DE3751893T2

DE3751893T2 - Polypeptid und dessen Herstellung

Info

Publication number: DE3751893T2
Application number: DE3751893T
Authority: DE
Inventors: Koichi Igarashi; Tsutomu Kurokawa; Yasutomi Nishizuka; Yoshitaka Ono
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-06-27
Filing date: 1987-06-26
Publication date: 1997-01-16
Anticipated expiration: 2007-06-27
Also published as: JP3146352B2; EP0686695A1; EP0251244B1; ES2093600T3; JP2593476B2; DE3751893D1; EP0251244A3; JPH11123084A; DE3752391T2; ATE142256T1; DE3752391D1; ATE347592T1; US5219748A; EP0686695B1; JPS642572A; CA1341288C; EP0251244A2

Description

Hintergrund der Erfindung

(a) Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Phosphorylierungsenzym eines calcium- und phospholipidabhängigen Proteins (hierin nachstehend kurz Proteinphosphorylierungsenzym C oder Proteinkinase C genannt) und auf eine Technik mit rekombinanter DNA zur Herstellung desselben, insbesondere auf Ratten-Kinase C und Human-Kinase C.

(b) Beschreibung des Standes der Technik

Von zahlreichen Arten biologisch aktiver Substanzen, wie etwa Zellwachstumsfaktoren, Hormone und Neurotransmitter, ist bekannt, daß sie an der Ausübung verschiedener Funktionen und den Anpassungsphänomen lebender Organismen beteiligt sind. Diese extrazellulären Signale werden durch intrazelluläre Mediatoren wie etwa cyclisches AMP (cAMP), cyclisches GMP (cGMP), Diacylglycerin (DG) und Calcium (Ca&spplus;&spplus;) ausgeübt. Es ist erkannt worden, daß DG als Ergebnis eines Inositphospholipidabbaus in Zellmembranen durch eine Anzahl Hormone und Neurotransmitter erzeugt wird, welche fjir die Aktivierung von Zellfunktionen verantwortlich sind. Es wird angenommen, daß die Aktivierung verschiedener Zellfunktionen und der Zellvermehrung durch die Phosphorylierung verschiedener intrazellulärer Proteine mit einem Proteinkinase C-Enzym erreicht wird, welches durch DG in Gegenwart von Ca&spplus;&spplus; aktiviert wird. Somit ist Proteinkinase C ein Enzym, daß im Mechanismus der Hauptinformationsweiterleitung externer Signale eine wichtige Rolle spielt. Das aus Rattenhirnen isolierte Enzym ist ein saures Protein mit einem isoelektrischen Punkt von pH 5,6 und einem Molekulargewicht von ungefähr 77000. Dieses Enzym setzt sich aus einem einzelnen Peptid mit einer hydrophoben Region, die als Bindungsstelle zu Zellmembranen dient, und einer hydrophilen Region zusammen, in der das aktive Zentrum vorliegt. Die Proteinkinase C befindet sich normalerweise in einer inaktiven Form, wird aber durch Calcium, Phosphatidylserin und DG aktiviert. Von ATP ist bekannt, daß es als Phosphorsäuredonor dient.
So führt die Proteinkinase C die Weiterleitung extrazellulärer Signale in Zellen durch die Phosphorylierung von Proteinen als eine Proteinkinase aus und ist deshalb eines der unverzichtbaren Enzyme beim Untersuchen des Empfangs extrazellulärer Signale und dem Weiterleitungsmechanismus und ist ein sehr wertvolles Reagenz. Das Enzym wird auch durch tumorfördernde Phorbolester direkt aktiviert. Von Phorbolestern ist bekannt, daß sie nicht nur die Förderung der Karzinogenese bewirken, sondern auch an verschiedenen biologischen Reaktionen, wie etwa Zellmitose und -differenzierung, Enzyminduktion und Beschleunigung des Lipidstoffwechsels, teilnehmen. Unter diesen Umständen besteht die große M-glichkeit, daß die Proteinkinase C in erkrankten Zellen oder Tumorzellen, die sich aus Störungen beim Mechanismus der Weiterleitung von Zellsignalen ergeben, zu einem wichtigen Indexenzym wird und daß Antikörper auf die Proteinkinase C als diagnostische und Untersuchungsreagenzien verwendet werden. Zu diesen Zwecken ist es erforderlich, eine große Menge Human- Proteinkinase C bereitzustellen. Natürliche Human-Proteinkinase C kommt jedoch nur in geringer Menge vor. Der Erhalt der Human- Proteinkinase C aus menschlichem Gewebe umfaßt weiterhin verschiedene Probleme und ist äußerst schwierig. Deshalb sind die Aminosäurensequenz von Human-Proteinkinase C und die DNA-Sequenz des Human-Proteinkinase-C-Gens noch nicht bestimmt worden.
Andererseits wird im Hinblick auf Proteinkinase C, die aus verhältnismäßig leicht erhältlichen tierischen Materialien stammt, zum Beispiel eine Proteinkinase C aus Rattenhirnen gereinigt. Die Aminosäurensequenz und die Gen-DNA-Sequenz der Ratten-Proteinkinase C sind jedoch noch nicht bestimmt worden. Es ist auch sehr schwierig, Ratten-Proteinkinase C in großer Menge zu erhalten.
Wie vorstehend beschrieben, bleibt eine Anzahl unbekannter Punkte hinsichtlich der Eigenschaften, der Aminosäurensequenz und des Human-Proteinkinase-C- und Ratten-Proteinkinase-C-Gens übrig. Es ist deshalb äußerst erwünscht, das für die Proteinkinase C kodierende Gen aufzuklären und ein Herstellungsverfahren für das Protein als Reagenz und Untersuchungsmittel durch rekombinante Gentechniken bereitzustellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Proteine von Tieren mit einer Ähnlichkeit zum Menschen zeigen auch bei der Aminosäurensequenz eine hohe Homologie. Der größere Teil der Unterschiede bei den Aminosäuren wird nur durch eine Punktmutation der Kodons eingeführt. So haben die Erfinder eine aus Rattenhirn stammende Proteinkinase C, die ein leicht erhältliches Material ist, gereinigt, deren Aminosäurensequenz bestimmt und die DNA-Sequenz des Ratten-Proteinkinase-C-Gens aufgeklärt. Die DNA-Sequenz des Ratten-Proteinkinase-C-Gens wird in Beispiel 1, 2 und 4 im einzelnen beschrieben und die aus der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäurensequenz wird in Fig. 2 und 8 dargestellt.
Obschon eine Anzahl DNA-Sequenzen für die DNA-Sequenz des klonierten Ratten-Proteinkinase-C-Gens durch Kodondegenerierung möglich ist, wird von einem Teil der DNA-Sequenz angenommen, daß er der DNA-Sequenz von Human-Proteinkinase C sehr ähnelt. Auf der Grundlage dieser Annahme haben die Erfinder zuerst das Ratten-Proteinkinase-C-Gen kloniert und haben das Human-Proteinkinase-C-Gen aus menschlichen Zellen mittels einer cDNA kloniert, die aus dem klonierten Ratten-Proteinkinase-C-Gen als DNA-Sonde erhalten wurde. Durch Aufbauen einer rekombinanten DNA mit dem Human-Proteinkinase-C-Gen und durch Kultivieren einer Transformante, die mit der rekombinanten DNA transformiert wurde, wird Human-Proteinkinase C erzeugt. Im Hinblick auf die vorangehenden Befunde haben die Erfinder eine weitere Untersuchung angestellt und haben die vorliegende Eefindung abgeschlossen.

Die vorliegende Erfindung stellt

(1) eine Human-Proteinkinase C (I), die ein Polypeptid ist, das die folgende Aminosäurensequenz umfaßt:
einen Teil davon, der dieselbe Aktivität besitzt, oder das Polypeptid, dessen Aminosäurensequenz teilweise ersetzt ist und das dieselbe Aktivität besitzt,
(2) eine rekombinante DNA (II), die eine Nukleotidsequenz enthält, die für die vorstehend in (1) definierte Human-Proteinkinase C kodiert,
(3) eine Transformante, die mit einem Vektor transformiert wurde, der die vorstehend in (2) definierte DNA (II) enthält, und
(4) ein Verfahren zum Herstellen einer Human-Proteinkinase c bereit, welches die Schritte des Kultivierens einer Transformante (3) in einem Kulturmedium unter Erzeugen und Anreichern der Human-Proteinkinase C in der Kultur und Isolieren derselben umfaßt.

Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung

(5) eine Ratten-Proteinkinase C, die ein Polypeptid ist, das die in Fig. 2 dargestellte Aminosäurensequenz umfaßt,
(6) eine rekombinante DNA (IV), die eine DNA-Sequenz umfaßt, die für die vorstehend in (5) definierte Ratten-Proteinkinase C kodiert,
(7) eine Transformante, die mit einem Vektor transformiert wurde, der die vorstehend in (6) definierte DNA (IV) enthält, und
(8) ein Verfahren zur Herstellung von Ratten-Proteinkinase c bereit, welches die Schritte des Kultivierens einer Transformante (7) in einem Kulturmedium unter Erzeugen und Anreichern der Ratten-Kinase in der Kultur und Isolieren derselben umfaßt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Aminosäurensequenzen der vier Peptidfraktionen, die aus Ratten-Proteinkinase C in Beispiel 1(1) erhalten wurden;
Figur 2 zeigt die Nukleotidsequenz von Ratten-Proteinkinase-CcDNA und die aus der Nukleotidsequenz abgeleitete Aminosäurensequenz;
Fig. 3 ist eine schematische Darstellung der Restriktionsenzymkarte der Human-Proteinkinase-C-cDNA;
Fig. 4 zeigt eine Nukleotidsequenz eines Teils von Human-Proteinkinase-C-cDNA und die abgeleitete Aminosäurensequenz;
Fig. 5 und 6 zeigt die Homologiebeziehung zwischen der Nukleotidsequenz von Ratten-Proteinkinase-C-cDNA und der abgeleiteten Aminosäurensequenz (Fig.2) und der Nukleotidsequenz eines Teils der Human-Proteinkinase-C-cDNA und der abgeleiteten Aminosäurensequenz (Fig. 4);
Fig. 7 ist eine schematische Darstellung, welche die Art und Weise der Überlappung beider Typen in Beispiel 4 erhaltener Ratten-Proteinkinase-C-Klone darstellt;
Fig. 8 zeigt die gesamte Nukleotidsequenz der Ratten-Proteinkinase-C-cDNA Typ-I (β-1) und die abgeleitete Aminosäurensequenz, wobei die Region in dem Kasten eine zusätzliche Nukleotidsequenz zeigt, die dem Typ I (β-1) hinzugefügt wurde, und die auf diese Weise hinzugefügte Nukleotidsequenz ist die gesamte Nukleotidsequenz des Typs II (β-2);
Fig. 9 ist ein Schema des Plasmidaufbaus zum Exprimieren von Ratten-Proteinkinase C in tierischen Zellen;
Fig. 10 zeigt das Aktivitätsmuster von Proteinkinase C bei der Mono Q-Säulenchromatographie von Cytoplasmafraktionen, die aus transfizierten und nicht-transfizierten Zellen stammen, wobei A: von pTB652-transfizierten Zellen stammend, B: von pTB653-transfizierten Zellen stammend, C: von nicht-transfizierten Zellen stammend;
Fig. 11 zeigt ein Autoradiogramm des durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese isolierten und mit einem Anti-Proteinkinase-C- Antikörper umgesetzten Antikörper-Proteins, wobei a: aus Rattenhirnen isolierte Proteinkinase C; b: von nicht-transfizierten Zellen stammend, c: von pTB652-transfizierten Zellen stammend, d: von pTB653-transfizierten Zellen stammend und
Fig. 12 zeigt ein Aktivitätsmuster von Proteinkinase C bei der Hydroxylapatit-Säulenchromatographie einer aktiven Fraktiön auf einer Mono Q-Chromatographiesäule von Cytoplasmafraktionen, die aus transfizierten und nicht-transfizierten Zellen stammen, wobei A: von pTB707-transfizierten Zellen stammend, B: von pTB708-transfizierten Zellen stammend, C: von nicht-transfizien ten Zellen stammend, D: Rattenhirn-Proteinkinase C.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die vorstehend beschriebene DNA (II) zur Exprimierung der Human- Proteinkinase C kann vorzugsweise die folgende DNA-Sequenz (III) besitzen:
Die Human-Proteinkinase C in der DNA und der Transformante gemäß der vorliegenden Erfindung und im Herstellungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung enthält als Teil derselben die Human- Proteinkinase C (I), die durch die vorstehende Aminosäurensequenz exprimiert wird.
Die vorstehend beschriebene DNA (IV) zur Exprimierung von Ratten-Proteinkinase C umfaßt die in Fig. 8 dargestellte DNA-Sequenz.
Ein Exprimierungsfaktor, der eine DNA mit einer für das Polypeptid einer Human-Protein-Proteinkinase C kodierenden Nukleotidse quenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt, kann durch das Verfahren hergestellt werden, das die Schritte des:
(a) Abtrennens einer für eine Human-Proteinkinase C kodierenden RNA,
(b) Herstellens einer einzeisträngigen, komplementären DNA (cDNA) und anschließend einer doppelsträngigen DNA aus der RNA,
(C) Inserierens der komplementären DNA in ein Plasmid,
(d) Transformierens eines Wirts mit dem rekombinanten Plasmid,
(e) Isolierens eines Plasmids nach dem Kultivieren der auf diese Weise erhaltenen Transformante, welches die gewünschte DNA enthält, aus der Transformante durch irgendein geeignetes Verfahren wie etwa ein Koloniehybridisierungsverfahren mittels einer Ratten-cDNA als Sonde,
(f) Ausschneidens der gewünschten, klonierten DNA aus dem Plasmid und
(g) Ligieren der klonierten DNA mit einem Träger an einer Stelle stromabwärts des Promotors umfaßt.
Die für die Human-Proteinkinase C kodierende DNA kann aus verschiedenen Human-Proteinkinase C produzierenden Zellinien, wie etwa aus dem menschlichen Gehirn stammende Zellen und menschliche Fibroblasten, erhalten werden. Beispiele der menschlichen Fibroblasten schließen WI38 (ATCC Nr. CCL-75) und IMR90 (ATCC Nr. CCL-186) ein. Die Zellinien WI38 und IMR90 sind in dem von der American Type Culture Collection veröffentlichten Katalog der Zellinien und Hybridome, 5. Ausgabe, 1985, aufgeführt.
Als Verfahren zum Herstellen von RNA aus einer Human-Proteinkinase C produzierenden Zellinie kann das Guanidinthiocyanat-Verfahren [Chirgwin, J.M., Biochemistry 18, 5294 (1979)) angeführt werden.
Mittels der auf diese Weise erhaltenen RNA als Matrize wird mit einem reversen Transkriptionsenzym gemäß einem Verfahren zum Beispiel von Okayama, H. et al. [Molecular and Cellular Biology 2, 161 (1982); ibid. 3, 280 (1980] eine cDNA hergestellt.
Das Plasmid, in das die cDNA inseriert werden soll, kann zum Beispiel von E. coli stammendes pBR322 [Gene 2 95 (1977)], pBR325 [Gene 4, 121 (1978)], pUC12 [Gene 19, 259 (1982)] und pUC13 [Gene 19, 259 (1982)] und von Bacillus Subtilus stammendes pUB110 [Biochemical and Biophysical Research Communication 112, 678 (1983)] sein. Andere Plasmide können verwendet werden, so lang sie in einem Wirt repliziert werden können.
Als Verfahren zum Inserieren der cDNA in ein Plasmid kann das in "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 239 (1982), offenbarte Verfahren von Maniatis, T. et al. angeführt werden.
Das Plasmid, in das eine cDNA inseriert wurde, kann eines sein, das unter Verwendung einer cDNA-Bank (von Dr. Okayama, National Institute of Child Health and Human Development, Bethesda, USA, erhältlich) mittels E. coli x1776 als Wirt erhalten wurde und durch Inserieren einer cDNA, die aus normaler mRNA menschlicher diploider Zellen hergestellt wurde, in einen pCD-Vektor erhalten wurde [Okayama et al., Molecular Cell. Biology 3, 280 (1983)].
Mit dem auf diese Weise erhaltenen Plasmid wird anschließend ein geeigneter Wirt wie etwa ein der Gattung Escherichia oder Bacillus angehrender Mikroorganismus transfiziert.
Beispiele der Gattung Escherichia angehörender Mikroorganismen schließen Escherichia coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 60, 160 (1968)], M103, M103 [Nucleic Acids Research 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology 120, 517 (1978)), HB101 [Journal of Molecular Biology 41, 459 (1969)) und C600 [Genetics 39, 440 (1954)) ein.
Beispiele der Gattung Badilus angehörender Mikroorganismen schließen Bacillius subtilis MI114 [Gene f14, 255 (1983)] und 207- 21 [Journal of Molecular Biology 95, 87 (1984)] ein.
Ein Verfahren zur Transformation kann zum Beispiel das Calciumchloridverfahren oder Calciumchlorid/Rubidiumchloridverfahren von Maniatis, T. et al. ["Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 249 (1982)] sein.
Aus den auf diese Weise erhaltenen Transformanten werden die gewünschten Klone durch irgendein bekanntes Verfahren, zum Beispiel ein Koloniehybridisierungsverfahren [Gene 10, 63 (1980)] und ein DNA-Basensequenz-Bestimmungsverfaren [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 560 (1977); Nucleic Acids Research 9, 309 (1981)] ausgelesen.
Auf die vorstehende Weise kann ein Mikroorganismus erhalten werden, der einen Vektor trägt, der eine klonierte DNA mit einer Nukleotidsequenz enthältl die für die Human-Proteinkinase C kodiert.
Das im hier nachstehend beschriebenen Beispiel 3(1) erhaltene, in Escherichia coli K12DH1/pTB637 enthaltene Plasmid pTB637 enthält eine DNA mit einer Nukleotidsequenz, die für die Human- Proteinkinase C (I) kodiert. Die Nukleotidsequenz der DNA, die für die Human-Proteinkinase C (I) kodiert, wird als ein Teil der DNA angesehen. Die Restriktionsenzym-Spaltungsstellen der DNA werden in Fig. 3 dargestellt. Wie in Fig. 3 dargestellt, ist die gesamte Länge der DNA etwa 1,2 kbp und sie wird mit dem Restriktionsenzym Psti oder BamHI in Fragmente gespalten.
Anschließend wird das Plasmid aus dem Mikroorganismus isoliert.
Als Isolierungsverfahren kann das Alkaliverfahren [Birmboim, H. C. et al., Nucleic Acids Research 1, 1513 (1979)] angeführt werden.
Das Plasmid mit der klonierten DNA mit einer Nukleotidsequenz, die für die Human-Proteinkinase C kodiert, wird so wie sie ist isoliert oder wird gewünschtenfalls mit einem Restriktionsenzym ausgeschnitten.
Das klonierte Gen wird mit einem zu dessen Exprimierung geeigneten Träger (Vektor) an einer Stelle stromabwärts seiner Promotorregion ligiert, um dadurch einen Exprimierungsvektor zu erhalten.
Als Vektor können von E. coli stammende Plasmide wie etwa pBR322, pBR325, pUC12 und pUC13, von Bacillus subtilis stammende Plasmide wie etwa pUB110, pTP5 und pC194, aus Hefe stammende Plasmide wie etwa pshlg und pshls, Bakteriophagen wie etwa der λ-Phage und tierische Viren wie etwa Retroviren und Vacciniaviren angeführt werden.
Das Gen kann am 5'-Terminus ATG, das als Translationsstartkodon dient, und am 3'-Terminus TAA, TGA oder TAG besitzen, das als Translationsabbruchkodon dient. Zum Exprimieren des Gens wird ein Promotor stromaufwärts gebunden. Jeder Promotor kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, so lang er als Wirt geeignet ist, der zur Expression des Gens verwendet wird.
Beispielhaft für geeignete Promotoren sind der trp-Promotor, lac-Promotor, recA-Promotor, λPL-Promotor und lpp-Promotor, wenn der Wirt ein der Gattung Escherichia angehörender Mikroorganismus ist, der SP01-Promotor, SP02-Promotor und penP-Promotor, wenn der Wirt Bacillus angehört, und der PH05-Promotor, PGK- Promotor, GAP-Promotor und ADH-Promotor, wenn der Wirt eine Hefe ist. Besonders bevorzugt ist eine Kombination eines der Gattung Escherichia angehörenden Mikroorganismus als Wirt und der trp- Promotor oder λPL-Promotor als Promotor.
Wenn der Wirt eine tierische Zelle ist, kann ein aus SV40 stammender Promotor oder ein Promotor eines Retrovirus verwendet werden. Der erste Promotor ist besonders bevorzugt.
Mittels des auf diese Weise aufgebauten, DNA(II) enthaltenden Vektors wird eine Transformante hergestellt.
Als Wirt kann ein der Gattung Escherichia oder Bacillus angehörender Mikroorganismus, eine Hefe oder eine tierische Zelle verwendet werden.
Als der Gattung Escherichia oder der Gattung Bacillius angehörender Mikroorganismus kann der vorstehend beschriebene verwendet werden. Beispiele geeigneter Hefen schließen Saccharomyces cerevisiae AH22R&supmin;, NA87-11a und DKD-5D ein. Beispiele geeigneter tierischer Zellen schließen Affenzellen COS-7, Vero, CHO-Zellen des chinesischen Hamsters, Maus-L-Zellen und menschliche FL- Zellen ein.
Ein der Gattung Escherichia coli angehörender Mikroorganismus kann gemäß einem zum Beispiel in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 2110 (1972), oder Gene 17, 107 (1982), offenbarten verfahren transformiert werden. Ein der Gattung Bacillius angehörender Mikroorganismus kann gemäß einem zum Beispiel in Molecular & General Genetics 168, 111 (1979), offenbarten Verfahren transformiert werden. Eine Hefe kann gemäß einem zum Beispiel in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 1929 (1978), offenbarten Verfahren transformiert werden. Eine tierische Zelle kann gemäß einem zum Beispiel in Virology 52, 456 (1973), offenbarten Verfahren transformiert werden.
Auf die vorstehend beschriebene Weise wird eine mit einem DNA(II) enthaltenden Vektor transformierte Transformante erhalten.
Ein Beispiel einer derartigen Transformante ist im nachstehend beschriebenen Beispiel 3(1) erhaltene Escherichia coli K12DH1/pTB637. Der Mikroorganismus ist seit dem 13. Juni 1986 unter der Zugangsnummer IFO 14510 beim Fermentationsinstitut, Osaka (IFO), Japan, und ferner seit dem 20. Juni 1986 unter der Zugangsnummer FERM P-8815 beim Fermentationsforschungsinstitut, Amt für industrielle Wissenschaft und Technologie, Ministerium für internationalen Handel und Industrie (FRI), hinterlegt worden und die Hinterlegung ist in eine Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag unter der Zugangsnummer FERM BP-1371 umgewandelt worden.
Als Medium, in dem eine Transformante eines der Gattung Escherichia oder Badilus angehörenden Wirts kultiviert wird, ist ein flüssiges Medium geeignet. Das flüssige Medium kann mit einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle und einer für das Wachstum der Transformante erforderlichen organischen Substanz ergänzt werden. Die Kohlenstoffquelle kann zum Beispiel Glucose, Dextrin, lösliche Stärke oder Sucrose sein. Die Stickstoffquelle kann zum Beispiel eine anorganische oder organische Substanz wie etwa ein Ammoniumsalz, ein Nitrat, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Sojabohnenkuchen oder Kartoffelextrakt sein. Die anorganische Substanz kann zum Beispiel Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat oder Magnesiumchlorid sein. Eine Hefe, ein Vitamin und ein Wachstumsförderungsfaktor können dem Medium ebenfalls zugesetzt werden. Der pH des Mediums liegt vorzugsweise im Bereich von 6 bis 8.
Ein bevorzugtes Medium zum Kultivieren eines der Gattung Escherichia angehörenden Mikroorganismus ist M9-Medium, das zum Beispiel Glucose, Gasaminosäure enthält [Miller, "Journal of Experiments in Molecular Genetics", 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)]. Dieses Medium kann mit einem geeigneten Mittel wie etwa 3β-Indolylacrylsäure zum Zweck des Verbesserns der Promotorwirkung ergänzt werden.
Wenn ein der Gattung Escherichia angehörender Mikroorganismus als Wirt verwendet wird, wird das Kultivieren im allgemeinen 3 bis 24 Stunden bei 15 bis 43ºC nötigenfalls unter Belüften und Rühren ausgeführt. Wenn ein der Gattung Bacillus angehörender Mikroorganismus als Wirt verwendet wird, wird das Kultivieren im allgemeinen 6 bis 24 Stunden bei 30 bis 40ºC nötigenfalls unter Belüften und Rühren ausgeführt.
In Fall, wenn eine Transformante eines Wirts, der eine Hefe ist, kultiviert wird, kann Burkholders Minimalmedium [Bostian, K. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4505 (1980)] als Beispiel eines Kulturmediums angeführt werden. Der pH des Mediums wird vorzugsweise auf 5 bis 8 eingestellt. Das Kultivieren wird im allgemeinen 24 bis 72 Stunden bei 20 bis 35ºC nötigenfalls unter Belüften und Rühren ausgeführt.
Das Medium zum Kultivieren einer Transformante einer tierischen Zelle als Wirt kann zum Beispiel MEM-Medium, das 5 bis 20% fetales Rinderserum enthält [Science 122, 501 (1952)], DMEM- Medium [Virology 8, 396 (1959)], RPMI1640-Medium [The Journal of the American Medical Association 199, 519 (1967)] und 199-Medium sein [Proceeding of the Society for the Biological Medicine 73 1 (1950)]. Der pH des Mediums ist vorzugsweise 6 bis 8. Das Kultivieren wird im allgemeinen 15 bis 60 Stunden bei 30 bis 40ºC nötigenfalls unter Belüften und Rühren ausgeführt.
Aus der vorstehenden Kultur kann das Human-Proteinkinase-C- Protein in der folgenden Weise abgetrennt und gereinigt werden.
Zum Extrahieren der Human-Proteinkinase C aus dem kultivierten Mikroorganismus oder der Zelle kann geeigneterweise ein Verfahren gewählt werden, bei dem der Mikroorganismus oder die Zelle aus der Kultur durch irgendein herkömmliches Verfahren gesammelt wird und in einem Puffer suspendiert wird, der ein Proteindenaturierungsmittel wie etwa Guanidin-Salzsäure enthält. Der suspendierte Mikroorganismus oder die Zelle werden anschließend durch Ultraschallwellen, ein Lysozym (und/oder Einfrieren und Auftauen) aufgebrochen, gefolgt vom Zentrifugieren unter Erhalten des Human-Proteinkinase-C-Proteins.
Bekannte Trenn- und Reinigungsverfahren können zur Reinigung des Human-Proteinkinase-C-Proteins aus dem vorstehend beschriebenen Überstand geeigneterweise kombiniert werden. Derartige bekannte Trenn- und Reinigungsverfahren schließen zum Beispiel Verfahren, welche die Löslichkeit ausnützen, wie etwa Aussalzen und Lösungsmittelfällung, Verfahren, die hauptsächlich den Molekulargewichtsunterschied ausnützen, wie etwa Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, Verfahren, die den Ionisierungsunterschied ausnützen wie etwa Ionenaustauschchromatographie, Verfahren, die den Unterschied bei den Hydrophobieeigenschaf ten ausnützen, wie etwa Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, und Verfahren ein, die den Unterschied im isoelektrischen Punkt ausnützen, wie etwa Elektrophorese am isoelektrischen Punkt.
Ein Beispiel des durch das Genrekombinationsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Human-Proteinkinase-C-Proteins ist das Protein, welches das Polypeptid mit der in Fig. 1 gezeigten Aminosäurensequenz enthält. Das Polypeptid kann an seinem N-Terminus Met besitzen.
Die Aktivität der auf diese Weise erhaltenen Human-Proteinkinase-C-Aktivität kann als bekannte Proteinphosphorylierungsaktivität gemessen werden.
Verschiedene Arten Zellen, die ursprünglich nur eine geringe Menge Human-Proteinkinase C produzieren oder die überhaupt keine Human-Proteinkinase C produzieren, erwerben die Fähigkeit, eine große Menge Human-Proteinkinase C zu produzieren, durch die Transfizierung mit der DNA gemäß der vorliegenden Erfindung und sie können eine große Menge Human-Proteinkinase C produzieren.
Das Expressionsplasmid der vorliegenden Erfindung, welches das Gen enthält, das für das Human-Proteinkinase-C-Protein kodiert, kann zur Transformierung in verschiedene Zellarten eingeführt werden, was es ermöglicht, die sich daraus ergebenden Zellen Human-Proteinkinase C produzieren zu lassen. Deshalb kann eine große Menge Human-Proteinkinase C erhalten werden.
Die auf diese Weise hergestellte Human-Proteinkinase C kann als Reagenz oder als Diagnose- oder Untersuchungsmaterial (zum Beispiel die in 0,001 bis 10 µg in einem Versuch verwendete Menge Human-Proteinkinase C) zusammen mit einem daraus hergestellten Antikörper verwendet werden. Zum Beispiel kann die Proteinkinase C gemäß der vorliegenden Erfindung als Reagenz zum Untersuchen zellulärer Signalübertragungsmechanismen, als Reagenz zur Diagnose oder Untersuchung von Erkrankungen (wie etwa Tumor), die sich aus einer Störung des zellulären Signalübertragungsmechanismus ergeben, oder als bei der Verhinderung und Heilung der Erkrankungen wirksames Durchmusterungsmittel verwendet werden.
Im Voranstehenden ist im Einzelnen das Klonieren der Human- Proteinkinase C, die Herstellung der Transformante, die Herstellung des Human-Proteinkinase-C-Proteins mittels der Transformante, die Brauchbarkeit des Proteins und dergleichen beschrieben worden. Dies trifft auch auf Ratten-Proteinkinase C zu.
In der vorliegenden Beschreibung und den begleitenden Zeichnun gen beruhen die Abkürzungen für Basen, Aminosäuren und ähnliche Chemikalien auf denjenigen gemäß der IUPAC-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur oder den gebräuchlicherweise in der Technik verwendeten. Beispiele der Abkürzungen sind wie folgt. Aminosäuren mit optischen Isomeren beziehen sich, so lange nicht anders besonders angegeben, auf L-Formen.
DNA: Desoxyribonukleinsäure
cDNA: komplementäre Desoxyribonukleinsäure
A: Adenin
T: Thymin
G: Guanin
C: Cystosin
RNA: Ribonukleinsäure
dATP: Desoxyadenosintriphosphat
dTTP: Desoxythymidintriphosphat
dGTP: Desoxyguanosintriphosphat
dCTP: Desoxycytidintriphosphat
ATP: Adenosintriphosphat
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
SDS: Natriumdodecylsulfat
Gly: Glycin
Ala: Alanin
Val: Valin
Leu: Leucin
Ile: Isoleucin
ser: Serin
Thr: Threonin
Gys: Cystein
Met: Methionin
Glu: Glutaminsäure
Asp: Asparaginsäure
Lys: Lysin
Arg: Arginin
His: Histidin
Phe: Phenylalanin
Tyr: Tyrosin
Trp: Tryptophan
Pro: Prolin
Asn: Asparagin
Gln: Glutamin

Beispiel

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend durch Beispiele genauer beschrieben.
Die in Beispiel 2 erhaltene Transformante E. coli K12DH1/pTB638 ist seit dem 20. Juni 1986 unter der Zugangsnummer IFO 14514 beim IFO und seit dem 28. Juni 1986 unter der Zugangsnummer FERM P-8829 beim FRI hinterlegt worden und die Hinterlegung ist in eine Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag geändert worden und unter der Zugangsnummer FERM BP-1372 aufbewahrt worden.
Die in Beispiel 4 erhaltene Transformante E. coli K12DH1/pTB652 ist seit dem 29. August 1986 unter der Zugangsnummer IFO 14539 beim IFO und seit dem 5. September 1986 unter der Zugangsnummer FERM P-8958 beim FRI hinterlegt worden und die Hinterlegung ist in eine Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag unter der Zugangsnummer FERM BP-1373 geändert worden.
Die in Beispiel 4 erhaltene Transformante E. coli K12DH1/pTB653 ist seit dem 29. August 1986 unter der Zugangsnummer IFO 14540 beim IFO und seit dem 5. September 1986 unter der Zugangsnummer FERM P-8959 beim FRI hinterlegt worden und die Hinterlegung ist in eine Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag unter der Zugangsnummer FERM BP-1374 geändert worden.
Die in Beispiel 5 erhaltene Transformante E. coli DH1/pTB755 ist seit dem 21. Mai 1987 unter der Zugangsnummer IFO 14612 beim IFO und seit dem 29. Mai 1987 unter der Zugangsnummer FERM P-1382 beim FRI unter dem Budapester Vertrag unter der Zugangsnummer FERM BP-1382 hinterlegt worden.

Beispiel 1

(1) Aufklärung der Aminosäurensequenz von Ratten-Proteinkinase C

Aus Rattenhirnen wurde eine Ratten-Proteinkinase C gemäß dem Verfahren von Kikkawa [J. Biol. Chem. 257, 13341 (1982)] extrahiert. Aus den Gehirnen von 240 Ratten wurden 2,0 mg gereinigte Proteinkinase-C-Probe erhalten. Die Proteinkinase-C-Probe (1,9 mg) wurde in 1,9 ml 6 M Harnstoff enthaltender 50 mM Tris-HCl- Lösung (pH 9,0) gelöst, welcher Lysylendopeptidase zu einer Konzentration von 25 µg/ml zugesetzt wurde, und das Gemisch wurde 21 Stunden bei 37ºC verdaut. Die auf diese Weise hergestellten Peptide wurden auf eine Umkehr-HPLC-Säule (Micro pak Protein C-18-10, 0,4 x 30 cm) aufgebracht und danach erfolgte eine Acetonitril-Gradientenelution unter Erhalten von Fraktionen mit etwa 50 Peptiden. Davon wurden vier Peptide (Peptid Nr. 24, 37, 49 und 51) dem automatisierten Edman-Abbau mittels eines Dampfphasen-Proteinsequenzers (Model 470A, Applied Biosystems, Inc.) zur Bestimmung ihrer Aminosäurensequenzen unterzogen.
Die als Ergebnis des Edman-Abbaus freigesetzten Phenylhydantomderivate der Aminosäuren wurden durch HPLC mittels einer Micro pak SPC 18-3-Säule (Varian Associates, Inc.) analysiert. Die Aminosäurensequenz jedes der vier Peptide war wie in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 2

(1) Herstellung einer aus Rattenhirn-mRNA stammenden cDNA-Bank

Eine RNA wurde aus Rattenhirn durch das Guanidinisothiocyanatverfahren [Chirgwim et al., Biochemistry 18, 5294 (1978)] extrahiert. Poly(A)-RNA wurde durch Oligo-dT-Cellulose-Säulenchromatographie [Aviv und Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972)] gereinigt.
Mittels dieser poly(A)-RNA als Matrize wurde eine cDNA-Bank mit dem pcdvl-Vektor und pll-Linker gemäß dem Verfahren von Okayama und Berg [Okayama & Berg, Mol. Gell. Biol 2 161 (1982)] aufgebaut. Das die ringgeschlossene cDNA enthaltende Vektorplasmid wurde in E. coli DH1 transfiziert. Ausgehend von 5 µg Poly(A)- RNA wurde eine cDNA-Bank erhalten, die aus etwa 5x10&sup5; Klonen bestand und E. coli als Wirt verwendete.

(2) Isolierung eines Ratten-Proteinkinase-C-cDNA enthaltenden Plasmids und Aufklärung seiner DNA-Sequenz

Die vorstehend mittels E. coli DH1 beschriebene Ratten cDNA-Bank wurde auf 10 Nitrocellulosefilter (Milipore, HATF-Filter) zu etwa 3 x 10&sup4; Klone/Filter aufgebracht. Anschließend wurden 20 Filterdoppel (jeweils zwei paarweise) mittels dieser Filter als Stammfilter hergestellt. Die E. coli auf jedem Filterdoppel wurde mit 0,5 N NaOH-Lösung unter Freisetzen und Denaturieren der Plasmid-DNA lysiert, gefolgt vom Trocknen zum Fixieren der DNA auf dem Filter [Grustein, M. & Hogness, D. S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1975)].
Auf der Grundlage der Aminosäurensequenz der Peptide, die in Beispiel 1(1) bestimmt wurde, wurden den Aminosäurensequenzen entsprechende Oligonukleotide chemisch synthetisiert. Auf diese Weise wurden
die den Aminosäureresten 7-12 des Peptids Nr. 24 (Tyr-Ile-Asp- Trp-Glu-Lys) entspricht,
die den Aminosäureresten 3-8 des Peptids Nr. 51 (Asp-Trp-Trp- Ala-Phe-Gly) entspricht, und
die den Aminosäureresten 24-29 des Peptids Nr. 51 (Glu-Asp-Glu- Asp-Glu-Leu) entspricht, jeweils zur Verwendung als Durchmuste rungssonde für Ratten-Proteinkinase-C-cDNA chemisch synthetisiert.
Der 5'-Terminus jeder Oligonukleotidsonde wurde mittels [γ-³²P]ATP und T4-Polynukleotidkinase mit ³²p markiert.
Die markierten Sonden Nr. 2 und 3 wurden getrennt mit den Filterdoppeln hybridisiert, auf denen die Plasmid-DNA fixiert war. Die Hybridisierungsreaktion wurde 16 Stunden bei 42ºC in 10 ml 5xSSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat), 5x Denhardts, 0,1% SDS und 100 µg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA-Lösung ausgeführt, die 10 µCi der markierten Sonde enthielt. Auf die Reaktion folgend wurden die Filter mit einer 6xSSC- und 0,1%igen SDS-Lösung drei Mal 30 Minuten bei Raumtemperatur und zwei Mal 60 Minuten bei 47ºC im Fall von Sonde Nr. 2 und 60 Minuten bei 43ºC im Fall von Sonde Nr. 3 gewaschen [Maniatis, M. et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, S. 309 (1982)]. Von jedem gewaschenen Filter wurde anschließend ein Radioautogramm aufgenommen. Radioautogramme eines jeden Paars Filterdoppel wurden zum Ausfindigmachen eines Stammes übereinandergelegt, welcher mit beiden der zwei Sonden reagieren konnte. Durch dieses Verfahren wurde aus 3x105 Kolonien ein Stamm E. coli K12DH1/pTB638 (IFO 14514, FERM-BP 1372) entnommen, der mit beiden Sonden reagieren kann.
Anschließend wurde aus diesem Stamm durch das Alkaliverfahren [Birnboim, H. C. Doly, J., Nucleic Acids Res. 1, 1513 (1979)] eine Plasmid-DNA (pTB638) extrahiert. Nach der Reinigung wurde die Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (hergestellt von Takara Shuzo) gespalten und das Produkt wurde der Elektrophorese an einem Agarosegel unterzogen. DNA-Fragmente in dem Gel wurden gemäß dem Southern-Blotting-Verfahren [Maniatis, M. et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, S. 382 (1982)] auf ein Nitrocellulosefilter (BA85, S & S Inc.) überführt. Von dem Plasmid-DNA-Fragment auf dem Filter wurde gefunden, daß es mit allen vorstehend beschriebenen Oligonukleotidsonden reagiert.
Die Nukleotidsequenz einer cDNA-Region dieser Plasmid-DNA wurde durch das Didesoxynukleotid-Kettenabbruchsverfahren [Messing, J. et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981)] bestimmt. Die DNA- Sequenz und die aus der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäurensequenz werden in Fig. 2 dargestellt.
Aus den dargestellten Sequenzen ist zu erkennen, daß die in Referenzbeispiel 1(1) bestimmten Aminosäurensequenzen der Peptide Nr. 24 und 51 den Nukleotidsequenzen an Nr. 445-480 beziehungsweise 220-312 genau entsprechen. Auf diese Weise wurde bestätigt, daß das Plasmid pTB638 Ratten-Proteinkinase-C-cDNA war. Da die cDNA eine poly(A)-Struktur enthielt, wurde gefunden, daß die cDNA Kodons der C-terminalen Region von Proteinkinase C und einen nicht-translatierten Abschnitt der 3'-terminalen Region der mRNA enthielt. Die Ratten-Proteinkinase C enthält die in Fig. 2 dargestellte Aminosäurensequenz als Teil derselben.

Beispiel 3

(1) Isolierung eines Human-Proteinkinase-C-cDNA enthaltenden Plasmids

Von Dr. Okayama, National Institute of Child Health and Human Development, Bethesda, USA, wurde eine cDNA-Bank zur Verfügung gestellt, die E. coli x1776 als Wirt verwendete und durch Inserieren einer cDNA hergestellt wurde, die aus einer aus menschlicher Vorhaut stammenden mRNA-Zellkultur der ersten Generation in pCD-Vektor synthetisiert wurde [siehe Okayama et al., Mol. Gell. Biol. 3, 280 (1983)]. Eine Plasmid-DNA wurde aus der cDNA- Bank gemäß dem Alkaliverfahren [Birnboim, H. C. & Doly, J. Nucleic Acids Res. 1, 1513 (1979)] extrahiert und wurde unter Erhalten einer cDNA-Bank, die E. coli DH1 als Wirt verwendet und aus etwa 2x106 Klonen besteht, in E. coli DH1 transfiziert.
Diese cDNA-Bank wurde zu etwa 5x104 Klone/Filter auf 12 Nitrocellulosefilter aufgebracht (HATF-Filter, Milipore Inc.) aufgebracht. Mittels dieser Filter als Stammfilter wurden Filterdoppel hergestellt. Die E. coli auf jedem Filterdoppel wurde mit 0,5 N NaOH-Lösung unter Freisetzen und Denaturieren der Plasmid- DNA lysiert, gefolgt vom Trocknen zum Fixieren der DNA auf dem Filter [Grustein, M. & Hogness, D. S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1975)].
Ein durch Verdauen des in Beispiel 2-(2) erhaltenen Plasmids pTB638 mit dem Restriktionsenzym PstI erhaltenes DNA-Fragment von etwa 0,7 kb wurde mittels [α-³²P]αTP und DNA-Polymerase I durch das Nick-Translationsverfahren [Rigby, P. W. et al., J. Mol. Bil. 113, 237 (1977)] mit ³²p markiert.
Das markierte DNA-Fragment als Sonde wurde mit den vorstehenden Filterdoppeln, auf denen die Plasmid-DNA fixiert war, hybridisiert. Die Hybridisierungsreaktion wurde 16 Stunden bei 42ºC in 10 ml einer 5 µCi markierte Sonde enthaltenden Lösung von 20% Formamid, 5xSSPE, Sxdenhardts, 0,1% SDS und 100 µg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA-Lösung ausgeführt. Auf die Reaktion folgend wurden die Filter drei Mal 30 Minuten bei Raumtemperatur und zwei Mal 30 Minuten bei 50ºC mit einer 2xSSC- und 0,1%igen SDS-Lösung gewaschen [Maniatis, T. et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, S. 309 (1982)]. Anschließend wurde von jedem gewaschenen Filter ein Radioautogramm aufgenommen. Als Ergebnis wurde ein Stamm E. coli K12DH1/pTB637 (IFO 14510, FERM BP-1371) ausgesondert, der mit der Sonde reagieren konnte.
(2) Bestimmung der Nukleotidsequenz der cDNA Aus dem vorstehend in (1) erhaltenen Stamm E. coli K12DH1/pTB637 (IFO 14510, FERM BP-1371) wurde durch das Alkaliverfahren eine Plasmid-DNA (pTB637) extrahiert und gereinigt. Die cDNA-Region dieser Plasmid-DNA ist insgesamt etwa 1,2 Kbp lang und hat die in Fig. 3 dargestellte Restriktionsenzym-Spaltungskarte.
Ein Abschnitt der Nukleotidsequenz der cDNA-Region wurde durch das Didesoxynukleotidketten-Terminationsverfahren [Messing, J. et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981)] bestimmt. Die auf diese Weise bestimmte DNA-Sequenz und die aus der DNA-Sequenz abgeleitete Aminosäurensequenz werden in Fig. 4 dargestellt.
Die abgeleitete Aminosäurensequenz zeigt eine große Homologie mit der in Beispiel 2(2) dargestellten, aus der Ratten-Proteinkinase-C-DNA abgeleiteten, wodurch gezeigt wird, daß die in dem Plasmid pTB637 enthaltene cDNA Human-Proteinkinase-C-cDNA ist (siehe Fig. 5 und 6). Fig. 5 ist ein Diagramm zum Überprüfen der Homologie bei den Aminosäuren, in dem die Aminosäurensequenzen von Fig. 2 und 4 dargestellt sind, wobei sich die erste Aminosäure von Fig. 2 mit der 26. Aminosäure (Ala) von Fig. 4 deckt und wobei die identischen Aminosäurenreste eingerahmt sind. Fig. 6 ist ein Diagramm zum Überprüfen der Homologie bei der DNA-Sequenz, in dem die Aminosäurensequenzen von Fig. 2 und 4 dargestellt sind, wobei sich das erste Kodon (G) für die 26. Aminosäure (Ala) von Fig. 4 mit dem ersten Kodon von Fig. 2 deckt und wobei die identischen Nukleotidreste mit einem Kreis versehen sind.

Beispiel 4

(1) Herstellung einer aus Rattenhirn-mRNA stammenden cDNA-Bank

Ein RNA-Fragment wurde durch das Guanidinisothiocyanatverfahren [Chirgwim et al., Biochemistry 18, 5294 (1978)] aus Rattenhirn extrahiert. Poly(A)-RNA wurde durch oligo-dT-Cellulose-Säulen chromatographie [Aviv und Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972)] gereinigt.
Mittels dieser poly(A)-RNA als Matrize wurde mit dem Phagenvektor λgt10 [Huynh, T. V. et al., "DNA-Cloning, A Practical Approach", IRL Press, Oxford, S. 49 (1985)] gemäß dem Verfahren von Watson und Jackson [Watson, C. J. & Jackson, J. F., "DNA Gbning, A Practical Approach", IRL Press, Oxford, S. 49 (1985)] eine cDNA-Bank aufgebaut. Ausgehend von 10 µg poly(A)RNA wurde eine cDNA-Bank erhalten, die aus etwa l,5x106 Klonen bestand und die E. coli C600, Hfla (Huynh, T. V. et al., oben) als Wirt verwendete.

(2) Isolierung eines Ratten-Proteinkinase-C-cDNA enthaltenden Phagen und Aufklärung seiner DNA-Basensequenz

Die vorstehend beschriebene, E. coli C600, HflA als Wirt verwendende Phagen-cDNA-Bank wurde zu etwa 1x10&sup5; Klone/Platte auf 10 Weichagarplatten aufgebracht und auf Nitrocellulosefilter überführt (HATF-Filter, Milipore Inc.) und mit 0,5 N NaOH-Lösung lysiert. Die sich daraus ergebende freigesetzte und denaturierte Phagen-DNA wurde zur Fixierung auf den Platten getrocknet [Maniatis et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, S. 320 (1982)].
In Beispiele 2(2) erhaltene E. coli K12DH1/pTB638 (IFO 14514, FERM BP-1372) wurde mit dem Restriktionsenzym PstI unter Erhalten eines DNA-Fragments mit 0,7 kb verdaut. Das DNA-Fragment wurde durch das Nick-Translationsverfahren (Maniatis et al., oben, S. 109) unter Ergeben einer Sonde mit ³²p markiert.
Die auf den Filtern fixierte DNA wurde durch Reaktion in 10 ml die markierte Sonde enthaltendem 5xSSPE (0,9 M NaCl, 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), 5 mM EDTA), 50% Formamid, 5xDenhardts, 0,1% SDS und 100 µg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA- Lösung mit der markierten Sonde hybridisiert. Auf die Reaktion folgend wurden die Filter zwei Mal 30 Minuten bei Raumtemperatur mit einer 2xSSC- (1xSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) und 0,1% SDS- und zwei Mal 30 Minuten bei 68 C mit einer 1xSSC- und 0,1% SDS-Lösung gewaschen. Die gewaschenen Filter wurden getrocknet und der Radioautographie zum Selektieren von Klonen unterzogen, die mit der Sonde reagieren können. Aus dem Klon λCKR107 wurde gemäß dem Verfahren von Davis et al. [Davis et al., "Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory (1980)] eine Phagen-DNA extrahiert. Diese wurde mit dem Restriktionsenzym BglI1 und EcoRI unter Erhalten eines DNA- Fragments mit etwa 0,5 kb gespalten. Das DNA-Fragment wurde in derselben Weise wie vorstehend beschrieben mit ³²p markiert. Unter Verwenden des markierten DNA-Fragments als Sonde wurde die Hybridisierung in derselben Weise wie vorstehend ausgeführt. Zum Reagieren mit der Sonde befähigte Klone wurden ausgesondert. Die Nukleotidsequenzen von cDNA-Regionen mehrerer Arten bei dem vorstehenden Durchmustern erhaltener Klone wurden durch das Didesoxynukleotidketten-Terminationsverfahren [Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981)] bestimmt.
Auf diese Weise kann durch Kombinieren der cDNA-Regionen der so erhaltenen Phagenklone die gesamte Kodierungsregion der Rattenhirn-Proteinkinase C abgedeckt werden. Eine Untersuchung der aus der DNA-Sequenz abgeleiteten Aminosäurensequenz zeigt, daß in der Rattenhirn-Proteinkinase C wenigstens zwei Molekültypen vorliegen, die 671 [Typ I (β-1)] und 673 [Typ II (β-2)] Aminosäuren besitzen und die sich nur in ihren C-terminalen Regionen unterscheiden.
Das uberlappen der auf diese Weise erhaltenen Klone wird in Fig. 7 veranschaulicht. Die gesamte DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäurensequenz werden in Fig. 8 dargestellt.

(3) Aufbau des Rattenhirn-Proteinkinase-C-Expressionsplasmid für eine tierische Zelle

Die in Fig. 7 dargestellte DNA des Phagenklons λCKR152 wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI unter Erhalten einer cDNA mit 1,4 Kb teilverdaut. Die DNA wurde mit Plasmid pTB389 vermischt, das mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten worden war und das zum Entfernen seiner 5'-terminalen Phosphorsäuregruppen mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Plasmid pTB389 wird durch Überführen jeder Psti-Spaltungsstelle in der 5'-terminalen Region und der BamHI-Spaltungsstelle in der 3'-terminalen Region der Interleukin-2-Genregion von Plasmid pTB106 (offenbart in der japanischen offengelegten Patentanmeldung Nr. 61-63282, die der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 172 619 entspricht) in EcoRI unter Entfernen der Interleukin-2-Genregion erhalten. Das Gemisch wurde zum Aufbauen von Plasmid pTB648 mit T4-DNA-Ligase umgesetzt. Das Plasmid pTB648 wurde anschließend mit EcoRI unter Erhalten einer DNA mit 4,0 kb mit 937 bp der 5'-terminalen Region der cDNA teilverdaut, gefolgt vom Entfernen der 5'-terminalen Phosphorsäuregruppe. Die sich daraus ergebende DNA wurde mit einer cDNA mit 2,5 kb, die durch Teilverdauen des in Fig. 7 dargestellten Phagenklons λCKR107 mit dem Restriktionsenzym EcoRI erhalten wurde, oder mit einer cDNA mit 2,3 kb gemischt, die durch Verdauen des Phagenklons λCKR108 mit EcoRI erhalten wurde. Die Gemische wurden zum Aufbauen der Plasmide pTB651 beziehungsweise pTB650, wovon jedes zum Transformieren tierischer Zellen verwendet wird und die gesamte, für Rattenhirn- Proteinkinase C kodierende Region abdeckt, jeweils mit T4-DNA- Ligase umgesetzt.
Der Interleukin-2-Genexpressionsvektor pTB106 für eine tierische Zelle (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 61-63282, die der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 172 619 entspricht) wurde mit dem Restriktionsenzym HgiAI unter Erhalten eines DNA- Fragments mit 1,0 kb verdaut, das eine Interleukin-2-Gen-Leadersequenz enthält. Das kohäsive Ende des DNA-Fragments wurde durch Reaktion mit T4-DNA-Polymerase in ein glattes Ende überführt, an das mit T4-DNA-Ligase der EcoRI-Linker CCGGAATTCCGG gebunden wurde, gefolgt von der vollst=ndigen Verdauung mit EcoRI und HindIII unter Abtrennen einer von SV40-DNA stammenden Sequenz (Promotor- und Spleißabschnitt) und eines ersten DNA-Fragments mit 0,64 kb, das aus der IL-2-Gen-Leadersequenz bestand. Das vorstehend beschriebene Plasmid pTB106 wurde unter Abtrennen einer DNA-Replikationsstartregion zum Replizieren einer aus dem Plasmid pBR322 stammenden DNA in E. coli und eines zweiten DNA- Fragments mit 2,6 kb mit einer Sequenz, die ein Ampicillinresistentes Gen und eine aus SV40-DNA stammende Polyadenylierungsregion enthielt, mit BamHI und HindIII verdaut. Weiter wurde aus Plasmid pTB361 (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 61-88881, die der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 177 915 entspricht) das klonierte Synthesegen des menschlichen Epidermiszellen-Wachstumsfaktors (EGF), ein drittes EcoRI-BamHI-DNA-Fragment mit 0,18 kb hergestellt, das für Human- EGF kodiert. Das erste bis dritte DNA-Fragment werden durch die T4-DNA-Ligasereaktion unter Aufbauen von Plasmid pTB406 ligiert. Das Plasmid pTB406 wurde an stromaufwärts des SV40-Promotors gelegenen ClaI- und HindIII-Stellen gespalten, in die ein gereinigtes ClaI-HindIII-DNA-Fragment mit 1,1 kb inseriert wurde, das aus pTB314 (japanische offengelegte Patentanmeldung Nr. 61-63282, die der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 172 619 entspricht) abgetrennt wurde und eine Abelson-Maus-Leukämievirus-LTR-Region (A-MULV) besitzt, wodurch Plasmid pTB505 aufgebaut wurde.
Das Plasmid pTB505 wurde mit Glal und BamHI unter Erhalten eines DNA-Fragments mit 1,5 kb weiter verdaut, das ein MULV-LTR enthielt. Diese DNA wurde mit einem aus dem Plasmid pTB650 oder ptb6sl erhaltenen ClaI-BamHI-DNA-Fragment gemischt und das Gemisch wurde zum Aufbauen der zum Transformieren tierischer Zellen brauchbaren Plasmide pTB652 beziehungsweise pTB653 mit einem MuLV-LTR an ihren stromaufwärts gelegenen Regionen mit 4- DNA-Ligase umgesetzt (siehe Fig. 9).
(4) Mit jedem vorstehend in (2) erhaltenen Plasmid pTB652 und Plasmid pTB653 wurde E. coli K12DH1 gemäß dem in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 (1972), offenbarten Verfahren unter Erhalten einer Transformante E. coli K12DH1/pTB652 (IFO 14539, FERM BP-1373) beziehungsweise einer Transformante E. coli K12DH1/pTB653 (IFO 14540, FERM BP-1374) transformiert.

(5) Exprimierung von Rattenhirn-Proteinkinase C in tierischen Zellen

Affen-COS-7-Zellen [Cell f17, 279-288 (1981)] wurden auf einer Einzelschicht (5 Plastikschalen mit einem Falcon-Durchmesser von 100 mm) in mit 5% fetalem Rinderserum ergänztem DMEM-Medium kultiviert. Nach dem Ersetzen durch dasselbe Medium wurde die Kultur 4 Stunden weiter fortgesetzt. Anschließend wurden den Zellen in herkömmlicher Weise hergestellte [Graham et al., Virology 52, 456 (1973)] Calciumphosphatfällungen, die 30 µg/Schale Plasmid pTB652 oder pTB653 enthielten, unter Erhalten mit pTB652 und pTB653 transfizierter Zellen zugesetzt. Weitere vier Stunden später wurden die Zellen mit Glycerin behandelt und die Kultivierung der pTB652-transfizierten und pTB653-transfizierten COS-7-Zellen wurde 70-72 Stunden weiter fortgesetzt.
Danach wurde der Kulturüberstand verworfen und die Zellen wurden in 1,5 ml eines Puffers [0,25 M Sucrose, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EGTA, 2 mM EDTA und 20 µg/ml Leupeptin] suspendiert und mittels eines Teflon-Homogenisators homogenisiert. Das Homogenisat wurde unter Erhalten einer Gytoplasmafraktion mit einer Beckmann 100.2-Zentrifuge 60 Minuten bei 55000 Upm zentrifugiert. Die Fraktion wurde gemäß dem herkömmlichen Verfahren [Kikkawa et al., J. Biol. Chem. 257, 13341 (1982)] unter Erhalten des Aktivitätswerts von 1 mg Protein auf Proteinkinase-C- Aktivität untersucht. Wie nachstehend in Tabelle 1 dargestellt, zeigten die Gytoplasmafraktionen der pTB652-transfizierten und pTB653-transfizierten COS-7-Zellen eine etwa drei Mal so starke Proteinkinase-C-Aktivität wie die der nicht-transfizierten Zellen. Tabelle 1 Herstellung von Rattenhirn-Proteinkinase C durch Transfizierung von Plasmid pTB652 oder pTB653

(6) Analyse aus transfizierten Zellen erhaltener Proteinkinase C

Die in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Gytoplasmafraktionen wurden jeweils mit 6 Volumina 20 mM Tris-HCl-Puffer (Puffer A, pH 7,5) verdünnt, der 0,5 mM EGTA, 0,5 mM EDTA und 10 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, und wurde auf eine Pharmacia FPLC-Mono-Q-Säule (0,5 x 5 cm, Pharmacia HR5/5) aufgebracht. Nach dem Waschen der Säule mit Puffer A wurde Proteinkinase C mit 20 ml eines Puffer A enthaltenden linearen NaCl-Gradienten (0-0,6 M) eluiert. Wie in Fig. 10 dargestellt, wurde in den Testproben aus pTB652-transfizierten und pTB653-transfizierten Zellen verglichen mit den nicht-transfizierten Zellen eine merklich höhere Enzymaktivität nachgewiesen.
Die aus der Mono-Q-Säule eluierten aktiven Fraktionen wurden an 8,5%igem SDS-Polyacrylamidgel gemäß dem Verfahren von Laemmli (Laemmli, U. K., Nature 227, 680-685 (1970)] der Elektrophorese unterzogen und gemäß dem Verfahren von Towbin et al. (Towbin, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 (1979)] auf Nitrocellulosefilter überführt. Man ließ die Filter jeweils über Nacht bei 4ºC in einem 10 mM Tris-HGL-Puffer (pH 7,5), der 150 mM NaCl, 5% Casein und 20% normales Pferdeserum enthielt, stehen und ließ sie anschließend 1 Stunde bei Raumtemperatur in einem 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) stehen, der 150 mM Nagl, 1% Casein und anti-Proteinkinase-C-Antikörper enthielt [von Dr. P. J. Parker, Coussens, L. S., Science 233, 859-866 (1986)]. Die Filter wurden mit einem 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gewaschen, der 0,05% Tween 20 und 150 mM Nagl enthielt, und man ließ 1,5 Stunden in einem Tris-HCl-Puffer stehen, der 1% Casein, 150 mM NaCl, 0,1 µCi/ml ¹²&sup5;I-Protein A enthielt. Nach dem Waschen der Filter in derselben Weise wie vorstehend wurden Röntgenfilme mit den Filtern belichtet, um die Proteinbanden sichtbar zu machen, die mit dem Antikörper reagierten. Wie in Fig. 11 dargestellt, ergab die aus den transfizierten Zellen stammende Probe die Proteinbande, die mit dem Antikörper in derselben Position wie diejenige von aus Rattenhirn isolierter Proteinkinase C reagierte.

(7) Reinigung aus transfizierten Zellen erhaltener Proteinkinase C

Ähnliche Ergebnisse wurden auch im Fall von COS-7-Zellen erhalten, die mit pTB707 (mit einer 5'-untranslatierten Region aus 55 Basenpaaren), das durch Verkürzen der 5'-untranslatierten Region von pTB652 erhalten wurde, und mit pTB708 (das eine 5'- untranslatierte Region aus 55 Basenpaaren trug), das durch Ver kürzen der 5'-untranslatierten Region von pTB653 erhalten wurde, transfiziert wurden.
So wurden in derselben Weise wie vorstehend beschrieben aus pTB707- und pTB708-transfizierten Zellen (jeweils in einer 50 Schalen mit 100 mm Durchmesser entsprechenden Menge) Cytoplasma- Fraktionen erhalten und auf die präparative Chromatographie mittels einer Mono-Q-Säule (1 x 10 cm, Pharmacia HR10/10) angewandt. Die aktiven Fraktionen wurden mit einer Hydroxyapatitsäule teilweise gereinigt. Die aktiven Fraktionen wurden anschließend mit demselben Volumen eines 20 mM Kaliumphosphatpuffers (Puffer B, pH 7,5) verdünnt, der 0,5 mM EGTA, 0,5 mM EDTA, 10% Glycerin und 10 mM Mercaptoethanol enthielt, und auf eine Hydroxylapatitsäule (Typ KOKEN S, 0,78 x 10 cm) des Pharmacia FPLC-Systems aufgebracht. Die Proteinkinase-C-Aktivität wurde mit dem linearen Gradientenpuffer B eluiert, der 20-280 mM Kaliumphosphat enthielt. Wie in Fig. 12 dargestellt, ergab die aus Rattenhirnen isolierte Proteinkinase C drei Peaks (Peak 1, 2 und 3 links in D in Fig. 12) und die aus den nicht-transfizierten Zellen stammende Probe zeigte eine Peak 3 entsprechende Aktivität.
Auf der anderen Seite zeigte die aus den transfizierten Zellen stammende Probe Aktivitäten&sub1; die Peak 2 und 3 entsprachen. Dies legt nahe, daß die Peak 2 entsprechende Proteinkinase-C-Aktivität durch die mit der Plasmid-DNA transfizierten Zellen exprimiert wird.

Claims

1. Human-Proteinkinase C, die ein Polypeptid ist, das die folgende Aminosäurensequenz umfaßt:

ein Teil davon, der dieselbe Aktivität besitzt, oder das Polypeptid, dessen Aminosäurensequeriz teilweise ersetzt ist und das dieselbe Aktivität besitzt.

2. Rekombinante DNA, die eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine Human-Proteinkinase C kodiert, welche das Polypeptid gemäß Anspruch 1 ist.

3. Transformante, die mit einem Vektor mit einer DNA transformiert wurde, die eine Nukleotidsequenz umfaßt, die für eine Human-Proteinkinase C kodiert, welche das Polypeptid gemäß Anspruch 1 ist.

4. Verfahren zum Herstellen einer Human-Proteinkinase C, welches die Schritte des Kultivierens einer Transformante gemäß Anspruch 3 in einem Kulturmedium, Anreichern von Human-Proteinkinase C in der Kultur und Isolieren derselben umfaßt.

5. Ratten-Proteinkinase C, die ein Polypeptid ist, das die in Fig. 2 dargestellte Aminosäurensequenz umfaßt.

6. Rekombinante DNA, die eine Nukleotidsequenz enthält, die für eine Ratten-Proteinkinase C kodiert, welche ein Polypeptid ist, das die in Fig. 2 dargestellte Aminosäurensequenz umfaßt.

7. Transformante, die mit einem Vektor mit einer DNA transformiert wurde, die eine Nukleotidsequenz umfaßt, die für eine Ratten-Proteinkinase C kodiert, welche ein Polypeptid ist, das die in Fig. 2 dargestellte Aminosäurensequenz umfaßt.

8. Verfahren zum Herstellen einer Ratten-Proteinkinase C, welches die Schritte des Kultivierens einer Transformante gemäß Anspruch 7 in einem Kulturmedium, Anreichern von Ratten-Proteinkinase C in der Kultur und Isolieren derselben umfaßt.