的野生型p53，以创建一个分析内源性野生型p53功能的模型。
Johnson等人(1996)首先证明了ROS可以用作依赖于p53的程序性细胞死亡的下游介质。他们使用具有在强启动子的控制下的人p53cDNA的腺病毒载体，在培养的人或大鼠的平滑肌细胞(SMC)中产生高水平的人野生型p53表达。p53在两种细胞类型中都以相等水平表达，但只在人细胞中诱导程序性细胞死亡。在感染的八天中，发现基本上所有的过量表达p53的人SMC都死亡。动力学研究证明，在具有p53的病毒感染后4小时，在SMC中的p53和ROS的水平增加。三种不相关的抗氧化剂显示阻断ROS产生，但不阻断p53过量表达，并显示阻断程序性细胞死亡的诱导。可以断定p53表达的增加至少在某些正常细胞类型中足以诱导程序性细胞死亡，而ROS是该诱导的下游介质。
Vogelstein研究小组(Polyak等，1997)使用一种腺病毒载体，以在具有失活的内源p53基因的人DLD-1结肠癌细胞中引起野生型p53的表达。在病毒感染后16小时和证明程序性细胞死亡前8小时，由这些细胞纯化RNA。使用允许定量评估细胞mRNA群体的SAGE技术进行分析。鉴定出约8,000个转录物。其中，在表达p53的细胞中14个很显著(高出10倍)，26个明显更丰富。鉴定出了14个最高度诱导基因中的13个，并发现几个基因编码影响细胞的氧化还原状态的蛋白。
该小组假定，p53可能通过刺激ROS产生诱导程序性细胞死亡。研究人员使用荧光探针检测细胞内ROS水平，发现用具有p53的病毒感染后诱导ROS产生，随着程序性细胞死亡的进行，ROS水平持续增加。用强氧化剂甲萘醌或过氧化氢处理DLD-1细胞，仅诱导14个基因中的一个基因p21的表达，这证明该组基因不仅仅由ROS表达诱导。这些基因既不是由用消炎痛处理细胞而诱导，也不是由用神经酰胺处理细胞而诱导，在没有p53表达的情况下这两种介质都可以诱导程序性细胞死亡。
时程实验表明，在p53转录激活氧化还原控制基因的过程中的一系列事件，引起ROS产生导致对线粒体的氧化损伤，继而引起细胞死亡。用特异性药剂抑制这些步骤中的每一步证明了在序贯事件之间的因果关系。
这些发现给出了以下的在DLD-1细胞中p53诱导的程序性细胞死亡的三步模型：(1)p53转录激活包括氧化还原酶的特定基因亚群；(2)诱导的蛋白总的来说引起ROS水平的增加；和(3)ROS损伤线粒体，引起钙和其它组分的渗漏。这些组分刺激ICE样酶家族的成员，所述成员一贯参与程序性细胞死亡的末期事件。
在不同的细胞类型中，在响应于基因组损伤由野生型p53转录正调节的基因方面，似乎有一些变异性。其中两个是Bax和GADD45，Bax是BCL-2家族的一个成员，已经表明其有时参与依赖于p53的程序性细胞死亡的诱导，GADD45的产物结合PCNA，并因此能够引起细胞周期关卡停滞。例如McCurrach等人(1997)发现，在初级成纤维细胞中，Bax是由化学疗法诱导的依赖于野生型p53的程序性细胞死亡的效应子之一。在该研究中，发现野生型p53转录激活Bax。然而，在先前由Polyak等人(1997)论述的研究中，无论是Bax还是GADD45，都没有发现它们的基因由野生型p53诱导。Strobel等人的研究(1996)证明了Bax在响应于由化学治疗引起的细胞损伤而诱导程序性细胞死亡中的潜在重要性。该小组将具有Bax cDNA的表达载体转染到没有功能性p53的SW626卵巢癌细胞系中。转染子显示Bax表达的增加平均比对照细胞高10倍。当所述化学治疗剂为紫杉醇、长春新碱或阿霉素时，在化学疗法处理后在Bax转染子中的诱导程序性细胞死亡的阈值显著降低，但当所述治疗剂是卡铂、鬼臼亚乙苷或羟基脲时则没有降低。
另外的涉及表达野生型p53、并在用阿霉素处理后经受或增生停滞或程序性细胞死亡的癌细胞系的研究表明，上述14个基因中的多数在引入p53之后在DLD-1细胞中被高度诱导，并在引起细胞周期停滞的较低药物剂量下和引起程序性细胞死亡的较高剂量下受到正调节(Polyak等，1997)。作者推测，在决定细胞是经受周期停滞还是经受程序性细胞死亡中的决定性因素是细胞处理氧化胁迫的能力。换句话说，处理氧化胁迫的能力低的细胞经受程序性细胞死亡，而抗性较强的细胞经受周期停滞。
细胞经受的氧化胁迫的水平与基因组损伤后细胞趋向于经受依赖于p53的程序性细胞死亡而不是趋向于经受细胞周期停滞和修复正相关。Lotem等人(1996)研究了在髓细胞白血病细胞中氧化胁迫和细胞因子对这些现象的作用。抗氧化剂和某些细胞因子显示了对这些细胞的协同保护，以抵抗由细胞毒性化合物诱导的程序性细胞死亡。然而，用过氧化氢治疗增加了氧化胁迫，增加了细胞死亡程序的发生，并提高了防止程序性细胞死亡需要的保护性细胞因子治疗的水平。
已知水杨酸抑制参与应缴反应的蛋白激酶和转录因子的活化。Chernov和Stark(1997)发现，水杨酸可逆地抑制野生型p53与DNA的结合，并因此在用阿霉素(toxorubicin)或辐射处理后抑制p53诱导p21转录和程序性细胞死亡的能力。如果在DNA损伤的60个小时之内洗涤出所述水杨酸，则受抑制的依赖于p53的事件能够继续进行至完成。
在某些情况下在基因组损伤后影响野生型p53是诱导细胞周期停滞还是诱导程序性细胞死亡的一个因子是c-myc。Saito和Ogawa(1995)研究了组成型表达c-myc而不表达p53的大鼠肝细胞癌细胞系FAA-HTCl。在这些细胞中的c-myc表达受到反义L CHK2HR寡核苷酸的有效抑制。通过将具有野生型p53 cDNA的地塞米松诱导型表达载体转染到这些细胞中，实现野生型p53的表达。结果表明，野生型p53可以根据c-myc的状态，在上述细胞中或者作为细胞周期停滞的诱导物起作用，或者作为程序性细胞死亡的诱导物起作用。在一部分细胞中野生型p53的表达导致对程序性细胞死亡的诱导，但不抑制存活细胞的增生。如果c-myc的表达受到抑制，那么野生型p53的表达引起对细胞增生的抑制，但不诱导程序性细胞死亡。通过其它的能够诱导程序性细胞死亡的诱导物也已经显示了c-myc的不可调型表达(Evan等，1992；Hoang等，1994；Lotem和Sachs1993)。
另外的研究已经表明，在某些情况下野生型p53诱导程序性细胞死亡，而不先引起其它基因的表达。在这些情况下，依赖于野生型p53的程序性细胞死亡在分别阻断RNA和蛋白合成的放线菌素D或环己酰亚胺的存在下发生(Caelles等，1994)。例如已经表明，将没有p53结合DNA所需的末端p53氨基酸残基的p53表达载体引入到海拉细胞中，产生依赖于p53的程序性细胞死亡(Haupt等，1995)。然而，该发现没有足够的理由支持p53与转录无关的假定，p53可以影响转录的唯一途径是通过直接结合至基因本身的调节元件。这些发现以及相似的发现(Sabbatini等，1995)已经用来支持p53可以诱导程序性细胞死亡而不影响转录的理论。
因此，很可能野生型p53可以通过转录激活特定的基因组、通过直接的蛋白-蛋白相互作用或通过这些方法的组合，诱导程序性细胞死亡。然而，程序性细胞死亡的诱导不一定需要野生型p53的表达。这可从对p53基因剔除小鼠正常发育的观察以及可以诱导没有野生型p53的细胞经受程序性细胞死亡的事实明显看出(Clarke等，1993)。
如图18所示，可以引起程序性细胞死亡的多种途径汇合利用一个共同的终末阶段(terminal phase)，该阶段涉及白介素1-β-转化酶(ICE样)家族。该酶家族目前已知包含11个成员，可以分为以下三个亚家族：ICE亚家族、CPP32亚家族和称为caspases的Ich-1亚家族(Boldin等，1996；Chinnaiyan等，1996；Duan等，1996a & 1996b；Fernandes-Alnemri等，1996；Lin和Benchimol 1995；Lippke等，1996；Muzio等，1996；Wang等，1996)。例如Sabbatini等(1997)详细研究了ICE家族酶在依赖于p53的程序性细胞死亡发生中的作用。他们证明了ICE样蛋白酶CPP32的肽抑制剂在幼龄大鼠肾细胞系中，抑制由通过实验方法在这些细胞中表达野生型p53诱导的细胞死亡程序。
野生型p53似乎还可以加强ICE家族酶引起程序性细胞死亡的能力(Jung和Yuan 1997)。例如，当用具有ICE样酶的cDNA的表达载体转染COS-1细胞时，在所述COS-1细胞中使野生型p53的功能失活，使所述细胞免于经受程序性细胞死亡，而转染正常COS-1细胞使它们经受死亡程序。将具有或ICE样酶或温度敏感型p53突变体的表达载体都转染到具有无活性的内源性野生型p53的COS-1细胞中。在允许野生型p53起作用的温度下，ICE样酶引起程序性细胞死亡的能力明显增强。另一个实验表明，野生型p53通过所述酶加强程序性细胞死亡诱导的能力由Bax介导。
治疗癌症的OL(1)p53
在临床应用中的所有癌症疗法都以剂量依赖方式通过诱导程序性细胞死亡杀死癌细胞。在某些情况下，已经表明这种程序的诱导是依赖于野生型p53的。在较低剂量下，许多引起基因组损伤的药物影响具有野生型p53的细胞中对关卡的诱导。所述关卡暂时停滞细胞增生，为修复被损伤的细胞提供了时间。
研究者近来的研究(该研究没有涉及OL(1)p53的研制)对以下问题提供了一个合理的解释：即为什么抑制野生型p53的表达可以增强许多抗癌疗法对具有一个依赖于完整的野生型p53的细胞周期关卡的类似的癌细胞的杀死作用。证据显示，当所述细胞周期关卡不能约束(engage)后面的对基因组的治疗性损伤时，癌细胞在没有有丝分裂的情况下持续复制它们的DNA，导致诱导程序性细胞死亡。治疗的重要结果在于，在阻断的关卡方面，抗癌疗法在杀死癌细胞方面变得更加有效。
在一些研究中，通过使用遗传学方法剔除野生型p53的表达，或者剔除一个其下游效应子(尤其是p21)的表达，防止关卡的约束。假如这些中断的性质不可逆，那么很明显在这些情况下不需要野生型p53诱导程序性细胞死亡。在其它的实验中显示，甲基黄嘌呤衍生物与中断野生型p53途径的药物协作，进一步加强癌细胞对抗癌药物的敏感性，所述甲基黄嘌呤衍生物诸如己酮可可豆碱或蛋白激酶C抑制剂UCN-01(7-羟基星形孢菌素)，它们都抑制G2关卡功能。
与野生型p53的这种作用一致的是，p53寡聚物和OL(1)p53尤其可以协同加强损伤基因组的药物杀死癌细胞的能力。而且，在对癌细胞产生最大致死作用最佳的剂量下，OL(1)p53和抗癌药物组合不杀死测试的正常细胞类型。
当诸如OL(1)p53或天然磷酸二酯寡聚物的硫代磷酸酯寡聚物结合细胞时，它们诱导细胞通过环加氧酶依赖性机制增加它们的氧自由基的产生。在20％(大气)氧中进行的正常细胞培养比在降低的氧张力中进行的培养效果更加显著。这些自由基可以引起基因组损伤，此现象可以解释为什么OL(1)p53在正常组织培养物中杀死癌细胞而不需要加入能够引起基因组损伤的化合物(诸如癌症化学治疗剂)，以及为什么只要不加入损伤基因组的药物，OL(1)p53就不杀死在类似于体内存在的氧水平下培养的癌细胞。用诸如OL(1)p53的寡聚物预处理的癌细胞可以用一定剂量的损伤基因组的药物杀死，所述药物在没有p53寡聚物的情况下不毒害所述细胞。据估计，诸如己酮可可豆碱或UCN-01的G2抑制剂甚至可以进一步增强这种协同作用，所述G2抑制剂当用于处理野生型p53功能被损害的癌细胞时，比处理那些具有完整p53功能的癌细胞更有效。
因为硫代磷酸酯是DNA类似物，所以对DNA具有亲和性的癌症化学治疗剂可能与其结合。使用OL(1)p53验证此观点，显示所述OL(1)p53紧密结合米托蒽醌，但不结合去甲氧柔红霉素或柔红霉素。米托蒽醌和所述寡聚物之间的相互作用显著降低了化学治疗剂对不表达野生型p53的癌细胞的毒性作用。
在另一个寡聚物-药物相互作用的研究中，已知与硫基团(sulfurgroups)反应的对乙酰氨基酚的生物活性代谢物显示结合包括OL(1)p53在内的硫代磷酸酯寡聚物。此相互作用可以使OL(1)p53失活，并应当在进一步的临床实验之前被测定。
在包括恒河猴的几个物种中进行的药理学和毒理学研究证明，OL(1)p53具有有助其用作系统治疗剂的药代动力学特性，以及所述寡聚物甚至在远超出预期的治疗水平的剂量水平下也是无毒的。测序和细胞培养研究表明，如同在人细胞中的表现一样，OL(1)p53在猴细胞中也抑制p53表达。然而，所述寡聚物对来自低等动物的细胞和组织没有任何特异性作用。
在患急性髓细胞白血病或骨髓发育不良综合征的患者中进行作OL(1)p53为单一药物的I期临床实验。通过连续输注超过10天给予所述寡聚物，结果表明，在预定产生治疗水平的剂量范围内所述寡聚物是无毒的。没有见到完全的反应。
将就在开始OL(1)p53给予之前和在输注过程中的不同时间取自患者的恶性细胞置于20％氧中培养。与来自未治疗患者的外周白血病母细胞相比较，在OL(1)p53输注开始后取出的那些细胞随着输注到患者中的OL(1)p53的量的增加而更快死亡。同样地，由白血病患者或骨髓发育不良患者产生的长期骨髓培养物证明，随着输注到供体中的OL(1)p53量的增加，产生恶性细胞的能力显著降低。此抑制在治疗后持续几个月，而没有任何表明该作用是可逆的证据。
OL(1)p53临床实验结果与实验室数据一致，这强有力地表明为了使所述寡聚物在患者中起作用，所述寡聚物必须和损伤基因组的抗癌剂结合使用。在所述临床实验中使用来自患者的细胞分析细胞培养物的数据，也与此假设一致。当癌细胞置于20％氧中培养时，所述寡聚物诱导这些细胞产生作为损伤基因组的药物的ROS。
由以上论述可以得出，例如用p53寡聚物阻断p53的表达，则可以导致防止：(1)提供尝试修复的时间的细胞周期停滞，和(2)依赖于p53的程序性细胞死亡。因为许多癌症疗法引起基因组损伤，所以也期望它们可以在那些表达野生型p53的癌细胞中产生对野生型p53的诱导。实际上，已知X射线辐射、拓扑异构酶抑制剂、烷化剂、anthracycline、纺锤体抑制剂和某些抗代谢物都产生依赖于p53的细胞周期停滞(Cross等，1995；Kastan等，1991；Linke等，1996；Tishler等，1995)。对这种野生型p53诱导的抑制应当通过使损伤的基因组得到复制，导致产生机能障碍的细胞，以及诱导程序性细胞死亡，增加这些抗癌疗法对增生的癌细胞的毒性。
在Johns Hopkins和Pennsylvania大学的合作研究者的实验室已经发表了一系列论述此问题的出版物(McDonald等，1996；Waldman等，1996和1997)。在这些研究中使用等基因人结肠癌细胞系，只是在它们的p21状态上不同。使用同源重组由p21+/+细胞生产p21-/-细胞。通常，基因组损伤对p53的诱导导致p53在直接结合p21基因中作为转录因子诱导p21。然后新合成的p21结合细胞周期进展所需的蛋白，并阻断其功能，参阅图18。
这些研究中的第一个(McDonald等，1996)设法测定了当与p21+/+HCT116细胞比较时，p21-/-HCT116人结肠癌细胞是否具有DNA修复缺陷(两种HCT116克隆都具有野生型p53)。当用克隆发生存活实验鉴定时，发现p21缺陷型克隆对UV损伤的敏感性超出表达p21的细胞2到3倍。而且，与具有完整p21功能的细胞相比，p21-/-癌细胞自发产生6-TG-抗性集落的频率增加2至3倍，所述6-TG-抗性克隆表示hprt基因通过突变失活。这些数据表明，p21功能的丧失与细胞修复DNA损伤的能力下降有关联。
为进一步验证此观点，研究者将表达质粒转染到p21+/+HCT116或p21-/-HCT116人结肠癌细胞中。所述载体包含由巨细胞病毒报道基因驱动的β-半乳糖苷酶cDNA，并在转染前用或者UV辐射或者顺氯氨铂抗癌剂特意损伤。发现没有p21的HCT116细胞修复损伤的表达载体的效率比p21+/+HCT116细胞低3至5倍。将具有p21 cDNA的表达载体转染到p21-/-HCT116细胞中，使所述细胞的修复能力增加2至3倍。可以断定，抑制p21与PCNA相互作用、并因此阻止响应于DNA损伤的细胞周期停滞的药物可能与传统的引起DNA损伤的抗癌剂具有协同的细胞毒害相互作用。
在随后的研究中，研究者检验了某些损伤基因组的药物对p21+/+HCT116细胞和p21-/-HCT116细胞的作用(Waldman等，1996)。药物包括癌症治疗药阿霉素、鬼臼亚乙苷和γ-辐射以及拓扑异构酶-1抑制剂喜树碱(camptothecan)。在90个小时的治疗中，每一种都显示能够在引起p21+/+细胞经受的细胞周期停滞延长但细胞不死亡的浓度下，通过诱导程序性细胞死亡完全杀死p21-/-细胞的培养物。对p21-/-细胞的分析表明，在处理后将细胞简单地在G2中而不是在G1中阻断，然后在没有有丝分裂的情况下开始多轮DNA合成，产生的具有异常核形态的超二倍体细胞随后经受程序性细胞死亡。
使用DLD-1人结肠癌细胞系进行一组同样的实验，与HCT116系不同，所述DLD-1人结肠癌细胞系具有突变的p53，但在为二倍体方面类似于HCT116系。该作者推论p53突变细胞在DNA损伤后不表达p21，并且在功能上应当与p21-/-细胞等效。正如所预测的一样，在用阿霉素或γ-辐射处理后，DLD-1细胞几乎不表达p21，这证明一种关卡缺陷，导致与在HCT116系中终止程序性细胞死亡基本相同的一组形态学/生理学变化发生。
当使用具有突变p53的非整倍体人结肠癌细胞系进行这些实验时，发现用损伤DNA的药物处理这些系中的两个的效果，符合导致程序性细胞死亡的事件的相同模式。在第三个系中，先前存在的非整倍性足够宣布禁止任何关于在细胞死亡之前DNA含量明显增加的坚定结论。Waldman等人总结说“详细的分析证明，在DNA损伤后，程序性细胞死亡显然由在有丝分裂和S期之间的解偶联诱导。没有p21依赖性关卡的细胞在没有有丝分裂的情况下，持续经受多轮DNA合成，而不是经受相关的停滞，最后以多倍性和程序性细胞死亡终结”(第1034页)。
然而，该作者未能解释一个由他们的实验证明的重要观点。几个出版物已经指出，在具有野生型p53的细胞中由许多抗癌治疗诱导的程序性细胞死亡是依赖于p53的(Dronehower等，1992；Lowe等，1993；Symonds等，1994)。此外，一些具有野生型p53的癌细胞对于化学治疗可以比具有突变的p53的相似细胞更敏感(Aas等，1996；Lowe等，1993a和1993b)。然而，如同在HCT116 p21-/-细胞中一样，发现具有突变的p53的三个不同的结肠癌细胞系经受一系列相似的导致诱导程序性细胞死亡的事件，这表明在没有有丝分裂的情况下，由复制损伤的DNA导致的程序性细胞死亡是不依赖于野生型p53的。
HCT116的研究证明，依赖于p53/p21的细胞周期停滞的中断可以导致由抗癌治疗诱导的程序性细胞死亡的阈值降低，因为在p21-/-细胞中诱导程序性细胞死亡的剂量低于p21+/+HCT116细胞所需的剂量。因为p21+/+HCT116细胞和p21-/-HCT116细胞都表达野生型p53，所以这种诱导可能是依赖于p53的。如果基于依赖于p53的程序性细胞死亡机制，则DNA或基因组损伤诱导程序性细胞死亡的阈值水平在表达野生型p53的癌细胞中可能较低。然而，在没有p53的情况下，诱导不依赖于p53的程序性细胞死亡的损伤水平阈值可能更高。
因为OL(1)p53短暂抑制p53的表达，所以用这种寡聚物加上常规疗法治疗癌细胞，可以在抑制p53的时间过程中引起细胞周期关卡的中断，以及在恢复p53表达后引起依赖于p53的程序性细胞死亡。因此，OL(1)p53在使表达野生型p53的癌细胞对抗癌疗法敏化方面，比刚刚描述的涉及p53或p21基因剔除的方法更有效。
在该系列的第三个专论中提出的实验用来确定抑制细胞周期关卡是否能增加在无免疫应答动物中生长的HCT116人结肠癌细胞对γ-辐射的敏感性(Waldman等，1997)。由所述细胞系的p21+/+和p21-/-亚克隆建立异种移植肿瘤。在没有治疗的情况下，p21+/+和p21-/-肿瘤以几乎相同的速率生长。然后用或者7.5Gy或者15Gy的局部γ-辐射治疗每组12至17个具有约50mm2肿瘤的动物，随后每两周检测一次。辐射没有治愈具有p21+/+肿瘤的动物，并且在治疗后的几天中所有的p21+/+肿瘤都继续生长。相反，随着剂量的增加，γ-辐射治愈了18％和38％的p21-/-肿瘤(利用卡方检验，P＜0.01)，其中治愈定义为没有可检测的肿瘤。没有治愈的p21-/-肿瘤显示，其大小在治疗后剂量依赖性地明显减小。
本研究的第二个目的是在评价受靶细胞的p53和/或p21状态影响的癌症治疗中，测定克隆发生存活试验的值。发现当比较HCT116的p21+/+和p21-/-亚克隆时，γ-辐射后存活的克隆的数目很少，但几乎相等。低集落数分别归因于细胞周期停滞和程序性细胞死亡。在p21+/+细胞而不是p21-/-细胞的情况下，在存活集落之间的面积由存活细胞的细胞苔(lawn)组成。研究者指出，这个活的p21+/+细胞的细胞苔起类似于饲养细胞层的作用，这种饲养细胞层已知在支持克隆发生细胞生长方面很重要。他们进一步表明，在受治疗的p21+/+肿瘤中存在该饲养层和在体内没有这种饲养细胞群可以解释他们的动物数据。
另一个研究小组也检查了野生型p53和/或p21破坏在癌细胞对某些癌症化学治疗剂和电离辐射的敏感性方面的作用(Fan等，1995和1997)。对都具有野生型p53的MCF-7人乳癌细胞或者HCT116结肠癌细胞，或者用人乳头瘤病毒16型E6基因转染(MCF-7/E6或HCT116/E6)，或者用显性p53突变体转染(MCF-7/mu-p53)，以中断野生型p53功能。使用克隆发生存活实验，所有三个野生型p53功能受抑制的亚克隆以及HCT116 p21-/-细胞，都显示对顺氯氨铂和氮芥的敏感性明显超过相应的具有完整野生型p53或p21功能的细胞。
发现所有四个野生型p53或p21功能被破坏的亚克隆与相应的具有完整野生型p53或p21功能的细胞相比，缺乏修复转染的顺氯氨铂损伤的CAT报道基因的能力。因此，研究者把这些细胞的顺氯氨铂敏感性的增加归因于G1关卡控制缺陷、核苷酸切除修复缺陷或这二者。
同Johns Hopkins的研究小组一样，当使用电离辐射作为基因组损伤工具时，Fan的研究小组也没有发现在克隆发生存活实验中具有完整野生型p53或p21功能的细胞和没有该功能的细胞之间明显的不同。然而，他们显然意识到了由Johns Hopkins研究小组阐述的这个实验的缺点。
Servomaa等人(1996)对取自头颈癌患者的20个人鳞状细胞癌细胞系的p53状态和辐射敏感性进行了研究。在这些系中发现15个系p53突变和/或缺失。使用在辐射治疗后四周记录的克隆发生存活实验测定“平均失活剂量”(AUC)。结果是具有突变的p53或没有p53的系为1.82±0.24Gy，而具有野生型p53的系为2.23±0.15Gy(P＜0.01)。作者推断，不表达p53的系对辐射最敏感。
已经发现甲基黄嘌呤衍生物己酮可可豆碱是G2关卡抑制剂(Russell等，1996)。由于它的一些其它的特性，包括增加红细胞柔性的能力(Ciocon等，1997)，因此它是给予患多种疾病的患者的相对无毒的化合物。己酮可可豆碱显示与顺氯氨铂协作，杀死野生型p53功能中断或p21缺陷的癌细胞系，而不改变具有完整野生型p53和p21的对照细胞的敏感性(Pan等，1995)。还发现该药物在野生型p53功能被损伤的细胞中抑制G2关卡有效得多。
Russell等人(1996)通过转导来自HPV 16型的E6基因，使在人A549肺腺瘤细胞系中起作用的p53失活。使用克隆发生存活实验，他们发现己酮可可豆碱和一种新的甲基黄嘌呤lisofylline都使E6转导的癌细胞对γ-辐射的敏化15倍(与对照相比)。表明这两种介质都阻断辐射诱导G2细胞周期停滞的能力，并发现lisofylline还阻断G1停滞。
UCN-01(7-羟基星形孢菌素)是也可以阻断G2关卡的的蛋白激酶C抑制剂。它已经在啮齿动物中显示了抗人类肿瘤生长的抗肿瘤活性，目前处于用于癌症治疗的临床实验中(Pollack等，1996)。Wang等人(1996)检测了该药物影响MCF-7乳癌细胞对顺氯氨铂的敏感性的能力，所述MCF-7乳癌细胞具有野生型p53或通过一个具有HPV E6基因的表达载体的转染使p53失活。使用克隆发生实验和MTT实验检测药物敏感性，显示通过UCN-01治疗，所述敏感性在没有完整的野生型p53功能的细胞中比在具有功能性野生型p53的细胞中显著增强。关于涉及己酮可可豆碱的研究，发现UCN-01在野生型p53功能已经消除的细胞中阻断由基因组损伤诱导的G2停滞，比在具有完整功能的那些细胞中有效得多。
同样地，Shao等人(1997)证明了，UCN-01在加强损伤基因组的药物对由于实验操作而没有野生型p53功能的HCT116结肠癌细胞系和MCF-7乳癌细胞系的细胞毒性作用方面，比对该功能完整的相同细胞更有效。
咖啡碱也在体外阻断G2细胞周期停滞，它似乎通过活化p34cdc2激酶起作用。Yao(1996a)证明了，咖啡碱治疗选择性地使野生型p53功能缺陷的肿瘤细胞对辐射诱导的程序性细胞死亡敏化。因此，看来对于某些癌症，与单独使用OL(1)p53相比，使用OL(1)p53加上G2关卡抑制剂可能更大程度地加强常规抗癌疗法的有益作用。
微管活性剂诱导通常引起G2停滞的细胞周期关卡。几个研究已经暗示，野生型p53在影响细胞对G2活性剂响应方面起作用(Fan等，1995；Powell等，1995；Russell等，1995)。这些发现引导Tishler等人(1995)检测癌症化学治疗剂紫杉酚、长春碱和噻氨酯哒唑在癌症前期的胚性小鼠NIH-3T3细胞系中诱导依赖于野生型p53的过程的能力。所有这三种微管活性剂都引起G2细胞周期停滞和增加p53与DNA的结合。只有长春碱和噻氨酯哒唑显示引起p21转录增加。
Wahl等人(1996)通过观察野生型p53功能中断影响成纤维细胞对紫杉酚的敏感性，延续了这些研究。在正常的人成纤维细胞中通过用具有或HPVE6基因或SV40T抗原基因的表达载体转染它们，破坏野生型p53的功能。成纤维细胞也取自正常的小鼠和p53基因剔除小鼠。在两种类型的细胞中p53功能的损伤与紫杉酚细胞毒性比对照增加7至9倍有关。紫杉酚显示通过诱导不依赖于细胞的p53状态的程序性细胞死亡杀死细胞。经受得住紫杉酚治疗的、具有完整p53的细胞显示p21水平增加，并经受细胞周期停滞。
除了p21以外，野生型p53也响应于基因组损伤诱导第二个基因GADD45，所述GADD45利用其对PCNA的抑制作用也起作用诱导细胞周期关卡。Smith等人(1996)在表达野生型p53的RKO人结肠癌细胞系中通过用一个反义载体对其转染，阻断GADD45的表达。降低GADD45的水平使癌细胞对UV辐射的致死作用和对顺氯氨铂治疗敏化。另外，通过使用UV损伤的报道质粒和期外DNA合成实验作为判断，显示其中GADD45受到抑制的细胞修复DNA损伤的能力下降。还将具有各种破坏野生型p53功能的基因的表达载体转染到RKO细胞中。抑制p53功能和抑制GADD45表达一样，都对DNA修复具有相同的作用。
GADD45通常产生与p21细胞周期关卡相同的诱导作用，存在至少一种另外的p53调节基因GADD45使p53成为比p21更好的用于阻断由损伤基因组的药物诱导的关卡的靶。
按照本发明，EGFR抑制剂或HER2抑制剂(诸如常规单克隆抗体或优选按照本发明产生的催化性抗体)与p53寡聚物(诸如OL(1)p53)和/或其它的细胞周期关卡抑制剂(诸如UCN-01、p21寡聚物或p27寡聚物)联合使用，将特别适合于和常规化学治疗联合使用，用于治疗表达EGFR和/或HRR2的癌症。
Mendelsohn和他的同事们已经表明，例如用单克隆抗体阻断EGFR功能，引起p53和p21或p27/KIP1的表达增加，导致诱导细胞周期关卡(Wu等，1996；Peng等，1996)。EGFR抑制剂和诸如寡聚物或催化性抗体的p53、p21或p27抑制剂联合使用，将阻止细胞周期停滞，并且尤其当与能够引起基因组损伤的常规癌症治疗联合使用时，加强EGFR抑制剂的抗癌作用。
另外，使用诸如OL(1)p53的p53寡聚物将促进其它EGFR抑制剂的抑制作用，因为p53转录激活EGFR基因(Ludes-Meyers，1996；Sheikh等，1997)。
(c)用EGFR催化性抗体和OL(1)p53联合治疗患者
治疗程序将包括以下方面：(1)取出癌症样品，以测定p53基因的突变状态。(2)以0.1mg/kg/hr的所述寡聚物的量给患者输注约5天，并根据抗体的周转率，以1-50mg的剂量范围使患者接受大剂量的EGFR催化性抗体静脉注射。(3)在开始寡聚物输注后24小时开始常规化学治疗。选择的一种或多种化学治疗剂是不结合OL(1)p53并能够引起基因组损伤的药物。在美国专利第5,654,415号中描述了适于此用途的寡聚物，其内容通过引用结合到本文中。
实施例II
在抗HIV的疫苗接种中的催化性抗体
本文描述了一种可用于治疗AIDS的疫苗构成物，它包含模型B细胞表位和衍生自gp120的T辅助细胞表位。B细胞表位的CRAA用来激发催化性抗体。典型的B细胞表位衍生自通常在不同HIV-1毒株中保守的CD4结合位点。此外，gp120的CD4结合位点是合适的靶，因为和其它许多表位不同，CD4结合位点容易为天然病毒表面上的抗体所接近[31]。已知所述CD4结合位点是一个构象决定簇。
在本发明中，描述了识别CD4结合位点特定部分(与完整的CD4结合位点相反)的催化性抗体的制备。还将鉴定在gp120(或其它的HIV蛋白)中可能是催化性抗体合适的靶的另外的肽表位。因为切割gp120可能导致蛋白构象的总体变化，并伴随着生物学活性的丧失，所以某些gp120肽表位即使它们不直接参与HIV-1结合宿主细胞或HIV-1与细胞内组分的相互作用，也可能是催化性抗体的合适的靶。在本发明的范围内也考虑了这些靶和其它的靶。
由于MHC多态性，所以在不同的个体中用于抗体合成的T辅助细胞潜在地受到限制。在本发明中，遗传背景被严格定义的小鼠品系将用作用于激发应答于B-T表位缀合物的催化性免疫的模型。使用由各种MHC II类等位基因混杂识别的“通用”T辅助表位。该方法的另一个好处在于容易适应人体临床实验。
合成为160kD的单一前体的HIV-1包膜糖蛋白gp160。用细胞蛋白酶于Arg511-Ala512键切割该蛋白，产生gp120和膜内在蛋白gp41。gp120的生物学活性在HIV-1初始结合宿主细胞、病毒的繁殖以及其对未感染的神经元和其它细胞的毒性作用中是关键因素。gp120的构象表位与宿主细胞上CD4受体的结合是HIV-1感染的第一步。构成此表位的各个氨基酸似乎位于第二(C2)、第三(C3)和第四(C4)保守的gp120区段上[12]。它们是gp120残基256、257、368-370、421-427和457。参阅图7。已经描述了结合CD4结合位点的单克隆抗体[32]。因为CD4结合位点是构象表位，所以自身不是该表位组分的远离的残基对于保持结合CD4的能力可能很重要。
gp120和其它宿主细胞蛋白的相互作用对病毒繁殖也是必不可少的。例如，钙调蛋白结合gp120可能涉及HIV-1感染性，这由钙调蛋白拮抗物的抑制作用所展现。位于gp120的V1区和V2区之间的Asp180是病毒复制的关键[33]。同样地，V3回折(loop)对感染性可能是必不可少的[34]。因此很明显，是gp120上的结构决定簇而不是那些构成CD4结合位点的结构决定簇是病毒基因组复制、外被蛋白合成和病毒颗粒包装必需的。
胰蛋白酶消化gp120阻断了它的神经毒性作用。用胰蛋白酶、肥大细胞类胰蛋白酶或Xa因子处理HIV-1颗粒，削弱了它们的感染性。于残基269-270或432-433切割gp120破坏了CD4结合能力，而于残基64-65、144-145、166-167、172-173或315-316切割gp120不影响CD4结合[35]。另一方面，利用细胞蛋白酶在位于gp120的V3回折上的Arg315-Ala316肽键处切割gp120，相信对于生产性病毒感染是必不可少的。已经提出，在宿主细胞表面表达的二肽基肽酶(CD26)是于Arg315-Ala316切割的原因。该切割位点位于主要中和决定簇(PND)上，所述主要中和决定簇是gp120V3回折的一个元件，容易合成针对其的保护性抗体。已经假定，抗体结合PND阻断了宿主细胞蛋白酶对gp120的切割，导致HIV中和。没有证据表明PND在CD4结合HIV中起直接作用，但是已经表明它参与结合HIV共同受体。
B细胞的有效抗体合成部分取决于T辅助细胞的募集，所述T辅助细胞一旦被致敏，就分泌必需的刺激性细胞因子，并通过辅助分子介导的直接接触激活B细胞，所述辅助分子诸如在T辅助细胞上的CD4和在B细胞上的B7。通过加工的抗原表位结合MHC II类分子的复合体的T细胞受体(TCR)识别，发生抗原特异性的T细胞的募集。
通过共价连接T细胞表位至B细胞表位配制基于肽的疫苗，宿主合成针对该疫苗的抗体。T表位结合在抗原提呈细胞表面上的MHCII类分子，然后通过TCR结合B-T表位的MHC II类复合体。在一个杂交繁殖的物种中不同的个体表达不同的涉及抗原呈递至T细胞的MHC II类等位基因(I-E和I-K基因座)。实际上，肽疫苗应当不受MHC限制，即不管MHC II类变异是否涉及抗原提呈，都应当激发强烈的抗体应答。
MHC II类分子、TCR和抗原表位之间的相互作用是相当混杂的。因此，某些肽可以用作通用T表位，即这些肽可以有效结合不同的MHC II类等位基因。而且，在不同类型的TCR水平上，所述肽的识别没有明显限制。如本发明所述，这种肽在用来通过激发保护性抗体应答而中和HIV的疫苗中是合适的T表位组分。
如前所述，某些抗体在蛋白质抗原中既结合肽键，又切割肽键。近来的研究表明，某些编码L链V区的种系基因能够表达这种催化活性。在未免疫的人和动物中已经描述了具有相对非特异性的肽酶活性(定义为多反应活性)的抗体和L链[36]。而且，种系VL基因编码通过诱变鉴定的VIP酶L链的催化性残基。所述肽酶活性也可以在抗体的体细胞多样化过程中提高，该过程在用肽抗原免疫后发生。已经观察到，某些具有高水平催化效率的VIP酶L链与它们的种系基因对应物相比高度突变[14]。描述了合适的VH区和催化性VL区的配对导致催化效率提高[28]。而且，分离自自身免疫病患者的多克隆催化性抗体显示了对自身抗原的高亲和性[1，4，5]，这是所述抗体已经经受体细胞突变和克隆选择的典型征兆。
在自身免疫病中催化性抗体的存在可能归因于针对催化剂合成的遗传素因，它是在抗体V区的体细胞序列多样化过程中通过选择性表达特定的种系V基因或通过增加催化部位的形成而产生。在文献中深入阐述了对自身免疫病与偏向使用不同V基因有关的观察。其它与抗体表达有关的基因可能也有助于在自身免疫病中的催化活性水平。MRL/lpr小鼠已知是合适的催化性抗体生产者[7]。在该小鼠品系中，相信是Fas凋亡基因的突变使T细胞和B细胞增生，并表现出狼疮样疾病。
通过在能够诱导合成抗体的免疫原中加入合适的结构，产生用于治疗AIDS的免疫治疗剂，其中所述抗体将gp120的特异性与快速肽键切割活性结合在一起。
与活化的丝氨酸残基共价反应的二异丙基氟磷酸(DFP)抑制针对甲状腺球蛋白的自身抗体的催化活性和能够切割合成蛋白酶底物的各种L链的催化活性。参阅图8和图9。
抗VIP的催化性抗体包含高亲和性的抗原结合亚位点(subsite)，所述亚位点在结构上和功能上不同于催化性亚位点。在抗VIP L链中，于引起化学催化的残基(Ser27a，His93)处诱变导致周转(kcat)降低，但Km变化最小，这表明使过渡态稳定的残基在底物基态识别中没有起作用。于空间上远离催化亚位点的残基处诱变引起与底物基态结合的丧失(增加Km)，并如所预测的周转增加。因此可以断定，引起最初高亲和性结合的残基和引起化学切割步骤的残基是不相同的。
针对过渡态类似物(TSA)和共价反应性抗原类似物(CRAA)的抗体
已经提议将TSA免疫[37，13，38]作为产生结合过渡态的抗体并因此降低阻碍该反应的活化能的方法。如上文所述，通常使用的膦酸类似物包含一个四面体三价磷原子和一个连接于所述磷上的带电荷氧原子。过渡态肽键切割的形成据认为涉及在切割位点上的三角形碳原子转变成四面体状态，以及羰基上的氧获得负电荷。因此所述膦酸TSA可以诱导能够结合过渡态的氧阴离子结构和四面体构型的抗体的合成。然而，针对这些TSA的抗体虽然相对来说能够促进要求不高的酰基转移反应，但还没有报道其催化肽键切割。近来已经报道了针对亚磷酸酯TSA的抗体缓慢切割稳定的伯酰胺[11]。与更普通的抗膦酸抗体相比，抗亚磷酸酯抗体可能允许质子上较多地移至在易裂键上的酰胺氮，这可能是其催化活性较好的原因。
在本实施例中，在以下的假定中预测了我们的CRAA设计：(a)如同在酶中一样，抗体催化需要 化学活性的氨基酸参与，以催化肽键切割。(例如，在丝氨酸蛋白酶中的丝氨酸羟基由于在丝氨酸残基、组氨酸残基和门冬氨酸残基之间形成分子内氢键网，因此获得亲核特性和介导共价催化的能力)；和(b)由催化剂识别多个结构元件，以达到有效的过渡态稳定化。似乎单独的膦酸TSA结构是诱导催化性抗体的不完全抗原，因为该结构不包含结合亲核性催化部位所需的元件，或者不包含在催化剂中决定S1侧翼残基识别位点的位点。本发明的抗原类似物诱导合成具有共价催化能力以及具有识别碱性侧翼残基和四面体反应中心能力的抗体。本文描述了由CRAA诱导合成前述类型的催化性抗体，所述CRAA用来结合种系编码的抗体中的丝氨酸蛋白酶位点。制备能够与催化性抗体中的亲核性丝氨酸残基反应的亲电子CRAA。这些新的CRAA将用作免疫原，以迫使利用丝氨酸蛋白酶位点合成对gp120特异性的抗体。用上述的CRAA免疫促进了表达种系编码的催化部位的B细胞的克隆选择。而且，通过在CRAA结构的侧翼上加入合适的抗原表位，将确保对gp120的特异性。参阅图10。
应当注意，也可以使用常规的膦酸TSA结构，即使它自身是功能不全的免疫原。在膦酸TSA的P1位加入碱性残基可能有助于诱导催化性抗体的合成，因为过渡态中的反应中心的稳定化可以和侧翼残基识别一起发生。而且，异种免疫(其中在用膦酸酯CRAA免疫后用膦酸TSA免疫)可能产生共价催化部位以及氧阴离子稳定位点。结合这些功能的抗体位点比那些只使用上述机制之一的抗体位点催化性更强。因此，在本发明的范围内考虑了共给予患者TSA和CRAA的方法。
自身免疫病与对有效抗原特异性的催化性抗体的产生有关。已经在狼疮患者中鉴定了能够结合[39]和切割gp120的抗体。而且，分离自有狼疮倾向的小鼠(MRL/lpr品系)的L链切割gp120。
通过在蛋白质G-琼脂糖凝胶[41]上亲和层析，由17个HIV-1阳性患者和10个狼疮患者中纯化IgG样品，分析其切割125I-gp120的能力。通过氯胺T法放射性标记电泳纯的gp120(IIIB，AIDS Researchand Reference Reagent Program，NIH)，接着用凝胶过滤纯化125I-gp120。通过SDS-PAGE和放射自显影检测到放射性标记的gp120在120kD有一条单带。17个HIV-1阳性IgG样品中的16个没有gp120切割活性，一个显示几乎检测不到的活性。相比之下，10个狼疮IgG样品中的3个显示容易检测到的gp120切割。参阅图11。显然IgG样品没有水解125I-白蛋白，这表明观察到的gp120水解不是一个非特异性的现象。在单独的实验中，由切割gp120的一个狼疮IgG样品中和由MRL/lpr小鼠的血清IgG中纯化L链。这通过使用先前描述的用于从人单克隆IgG和多克隆IgG中分离切割VIP的L链的方法[9，28]，对IgG还原和烷基化以及FPLC凝胶过滤而进行。显然，125I-gp120切割活性在对应于狼疮患者和MRL/lpr小鼠的L链峰值(25kD)的组分中。如前所述[28]通过SDS-PAGE和免疫印迹证实回收自FPLC柱的L链的身份。同样的来自HIV-1阳性IgG和BALB/c IgG的L链组分显示没有gp120切割活性。狼疮L链、MRL/lpr L链和胰蛋白酶切割125I-gp120的比活分别为31、307和204(以任意单位计的完整gp120条带面积的减少/nM催化剂/小时温育时间表示)。请注意，催化剂亚群可能构成L链的一小部分，这意味着催化性L链的真正的比活必须大于以上提及的值。
在存在丝氨酸蛋白酶抑制剂(0.3mM二异丙基氟磷酸)的情况下，基本上完全抑制了来自狼疮患者的IgG切割gp120(图12A)。相比之下，金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和酸性蛋白酶的抑制剂(EDTA、碘乙酰胺、胃蛋白酶抑制剂A)没有影响该反应。
L链催化gp120切割的另外的证据来自对具有该活性的单克隆L链的鉴定。根据水解125I-gp120的能力，筛选由患多发性骨髓瘤的患者中纯化的29个单克隆L链、这些L链可三个重组VL区、具有VIP水解活性的一个重组L链[10]和多克隆抗VIP抗体[2]。鉴定出一个来自多发性骨髓瘤患者的具有gp120水解活性的单克隆L链(Lay2)。其余的抗体样品没有活性。从凝胶过滤柱中共同洗脱下gp120水解活性和L链蛋白峰。在生理缓冲液和营养培养基(PBS、HBSS和RPMI1640)中观察到Lay2几乎等量切割gp120。利用非还原性电泳证明，四个放射性标记的gp120切割产物的质量为约80kD、成片条带约50kD、20kD和小于6kD。80kD的条带在还原条件下尺寸进一步减小，这表明其包含二硫键片段。使用衍生自HIV-1毒株IIIB、SF2和MN的125I-gp120制剂观测到相同的产物分布型(图12B)。和狼疮IgG一样，丝氨酸蛋白酶抑制剂DFP而不是其它类型的蛋白酶抑制剂，抑制L链的活性。
为证实所述切割反应不是一个与gp120放射性碘化有关的假象，研究了未标记蛋白的切割(图13)。通过还原性SDS-电泳凝胶的免疫印迹，用先前描述的识别蛋白的蛋白水解分解产物的抗gp120抗体[35]鉴定切割产物。gp120水解明显随着L链浓度的增加而增加，这可由120kD底物条带的强度降低确定。这同时伴随着80kD产物和其它切割产物的累积增加。在还原条件下分析的未标记的gp120和放射性标记的gp120的切割分布型是相同的，除了个别条带的强度不同，这可能是用于检测两种类型的底物的方法的反映(免疫印迹相对于在酪氨酸残基上对125I-标记接着放射自显影)。
在20nM L链浓度和增加的gp120浓度(10-300nM)下检测的切割反应的初始速率是饱和的(表观Km值为30nM，Vmax为0.06nmolgp120/nmol Lay2/小时)。nM Km值表示比较高的亲和结合。在最高1μM的浓度下平行分析的胰蛋白酶催化的gp120切割是不饱和的，这表示低亲和识别。VIP抑制L链对125I-gp120的切割(VIP的Ki为620nM)。Lay2的L链也水解放射性标记的VIP，Km为144nM[40]。因此，看起来VIP结合L链大幅低于gp120约5-21倍。已经鉴定了在gp120和VIP之间的两个同源短区，它们应当是两种多肽和催化剂反应性的基础。
提供合成肽类似物制剂的方法，所述制剂激发合成能够保护免受HIV感染的特异性的、有效的催化性抗体。较早的研究已经表明，可以通过用与gp120肽的丝氨酸反应性CRAA免疫小鼠，募集和提高种系编码的抗体的多反应性催化活性。激发催化性抗体应答与非催化性抗体应答相比，应当提供较好的抗HIV-1感染的保护。
制备和评价以下的合成免疫原：
(A)合成免疫原
(a)缀合来自破伤风类毒素的T辅助细胞表位(残基830-834)的gp120的B细胞表位(残基421-436)(命名为B-T表位)的膦酸过渡态类似物(TSA)；
(b)所述B-T表位的磷酸酯CRAA；和
(c)所述B-T表位的未修饰的肽形式。
(B)用来自(A)的三种免疫原免疫非自身免疫小鼠(B10.BR品系)和自身免疫小鼠(MRL/lpr)，并研究纯化自血清的IgG的下列活性：
(a)结合和切割膦酸B-T表位、膦酸酯B-T表位和未修饰的B-T表位；
(b)结合和切割单体全长gp120；和
(c)结合和切割天然的细胞表面结合的gp120。
免疫原
能够激发抗HIV的催化性抗体的原型疫苗包括：1)一个B细胞可以针对其产生高亲和性抗体的表位(B表位)；2)一个由MHC II类抗原结合并呈递到T细胞的表位(T表位)；和3)在肽键切割过程中形成的过渡态的结构模拟物，它倾向于激发合成能够稳定过渡态的抗体，并因此催化切割反应。
B表位组分：通过操纵催化剂切割位于在感染过程中起重要作用的gp120表位中的肽键，可以实现gp120在切割后丧失感染性。请注意，于远离生物学上重要的决定簇的肽键切割gp120也可能导致gp120功能的丧失，因为gp120片段的构象可以相对于亲代蛋白“整体”改变。可以通过操纵抗体识别已知是中和抗体的靶的表位，增加中和病毒感染性的可能性。切割CD4结合位点是一个实现HIV中和的有吸引力的机制，其原因在于：CD4-gp120结合在HIV进入宿主细胞中是必需的一步；已知用胰蛋白酶于432-433键处切割CD4结合阻断了gp120结合CD4的能力；已知针对CD4结合位点的抗体抑制HIV感染；在HIV表面表达的天然gp120上的CD4结合位点暴露在环境中(与此相反，单体gp120的另外几个表位隐藏在天然gp120寡聚物中)[32]；以及在不同HIV-1亚型中都CD4结合位点相当保守。选择gp120残基421-436组成的线性肽序列作为在本方案中免疫原的B表位组分(KQIINMWQEVGKAMYA，图10)。诱变研究已经表明，gp120的该区在CD4结合中起重要作用。
过渡态类似物组分和共价反应性抗原类似物元件：当过渡态比基态更稳定时发生催化。在本发明中，抗原类似物起募集催化功能的作用，同时保留抗体结合基态抗原的能力。后一特性是获得gp120特异性的催化剂必需的，与非特异性地切割各种多肽的抗体相反。包含位于靶肽键侧翼的gp120肽序列将赋予gp120特异性。在图14中显示了负责使丝氨酸蛋白酶样催化性抗体的肽键切割过渡态稳定化的关键结构特征，它可以包括：(a)在过渡态中于易裂肽键上形成的四面体亲电子碳原子，它能够结合催化剂中的亲核性丝氨酸残基；(b)在该碳原子上形成的氧阴离子结构，可以通过与催化剂中的象Asn、Gln或Arg的残基离子配对(所谓的氧阴离子空穴)而使其稳定；和(c)在易裂肽键的N端侧的碱性残基，可以通过与位于抗体的催化部位中的酸性残基(诸如Asp或Glu)或接近抗体的催化部位的酸性残基离子配对产生对其的识别。请注意，尽管侧翼残基的带正电侧链没有直接涉及催化过程中的键产生和破裂过程，但其可以在过渡态中占据一个与基态不同的空间位置。这是可能的，因为易裂肽键的部分双键特征在形成过渡态时丧失，使得有可以围绕该键旋转，由此引起远离基团的位置的变化。已经利用在易裂键上的sp2(基态)构型和sp3(过渡态)构型中的肽底物的计算机模型，推断了这种在过渡态中的远程空间变化的可行性。
评价分别包含膦酸类似物和膦酸酯类似物的TSA和CRAA。在这两种情况下，四面体三价磷原子用作gp120中连接残基432和433的易裂肽键碳原子的类似物。在图10显示的苯酯构型中，所述三价磷原子获得部分正电荷，正如易裂肽键碳原子带有与亲和性丝氨酸残基反应所需的部分正电荷。先前已经描述了肽邻苯基磷酸酯(peptidic O-phenylphosphonate)能够通过与活性位点丝氨酸残基的氧原子形成共价键，不可逆地使各种丝氨酸蛋白酶失活[29]。Sampson和Bartlett以及其他人[23，24]已经建立了在所述磷原子上制备苯酯以及连接位于膦酸酯侧翼的肽序列必需的化学合成方法。
在TSA/CRAA结构的N端侧和C端侧分别存在12个和4个氨基酸，对应于gp120的残基421-436的序列。在CRAA-gp120的P1位置已经加入一个碱性残基，以利用抗体中存在的种系编码的碱性残基特异性的催化部位。碱性残基与磷酸苯酯结构的存在，促进了与催化部位的紧密结合，并因此促进了CRAA-gp120选择性刺激合成催化部位的B细胞克隆增生的能力。
应当注意到，上述的B表位的膦酸酯CRAA在结构上不同于先前的用于产生酯酶抗体的膦酸TSA[13，38]。常规的膦酸TSA包含一个连接于所述磷上的阴离子氧，它能够结合在催化剂中发现的氧阴离子空穴。然而，所述膦酸TSA不能与催化部位中的亲核性丝氨酸残基反应。据报道Phe-Ile肽键的膦酸TSA不诱导酰胺酶催化性抗体的形成[41]。
将上述的膦酸酯类似物与B表位的膦酸TSA相比有以下几个原因：(a)在上述研究中描述的免疫原不包含P1位的碱性残基，所述免疫原应当对抗用于合成肽酶抗体的种系催化剂的募集；和(b)单独用膦酸类似物免疫可能不足以激发肽酶抗体合成，而用膦酸类似物和膦酸酯类似物异种免疫可能产生良好的肽酶抗体应答，因为可以对异种免疫预先考虑，以根据氧阴离子空穴(膦酸免疫)以及亲核性丝氨酸残基(膦酸酯免疫)选择。这种使用gp120膦酸免疫原和gp120膦酸酯免疫原的共免疫在本发明的考虑范围内。
T表位组分：为募集用于合成抗-gp120抗体的T辅助细胞，将对应于破伤风毒素的残基830-844的15个氨基酸肽(QYIKANSKFIGITEL)置于B表位的N端侧。在疫苗构成物中存在T表位消除了B表位缀合大载体蛋白的需要。先前的几个研究已经表明，包括一个T表位和一个B表位的比较短的线性肽能够激发有效的抗B表位的抗体合成[42]。已知在本发明中使用的破伤风毒素T表位在表达不同的II类等位基因的宿主中用作T表位，并因此已经被表征为“通用”T表位[43]。此外描述了连接至该T表位的gp120B表位诱导抗gp120抗体合成。尽管由人类研究推论出所述T表位的“通用性”，但其可能扩展到小鼠，因为II类限制往往在系统发生学上保守。不管人和小鼠之间在这一点上可能的差异，已经使在本发明中使用的小鼠品系与参与募集用于抗体合成的T辅助细胞的的II类等位基因(AkEk单元型)相匹配的，这消除了关于T辅助细胞募集的差异可能促使催化性抗体应答变异的担心。
免疫原的装配：在应用生物系统合成仪上通过常规的固相合成技术进行31个残基的基态B-T构成物(命名为未修饰的B-T表位)的合成，所述B-T构成物由N端的破伤风毒素残基830-844和C端的gp120残基421-436组成。进行质谱分析和1H和13CNMR，以证实所述结构。
B-T表位的TSA和CRAA在靶切割位点上包含膦酸结构和膦酸酯结构。这些是新试剂，但它们的合成不应存在问题。先前使用标准有机化学技术合成TSA和其它类型的酶抑制剂[23，24]。
如下简要概述合成流程。由次磷酸(hypophosporus acid)的二苯甲胺盐和6-氨基甲酸苄酯并己醛(benzylcarbamatohexanal)制备赖氨酸的亚磷酸酯电子等排物，接着除去酸中的二苯甲基。通过常规的固相合成技术制备所需的侧翼肽(用gp120残基421-431延伸的破伤风毒素残基830-844；gp120残基432-436)，除了对应于C端片段的肽包含2-羟基-6-苄氧羰基氨基己酸，而不是N端赖氨酸。用苄氧羰基保护其它的碱性侧链，而用苄酯基保护酸性侧链。受保护的肽通过经典的溶液相肽合成方法连接于亚磷酸赖氨酸电子等排物上。通过氧化偶合亚磷酸酯与苯酚，制备最终的肽膦酸苯酯结构。使用相同的合成流程制备膦酸[23；流程h和I]，即将亚磷酸酯转化为膦酸单酯，用乙腈中的双(三甲硅烷基)乙酰胺处理，，接着用三乙胺水溶液、四氯化碳处理，并在AG-X-50离子交换树脂上锂交换。进行质谱和NMR以证实所述结构。
小鼠的免疫
研究两个小鼠品系(BR10.BR和MRL/lpr)对4种免疫原构成物的抗体应答。用以下进行免疫：
a.B-T表位(连接至破伤风毒素的残基830-844的gp120残基421-436)。
b.在残基Lys432上的B-T表位的膦酸类似物。(TSA)
c.在残基Lys432上的B-T表位的膦酸酯类似物。(CRAA)
d.B-T表位的膦酸酯类似物，继之以B-T表位的膦酸类似物(TSA+CRAA；异种免疫)。
常规的免疫方法将用于诱导抗体合成。三次腹膜内注射和一次静脉注射给予免疫原(每次约100μg肽)。最后一次免疫经静脉内进行。测试两种佐剂：RIBI和明矾。明矾允许人类使用，先前已经表明明矾激发针对与本发明提出的那些B-T表位类似的B-T表位的抗体合成。RIBI是弗氏完全佐剂的低毒性替代物，并可再现地促进针对各种抗原的良好的抗体应答。在免疫流程中的5个时间点由小鼠的眶后血管丛放血，制备血清。收获脾细胞并加工，制备用于结构功能研究的FV噬菌体呈现文库。对两种佐剂进行分析是有利的，因为佐剂可以通过在B细胞发育和克隆选择时由其募集的细胞因子和TH亚群的作用，影响抗体对疫苗应答的质和量[44]。因此，将研究总共16组小鼠(4种免疫原×2个小鼠品系×2种佐剂)，每组由5只小鼠组成。
在免疫前的所有组成成分中已经存在低亲和性的抗原非特异性肽酶抗体。只要募集了用于抗体合成的种系基因编码的非特异性肽酶活性，则用CRAA免疫就将导致gp120特异性的催化性抗体的合成。患有自身免疫病的人和小鼠是抗原特异性的催化性抗体的多产生产者，这表明患病的免疫系统有效地募集了编码催化部位的种系基因，并允许所述催化部位在免疫应答过程中突变成为对个别抗原是特异性的。MRL/lpr小鼠品系从种属上说易患自身免疫病，先前已经观察到该品系能够产生高水平的催化性抗体。而且，来自MRL小鼠的免疫前血清的L链表达gp120切割活性。因此可以预期，用所公开的免疫原免疫MRL/lpr小鼠形成的抗体亚组将表达gp120特异性的催化活性。与此相关的是，在狼疮患者中发现的gp120结合抗体部分针对包括在所公开的免疫原中的gp120 B表位[39]。BR10.BR小鼠品系不易患自身免疫病。来自该品系的结果将反映所公开的免疫原在健康的免疫系统中刺激针对gp120的催化免疫的能力。BR10.BR小鼠和MRL/lpr小鼠在导致T细胞限制抗体合成的II类基因座(AkEk)上具有相同的单元型，这确保了在两个品系之间催化性抗体合成的任何差异都不是缘于II类限制。
抗体结合活性
应答于CRAA而合成的抗体应当结合肽切割反应性好于基态的过渡态，这使得催化发生。抗CRAA/TSA的抗体的结合强度将作为抗体催化活性的预测值。而且，如果免疫原中的B表位以大致相同的构象存在于所述免疫原和全长gp120中，则所述抗体也将结合全长蛋白。最后，如果所述表位如在已知以寡聚物形式存在于病毒表面的天然gp120中一样暴露，则所述抗体也应当结合寡聚的gp120结构。
未修饰的B-T表位和TSAB-T表位和CRAA B-T表位：通过ELISA比较三种形式的B-T表位(即未修饰形式、膦酸形式和膦酸酯形式)的结合。使用作为固相的未修饰B-T表位(约50μg/ml)包被的ELISA平板和作为可溶性竞争物的未修饰的B-T表位、膦酸B-T表位和膦酸酯B-T表位，通过竞争实验评价结合强度的表观值(如IC50值)。使用过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG接着加入底物(邻苯二胺和过氧化氢)检测该结合。因为准备研究多克隆制备物，所以结合曲线可能偏离简单的S形结合等温线。尽管如此，各个配体的IC50值仍将作为抗体的平均结合亲和性的有效预测值。
以下的关系式可以用来预测催化速率加速度：Ki/Kd＝kcat/kuncat，其中Ki和Kd分别是TSA和未修饰的B-T表位的平衡解离常数，而kcat和kuncat分别是催化反应和未催化反应的一级速度常数。在该等式中可以代入IC50值，以预测速率加速度，但该预测值将是几种抗体活性的平均值，因为待研究的IgG样品是不同抗体的混合物。于4℃在二异丙基氟磷酸(DFP)的存在下进行结合实验，以使肽切割对检测结合参数的干扰最小化。在先前的研究中已经发现了DFP(一种已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂)均一抑制抗体的催化活性。反应温度的降低将降低催化反应的速率。请注意，由催化实验估计的Km值将有助于证实为结合强度预测值的IC50的有效性。
进行溶液相实验，以证实由在固相上的抗原“毡层(carpeting)”引起的抗体亲抗原作用不会产生令人误解的结合评价。使用125I放射性标记的B-T表位进行所述溶液相实验。如前所述使用氯胺T法进行所述肽的放射性标记[2]。[所述B-T表位包含一个对应于gp120残基435的酪氨酸]。使用蛋白质G-琼脂糖凝胶捕获抗体-抗原复合物，并通过在γ分光计中对放射性计数，测定所述结合。和前文一样，在不同的TSA/CRAA竞争物浓度下研究所述结合，以便评价未修饰的表位与其TSA/CRAA的结合强度。
纯化的gp120和细胞表面表达的gp120：检测纯化的gp120和细胞表面gp120的抗体结合，以测定在全长寡聚物形式的蛋白中靶B表位对于抗体是否可及。使用在哺乳动物细胞系中表达的重组gp120，以保证所述蛋白的糖基化模式类似于在HIV感染细胞中的模式。在用gp120包被的固相上进行竞争性ELISA，以测定抗体的表观结合强度。待研究的竞争物配体是全长gp120和激发针对其的抗体的三种B-T表位(膦酸TSA B-T表位、膦酸酯CRAA B-T表位和未修饰的B-T表位)。根据所述竞争物配体的IC50值(表观Ki)估计合成免疫原和全长gp120的相对反应性。全长gp120和未修饰的B-T表位的IC50值几乎相等，这表明所述靶B表位在所述两个分子中以几乎相同的构象存在。观察表明，同全长gp120相比，抗体与B-T表位的膦酸或B-T表位的膦酸酯的结合较强，这说明所述抗体可能显示催化活性。如上所述，进行使用放射性标记的gp120的溶液相实验，以证实不存在ELISA假象，诸如由配体固定化引起的结合亲和力增加。
H9 T细胞系的HIV-1感染的细胞在其表面上表达gp120。细胞表面gp120的大多数模仿粘附的病毒颗粒的形式。据认为，细胞表面的gp120以类似于病毒体表面的gp120的聚集状态的寡聚物状态存在。因此，已经抑制了抗体与细胞表面表达的gp120的反应，以显示抗体识别病毒体结合的gp120的能力。
在本发明中，在5％CO2中的RPMI/10％FCS中培养得自NIHAIDS保藏机构的H9细胞。用包含HIV-1毒株MN(AIDS保藏机构)的培养物上清液于37℃感染所述细胞(106/ml)2小时。在洗涤后，将所述细胞培养约一周。通过在1mM DFP的存在下，在圆底96孔平板中于4℃与合适数量的完整细胞温育4-6小时，接着洗涤所述细胞，以除去未结合的抗体，与缀合过氧化物酶的兔抗小鼠IgG温育，与过氧化氢和邻苯二胺反应显色，并使用ELISA读板仪在490nm定量测定光密度，测定各种浓度的IgG(1nM-1μM)的结合。对照包括免疫前IgG和已知与细胞表面gp120(可由NIH AIDS保藏机构获得)反应的抗体。也可以使用如[45]所述的用于检测结合的抗gp120抗体的荧光标记的第二抗体，通过流式细胞仪研究与所述细胞的抗体结合。该方法使得可以通过估计抗体的缔合速率和解离速率测定表观抗体亲和力。
进行竞争试验，其中所述B-T表位构成物或可溶性全长gp120将被允许作为抗体结合细胞的竞争配体起作用。如在前述段落中描述的竞争研究中一样，B-T表位的IC50值将评估抗体结合B表位的相对强度。为使抗体切割gp120最小化，将在4℃进行温育。在该温育中还可以包括为抗体催化的一种有效抑制剂的二异丙基氟磷酸。在结合反应结束时将通过锥虫蓝排斥试验评价细胞生存力，以证实所述抑制剂(和其它的实验条件)没有破坏细胞完整性，所述细胞完整性可能潜在地干扰gp120的寡聚物结构。
根据催化活性筛选：
使用未修饰的B-T表位作为底物，筛选在蛋白质G-琼脂糖凝胶上通过亲和层析从血清中纯化的IgG的催化活性。最初的筛选试验将在10μM底物和0.25μM IgG浓度下和1-2小时的温育时间下进行。即使表观周转低至0.1/分钟，产物也应当累积至约3μM的浓度(最初底物浓度的30％)。通过在214nm检测的反相HPLC分析(三氟乙酸/乙腈梯度)反应混合物。根据产物峰下的面积计算产物浓度。对照包括免疫前IgG。
也将根据对全长gp120的切割筛选所有的IgG样品。底物是125I-gp120。通过氯胺T法放射性标记gp120(在CHO细胞中表达的重组MN)，接着通过分辨性FPLC，以获得亲电子的均一的125I-gp120。SDS-电泳和放射自显影将用于显现产物条带。已经描述了允许快速样品处理的方法。每天可以筛选约50个IgG样品的活性。使用未标记的gp120作为底物，以证实所述切割反应不是与放射性标记步骤相关的假象。为此目的，将使用具有抗gp120抗体的反应混合物的SDS-PAGE凝胶免疫印迹，所述抗gp120抗体能够识别gp120的各种蛋白水解片段。
通过SDS-PAGE确定用作催化剂的IgG的纯度。在Fab部分中和通过在变性条件下(6M氯化)的凝胶过滤制备的IgG中保留催化活性，证实所述催化活性是由如前所述的抗体造成的[36]。
在没有或有人血清的情况下进行所述试验，以评价在血清中发现的蛋白酶抑制剂是否影响催化性抗体活性。在初步试验中已经发现血清不影响分离自狼疮血清的抗体切割gp120或甲状腺球蛋白。基于这些结果，在小鼠中也应当存在血清抑制剂抗性的抗体。
切割位点的特异性：鉴定通过切割未修饰的B-T表位和全长gp120产生的产物片段，来推断切割位点。如先前(1，2)所述，通过HPLC分离的B-T表位片段将经过N端氨基酸测序和FAB-质谱分析，以鉴定所述切割位点。在全长gp120底物的情况下，通过SDS电泳分离反应产物，将其印迹到PVDF上，印迹的多肽经受N端测序，通过与gp120的序列比较来鉴定所述切割位点。对照包括来自免疫前小鼠的IgG。
包括胰蛋白酶作为阳性对照。可以预期胰蛋白酶在多个肽键上切割B-T表位，所述肽键位于Lys或Arg残基旁，即在B表位中的残基421-422和432-433和在T表位中的残基833-834和837-838。相比之下，由于存在膦酸结构或膦酸酯结构而在抗体中募集的催化活性，应当由IgG主要在Lys432-Ala433肽键处切割B-T表位。可能可以观察到另一种结果。可以通过用基态抗原免疫来合成抗原特异性的催化剂。因此，可以发现能够在不是432-433键的肽键处切割所述底物的催化剂，因为在免疫前的所有组成成分中存在的种系编码的活性可以识别碱性残基，而不考虑抗原表位的总体结构[36，40]。优先在残基432-433发生的切割反应达到的程度将显示膦酸/苯基磷酸酯(phenylphosphonate ester)结构在募集催化部位中的重要性。同样地，对全长gp120的切割限于位于残基421-436中的肽键的程度，也将显示该肽表位在募集对gp120特异性的催化活性中的重要性。
底物特异性：将进行这些研究，以评价抗体催化剂的治疗用途。研究对各种肽和蛋白底物的切割。可以利用几种放射性标记的多肽研究底物特异性分布型：(a)125I-白蛋白；(b)125I-甲状腺球蛋白；(c)125I-VIP；和(d)125I-IgG。根据通过电泳和放射自显影显现出质量较低的产物条带，指示蛋白水解。通过用三氯乙酸沉淀完整的肽或通过反相HPLC[2]检测VIP的水解。还将通过抑制试验检测较大批的随机选择的多肽(n＞10；市售可得的多肽，例如酪蛋白、胶原蛋白等)，即它们抑制催化剂水解125I-gp120的能力。120kD的gp120条带消耗的下降显示对反应的抑制。
动力学：将进行动力学研究，以测定表观速率常数和催化效率(k催化/Km)。使用未修饰的B-T表位和全长gp120作为底物。由在不同底物浓度下进行的试验测定动力学常数。如果所述血清包含与能够结合所述表位的非催化性抗体混合的催化性抗体，则该结合体(binder)可以保护所述表位免受催化剂切割。为了区分开这两种集合体(pool)，将所述血清IgG吸附到可以结合催化性抗体但不能结合非催化性抗体的一种固定化抑制剂上。这种抑制剂可以得到。因为所述抑制剂不包含gp120表位，所以它们不结合通过用gp120 B-T表位免疫诱导的非催化性抗体。将生物素连接于所述抑制剂上，以便用抗生物素蛋白包被的平板固定化。在来自免疫小鼠的血清IgG与过量的固定化抑制剂温育之后，通过ELISA对上清液进行结合未修饰的B-T表位的分析。没有结合表明不存在显著量的抗所述表位的非催化性抗体。而且，可以用pH为9或更高的羟胺洗脱结合的抗体，所述羟胺可以切割抗体和所述抑制剂之间的共价键。然后可以分析洗脱的抗体的动力学参数，所述洗脱的抗体不存在抗B-T表位的非催化性抗体。
nM或更低的Km值表示高亲和性抗原结合活性。观察到这两种底物的Km值和kcat值相等，这表明位于合成免疫原中的残基421-436采用的构象类似于在gp120中的构象。考虑到表观速率常数的值，IgG制备物应当显示比先前使用的多克隆抗体制备物观察到的周转快得多的周转，因为本发明的免疫原特意用来在免疫过程中促进催化部位的募集和改进。
也将评价所述表位的膦酸和膦酸酯对IgG催化切割未修饰的B-T表位的抑制。水解降低表示膦酸肽和膦酸酯肽是B-T表位结合的竞争性抑制剂和/或用作另外的底物。当观察到抑制时，检测Ki值，以评价IgG与B-T表位及其TSA/CRAA的相对反应性。为测定TSA/CRAA是否用作底物，通过反相HPLC分离产物肽并通过氨基酸测序鉴定产物肽，研究IgG对它们的切割。如果所述催化剂能够混杂地切割多个肽键，则所述催化剂可以切割TSA/CRAA肽。在另一方面，如果所述抗体只在Lys432-Ala433键处切割，则所述TSA/CRAA不用作底物，因为它们在此位置包含非切割性的肽键类似物。
切割细胞表面表达的gp120：为证实催化性抗体活性涉及gp120的生物学相关形式，即病毒体结合的寡聚物gp120。使用生物合成地在细胞表面表达的放射性标记的gp120作为底物。通过在35S-标记的蛋氨酸(在缺乏蛋氨酸的培养基中)中培养HIV感染的H9细胞，进行gp120的放射性标记。用各种浓度的来自免疫前小鼠和免疫小鼠的IgG部分处理所述细胞。使用温和去污剂(0.1％Triton-X-100)制备细胞提取物，所述去污剂应当足以使放射性标记的gp120释放到上清液中。使用可获得的兔抗gp120抗体从所述细胞提取物中免疫沉淀gp120(及其片段)，已知所述兔抗gp120抗体结合所述蛋白的各种胰蛋白酶消化片段[35]。使用SDS电泳分离反应产物。完整gp120条带的消失以及较低质量的片段的出现表示切割了细胞表面结合的gp120。对照包括用未免疫兔的IgG免疫沉淀所述细胞提取物，在此情况下应当没有放射性被沉淀。用抗gp120抗体进行凝胶的免疫印迹，以证实所述免疫沉淀的物质代表gp120片段。
还将进行所述抗体识别HIV-1表面表达的gp120构象的验证性试验。使用蔗糖密度梯度纯化的MN-病毒制备物(得自AdvancedBiotechnologies)作为底物。在温育所述病毒和抗体之后，如对细胞表面表达的gp120的描述测定gp120切割，即去污剂提取、电泳和用已知结合gp120切割片段的抗gp120抗体免疫印迹。
用B-T表位免疫原免疫，将激发结合全长可溶性gp120和细胞表面表达的gp120的抗体，因为gp120中的靶表位是CD4结合位点的一部分，所以可以假定所述CD4结合位点暴露在蛋白表面上(相反将隐藏在所述蛋白的内部)。而且，在不同的HIV毒株中所述靶表位均保守。因此，希望合成反应性广泛的抗体。
来自非自身免疫小鼠的免疫前IgG缺乏催化切割gp120中的靶表位的能力。同样地，来自用未修饰的B-T表位免疫的非自身免疫小鼠的IgG几乎不表达或不表达gp120切割活性。
来自自身免疫小鼠的免疫前IgG可能显示低水平的gp120切割，但该活性不是对gp120高度特异性的。用未修饰的B-T表位免疫自身免疫小鼠将产生对gp120特异性的催化活性，但所述免疫原的结构没有预示催化周转的增加。相比之下，B-T表位TSA和CRAA用来激发抗体合成，所述抗体将结合gp120基态和结合肽键切割反应过渡态的能力结合在一起。因此，TSA和CRAA免疫预计将激发显示高亲和性结合gp120(表观Km和Kd值低)和显示快速周转(表观kcat)的抗体的合成。而且，用所述B-T表位的类似物免疫自身免疫小鼠，将引导在免疫前状态中发现的混杂的催化活性对准特化为识别靶gp120表位(残基421-436)的催化活性。
用TSA和CRAA免疫BA10.BR小鼠(非自身免疫小鼠)，将破坏在非自身免疫状态中限制催化性抗体合成的抑制物机制。此试验与研制HIV疫苗相关，因为研制疫苗的目的就是保护免受感染，而不考虑宿主的自身免疫状态或非自身免疫状态。
B-T表位膦酸酯与膦酸B-T表位相比，将激发更强有力的催化剂，因为所述前一种免疫原将促进合成抗体(包含亲核性Ser/Thr残基)的B细胞的克隆扩充，它是由种系VL基因编码的先前存在的催化部位的一个特征。在另一方面，所述膦酸B-T表位用来募集包含一个氧阴离子空穴(诸如在枯草溶菌素中的Asn255)的抗体，以使在过渡态中的羰基氧上显露出的负电荷稳定化。没有获得证据证明氧阴离子稳定化是导致种系编码的催化剂催化的原因。但是请注意，V区体细胞多样化机制(超变，V-J/V-D-J重组和VL/VH配对多样性)是能够重新形成催化部位的强有力的机制。将种系亲核位点和体细胞产生的氧阴离子空穴组合在一起的抗体的研制是相当可行的。这种亲核性的氧阴离子稳定化位点是非抗体性丝氨酸蛋白酶有效催化的原因。所提出的异种免疫将激发高周转的gp120特异性催化剂的合成，在所述异种免疫中，将通过用膦酸酯B-T表位与膦酸B-T表位相继免疫，诱导抗体合成。由于膦酸酯的共价的、亲电子的反应性，因此所述异种免疫还将募集编码亲核性位点的抗体种系基因，接着在免疫应答过程中体细胞产生氧阴离子稳定化结构。
比较由未修饰的B-T表位激发的抗gp120抗体的HIV-1中和活性和由膦酸B-T表位TSA和膦酸酯B-T表位CRAA 激发的抗体的中和活性。
gp120结合CD4引起HIV-1感染细胞。于432-433键处切割gp120将有效阻断细胞与HIV-1结合，因为所述切割位点位于gp120的CD4结合区，先前已经表明由胰蛋白酶切割该键抑制CD对溶液相gp120的结合C[35]。
抗体：比较在用对照B-T表位构成物(未修饰的肽)、膦酸B-T表位(TSA)、膦酸酯B-T表位(CRAA)以及膦酸B-T表位和膦酸酯B-T表位的组合(TSA+CRAA)免疫的过程中，于不同时间由小鼠纯化的IgG样品。来自所有这些免疫的超免疫IgG应当能够高亲和性地结合gp120。可以预料，在来自TSA/CRAA免疫的两种小鼠品系的IgG中存在所述催化活性。
HIV-1中和：首先，使用标准的实验室毒株(HIV-1 MN)，在已清楚特征鉴定了的定量的T细胞系试验中筛选来自不同的免疫阶段的所有小鼠的未知(blinded)的IgG样品。使用接近免疫进程结束时获得的超免疫IgG进行进一步的研究。对照包括与没有HIV-1的IgG温育的细胞，以排除所述IgG的非特异性毒性作用的可能性。使用得自血液的PHA活化的淋巴细胞作为一个细胞类型，以及使用得自血液的巨噬细胞作为第二个细胞类型，分析这些IgG样品。单个的双噬性原始分离株HIV-1 ADA是在初级细胞试验中使用的病毒分离株。使用两种细胞类型的原因是避免错过任何可能存在于对不同细胞和病毒类型特异性的特有表位中的中和/失活活性。由较早的研究显然可知许多因素造成实验室毒株与现场分离株(field isolate)的中和方面的巨大差异。直接比较那些显示中和活性的抗体样品的V3和CD4抑制性人单克隆血清和清楚特征鉴定了的HIV-1阳性人多克隆血清的能力。另外，将进一步评价这些抗体的作用阶段、作用机制、可逆性程度，以及它们在多种初级细胞类型中大范围的抗原亚型/分化体内的中和活性的广度。
待测试的IgG包括非催化性抗gp120 IgG制备物(来自用未修饰的B-T表位免疫的非自身免疫小鼠)和催化性抗gp120 IgG制备物(例如来自用B-T表位的TSA/CRAA免疫的小鼠)。因为在gp120中的靶B表位是CD4结合必需的，所以可以预料甚至连本发明的IgG制备物中的非催化性抗体都抑制HIV-1中和。假定激发了足够效价的抗体，那么来自每一个实验组的小鼠的超免疫IgG都可以抑制HIV-1的感染性。
比较催化性FV构成物和非催化性FV构成物的同源制备物的HIV-1中和活性。这将证实由多克隆IgG研究获得的结果。而且，因为所述FV构成物没有FC区，所以将排除类似于完全结合和FC受体结合的现象。因此使用所述FV构成物将证实归因于这些现象的HIV-1感染性没有增强。
与非催化性抗体相比，催化性抗体的主要吸引力在于它们的较大的和不可逆的抗原中和能力。在本发明中，所述催化性IgG样品在比非催化性IgG样品低几个数量级的浓度下，应当显示有效的HIV-1中和。为所述催化剂靶的表位是gp120的CD4结合位点的一部分。而且，已经发现胰蛋白酶对靶键(Lys432-Ala433)的切割阻断了gp120结合CD4。所述CD4结合位点往往在不同的HIV-1毒株和亚型中保守。因此，本发明的抗gp120催化剂提供了一个治疗感染性疾病(诸如HIV感染)的有益的治疗工具。
实施例III
在局部缺血-再灌输伤害和脓毒性休克/SIRS Larry I中使用CRAA和催化性抗体需要参考本节
当组织的血液供应较长时期中断(局部缺血)然后恢复(再灌输)时，发生局部缺血-再灌输伤害。这种类型的伤害在恢复至被伤害的组织血流的治疗之后，影响心脏病发作患者和中风患者。局部缺血和尤其是再灌输都与某些因子释放到该组织相关，所述因子通过诱导程序性细胞死亡引起炎症反应和伤害。
脓毒性休克和系统性炎症反应综合症(SIRS)是一种经常致命的综合症的术语，该综合症包括血液动力改变、炎症和最终以可预知的顺序首先由肺开始的主要器官的衰竭。脓毒性休克综合症最初只与革兰氏阴性细菌感染和内毒素的作用有关，但随后发现各种其它的医学问题，诸如由偶然事故造成的大范围组织损伤，引发同样的综合症，在没有感染的情况下所述综合症称为SIRS[46]。在这两种综合症中观察到的多个器官衰竭均与程序性细胞死亡的发生紧密相关，并可能在很大程度上由其引起。
局部缺血-再灌输伤害
在此疾病中四个主要的可溶性因子诱导程序性细胞死亡，它们是活性氧种类(ROS)和一氧化氮(→过亚硝酸盐→羟基ROS)，以及白介素-1β(IL-1)和肿瘤坏死因子α(TNF)，ROS和一氧化氮诱导IL-1和TNF以及被IL-1和TNF诱导。
考虑到在局部缺血-再灌输伤害和脓毒性休克/SIRS中涉及程序性细胞死亡，刚刚提及的可溶性因子在两种疾病中都起显著作用的事实着重说明了所述医学急症之间在病理生理方面的相似性。
使用本发明的新的CRAA有利于研制切割IL-1和TNF的催化性抗体，用于治疗局部缺血-再灌输伤害、脓毒性休克/SIRS和急性呼吸窘迫综合症(ARDS)以及其它的炎性疾病(诸如类风湿性关节炎)和治疗神经性疼痛。
局部缺血-再灌输伤害
血流及早返回局部缺血的组织对于停止由氧和营养物质供应中断引起的细胞伤害的发展是关键。令人感到反常的是，局部缺血组织血流的重新建立与进一步的组织损伤有关。例如已经通过试验方法表明，4小时的肠内局部缺血的损伤显著低于3小时的局部缺血加上1小时的再灌输[47，48]。在许多研究中已经阐明了再灌输阶段对总体的组织损伤的重要性，这些研究显示在局部缺血阶段开始的治疗干涉反而和在再灌输起始时开始的治疗干涉同样有效[49，50，51，52]。局部缺血-再灌输伤害的组织迅速显示出被经受程序性细胞死亡的细胞的区域包围的坏死细胞死亡区域[53，54，55]。
已经完全确定，局部缺血组织在再灌输时必定暴露于分子氧，表现出伤害[56-61]。
已经假定了几种机制解释局部缺血-再灌输伤害的发病机理，但最大的注意力集中ROS上。ROS指的是任何衍生自带有负电荷的分子氧的化合物，包括超氧化物、过氧化氢和分别用一个、两个和三个电子还原的羟基。
许多种证据已经使ROS与在局部缺血-再灌输伤害相关，包括：1)通过电子自旋共振和自旋捕获[62，63]以及通过氮蓝四唑还原、化学发光和水杨酸盐捕获，已经检测到了在局部缺血组织中产生ROS。2)在没有局部缺血-再灌输伤害的情况下，组织暴露于ROS中产生类似于局部缺血-再灌输伤害自身的病理学变化[64，65，66，67]。3)用清除ROS或限制ROS产生的药物治疗，明显减轻了局部缺血-再灌输伤害的损伤[68，69]。
局部缺血的初始影响之一是在受影响的组织中ATP缺乏，这进而使细胞膜可透过离子，并使集钙作用失效。造成的胞质钙增加促进了依赖于钙的磷脂酶和蛋白水解酶活化，一个重要的结果是黄嘌呤脱氢酶转变成黄嘌呤氧化酶[70]。在实质细胞和内皮细胞中发现了黄嘌呤氧化酶，它产生ROS超氧化物并直接或间接产生过氧化氢。抑制黄嘌呤氧化酶减轻了由局部缺血-再灌输伤害引起的损伤，这支持由该酶产生ROS而促使发病的观点。
在局部缺血组织中发生磷脂酰乙醇胺减少、磷脂分解和游离脂肪酸的释放。随着再灌输的开始，迅速利用游离脂肪酸，尤其是花生四烯酸，刺激导致ROS产生的脂氧化酶和环加氧酶途径。已经表明环加氧酶抑制剂有益于减少归因于局部缺血-再灌输伤害的组织损伤。
一氧化氮是由内皮持续释放的高度活性物质[71]。它维持在活性血管舒张和血管不渗透性的状态中的微循环，并防止血小板和淋巴细胞粘附于内皮。利用一种组成型活性内皮合酶由L-精氨酸酶促合成一氧化氮，可以通过诸如NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)的L-精氨酸类似物抑制它的产生。在冠状血管结构中用诸如L-NAME的抑制剂抑制一氧化氮的产生，可以通过血管收缩引起心肌局部缺血[72]。然而，有一个实质性的证据是，一氧化氮合成的抑制剂显著降低了与局部缺血-再灌输伤害相关的组织损伤的水平[73，74]。
一氧化氮合酶的可诱导形式是局部缺血-再灌输伤害过程中一氧化氮分子水平增加的原因。诱导物包括炎性细胞因子、神经兴奋性氨基酸和在局部缺血后体温过高期间流动相关的血管舒张。Noiri等人[75]证明，以诱导型一氧化氮合酶基因的转录物为靶的一种反义寡聚物可以降低这些基因的表达。当系统给予时，此寡聚物被肾吸收，并显著减轻了由实验产生的大鼠肾局部缺血引起的肾脏衰竭。
一氧化氮可以和超氧化物阴离子化合，产生导致产生羟基的毒性自由基过亚硝酸，这是一种被认为是产生局部缺血-再灌输伤害的主要因子的ROS[74]。在所有的需氧呼吸细胞中，还原分子氧以产生超氧化物都发生在线粒体转运系统中。
也已经表明，一氧化氮在许多生理和实验条件下诱导程序性细胞死亡。高水平的一氧化氮产生的激活有助于形成第一条防御线，抵抗侵入的病原体和肿瘤细胞。
在局部缺血-再灌输伤害的区域中释放ROS吸引炎性淋巴细胞，所述炎性淋巴细胞进而可以利用包括释放另外的ROS的细胞毒性武器库引起组织伤害。许多研究已经表明：1)在局部缺血-再灌输伤害的区域中累积淋巴细胞，和2)缺乏循环嗜中性粒细胞或使用阻止嗜中性粒细胞活化的药物有时可以减轻与局部缺血-再灌输伤害有关的组织损伤。
程序性细胞死亡的末期涉及一组属于ICE家族的酶。已经表明，能够抑制这些酶其中一些的肽在啮齿动物中减轻了由一过性中脑动脉阻塞导致的局部缺血性脑损伤，并显著改善了产生的行为缺陷[76]。后一发现证明，局部缺血的神经组织的功能恢复可以采用防止细胞死亡程序继续进行至完成的治疗。可推测，在局部缺血继之以再灌输伤害的情况下，功能恢复的程度甚至更高。
许多研究已经证明，程序性细胞死亡是局部缺血-再灌输伤害损伤的组织普遍存在的特征[53，54，55]。
Szabolcs等人报道，在大鼠心脏中对诱导型一氧化氮合酶水平的诱导，与程序性细胞死亡正相关[77]。将Lewis大鼠的心脏组织移植到作为心脏同种异体移植排斥模型的Wistar-Furth大鼠中，而将由Lewis大鼠至Lewis大鼠的移植用作对照。在移植后的第3天至第5天，经受程序性细胞死亡的心肌细胞的数目急剧增加。在第5天，同种异体移植与同基因移植比较，显示经受程序性细胞死亡的肌细胞、内皮细胞和巨噬细胞明显增加得更多。可诱导型一氧化氮合酶mRNA、蛋白质和酶活性的表达显示，在心肌细胞中的程序性细胞死亡的时间和程度同时增加。免疫组织化学染色证明了可诱导的一氧化氮增加的区域也表达硝基酪氨酸，表明形成过亚硝酸。
许多种证据支持白介素-1β(IL-1)和肿瘤坏死因子α(TNF)在局部缺血-再灌输伤害的发展中起重要作用的结论。
已经表明，两种促炎细胞因子的产生与肌细胞/巨噬细胞系的细胞活化有关，所述活化可以通过黄嘌呤氧化酶衍生的氧基活性产生。
在20世纪40年代发现IL-1，最初表明其当注射到动物中时引起发热。在20世纪70年代早期，发现IL-1当注射到动物中时具有各种其它的生理学作用，包括嗜中性粒细胞、抗微生物反应加强、肝急性期反应物的合成增加和诱导集落刺激因子。还发现其加强对培养物中的有丝分裂原的T细胞应答和作为佐剂的功能。
克隆研究已经表明，IL-1是一个由IL-1α、IL-1β和IL-lra组成的三个成员的家族。前两个是兴奋剂，后一个是受体拮抗剂。IL-1α定位于细胞膜上，而IL-1β作为细胞因子释放，是本文中仅仅涉及的形式。它作为在可以成为有活性之前必须被切割的前体合成。这些酶中最特殊的是白介素-1β-转化酶(ICE)，它与在程序性细胞死亡的最后阶段起作用的酶家族紧密相关。
已经证明了IL-1表达是在视网膜、肝、骨骼肌和肠中经受局部缺血-再灌输伤害的区域。同样证明了IL-1和TNF表达均是在脑和心脏中。在Hara等人[76]使用的啮齿动物模型中，在中脑动脉实验性阻塞恢复之后30至60分钟，IL-1表达达到其峰值，随后降低。
IL-1对大鼠心肌细胞的处理诱导一氧化氮合酶转录，并诱导依赖于蛋白激酶A的途径增加该酶的表达。IL-1还显示在大脑内皮细胞中诱导该酶。同样地，IL-1和TNF显示诱导心脏和肝一氧化氮合酶。如上所论述，ROS引发诱导p53表达的基因组损伤，所述p53表达可以导致程序性细胞死亡。
IL-1也诱导其它的如IL-6的促炎细胞因子表达。在某些情况下，诱导由还可以介导TNF作用的转录因子NF-KB介导。根据在对所有三种细胞因子响应的细胞群中明显重叠的信号转导途径，可以部分解释IL-1和TNF之间以及IL-1和IL-6之间经常观察到的协同作用。
已经发现，IL-lra治疗经受局部缺血-再灌输伤害的大鼠，减少了TNF产生，减轻了组织伤害并降低了死亡率[78]。在大鼠肝中通过夹紧肝左叶和肝中叶的血管90分钟，诱发局部缺血。在一组试验中，在诱发局部缺血前5分钟，系统给予IL-lra，在开始再灌输后于不同的时间点检测血液和肝脏中的TNF水平。在对照动物中，发现在这两种组织中的TNF水平随着再灌输持续的时间的增加而增加，试验在距局部缺血发生4.5小时时终止。相反，IL-lra治疗在两种组织中引起TNF水平降低。组织学检查证明，与对照相比，肝损伤的显著下降与IL-lra治疗有关。
在第二组试验中，在完成局部缺血阶段之后除去未受影响的右外侧肝叶和肝尾叶。80％的对照动物死亡，与用IL-lra治疗的动物有30％死亡形成对比。
在类似的研究中证明，IL-lra治疗和天然产生的IL-lra保护大鼠脑组织免受局部缺血-再灌输伤害诱导的损伤。
检查了TNF在脑局部缺血-再灌输伤害中的作用。在一组试验中，在阻塞中脑动脉80或160分钟(一过性)之前24小时或直至试验结束24小时后(永久性)，脑室内给予大鼠不同剂量的TNF。在某些组中，在注射TNF前30分钟给予TNF中和抗体。给予外源TNF在由永久性阻塞引起的梗塞大小(infact size)中产生明显的依赖于剂量的增加(32％)。高剂量的TNF(25pmol)在两个暂时阻塞的组中引起的梗塞大小的增加分别为100％和34％。在接受TNF抗体预处理的动物中去除了外源TNF的所有这些作用。
在再一组试验中，通过在永久阻塞前30分钟或永久阻塞后3和6小时，给予或中和抗体或可溶性TNF受体(sTNF-RI)阻断TNF功能，来评价阻断内源性TNF的效果。在阻塞前或阻塞后阻断TNF功能导致梗塞大小根据抑制剂剂量减小最高26％。
已经表明，TNF部分介导与局部缺血-再灌输伤害的再灌输阶段有关的肝损伤。肝产生TNF是嗜中性粒细胞在受影响区域汇集和活化而导致释放ROS的原因。用中和TNF的抗体被动免疫可以明显抑制这些病理作用。也已经表明，给予培养的肝细胞TNF增强了在同一时间给予的ROS的细胞毒性。同样地，通过在大鼠模型中阻塞上部肠系膜动脉45分钟诱导急性局部缺血-再灌输伤害之后，中和TNF的抗体显示降低了心血管效应，并提高了存活率。
脓毒性休克/SIRS
撇开病因学不谈，在局部缺血-再灌输伤害和脓毒性休克/SIRS中发生的基本病理生理事件非常相似，但在前者中病状是局部的，而在后者中病状是系统性的，并可以以由肺开始的多个器官衰竭而结束。在这两组疾病中的关键要素都是ROS、一氧化氮、IL-1、TNF和程序性细胞死亡。
在此领域的大多数试验性研究都涉及脓毒性休克，因为该综合症容易使用细菌或细菌产物诱导。在这些研究中揭示的与患者中的脓毒性休克/SIRS相关的病理生理变化证明，该综合症由促炎介质级联产生。一般认为此级联是由首先由巨噬细胞和其它炎性细胞释放的IL-1和TNF启动。各种各样的其它细胞类型和机体中大部分具有IL-1受体的细胞也产生IL-1。已经表明，ROS和TNF刺激IL-1产生，而IL-1和TNF这两种细胞因子都促进ROS产生。在脓毒性休克中，IL-1和TNF的产生起因于内毒素和其它细菌产物的作用。这两种细胞因子和ROS的高表达导致产生过量的各种各样的次级介质，包括IL-6、IL-8、γ-干扰素、前列腺素I2、血栓烷A2、前列腺素E2、转化生长因子β、血小板活化因子、缓激肽、血管紧张肽和血管活性肠肽。这些因子是造成与此综合症相关的病理心血管、血流动力学和凝固以及其它变化的原因。
当证明了TNF的过量产生是休克和死亡的一个前因时，TNF就成为和脓毒性休克/SIR综合症有关联的第一个细胞因子。不久之后表明IL-1具有相似的毒性，并且当与TNF一起给予时有协同作用。因此当联合在其它情况下为非致死量的TNF和IL-1时，在动物中产生致死性休克。
在炎症损伤之后，TNF是第一个出现在循环中的细胞因子，随后是IL-1。例如在注射内毒素的志愿者中，在损伤后60-90分钟TNF水平达到最高点，并在3小时内回到基线。在治疗后3-4小时IL-1水平形成平台。这些一般的观察和TNF可以诱导IL-1产生的发现得出以下观点：即TNF是开始脓毒性休克/SIR综合症的最初的细胞因子，而IL-1更多地涉及其延续。
对由TNF和IL-1二者诱导的血清IL-6水平的检测已经表明，用其作为对TNF和IL-1产生的检测比直接检测这些细胞因子更好。在循环中的IL-6水平经常和外伤患者、脓毒病患者和脓毒性休克/SIRS患者的疾病严重程度直接相关。然而，与IL-1和TNF不同，给予IL-6不引发炎症或脓毒性休克/SIRS，而且IL-6的抑制剂不阻止该综合症的致死作用。
大量额外的证据支持这些介质在此综合症的发病中起决定性作用的观点。例如Casey等人[77]研究了各种涉及脓毒性休克的因子和97个患者的结果之间的相关性，其中57个或者完全爆发脓毒性休克，或者为即将发生脓毒性休克/SIRS的前兆的血压过低。这一组患者的存活率是54％。血浆IL-6水平和死亡率之间是最强的正相关，而血浆IL-6水平和IL-1水平之间是第二最强的正相关。在正常的受试者中通常检测不到IL-1(＜40pg/ml)。TNF和内毒素水平以及死亡之间不相关。与TNF没有相关性归因于以下事实，即此细胞因子只在所述因子级联的最早期产生，并且其半寿期短。然而，TNF水平升高确实与革兰氏阳性脓毒病的出现相关。
涉及脓毒性休克/SIRS的促炎细胞因子，尤其是TNF，激活凝血级联和补体级联，这引起嗜中性粒细胞的活化，并释放ROS。在内皮细胞和炎性细胞中IL-1和TNF诱导一氧化氮合酶。活化的嗜中性粒细胞在形成超氧化物离子的所谓的呼吸爆发中消耗氧，所述超氧化物离子与一氧化氮反应，以形成分解形成高度毒性的羟基ROS的过亚硝酸。ROS，尤其是超氧化物，当与自身扩增过程中的血浆前体反应时，产生趋化因子。
脓毒性休克/SIRS患者对抗氧化剂治疗有良好的反应，这证实了ROS在该综合症发病中的重要性。例如在患脓毒病相关的急性呼吸窘迫综合症(ARDS)的患者中，在用四种抗氧化剂联合治疗之后已经观察到死亡率显著降低。ARDS指的是肺衰竭相关的病理生理学，是鉴定脓毒性休克/SIRS末期的多个器官衰竭中的第一个。同样地，在另一个研究中，给予抗氧化剂正乙酰基半胱氨酸的ARDS患者显示肺和心脏功能改善，包括肺部血管抗性、心输出量和氧运输的变化。
已经根据这些和强烈显示利用阻断TNF和IL-1产生的药物可以防止该综合症的大量额外数据，发展了对脓毒性休克/SIRS的机理性认识。已经表明，IL-1中和抗体在动物模型中缓解了脓毒性休克综合症。然而，给予重组IL-lra已经成为在脓毒性休克/SIRS动物模型中用于阻断IL-1功能的最常用的方法[78]。
例如用适量的IL-lra继之以正常致死量的内毒素同时治疗兔，只形成温和的和一过性血压过低，并减少了渗透到组织中的嗜中性粒细胞。也已经证明，IL-lra防止感染肺炎克雷伯氏菌(K.pnwumoniae)的大鼠死亡，并防止大肠杆菌(E.coli)性腹膜炎。
已经研究了在狒狒中输注IL-lra削弱继发性致死大肠杆菌脓毒性休克的能力。当以超出IL-1水平103至104倍的范围给予IL-lra时，尽管没有观察到对最初产生细胞因子的影响，但IL-lra防止持续的IL-1应答，结果是在24小时时的100％的存活率，相比之下在安慰剂治疗的对照中存活率为43％。
许多报道已经提供了证据证明，TNF中和抗体和可溶性TNF受体可以保护动物抵抗在其它情况下致死的可以诱导脓毒性休克的细菌毒素(诸如内毒素)的注射。然而为了对治疗有利，这些治疗不得不在输注内毒素或细菌之前或过程中给予。
也已经使用TNF-1受体剔除小鼠，研究了TNF在脓毒性休克起始中的作用。这些小鼠显示对在正常小鼠中产生致死性的脓毒性休克综合症的TNF剂量没有反应。如果用D-半乳糖胺和通过阻断其肝代谢使其对毒素敏化的药物，预处理所述剔除小鼠，则它们也不对正常致死剂量的内毒素反应。正常小鼠和剔除小鼠在内毒素诱导的血浆TNF水平上没有差异。在用亚致死量的内毒素攻击后，发现在剔除小鼠中释放到循环中的IL-6的水平引人注目地低于对照。最后，已经显示来自剔除小鼠的巨噬细胞通过可诱导的一氧化氮合酶途径产生一氧化氮的能力严重受限。相反，IL-6缺乏的小鼠显示没有这种缺陷。
由五个不同公司开发的多达6种的用于治疗脓毒性休克的TNF拮抗剂已经同时处于II至III期临床试验中。这些抑制剂中的4种是中和抗体，两种是可溶性重组TNF受体。这些产品中没有一个宣称自己为用于此综合症的有前途的治疗。然而，包括中和抗体的TNF拮抗剂在患者中没有功效不是固有的，因为随后在治疗类风湿性关节炎的临床试验中已经表明了它们的重要前途。
无疑，在过去10年中尝试开发新的用于脓毒性休克/SIRS的疗法已经造成了许多挫折。Pruitt等人[78]总结了许多关于由为数众多的研究者提出的细胞因子抑制剂试验为什么失败的原因。可能达至成功的一个最大的障碍与现有的细胞因子抑制剂的成本有关。它们的高价格使它们不可能预防使用。例如Pruitt等人[78]指出，为了维持10-15μg/ml的治疗血浆浓度，只要患者是脓毒性的，就不得不以1.5-2.0mg/kg/hr的浓度给予约每天2.5克的IL-lra。
因此，接受IL-1抑制剂或TNF抑制剂的患者已经是有症状的。此外，我们对此综合症的发病机理的研究强有力地表明，必须就在过量的促炎细胞因子释放的级联的最开始，阻断IL-1和尤其是TNF的功能，所述级联在推动所述综合症发展方面起主要作用。再者，动物研究已经令人信服地表明，为了使IL-1和TNF有效，必须就在产生脓毒性休克/SIR综合症之前或同时给予IL-1和TNF。
例如在Synergen Inc.的II期临床试验中，在判断一个患者是适合研究的志愿者之后平均9小时给予IL-lra[79]。结果，进入该试验的许多患者在开始IL-lra输注前24小时或更长时间，已经出现脓毒性反应。因此对于许多患者来说，促炎级联在于开始尝试阻断IL-1功能时已经远远领先了。
使用28天所有起因的死亡率标准也可能使在IL-lra临床试验中的阳性反应不明显。对II期试验和第一个III期试验数据的重新评价揭示，由IL-lra输注获得的主要利益发生在治疗后3-7天[78]。随后存活曲线基本平行。这个发现可能反映了IL-lra的半寿期很短。例如在患脓毒病的灵长类动物中IL-lra的β期半寿期大约为21分钟。同样地，IL-1和TNF的半寿期检测为几分钟至几小时。因此，在IL-lra输注后的第一周以后的死亡率与评价治疗价值不相干并不令人奇怪。
IL-lra临床试验的另一个问题来自根据该细胞因子的血浆浓度决定细胞因子抑制剂的剂量的作法，该问题一般出现在系统给予IL-1抑制剂或TNF抑制剂时。原因在于，这些细胞因子的局部组织浓度可能远高于血浆中存在的浓度。例如在ARDS患者中，已经表明肺中的IL-1浓度高达15ng/ml，而血浆浓度在100pg/ml以下。
因此，脓毒性休克/SIRS数据和现时对该综合症的研究，支持开发新的疗法，该疗法可以(1)阻断IL-1和TNF，并且对于预防性地给予处于风险之中的患者足够廉价；和(2)防止对器官衰竭起作用的主要因素-程序性细胞死亡，器官衰竭引起许多与此综合症有关的死亡。
因此，本文描述的CRAA将刺激免疫产生对TNF和IL-1特异性的催化性抗体。可以使用基于给予其它已知的单克隆抗体的已经开发用于免疫治疗的方案，给予这些抗体。因为本发明的抗体以催化方式起作用，所以剂量远低于可逆且化学计量地结合的抗体。因此，对处于所述综合症风险之中的患者的预防性治疗的成本将大幅降低。在图15中显示了用于激发针对TNFα的催化性抗体的示例性CRAA。在图16和图17中显示了用于激发针对IL-1β的催化性抗体的示例性CRAA。在图17中显示了硼酸亲电子中心。
实施例IV
用本发明的催化性抗体被动免疫
在许多医学领域中给予单克隆抗体具有临床利益。在器官移植领域，已经使用结合T细胞受体的MoAb(OKT3)减少体内的T细胞。另外，使用MoAb治疗移植物抗宿主病取得了一定成功。已经建立了一种临床试验，评价抗CD4 MoAb在治疗多发性硬化病中减少T细胞亚群的能力。
因此，给予单克隆抗体的方法对于本领域的技术一般的临床医师而言也是熟知的。在单独或与针对癌基因HER2的重组单克隆抗体联合的化学治疗的III期随机的有对照的研究中，提供了典型的方法和给药流程。
所有的对研究的分支重组人源化单克隆抗体Her2随机化的患者都在第0天(输注单克隆抗体HER2的第一天，或在对照组中的患者随机化的那一天)静脉内接受4mg/kg负载量的治疗，然后在整个研究过程中每周一次静脉内接受2mg/kg剂量的治疗。在每一次研究就诊期间通过一种临床评价监测所有的患者，所述临床评价为症状指导的体检(如果合适)和实验室试验。在研究过程中对所有的患者以规定的间隔进行常规的肿瘤评价。记录下所有的不利事件。
如以上对HER2单克隆抗体的描述，进行本发明的催化性抗体的给予。如在HER2研究中一样，在输注后将评价患者以测定给予的催化性抗体的功效。
倘若如上给予的催化性抗体在患者中产生了不良副作用，则给予免疫性CRAA，以共价抑制所述催化性抗体的作用。
实施例V
使用本发明的CRAA自动免疫
使用先前开发的方法，用设计用来激发抗所需抗原的保护性抗体应答的疫苗进行自动免疫[82，83]。例如，可以将CRAA和诸如明矾的合适的佐剂制剂混合，以最适于最大抗体合成的剂量(每公斤体重100-1000μg)肌内给予，并可以以4周的间隔给予2或3次的加强注射，直至血清中的催化性抗体浓度达到平台水平。如此产生的保护性免疫力预期将持续几年，因为接种疫苗将导致形成特异性的长寿命记忆细胞，它们一暴露于入侵的生物体或癌细胞就可以被刺激产生抗体。在实施例I和II中陈述了测定催化性抗体浓度的说明和方法。因为针对大多数抗原的抗体合成应答是T细胞依赖性的，所以可以如在实施例II中关于gp120的描述，通过肽合成将合适的T细胞表位加入到免疫原中。另一方面，如果需要，可以通过Lys侧链氨基或Cys侧链巯基偶联，将诸如匙孔血蓝蛋白的载体缀合至CRAA，以使抗体应答最大化。
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尽管上文已经描述和具体例举了本发明的某些优选的实施方案，但无意将本发明限制于这些实施方案当中。可以不脱离如在以下权利要求书中提出的本发明的范围和精神，进行各种修改。
序列表
<110>Sudhir Paul
     Larry J.Smith
     Gennady Gololobov
<120>鉴定催化性抗体的诱导物和抑制物的方法、组合物及其应用
<130>UNMC 63123
<140>
<141>1999年3月23日
<150>US09/046,373
<151>1998年3月23日
<160>10
<170>FastSEQ for Windows版本3.0
<210>1
<211>16
<212>PRT
<213>人免疫缺陷病毒-1
<400>1
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala
 1                5                 10                  15
<210>2
<211>15
<212>PRT
<213>破伤风梭菌
<400>2
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1                5                   10                  15
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>3
Met Glu Glu Asp Gly Val Arg Lys Cys
 1               5
<210>4
<211>6
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>4
Cys Glu Gly Pro Cys Arg
 1               5
<210>5
<211>11
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>5
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly
 1               5                   10
<210>6
<211>4
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>6
Ala Met Tyr Ala
 1
<210>7
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>7
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu
 1               5
<210>8
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>8
Asp Asn Gln Leu Val Val Pro
 1               5
<210>9
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>9
Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys
 1               5
<210>10
<211>7
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>10
Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu
 1               5

Claims (3)

1.图4所示的化合物。
2.图10所示的膦酸苯酯化合物。
3.治疗与内源产生的催化性抗体的存在相关的病理状况的药用制剂，其特征在于该制剂包含一种权利要求1或2所述的化合物和一种生物相容性介质，上述化合物能与上述内源产生的催化性抗体不可逆地结合，且上述化合物的量足以抑制上述催化性抗体活性。
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