JPH07258295A

JPH07258295A - プロスタグランジンｄ受容体、その製造方法、その受容体をコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞

Info

Publication number: JPH07258295A
Application number: JP6075382A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Ichikawa; 厚市川; Ichikazu Nakao; 一和中尾; Shu Narumiya; 周成宮
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-03-22
Filing date: 1994-03-22
Publication date: 1995-10-09
Anticipated expiration: 2020-07-13
Also published as: JP3671403B2

Abstract

(57)【要約】【構成】哺乳動物のプロスタグランジン（ＰＧ）Ｄ受容
体、その製造方法、その受容体をコードするＤＮＡ、そ
のＤＮＡ配列に選択的にハイブリダイズするフラグメン
ト、そのＤＮＡからなる複製または発現ベクターおよび
そのベクターで形質転換された宿主細胞。【効果】本発明のポリペプチドは、それ自体、ＰＧＤ₂
と特異的に結合するのでＰＧＤ₂の過剰産生によって生
ずる疾患の予防あるいは治療剤、例えば、免疫賦活剤、
出血傾向の抑制剤等として用いることができる。また、
ＰＧＤ₂のアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有す
る物質のスクリーニングに用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、哺乳動物のプロスタグ
ランジンＤ受容体、その製造方法、その該受容体をコー
ドするＤＮＡ、そのＤＮＡからなる複製または発現ベク
ターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞に関
する。

【０００２】

【従来の技術】プロスタグランジン（ＰＧ）、トロンボ
キサン（ＴＸ）およびロイコトリエン（ＬＴ）ようなプ
ロスタノイドは、アラキドン酸の酸化代謝物のひとつの
ファミリーであり、生体内で局所ホメオスタシスを維持
するために種々の生理作用を発揮している（Annu. Rev.
Biochem. 47, 997 (1978)、The Pharmacological Basi
s of Therapeutics （Gilman, A. G., Good-man, L.
S., Rall, T. W., and Murad, F., eds) 7th Ed., pp 6
60, Macmillan Publishing Co., New York (1985)およ
び Annu. Rev. Pharm. Tox.,10, 213 (1989) 参照のこ
と）。それらの生理作用はそれぞれのプロスタノイドに
特有の細胞膜受容体によって制御されている（Comprehe
nsive Medicinal Chemistry (Hansch, C., Sammes, P.
G., Taylor,J. B. and Emmett, J. C. eds), 3 ,643, P
ergamon, Oxford (1990) 参照のこと）。

【０００３】プロスタノイドの一員であるプロスタグラ
ンジンＤ₂（ＰＧＤ₂）は、哺乳動物の多くの組織や細
胞中で、種々の生理学的刺激および病理学的刺激によっ
て、アラキドン酸から合成され（Arch. Biochem. Bioph
ys., 260, 521-531 (1988)）、それらの機能を調節する
ために種々の生理活性を発揮している（Prostaglandin
s, 35, 277-300 (1988)）。例えば、ＰＧＤ₂は血小板
凝集時に生成され、ネガティブフィードバックモジュレ
ータとして作用している（Prostaglandins, 16,373-388
(1978)）。また血管、胃および子宮の平滑筋を弛緩し
（Brit. J. Pharmacol.,85 ,367-375 (1985), Circulat
ion Res., 71, 1305-1313 (1992), Eur. J. Pharmaco
l., 81, 141-143 (1982)）、白血球の活性化を抑制し
（Brit. J. Pharmacol., 108, 1051-1054 (1993)）、自
律神経または知覚神経の伝達を調節するために末梢神経
に作用する（Am. J. Physiol., 260, G904-G910 (199
1), Brit.J. Pharmacol., 108, 185-190 (1993)）。さ
らにＰＧＤ₂は免疫反応で重要な役割を果たすために、
肥満細胞やマクロファージ系細胞によって放出される
（J. Immunol., 129, 1627-1631 (1982), J. Immunol.,
143, 2982-2989 (1989)）。中枢神経系においては、Ｐ
ＧＤ₂は、睡眠を生理学的にコントロールしているので
はないかと考えられている（FASEB J., 5 ,2575-2581
(1991) ）。

【０００４】このように、ＰＧＤ₂の生理学的作用につ
いては大いに注目されているが、ＰＧＤ₂の受容体を同
定し、解析するための薬理学的、生化学的研究は遅れて
いる。その理由としては、ＰＧＤ₂は比較的高濃度（１
０ｎＭから１μＭ）でその作用を発揮すること（Prosta
glandins, 16, 373-388 (1978)）、他のプロスタグラン
ジン類（ＰＧｓ）と同様に、他のプロスタノイドの受容
体とクロスリアクションすること（Prostaglandins, 3
5, 277-300 (1988), Comprehensive MedicinalChemistr
y, 3, 643-714 (1989)）、およびその顕著な生理作用に
もかかわらず組織中の受容体の数が少ないことが挙げら
れる。従って、ＰＧＤ受容体の性質、分布、局在化につ
いては現在まで不明である。

【０００５】

【発明の目的】最近、多数のプロスタノイド受容体のｃ
ＤＮＡが単離され、それらの一次構造が明らかになっ
た。具体的には、ＴＸＡ₂（Nature, 349, 617-620 (19
91), Biochem. Biophys. Res. Commun., 184, 1197-120
3 (1992)）、ＰＧＥ受容体のＥＰ１、ＥＰ２およびＥＰ
３サブタイプ（J. Biol. Chem., 267 ,6463-6466 (199
2),J. Biol. Chem., 268, 7759-7762 (1993), J. Biol.
Chem., 268 , 20175-20178 (1993)）、PGI （J. Biol.
Chem., (1994)）、およびＰＧＦ（J. Biol. Chem., 26
9 , 1356-1360 (1994)）の各受容体である。さらに、ヒ
トＴＸＡ₂受容体の遺伝子構造も明らかにされた（J. B
iol. Chem., 268 , 25253-25259 (1993)）。これらの研
究によって、プロスタノイドの受容体は、ロドプシンタ
イプＧ−プロテイン共役受容体スーパーファミリーのサ
ブファミリーを構成していることが判明した（Annu. Re
v. Neurosci., 12, 67-83 (1989)）。これらの研究で得
られた情報をもとに、本発明者等は、リバーストランス
クリプション−ポリメラーゼチェインリアクション（Re
verse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-
PCR ）法によってマウスＰＧＤ受容体をコードするｃＤ
ＮＡを単離することに成功した。さらに単離されたクロ
ーンのシークエンスを解析し、またＣＨＯ細胞で発現さ
せて分析した結果、それがマウスＰＧＤ受容体をコード
していることを明らかにして本発明を完成した。

【０００６】スイスプロット（Swiss Prot Release 2.
0）に登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配
列を調査したが、本発明のポリペプチドと同一の配列を
有しているものはまったく無かった。さらに、ジーンバ
ンク（GenBank Release 70.0）に登録されているヌクレ
オチド配列も調査したが、本発明のポリペプチドをコー
ドするｃＤＮＡと同一の配列は見つからなかった。従っ
て、本発明のポリペプチドはまったく新規なものである
ことが確認された。

【０００７】

【発明の構成】本発明は、実質的に純粋な形である哺乳
動物のＰＧＤ受容体に関する。ここでＰＧＤとは、ＰＧ
Ｄ₁、ＰＧＤ₂等のＰＧＤ類似体が挙げられるが、好ま
しくは、ＰＧＤ₂である。また、哺乳動物としては、ヒ
ト、マウス、ラット等が挙げられる。本発明の一態様と
しては、マウスのＰＧＤ受容体に関する。具体的には、
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド、そのホモローグ、その配列のフラグメント、および
そのホモローグに関する。本発明はさらにそれらのポリ
ペプチドをコードするＤＮＡに関する。より具体的に
は、配列番号２または３で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡ、および配列番号２または３で示される塩基配列に
選択的にハイブリダイズするフラグメントを有するＤＮ
Ａに関する。

【０００８】特に、本発明は、（１）配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列を含むポリペプチド、（２）前記
（１）に記載したポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
および（４）配列番号３で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡに関する。

【０００９】配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む
ポリペプチドとは、配列番号１で示されるアミノ酸配列
からなるポリペプチドだけでなく、そのポリペプチドの
Ｎ末端および／またはＣ末端に、配列番号１で示される
アミノ酸数の２０％、より好ましくは５％以内の別個の
ポリペプチドを付加したポリペプチドを意味する。

【００１０】実質的に純粋な形である配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、一般に、生
産時のポリペプチドの９０％以上、例えば９５、９８ま
たは９９％が配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む
ポリペプチドであることを意味する。

【００１１】配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む
ポリペプチドのホモローグとは、一般に少なくとも５０
個、好ましくは少なくとも１００個、例えば１５０、２
００または２５０個の連続したアミノ酸領域で、少なく
とも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、
より好ましくは９５％以上相同性のあるものであり、そ
のようなホモローグは、以後本発明ポリペプチドとして
記載される。

【００１２】さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配
列を含むポリペプチドのフラグメント、またはそれらの
ホモローグのフラグメントとは、少なくとも１０アミノ
酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、
２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味
する。

【００１３】配列番号２または３で示される塩基配列を
有するＤＮＡに選択的にハイブリダイズするＤＮＡと
は、一般に、少なくとも５０個、好ましくは少なくとも
１００個、例えば１５０、２００または２５０個の連続
した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少
なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上
の相同性のあるものであり、そのようなＤＮＡは、以後
本発明のＤＮＡとして記載される。

【００１４】配列番号２または３で示される塩基配列を
有するＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩
基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２
５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラ
グメントも本発明のＤＮＡに含まれる。

【００１５】本発明のＤＮＡは、遺伝子組換え法、合成
法あるいは当業者に公知の方法によって取得することが
できる。

【００１６】さらに、本発明には、本発明のＤＮＡから
なる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとし
ては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの
発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子な
どからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクタ
ーが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選
択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を
含んでいてもよい。

【００１７】さらに、本発明には、配列番号２または３
で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディ
ングフレームを有するＤＮＡを含む本発明のＤＮＡを複
製または発現させるためのベクターで形質転換された宿
主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、
昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。

【００１８】さらに、本発明には、本発明のポリペプチ
ドを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培
養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も
含まれる。

【００１９】本発明のポリペプチドとしては、配列番号
１で示されたアミノ酸配列を有するもの以外に、その一
部が欠損したもの（例えば、成熟蛋白中、生物活性の発
現に必須な部分だけからなるポリペプチド）、その一部
が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似し
たアミノ酸に置換したもの）、およびその一部に他のア
ミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。

【００２０】よく知られているように、ひとつのアミノ
酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、メチオニ
ン（Ｍｅｔ）は１種類、ロイシン（Ｌｅｕ）は６種類）
知られている。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列を
変えることなくＤＮＡの塩基配列を変えることができ
る。

【００２１】（２）で特定される本発明のＤＮＡには、
それぞれ配列番号１で示されるポリペプチドをコードす
るすべての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えるこ
とによって、ポリペプチドの生産性が向上することがあ
る。

【００２２】（３）で特定されるＤＮＡは、（２）で示
されるＤＮＡの一態様であり、天然型配列を表わす。

【００２３】（４）に示されるＤＮＡは、（３）で特定
されるＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。

【００２４】配列番号３で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡの作製は、以下の方法に従って行なわれる。すなわ
ち、(i) 本発明のポリペプチドが産生される細胞から
ｍＲＮＡを分離し、(ii) 該ｍＲＮＡからファーストス
トランド（１本鎖ＤＮＡ）、次いでセカンドストランド
（２本鎖ＤＮＡ）を合成し（ｃＤＮＡの作製）、(iii)
該ｃＤＮＡを適当なプラスミドベクターに組み込み、(i
v) 得られた組換えベクターで宿主細胞を形質転換し
（ｃＤＮＡライブラリーの作製）、(v) 得られたｃＤ
ＮＡライブラリーより、ハイブリダイゼーション法によ
り目的とするＤＮＡ含有プラスミドを単離し、(vi) 目
的とするＤＮＡの塩基配列を決定することによって作製
することができる。

【００２５】より詳細に説明すると、工程(i) は、哺乳
動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ等）の組織
中、ＰＧＤ受容体を発現していると考えられる組織、好
ましくは、肺、血管、白血球等の組織細胞より、Okayam
a, H. 等の方法（Method inEnzymology, 154 , 3(1987)
に記載）、Chirgwin, J. M. 等の方法（Biochem.,18,
5294 (1979) に記載）等の方法に従って行なわれる。(i
i)、(iii) および(iv)の工程はｃＤＮＡライブラリー作
製の工程であり、改変した Gubler ＆ Hoffman法（Gen
e, 25, 263(1983) に記載）に準じて行なわれる。(iii)
の工程で用いられるプラスミドベクターとしては大腸
菌内で機能するもの（例えば、ｐＢＲ３２２）や枯草菌
内で機能するもの（例えば、ｐＵＢ１１０）が多数知ら
れているが、好適には、大腸菌内で機能するλ−ＺＡＰ
IIが用いられる。(iv)の工程で用いられる宿主細胞は既
に多くのものが知られており、いずれを用いてもよい
が、好ましくはＤＨ５のコンピテントセル（Gene, 96,
23(1990)記載の方法により調製される。）である。最近
では、各動物の種々の組織のｃＤＮＡライブラリーが既
に市販されている。これらの市販のｃＤＮＡライブラリ
ーも好適に用いられる。工程(v) は、それ自体公知であ
り、例えば、プラークハイブリダイゼーション法、コロ
ニーハイブリダイゼーション法（Gene, 10, 63 (1980)
に記載）等によって行われる。また、適当なプローブと
しては、異種動物のＰＧＤ受容体のＤＮＡまたはそのフ
ラグメントまたは該ＤＮＡとホモロジーを有するＤＮＡ
が用いられる。工程(vi)はそれ自体公知であり、例えば
ジデオキシ・ターミネーター（dideoxy terminator）法
やマキサム・ギルバート（Maxam-Gilbert ）法により行
なわれる。

【００２６】配列番号２または３で示される塩基配列
が、一旦確定されると、その後は、化学合成によって、
またはＰＣＲ（polymerase chain reaction ）法によっ
て、あるいは該塩基配列の断片をプローブとしたハイブ
リダイズ法によって、本発明のＤＮＡを得ることができ
る。さらに、本ＤＮＡを含有するベクターＤＮＡを適当
な宿主に導入し、これを増殖させることによって、目的
とする本発明ＤＮＡを必要量得ることができる。もちろ
ん、本発明のＤＮＡは、以下の実施例に記載した方法に
よっても製造することができる。

【００２７】本発明のポリペプチド（配列番号１）を取
得する方法としては、（１）生体または培養細胞から精
製単離する方法、（２）ペプチド合成する方法、または
（３）遺伝子組換え技術を用いて生産する方法、などが
挙げられるが、工業的には（３）に記載した方法が好ま
しい。

【００２８】遺伝子組換え技術を用いてポリペプチドを
生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、
例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発
現系が挙げられる。

【００２９】例えば、大腸菌で発現させる場合には、蛋
白部分をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号２で示さ
れる塩基配列をコードするＤＮＡ）を、適当なプロモー
ター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモータ
ー、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流
に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢ
Ｒ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現
ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質転
換した大腸菌（例えば、E.coli ＤＨ１、E.coli ＪＭ
１０９、E.coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養
して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ること
ができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例え
ば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリ
プラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することも
できる。さらに、他のポリペプチドとのヒュージョンプ
ロテイン（fusion protein）を生産することもできる。

【００３０】また、哺乳動物細胞で発現させる場合に
は、例えば、配列番号３で示される塩基配列をコードす
るＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベ
クター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイ
ルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロ
モーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロ
モーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に
挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現
ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−
７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ
細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養
することによって、その培養液中に目的とするポリペプ
チドが分泌される。以上のようにして得られたポリペプ
チドは、一般的な生化学的方法によって単離精製するこ
とができる。

【００３１】

【発明の効果】本発明のポリペプチドは、それ自体、Ｐ
ＧＤ、とりわけＰＧＤ₂と特異的に結合するのでＰＧＤ
₂の過剰産生によって生ずる疾患の予防あるいは治療
剤、例えば、免疫賦活剤、出血傾向の抑制剤等として用
いることができる。また、ＰＧＤ₂のアゴニストまたは
アンタゴニスト活性を有する物質のスクリーニングに用
いられる。

【００３２】さらに、該ポリペプチドのポリクローナル
抗体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における
該ポリペプチドの定量が行なえ、これによって該ポリペ
プチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利
用することができる。ポリクローナル抗体およびモノク
ローナル抗体は該ポリペプチドあるいはその断片を抗原
として用いて常法により作製することができる。

【００３３】本発明のＤＮＡは、多大な有用性が期待さ
れる本発明のポリペプチドを生産する際の重要かつ必須
の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療に利用で
きる。また、本発明のＤＮＡをプローブとしてジェノミ
ック（genomic ）ＤＮＡを分離できる。同様にして、本
発明ＤＮＡと相同性の高いヒトの関連ポリペプチドの遺
伝子、またヒト以外の生物における本発明ポリペプチド
と相同性の高いポリペプチドの遺伝子を分離することも
可能である。

【００３４】

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的
に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するもので
はない。

【００３５】実施例１：マウスＰＧＤ受容体のｃＤＮＡ
クローニング（１）ＲＴ−ＰＣＲ法による、種々のプロスタノイド受
容体と相同性を示すマウス胸腺ｃＤＮＡフラグメントの
増幅一本鎖ｃＤＮＡをマウス胸腺由来全ＲＮＡから、ランダ
ムヘキサヌクレオチドをプライマーとして用いて合成し
た。ＰＣＲのプライマーとしては、種々のプロスタノイ
ド受容体で高度に保存されているアミノ酸配列に相当す
るオリゴヌクレオチドを合成して用いた。すなわち、２
番目の細胞外ループ領域中のＧｌｙＴｈｒＴｒｐＣｙｓ
Ｐｈｅ（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ）および７番目の膜貫通領域中
のＡｓｐＰｒｏＴｒｐＩｌｅ（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ）（Ｉｌ
ｅ／Ｌｅｕ）に相当する、それぞれ以下に示す合成ヌク
レオチドを用いた。

【００３６】

【化１】 5'-GG(A/G/C/T)AC(A/G/C/T)TGGTG(C/T)TT(C/T)(A/T)T-3' および 5'-A(T/G)(A/G)(A/T)A(A/G/T)ATCCA(A/G/C/T)GG(A/G)TC-3'

【００３７】増幅は、９５℃で１分間、３８℃で１分間
そして７０℃、１分間で３５回行なった。増幅されたｃ
ＤＮＡフラグメントは、pBluescript SK II (+) (Strat
agene 社製) ベクターにサブクローニングした。ランダ
ムにピックアップしたクローンについてシークエンシン
グした結果、フラグメントＰＧ２５は、他のプロスタノ
イド受容体の５番目と６番目の膜貫通領域と高い相同性
を有するシークエンスを含んでいた。

【００３８】（２）ハイブリダイゼーションによるマウ
スジェノミックライブラリーのスクリーニングマウスジェノミックライブラリー、λＦＩＸII（Strata
gene社製）中の２×１０⁵のクローンを、³²Ｐでラベル
したＰＧ２５フラグメントをプローブとしてプラークハ
イブリダイゼーションによってスクリーニングした。ハ
イブリダイゼーションは、５×Denhardt's溶液（0.1 ％
Ficoll 、0.1 ％ポリビニルピロリドン（ polyvinylpy
rrolidone ）および0.1 ％ウシ血清アルブミン）と0.5
％ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）を含有する６×Ｓ
ＳＣ（９００ｍＭＮａＣｌ，９０ｍＭクエン酸ナトリ
ウム）中、５８℃で１５時間行ない、ハイブリダイゼー
ション後、フィルターは、６５℃で３０分間、１％ＳＤ
Ｓ含有 0.2×ＳＳＣで２回洗浄した。４個のポジティブ
クローンが単離された。最長クローンのインサートは１
３ｋｂであった。サザンブロットハイブリダイゼーショ
ンにより、ふたつのＸｂａＩフラグメント（ 3.3ｋｂｐ
および６ｋｂｐ）がプローブにハイブリダイズすること
が見出された。これらのフラグメントはそれぞれサブク
ローニングし、塩基配列を決定した。核酸の塩基配列
は、ジデオキシ塩基配列決定法（dideoxy chain termin
ation method）により行なった。

【００３９】（３）オープンリーディングフレームの構
築前記（１）および（２）より、ＰＧ２５は、ふたつのエ
クソンにまたがっていることが判った。そこで、ＰＧ２
５の５′上流と３′下流の配列を得るために、マウス肺
由来のｃＤＮＡライブラリー（Clontech社製）から、以
下のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲを行った。

【００４０】

【化２】 5'-GGAGTGCTGGCTGTCTCT-3'および 5'-CTTCAGTGCTGATCCCTC-3'

【００４１】増幅は、９５℃で１分間、３８℃で１分間
そして７０℃、１分間で３５回行なった。増幅されたｃ
ＤＮＡフラグメントを、pBluescript SK II (+) (Strat
agene 社製）ベクターにサブクローニングし、塩基配列
を決定した。得られたクローン（ＰＧｃ１）は、８２４
ｂｐからなり、ジェノミッククローンのエクソンに相当
することが判った。ＰＧｃ１をＮａｒＩで消化し、消化
したフラグメントの３’部分をジェノミッククローンの
ＰｓｔＩ−ＮａｒＩフラグメントにライゲーションし、
1.2ｋｂｐのフラグメント、ＰＧｃ９を構築した。ジェ
ノミッククローン、ＲＴ−ＰＣＲ生成物、ＰＧ２５、Ｐ
Ｇｃ１およびＰＧｃ９の関係を図１に示す（オープンリ
ーディングフレームは斜線で示される。）。このように
して、完全長ｃＤＮＡに相当するクローンを得た。全長
の塩基配列を配列番号３に、また、オープンリーディン
グフレームの塩基配列を配列番号２に示す。さらに、オ
ープンリーディングフレームより推定されるアミノ酸配
列を配列番号１に示す。

【００４２】実施例２：ＣＨＯ細胞によるマウスＰＧＤ
受容体の発現と各種リガンドとのバインディングアッセ
イマウスジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子（Bioc
hem. Biophys. Res. Commun., 164 , 39 (1989) ）をセ
レクションマーカーとして含む、真核細胞発現ベクタ
ー、ｐｄＫＣＲ−ｄｈｆｒにＰＧｃ９をサブクローン
し、得られたプラスミドＤＮＡ、ｐｄＫＣＲ−ｄｈｆｒ
−ＰＧｃ９をJ. Biol. Chem., 267 , 2437 (1992) に記
載の方法に従って、ジヒドロ葉酸還元酵素活性の欠損し
たＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｄｈｆｒ^-）（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 77, 4216 (1980) に記載）に形質転換し
た。ジヒドロ葉酸還元酵素を発現する細胞群は、１０％
透析ウシ胎児血清を含有するα−ＭＥＭ（−）培地（Ce
ll Culture Laboratories 社製）中で培養し、選択し
た。特異的な［³Ｈ］ＰＧＤ２結合活性を示すクローン
がいくつか単離された。それらのクローンのうちの一
つ、ＣＨＯ−Ｊを以下の実験に供した。

【００４３】ＣＨＯ−Ｊ細胞を、１０％ウシ胎児血清、
ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するα−Ｍ
ＥＭ（−）培地で培養した後、ホスフェートバッファー
セーラインで一度洗浄し、培養プレートから回収した
後、８００×ｇで１５分間遠心分離して沈降させた。得
られたセルペレットを１０倍量のホモジネート用バッフ
ァー（２５ｍＭＨＥＰＥＳ・ＮａＯＨ（ｐＨ7.4 ）、
１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＭｇＣｌ₂、２５０ｍＭ
ｄ−マンニトール、２ｍＭ β−メルカプトエタノー
ル、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド、
１ｍＭベンズアミジン塩酸塩からなる）中に懸濁さ
せ、超音波処理してホモジネートした。得られたホモジ
ネートを、標識しない各リガンドの存在下または非存在
下、１０ｎＭ［³Ｈ］ＰＧＤ₂と４℃で６０分間インキ
ュベートした。インキュベーション後、氷冷した洗浄用
バッファー（２５ｍＭＨＥＰＥＳ・ＮａＯＨ（ｐＨ7.
4 ）、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１４０
ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌよりなる）を加えて反
応を停止し、素早くワットマン（Whatman ）ＧＦ／Ｃ
グラスファイバーフィルターで濾過した。フィルターを
氷冷した洗浄用バッファーで４回洗浄した後、フィルタ
ー上の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測
定した。標識していないＰＧＤ₂を２００倍以上存在さ
せた時の、フィルターに結合した放射活性をもって非特
異的な結合とした。

【００４４】このアッセイの結果、ＰＧＤ２受容体に対
するリガンドである［³Ｈ］ＰＧＤ₂は、ＰＧｃ９を発
現したＣＨＯ細胞の細胞膜に特異的に結合することが判
った。この結合のスキャッチャード（Scatchard ）分析
の結果は、図２に示す。さらに、［³Ｈ］ＰＧＤ２の特
異的結合に対する種々のプロスタノイドの阻害活性を図
２に示す。種々のプロスタノイドによる結合阻害は、Ｐ
ＧＤ₂＞＞ＢＷ２４５Ｃ＝ＢＷＡ８６８Ｃ＞ＳＴＡ₂で
あり、Iloprost、ＰＧＥ₂およびＰＧＦ_２αには結合し
なかった。

【００４５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３５７配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Asn Glu Ser Tyr Arg Cys Gln Thr Ser Thr Trp Val Glu Arg Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ala Thr Met Gly Ala Val Leu Phe Gly Ala Gly Leu Leu Gly 20 25 30 Asn Leu Leu Ala Leu Val Leu Leu Ala Arg Ser Gly Leu Gly Ser Cys 35 40 45 Arg Pro Gly Pro Leu His Pro Pro Pro Ser Val Phe Tyr Val Leu Val 50 55 60 Cys Gly Leu Thr Val Thr Asp Leu Leu Gly Lys Cys Leu Ile Ser Pro 65 70 75 80 Met Val Leu Ala Ala Tyr Ala Gln Asn Gln Ser Leu Lys Glu Leu Leu 85 90 95 Pro Ala Ser Gly Asn Gln Leu Cys Glu Thr Phe Ala Phe Leu Met Ser 100 105 110 Phe Phe Gly Leu Ala Ser Thr Leu Gln Leu Leu Ala Met Ala Val Glu 115 120 125 Cys Trp Leu Ser Leu Gly His Pro Phe Phe Tyr Gln Arg His Val Thr 130 135 140 Leu Arg Arg Gly Val Leu Val Ala Pro Val Val Ala Ala Phe Cys Leu 145 150 155 160 Ala Phe Cys Ala Leu Pro Phe Ala Gly Phe Gly Lys Phe Val Gln Tyr 165 170 175 Cys Pro Gly Thr Trp Cys Phe Ile Gln Met Ile His Lys Glu Arg Ser 180 185 190 Phe Ser Val Ile Gly Phe Ser Val Leu Tyr Ser Ser Leu Met Ala Leu 195 200 205 Leu Val Leu Ala Thr Val Val Cys Asn Leu Gly Ala Met Tyr Asn Leu 210 215 220 Tyr Asp Met His Arg Arg His Arg His Tyr Pro His Arg Cys Ser Arg 225 230 235 240 Asp Arg Ala Gln Ser Gly Ser Asp Tyr Arg His Gly Ser Leu His Pro 245 250 255 Leu Glu Glu Leu Asp His Phe Val Leu Leu Ala Leu Met Thr Val Leu 260 265 270 Phe Thr Met Cys Ser Leu Pro Leu Ile Tyr Arg Ala Tyr Tyr Gly Ala 275 280 285 Phe Lys Leu Glu Asn Lys Ala Glu Gly Asp Ser Glu Asp Leu Gln Ala 290 295 300 Leu Arg Phe Leu Ser Val Ile Ser Ile Val Asp Pro Trp Ile Phe Ile 305 310 315 320 Ile Phe Arg Thr Ser Val Phe Arg Met Leu Phe His Lys Val Phe Thr 325 330 335 Arg Pro Leu Ile Tyr Arg Asn Trp Ser Ser His Ser Gln Gln Ser Asn 340 345 350 Val Glu Ser Thr Leu 355

【００４６】配列番号：２配列の長さ：１０７１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGAACGAGT CCTATCGCTG TCAGACATCC ACCTGGGTGG AAAGGGGCTC CTCGGCGACG 60 ATGGGCGCTG TGCTCTTCGG TGCGGGGCTT CTGGGCAATC TTCTGGCGCT GGTGCTGCTG 120 GCGCGCTCGG GACTGGGGTC TTGCCGGCCA GGGCCACTAC ACCCGCCGCC CTCGGTCTTT 180 TATGTGCTCG TGTGTGGCTT GACGGTCACC GACTTGCTGG GCAAGTGTCT GATCAGCCCG 240 ATGGTCCTGG CTGCCTACGC GCAAAACCAG AGCCTAAAGG AACTGCTGCC TGCCTCAGGC 300 AATCAGTTAT GCGAAACGTT CGCCTTCCTG ATGTCCTTCT TTGGGCTAGC CTCGACCTTA 360 CAGCTGTTGG CTATGGCGGT GGAGTGCTGG CTGTCTCTGG GACACCCCTT CTTCTACCAA 420 AGGCACGTCA CCTTGCGCCG GGGAGTGCTG GTGGCACCGG TCGTGGCCGC CTTCTGCTTG 480 GCTTTCTGTG CGCTCCCCTT TGCTGGTTTT GGGAAGTTCG TGCAGTACTG TCCAGGCACC 540 TGGTGTTTCA TCCAGATGAT CCACAAGGAG CGTTCATTTT CGGTAATAGG CTTCTCTGTG 600 CTCTACTCCA GCCTCATGGC GCTGCTGGTC CTCGCAACCG TGGTGTGCAA CCTGGGTGCC 660 ATGTACAACC TCTATGACAT GCACAGGCGC CATAGGCACT ATCCTCACCG CTGCTCCAGG 720 GACCGCGCCC AGTCAGGCTC AGACTACAGG CACGGGTCCC TGCATCCTTT GGAGGAGCTG 780 GACCACTTTG TGCTGCTGGC TCTCATGACA GTGCTCTTCA CCATGTGTTC CCTGCCTTTA 840 ATTTATCGTG CGTACTATGG AGCCTTTAAA CTTGAGAACA AAGCTGAAGG AGACTCAGAA 900 GACCTCCAAG CCTTGCGTTT CCTGTCTGTG ATTTCCATAG TGGACCCCTG GATCTTCATC 960 ATCTTCAGGA CTTCAGTATT CCGGATGTTA TTTCACAAGG TTTTCACAAG ACCTCTGATC 1020 TACAGAAACT GGAGCAGCCA TTCCCAGCAA AGTAACGTGG AATCCACTTT G 1071

【００４７】配列番号：３配列の長さ：１２４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 CTGCAGCCTT TCTTCCAGTC AGACGGGACA AGGGCTATGA ACGAGTCCTA TCGCTGTCAG 60 ACATCCACCT GGGTGGAAAG GGGCTCCTCG GCGACGATGG GCGCTGTGCT CTTCGGTGCG 120 GGGCTTCTGG GCAATCTTCT GGCGCTGGTG CTGCTGGCGC GCTCGGGACT GGGGTCTTGC 180 CGGCCAGGGC CACTACACCC GCCGCCCTCG GTCTTTTATG TGCTCGTGTG TGGCTTGACG 240 GTCACCGACT TGCTGGGCAA GTGTCTGATC AGCCCGATGG TCCTGGCTGC CTACGCGCAA 300 AACCAGAGCC TAAAGGAACT GCTGCCTGCC TCAGGCAATC AGTTATGCGA AACGTTCGCC 360 TTCCTGATGT CCTTCTTTGG GCTAGCCTCG ACCTTACAGC TGTTGGCTAT GGCGGTGGAG 420 TGCTGGCTGT CTCTGGGACA CCCCTTCTTC TACCAAAGGC ACGTCACCTT GCGCCGGGGA 480 GTGCTGGTGG CACCGGTCGT GGCCGCCTTC TGCTTGGCTT TCTGTGCGCT CCCCTTTGCT 540 GGTTTTGGGA AGTTCGTGCA GTACTGTCCA GGCACCTGGT GTTTCATCCA GATGATCCAC 600 AAGGAGCGTT CATTTTCGGT AATAGGCTTC TCTGTGCTCT ACTCCAGCCT CATGGCGCTG 660 CTGGTCCTCG CAACCGTGGT GTGCAACCTG GGTGCCATGT ACAACCTCTA TGACATGCAC 720 AGGCGCCATA GGCACTATCC TCACCGCTGC TCCAGGGACC GCGCCCAGTC AGGCTCAGAC 780 TACAGGCACG GGTCCCTGCA TCCTTTGGAG GAGCTGGACC ACTTTGTGCT GCTGGCTCTC 840 ATGACAGTGC TCTTCACCAT GTGTTCCCTG CCTTTAATTT ATCGTGCGTA CTATGGAGCC 900 TTTAAACTTG AGAACAAAGC TGAAGGAGAC TCAGAAGACC TCCAAGCCTT GCGTTTCCTG 960 TCTGTGATTT CCATAGTGGA CCCCTGGATC TTCATCATCT TCAGGACTTC AGTATTCCGG 1020 ATGTTATTTC ACAAGGTTTT CACAAGACCT CTGATCTACA GAAACTGGAG CAGCCATTCC 1080 CAGCAAAGTA ACGTGGAATC CACTTTGTGA GGGCTTTGCG TGTTCTGATA AGCTGAAAAT 1140 ACAGCACACA TTCAAAGAGC CGTGCTTGGA AAAGCCTTAC AATTTAAATC CTTAAAAACT 1200 ATCTCCCATG AAGAGATGGA GAGAGGGATC AGCACTGAAG 1240

【００４８】配列番号：４配列の長さ：１２４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：mouse 組織の種類：肺配列の特徴特徴を表わす記号：ＣＤＰ存在位置：37..1110 特徴を決定した方法：Ｐ配列 CTGCAGCCTT TCTTCCAGTC AGACGGGACA AGGGCT ATG AAC GAG TCC TAT CGC 54 Met Asn Glu Ser Tyr Arg 1 5 TGT CAG ACA TCC ACC TGG GTG GAA AGG GGC TCC TCG GCG ACG ATG GGC 102 Cys Gln Thr Ser Thr Trp Val Glu Arg Gly Ser Ser Ala Thr Met Gly 10 15 20 GCT GTG CTC TTC GGT GCG GGG CTT CTG GGC AAT CTT CTG GCG CTG GTG 150 Ala Val Leu Phe Gly Ala Gly Leu Leu Gly Asn Leu Leu Ala Leu Val 25 30 35 CTG CTG GCG CGC TCG GGA CTG GGG TCT TGC CGG CCA GGG CCA CTA CAC 198 Leu Leu Ala Arg Ser Gly Leu Gly Ser Cys Arg Pro Gly Pro Leu His 40 45 50 CCG CCG CCC TCG GTC TTT TAT GTG CTC GTG TGT GGC TTG ACG GTC ACC 246 Pro Pro Pro Ser Val Phe Tyr Val Leu Val Cys Gly Leu Thr Val Thr 55 60 65 70 GAC TTG CTG GGC AAG TGT CTG ATC AGC CCG ATG GTC CTG GCT GCC TAC 294 Asp Leu Leu Gly Lys Cys Leu Ile Ser Pro Met Val Leu Ala Ala Tyr 75 80 85 GCG CAA AAC CAG AGC CTA AAG GAA CTG CTG CCT GCC TCA GGC AAT CAG 342 Ala Gln Asn Gln Ser Leu Lys Glu Leu Leu Pro Ala Ser Gly Asn Gln 90 95 100 TTA TGC GAA ACG TTC GCC TTC CTG ATG TCC TTC TTT GGG CTA GCC TCG 390 Leu Cys Glu Thr Phe Ala Phe Leu Met Ser Phe Phe Gly Leu Ala Ser 105 110 115 ACC TTA CAG CTG TTG GCT ATG GCG GTG GAG TGC TGG CTG TCT CTG GGA 438 Thr Leu Gln Leu Leu Ala Met Ala Val Glu Cys Trp Leu Ser Leu Gly 120 125 130 CAC CCC TTC TTC TAC CAA AGG CAC GTC ACC TTG CGC CGG GGA GTG CTG 486 His Pro Phe Phe Tyr Gln Arg His Val Thr Leu Arg Arg Gly Val Leu 135 140 145 150 GTG GCA CCG GTC GTG GCC GCC TTC TGC TTG GCT TTC TGT GCG CTC CCC 534 Val Ala Pro Val Val Ala Ala Phe Cys Leu Ala Phe Cys Ala Leu Pro 155 160 165 TTT GCT GGT TTT GGG AAG TTC GTG CAG TAC TGT CCA GGC ACC TGG TGT 582 Phe Ala Gly Phe Gly Lys Phe Val Gln Tyr Cys Pro Gly Thr Trp Cys 170 175 180 TTC ATC CAG ATG ATC CAC AAG GAG CGT TCA TTT TCG GTA ATA GGC TTC 630 Phe Ile Gln Met Ile His Lys Glu Arg Ser Phe Ser Val Ile Gly Phe 185 190 195 TCT GTG CTC TAC TCC AGC CTC ATG GCG CTG CTG GTC CTC GCA ACC GTG 678 Ser Val Leu Tyr Ser Ser Leu Met Ala Leu Leu Val Leu Ala Thr Val 200 205 210 GTG TGC AAC CTG GGT GCC ATG TAC AAC CTC TAT GAC ATG CAC AGG CGC 726 Val Cys Asn Leu Gly Ala Met Tyr Asn Leu Tyr Asp Met His Arg Arg 215 220 225 230 CAT AGG CAC TAT CCT CAC CGC TGC TCC AGG GAC CGC GCC CAG TCA GGC 774 His Arg His Tyr Pro His Arg Cys Ser Arg Asp Arg Ala Gln Ser Gly 235 240 245 TCA GAC TAC AGG CAC GGG TCC CTG CAT CCT TTG GAG GAG CTG GAC CAC 822 Ser Asp Tyr Arg His Gly Ser Leu His Pro Leu Glu Glu Leu Asp His 250 255 260 TTT GTG CTG CTG GCT CTC ATG ACA GTG CTC TTC ACC ATG TGT TCC CTG 870 Phe Val Leu Leu Ala Leu Met Thr Val Leu Phe Thr Met Cys Ser Leu 265 270 275 CCT TTA ATT TAT CGT GCG TAC TAT GGA GCC TTT AAA CTT GAG AAC AAA 918 Pro Leu Ile Tyr Arg Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Lys Leu Glu Asn Lys 280 285 290 GCT GAA GGA GAC TCA GAA GAC CTC CAA GCC TTG CGT TTC CTG TCT GTG 966 Ala Glu Gly Asp Ser Glu Asp Leu Gln Ala Leu Arg Phe Leu Ser Val 295 300 305 310 ATT TCC ATA GTG GAC CCC TGG ATC TTC ATC ATC TTC AGG ACT TCA GTA 1014 Ile Ser Ile Val Asp Pro Trp Ile Phe Ile Ile Phe Arg Thr Ser Val 315 320 325 TTC CGG ATG TTA TTT CAC AAG GTT TTC ACA AGA CCT CTG ATC TAC AGA 1062 Phe Arg Met Leu Phe His Lys Val Phe Thr Arg Pro Leu Ile Tyr Arg 330 335 340 AAC TGG AGC AGC CAT TCC CAG CAA AGT AAC GTG GAA TCC ACT TTG TGA 1110 Asn Trp Ser Ser His Ser Gln Gln Ser Asn Val Glu Ser Thr Leu 345 350 355 GGGCTTTGCG TGTTCTGATA AGCTGAAAAT ACAGCACACA TTCAAAGAGC CGTGCTTGGA 1170 AAAGCCTTAC AATTTAAATC CTTAAAAACT ATCTCCCATG AAGAGATGGA GAGAGGGATC 1230 AGCACTGAAG 1240

【図面の簡単な説明】

【図１】ジェノミッククローン、ＲＴ−ＰＣＲ生成
物、ＰＧ２５、ＰＧｃ１およびＰＧｃ９の関係を示す図
である。オープンリーディングフレームは斜線で示され
る。

【図２】［³Ｈ］ＰＧＤ₂の、ＰＧｃ９をトランスフ
ェクトした細胞膜への結合に対する種々のリガンドの阻
害活性を示すグラフである。また、図中の図は、
［³Ｈ］ＰＧＤ₂のスキャッチャード（Scatchard ）分
析の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＥＬ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＬ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】実質的に純粋な形である、哺乳動物のＰ
ＧＤ受容体。
【請求項２】マウス由来のものである請求項１記載の
受容体。
【請求項３】配列番号１で示されるアミノ酸配列を含
むポリペプチド、そのホモローグ、その配列のフラグメ
ント、およびそのホモローグである請求項２記載の受容
体。
【請求項４】配列番号１で示されるアミノ酸配列から
なる請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】請求項１、２、３または４に記載された
ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】配列番号２で示される塩基配列を有する
請求項５記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイ
ブリダイズするフラグメント。
【請求項７】配列番号３で示される塩基配列を有する
請求項５記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイ
ブリダイズするフラグメント。
【請求項８】請求項５から７のいずれかの項に記載の
ＤＮＡからなる複製または発現ベクター。
【請求項９】請求項８記載の複製または発現ベクター
で形質転換された宿主細胞。
【請求項１０】請求項１から４のいずれかの項に記載
されたポリペプチドを発現させるための条件下で、請求
項９記載の宿主細胞を培養することからなるそのポリペ
プチドの製造方法。