JP2987818B2

JP2987818B2 - Ｔｘａ２受容体およびそれをコードする遺伝子

Info

Publication number: JP2987818B2
Application number: JP2410885A
Authority: JP
Inventors: 周成宮; 重忠中西
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1990-12-14
Filing date: 1990-12-14
Publication date: 1999-12-06
Anticipated expiration: 2014-12-06
Also published as: KR100220256B1; GR3020785T3; DE69120380D1; JPH04210595A; EP0490410A1; ATE139564T1; DE69120380T2; EP0490410B1; DK0490410T3; KR920012433A; ES2090221T3

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はTXA₂受容体をコードする
遺伝子、該遺伝子を用いるTXA₂受容体の製造法、該製造
法により得られるTXA₂受容体、該遺伝子を発現する宿
主、該遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブ、
および該プローブを用いる該遺伝子の検出法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トロンボキサン(TX)A₂は非常に不安定な
アラキドン酸代謝産物で、強力な血小板凝集因子であ
り、かつ、血管および器官平滑筋の収縮作用を有する。
また、TXA₂は、心筋梗塞、発作、および気管支喘息のよ
うな疾病の媒介物質であることが示唆されている。本発
明者らは、先に、TXA₂の安定な誘導体S-145を用いるこ
とにより、ヒト血小板TXA₂受容体を見かけ上純粋になる
まで精製した(Ushikubi, F.ら、J. Biol. Chem.264,164
96-16501(1989))。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】TXA₂を含む生物学的に
活性なアラキドン酸代謝物は、総称してエイコサノイド
と呼ばれ、３０以上の物質からなる大きなファミリーで
あり、そのファミリーのそれぞれが特異的な受容体に作
用し、種々の活性を表わす。このファミリーに属する物
質の受容体の構造は、未だ解明されていない。このファ
ミリーに属する１つの物質の受容体の構造が明らかにな
れば、その他の物質の受容体構造の解明が容易になり、
病態生理学的に重要なこれらの物質を制御する、より選
択的な薬剤の開発が可能になる。TXA₂受容体に特異的に
結合する薬剤の探索やTXA₂受容体そのものの研究には、
比較的大量のTXA₂受容体が必要であるが、それに必要な
量のTXA₂受容体を供給し得る手段が無いのが現状であ
る。また、TXA₂受容体を発現する細胞は、そのアゴニス
トやアンタゴニストの探索や、受容体からの信号伝達機
構の解明研究に必須であるが、現在、容易に十分に得る
ことはできない。さらに、現在、ヒト細胞中のTXA₂受容
体遺伝子の発現を、特異的に検出する手段も無い。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ヒト血小
板TXA₂受容体のアミノ酸配列の一部に対応するオリゴヌ
クレオチドプローブを用いて、ヒト胎盤からこの受容体
をコードするｃＤＮＡクローン単離し、またヒト巨核細
胞性白血病細胞の培養物から部分的なクローンを単離し
た。その胎盤ｃＤＮＡは３４３個のアミノ酸からなるタ
ンパク質をコードし、このタンパク質は７つの膜通過部
位を有していると推定された。ＣＯＳ−７細胞で発現さ
れたこのタンパク質は、血小板TXA₂受容体と同じ親和性
で種々の試薬と結合し、Xenopus oocyteで発現されたも
のはアゴニスト刺激によりCa²⁺活性化Cl^-チャンネルを
開いた。ノーザンブロット分析および上記２つのクロー
ンのヌクレオチド配列の決定により、血小板および血管
組織に存在するTXA₂受容体は同一のものであることが示
唆された。

【０００５】本発明によるTXA₂受容体のアミノ酸配列お
よび遺伝子配列の決定により、TXA₂が属するファミリー
の他の物質の受容体構造の明解が容易になる。本発明は
また、該遺伝子を宿主中で発現させるTXA₂受容体の製造
法、および、それにより得られるTXA₂受容体を提供し、
これにより、病態生理学的に重要な媒介物質を制御す
る、より選択的な薬剤の開発が可能になる。本発明はさ
らに、該遺伝子を発現する宿主を提供し、これにより、
TXA₂受容体のアゴニストやアンタゴニストの探索や、受
容体からの信号伝達機構の明解研究を行なうことができ
る。最後に、本発明は、該遺伝子と特異的にハイブリダ
イズするプローブを提供するものであり、これにより該
遺伝子の特異的な検出が可能になった。

【０００６】すなわち、本発明はまず、TXA₂受容体をコ
ードする遺伝子を提供し、好ましくは、該TXA₂受容体は
配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するものであ
る。本発明で言うTXA₂受容体をコードする遺伝子とは、
配列番号：１に記載のアミノ酸配列をコードするものだ
けでなく、TXA₂受容体活性を有する、特に下記のS-145
と特異的に結合する受容体タンパク質をコードする全て
の遺伝子を意味する。この遺伝子は、受容体のコード領
域だけでなくその前後に、プロモーター／オペレーター
配列、ＳＤ配列、ターミネーター、ポリアデニル化信号
などの、発現に有用な配列を有していてもよく、該受容
体の発現を阻害しない配列であれば如何なる配列を有し
ていてもよい。従って、該遺伝子を有するプラスミドや
ウイルス遺伝子、該遺伝子の発現ベクターも本発明に含
まれる。また、ここで言う遺伝子とは、ＤＮＡまたはＲ
ＮＡのいずれかを意味するが、その一方に限定されるも
のではない。

【０００７】本発明は、上記遺伝子を宿主中で発現させ
ることを特徴とするTXA₂受容体の製造法および該製造法
により得られるTXA₂受容体を提供する。該宿主は、真核
細胞であることが望ましい。本発明の製造法には、ＤＮ
Ａのみならず、ｍＲＮＡを用いてもよい。本発明のTXA₂
受容体は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する
ものだけでなく、TXA₂受容体活性を有する、特に下記の
S-145と特異的に結合する受容体タンパク質全てを意味
する。

【０００８】本発明は、上記遺伝子を発現する宿主をも
提供する。該宿主としては、真核細胞、特に、Xenopus
の卵母細胞やＣＯＳ−７細胞が好ましいが、当該技術分
野で良く知られた宿主／ベクター系を用いて、大腸菌や
枯草菌などの原核細胞宿主、酵母やＣＨＯ細胞などの真
核細胞宿主など公知のすべての宿主で該遺伝子を発現す
ることが可能である。

【０００９】本発明はさらに、上記遺伝子と特異的にハ
イブリダイズしうるプローブを提供する。このプローブ
とは、例えば下記のＭＥＧクローンのHincII断片（５８
６ｂｐ）が挙げられるが、上記遺伝子と特異的にハイブ
リダイズし、これを特異的に検出し得るものであれば如
何なるものでもよい。また、ＤＮＡに限定されず、ＲＮ
Ａでもよい。このプローブは、適当な標識物、好ましく
は、放射性物質（³²Ｐなど）で標識しておくのが好まし
い。このプローブを、通常のノーザンブロット分析法な
どに従い、試料中の遺伝子とハイブリダイズさせること
により、該遺伝子を特異的に検出することが可能にな
る。

【００１０】以下に、本発明をさらに詳細に説明する。
精製されたヒト血小板TXA₂受容体をタンパク質分解反応
に付し、４つの部分的アミノ酸配列を決定した。この配
列の一部を、41-merのオリゴヌクレオイドプローブのデ
ザインに用いた。このプローブを用いて、ヒト巨核細胞
性白血病培養細胞ＭＥＧ−０１(Nakajima, M.ら, Biocn
hem. Biophys. Res. Commun. 158. 958-965 (1988))の
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、１.４ＫＢ
挿入物を有する１つの陽性クローン(ＭＥＧ）を単離し
た。ＭＥＧのヌクレオイド配列を決定したところ、これ
は部分的クローンであることが判明した。そのため、Ｍ
ＥＧのHincII断片(586bp)をヒト胎盤ｃＤＮＡライブラ
リーをスクリーニングするためのプローブとして用い
た。胎盤は、ノーザンブロット分析において最も強く反
応したため、ｃＤＮＡ源として選択した。その結果、全
コード領域を含む２.９ｋｂの挿入物を有する１つの陽
性クローン(ＨＰＬ)が単離された。本発明の追試にあた
っては、配列表の配列番号：１に記載のＤＮＡ配列に基
づき合成したプローブを用いてスクリーニングを行なえ
ば、容易にTXA₂受容体をコードするクローンが単離でき
るであろう。

【００１１】図１および配列表に、ＨＰＬの制限酵素地
図、ヌクレオチド配列(２,９３２ｂｐ)および推定され
るアミノ酸配列を示す。オープンリーディングフレーム
は、３４３アミノ酸からなるタンパク質（相対分子量：
３７,４２９）をコードした。ＭＥＧは、２ケ所の置換
があるが、配列番号：１のＨＰＬの１５７２から２９２
３番目のヌクレオチド配列に対応し、その重複部分にお
ける推定のアミノ酸配列は同一であった。ＨＰＬのＮ末
端配列は、アミノ酸配列を決定した４つの部分の１つと
一致し、そこには２つのＮ−グリコシレイション部位が
あるが、ペプチド分析においてシグナル配列は見出され
なかった。推定されたアミノ酸配列の疎水性分析によ
り、膜通過部位と考えられる７ケ所の疎水性部位（配列
番号：１における、Ｉ：３０〜５２、II：６７〜８６、
III：１０７〜１２８、IV：１５０〜１７２、Ｖ：１９
４〜２１９、VI：２４７〜２７０、VII：２９０〜３１
１）が明らかになった。

【００１２】本受容体とロドプシン型受容体とを比較し
た結果、本受容体と他の受容体との間には、特に膜通過
部位を推定された部分において、かなりの相同性があ
り、これは本受容体がこの受容体ファミリーに属してい
ることを示唆している。ロドプシンおよびサブスタンス
Ｐの受容体と同様に、本発明のTXA₂受容体の３番目の膜
通過部位にはＡｓｐが無く、これはアドレナリン受容体
においてはリガンドのアミノ基に結合するものと推定さ
れている。他方、本発明のTXA₂受容体は、７番目の膜通
過部位に、牛ロドプシンのＬｙｓ²⁹⁶に対応する位置に
ある、Ａｒｇ²⁹⁵を有している。後者のアミノ酸残基
は、ロドプシン分子の膜結合部位であると同定されてい
る。本発明のTXA₂受容体の構造的特徴は、この受容体の
リガンドが酸性であるという特徴を反映したものであろ
う。

【００１３】このTXA₂受容体の３番目の細胞質内環状部
は３０残基以下からなり、この環状部のＮ末端はロドプ
シンと高い相同性を示す。しかし、この環状部のＣ末端
には、他の受容体で見られるような塩基性アミノ酸に富
む部分がない。これらの部位は、結合Ｇタンパク質との
結合やその特異性を決定する部分である。本発明のTXA₂
受容体に結合するＧタンパク質は、百日咳毒やコレラ毒
に感受性を示さないことが知られているが、未だ同定さ
れていない。

【００１４】短いＣ末端の尾部は、セリンおよびトレオ
ニンを合わせて６つ有しており、アドレナリン受容体、
特にβ₁受容体に相同性を示す。この構造は、信号伝達
経路がアゴニストにより誘導されて非感受性になること
に関連していると思われる。β受容体と同様に、TXA₂受
容体はアゴニスト刺激により非感受性になる。

【００１５】ＨＰＬがTXA₂受容体をコードしていること
を確認するため、ＨＰＬの２.０ｋｂ断片を真核細胞発
現ベクターＣＤＭ８（Seed, B.、Nature 329, 840-842
(1987)）にサブクローン化し、このプラスミドをＣＯＳ
−７細胞に導入した。リガンドとの結合は、選択的TXA₂
受容体アンタゴニストである[³H]S-145（Ushikubi, F.
ら、Eicosanoids 2, 21-27 (1989)）を用いて調べた。
形質転換したＣＯＳ細胞の膜は、飽和まで[³H]S-145と
結合し、その解離定数（Ｋｄ）は１.２ｎＭであった。
これは、新鮮な血小板由来の膜について観察されるもの
に匹敵する。この結合の特異性は、種々のプロスタノイ
ドやTXA₂誘導体を用いて分析した。TXA₂アゴニスト（Ｓ
ＴＡ₂）とアンタゴニスト（Ｓ−１４５、ＯＮＯ−３７
０８）は、[³H]S-145の結合と、他の細胞のTXA₂受容体
について観察されたものと同一のオーダーで、競合し
た。他のプロスタグランジン（ＰＧｓ）および不活性な
TXA₂代謝物（TXB₂）は、この競合反応において、1/100
以下の活性しか示さなかった。

【００１６】TXA₂受容体の刺激により、ＰＩ転移やCa²⁺
移動が誘発されていることが知られている。よって、Ｐ
Ｉ転移と連動したアゴニスト刺激により内因性Ca²⁺依存
性Cl^-チャンネルが開く、Xenopusの卵母細胞で本発明の
クローンを発現させた。このクローンのin vitro転写ｍ
ＲＮＡを注射した卵母細胞へ、１μＭのＳＴＡ₂を作用
させたところ、数百ｎＡの速い内部電流が起こり、続い
て低幅の電流の遅い相が現れた。この応答反応は、１ｎ
Ｍ程度の低いＳＴＡ₂濃度においても観察された。ＰＧ
Ｄ₂やＰＧＦ₂αは、１μＭでこのような応答反応を引き
起こさなかった。ＰＧＥ₁、Ｅ₂、Ｉ₂のような他のＰＧ
ｓおよびＴＸＢ₂はいずれも、このような実験条件下で
は、応答反応を引き起こさなかった。以上のように、Ｈ
ＰＬによりコードされるタンパク質は、TXA₂受容体の特
徴であるリガンド結合能を有し、本来の受容体が起こす
応答反応と同じ応答を引き起こした。

【００１７】種々の組織におけるTXA₂受容体ｍＲＮＡの
発現をノーザンブロットにより分析することは、受容体
サブタイプの存在が議論されているため、興味深いこと
である。ラットの種々の組織由来のポリ（Ａ）₊ＲＮＡ
を用いて詳細に分析してみたが、たぶんこの受容体の種
特異性のため、ほとんどシグナルは現れなかった。従っ
て、ヒト胎盤、ヒト肺、培養ＭＥＧ−０１細胞由来のポ
リ（Ａ）⁺ＲＮＡについて分析を行なった。胎盤と肺はT
XA₂受容体に富む代表的な組織である。過酷な条件下
で、３つの全てのレーンの２,８ｋｂに、大きなハイブ
リダイゼイションバンドが観察され、胎盤ＲＮＡが最も
強いものであった。このレーンでは、３. ５ｋｂに小さ
なバンドが存在した。この３.５ｋｂのバンドは、長時
間反応させることにより、ＭＥＧ−０１のポリ（Ａ）⁺
ＲＮＡのレーンでも明瞭になった。これらの結果と、Ｍ
ＥＧおよびＨＰＬが同一のアミノ酸配列をコードすると
いう上記の見知から、同一種のｍＲＮＡが血小板前駆細
胞や多血管組織で発現されることが示唆された。

【００１８】生物学的に活性なアラキドン酸代謝物は、
総称してエイコサノイドと呼ばれるが、３０以上の物質
からなる大きなファミリーであり、そのファミリーのそ
れぞれが特異的な受容体に作用し、種々の活性を表わ
す。サイコサノイド受容体のクローニングにより、この
ファミリーの他の物質の受容体構造の解明が容易にな
り、病態生理学的に重要な媒介物質を制御する、より選
択的な薬剤の開発が可能になる。

【００１９】

【実施例】クローニングヒト血小板TXA₂受容体を、見かけ上純粋になるまで精製
し(Ushikubi, F.ら、J. Biol. Chem.264, 16496-16501
(1989))、シアン化臭素、リジルエンドペプチダーゼお
よびトリプシンによるタンパク質分解反応に付した。ペ
プチド断片は逆相ＨＰＬＣにより単離し、自動化パルス
液相タンパク質シーケンサーによりその配列を決定し
た。この配列の一部（配列番号：１の296から309までの
アミノ酸配列）から、４１merの混合オリゴヌクレオチ
ドプローブをデザインした。ＭＥＧ−０１ｃＤＮＡライ
ブラリーを、5′末端で放射ラベルしたこのプローブで
スクリーニングした。その結果、１つの陽性クローン、
ＭＥＧが単離された。このクローン中の１.４ｋｂ挿入
配列は、精製したタンパク質の４つの部分アミノ酸配列
のうちの２つを含む１つのオープンリーディングフレー
ムを有していた。このＭＥＧの５８６ｂｐのHincII断片
を、次の胎盤ｃＤＮＡライブラリー（T. Maniatisら、M
olecular Cloning (1989), Cold Spring Harbor Labora
tory Press, Cold Spring Harbor, NY参照）のスクリー
ニングに用いた。１つの陽性クローンが単離されたの
で、これを分析した。ＤＮＡ配列の決定は、ジデオキシ
鎖終止法を用いて、２重鎖鋳型について行なった。

【００２０】図１に、ヒト胎盤由来のTXA₂受容体クロー
ン（ＨＰＬ）およびヒト巨核細胞性白血病培養細胞由来
のTXA₂受容体クローン（ＭＥＧ）の制限酵素地図を示
す。点刻した四角の部分は、コード領域である。

【００２１】配列表の配列番号：１に、ＨＰＬのヌクレ
オチド配列および推定されるアミノ酸配列を示す。5′
末端のＡＴＧトリプレットは、そのフレーム内に、精製
されたタンパク質の部分アミノ酸配列の全てを含むの
で、翻訳開始コドンであると同定された。5′非翻訳領
域に１８個の他のＡＴＧが存在するが、全てリーディン
グフレームが短か過ぎる。ポリアデニル化シグナルは、
配列番号：１の2908〜2913であると推定された。タン
パク質分解されたペプチドから得られた４つの配列は、
配列番号：１のアミノ酸配列の1〜19、131〜141、277〜
284、289〜322と一致した。配列番号：１のアミノ酸配
列の4および16のＡｓｎは、Ｎ−グリコシレイション部
位であると推定された。ＭＥＧは、配列番号：１のＨＰ
Ｌの1572 から２９２３までのヌクレオチド配列を含む
が、２つの置換がある。配列番号：１のＨＰＬの1786と
1915の位置で、いずれもＴ→Ｃとなっている。これらの
置換は、これらのコドンによりコードされるアミノ酸配
列を変えるものではない。

【００２２】発現ＨＰＬをBamHIで消化し、5′非翻訳領域の大部分を除去
し、得られた２.０ｋｂ断片を、真核細胞発現ベクター
ＣＤＭ８（Seed, B., Nature 239, 840-842 (1987)）の
HindIII-XbaI部位に挿入した。改良ＤＥＡＥ−デキスト
ラン法（Ausbel, F. M.ら、Current Protocols in Mole
cular Biology. 9.2.5 (Wiley, Ney York, 1989)）に従
って、ＣＯＳ−７細胞を形質転換した。形質転換の６０
時間後、細胞を回収し、１ｍＭベンザミジンと０.３ｍ
ＭＰＭＳＦの存在下で、上記Ausbel, F. M.らの方法に
従い細胞をホモジナイズして膜を調製した。膜は、最終
的に、２０ｍＭＮａ−Ｍｅｓ（ｐＨ６.４）と５ｍＭ
ＥＧＴＡに懸濁し、[³H]S-145（２４Ｃｉ／ｍｍｏｌ）
との結合実験をUshikubi, F.ら, Eicosanoids 2, 21-27
(1989)に記載の方法に従って行なった。競合実験は、
１.２５ｎＭ [³H]S-145と種々の濃度のリガンドを用い
て行なった。

【００２３】形質転換したＣＯＳ細胞の膜は、飽和まで
[³H]S-145と結合し、その解離定数（Ｋｄ）は１.２ｎＭ
であった。これは、新鮮な血小板由来の膜について観察
されるものに匹敵する。最大結合Ｂｍａｘ値は、２.２
ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質であった。

【００２４】競合実験の結果、TXA₂アゴニスト（ＳＴＡ
₂）とアンタゴニスト（Ｓ−１４５、ＯＮＯ−３７０
８）は、他の細胞のTXA₂受容体について観察されたもの
と同一のオーダーで、[³H]S-145と競合した。他のプロ
スタグランジン（PGD₂、PGF₂α、PGE₂、PGI₂）および不
活性なTXA₂代謝物（TXB₂）は、この競合反応において、
1/100以下の活性しか示さなかった。

【００２５】応答反応ＨＰＬの２.０ｋｂのBamHIサブクローン由来のin vitro
合成ｍＲＮＡをXenopusの卵母細胞に注入し、４８時間
後に、電気生理学的応答反応を測定した。１００μＭ濃
度でエタノールに溶解したTXA₂アゴニストSTA₂および他
のＰＧｓを、１μＭ濃度で培地に加え、卵母細胞の応答
反応を、Masu, Y.ら,Nature 329, 836-838 (1987)に記
載の２マイクロピペット電圧クランプ法により記録し
た。

【００２６】１μＭのＳＴＡ₂を作用させたところ、数
百ｎＡの速い内部電流が起こり、続いて低幅の電流の遅
い相が現れた。この反応は、１ｎＭ程度の低いＳＴＡ₂
濃度においても見られた。ＰＧＤ₂やＰＧＦ₂αは、１μ
Ｍで反応を引き起こさなかった。ＰＧＥ₁、Ｅ₂、Ｉ₂の
ような他のＰＧｓおよびＴＸＢ₂はいずれも、このよう
な実験条件下では、反応を引き起こさなかった。このよ
うに、ＨＰＬによりコードされるタンパク質は、TXA₂受
容体の特徴であるリガンド結合能を有し、本来の受容体
が起こす応答反応を引き起こした。

【００２７】ノーザンブロット分析全ＲＮＡは、ＭＥＧ−０１細胞、ヒト胎盤、ヒト肺のそ
れぞれから、チオシアン酸グアニジニウム−塩化セシウ
ム法により調製した。ポリ(Ａ)⁺ＲＮＡは、オリゴー
（ｄＴ）セルロースカラムを用いて単離した。それぞれ
のポリ(Ａ)⁺ＲＮＡを２０μｇ、ホルムアルデヒドアガ
ロースゲル電気泳動に付し、Byodyne膜に移し、ＵＶで
架橋結合させた。フィルターは、５×ＳＳＣ緩衝液、５
×デンハート溶液、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ
６.５、２００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ、５０
％ホルムアミド、および０.１％ＳＤＳ中で、４２℃、
４時間、プレハイブリダイズさせた後、同じ緩衝液中、
４２℃で１夜、ランダムプライミング法により³²Ｐ−ｄ
ＣＴＰで標識したＭＥＧクローンの５８６ｂｐ HincII
断片（４×１０⁶ｃ．ｐ．ｍ．ｍｌ^-1）とハイブリダイ
ズさせた。このフィルターを、０.１×ＳＳＣ、０.１％
ＳＤＳ中、６５℃で１時間、２回洗浄し、−８０℃で強
化スクリーンの存在下、１２日間、Ｘ線フィルムにさら
した。

【００２８】ヒト胎盤、ヒト肺、培養ＭＥＧ−０１細胞
由来のポリ（Ａ）⁺ＲＮＡについて分析を行なったが、
胎盤と肺はTXA₂受容体に富む代表的な組織である。過酷
な条件下で、３つの全てのレーンの２.８ｋｂに、大き
なハイブリダイゼイションバンドが観察され、胎盤ＲＮ
Ａが最も強いものであった。この胎盤ＲＮＡのレーンで
は、３.５ｋｂに小さなバンドが存在した。このバンド
は、長時間反応させることにより、ＭＥＧ−０１のポリ
（Ａ）⁺ＲＮＡのレーンでも明瞭になった。これらの結
果と、ＭＥＧおよびＨＰＬが同一のアミノ酸配列をコー
ドするという上記の見知から、同一種のｍＲＮＡが血小
板前駆細胞や多血管組織で発現されることが示唆され
た。

【配列表】

【００２９】配列番号：１配列の長さ：2932 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル：No アンチセンス：No 起源生物名：ヒト組織の種類：胎盤クローン名：HPL 配列の特徴特徴を表す記号：polyA signal 存在位置：2908..2913 特徴を決定した方法：S 配列 GTAATGCAGA GATAATAAAA CTTCTTAGGT CCATAGGTCT TATAATAATT TAATAACCTA 60 AACATGGTAT ACAAATTCCT CCAAACCCAA TAACATAATT ATAGTTTCAA AAAGTTCCCC 120 AAACTTTCAA GTTAGATTTT ATTGCTTTGA TGAGTGGCTT TAAATATGAA AAGTCTTGCC 180 TGTGAAGGGC AATCCTTTTC CCGTGGACTG GGATCTATAG AAATACAGAA ATGTGCCCAG 240 GGGTTCATCT CCCTAATAAC CATCATTCAC ATTTCTCAAC CTCCCTAATA ACCAGCCACC 300 ATGTGAGAAG GATCCACAGT TACTGTTTAT GACTATAATT AACTAGTACC TGGGACTGGT 360 CAGTGGAGTT GGTTGCAACC TGATGCTAAG GATGTCAAAG TTGTCTCGGC CTCTGTTCCC 420 AGCCAGTAAG TAATTCCCTG GCCTCGGGCC ATACCCCCTA ATCTTGGTCA GCTGATTATG 480 ACAGGCAGAC AGCACAGTAA ATAACACTAT ATATTAAGAA AACCCAAAGC ATATGTATCA 540 ATGGTATATA CCCAACAGCA TCCTAGGAAT GGAGAGTCTG TAGCAAGGGC CTCCAATGTG 600 AAGGTCAACA CAGTCACTGT GATGCGTGTA TTTCCATTTT GTAAAGCATG ATCTCTGGTG 660 GTCATTTTTA TCTTCCTAAC TTATTGGAAA AGTCTCCTGT TTTGGGGGCC CGCCCCTGGT 720 CACAGCCAGA CTGACTCAGT TTCCCTGGGA GGTCCCGCTC GAGCCCGTCC TTCCCCTCCC 780 TCTGCCCGCC CCCAGCCCTC GCCCCACCCT CGGCGCCCGC ACATCTGCCT GCTCAGCTCC 840 AGACGGCGCC CGGACCCCCG GGCGCGGGAT CCAGCCAGGT GGGAGCCCCG CAGATGAGGT 900 CTCTGAAGGT GTGCCTGAAC CAGTGCCAGC CTGCCCTGTC TGCAGCATCG GCCTGATGGG 960 GTGGTGACTG ATCCCTCAGG GCTCCGGAGC C ATG TGG CCC AAC GGC AGT TTC 1012 Met Trp Pro Asn Gly Ser Ser 1 5 CTG GGG CCC TGT TTC CGG CCC ACA AAC ATT ACC CTG GAG GAG AGA CGG 1060 Leu Gly Pro Cys Phe Arg Pro Thr Asn Ile Thr Leu Glu Glu Arg Arg 10 15 20 CTG ATC GCC TCG CCC TGG TTC GCC GCC TCC TTC TGC GTG GTG GGC CTG 1108 Leu Ile Ala Ser Pro Trp Phe Ala Ala Ser Phe Cys Val Val Gly Leu 25 30 35 GCC TCC AAC CTG CTG GCC CTG AGC GTG CTG GCG GGC GCG CGG CAG GGG 1156 Ala Ser Asn Leu Leu Ala Leu Ser Val Leu Ala Gly Ala Arg Gln Gly 40 45 50 55 GGT TCG CAC ACG CGC TCC TCC TTC CTC ACC TTC CTC TGC GGC CTC GTC 1204 Gly Ser His Thr Arg Ser Ser Phe Leu Thr Phe Leu Cys Gly Leu Val 60 65 70 CTC ACC GAC TTC CTG GGG CTG CTG GTG ACC GGT ACC ATC GTG GTG TCC 1252 Leu Thr Asp Phe Leu Gly Leu Leu Val Thr Gly Thr Ile Val Val Ser 75 80 85 CAG CAC GCC GCG CTC TTC GAG TGG CAC GCC GTG GAC CCT GGC TGC CGT 1300 Gln His Ala Ala Leu Phe Glu Trp His Ala Val Asp Pro Gly Cys Arg 90 95 100 CTC TGT CGC TTC ATG GGC GTC GTC ATG ATC TTC TTC GGC CTG TCC CCG 1348 Leu Cys Arg Phe Met Gly Val Val Met Ile Phe Phe Gly Leu Ser Pro 105 110 115 CTG CTG CTG GGG GCC GCC ATG GCC TCA GAG CGC TAC CTG GGT ATC ACC 1396 Leu Leu Leu Gly Ala Ala Met Ala Ser Glu Arg Tyr Leu Gly Ile Thr 120 125 130 135 CGG CCC TTC TCG CGC CCG GCG GTC GCC TCG CAG CGC CGC GCC TGG GCC 1444 Arg Pro Phe Ser Arg Pro Ala Val Ala Ser Gln Arg Ar Ala Trp Ala 140 145 150 ACC GTG GGG CTG GTG TGG GCG GCC GCG CTG GCG CTG GGC CTG CTG CCC 1492 Thr Val Gly Leu Val Trp Ala Ala Ala Leu Ala Leu Gly Leu Leu Pro 155 160 165 CTG CTG GGC GTG GGT CGC TAC ACC GTG CAA TAC CCG GGG TCC TGG TGC 1540 Leu Leu Gly Val Gly Arg Tyr Thr Val Gln Tyr Pro Gly Ser Trp Cys 170 175 180 TTC CTG ACG CTG GGC GCC GAG TCC GGG GAC GTG GCC TTC GGG CTG CTC 1588 Phe Leu Thr Leu Gly Ala Glu Ser Gly Asp Val Ala Phe Gly Leu Leu 185 190 195 TTC TCC ATG CTG GGC GGC CTC TCG GTC GGG CTG TCC TTC CTG CTG AAC 1636 Phe Ser Met Leu Gly Gly Leu Ser Val Gly Leu Ser Phe Leu Leu Asn 200 205 210 215 ACG GTC AGC GTG GCC ACC CTG TGC CAC GTC TAC CAC GGG CAG GAG GCG 1684 Thr Val Ser Val Ala Thr Leu Cys His Val Tyr His Gly Gln Glu Ala 220 225 230 GCC CAG CAG CGT CCC CGG GAC TCC GAG GTG GAG ATG ATG GCT CAG CTC 1732 Ala Gln Gln Arg Pro Arg Asp Ser Glu Val Glu Met Met Ala Gln Leu 235 240 245 CTG GGG ATC ATG GTG GTG GCC AGC GTG TGT TGG CTG CCC CTT CTG GTC 1780 Leu Gly Ile Met Val Val Ala Ser Val Cys Trp Leu Pro Leu Leu Val 250 255 260 TTC ATT GCC CAG ACA GTG CTG CGA AAC CCG CCT GCC ATG AGC CCC GCC 1828 Phe Ile Ala Gln Thr Val Leu Arg Asn Pro Pro Ala Met Ser Pro Ala 265 270 275 GGG CAG CTG TCC CGC ACC ACG GAG AAG GAG CTG CTC ATC TAC TTG CGC 1876 Gly Gln Leu Ser Arg Thr Thr Glu Lys Glu Leu Leu Ile Tyr Leu Arg 280 285 290 295 GTG GCC ACC TGG AAC CAG ATC CTG GAC CCC TGG GTG TAT ATC CTG TTC 1924 Val Ala Thr Trp Asn Gln Ile Leu Asp Pro Trp Val Tyr Ile Leu Phe 300 305 310 CGC CGC GCC GTG CTC CGG CGT CTC CAG CCT CGC CTC AGC ACC CGG CCC 1972 Arg Arg Ala Val Leu Arg Arg Leu Gln Pro Arg Leu Ser Thr Arg Pro 315 320 325 AGG TCG CTG TCC CTC CAG CCC CAG CTC ACG CAG CGC TCC GGG CTG CAG 2020 Arg Ser Leu Ser Leu Gln Pro Gln Leu Thr Gln Arg Ser Gly Leu Gln 330 335 340 TAGGAAGTGG ACAGAGCGCC CCTCCCGCGC CTTTCCGCGG AGCCCTTGGC CCCTCGGACA 2080 GCCCATCTGC CTGTTCTGAG GATTCAGGGG CTGGGGGTGC TGGATGGACA GTGGGCATCA 2140 GCAGCAGGGT TTTGGGTTGA CCCCAATCCA ACCCGGGGAC CCCCAACTCC TCCCTGATCC 2200 TTTTACCAAG CACTCTCCCT TCCTCGGCCC CTTTTTCCCA TCCAGAGCTC CCACCCCTTC 2260 TCTGCGTCCC TCCCAACCCC AGGAAGGGCA TGCAGACATT GGAAGAGGGT CTTGCATTGC 2320 TATTTTTTTT TTTAGACGGA GTCTTGCTCT GTCCCCCAGG CTGGAGTGCA GTGGCGCAAT 2380 CTCAGCTCAC TGCAACCTCC ACCTCCCGGG TTCAAGCGAT TCTCCTGCCT CAGCCTCCTG 2440 AGTAGCTGGG ACTATAGGCG CGCGCCACCA CGCCCGGCTA ATTTTTGTAT TTTTAGTAGA 2500 GACGGGGTTT CACCGTGTTG GCCAGGCTGG TCTTGAACTC CTGACCTCAG GTGATTCACC 2560 AGCCTCAGCC TCCCAAAGTG CTGGGATCAC AGGCATGAAC CACCACACCT GGCCATTTTT 2620 TTTTTTTTTT TAGACGGAGT CTCACTCTGT GGCCCAGCCT GGAGTACAGT GGCACGATCT 2680 CGGCTCACTG CAACCTCCGC CTCCCGGGTT CAAGCGATTC TCGTGCCTCA GCCTCCCGAG 2740 CAGCTGGGAT TACAGGCGTA AGCCACTGCG CCCGGCCTTG ACTGCTCTTT GACCCTGAAT 2800 TTGACCTACT TGCTGGGGTA CAGTTGCTTC CTTTTGAACC TCCAACAGGG AAGGCTCTGT 2860 CCAGAAAGGA TTGAATGTGA AACGGGGGCA CCCCCTTTTC TTGCCAAAAT ATATCTCTGC 2920 CTTTGGTTTT AT 2932

【図面の簡単な説明】

【図１】ＨＰＬおよびＭＥＧの制限酵素地図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 1/00 - 17/14 C12N 5/00 - 5/28 C12P 1/00 - 41/00 C12Q 1/00 - 1/70 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（ＧＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有す
るTXA₂受容体をコードする遺伝子。
【請求項２】請求項１に記載の遺伝子を宿主中で発現す
ることにより得られるTXA₂受容体。
【請求項３】該宿主が真核細胞である請求項２に記載の
TXA₂受容体。
【請求項４】請求項１に記載の遺伝子を宿主中で発現さ
せることを特徴とするTXA₂受容体の製造法。
【請求項５】該宿主が真核細胞である請求項４に記載の
製造法。
【請求項６】請求項１に記載の遺伝子を発現する宿主。
【請求項７】真核細胞である請求項６に記載の宿主。
【請求項８】請求項1に記載の遺伝子と特異的にハイブ
リダイズしうるプローブ。
【請求項９】MEGのHincII断片である請求項８に記載の
プローブ。
【請求項１０】請求項８または９に記載のプローブをハ
イブリダイズさせることを特徴とする請求項１に記載の
遺伝子の検出方法。