JP2000023681A

JP2000023681A - 腫瘍タンパク質のプロテインキナ―ゼ

Info

Publication number: JP2000023681A
Application number: JP11139329A
Authority: JP
Inventors: Michael Karin; カリン、マイケル; Masahiko Hibi; ヒビ、マサヒコ; Anning Linn; リン、アニン
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1993-07-19
Filing date: 1999-05-19
Publication date: 2000-01-25
Anticipated expiration: 2021-02-15
Also published as: JP2986548B2; WO1995003324A1; WO1995003323A1; AU7366894A; US5804399A; JPH09500535A; US5994513A; EP0726908A1; US6514745B1; US6193965B1; US5593884A; PT728143E; EP0728143A1; JP3745558B2; ES2191032T3; US5837244A; EP0728143A4; JP2925740B2; AU7338094A; DE69432223T2

Abstract

(57)【要約】【課題】ＪＮＫ活性を調整する試薬及びＪＮＫが関与
する疾患の処置方法の提供。【解決手段】還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定した場
合、４６ｋＤの分子量を有し、セリンおよびスレオニン
キナーゼ活性を有し、ｃ−ＪｕｎＮ−末端活性化ドメイ
ンにリン酸化するという特徴を有する単離ポリペプチド
およびポリヌクレオチド、並びにＪＮＫの検出方法の提
供。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ハワードヒュー・
メディカルインスティチュートの支援および政府の支援
のもと、エネルギー局より授与されたグラント番号:DE-
86ER60429 および米国予防衛生研究所より授与されたグ
ラント番号：CA-50528およびCA-58396を受けて行われ
た。合衆国政府は、本発明において一定の権利を有す
る。

【０００２】本発明は、一般にプロテインキナーゼ、腫
瘍遺伝子および腫瘍タンパク質の分野に関し、具体的に
は、ｃ−ＪｕｎＮ−末端活性化ドメインに結合し、これ
をリン酸化して活性を高めるプロテインキナーゼに関す
る。

【０００３】

【従来の技術】多くのウイルス遺伝子および細胞性遺伝
子が、潜在的な発癌遺伝子として同定されており、これ
らはまとめて腫瘍遺伝子(oncogene)と呼称されている。
ウイルス腫瘍遺伝子の細胞性相同物、即ち、腫瘍原遺伝
子(proto-oncogene)またはｃ−腫瘍遺伝子は、細胞増殖
および分化の制御において機能するか、または細胞内シ
グナル系を仲介する。腫瘍遺伝子の産物は、その細胞内
の存在位置にしたがって、例えば分泌腫瘍タンパク質、
表面腫瘍タンパク質、細胞質腫瘍タンパク質および核腫
瘍タンパク質のように分類される。

【０００４】細胞核を標的とするタンパク質を発現する
腫瘍原遺伝子は、腫瘍遺伝子の小部分を構成する。これ
ら核腫瘍原タンパク質は、典型的にはＲＮＡおよびＤＮ
Ａ合成のトランスアクチベータおよびレギュレータとし
て直接作用する。核腫瘍遺伝子産物は、細胞の異常増殖
および最終的には新形成をもたらす遺伝子調節の変化を
誘発する能力有する。核腫瘍遺伝子の例には、ｍｙｃ、
ｓｋｉ、ｍｙｂ、ｆｏｓおよびｊｕｎ遺伝子が含まれ
る。ｃ−ｊｕｎ腫瘍原遺伝子によってコードされるｃ−
Ｊｕｎタンパク質は、二量体性の配列特異的転写活性化
物質、ＡＰ−１の重要な成分である。他の転写活性化物
質と同様に、ｃ−Ｊｕｎは、ＤＮＡ結合ドメインおよび
トランス活性化（トランスアクチベーション）ドメイン
を含む２つの機能性ドメインを有する。このＤＮＡ結合
ドメインはＣ−末端に位置し、ＢＺｉｐ構造を有する。
この構造は、それぞれＤＮＡ結合と二量体化のために必
要となる保存塩基（Ｂ）およびロイシンジッパー（Ｚｉ
ｐ）ドメインから成る。Ｎ−末端はトランス活性化ドメ
インを含む。ｃ−Ｊｕｎの発現は多くの細胞外シグナル
によって急速に誘発されるが、その活性はまたタンパク
質のリン酸化によって翻訳後に調節される。ｃ−Ｊｕｎ
のＤＮＡ結合ドメインの隣のクラスター部のリン酸化は
ＤＮＡの結合を抑制する（Boyleら、Cell 64:573(199
1); Linら、Cell70:777(1992)）。トランス活性化ドメ
イン内に配置された他の２つの部位、即ちＳｅｒ６３お
よびＳｅｒ７３のリン酸化は、ｃ−Ｊｕｎの能力を高め
転写を活性化させる（Binetruyら、Nature 351:122(199
1);Smealら、Nature 354:494(1991)）。これらの部位の
リン酸化率は非刺激細胞では低く、増殖因子（例えば血
小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）もしくはｖ−Ｓｉｓ）、
または腫瘍発生的に活性化されたＳｒｃ、Ｒａｓおよび
Ｒａｆタンパク質の発現に反応して急速に増加する。骨
髄系およびリンパ系細胞では、これらの部位のリン酸化
は、フォルボールエステル（ＴＰＡ）によって刺激され
るが、線維芽細胞および上皮細胞では刺激されない。こ
れらの相違は、リンパ系細胞対線維芽細胞におけるＨａ
−ｒａｓ調節の態様の相違によるものであろう。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】多くのタンパク質が、
特定のプロモーターによる転写の活性化において互いに
協調的に機能する。この協力を介して遺伝子は転写さ
れ、タンパク質生成物が生じる。Ｆｏｓ腫瘍原遺伝子フ
ァミリーは、Ｊｕｎ遺伝子ファミリーのメンバーととも
に安定な複合体を形成し、これはＤＮＡにＡＰ−１部位
で結合する。このＡＰ−１部位は多数の遺伝子のプロモ
ータードメインに位置する。Ｆｏｓ／Ｊｕｎ複合体の結
合は、ＡＰ−１部位に結合した遺伝子の転写を活性化す
る。自身の増殖調節メカニズムを失った細胞では、この
Ｆｏｓ／Ｊｕｎ複合体がＡＰ−１部位に居座り、特定の
遺伝子の過剰発現を引き起こすかもしれないと考えられ
ている。多くの増殖性疾患は、例えば腫瘍原遺伝子のよ
うな他の点では正常な遺伝子の過剰発現が原因であるの
で、これら遺伝子の過剰な活性化と干渉する組成物を同
定することが望ましい。

【０００６】長年にわたって、遺伝子の発現またはその
メッセージのタンパク生成物への翻訳を変化させる能力
について、種々の薬剤が調べられてきた。現在の薬剤療
法の１つの問題は、それは無差別的に作用し、新生細胞
同様健常な細胞にも影響を与える傾向があるということ
である。これは、主に健常な細胞に対する毒性をもった
薬剤の作用のために重篤な副作用が存在する多くの化学
療法が有する主要な問題である。

【０００７】前述の記載から、健常細胞に対する潜在的
なマイナスの影響を減少させるために、その発現産物が
細胞増殖に関連する遺伝子の過剰発現に影響を与える異
常細胞中の特定の標的を同定する必要がある。本発明
は、そのような標的を提供する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、ｃ−ＪｕｎＮ
−末端活性化ドメインをリン酸化する新規なプロテイン
キナーゼ（ＪＮＫ）を提供する。ＪＮＫ１は、４６ｋＤ
の分子量（還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＰＡＧＥ）によって決定）を有し、セリンとスレオ
ニンキナーゼ活性を有するという特徴をもつ。特にＪＮ
Ｋ１はｃ−Ｊｕｎのセリン残基６３と７３をリン酸化す
る。

【０００９】ｊｕｎ腫瘍原遺伝子産物は、ＡＰ−１部位
に結合するトランスアクチベータータンパク質であるの
で、ｃ−Ｊｕｎ活性化の調節は、細胞中での正常な遺伝
子発現および増殖制御に影響を与える点で重要であろ
う。ＪＮＫの発見は、ＪＮＫ活性に影響を与える組成物
を同定し、これにより、ｃ−Ｊｕｎ活性化とその後のＡ
Ｐ−１部位結合遺伝子の活性化に影響を与える手段を提
供する。

【００１０】ＪＮＫの同定によって、ｃ−Ｊｕｎおよび
ＡＰ−１の活性化に関与する特異的キナーゼ活性のレベ
ルを検出することが可能になった。さらに、本発明は、
細胞増殖性疾患をもつ患者に、ＪＮＫ活性を調整する試
薬を治療的に有効な量で投与することによって、ＪＮＫ
が関与するこの疾患を処置する方法を提供する。

【００１１】本発明はまた、アミノ酸３３−７９に対応
するｃ−ＪｕｎのＪＮＫ結合領域を含む合成ペプチドを
提供する。このペプチドは、ＪＮＫによるｃ−Ｊｕｎ活
性化量を減少させたい状況において、自然に生じるｃ−
Ｊｕｎの競合阻害剤として有用である。

【００１２】本発明はまたＪＮＫ２を開示するが、これ
はＪＮＫ１と同様な活性をもつ新規なプロテインキナー
ゼであり、５５ｋＤの分子量を有する。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明は、ｃ−Ｊｕｎ腫瘍原タン
パク質の十分に解明されたドメインに結合し、その活性
化ドメイン内の２ケ所をリン酸化する新規なプロテイン
キナーゼ（ＪＮＫ）を提供する。これらの部位のリン酸
化は、転写を促進し腫瘍性のトランスフォーメーション
（形質転換）を仲介するｃ−Ｊｕｎの能力を増加する。

【００１４】ｃ−Ｊｕｎの活性はリン酸化によって調節
される。形質転換性腫瘍遺伝子およびＵＶ光を含む種々
の刺激が、ｃ−ＪｕｎのＮ−末端活性化ドメインのセリ
ン６３および７３のリン酸化を誘発し、それによってそ
のトランス活性化機能を強化する。本発明は、分子量が
４６ｋＤであり（還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決
定)、セリンおよびスレオニンキナーゼ活性を有し、ｃ
−ＪｕｎのＮ−末端の活性化ドメインをリン酸化するこ
とができるという特徴をもつ単離ポリペプチドに関す
る。このタンパク質はＪＮＫ１と呼称される。さらに、
ＪＮＫ２と呼ばれる第二のＪＮＫタンパク質（５５ｋ
Ｄ）も開示される。

【００１５】“単離された”とは、本発明の一切のＪＮ
Ｋポリペプチド、またはＪＮＫポリペプチドをコードす
る一切の遺伝子を指し、該ポリペプチドは、それぞれ他
のポリペプチドまたは遺伝子を実質的に含まず、またＪ
ＮＫポリペプチドもしくは遺伝子とともに天然では通常
見出され得る他の夾雑物も実質的に含まない。

【００１６】本発明は、機能性ポリペプチド（ＪＮＫ）
およびそれらの機能性フラグメントを含む。本明細書で
用いられているように、“機能性ポリペプチド”とは、
確立された機能アッセーにより同定される生物学的な機
能または活性を有し、細胞における特定の生物学的、形
態学的または表現型の変更に関連しているポリペプチド
を指す。例えば、この生物学的機能は、抗体分子が結合
することができるような小さいポリペプチドフラグメン
トから、細胞内の表現型の変更を特徴的に誘発またはプ
ログラミングすることに関係できる大きいポリペプチド
まで変動しうる。ＪＮＫの酵素的機能を有するポリペプ
チドまたはフラグメントは、ｃ−ＪｕｎＮ−末端活性化
ドメインキナーゼ活性を有する。“機能性ポリヌクレオ
チド”とは、本明細書に記載した機能性ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを指す。

【００１７】ＪＮＫの一次アミノ酸配列の小さな修飾
は、本明細書に記載したＪＮＫポリペプチドと比較した
場合、実質的に同等な活性を有するタンパク質を生じる
であろう。そのような修飾は、部位指向性（site-direc
ted)突然変異のように意図的に実施できるが、また自然
発生的にも生じるであろう。これらの修飾によって生じ
るポリペプチドの全ては、ＪＮＫのキナーゼ活性が存在
する限り本発明に含まれる。さらに、１つまたは２つ以
上のアミノ酸の欠失はまた、そのキナーゼ活性に顕著な
変化を与えることなく、得られた分子の構造を修飾する
ことができる。これによって、より大きな利用性を有す
るより小型の活性分子を開発することができる。例え
ば、ＪＮＫキナーゼ活性に必要でないアミノ末端または
カルボキシ末端のアミノ酸を除去することが可能であ
る。

【００１８】本発明のＪＮＫポリペプチドはまた、この
ポリペプチド配列の保守的変形も含む。本明細書で用い
られているように“保守的変形”とは、生物学的に同様
な別の残基のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を
指す。保守的変形の例には、例えばイソロイシン、バリ
ン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの疎水性残
基を別のものによって置換すること、または１つの極性
残基を別のものと置換すること、例えばリシンをアルギ
ニンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、またはアス
パラギンをグルタミンで置換すること等が含まれる。
“保守的変形”という用語は、置換ポリペプチドに対し
て得られた抗体がまた未置換ポリペプチドと免疫的に反
応するならば、未置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ
酸の使用も含む。

【００１９】本発明はまた、ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナー
ゼ、ＪＮＫに結合する合成ペプチドを提供する。配列番
号１のこのアミノ酸配列およびその保守的変形は本発明
の合成ペプチドを含む。この配列は、ｃ−Ｊｕｎポリペ
プチドのアミノ酸３３−７９を表す（Angelら、Nature
332(6160):166(1988)）。本明細書で用いられているよ
うに、“合成ペプチド”という用語は、天然に生じる完
全なタンパク質分子を含まないペプチドを指す。ペプチ
ドが、例えば化学合成、組換え体遺伝子工学または完全
抗原のフラグメント化等の技術を用いて人間の仲介によ
って生成され得る場合、そのペプチドは“合成”であ
る。

【００２０】本発明のペプチドは、α−アミノ基のｔ−
ＢＯＣまたはＦＭＯＣ保護のような通常用いられる方法
によって合成できる。両方法は段階的な合成を含み、こ
れによって、ペプチドのＣ−末端から開始してただ１つ
のアミノ酸が、各段階で付加される（Coliganら、免疫
学の今日のプロトコル(Current Protocols in Immunolo
gy)、Wiley Interscience(1991)、ユニット9)。本発明
のペプチドは、メリーフィールドおよびスチュワートと
ヤングが記載した既知の固相ペプチド合成法によって、
０．１−１．０ｍＭｏｌアミン／ｇポリマー含有コポリ
（スチレン−ジビニルベンゼン）を用いて合成できる
（Merrifield J. Am. Chem. Soc., 85:2149(1962); Ste
wart & Young、固相ペプチド合成（Solid Phase Peptid
e Synthesis)、Freeman、San Francisco (1969)）。化
学合成が終了したとき、ペプチドを脱保護し、液体ＨＦ
−１０％アニゾールにより０℃で約１／４−１時間処理
してポリマーから切断することができる。試薬を蒸発さ
せ、１％酢酸溶液でポリマーから抽出し、続いて凍結乾
燥させて粗製物質を得る。これを通常、溶媒として５％
酢酸を用いて例えばセファデックスＧ−１５でのゲル濾
過のような技術により精製することができる。カラムの
適切な分画の凍結乾燥によって、均質なペプチドまたは
ペプチド誘導体を得ることができ、続いてアミノ酸分
析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフ
ィー、紫外線吸収スペクトル分析、モル旋光度、溶解度
のような標準的な技術によって性状を調べ、固相エドマ
ン分解によって定量できる。

【００２１】本発明はまた、本発明のＪＮＫポリペプチ
ドおよび配列番号１の合成ペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを提供する。本明細書で用いられるように、
“ポリヌクレオチド”は、分離フラグメントの形状の、
または大型構築物の成分としてのデオキシリボヌクレオ
チドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本発明
のポリペプチドをコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡフラグ
メントからまたはオリゴヌクレオチドから組み立てるこ
とができ、これは、組換え体転写ユニットで発現させる
ことができる合成遺伝子を提供する。本発明のポリヌク
レオチド配列には、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列
が含まれる。

【００２２】本発明のＤＮＡ配列は、幾つかの方法によ
って得ることができる。例えば、ＤＮＡは、当技術分野
で周知のハイブリダイゼーション法を用いて単離するこ
とができる。この方法には以下の工程が含まれる：１）
ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーに対し
てプローブをハイブリダイズさせて、共通するヌクレオ
チド配列を検出する；２）発現ライブラリーを抗体でス
クリーニングして、共通した構造特徴物を検出する；さ
らに、３）ポリメラーゼ鎖伸長反応（Polymerase chain
reaction, PCR）によって合成する。但しこれに限られ
るものではない。

【００２３】ハイブリダイゼーション法は、標識付けさ
れた混合合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて、組
換え体クローンをスクリーニングするのに有用である。
この方法では、各プローブは、潜在的に変性二重鎖ＤＮ
Ａの異種混合物を含むハイブリダイゼーションサンプル
中の特定のＤＮＡ配列の完全な相補物である。そのよう
なスクリーニングでは、ハイブリダイゼーションは好ま
しくは、一本鎖ＤＮＡまたは変性二重鎖ＤＮＡに対して
実施される。ハイブリダイゼーションは、特に、対象ポ
リペプチドに関連するｍＲＮＡ配列の量が極めてわずか
しか存在しない原材料に由来するｃＤＮＡクローンの検
出に有用である。言い換えれば、非特異的な結合を回避
するために指向される厳しいハイブリダイゼーション条
件を用いることによって、例えばその完全な相補物であ
る混合物中のただ１つのプローブに対する当該標的ＤＮ
Ａのハイブリダイゼーションによって、特異的ｃＤＮＡ
クローンをオートラジオグラフによって可視化すること
が可能である（Wallace ら、Nucleic Acid Research 9:
879(1981))。

【００２４】ＪＮＫをコードする特定のＤＮＡ配列
は、：１）ゲノムＤＮＡから二重鎖ＤＮＡ配列を単離す
る；２）ＤＮＡ配列を化学的に製造し、対象ポリペプチ
ドに必要なコドンを提供する；３）真核ドナー細胞から
単離したｍＲＮＡの逆転写によって、二重鎖ＤＮＡ配列
をインビトロで合成することによっても得ることができ
る。後者の場合には、ｍＲＮＡの二重鎖ＤＮＡ相補物が
最後に形成され、これは一般にはｃＤＮＡと呼ばれる。
組換え体工程で使用される特定のＤＮＡ配列を作成する
ためのこれら３つの方法の内、ゲノムＤＮＡ単離体の単
離が最も一般的でない。このことは、イントロンの存在
のために哺乳類のペプチドを微生物で発現させることが
所望される場合に特にそうである。

【００２５】ＤＮＡ配列の合成は、所望のポリペプチド
産物のアミノ酸残基の完全な配列が分かっている場合に
は、しばしば最良の方法である。所望のポリペプチドの
アミノ酸残基の完全な配列が不明の場合は、ＤＮＡ配列
の直接合成は不可能であり、最良の方法はｃＤＮＡ配列
の合成である。対象ｃＤＮＡ配列を分離する標準的な方
法として、とりわけプラスミドまたはファージ保有のｃ
ＤＮＡライブラリーの作成が用いられるが、これらライ
ブラリーは、高レベルの遺伝子発現をもつドナー細胞に
おいて豊富なｍＲＮＡの逆転写から得られる。ポリメラ
ーゼ鎖伸長反応法と組み合わせて用いる場合、発現がま
れな産物のクローニングも可能である。ポリペプチドの
アミノ酸配列の大半が既知の場合には、標的ｃＤＮＡ中
に存在することが想定される配列の写しである標識一本
鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡプローブ配列の作
製が、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション工程で用
いられることもあろう。これは、一本鎖形に変性させた
ｃＤＮＡのクローニングしたコピーで実施される（Jay
ら、Nucl. Acid Res. 11:2325(1983))。

【００２６】ｃＤＮＡ発現ライブラリー例えばラムダｇ
ｔ１１は、少なくとも１つのエピトープを有するＪＮＫ
ポリペプチドについて、ＪＮＫ特異的抗体を用いて間接
的にスクリーニングすることができる。そのような抗体
は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよ
く、ＪＮＫｃＤＮＡの存在を示唆する発現産物を検出す
るために用いられる。

【００２７】ポリヌクレオチド配列は遺伝暗号から推定
できるが、遺伝暗号の縮退(degeneracy)を考慮に入れな
ければならない。本発明のポリヌクレオチドには、遺伝
暗号の結果として縮退した配列が含まれる。２０個の天
然のアミノ酸が存在し、その大半は１つ以上のコドンに
よって特定される。したがって、ＪＮＫのアミノ酸配列
が機能を有するポリペプチドを生じる限り（少なくと
も、ポリヌクレオチドのセンス鎖の場合）、全ての縮退
ヌクレオチド配列が本発明に含まれる。

【００２８】ＪＮＫのポリヌクレオチド配列はまた、Ｊ
ＮＫをコードするポリヌクレオチドに対して相補的な配
列（アンチセンス配列）を含む。アンチセンス核酸は、
特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分と相補的なＤＮ
ＡまたはＲＮＡである（Weitraub Scientific American
262:40(1990))。本発明は、ＪＮＫポリペプチドの産生
を抑制することができる全てのアンチセンスポリヌクレ
オチドを包含する。細胞内では、アンチセンス核酸は対
応するｍＲＮＡとハイブリダイズし、二重鎖分子を形成
する。アンチセンス核酸は、細胞が二重鎖のｍＲＮＡは
翻訳しないのでｍＲＮＡの翻訳に干渉する。容易に合成
できるということと、標的ＪＮＫ産生細胞に導入したと
きに大型の分子より問題を生じる可能性が少ないという
ことから、約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマ
ーが好ましい。遺伝子の翻訳を抑制するためにアンチセ
ンス法を用いることは当技術分野では周知である（Marc
us-Sakura Anal. Biochem., 172:289(1988))。

【００２９】さらに、ＪＮＫのためのリボザイムヌクレ
オチド配列も本発明に含まれる。リボザイムは、ＤＮＡ
制限エンドヌクレアーゼと類似した態様で他の一本鎖Ｒ
ＮＡを特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子であ
る。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修
飾を介して、ＲＮＡ分子内の特定のヌクレオチド配列を
認識し、それを切断する分子を作り出すことが可能であ
る（Cech J. Amer. Med.Assn, 260:3030(1988)) 。それ
らが配列特異的であるという理由から、この方法の主な
利点は、特定の配列をもつｍＲＮＡのみが不活性化され
るということである。

【００３０】リボザイムには２つの基本的なタイプすな
わちテトラヒメナ型（Hasselhoff Nature 334:585(198
8))および“ハンマーヘッド”型が存在する。テトラヒ
メナ型リボザイムは、４塩基の長さの配列を認識し、一
方、“ハンマーヘッド”型リボザイムは、長さが１１−
１８塩基の配列を認識する。認識配列が長ければ長いほ
ど、標的ｍＲＮＡ種においてのみその配列が生じる可能
性は大きくなる。結果として、ハンマーヘッド型リボザ
イムは、特定のｍＲＮＡ種を不活性化させることについ
てテトラヒメナ型リボザイムより好ましく、１８塩基の
認識配列はより短い認識配列よりも好ましい。

【００３１】本発明のＪＮＫポリペプチドはまた、ＪＮ
Ｋポリペプチドのエピトープに対して免疫反応性を有す
るか、または結合する抗体を生成するために用いること
ができる。本発明の抗体はまた、配列番号１の合成ペプ
チドに結合する抗体を含む。異なるエピトープ特異性を
もつ、実質的にモノクローナル抗体を集めたものから成
る抗体が、それぞれ別個のモノクローナル抗体調製物と
同様提供される。モノクローナル抗体は、このタンパク
質のフラグメントを含む抗原から当技術分野で周知の方
法によって作製される（Kohlerら、Nature 256:495(197
5); 分子生物学の今日の手技（Current Protocols inMo
lecular Biology)、オースベル(Ausubel)ら編(198
9)）。

【００３２】本発明で用いられているように“抗体”と
いう用語は、完全な分子と同様にそのフラグメント（例
えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ')２およびＦｖ）でエピトープ
決定基と結合することができるものを含む。これらの抗
体フラグメントは、その抗原またはレセプターと選択的
に結合する何らかの能力を保持し、以下のように定義さ
れる；（１）Ｆａｂとは、抗体分子の一価の抗原結合フラグメ
ントを含むフラグメントで、完全な抗体を酵素パパイン
で消化することによって生成でき、完全な一本の軽鎖と
１本の重鎖の一部分が得られる。（２）Ｆａｂ'とは、完全な抗体をペプシンで処理し、
続いて還元することによって得られる抗体分子のフラグ
メントで、完全な一本の軽鎖と重鎖の一部分が得られ
る。抗体１分子につき２つのＦａｂ’フラグメントが得
られる。（３）（Ｆａｂ')２とは、完全な抗体を酵素ペプシン
で処理し、その後還元を施さない場合に得られる抗体の
フラグメントである。Ｆ（ａｂ')２は、２つのジスル
フィド結合によって結合した２つのＦａｂ’フラグメン
トの二量体である。（４）Ｆｖは、２本の鎖として発現される、軽鎖の可変
領域と重鎖の可変領域を含む遺伝学的に作製されたフラ
グメントと定義される。（５）単鎖抗体（“ＳＣＡ”）は、軽鎖の可変領域と重
鎖の可変領域を含み、これらが遺伝学的に融合した単鎖
分子として適切なリンカーによって結合された、遺伝学
的に作製された分子と定義される。

【００３３】これらのフラグメントの作製方法は当技術
分野で既知である（例えば、Harlow& Lane著、抗体: 実
験室マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual）コ
ールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク(198
8)、この文献は参照により本明細書に含まれる) 。

【００３４】本発明で用いられているように、“エピト
ープ”という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原
上の一切の抗原決定基を指す。エピトープ決定基は、通
常は分子の化学的に活性な表面分族例えばアミノ酸また
糖側鎖から成り、さらに通常、特異的な電荷特性と同様
に特異的な三次元構造特性を有する。

【００３５】本発明のＪＮＫポリペプチドに結合する抗
体は、免疫抗原として完全なポリペプチドまたは対象と
なっている小型のペプチドを含むフラグメントを用いて
調製できる。動物を免疫するために用いられるポリペプ
チドまたはペプチド例えば配列番号１は、ｃＤＮＡの翻
訳または化学合成から得ることができ、必要であれば担
体タンパク質と共役させてもよい。ペプチドに化学的に
結合できる通常用いられる担体には、キーホールリンペ
ットのヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風毒素が含まれ
る。続いてこの結合ペプチドを動物（例えばマウス、ラ
ットまたはウサギ）を免疫するために用いる。

【００３６】所望の場合は、ポリクローナル抗体または
モノクローナル抗体をさらに、例えば、それに対して抗
体を作製したポリペプチドまたはペプチドを結合させた
マトリックスに結合させ、続いて溶出させることによっ
て精製することができる。モノクローナル抗体、同様ポ
リクローナル抗体の精製および／または濃縮のための免
疫学分野における一般的な種々の技術も、当該技術分野
でも知られている（Coligan ら、ユニット９、免疫学の
今日のプロトコル（Current Protocols in Immunolog
y)、Wiley Interscience(1991)、この文献は参照により
本明細書に含まれる)。

【００３７】抗イディオタイプ技術を用いて、エピトー
プを模倣したモノクローナル抗体を生成することもまた
可能である。例えば、最初のモノクローナル抗体に対し
て作製された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、
超可変領域内に結合ドメインを有し、この結合ドメイン
は、最初のモノクローナル抗体が結合するエピトープの
“イメージ”である。したがって、本発明では、開示す
る合成ペプチドに結合する抗体から作製された抗イディ
オタイプ抗体は、ｃ−Ｊｕｎに結合するＪＮＫ上の部位
に結合することができ、したがってＪＮＫがｃ−Ｊｕｎ
に結合し、リン酸化されることを防止することができ
る。

【００３８】本発明のポリペプチドまたは合成ペプチド
（配列番号１）をコードするポリヌクレオチド配列は、
原核細胞または真核細胞のいずれでも発現できる。宿主
には、細菌、酵母、哺乳類生物が含まれる。真核細胞性
配列またはウイルス性配列を有するＤＮＡ配列を原核細
胞で発現させる方法は、当技術分野で周知である。宿主
の中で発現と複製が可能な、生物学的機能を有するウイ
ルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは、当技術分野で
既知である。そのようなベクターは本発明のＤＮＡ配列
を取り込ませるために用いられる。

【００３９】ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、
適切な宿主細胞にＤＮＡを移すことによってインビトロ
で発現させることができる。“宿主細胞”とは、ベクタ
ーがその中で増殖でき、そのＤＮＡを発現させることが
できる細胞である。複製中に突然変異が生じる可能性が
あるので、全ての子孫が親細胞と同一であるとは限らな
いことは理解されるところである。しかしながら、“宿
主細胞”という用語が用いられる場合はそのような子孫
が含まれる。安定なＤＮＡ伝達の方法、言い換えれば、
外来ＤＮＡが継続的に宿主内で維持される場合は、当技
術分野で既知である。

【００４０】本発明では、ＪＮＫポリヌクレオチド配列
は、組換え体発現ベクターに挿入することができる。
“組換え体発現ベクター”という用語は、遺伝配列の挿
入または取り込みによる操作が行われた、当技術分野で
既知のプラスミド、ウイルスまたは他の担体を指す。そ
のような発現ベクターは、宿主に挿入された遺伝配列の
効果的な転写を促進するプロモーター配列を含む。発現
ベクターは、典型的には複製開始点、プロモーターを、
形質転換細胞の表現形選別を可能にする特定の遺伝子と
ともに含む。本発明で使用するために適切なベクターに
は以下が含まれるが、但しこれらに限られるものではな
い：細菌で発現させるためにＴ７基材発現ベクター（Ro
senbergら、Gene 56:125(1987))、哺乳類細胞での発現
にｐＭＳＸＮＤ（Lee & Nathans J. Biol. Chem. 263:3
521(1988))および昆虫細胞での発現にバキュロウイルス
由来ベクター。ＤＮＡセグメントは、調節エレメント例
えばプロモーター例えばＴ７、メタロチオネインＩ、ま
たはポリヘドリンプロモーターに機能できるように結合
されてベクター中に存在する。

【００４１】ベクターは、発現ベクターを含む宿主細胞
を同定するために、表現形によって選択できるマーカー
を含むことが可能である。原核細胞発現ベクターで典型
的に用いられるマーカーの例は、アンピシリンに対する
抗生物質耐性遺伝子（β−ラクタマーゼ）、テトラサイ
クリンおよびクロラムフェニコールに対する抗生物質耐
性遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ）を含む。哺乳類の発現ベクターで用いられる典
型的なマーカーの例には、アデノシンデアミナーゼ（Ａ
ＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ
（ｎｅｏ、Ｇ４１８）、ジヒドロフォレートレダクター
ゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトラン
スフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）お
よびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ（ＸＧＰＲＴ、ｇｐｔ）が含まれる。

【００４２】組換え体ＤＮＡによる宿主細胞の形質転換
は、当技術分野で周知の慣用的技術で実施できる。宿主
が原核細胞例えば大腸菌の場合、ＤＮＡ取り込み能力を
有するコンピテント細胞は、増殖期後に採集した細胞か
ら調製でき、続いて当技術分野で周知の工程によってＣ
ａＣｌ２法で処理される。また別には、ＭｇＣｌ２また
はＲｂＣｌも用いることができる。形質転換はまた、宿
主細胞からプロトプラストを形成した後、またはエレク
トロポレーションによって実施することができる。

【００４３】宿主が真核細胞の場合、ＤＮＡのトランス
フェクション法、例えばリン酸カルシウム共沈、慣用的
な機械的方法例えばマイクロインジェクション、エレク
トロポレーション、リポゾーム封入プラスミドの挿入、
またはウイルスベクターを用いることができる。真核細
胞はまた、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列および、選択可能な表現形（例えばヘルペスシンプレ
ックスチミジンキナーゼ遺伝子）をコードする第二の外
来ＤＮＡ分子で同時形質転換させることができる。別の
方法は、真核細胞ウイルス（例えばシミアンウイルス４
０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルス）を用
い、一時的に真核細胞を感染または形質転換させて、該
タンパク質を発現させることである（真核細胞ウイルス
ベクター(Eukaryotic Viral Vectors)、コールドスプリ
ングハーバー研究所、Gluzman 編、1982)。哺乳類宿主
細胞の例には、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＣＨＯ細
胞が含まれる。

【００４４】本発明によって提供される宿主発現ポリペ
プチドまたはそのフラグメントの単離と精製は、調製用
クロマトグラフィーおよびモノクローナル抗体もしくは
ポリクローナル抗体を必須とする免疫学的分離を含む慣
用的な手段によって実施できる。

【００４５】本発明のＪＮＫプロテインキナーゼは、キ
ナーゼの活性に影響を与える化合物または組成物を同定
するためのスクリーニング法として有用である。したが
って、別の実施例では、本発明は、ｃ−ＪｕｎＮ−末端
キナーゼに影響を与える組成物を同定する方法を提供す
る。この方法は以下の工程を含む；被験組成物およびキ
ナーゼまたは該キナーゼをコードするポリヌクレオチド
を含む構成成分を、それら構成成分が相互反応するため
に十分な条件下でインキュベートし、続いてその後、該
組成物がキナーゼ活性または該キナーゼをコードするポ
リヌクレオチドに与えた影響を測定する。キナーゼに対
する観察される影響は、抑制性または刺激性のいずれか
であるだろう。例えば、キナーゼ活性の増加または減少
は、放射性化合物（例えば³²Ｐ−ＡＴＰ）を構成成分混
合物に加え、ｃ−Ｊｕｎまたは他の適切なＪＮＫの基質
中への放射能の取り込みを調べ、該化合物がプロテイン
キナーゼ活性を抑制するかまたは刺激するのかを決定す
ることができる。キナーゼをコードするポリヌクレオチ
ドを発現ベクターに挿入し、キナーゼの転写に対する組
成物の影響を、例えばノザンブロットアッセーで測定す
ることができる。

【００４６】別の実施例では、本発明は、ＪＮＫに関連
する細胞増殖性疾患を治療する方法を提供するが、該方
法は、この疾患をもつ対象者に、キナーゼ活性を調整す
る試薬を治療的に有効な量で投与することを含む。“治
療的に有効”という用語は、例えば使用されるモノクロ
ーナル抗体またはアンチセンスヌクレオチドの量が、Ｊ
ＮＫ関連疾患を改善するために十分な量であることを意
味する。“細胞増殖性疾患”という用語は、悪性細胞増
殖だけでなく、周辺組織とはしばしば形態的に異なるよ
うに見える非悪性細胞増殖をも指す。例えば、この方法
は、種々の器官系、例えば肺、乳房、類リンパ、胃腸管
および秘尿生殖管の悪性物だけでなく、例えば大半の大
腸癌、腎細胞の癌、前立腺癌、肺の非小細胞癌、小腸の
癌および食道癌のような悪性物を含む腺癌の治療に有用
であるかもしれない。

【００４７】この方法はまた、非悪性または免疫関連細
胞増殖疾患例えば乾癬、尋常性天疱瘡、ベーチェット症
候群、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、虚血性心疾
患、透析後症候群、白血病、類リューマチ性関節炎、後
天性免疫不全症候群、脈管炎、敗血症性ショックおよび
他の急性炎症タイプ並びに脂質組織球増殖症の治療にも
有用である。特に好ましいものは免疫疾患である。本質
的には、病因的にＪＮＫキナーゼ活性と連関しているい
ずれの疾患もこの治療に感受性があると考えられるであ
ろう。

【００４８】この治療は、ＪＮＫキナーゼ活性を調整す
る試薬の投与を含む。“調整する”という用語は、ＪＮ
Ｋが過剰に発現されている場合はその発現抑制を予想
し、その発現が低下している場合はＪＮＫ発現の増加が
予想される。この用語はまた、天然のｃ−Ｊｕｎの細胞
内の結合部位に対する競合的抑制物質として、例えば配
列番号１のペプチドを用いることによって、ｃ−Ｊｕｎ
のリン酸化の抑制を予想する。細胞増殖性疾患がＪＮＫ
の過剰発現と関連している場合は、ＪＮＫポリヌクレオ
チドアンチセンス配列またはＪＮＫ結合抗体のような抑
制性試薬を細胞に導入できる。さらに、本発明のペプチ
ドに結合するモノクローナル抗体に結合する抗イディオ
タイプ抗体もまた、本発明の治療方法として用いること
ができる。また別に、細胞増殖性疾患がＪＮＫポリペプ
チドの突然変異体の発現または低発現に関連している場
合は、ポリヌクレオチドセンス配列（ＤＮＡのタンパク
質コード鎖）またはＪＮＫポリペプチドを細胞内に導入
することができる。

【００４９】本発明の抗体は、注射によるか、または時
間をかけた緩徐な輸液によって非経口的に投与できる。
本発明のモノクローナル抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉
内、皮下、髄膜腔内または経皮的に投与できる。

【００５０】本発明のペプチドまたは抗体の非経口投与
用調製物には、滅菌水性もしくは非水性溶液、懸濁液お
よび乳液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレング
リコール、ポリエチレングリコール、植物油例えばオリ
ーブ油および注射可能な有機エステル例えばオレイン酸
エチルである。水性担体には、水、アルコール性／水性
溶液、乳液または懸濁液が含まれ、食塩水、緩衝性媒体
が含まれる。非経口担体には、塩化ナトリウム溶液、デ
キストロースリンゲル氏液、デキストロース添加塩化ナ
トリウム、乳酸塩付加リンゲル氏液、または固定油が含
まれる。静脈内投与用担体は、液体と栄養補充物、電解
質補充物（例えばリンゲルデキストロース液をベースに
したようなもの）等を含む。保存料および他の添加物例
えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス
などを含んでいてもよい。

【００５１】アンチセンス配列を含むポリペプチド配列
は、当技術分野で既知の種々の技術によって治療的に投
与することができる。そのような処置は、増殖性疾患を
もつ動物の細胞にＪＮＫポリペプチドを導入することに
よってその治療的効果を達成するであろう。ＪＮＫポリ
ヌクレオチドの薬剤送達は、遊離ポリヌクレオチドまた
は組換え体発現ベクター例えばキメラウイルスまたはコ
ロイド性分散系を用いて達成できる。ヌクレオチド配列
の治療的薬剤送達で最も好ましいものは、照準化リポゾ
ームの使用である。

【００５２】本明細書で教示する遺伝子治療に利用でき
る種々のウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘル
ペスウイルス、ワクシニア、または好ましくはレトロウ
イルスのようなＲＮＡウイルスが含まれる。好ましく
は、レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリのレ
トロウイルス誘導ウイルスである。単一の外来遺伝子を
挿入できるレトロウイルスベクターの例には以下が含ま
れるが、これらに限られるものではない：モロニーマウ
ス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉
腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（Ｍ
ｕＭＴＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。さら
に多数のレトロウイルスベクターの付加によって多数の
遺伝子を取り込ませることができる。これらのベクター
の全ては選択可能なマーカーのための遺伝子を伝達また
は取り込ませることができ、それによって形質導入細胞
を識別し増殖させることができる。ＪＮＫ配列を特定の
標的細胞に対するレセプター用リガンドをコードする別
の遺伝子とともにウイルスベクターに挿入することによ
って、このベクターは標的特異性を獲得する。レトロウ
イルスベクターは、例えば糖、糖脂質またはタンパク質
をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって
標的特異的にすることができる。好ましい照準化は抗体
を用いることによって達成される。当業者は、ＪＮＫポ
リヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの特異的
送達を可能にするために、レトロウイルスゲノムに挿入
されるべき特定のポリヌクレオチド配列を容易に知りえ
るであろう。

【００５３】組換え体レトロウイルスは不完全であるの
で、感染性のベクターウイルスを製造するためにそれら
は助けを必要とする。この助けは、例えばヘルパー細胞
株を用いることによって提供されるが、このヘルパー細
胞株は、ＬＴＲ内の調節配列の制御の下で、レトロウイ
ルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含ん
でいる。これらプラスミドは、パッケージ系に被包化の
ためのＲＮＡ転写物を認識させるヌクレオチド配列を欠
いている。パッケージングシグナルを欠くヘルパー細胞
株には、例えばΨ２、ＰＡ３１７およびＰＡ１２が含ま
れるが、これらに限られるものではない。これらの細胞
株は、ゲノムが包み込まれないので空のウイルス粒子を
生じる。レトロウイルスベクターが、パッケージングシ
グナルは完全であるが構造遺伝子が他の対象遺伝子で置
き換えられているような細胞に導入されると、ベクター
はパッケージされベクターウイルス粒子が産生される。
この方法で産生されたベクターウイルス粒子を、続いて
組織細胞株例えばＮＩＨ３Ｔ３細胞に感染させるために
用いて、大量のキメラレトロウイルス粒子を産生させる
ことができる。

【００５４】ＪＮＫポリヌクレオチドの別の照準化送達
システムは、コロイド分散システムである。コロイド分
散システムには、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小
球体、ビーズ並びに水中油滴乳化物、ミセル、混合ミセ
ルおよびリポゾームを含む脂質ベース系が含まれる。本
発明の好ましいコロイド系はリポゾームである。リポゾ
ームは、インビトロおよびインビボでの送達担体として
有用な人工膜担体である。サイズが０．２−４．０μｍ
の大型の単ラメラ小胞（ＬＵＶ）は、大型の巨大分子を
含む大量の水性緩衝液を封入することが示された。ＲＮ
Ａ、ＤＮＡおよび完全なウイルス粒子が水性の内部に封
入され、生物学的に活性な形で細胞に送達される（Fral
eyら、Trends Biochem. Sci., 6:77(1981)）。哺乳類細
胞の他にも、リポゾームは、植物、酵母および細菌細胞
にポリヌクレオチドを送達するために用いられた。リポ
ゾームが有効な遺伝子伝達担体であるために、次のよう
な特徴が必要である：（１）対象遺伝子がそれらの生物
学的活性を損なうことなく高い効率で封入されること；
（２）非標的細胞と比較して標的細胞と専ら、実質的に
結合すること；（３）高効率で標的細胞の細胞質に小胞
の水性成分を送達できること；（４）遺伝子情報が正確
にさらに効果的に発現されること（Manninoら、Biotech
niques 6:682(1988))。

【００５５】リポゾームの照準化は解剖学的要素と機械
的要素に基づいて分類される。解剖学的分類は、選択
性、例えば器官特異性、細胞特異性および細胞内小器官
特異性の程度に基づく。機械的照準化は、受動的か能動
的化によって区別される。受動的照準化は、類洞毛細管
を含む器官の細網内皮系（ＲＥＳ）細胞に分布しようと
するリポゾームの自然の傾向を利用する。他方、能動的
照準化は、リポゾームを特異的なリガンド例えばモノク
ローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質に結合させ
ることによって、またはリポゾームの組成や大きさを変
えて自然な状態で生じる局在部位以外の器官および細胞
型に向かわせることによって、リポゾームを変化させて
行うものである。

【００５６】本発明はまた、ＪＮＫキナーゼ活性をもつ
細胞を検出する方法、またはＪＮＫ関連細胞増殖性疾患
を検出する方法を提供するが、この方法は、ｃ−Ｊｕｎ
Ｎ−末端キナーゼ活性をもつ細胞成分をその成分と結合
する試薬と接触させ、当該試薬と成分との相互反応を測
定することを含む。そのような試薬は、正常な組織と比
較した相対的なＪＮＫ発現レベルを測定するために用い
ることができる。細胞成分は核酸例えばＤＮＡ若しくは
ＲＮＡまたはタンパク質であろう。この成分が核酸の場
合、当該試薬は、核酸プローブまたはＰＣＲプライマー
である。核酸試薬とｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ活性を
もつポリペプチドをコードする核酸との相互反応は、典
型的には放射能標識を用いて測定されるが、他のタイプ
の標識も当業者にとって既知であろう。細胞成分がタン
パク質の場合、当該試薬は典型的には抗体プローブであ
る。このプローブは直接または間接的に検出できるよう
に、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、生物学的発光
化合物、化学発光化合物、金属キレーターまたは酵素に
よって標識されている。当業者には抗体に結合できる他
の適切な標識も容易に知りえるところである。

【００５７】ＪＮＫキナーゼ活性を有する細胞の好まし
い検出用プローブはｃ−Ｊｕｎタンパク質である。細胞
内のＪＮＫ活性は、ｃ−Ｊｕｎタンパク質プローブのリ
ン酸化量によって測定される。例えば、細胞抽出物中の
ＪＮＫ活性量は、当該抽出物をｃ−Ｊｕｎタンパク質と
混合し、放射能化合物例えば³²Ｐ−ＡＴＰを当該成分混
合物に加えることによって測定できる。ｃ−Ｊｕｎプロ
ーブに取り込まれる放射能量は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって決定され、ｃ−Ｊｕｎおよび正常レベルのＪ
ＮＫキナーゼ活性を有する細胞コントロール（対照群)
と比較される。

【００５８】ｃ−Ｊｕｎ基質を９６穴マイクロタイター
プレート上に固定し、処理細胞からの抽出物をこの穴に
添加する。続いてこの穴を洗浄し、³²Ｐ−ＡＴＰを含む
適切な緩衝液をこの穴に添加する。リン酸化反応を約１
５分行い、穴を洗浄して放射能を計測する。このアッセ
ーの修正には、ビーズもしくは磁性粒子を用いて基質を
固定し、基質のリン酸化の測定に、例えばモノクローナ
ル抗体および検出系（若しくはビオチン化抗体とアビジ
ンペルオキシダーゼ反応）のような非放射能工程を採用
することが含まれる。

【００５９】上記に記載したＪＮＫキナーゼの検出方法
で用いられるＪｕｎタンパク質は、単一のタンパク質ユ
ニットまたは融合タンパク質であってもよい。融合タン
パク質は、好ましくはｃ−Ｊｕｎ、および担体タンパク
質としてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）から成る。ｃ−ｊｕｎヌクレオチド配列を、発現ベ
クター例えばｐＧＥＸまたは、ｐＧＥＸ２Ｔもしくはｐ
ＧＥＸ３Ｘのような誘導ベクターで、３’から担体タン
パク質までクローニングし、遺伝子を発現させ、細胞を
溶解し、その抽出物を担体タンパク質が結合する樹脂を
含むカラムに通すか、またはそのような樹脂と直接混合
する。ＧＳＴが担体の場合は、グルタチオン（ＧＳＨ）
樹脂が用いられる。マルトース結合タンパク質（ＭＢ
Ｐ）が担体の場合は、アミロース樹脂が用いられる。他
の担体タンパク質および適切な結合樹脂は当業者には既
知であろう。

【００６０】本発明の物質はキットの調製に理想的であ
る。当該キットはｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼレベルの
検出に有用であり、当該キットは、ｃ−ＪｕｎＮ−末端
キナーゼに結合する抗体または、ＪＮＫヌクレオチドと
ハイブリダイズする核酸プローブを含む。このキットは
キャリア手段を含み、当該キャリア手段は、その中に１
つまたは２つ以上の容器例えばバイアル、試験管などを
閉塞した状態で収納するように区分けされてあり、各容
器にはアッセーで使用される別々の成分の１つが含まれ
る。例えば、容器の１つには、検出可能に標識付けされ
ているまたは標識付けすることもできる本発明のモノク
ローナル抗体が含まれる。このキットはまた、緩衝液を
含む容器および／またはレポーター分子例えば酵素標識
または蛍光標識に結合するレポーター手段例えば、ビオ
チン結合タンパク質（例えばアビジンまたはストレプト
アビジン）を含む容器を有する。

【００６１】以下の実施例は、本発明を制限するためで
はなく、本発明を詳述することを目的とするものであ
る。これら実施例は代表例であり、当業者にとって既知
の他の方法もまた選択肢として用いることも可能であ
る。

【００６２】

【実施例】（実施例１）＜プラスミドとＧＳＴ融合タンパク質の発現＞グルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ｃＪｕｎ発
現ベクター（ｐＧＥＸ２Ｔ−ｃＪｕｎ（ｗｔ））をＲＳ
Ｖ−ｃＪｕｎ（ＢｓｐＨＩ）から得た補填ＢｓｐＨＩ−
ＰｓｔＩフラグメント（アミノ酸１−２２３をコード）
をｐＧＥＸ２Ｔ（ファルマシア製）のＳｍａＩ部位に挿
入して構築した。ＲＳＶ−ｃＪｕｎ（ＢｓｐＨＩ）は、
ＲＳＶ−ｃＪｕｎの翻訳開始配列ＣＴＡＴＧＡを部位指
向性突然変異によってＴＣＡＴＧＡに換えることによっ
て構築した。ＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／６７）（Ｂ
ｓｐＨＩ）発現ベクターは、同じ方法でＲＳＶ−ｃＪｕ
ｎ（Ａｌａ６３／７３）（Smealら、上掲書）から得
て、ｐＧＥＸ２Ｔ−ｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／６７）を構
築するために用いた。種々のＧＳＴｃＪｕｎ先端切断変
異体は、ｃ−Ｊｕｎコード領域の様々な部分を増幅させ
るために、ポリメラーゼ鎖伸長反応（ＰＣＲ）を用いて
構築した。プライマーの配列は下記に示す：

【００６３】Ｎ−末端プライマー：ＴＣＴＧＣＡＧＧＡ
ＴＣＣＣＣＡＴＧＡＣＴＧＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣ
Ｇ（下線部コドン：アミノ酸１）（配列番号２）；ＴＣ
ＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＡＣＧＡＴＧＣＣＣＴＣＡ
ＡＣＧＣＣＴＣ（アミノ酸１１）（配列番号３）；ＴＣ
ＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴ
ＡＴＧＧＣＴＡＣ（アミノ酸２２）（配列番号４）；Ｔ
ＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＣＣＧＡＣＣＣＡＧＴＧ
ＧＧＧＡＧＣＣＴＧ（アミノ酸４３）（配列番号５）；
ＴＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＧＧＡ
ＣＣＴＣＣＴＣＡＣＣ（アミノ酸５６）（配列番号６）

【００６４】Ｃ−末端プライマー：ＴＧＡＡＴＴＣＴＧ
ＣＡＧＧＣＧＣＴＣＣＡＧＣＴＣＧＧＧＣＧＡ（アミノ
酸７９）（配列番号７）およびＴＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣ
ＡＧＧＴＣＧＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧ（アミ
ノ酸９３）（配列番号８）。

【００６５】ＤＮＡフラグメントは、Ｐｆｕポリメラー
ゼ（ストラテジーン(Strategene)製、ラホイヤ、カリフ
ォルニア）を用い、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化
し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（ストラテジーン
製）のＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ部位でサブクローニングし
て増幅させた。ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントは
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから切り出し、ｐＧＥＸ３Ｘ
（ファルマシア製）のＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ部位でサブ
クローニングした。幾つかの構築物は、ＰＣＲ産物のＢ
ａｍＨＩ−ＡｖａＩフラグメントおよびｐＧＥＸ２Ｘ−
ｃＪｕｎ（ｗｔ）のＡｖａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント
をｐＧＥＸ３ＸのＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入し
て作製した。ｐＧＥＸ３Ｘ−ｃＪｕｎ（３３−２２３）
は、ＸｈｏＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＧＥＸ３
Ｘに挿入して構築した。

【００６６】ｖ−Ｊｕｎおよびニワトリｃ−Ｊｕｎ配列
は、それぞれＲＣＡＳＶＣ−３およびＲＣＡＳＣＪ−３
から誘導した（Bosら、Genes Dev., 4:1677(1990)）。
ｖ−Ｊｕｎおよびニワトリｃ−ＪｕｎのためのＧＳＴ融
合ベクターは、ＲＣＡＳＶＣ−３およびＲＣＡＳＣＪ−
３のＮｃｏＩフラグメントをｐＧＥＸ−ＫＧ（Guan &Di
xon, Anual. Biochem., 192:262(1989)）のＮｃｏＩ部
位に挿入して構築した。ｃ−Ｊｕｎおよびｖ−Ｊｕｎコ
ード領域の種々の部分を含む同じフラグメントをｐＳＧ
４２４（ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン発現ベクター（Sa
dowski & Ptashne, Nucl. Acids Res., 17:753(1989)）
でクローニングした。

【００６７】ＧＳＴ融合タンパク質発現ベクターで、大
腸菌のＫＬ１−ＢｌｕｅまたはＮＭ５２２株を形質転換
させた。タンパク質誘発および精製は先に述べたように
実施した（Smith & Johnson, Gene 67:31(1988))。精製
融合タンパク質の量はバイオラッドタンパク質アッセー
キット（Bio-Rad Protein Assay Kit)で概算した。幾つ
かの実験では、ＧＳＴ融合タンパク質は、グルタチオン
（ＧＳＨ）−アガロースビーズから溶出させず、ｃ−Ｊ
ｕｎＮ−末端キナーゼの分離のためにビーズに保持させ
ておいた。

【００６８】＜細胞培養および細胞抽出物の調製＞ＦＲ
３Ｔ３、Ｈａ−ｒａｓ形質転換ＦＲ３Ｔ３，ＨｅＬａＳ
３およびＱＴ６細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｐｃ）および１０
０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｍ）を含むダル
ベッコーの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）で増殖させ
た。Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ５６２およびＵ９３７細胞は、１
０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのＰｃおよび１００μｇ／
ｍｌのＳｍを補充したＲＰＭＩ１６４０で増殖させた。
Ｆ９細胞は４５％ＤＭＥＭ、４５％ＨａｍのＦ１２、１
０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのＰｃ、および１００μｇ
／ｍｌのＳｍ中で増殖させた。核と細胞質の抽出物は。
ディグナムらの記載（Dignamら、(1983)）にしたがって
調製した。全細胞抽出物の調製には、採取細胞をＷＣＥ
緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７）、０．３
ＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ
のＥＤＴＡ、０．１％のトリトンＸ−１００、０．５ｍ
ＭのＤＴＴ、２０ｍＭのβ−グリセロホスフェート、
０．１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、２μｇ／ｍｌのロイペプチ
ン、１００μｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）に懸濁させた。この
細胞懸濁液を４℃で３０分間回転させ、抽出物は１００
００×ｇ１０分遠心して清澄にした。タンパク質量はバ
イオラッドタンパク質アッセーキットで概算した。

【００６９】＜トランスフェクション実験＞トランスフ
ェクション実験は、ＲＳＶ−ｃＪｕｎ、ＲＳＶ−ｖＪｕ
ｎおよびＧＡＬ４−Ｊｕｎ、ＧＡＬ４−ｖＪｕｎおよび
Ｈａ−Ｒａｓ（Ｌｅｕ６１）発現ベクターを先に述べた
ように用いて実施した（Boyleら、上掲書(1991); Binet
ruyら、上掲書(1991)；Smealら、上掲書(1991)）。ＣＡ
Ｔ活性は下記実施例８の記載にしたがって求めた。ｃ−
Ｊｕｎおよびｖ−Ｊｕｎタンパク質発現およびリン酸化
はスミールらの記載にしたがって調べた（Smealら、上
掲書(1991)；Smealら、Mol. Cell Biol., 12:3507(199
2)）。

【００７０】＜タンパク質の精製＞ＧＳＴ融合タンパク
質は、記載（Smithら、Gene 67:31-40(1988))にしたが
ってＧＳＨ−アガロースで親和性クロマトグラフィーに
よって精製した。精製ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ１および
ＥＲＫ２の混合物）はコッブ博士（Dr. M. Cobb, Unive
rsity of Texas Southwestern)から入手した。ＪＮＫ−
４６は、標準的液体クロマトグラフィーによってＵＶ照
射ＨｅＬａＳ３細胞から精製した。エピトープタッグ化
(tagged)ＪＮＫは、一時的にトランスフェクトさせたＣ
ＯＳ細胞から免疫精製した。簡単に記せば、ＣＯＳ細胞
を２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６)、０．５％のＮＰ
−４０、２５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのβ−グリセロ
ホスフェート、３ｍＭのＥＤＴＡ、３ｍＭのＥＧＴＡ、
１００μＭのオルトバナジウム酸Ｎａ、１０μｇ／ｍｌ
のロイペプチン、１ｍＭのＰＭＳＦで可溶化した。ＪＮ
Ｋを、プロテインＡ−セファロース結合Ｍ２モノクロー
ナル抗体を用いて免疫親和性クロマトグラフィーで分離
した。ビーズを緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ
７．７）、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴ
Ａ、０．０５％のトリトンＸ−１００）で十分に洗浄し
た。緩衝液Ａ中の３Ｍ尿素でＪＮＫをカラムから溶出さ
せ、１０％グリセロールを含む緩衝液Ａに対して透析し
た。

【００７１】（実施例２）＜キナーゼアッセー＞＜固相キナーゼアッセー＞細胞抽出物を希釈し、ＷＣＥ
緩衝液の最終組成を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．
７）、７５ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２
、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のトリトンＸ−
１００、０．５ｍＭのＤＴＴ、２０ｍＭのβ−グリセロ
ールホスフェート、０．１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、２μｇ
／ｍｌのロイペプチン、１００μｇ／ｍｌのＰＭＳＦと
した。抽出物を、１０μｇのＧＳＴまたはＧＳＴ−Ｊｕ
ｎ融合タンパク質を結合させた１０μｌのＧＳＨ−アガ
ロース懸濁物（シグマ製）と混合した。混合物を微量遠
心管で４℃で３時間回転させ、１００００×ｇで２０秒
遠心して沈澱させた。ＨＥＰＥＳ結合緩衝液（２０ｍＭ
のＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７）、５０ｍＭのＮａＣｌ、
２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、
０．０５％のトリトンＸ−１００）１ｍｌで４回洗浄し
た後、２０μＭのＡＴＰおよび５μＣｉのγ−³²ＰＡＴ
Ｐを含む３０μｌのキナーゼ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰ
ＥＳ（ｐＨ７．６）、２０ｍＭの塩化マグネシウム、２
０ｍＭのβ−グリセロールホスフェート、２０μＭのｐ
−ニトロフェニルホスフェート、０．１ｍＭのＮａ３Ｖ
Ｏ４、２ｍＭのＤＴＴ）に沈澱ビーズを再懸濁させた。
３０℃で２０分後に、ＨＥＰＥＳ結合緩衝液で洗浄して
反応を停止させた。リン酸化タンパク質を１．５倍のレ
ムリ（Laemlli)サンプル緩衝液３０μｌで溶出させ、１
０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで解析し、続いてオ
ートラジオグラフィーを行った。取り込まれたリン酸塩
の定量は、ゲルを薄く切りシンチレーション計測によっ
て求めた。リン酸化ＧＳＴ融合タンパク質はゲル薄片か
ら溶出させ、記載（Boyleら、上掲書(1991)）にしたが
ってリンペプチドマッピングを実施した。

【００７２】＜ゲル内キナーゼアッセー＞ゲル内キナー
ゼアッセーは、カメシタとフジサワの記載（Kameshita
& Fujisawa, Anal. Biochem., 183:139(1989))をわずか
に変更して実施した。簡単に記せば、ｃ−Ｊｕｎ結合タ
ンパク質を、８０μｇのＧＳＴ−ｃＪｕｎ含有ＧＳＨ−
アガロースビーズを用いて、上記のように全細胞抽出物
から分離した。タンパク質をレムリサンプル緩衝液に溶
出させ、ＧＳＴ−ｃＪｕｎの存在下（４０μｇ／ｍｌ）
または非存在下で重合させた１０％ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲルで解析した。電気泳動の後、ゲルを１００
ｍｌの２０％２−プロパノール、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ
（ｐＨ７．６）で３０分ずつ２回洗浄して、ＳＤＳを除
去した。ゲルを１回３０分で２回、１００ｍｌの緩衝液
Ａ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、５ｍＭのβ
−メルカプトエタノール）で洗浄した後、２００ｍｌの
緩衝液Ａ中６Ｍの尿素で１時間、室温でインキュベート
し、さらにその後、０．０５％のトゥイーン２０および
３Ｍ、１．５Ｍまたは０．７５Ｍの尿素かを含む緩衝液
Ａで連続的にインキュベートした。ゲルを各回１時間４
℃で数回０．０５％のトゥイーン２０を含む緩衝液Ａの
１００ｍｌで洗浄した後、５０μＭのＡＴＰと５μＣｉ
／ｍｌのγ−³²Ｐ−ＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液で１時
間３０℃でインキュベートした。反応後、ゲルを１００
ｍｌの５％トリクロロ酢酸と１％のピロリン酸ナトリウ
ムで数回室温で洗浄し、その後、乾燥させてオートラジ
オグラフィーを実施した。

【００７３】（実施例３）＜プロテインキナーゼのＧＳＴ−ｃＪｕｎ−ＧＳＨ−ア
ガロースビーズへの結合＞融合タンパク質、ＧＳＴｃＪ
ｕｎ（ｗｔ）は、そのＧＳＴ部分を介してグルタチオン
（ＧＳＨ）−アガロースビーズに結合して、プロテイン
キナーゼを含み得るｃ−Ｊｕｎ結合タンパク質の同定の
ための親和結合マトリックスを得ることができる。ＦＲ
３Ｔ３細胞のＨａ−Ｒａｓによる形質転換は、Ｓｅｒ６
３および７３におけるｃ−Ｊｕｎのリン酸化を高める結
果をもたらす（binetruyら、上掲書(1991); Smealら、
上掲書(1991)) 。予備実験によって、形質転換細胞はよ
り高レベルのｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ活性を含み、
一方、ｃ−ＪｕｎＣ−末端キナーゼ活性は変化しないこ
とが示された。ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ活性の特徴
を調べるためのより簡便なアッセーを開発するために、
非形質転換および形質転換ＦＲ３Ｔ３細胞の核抽出物と
細胞質抽出物をＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）−ＧＳＨ−アガ
ロースビーズと混合した。ＦＲ３Ｔ３（−）細胞および
Ｈａ−ｒａｓ形質転換ＦＲ３Ｔ３（＋）細胞を０．５％
ＦＣＳ中に２４時間保持し、採取して核抽出物とサイト
ゾル抽出物とを調製した。これらの抽出物（同じ数の細
胞から調製）を１０μｇのＧＳＴ−ｃＪｕｎ（ｗｔ）、
ＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７３）またはＧＳＴを含
むＧＳＨ−アガロースビーズと混合した。３時間インキ
ュベートした後、ビーズを遠心沈殿し、４回洗浄して、
γ−³²Ｐ−ＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液中で３０℃２０
分インキュベートした。反応をＳＤＳサンプル緩衝液で
洗浄して停止した。溶出タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で解析した。ＧＳＴｃＪｕｎ融合タンパク質の位置を図
１に表示する。このアッセーで用いた抽出物の量を標準
化するために細胞数よりむしろタンパク質濃度を用いた
とき（３００μｇのサイトゾル抽出物及び等量の核抽出
物）、同様な結果が得られた。この工程はＧＳＴｃＪｕ
ｎ（ｗｔ）のリン酸化をもたらしたが、これはプロテイ
ンキナーゼがＧＳＨ−アガロースに付着している間にＧ
ＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）と結合してリン酸化したことを示
唆している（図１）。他方、ＧＳＨ−アガロースに結合
したＧＳＴのリン酸化はこのアッセーでは検出できなか
った。

【００７４】同じ実験をＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／
７３）融合タンパク質を用いて繰り返した。この融合タ
ンパク質では、ｃ−ＪｕｎのＳｅｒ６３と７３を標的と
するキナーゼを同定するために、６３位と７３位のセリ
ンは両方ともアラニンに変換した。このタンパク質のリ
ン酸化は、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）のそれよりも極めて
低かった（図１）。これらの実験によって、ｃ−Ｊｕｎ
のＮ−末端部位に影響を与えるキナーゼ活性は、Ｈａｓ
−ｒａｓ形質転換に際して上昇し、インビボ標識で検出
される形質転換と非形質転換細胞との間のｃ−ＪｕｎＮ
−末端リン酸化の程度の違いと一致するという以前の観
察が確認された（Binetruyら、上掲書(1991); Smeal
ら、上掲書(1991)、(1992)）。この固相アッセーによっ
て検出されるキナーゼ活性は、サイトゾルおよび核分画
の両方に存在し、細胞当たりではサイトゾルで数倍高
い。しかしながら、細胞分画中にキナーゼのいくらかが
核からサイトゾルに漏出した可能性もある。

【００７５】固相アッセーを、他の細胞タイプのＮ−末
端ｃ−Ｊｕｎキナーゼ活性を調べるために用いた。Ｈｅ
Ｌａ細胞をＵＶに曝すことによって、Ｈａ−ｒａｓシグ
ナル経路が活性化され、ｃ−ＪｕｎのＮ−末端リン酸化
の強い増加が生じた（Devaryら、Cell 71:1081(199
2)）。他方、フォルボールエステル、ＴＰＡでＨｅＬａ
細胞を処理しても、ｃ−ＪｕｎのＮ−末端リン酸化には
極めてわずかな影響しか与えられない（Boyleら、(199
1)）。ＨｅＬａＳ３細胞を１２時間血清枯渇の状態にさ
せ、さらに、未処理、ＵＶ光で照射（４０Ｊ／ｍ２）ま
たはＴＰＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベー
トのいずれかを行った。ＵＶまたはＴＰＡに曝した後、
表示した時間に細胞を採取した。等しい数の細胞から分
離した全細胞抽出物（約８００μｇタンパク質）を、Ｇ
ＳＴ、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）またはＧＳＴｃＪｕｎ
（Ａｌａ６３／７３）のいずれかの１０μｇを含むＧＳ
Ｈ−アガロースビーズと混合した。３時間インキュベー
ト後、十分に洗浄し、上記のように固相リン酸化アッセ
ーを実施した。２０分反応させた後、ＳＤＳサンプル緩
衝液でタンパク質を分離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析
した。

【００７６】図２Ａに示したように、Ｎ−末端ｃ−Ｊｕ
ｎキナーゼ活性は、ＵＶ照射後５分以内に上昇し、３０
分後には未処理細胞より２５０倍となった。しかしなが
ら、ＴＰＡの影響はＵＶのそれに較べてわずかであっ
た。以前に認められたように、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）
は、ＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７３）よりさらに効
果的にリン酸化され、一方、ＧＳＴはリン酸化されなか
った。これらの結果は、インビボでのｃ−Ｊｕｎリン酸
化の測定結果と一致する（Boyle ら、上掲書(1991)；De
varyら、上掲書(1992)）。

【００７７】ＨｅＬａ細胞と較べてＪｕｒｋａｔＴ細胞
のＴＰＡ処理は、Ｓｅｒ６３および７３においてｃ−Ｊ
ｕｎリン酸化が刺激された。Ｊｕｒｋａｔ細胞に２時間
血清枯渇を施し、さらに未処理またはＴＰＡ（５０ｎｇ
／ｍｌ）処理１０分もしくは３０分のいずれかを施し
た。５×１０６細胞から調製した全細胞抽出物を、ＧＳ
Ｔ、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）またはＧＳＴｃＪｕｎ（Ａ
ｌａ６３／７３）を含むＧＳＨ−アガロースビーズと混
合した。ビーズに付着したＧＳＴタンパク質のリン酸化
は上記のように実施した。より速く移動するバンドはＧ
ＳＴｃＪｕｎタンパク質の分解産物に対応する。

【００７８】ＨｅＬａ細胞と異なりＪｕｒｋａｔ細胞で
は、Ｎ−末端キナーゼ活性は、ＴＰＡによって大きく高
められた（３０分後に２５倍）（図２Ｂ）。このキナー
ゼはまた、ＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７３）よりも
ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）に選択性を示し、ＧＳＴ部分に
対して結合せずまたはリン酸化しなかった。これらの結
果を合わせれば、固相アッセーで検出されるキナーゼ
は、Ｓｅｒ６３および７３でｃ−Ｊｕｎをリン酸化し、
さらに、その調節はインビボ標識によって調べたｃ−Ｊ
ｕｎＮ−末端リン酸化のそれと平行することが示唆され
る。

【００７９】（実施例４）＜結合キナーゼ、ＪＮＫによるセリン６３および７３の
リン酸化＞ＧＳＴｃＪｕｎに結合するキナーゼが使用す
る正確なリンアクセプター(phosphoacceptor) 部位を決
定するために、リン酸化ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）および
ＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７３）タンパク質をトリ
プシン消化二次元リンペプチドマッピング(phosphopept
ide mapping)に付した。Ｈｓ−ｒａｓ形質転換ＦＲ３Ｔ
３細胞（２．５ｍｇ）、ＵＶ照射ＨｅＬａ細胞（２００
μｇ）またはＴＰＡ刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞（１．２ｍ
ｇ）の全細胞抽出物を、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）または
ＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７３）を含むＧＳＨ−ア
ガロースビーズと混合した。ＧＳＴｃＪｕｎタンパク質
を、結合キナーゼによって上記のようにリン酸化し、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥによって単離してゲルから切り出し、ト
リプシンで消化して二次元リンペプチドマッピングを施
した。Ｘ、Ｙ、Ｔ１およびＴ２リンペプチドは指標で示
されている。オートラジオグラムは全て同じ期間露光し
た。

【００８０】図３Ａに示したように、Ｈａ−ｒａｓ形質
転換ＦＲ３Ｔ３細胞、ＵＶ照射ＨｅＬａ細胞およびＴＰ
Ａ刺激Ｊｕｅｋａｔ細胞から単離したキナーゼは、ＧＳ
ＴｃＪｕｎを、ＸおよびＹで、さらに他の２つのペプチ
ドＴ１およびＴ２でリン酸化した。ＸおよびＹは、それ
ぞれＳｅｒ−７３およびＳｅｒ−６３のリン酸化に対応
し（Smealら、上掲書(1991)）、相対的に高レベルのＴ
１およびＴ２を含むＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７
３）の消化物には存在しなかった。リンアミノ酸分析に
よって、Ｔ１およびＴ２はホスホスレオニンのみを含む
ことが示唆された。欠失解析実験によって、これらのス
レオニンは、ｃ−Ｊｕｎのアミノ酸９１、９３または９
５に割り当てられた。

【００８１】下記に述べるように、ＧＳＴｃＪｕｎに結
合するキナーゼをビーズから溶出させ、完全な長さの組
換え体ｃ−Ｊｕｎタンパク質を溶液中でリン酸化するた
めに用いた（図３Ｂ）。組換え体ｃ−Ｊｕｎタンパク質
は、ＧＳＴｃＪｕｎ（ＷＴ）−ＧＳＨ−アガロースビー
ズから溶出させたｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ（ＪＮ
Ｋ）によってインビトロでリン酸化し、さらにｃ−Ｊｕ
ｎは、ｃ−ＪｕｎおよびＨａ−Ｒａｓ発現ベクターで同
時トランスフェクトさせた³²Ｐ標識Ｆ９細胞から免疫沈
降によって単離された（Smealら、上掲書(1991)）。各
タンパク質調製物を同じ計測値だけトリプシンで消化
し、リンペプチドマッピングを施した。Ｘ、Ｘ’（アル
キル化によって生成されたＸの誘導体; Smealら、上掲
書(1991)）、Ｙ、ｂおよびｃの各リンペプチドの移動位
置を示す。

【００８２】インビボで認められたように、結合キナー
ゼは殆どＳｅｒ７３でｃ−Ｊｕｎをリン酸化し、次いで
Ｓｅｒ６３でリン酸化した。さらに、結合キナーゼ活性
は、ｃ−ＪｕｎのＣ−末端の２か所で弱くｃ−Ｊｕｎを
リン酸化し、リンペプチドｂおよびｃの出現をもたらし
た。これは、ｃ−ＪｕｎのＮ−末端部位の少なくとも１
つに対して明瞭な特異性をもって検出された最初のプロ
テインキナーゼであるので、これをｃ−ＪｕｎのＮ−末
端のプロテインキナーゼ（ｋｉｎａｓｅ）としてＪＮＫ
と名付けた。

【００８３】（実施例５）＜ＪＮＫのｃ−Ｊｕｎへの結合＞ＧＳＴｃＪｕｎとＪＮ
Ｋとの間の相互反応の安定性を調べるために、ＴＰＡ刺
激Ｊｕｒｋａｔ細胞の抽出物をＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）
−ＧＳＨアガロースビーズとともにインキュベートし
た。十分に洗浄した後、このビーズをＮａＣｌ、尿素、
グアニジン−ＨＣｌおよびＳＤＳの濃度を高めながらの
溶出に付した。ＪＮＫの溶出は、溶液中における組換え
体ｃ−Ｊｕｎをリン酸化する能力によって調べた。ＧＳ
ＴｃＪｕｎ（ｗｔ）−ＧＳＨアガロースビーズを、ＴＰ
Ａ刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞の全細胞抽出物とともに３時間
インキュベートし、４回洗浄してから、ＮａＣｌ、尿
素、グアニジン−ＨＣｌ（Ｍ）またはＳＤＳ（％）の濃
度を高めながらキナーゼ緩衝液で溶出した（図４）。溶
出分画（等容量）を、１０％グリセロールを含みＡＴＰ
は含まないキナーゼ緩衝液に対して４℃で透析し、続い
て２０μＭのＡＴＰおよび５μＣｉのγ−³²Ｐ−ＡＴＰ
の存在下でｃ−Ｊｕｎタンパク質（２５０ｎｇ）ととも
に３０℃で２０分間インキュベートした。溶出工程後に
ビーズに残ったキナーゼ量（Ｒレーン）は、２０μＭの
ＡＴＰおよび５μＣｉのγ−³²Ｐ−ＡＴＰの存在下でキ
ナーゼ緩衝液とともに単離ビーズを３０℃２０分インキ
ュベートして決定した。リン酸化タンパク質は上記のよ
うにＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、オートラジオグラフィ
ーによって可視化させた。ＧＳＴｃＪｕｎおよびｃ−Ｊ
ｕｎの移動位置は指標で示されている。

【００８４】驚くべきことには、ＪＮＫはＧＳＴｃＪｕ
ｎにむしろ強固に結合していることが分かった。すなわ
ち、ほんのわずかのキナーゼ活性しか０．５ＭのＮａＣ
ｌで溶出せず、さらに、２ＭのＮａＣｌで溶出させた後
も殆どのキナーゼはビーズに残った（図４Ａ）。結合キ
ナーゼの約５０％が１Ｍ尿素で溶出し、残りは２Ｍの尿
素で溶出した。ほぼ完全な溶出は、０．５Ｍのグアニジ
ン−ＨＣｌまたは０．０１％ＳＤＳのいずれかで達成さ
れた。全てのこれら溶出条件下で、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗ
ｔ）はまた、ＧＳＨ−アガロースビーズから部分的に溶
出した。このことは、ＪＮＫ：ｃ−Ｊｕｎ複合体の安定
性はＧＳＴ：ＧＳＨ複合体のそれと類似していることを
示唆する。

【００８５】ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）を、シアノゲンブ
ロマイドを用いてＧＳＨ−アガロースビーズに共有結合
で連結させ、ＴＰＡ刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞の全細胞抽出
物とともにインキュベートした。十分に洗浄した後、Ａ
ＴＰを含まないキナーゼ緩衝液（レーン２）または２０
μＭのＡＴＰ（図４Ｂ、レーン３）もしくは５０μＭの
ＡＴＰ（レーン４）を含むキナーゼ緩衝液を用いてビー
ズの一部分を溶出させた。溶出分画（等容量）を基質と
して組換え体ｃ−Ｊｕｎタンパク質（５００ｎｇ）と、
さらに５μＣｉのγ−³²Ｐ−ＡＴＰとともに３０分イン
キュベートした。さらに、キナーゼ緩衝液単独（レーン
１）または５０μＭのＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液（レ
ーン５）のいずれかで溶出させた後、ビーズを５μＣｉ
のγ−³²Ｐ−ＡＴＰの存在下で３０分ｃ−Ｊｕｎタンパ
ク質（５００ｎｇ）とともにインキュベートした。ｃ−
Ｊｕｎのリン酸化（矢印で示す）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
とオートラジオグラフィーで解析した。

【００８６】ＧＳＴｃＪｕｎが共有結合で連結されてい
るキナーゼ付加ＧＳＨ−アガロースビーズへの外来ｃ−
Ｊｕｎの添加によって、効果的なリン酸化が得られた
（図４Ｂ、レーン１）。このことは、ＧＳＴｃＪｕｎの
リン酸化後、ＪＮＫはビーズから分離し、外来ｃ−Ｊｕ
ｎをリン酸化することを示唆している。さらに、ＡＴＰ
を含むキナーゼ緩衝液でインキュベートすると、外来ｃ
−Ｊｕｎに対するリン酸化能によって示されるように、
ＪＮＫのＧＳＴｃＪｕｎビーズから溶出した（図４Ｂ、
レーン２−４）。５０μＭのＡＴＰとともにインキュベ
ートすると、２０％未満のキナーゼがビーズに残った
（図４Ｂ、レーン１と５を比較のこと）。

【００８７】（実施例６）＜ＪＮＫ１は４６ｋＤタンパク質である＞ＪＮＫの大き
さを決定するためにゲル内キナーゼアッセーを実施し
た。ＧＳＴｃＪｕｎ−ＧＳＨ−アガロースビーズを、Ｔ
ＰＡ刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞の全抽出物とともにインキュ
ベートし、十分に洗浄して結合タンパク質をＳＤＳサン
プル緩衝液に溶出させ、さらに、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗ
ｔ）の存在下（＋）または非存在下（−）で重合させた
ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離した。電気泳動
後、ゲルを６Ｍ尿素中でインキュベートし、さらに実施
例１で述べたように復元に付した。復元ゲルを５０μＭ
のＡＴＰおよび５μＣｉ／ｍｌのγ−³²Ｐ−ＡＴＰを含
むキナーゼ緩衝液中で３０℃１時間インキュベートし、
洗浄し固定して、オートラジオグラフィーによって可視
化させた。

【００８８】両方の例で、見かけの分子量が４６ｋＤで
あるタンパク質バンドがリン酸化された（図５Ａ）。リ
ン酸化はＧＳＴｃＪｕｎの存在化で２倍効果的であっ
た。このことは、４６ｋＤタンパク質バンドは自己リン
酸化ＪＮＫであるか、または共移動タンパク質であるこ
とを示している。³²Ｐ標識タンパク質は、ＧＳＴ−ＧＳ
Ｈ−アガロースビーズの溶出液では検出されなかった。

【００８９】Ｊｕｒｋａｔ細胞のＴＰＡ刺激またはＨｅ
Ｌａ細胞のＵＶ照射によってＪＮＫ活性が高まることを
示すために、同じゲル内キナーゼアッセーを用いた（図
５Ｂ)。ＧＳＴｃＪｕｎ−ＧＳＨ−アガロースビーズ
を、ＵＶ刺激または非刺激ＨｅＬａ細胞およびＴＰＡ刺
激または非刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞の全細胞抽出物ととも
にインキュベートした。洗浄後、結合タンパク質をＳＤ
Ｓサンプル緩衝液に溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離
させた。復元後、５０μＭのＡＴＰおよび５μＣｉ／ｍ
ｌのγ−³²Ｐ−ＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液中でインキ
ュベートし、リン酸化タンパク質をオートラジオグラフ
ィーで可視化した。

【００９０】これらの結果は、ＪＮＫの見かけの分子量
は４６ｋＤであるということについて新たな証拠を提供
する。種々の細胞タイプに同じＮ−末端ｃ−Ｊｕｎキナ
ーゼが存在するのか否かを決定するために、ゲル内キナ
ーゼアッセーを用いて、Ｋ５６２ヒト赤白血病細胞、Ｕ
９３７ヒト組織球性白血病細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｈ
ｅＬａ細胞、Ｆ９胎生期癌細胞、Ｈａ−ｒａｓ形質転換
ＦＲ３Ｔ３細胞およびＱＴ６ウズラ繊維芽細胞の抽出物
を調べた。ＨｅＬａ、Ｆ９およびＱＴ６抽出物は、ＵＶ
照射細胞から調製し、Ｕ９３７およびＪｕｒｋａｔ抽出
物はＴＰＡ刺激細胞から作製し、一方、Ｋ５６２細胞は
いずれの特別な処理も施さなかった。全ての細胞は、Ｇ
ＳＴｃＪｕｎに結合し、４６ｋＤあたりに移動するプロ
テインキナーゼを含んでいた（図５Ｃ）。ある細胞、特
にＱＴ６細胞は、その次に豊富なプロテインキナーゼ種
で約５５ｋＤの場所に移動するプロテインキナーゼを含
んでいた。両方のキナーゼ活性は細胞刺激によって誘発
された。増殖期のＫ５６２およびＨａ−ｒａｓ形質転換
ＦＲ３Ｔ３細胞、ＴＰＡ刺激ＪｕｒｋａｔおよびＵ９３
７細胞並びにＵＶ照射ＨｅＬａ、Ｆ９およびＱＴ６細胞
の全細胞抽出物とともに、ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）−Ｇ
ＳＨ−アガロースビーズをインキュベートした。洗浄
後、結合タンパク質を溶出させ、ゲル内キナーゼアッセ
ーで上記のように分析した。

【００９１】ＪＮＫは大きさが４６ｋＤであるという新
たな証拠が、ＴＰＡ刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞抽出物のＧＳ
ＴｃＪｕｎ結合タンパク質分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
って分離することによって得られた。分画タンパク質を
溶出して復元後、ＧＳＴｃＪｕｎに結合しＳｅｒ６３お
よび７３を特異的にリン酸化させることができる主要な
プロテインキナーゼの分子量は、４６ｋＤであることが
決定された。ＥＲＫ１およびＥＲＫ２のサイズ（それぞ
れ４４および４２ｋＤ）は、ＪＮＫのサイズに近いが、
両方のＥＲＫと反応する抗血清を用いたウェスタンブロ
ット分析によって、４６ｋＤＪＮＫは免疫学的にそれら
のいずれとも関連を有しないことが示された。さらに、
ＪＮＫはＲａｆ−１とは免疫学的に関係がない。さら
に、５５ｋＤポリペプチドはＪＮＫ活性を示すものとし
て同定されたが、４６ｋＤはもっと効率的にｃ−Ｊｕｎ
に結合するようであった（Hibiら、Genes Dev., 7:2135
(1993)）。

【００９２】（実施例７）＜キナーゼ結合部位の解明＞Ｎ−末端またはＣ−末端配
列のいずれかを欠くＧＳＴｃＪｕｎの欠失変異体（図６
Ａ）を用いてＪＮＫ結合部位を画定した。種々のｃ−Ｊ
ｕｎ配列を含むＧＳＴｃＪｕｎ融合タンパク質を大腸菌
で発現させ、ＧＳＨ−アガロースに結合させて単離し
た。この結合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、
クーマシーブルーで染色した。数字は各融合タンパク質
に存在するｃ−Ｊｕｎのアミノ酸を示す。完全なＧＳＴ
融合タンパク質の移動位置は点で示されている。より速
い移動バンドは分解産物である。

【００９３】これらのタンパク質をＧＳＨ−アガロース
ビーズに固定し、ＵＶ照射ＨｅＬａ細胞抽出物とともに
インキュベートした。ＵＶ照射ＨｅＬａＳ３細胞の全細
胞抽出物を、同じ量の種々のＧＳＴ融合タンパク質を含
むＧＳＨ−アガロースビーズと混合した。洗浄後、γ−
³²Ｐ−ＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液中で２０分ビーズを
インキュベートした。このビーズからＧＳＴ融合タンパ
ク質を溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラ
フィーで解析した。完全なＧＳＴ融合タンパク質の移動
位置は点で示されている。ＵＶ照射ＨｅＬａ細胞の全細
胞抽出物とともにインキュベートした後、結合したＪＮ
Ｋ分画の一部分を１ＭのＮａＣｌで溶出させ、溶液にお
ける組換え体ｃ−Ｊｕｎ（２５０ｎｇ）のリン酸化能に
ついて調べた。タンパク質のリン酸化はＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅとオートラジオグラフィーによって解析した。

【００９４】ＪＮＫの結合は、ＧＳＴｃＪｕｎ融合タン
パク質（その全てはＳｅｒ６３および７３の両方を含
む）をリン酸化する能力によって調べた（図６Ｂ）。Ｊ
ＮＫ結合に影響を与えることなく、そのＮ−末端リン受
容体の存在顕示に影響を与えるいかなる先端欠失の可能
性も排除できるように、これらのビーズから溶出させた
キナーゼを、溶液における完全な長さの外来ｃ−Ｊｕｎ
をリン酸化する能力について調べた（図６Ｃ）。両方の
アッセーから得られた結果は、アミノ酸（ＡＡ）１−２
１の除去はＪＮＫ結合に対して影響を与えないというこ
とを示した。ＡＡ１−３２の除去はＧＳＴｃＪｕｎのリ
ン酸化を減少させるが、キナーゼ結合に対しては小さな
影響を与えただけである。しかしながら、ＡＡ１−４２
の除去は完全にキナーゼ結合を排除した。Ｎ−末端の切
り縮めと反対に、調べた２つのＣ−末端の切断は、ＪＮ
Ｋ結合に対して影響を持たず、ｃ−ＪｕｎのＡＡ１−７
９を含むＧＳＴ融合タンパク質は完全な結合活性を示し
た。したがって、ＡＡ３３−７９はキナーゼ結合活性を
構成する。

【００９５】ＪＮＫ結合部位は、ｖ−Ｊｕｎに欠落して
いるｃ−ＪｕｎのＡＡ３１−５７に広がるδ領域を包含
する（Vogt& Bos, (1990))。δ領域のキナーゼ結合にお
ける関与を調べるために、ニワトリのｃ−ＪｕｎのＮ−
末端活性化ドメイン（ＡＡ１−１４４）またはｖ−Ｊｕ
ｎの対応する領域（図７Ａ）を含むＧＳＴ融合タンパク
質を構築した。ニワトリ（ｃｈ）ｃ−Ｊｕｎの活性化ド
メイン（ＡＡ１−１４４）およびｖ−Ｊｕｎの対応する
領域をＧＳＴに融合させ、大腸菌で発現させた。ＧＳＴ
融合タンパク質はＧＳＨ−アガロースビーズで単離し、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとクーマシーブルー染色で解析した。
完全タンパク質の移動位置は点で示されている。これら
ＧＳＴ融合タンパク質をＧＳＨ−アガロースに付加した
後、上記のようにキナーゼ結合アッセーを実施した。

【００９６】ＴＰＡ活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞の抽出物
を、ＧＳＴ、ＧＳＴｃＪｕｎ（Ｃｈ）またはＧＳＴｖＪ
ｕｎを含むＧＳＨ−アガロースビーズとともにインキュ
ベートした。洗浄後、γ−³²Ｐ−ＡＴＰを含むキナーゼ
緩衝液中でこのビーズをインキュベートし、リン酸化Ｇ
ＳＴ融合タンパク質を図６について述べたように解析し
た。結合タンパク質分画をＧＳＴｃＪｕｎ（Ｃｈ）およ
びＧＳＴｖＪｕｎビーズから溶出させ、溶液中における
ｃ−Ｊｕｎのリン酸化能について図６について述べたよ
うに調べた。ニワトリのＧＳＴｃＪｕｎがヒトＧＳＴｃ
Ｊｕｎと同じように効果的にキナーゼに結合したが、一
方、ＧＳＴｖＪｕｎはＪＮＫ結合では不完全であった
（図７Ｂ、Ｃ）。

【００９７】（実施例８）＜ＪＮＫ結合はＨａ−ｒａｓとＵＶ応答のために必要で
ある＞Ｓｅｒ６３と７３のリン酸化は、Ｈａ−ｒａｓに
よるｃ−Ｊｕｎ仲介トランス活性化の強化のために必要
である（Smeal等、上掲書(1991)）。この反応において
ＪＮＫの結合が何らかの役割を持つとしたら、インビト
ロでキナーゼ結合を減少させる変異体は、インビボでの
Ｈａ−ｒａｓによるｃ−Ｊｕｎ活性の刺激を弱めるはず
である。この関係は同時トランスフェクトによって調べ
た。発現ベクターは、キメラＧＡＬ４−ｃＪｕｎおよび
ＧＡＬ４−ｖＪｕｎタンパク質を発現させるために構築
した。これらキメラタンパク質は、酵母の活性化因子Ｇ
ＡＬ４（Sadowski & Ptashne (1989))のＤＮＡ結合ドメ
インとｃ−Ｊｕｎまたはｖ−ＪｕｎのＮ−末端配列とか
ら成る。ＧＡＬ４−依存レポーター５ｘＧＡＬ４−Ｅｌ
ｂ−ＣＡＴ（Lillie & Green (1989))を活性化させるこ
れらキメラの能力を、同時トランスフェクトさせたＨａ
−ｒａｓ発現ベクターの存在下または非存在下で調べた
（図８Ａ）。種々のｃ−Ｊｕｎ活性化ドメイン〔ｃＪ＝
ＡＡ１−２２３；３３−ＡＡ３３−２２３；５６＝ＡＡ
５６−２２３；Ａ６３，７３＝ＡＡ１−２４６（Ａｌａ
６３／７３）〕を含む表示されたＧＡＬ４−ｃＪｕｎキ
メラタンパク質をコードする１．０μｇの発現ベクター
および２．０μｇの５×ＧＡＬ４−Ｅｌｂ−ＣＡＴレポ
ーターを表示された量（μｇ）でｐＺＩＰＮｅｏＲａｓ
（Ｌｅｕ６１）の存在下または非存在下においてＦ９細
胞に同時トランスフェクトさせた。ｐＵＣ１８および適
切な量のｐＺＩＰｎｅｏを用いて、発現ベクターの全量
を一定に保ち、トランスフェクトさせるＤＮＡの全量を
１５μｇにした。トランスフェクト後２８時間で細胞を
採取し、ＣＡＴ活性を決定した。表示したものは２つの
実験の平均で、ＧＡＬ４−Ｊｕｎ発現ベクターの非存在
下で認められたレポーター発現レベルに対する何倍の活
性化かを計算した。

【００９８】ｃ−ＪｕｎのＡＡ１−３２の欠失は、Ｈａ
−ｒａｓ応答においてわずかな低下（ｗｔＧＡＬ４−ｃ
Ｊｕｎについて９．８倍誘発対１９倍誘発）をもたらし
たが、一方、ＡＡ１−４２または１−５５の欠失は、Ｈ
ａ−ｒａｓ応答に対してより大きな低下をもたらした
（５．２倍誘発）。Ｈａ−ｒａｓ応答に対する同様な減
少が、ｃ−Ｊｕｎ配列のｖ−Ｊｕｎ配列による置換に際
して認められた（４．７倍誘発）。実際、ＧＡＬ４−ｃ
Ｊｕｎ（５６−２２３）およびＧＡＬ４−ｖＪｕｎキメ
ラは、Ｓｅｒ６３と７３がアラニンに変換されているＧ
ＡＬ４−ｃＪｕｎ（１−２４６；Ａｌａ６３／７３）よ
りも応答性はわずかに２倍であった。このキメラはＨａ
−ｒａｓに対してわずかな応答（２倍）を示しただけで
あった。ＧＡＬ４−ｃＪｕｎおよびＧＡＬ４−ｖＪｕｎ
融合タンパク質の同じ組み合わせをＵＶ応答について調
べた。ｐＺＩＰＮｅｏＲａｓで同時トランスフェクトさ
せたという点を除いてＦ９細胞を上記のようにトランス
フェクトさせ、トランスフェクト後８時間で細胞にＵＶ
−Ｃを４０Ｊ／ｍ２で照射し、または照射しなかった。
２０時間後に細胞を採取し、ＣＡＴ活性について調べ
た。図８Ｂは上記のように計算した２つの実験の平均を
示す。

【００９９】図８Ｂに示したように、インビトロでＪＮ
Ｋに結合できないこれらのタンパク質は、インビボでＵ
Ｖに対して非応答性である。ＧＡＬ４−ｃＪｕｎ（１−
２２３）の活性はＵＶによって７．５倍刺激され、一
方、ＧＡＬ４−ｃＪｕｎ（４３−２２３）、ＧＡＬ４−
ｃＪｕｎ（５６−２２３）およびＧＡＬ４−ｖＪｕｎの
活性はわずかに１．５倍誘発されただけである。

【０１００】ｃ−Ｊｕｎリン酸化におけるＪＮＫ結合の
役割を明らかにするために、活性化Ｈａ−ｒａｓ発現ベ
クターの存在下または非存在下でｃ−Ｊｕｎおよびｖ−
Ｊｕｎ発現ベクターをＦ９細胞にトランスフェクトし
た。Ｈａ−ｒａｓ経路を活性化させるためにＵＶ照射も
用いた（Devaryら、(1992)）。ｖ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｊ
ｕｎを、ｐＺＩＰＮｅｏＲａｓ（Ｌｅｕ６１）の存在下
または非存在下でｖ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｊｕｎ発現ベク
ターでトランスフェクトされた³²Ｓまたは³²Ｐ−標識Ｆ
９細胞から免疫沈降により単離した。単離タンパク質を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとオートラジオグラフィーによって解
析した。各タンパク質について代表的な実験結果を示し
た。³²Ｐ標識ｖ−Ｊｕｎのオートラジオグラムは、対応
するｃ−Ｊｕｎのオートラジオグラムより３倍長く露光
して、同様な強度になっていることに留意されたい。ｖ
−Ｊｕｎおよびｃ−Ｊｕｎ発現ベクターをトランスフェ
クトさせた³²Ｐおよび³²Ｓ標識Ｆ９細胞から、ｖ−Ｊｕ
ｎおよびｃ−Ｊｕｎを単離した。免疫沈降によってＪｕ
ｎタンパク質を単離する前に、細胞の半分にＵＶ−Ｃ
（４０Ｊ／ｍ２）を３０分間照射した。この例では、ｃ
−Ｊｕｎとｖ−Ｊｕｎのレーンは同じ露光のオートラジ
オグラムを示している。２つの矢印は、ｃ−Ｊｕｎの２
つの形態（Devary, (1992)）の移動位置を示し、一方、
四角はｖ−Ｊｕｎの移動位置を示している。

【０１０１】³²Ｓ標識細胞からの免疫沈降によって、ｃ
−Ｊｕｎおよびｖ−Ｊｕｎは同程度に発現され、それら
の発現レベルはＨａ−ｒａｓ（図９Ａ）またはＵＶ（図
９Ｂ）のいずれにも影響されないことが示された。³²Ｐ
標識細胞からの免疫沈降によって、Ｈａ−ｒａｓおよび
ＵＶの両方ともｃ−Ｊｕｎのリン酸化を刺激し、一方、
基準レベルはｃ−Ｊｕｎのそれより数倍低いｖ−Ｊｕｎ
のリン酸化は、いずれの処置によっても強化されないこ
とが示唆された。以前に観察されたように（Devaryら、
上掲書(1991)）、ＵＶはｃ−Ｊｕｎリン酸化のより強力
な誘発因子で、電気泳動移動度を遅くする。リンペップ
チドマッピングによって、Ｈａ−ｒａｓ発現は、ｖ−Ｊ
ｕｎのリン酸化に対してはｃ−Ｊｕｎに対するその影響
と較べてはるかに小さな影響しか与えないことが確認さ
れた。以前に示されたように(Smealら、上掲書(199
1)）、ｖ−Ｊｕｎは、ｃ−ＪｕｎのＳｅｒ７３に対応す
る１つの部位だけをリン酸化した。

【０１０２】（実施例９）＜抗血清とタンパク質＞ｃ−Ｊｕｎ多クローン性抗血清
はBinetruyら、(Nature 351:122-127(1991) によって記
載された。抗ＣＤ３モノクローナル抗体ＯＫＴ３（Van
Wauweら、J.Immunol., 124:2708-2713(1980) ）はアル
トマン博士（Dr. Amnon Altman, La Jolla Institute f
or Allergy & Immunology)から入手し、抗ＣＤ２８モノ
クローナル抗体９．３はハンセンらの文献(Hansenら、I
mmunogenetics 10:247-260(1980))に記載されている。
抗ＥＲＫ２および抗ＥＲＫ抗体は、それぞれウェーバー
博士（Dr. M. Weber, University of Texas Southweste
rn）とコッブ博士（Dr. M.Cobb, University of Texas
Southwestern)から提供された。ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１
−２２３）の発現および精製は記載されている（Hibi
ら、Genes & Dev., 7:2135(1993)）。キナーゼ欠損ＥＲ
Ｋ１のための細菌発現ベクターはコッブ博士から提供さ
れ、その組換え体タンパク質はハグストロム博士（Dr.
J. Hagstrom)によって調製され、精製された。ＭＢＰは
シグマから購入した。

【０１０３】＜細胞培養、代謝標識および免疫沈降＞Ｊ
ｕｒｋａｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１
ｍＭのグルタメート、１００μ／ｍｌペニシリン（ｐｅ
ｎ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ｓｔｒｅ
ｐ）、および２５０ｎｇ／ｍｌアンホテリシンを添加し
たＲＰＭＩ（完全培地）で増殖させた。ＨｅＬａＳ３、
ＣＶ−１およびＦＲ３Ｔ３細胞は、１０％ＦＣＳ、１０
０μ／ｍｌのｐｅｎ、１００μｇ／ｍｌのｓｔｒｅｐを
補充したＤＭＥＭで増殖させた。全ての細胞は５％ＣＯ
２とともに３７℃で培養した。マウスの胸腺細胞は、８
週齢のＢａｌｂ／ｃマウスからリンパ球分離培地（ファ
ルマシア）で勾配遠心によって調製した。リンパ球は、
刺激前にＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ中で５時間３７℃で培
養した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、リン酸ナトリウムを含ま
ない培地で０．５ｍＣｉ／ｍｌの³²Ｐ−オルトホスフェ
ート（ＩＣＮラジオケミカルス）で９０分間標識した。
標識細胞を表示の通りＴＰＡ（シグマ）およびＡ２３１
８７（Calbiochem）１μｇ／ｍｌで処理した。使用に際
して、細胞刺激１０分前にエタノール中のサイクロスポ
リンＡ（ＣｓＡ）（サンド）１００ｎｇ／ｍｌを添加し
た。刺激後、標識細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、続い
てホスファターゼ阻害剤（２０ｍＭのβ−グリセロホス
フェート、１０ｍＭのｐ−ニトロフェニルホスフェー
ト、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４）およびプロテアーゼ阻害剤
（１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、アプロチニン、ペプ
スタチンンおよび１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフ
ロリド）を補充したＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭトリス
（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤ
ＴＡ、１％トリトンＸ−１００、１％ＤＯＣ、０．１％
ＳＤＳ）で溶解した。ｃ−Ｊｕｎは記載（Binetruyら、
上掲書(1992)）にしたがって免疫沈降され、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥとその後のペプチドマッピング（Boyleら、Cell
64:573-584(1991); Linら、Cell 70:777-789(1992))に
よって分析した。Ｈａ−ｒａｓはＹ１３−２５９で免疫
沈降させた。Ｈａ−ｒａｓ結合ヌクレオチドはサトーら
の記載（Satohら、Proc. Natl.Acad. Sci., USA 15:59
93-5997(1990) ）にしたがって抽出し解析した。

【０１０４】＜ＲＮＡ抽出とノザンブロッティング＞Ｒ
ＰＭＩ完全培地で増殖させた対数増殖期のＪｕｒｋａｔ
細胞（１０６／ｍｌ）を、適切な時期にＣｓＡで１５分
間予備処置し、続いて種々な処置をさらに４０分間行っ
た。先に記載（Angelら、Cell 49:729-739(1987))され
たように、全細胞質ＲＮＡを抽出した。１０μｇのＲＮ
Ａをグリオキサールで５５℃６０分間インキュベートし
て変性させ、リン酸緩衝液中の１％アガロースゲルで分
画した。分画ＲＮＡをゼータバインド（Zetabind）ナイ
ロンメンブレン（CUNO Labs製）にブロットし、ｃ−ｊ
ｕｎ、ｊｕｎ−Ｂ、ｊｕｎ−Ｄ、ｃ−ｆｏｓ、α−チュ
ブリンおよびＩＬ−２に特異的な³²Ｐ標識ｃＤＮＡプロ
ーブとハイブリダイズさせた。

【０１０５】＜プロテインキナーゼアッセー＞対数増殖
期の細胞を表示した時間刺激し、低張デタージェント細
胞抽出物を記載（Hibiら、Genes & Dev., 上掲書(199
3)）にしたがって調製した。記載（Hibiら、上掲書(199
3)）および実施例２にしたがってＧＳＴｃＪｕｎ（１−
２２３）−ＧＳＨアガロースビーズとともにインキュベ
ートした抽出物を用いて、ＪＮＫ活性測定用固相リン酸
化アッセーを実施した。ＥＲＫ１および２の活性は、基
質としてＭＢＰを用いた免疫複合体キナーゼアッセーに
よって調べた（Mindenら、Nature(1993)）。

【０１０６】＜レポーター、発現ベクターおよびトラン
スフェクション＞−７９ｊｕｎ−ＬＵＣ、−７３／＋６
３Ｃｏｌ−ＬＵＣ、−６０／＋６３Ｃｏｌ−ＬＵＣは以
前に記載された（Deng& Karin (1993)）。ＩＬ２−ＬＵ
Ｃレポータープラスミドは、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩ部
位の間のＩＬ２ＣＡＴ／＋１（Serflingら、EMBO J.,
8:465-473(1988)）由来ＩＬ２プロモーター（２９８ｂ
ｐ）をｐ２０Ｌｕｃベクター（Deng & Karin Genes & D
ev., 7:479(1993)）にサブクローニングして構築した。
ｃ−Ｊｕｎ発現ベクター、ｐＳＲａＩＩｃ−Ｊｕｎは、
ｐＲＳＶｃ−Ｊｕｎ（Binetruyら、上掲書(1991)）由来
ヒトｃ−ｊｕｎのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩフラグメン
トを平滑末端連結によってｐＳＲαＩＩベクターにサブ
クローニングして構築した。ｐＢＪ−ＣＮＡおよびｐＢ
Ｊ−ＣＮＢはクラブツリー博士（Dr. G. Crabtree、ス
タンフォード大学）から入手した。β−アクチン−ＬＵ
Ｃはグラス博士（Dr. C. Glass(UCSD)）から入手した。

【０１０７】ＴＡｇＪｕｒｋａｔ細胞は、ＳＶ４０ラー
ジＴ抗原を安定的にトランスフェクトさせたヒトＪｕｒ
ｋａｔＴ細胞株の誘導体（クラブツリー博士から分与）
であり、これを１０６／ｍｌまで増殖させ、続いて新鮮
な完全培地に２×１０７／ｍｌで再懸濁させた。１０７
細胞（０．５ｍｌ）をレポータープラスミド（５μｇ、
−７９ｊｕｎ−ＬＵＣ；１０μｇ、−７３／＋６３Ｃｏ
ｌ−ＬＵＣまたは−６０／＋６３Ｃｏｌ−ＬＵＣ；５μ
ｇＩＬ２−ＬＵＣ）と室温で１０分混合し、続いてバイ
オラドジーンパルサー（Bio-Rad GenePulser）を用いて
０．４ｃｍキュベットで２５０Ｖ、９６０ｕＦで電気的
に穴を開けた。電気穿孔の後、直ちに細胞を氷上に１０
分静置し、続いて刺激前に２４時間１０ｍｌの完全培地
に再懸濁させた。０．５μｇのｐＳＲａＩＩｃ−Ｊｕｎ
を１０７Ｊｕｒｋａｔ細胞にトランスフェクトさせるた
めに用いた。ルシフェラーゼ活性は記載（Deng & Kari
n、上掲書(1993)）にしたがって決定した。

【０１０８】＜ＲＡＳｐ２１に結合したＧＤＰおよびＧ
ＴＰの分析＞１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを補充した０．５ｍ
ＭのＮａ３ＶＯ４ホスフェート非含有ＤＭＥＭ中の³²Ｐ
−オルソホスフェート（ＩＣＮラジオケミカルス）１ｍ
Ｃｉ／ｍｌで、Ｊｕｒｋａｔ細胞１０×１０６を３時間
標識した。採取前に、１０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ、１μｇ
／ｍｌのＡ２３１８７、１０μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体
（ＯＫＴ３）、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体、または
それらの組み合わせを用いて細胞を刺激した。特定の時
間処理してから、直ちに細胞を１回氷冷ＰＢＳで、さら
に２回氷冷トリス緩衝食塩水（５０ｍＭのトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、１５０ｍ
ＭのＮａＣｌ、１０．５％Nonidet P −４０／１μｇ／
ｍｌのアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチン、お
よび１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド）で
洗浄した。Ｒａｓｐ２１をモノクローナル抗体Ｙ１２−
２５９（サンタクルツバイオテクノロジー社、サンタク
ルツ、カリフォルニア）で免疫沈降させた。ＲａｓのＧ
ＤＰ／ＧＴＰ含有量を、記載（Satohら、Proc. Natl. A
cad. Sci., USA 15:5993(1990))にしたがってＴＬＣで
分析し、アンビス（Ambis)放射能定量画像化システム
（アンビス、サンディエゴ、カリフォルニア）で定量し
た。

【０１０９】（実施例１０）＜Ｔ細胞活性化時のＡＰ−１活性の相乗誘発＞Ｔリンパ
球活性化の第一段階で、初期反応遺伝子は迅速に誘発さ
れる（Crabtree, Science 243:355,361(1989); Zipfel
ら、Mol. Cell Bio. 9:1041-1048(1989)）。Ｊｕｒｋａ
ｔＴ細胞の活性化時のｊｕｎおよびｆｏｓ遺伝子の誘発
を調べた。２つの異なる共同刺激例を用いた。１つはＴ
ＰＡとＣａ２＋のイオノフォアＡ２３１８７を用い、第
二はそのＣＤ３成分に対する抗体（ＯＫＴ３；Van Wauw
eら、J. Immunol., 124:2708-2713(1980)）とＴＣＲ複
合体の同時刺激および抗ＣＤ２８抗体（９．３；Hansen
ら、Immunogenetics 10:247-260(1993); Juneら、Immun
ol. Today 11:211-216(1990))と合わせたＣＤ２８補助
レセプターの刺激に基づくものである。表示の通り単独
または組み合わせて５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ（Ｔ）、１
μｇ／ｍｌのＡ２３１８７（Ａ）または１００ｎｇ／ｍ
ｌのサイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）とともに４０分イン
キュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞から、全細胞質ＲＮＡ
を抽出した。アガロースゲルで１０μｇのサンプルを分
画し、ナイロンメンブレンに移した後、ｃ−ｊｕｎ、ｊ
ｕｎ−Ｂ、ｊｕｎ−Ｄ、ｃ−ｆｏｓおよびα−チュブリ
ンの発現レベルを、ランダムプライム(random primed)
で作製したｃＤＮＡプローブに対するハイブリダイゼー
ションによって求めた。

【０１１０】第二に、表示のように、１０μｇ／ｍｌの
可溶性抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体、２μｇ／ｍｌの可溶
性抗ＣＤ２８（９．３）抗体または、５０ｎｇ／ｍｌの
ＴＰＡと１μｇ／ｍｌのＡ２３８１７の組み合わせ（Ｔ
／Ａ）とともに４０分間Ｊｕｒｋａｔ細胞をインキュベ
ートした。全細胞質ＲＮＡを単離し、上記のようにｃ−
ｊｕｎ、ｊｕｎ−Ｄおよびｃ−ｆｏｓプローブを用い
て、１０μｇのサンプルを分析した。同じ処理によるＩ
Ｌ−２の誘発は刺激後６時間で、ＩＬ−２とα−チュブ
リン特異的プローブを用いたブロットハイブリダイゼー
ションによって測定した。

【０１１１】第一および第二の同時刺激例の両方がＩＬ
−２転写を誘発した（図１１Ｂ）。ｃ−ｊｕｎの至適誘
発もまた、ＴＰＡとＡ２３１８７の合同処置（図１１
Ａ）、または抗ＣＤ３と抗ＣＤ２８抗体の合同処置（図
１１Ｂ）を必要とした。両方の同時刺激例によるｃ−ｊ
ｕｎの相乗誘発は、ＣｓＡによって部分的に抑制され
た。ｊｕｎ−ＢもまたＴＰＡによって誘発されたが、そ
の誘発はＡ２３１８７またはＣｓＡによっては影響され
なかった。ＴＰＡ＋Ａ２３１８７はｊｕｎ−Ｄ発現を強
化させたが、この作用はＣｓＡによってもまた抑制され
なかった。マチラ（Matillaら、EMBO J. 9:4425-4433(1
990))が報告したように、ｃ−ｆｏｓの最大誘発はＴＰ
Ａ＋Ａ２３１８７による処置を必要としたが、これはＣ
ｓＡでは抑制されなかった。したがって、ＣｓＡに対す
る感受性はｃ−ｊｕｎに固有である。一方，可溶性抗Ｃ
Ｄ３抗体とのインキュベートはｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆ
ｏｓの誘発をもたらしたが、ｃ−ｊｕｎの発現のみが抗
ＣＤ２８に同時に曝すことによって増加した。

【０１１２】ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）レポーター遺伝
子に融合した先端切断(truncated)されたＡＰ−１反応
性のヒトコラゲナーゼプロモーター（Angelら、Cell 4
9:729-739(1987))を用いて、Ｊｕｒｋａｔ細胞における
ＡＰ−１転写活性に対する異なる刺激の影響を調べた。
１０μｇの−７３Ｃｏｌ−ＬＵＣまたは−６０Ｃｏｌ−
ＬＵＣレポータープラスミドの何れかで、Ｊｕｒｋａｔ
細胞をトランスフェクトした。トランスフェクト後２４
時間して、細胞を２４穴プレートに分注し、表示のとお
り単独または組み合わせて５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ、１
μｇ／ｍｌのＡ２３１８７または１００ｎｇ／ｍｌのＣ
ｓＡとともに９時間インキュベートした。細胞を採取
し、ルシフェラーゼ活性を測定した。提示した結果は、
３穴１組で実施した３回の実験の平均である。

【０１１３】単独で投与したＴＰＡとＡ２３１８７は、
−７３Ｃｏｌ−ＬＵＣに対してわずかな影響しか与えな
かったが、一方、２つを合わせると相乗活性を生じた
（図１１Ｃ）。ＡＰ−１結合部位を欠く−６０Ｃｏｌ−
ＬＵＣレポーターは誘発されなかった。−７３Ｃｏｌ−
ＬＵＣの誘発はＣｓＡによって抑制された。抗ＣＤ３お
よび抗ＣＤ２８抗体による処理は、−７３Ｃｏｌ−ＬＵ
Ｃの相乗活性をもたらした。同様な結果はＡＰ−１反応
性ｃ−ｊｕｎプロモーターで得られた。これらの発見
は、多数のＡＰ−１部位を含む合成プロモーターを使用
した、以前のＪｕｒｋａｔ細胞でのＡＰ−１活性測定値
と異なる（Matillaら、joukeisho(1993); Ullmanら、Ge
nes & Dev., 7:188-196(1993))。これらの発見は再現性
があるが、一方、以前の実験は、生理学的なコラゲナー
ゼとｃ−ｊｕｎプロモーターはＡＰ−１転写活性につい
てより正確で有効な測定を提供することを示唆してい
る。実際、コラゲナーゼとｃ−ｊｕｎレポーターの発現
パターンはｃ−ｊｕｎ遺伝子のそれと非常に類似してい
る。

【０１１４】（実施例１１）＜ｃ−ＪｕｎＮ−末端リン酸化の同時刺激はＣｓＡによ
って抑制される＞ｃ−Ｊｕｎの転写誘発とＡＰ−１の最
適刺激はｃ−Ｊｕｎリン酸化の変化と相関する（Devar
y, Cell 71:1081-1091(1992))。Ｊｕｒｋａｔ細胞にお
けるｃ−Ｊｕｎリン酸化に対するＴＰＡとＡ２３１８７
の影響を調べた。ｃ−Ｊｕｎ発現を上昇させるために、
Ｊｕｒｋａｔ細胞にｃ−Ｊｕｎ発現ベクターをトランス
フェクトさせた。細胞を³²Ｐで標識し、種々の刺激を施
した細胞からｃ−Ｊｕｎを免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥで調べた（図１２Ａ）。Ｊｕｒｋａｔ細胞（１０６
細胞／レーン）は０．５μｇのＳＲα−ｃＪｕｎ発現ベ
クターでトランスフェクトさせ、２４時間して³²Ｐ−オ
ルソホスフェート（１ｍＣｉ／ｍｌ）で３時間標識付け
した。表示の通り単独または組み合わせて、５０ｎｇ／
ｍｌのＴＰＡ（Ｔ)、１μｇ／ｍｌのＡ２３１８７
（Ａ）または１００ｎｇ／ｍｌのＣｓＡで１５分間処理
した後、細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、ｃ−Ｊｕｎを
免疫沈降によって単離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し
た。ｃ−Ｊｕｎバンドは指標で示した。

【０１１５】非刺激細胞では、リン酸化ｃ−Ｊｕｎは単
一のバンドとして移動した。ＴＰＡで１５分間処理する
ことによって、よりゆっくりと移動するバンドの出現を
誘発し、Ａ２３１８７との同時刺激によってこの作用は
強化された。一方、ＣｓＡはＣａ＋＋作用を減少させ
た。この実験の短い時間枠の中で、ｃ−Ｊｕｎ発現に対
するごくわずかな影響があった。

【０１１６】同様な結果が、内在性ｃ−Ｊｕｎ発現とリ
ン酸化の解析によって得られた（図１２Ｂ）。２×１０
７Ｊｕｒｋａｔ細胞を³⁵Ｓ−メチオニン（９００μＣｉ
／ｍｌ）または³²Ｐ−オルソホスフェート（１ｍＣｉ／
ｍｌ）のいずれかで３時間標識付けした。表示のように
１００ｎｇ／ｍｌのＣｓＡの存在下または非存在下で５
０ｎｇ／ｍｌＴＰＡ＋１μｇ／ｍｌＡ２３１８７（Ｔ／
Ａ）とともに、またはそれらを加えないで１５分間イン
キュベートし、その後細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解さ
せ、免疫沈降によってｃ−Ｊｕｎを単離し、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで調べた。ｃ−Ｊｕｎバンドは指標で示した。し
かしながら、発現レベルが低いために、よりゆっくりと
移動する形態のあるものは明瞭に見ることはできなかっ
た。

【０１１７】ｃ−Ｊｕｎリン酸化をさらに二次元リンペ
プチドマッピングで解析した（図１２Ｃ）。この解析に
はすべてのｃ−Ｊｕｎの異性形を含めた。等しい数の細
胞から単離した図１２Ａに示す全てのｃ−Ｊｕｎ特異的
タンパク質バンドは、ゲルから切り出しトリプシン消化
リンペプチドマッピングに付した。典型的な結果を示し
た（この実験は少なくとも３回繰り返した）。Ｎ；非刺
激細胞、Ｔ；５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ処理細胞、Ｔ／
Ａ；５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡと１μｇ／ｍｌのＡ２３１
８７で処理した細胞、Ｔ／Ａ＋ＣｓＡ；Ｔ／Ａと１００
ｎｇ／ｍｌのＣｓＡとで処理した細胞、ａ、ｂ、ｃ、ｘ
およびｙは，ボイレら（Boyleら、Cell 64:573-584(199
1))およびスミールら（Smealら、Nature 354:494-496(1
991)）が以前に記載したｃ−Ｊｕｎの種々のトリプシン
消化リンペプチドに対応する。Ｔ１およびＴ２はマイナ
ーなリン酸化部位、Ｔｈｒ９１、９３および９５に対応
する（Hibiら、Genes & Dev., 7:000(1993))。

【０１１８】ｃ−ＪｕｎのＣ−末端リン酸化部位を含む
二重にリン酸化されたトリプシン消化ペプチド（Boyle,
Cell 64:573-584(1991)；Linら、Cell 70:777-789(199
2)であるスポットｂの濃さが多かれ少なかれ不変である
一方、ＴＰＡ処理によって、このペプチドの単一リン酸
化形（スポットｃ）は、その三重リン酸化形（スポット
ａ）を犠牲にしながら濃さを少し増加させた。この効果
はまた、ＴＰＡ＋Ａ２３１８７による同時刺激に対する
反応でも認められた。ＨｅＬａ細胞および線維芽細胞と
は対照的に（Boyleら、上掲書(1991); Mindenら、Natur
e (1993))、Ｊｕｒｋａｔ細胞のＴＰＡ処理によって、
Ｓｅｒ６３（スポットｙ）およびＳｅｒ７３（スポット
ｘ）に対応するＮ−末端のリン酸化が高められ、この効
果はＡ２３１８７によって極めて強化される。ＣｓＡは
Ａ２３１８７によるＮ−末端リン酸化の強化を防ぐ。

【０１１９】（実施例１２）＜ＪＮＫの相乗的活性化＞ＴＰＡ＋Ａ２３１８７に反応
したＮ−末端ｃ−Ｊｕｎリン酸化の強化は、ｃ−Ｊｕｎ
に結合し、そのＮ−末端部位をリン酸化するプロテイン
キナーゼであるＪＮＫの相乗的活性化によるものか否か
を決定するために実験を行った。ＪＮＫは４６ｋＤと５
５ｋＤのサイズの２つの形態として存在し、その両方と
も外部刺激によって活性化される（Hibiら、上掲書(199
3); Dengら、上掲書(1993)）。ゲル内キナーゼアッセー
は、ＪＮＫの両形態がＴＰＡによって活性化されること
を示した（図１３Ａ）。ＴＰＡ（Ｔ、５０ｎｇ／ｍ
ｌ）、Ａ２３１８７（Ａ、１μｇ／ｍｌ）またはＣｓＡ
（１００ｎｇ／ｍｌ）を単独または組み合わせて１５分
間、Ｊｕｒｋａｔ細胞の全細胞抽出物（ＷＣＥ）ととも
にインキュベートし、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２２３）
の存在下または非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥでゲル上で
分離し（１００μｇタンパク質／レーン）した。このゲ
ルを復元工程に付し、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ含有キナーゼ緩
衝液でインキュベートした。ＪＮＫの５５ｋＤと４６ｋ
Ｄ形に対応するタンパク質バンドは指標で示されてい
る。

【０１２０】Ａ２３１８７単独処理はＪＮＫを活性化し
なかったが、一方、ＴＰＡによってその活性化は強化さ
れた。ＣｓＡはこの同時刺激効果を阻害した。

【０１２１】ＪＮＫはＧＳＴｃＪｕｎ−グルタチオン
（ＧＳＨ）アガロース親和性樹脂上に保持され、そのキ
ナーゼ活性はＧＳＴｃＪｕｎのリン酸化によって測定さ
れる。上記のように処理したＪｕｒｋａｔ細胞のＷＣＥ
（５０μｇ）を、１０μｇのＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２
２３）で被覆した５μｌのＧＳＨアガロースビーズとと
もに１２時間４℃でインキュベートした。十分に洗浄し
た後、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ含有キナーゼ緩衝液中で２０分
間３０℃でビーズをインキュベートした。その後、ＳＤ
Ｓサンプル緩衝液でタンパク質を解離させ、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで分離した（図１３Ｂ）。４９ｋＤバンドはＧＳ
Ｔ−ｃＪｕｎ（１−２２３）に対応する。より速く移動
するバンドは分解産物である（Hibiら、上掲書(199
3)）。

【０１２２】この固相アッセーはまた、ＴＰＡ処理は、
単独では効果を持たないＡ２３１８７によって極めて強
化されるＪＮＫの活性化をもたらすことを示した。この
ＪＮＫの相乗的活性化はＣｓＡによって抑制された（図
１３Ｂ）。この固相アッセーは、ゲル内キナーゼアッセ
ーで同定された同じポリペプチドの活性を測定している
ということを証明するために、ＪＮＫをまずＧＳＴｃＪ
ｕｎ−ＧＳＨアガロースビーズ上で単離し、続いてそれ
をゲル内キナーゼアッセーで調べた。ＪＮＫの５５およ
び４６ｋＤ形の両方がＧＳＴｃＪｕｎに結合し、結合ア
ッセーで認められた態様と同じ態様で調節された（図１
３Ｃ）。図１３Ａで述べたように処理したＪｕｒｋａｔ
細胞のＷＣＥ（２００μｇ）を、上記のようにＧＳＴ−
ｃＪｕｎ（１−２２３）−ＧＳＨアガロースビーズとと
もにインキュベートし、その結合分画をＳＤＳサンプル
緩衝液に溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＧＳＴ−ｃ
Ｊｕｎ（１−２２３）含有ゲルで分離した。ゲルを復元
し、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ含有キナーゼ緩衝液でインキュベ
ートし、ＪＮＫポリペプチドを標識付けした。

【０１２３】（実施例１３）＜Ｃａ＋＋による同時刺激はＪＮＫおよびＴリンパ球に
固有である＞細胞内上昇Ｃａ＋＋は他の細胞においてＪ
ＮＫ活性化に影響を与えるか否かを調べた。ＪＮＫ活性
は、ＣＶ１およびＦＲ３Ｔ３細胞ＴＰＡによって弱く刺
激されたが、ＰＣ１２細胞では刺激されなかった（図１
４）。ＦＲ３Ｔ３、ＣＶ−１、ＰＣ１２およびマウス胸
腺細胞培養物を、表示の通りＴＰＡ（５０ｎｇ／ｍｌ、
Ｔ）、Ａ２３８１７（１μｇ／ｍｌ、Ａ）および／また
はＣｓＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で１５分インキ
ュベートした。樹立培養細胞からは２−４×１０５個、
初代胸腺細胞からは１．５×１０６個の細胞で調製した
ＷＣＥを、ＧＳＴｃＪｕｎ（１−２２３）ＧＳＨ−アガ
ロースビーズとともにインキュベートした。洗浄後、Ｊ
ＮＫ活性を上記のように固相リン酸化アッセーで求め
た。

【０１２４】これらの細胞の何れにおいてもＪＮＫ活性
は、Ａ２３１８７またはＣｓＡ処理によって影響を受け
なかった。同様な結果はＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２およびＧ
ｃ細胞で得られた。これに対してマウス胸腺細胞におけ
るＪＮＫ活性の調節は、Ｊｕｒｋａｔ細胞で観察された
ものと同様であった。ＴＰＡは、Ａ２３１８７によって
強化されたＪＮＫ活性の中等度の増加を誘発し、その同
時刺激がＣｓＡによって抑制される（図１４）。

【０１２５】ＪＮＫは、細胞外刺激によって活性化され
るプロリン指向プロテインキナーゼである（Hibiら、上
掲書(1993)）。この点で、ＪＮＫはＥＲＫ１および２Ｍ
ＡＰキナーゼと類似する（Boultonら、Cell 65:663-675
(1991))。ＥＲＫ１および２は、ｃ−ｆｏｓの誘発に深
く関与する（Gilleら、Nature 358:414-417(1992); Mar
aisら、Cell 73:381-393(1993))ようであり、したがっ
てＴ細胞活性化に関与する可能性があるため、それらの
調節を調べてみた。ＥＲＫ１およびＥＲＫ２活性は、免
疫複合体キナーゼアッセーを用い、ミエリン塩基性タン
パク質（ＭＢＰ）を基質としてＪｕｒｋａｔおよびマウ
ス胸腺細胞の両方で測定した。組換え体のキナーゼ欠損
ＥＲＫ１もまた、ＥＲＫ１および２の活性化に必須のプ
ロテインキナーゼであるＭＥＫのアッセーのための基質
に用いられた（Crewsら、Science258:478-4808(199
2)）。ＥＲＫもＭＥＫ活性も両方とも、Ｊｕｒｋａｔ細
胞またはマウス胸腺細胞のいずれのＴＰＡ処理によって
も最高に刺激された（図１５）。

【０１２６】Ｊｕｒｋａｔ（図１５、パネルＡ）または
マウス胸腺細胞（図１５、パネルＣ）のＷＣＥ（５μ
ｇ）を、１μｇのキナーゼ欠損ＥＲＫ１とともにγ−³²
Ｐ−ＡＴＰ含有キナーゼ緩衝液で２０分インキュベート
した。リン酸化タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離
し、変異体ＥＲＫ１に対応するバンドは指標で示した。
上記のように処理したＪｕｒｋａｔ（パネルＢ）または
マウス胸腺細胞（パネルＣ）のＷＣＥ（２０μｇ）を、
抗ＥＲＫ抗体（ウェーバー博士から提供）で免疫沈降さ
せた。この免疫複合体を洗浄し、γ−³²Ｐ−ＡＴＰおよ
び２μｇのＭＢＰを含むキナーゼ緩衝液で１５分間３０
℃でインキュベートした。リン酸化タンパク質をＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分離した。リン酸化ＭＢＰに対応するバン
ドは指標で示した。いずれの活性に対しても、Ａ２３１
８７およびＣｓＡは影響を与えなかった。

【０１２７】（実施例１４）＜抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体によるＪＮＫの相乗的
活性化＞ＪＮＫがＴ細胞活性化時のシグナル移送(integ
ration) において中心的役割を果たすならば、他の同時
刺激例もまた、その相乗的活性化を引き起こすはずであ
る。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体によるＴ細胞活性化
に呼応するＪＮＫの調節を調べた。正常マウス血清、１
μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および／または２μｇ／ｍｌの抗
ＣＤ２８抗体のいずれかとともに、Ｊｕｒｋａｔ細胞
（１×１０７）を表示のように１００ｎｇ／ｍｌのＣｓ
Ａの存在下または非存在下で１５分間インキュベートし
た。ＷＣＥを調製し、上記のようにゲル内キナーゼアッ
セーを用いて、１００μｇのサンプルをＪＮＫ活性化に
ついて調べた。

【０１２８】Ｊｕｒｋａｔ細胞を可溶性抗ＣＤ３または
可溶性抗ＣＤ２８抗体だけを使用してインキュベートし
た場合、ＪＮＫ活性に対して殆ど影響が認められない
が、一方、両抗体と同時インキュベートした場合、両方
の形態において強い相乗的活性化が生じた（図１６
Ａ）。

【０１２９】上記のように処理したＪｕｒｋａｔ細胞の
ＷＣＥ（５０μｇ）をＧＳＴｃＪｕｎ（１−２２３）−
ＧＳＨアガロースビーズとともにインキュベートし、固
相キナーゼアッセーを用いてＪＮＫ活性について調べ
た。同じＷＣＥ（２０μｇ）を抗ＥＲＫ２抗体で免疫沈
降し、ＭＢＰキナーゼ活性について調べた。ＣｓＡは部
分的にこの作用を弱めた。これに対して、可溶性抗ＣＤ
３抗体とのインキュベートは、抗ＣＤ２８との同時刺激
によって強化されず、またＣｓＡによって抑制もされな
いＥＲＫ２の効率的な活性化に十分であった（図１６
Ｂ）。

【０１３０】ＪＮＫのシグナル移送についての性質をさ
らに解明するために、抗ＣＤ３または抗ＣＤ２８の何れ
によってもＪＮＫを活性化しないＴＰＡの至適量より少
ない容量の場合を調べた（図１６Ｃ）。パネルＡで述べ
たように、単独または組み合わせた種々の刺激で処理し
たＪｕｒｋａｔ細胞のＷＣＥ（５０μｇ）を、ＧＳＴｃ
Ｊｕｎ（１−２２３）−ＧＳＨアガロースビーズととも
にインキュベートし固相キナーゼアッセーを用いてＪＮ
Ｋ活性について調べた。同じサンプル（２０μｇ）をま
た、図１６Ｂで述べたように、ＭＢＰキナーゼ活性につ
いて解析した。

【０１３１】この至適量より少ない量のＴＰＡは、Ａ２
３１８７と一緒になって、強いＪＮＫの相乗的活性化を
もたらしたが、ＥＲＫ２の活性化は生じなかった。ＪＮ
Ｋの活性化は、ＣｓＡによって完全に抑制された。至適
量以下のＴＰＡはまた、抗ＣＤ３または抗ＣＤ２８抗体
のいずれかと一緒になって強いＪＮＫ相乗的活性化をも
たらした。他方、ＥＲＫ２は抗ＣＤ３によって完全に活
性化されたが、単独ではＥＲＫ２の部分的活性化を生じ
る至適量以下のＴＰＡはそれ以上の効果を生じなかっ
た。抗ＣＤ２８抗体に曝しても、ＥＲＫ２の活性化はＴ
ＰＡによって増強されなかった。ＪＮＫはまた、抗ＣＤ
３＋Ａ２３１８７による合同処理によって効率的に活性
化されたが、抗ＣＤ２８＋Ａ２３１８７によっては活性
化されなかった。

【０１３２】（実施例１５）＜Ｈａ−Ｒａｓの活性化＞Ｈａ−Ｒａｓ活性化に対する
種々の処理の影響を調べ、結果を図１７に示した。０．
４ｍＣｉの³²Ｐ−オルソホスフェートで３時間標識付け
したＪｕｒｋａｔ細胞（２×１０６細胞／点）を、表示
の通り非特異的抗体（１μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ；コ
ントロール）、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体、２μｇ／
ｍｌの抗ＣＤ２８抗体、１０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡまたは
５００ｎｇ／ｍｌのＡ２３１８７（Ａ）と共にインキュ
ベートした。２分後、細胞を集め、溶解し、Ｈａ−Ｒａ
ｓを免疫沈降によって単離した。Ｈａ−Ｒａｓに結合し
たグアニンヌクレオチドを、実施例９で述べたように、
抽出し、薄層クロマトグラフィーで分離し、定量した。
表示した値は、２例１組として実施した別個の２回の実
験の平均を表す。Ｊｕｒｋａｔ細胞は³²Ｐ−オルソホス
フェートで標識し、上記のようにＴＰＡまたは抗ＣＤ３
抗体のいずれかで刺激した。表示した時点で細胞を採取
し、Ｈａ−ＲａｓのＧＴＰ含有量を直前に述べたように
測定した。

【０１３３】ＴＰＡの至適量と可溶性抗ＣＤ３抗体への
曝露によって、そのＧＴＰ含有量の増加による測定で、
Ｈａ−Ｒａｓの活性化をもたらし、一方、可溶性抗ＣＤ
２８抗体はＨａ−Ｒａｓ活性に対して影響をもたなかっ
た（図１７Ａ）。抗ＣＤ３抗体またはＴＰＡのいずれか
によるＨａ−Ｒａｓの活性化は、それぞれ抗ＣＤ２８抗
体またはＡ２３１８７の何れかによる同時刺激によって
増強されなかった。ＴＰＡによるＨａ−Ｒａｓの活性化
は少なくとも２０分持続するが、一方、可溶性抗ＣＤ３
抗体に対する反応は極めて一時的であった（図１７
Ｂ）。したがって、シグナル移送はＨａ−Ｒａｓの下流
で生じるはずである。

【０１３４】前述の記載は、本発明の範囲の詳述のため
であり制限のためではない。実際、当業者には、本明細
書の教示を基にし、過度の実験を行うことなくまた別の
実施例を企画し、作製することは容易であろう。

【０１３５】配列番号表配列番号１は、ｃ−Ｊｕｎの残基３３−７９のアミノ酸
配列である。配列番号２は、ｃ−Ｊｕｎ先端切断変異体
を作製するために用いられるＮ−末端プライマー用ヌク
レオチド配列である。配列番号３は、ｃ−Ｊｕｎ先端切
断変異体を作製するために用いられるＮ−末端プライマ
ー用ヌクレオチド配列である。配列番号４は、ｃ−Ｊｕ
ｎ先端切断変異体を作製するために用いられるＮ−末端
プライマー用ヌクレオチド配列である。配列番号５は、
ｃ−Ｊｕｎ先端切断変異体を作製するために用いられる
Ｎ−末端プライマー用ヌクレオチド配列である。配列番
号６は、ｃ−Ｊｕｎ先端切断変異体を作製するために用
いられるＮ−末端プライマー用ヌクレオチド配列であ
る。配列番号７は、ｃ−Ｊｕｎ先端切断変異体を作製す
るために用いられるＣ−末端プライマー用ヌクレオチド
配列である。配列番号８は、ｃ−Ｊｕｎ先端切断変異体
を作製するために用いられるＣ−末端プライマー用ヌク
レオチド配列である。配列番号９は、ｃ−ｊｕｎおよび
ｃ−Ｊｕｎのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列
である。配列番号１０は、ｃ−Ｊｕｎの推定アミノ酸配
列である。

【０１３６】

【配列表】（１）一般情報：（ｉ）出願人：ザリージェンツオブザユニバーシティオブカリフォルニア Karin, Michael Hibi, Masahiko Lin, Anning （ｉｉ）発明の名称：腫瘍タンパク質のプロテインキナーゼ（ｉｉｉ）配列の総数：１０（ｉｖ）郵便物の宛先：（Ａ）名宛人：Spensley Horn Jubas & Lubitz （Ｂ）丁名：1880 Century Park East, Suite 500 （Ｃ）町名：ロサンジェルス（Ｄ）州名：カリフォルニア（Ｅ）国名：アメリカ合衆国（Ｆ）ジップコード：９００６７（ｖ）コンピューター解読形式：（Ａ）媒体型：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）演算システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフト：PatentIn Release #1.0、バージョン #1.25 （ｖｉ）現在の出願状況：（Ａ）出願番号：ＰＣＴ（Ｂ）出願日：１９９４年７月１８日（Ｃ）分類：（ｖｉｉｉ）代理人情報：（Ａ）氏名：Wethrell, Jr., Ph.D., R. John, （Ｂ）登録番号：３１６７８（Ｃ）リファレンス／ドケット番号：ＦＤ−３７０１（ｉｘ）通信に関する情報：（Ａ）電話：（６１９）４５５−５１００（Ｂ）ファクシミリ：（６１９）４５５−５１１０

【０１３７】（２）配列番号１の情報（ｉ）配列の性状：（Ａ）長さ：４７アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：ペプチド（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：ｃ−Ｊｕｎ／ＪＮＫ結合部位（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ペプチド（Ｂ）存在位置：１．．４７（ｘｉ）配列：配列番号１ Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser 1 5 10 15 Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro 20 25 30 Asp Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu 35 40 45

【０１３８】（２）配列番号２の情報（ｉ）配列の性状：（Ａ）長さ：３５塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム由来）（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：Ｎ−末端プライマー（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：１．．３５（ｘｉ）配列：配列番号２ TCTGCAGGAT CCCCATGACT GCAAAGATGG AAACG 35

【０１３９】（２）配列番号３の情報（ｉ）配列の性状：（Ａ）長さ：３４塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム由来）（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：Ｎ−末端プライマー（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：１．．３４（ｘｉ）配列：配列番号３ TCTGCAGGAT CCCCGACGAT GCCCTCAACG CCTC 34

【０１４０】（２）配列番号４の情報（ｉ）配列の性状：（Ａ）長さ：３５塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム由来）（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：Ｎ−末端プライマー（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：１．．３５（ｘｉ）配列：配列番号４ TCTGCAGGAT CCCCGAGC GGACCTTATG GCTAC 35

【０１４１】（２）配列番号５の情報（ｉ）配列の性状：（Ａ）長さ：３５塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム由来）（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：Ｎ−末端プライマー（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：１．．３５（ｘｉ）配列：配列番号５ TCTGCAGGAT CCCCGCCGAC CCAGTGGGGA GCCTG 35

【０１４２】（２）配列番号６の情報（ｉ）配列の性状：（Ａ）長さ：３５塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム由来）（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：Ｎ−末端プライマー（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：１．．３５（ｘｉ）配列：配列番号６ TCTGCAGGAT CCCCAAGAAC TCGGACCTCC TCACC 35

【０１４３】（２）配列番号７の情報（ｉ）配列の性状：（Ａ）長さ：３０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム由来）（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：Ｃ−末端プライマー（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：１．．３０（ｘｉ）配列：配列番号７ TGAATTCTGC AGGCGCTCCA GCTCGGGCGA 30

【０１４４】（２）配列番号８の情報（ｉ）配列の性状：（Ａ）長さ：３３塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム由来）（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：Ｃ−末端プライマー（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：１．．３３（ｘｉ）配列：配列番号８ TGAATTCCTG CAGGTCGGCG TGGTGGTGAT GTG 33

【０１４５】（２）配列番号９の情報（ｉ）配列の性状：（Ａ）長さ：２０９６塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム由来）（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：Ｊｕｎ（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ＣＤＳ（Ｂ）存在位置：４１２．．１４０４（ｘｉ）配列：配列番号９ GAATTCCGGG GCGGCCAAGA CCCGCCGCCG GCCGGCCACT GCAGGGTCCG CACTGATCCG 60 CTCCGGCGGA GAGCCGCTGC TCTGGGAAGT CAGTTCGCCT GCGGACTCCG AGGAACCGCT 120 GCGCACGAAG AGCCGTCAGT GAGTGACCGC GACTTTTCAA AGCCGGGTAG GGCGCGCGAG 180 TCGACAAGTA AGAGTGCGCG AGGCATCTTA ATTAACCCTG CGCTCCCTGG AGCAGCTGGT 240 GAGGAGGGCG CACGGGGACG ACACCCAGCG GGTGCGTGCG CTCTTAGAGA AACTTTCCCT 300 GTCAAAGGCT CCGGGGGGCG CGGGTGTCCC CCGCTTGCCA CAGCCCTGTT GCGGCCCCGA 360 AACTTGTGCG CGCACGCCAA ACTAACCTCA CGTGAAGTGA CGGACTGTTC T ATG ACT 417 Met Thr 1 GCA AAG ATG GAA ACG ACC TTC TAT GAC GAT GCC CTC AAC GCC TCG TTC 465 Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala Ser Phe 5 10 15 CTC CCC TCC GAG AGG GGA CCT TAT GGC TAC AGT AAC CCC AAG ATC CTG 513 Leu Pro Ser Glu Arg Gly Pro Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys Ile Leu 20 25 30 AAA CAG AGC ATG ACC CTG AAC CTG GCC GAC CCA GTG GGG AGC CTG AAG 561 Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser Leu Lys 35 40 45 50 CCG CAC CTC CGC GCC AAG AAC TCG GAC CTC CTC ACC TCG CCC GAC GTG 609 Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro Asp Val 55 60 65 GGG CTG CTC AAG CTG GCG TCG CCC GAG CTG GAG CGC CTG ATA ATC CAG 657 Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu Ile Ile Gln 70 75 80 TCC AGC AAC GGG CAC ATC ACC ACC ACG CCG ACC CCC ACC CAG TTC CTG 705 Ser Ser Asn Gly His Ile Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln Phe Leu 85 90 95 TGC CCC AAG AAC GTG ACA GAT GAG CAG GAG GGG TTC GCC GAG GGC TTC 753 Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu Gly Phe 100 105 110 GTG CGC GCC CTG GCC GAA CTG CAC AGC CAG AAC ACG CTG CCC AGC GTC 801 Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro Ser Val 115 120 125 130 ACG TCG GCG GCG CAG CCG GTC AAC GGG GCA GGC ATG GTG GCT CCC GCG 849 Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Asn Gly Ala Gly Met Val Ala Pro Ala 135 140 145 GTA GCC TCG GTG GCA GGG GGC AGC GGC AGC GGC GGC TTC AGC GCC AGC 897 Val Ala Ser Val Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Phe Ser Ala Ser 150 155 160 CTG CAC AGC GAG CCG CCG GTC TAC GCA AAC CTC AGC AAC TTC AAC CCA 945 Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe Asn Pro 165 170 175 GGC GCG CTG AGC AGC GGC GGC GGG GCG CCC TCC TAC GGC GCG GCC GGC 993 Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala Ala Gly 180 185 190 CTG GCC TTT CCC GCG CAA CCC CAG CAG CAG CAG CAG CCG CCG CAC CAC 1041 Leu Ala Phe Pro Ala Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro His His 195 200 205 210 CTG CCC CAG CAG ATG CCC GTG CAG CAC CCG CGG CTG CAG GCC CTG AAG 1089 Leu Pro Gln Gln Met Pro Val Gln His Pro Arg Leu Gln Ala Leu Lys 215 220 225 GAG GAG CCT CAG ATA GTG CCC GAG ATG CCC GGC GAG ACA CCG CCC CTG 1137 Glu Glu Pro Gln Ile Val Pro Glu Met Pro Gly Glu Thr Pro Pro Leu 230 235 240 TCC CCC ATC GAC ATG GAG TCC CAG GAG CGC ATC AAG GCG GAG AGG AAG 1185 Ser Pro Ile Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg Ile Lys Ala Glu Arg Lys 245 250 255 CGC ATG AGG AAC CGC ATC GCT GCC TCG AAG TGC CGA AAA AGG AAG CTG 1233 Arg Met Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg Lys Leu 260 265 270 GAG AGA ATC GCC CGG CTG GAG GAA AAA GTG AAA ACC TTG AAA GCT CAG 1281 Glu Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln 275 280 285 290 AAC TCG GAG CTG GCG TCG ACG GCC AAC ATG CTC AGG GAA CAG GTC GCA 1329 Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala 295 300 305 CAG CTT AAA CAC AAA GTC ATG AAC CAC GTT AAC AGT GGG TGC CAA CTC 1377 Glu Leu Lys His Lys Val Met Asn His Val Asn Ser Gly Cys Gln Leu 310 315 320 ATC CTA ACG CAG CAG TTG CAA ACA TTT TGAAGAGAGA CCGTCGGGGG 1424 Ile Leu Thr Gln Gln Leu Gln Thr Phe 325 330 CTGAGGGGCA ACGAAGAAAA AAAATAACAC AGAGAGACAG ACTTGAGAAC TTGACAAGTT 1484 GCGACGGAGA GAAAAAAGAA GTGTCCGAGA ACTAAAGCCA AGGGTATCCA AGTTGGACTG 1544 GGTTCGGTCT GACGGCGCCC CCAGTGTGCA CGAGTGGGAA CCACCTGGTC GCGCCCTCCC 1604 TTGGCGTCGA GCCAGGGAGC GGCCGCCTGG GGGCTGCCCC GCTTTGCGGA CGGGCTGTCC 1664 CCGCGCGAAC GGAACGTTGG ACTTTCGTTA ACATTGACCA AGAACTGCAT GGACCTAACA 1724 TTCGATCTCA TTCAGTATTA AAGGGGGCAG GGGGAGGGGG TTACAAACTG CAATAGAGAC 1784 TGTAGATTGC TTCTGTAGTA CTCCTTAAGA ACACAAAGCG GGGGGAGGGT TGGGGAGGGG 1844 CGGCAGGAGG GAGGTTTGTG AGAGCGAGGC TGAGCCTACA GATGAACTCT TTCTGGCCTG 1904 CTTTCGTTAA CTGTGTATGT ACATATATAT ATTTTTTAAT TTGATTAAAG CTGATTACTG 1964 TCAATAAACA GCTTCATGCC TTTGTAAGTT ATTTCTTGTT TGTTTGTTTG GGATCCTGCC 2024 CAGTGTTGTT TGTAAATAAG AGATTTGGAG CACTCTGAGT TTACCATTTG TAATAAAGTA 2084 TATAATTTTT TT 2096

【０１４６】（２）配列番号１０の情報（ｉ）配列の性状：（Ａ）長さ：３３１アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）分子の種類：蛋白（ｘｉ）配列：配列番号１０ Met Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Glu Arg Gly Pro Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys 20 25 30 Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser 35 40 45 Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro 50 55 60 Asp Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu Ile 65 70 75 80 Ile Gln Ser Ser Asn Gly His Ile Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln 85 90 95 Phe Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu 100 105 110 Gly Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro 115 120 125 Ser Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Asn Gly Ala Gly Met Val Ala 130 135 140 Pro Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Phe Ser 145 150 155 160 Ala Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe 165 170 175 Asn Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala 180 185 190 Ala Gly Leu Ala Phe Pro Ala Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro 195 200 205 His His Leu Pro Gln Gln Met Pro Val Gln His Pro Arg Leu Gln Ala 210 215 220 Leu Lys Glu Glu Pro Gln Ile Val Pro Glu Met Pro Gly Glu Thr Pro 225 230 235 240 Pro Leu Ser Pro Ile Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg Ile Lys Ala Glu 245 250 255 Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg 260 265 270 Lys Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys 275 280 285 Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln 290 295 300 Val Ala Glu Leu Lys His Lys Val Met Asn His Val Asn Ser Gly Cys 305 310 315 320 Gln Leu Ile Leu Thr Gln Gln Leu Gln Thr Phe 325 330

【図面の簡単な説明】

【図１】ＦＩＧ．１は、³²Ｐ−ＡＴＰおよびＧＳＴ−
ｃＪｕｎ（ｗｔ）、ＧＳＴｃＪｕｎ（Ａｌａ６３／７
３）またはＧＳＴとともにインキュベートした後の、Ｆ
Ｒ３Ｔ３（−）およびＨａ−ｒａｓ−形質転換ＦＲ３Ｔ
３（＋）から得た核抽出物およびサイトゾル抽出物のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

【図２】ＦＩＧ．２は、Ａ）未処理またはＵＶ照射Ｈ
ｅＬａＳ３細胞、およびＢ）未処理またはＴＰＡととも
にインキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥを示す。細胞抽出物は、³²Ｐ−ＡＴＰおよびＧＳＴ
−ｃＪｕｎ（ｗｔ）、ＧＳＴｃＪｕｎ−（Ａｌａ６３／
７３）またはＧＳＴとともにインキュベートした。

【図３】ＦＩＧ．３は、ＧＳＴ−ｃＪｕｎおよびＪＮＫ
によってリン酸化されたｃ−Ｊｕｎのリンペプチドマッ
ピングを示す。ＦＩＧ．３ＡはＧＳＴ−ｃＪｕｎのマッ
プを示す。

【図４】ＦＩＧ．３Ｂはｃ−Ｊｕｎのマップを示す。

【図５】ＦＩＧ．４Ａは、ＮａＣｌ、尿素、グアニジン
−ＨＣｌ（ＧｕＨＣｌ）またはＳＤＳで洗浄し、ＧＳＴ
−ｃＪｕｎからＪＮＫを溶出させた後のリン酸化タンパ
ク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

【図６】ＦＩＧ．４Ｂは、ＧＳＴｃ−Ｊｕｎ（ｗｔ）を
ＧＳＨ−ビーズに共有結合させ、ＴＰＡ刺激Ｊｕｒｋａ
ｔ細胞の全細胞抽出物とともにインキュベートした後の
リン酸化ｃ−ＪｕｎのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

【図７】ＦＩＧ．５は、ゲル内キナーゼアッセーを示
す。ＧＳＴｃＪｕｎ−ＧＳＨアガロースビーズを、ＦＩ
Ｇ．５Ａ）ＧＳＴｃＪｕｎ（ｗｔ）の存在下もしくは非
存在下で重合させたＳＤＳゲル上のＴＰＡ刺激Ｊｕｒｋ
ａｔ細胞から得た細胞抽出物；ＦＩＧ．５Ｂ）ＵＶ刺激
もしくは未刺激ＨｅＬａ細胞およびＴＰＡ刺激もしくは
未刺激Ｊｕｒｋａｔ細胞の抽出物とともにインキュベー
トした。

【図８】ＦＩＧ．５Ｃ）対数増殖期のＫ５６２およびＨ
ａ−ｒａｓ−形質転換ＦＲ３Ｔ３、ＴＰＡ刺激Ｊｕｒｋ
ａｔおよびＵ９３７細胞、並びにＵＶ照射ＨｅＬＡ、Ｆ
９およびＱＴ６細胞の抽出物とともにインキュベートし
た。

【図９】ＦＩＧ．６Ａは、種々のＧＳＴｃ−Ｊｕｎ融合
タンパク質のタンパク質ゲルである。ＦＩＧ．６Ｂは、
ＦＩＧ．６Ａに示したようにＧＳＴ融合タンパク質を含
むＧＳＨビーズ上を通した後のＵＶ照射ＨｅＬａＳ３細
胞の全細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ＦＩＧ．
６Ｃは、ＧＳＨ−アガロースビーズから１ＭＮａＣｌで
溶出したリン酸化ＧＳＴｃＪｕｎ融合タンパク質のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥを示す。

【図１０】ＦＩＧ．７Ａは、大腸菌で発現されたＧＳ
Ｔ、ＧＳＴｃＪｕｎおよびＧＳＴｖＪｕｎのパターンを
示す。ＦＩＧ．７Ｂは、ＧＳＨ−ビーズとともにインキ
ュベートしたＴＰＡ活性化Ｊｕｒｋａｔ細胞抽出物由来
のＦＩＧ．７Ａのリン酸化タンパク質を示す。ＦＩＧ．
７Ｃは、ＧＳＴｃＪｕｎおよびＧＳＴｖＪｕｎビーズに
結合したタンパク質によるリン酸化後のｃ−Ｊｕｎタン
パク質を示す。

【図１１】ＦＩＧ．８は、Ａ）Ｈａ−ｒａｓまたはＢ）
ＵＶ処置の存在下または非存在下における、いろいろな
ｃ−Ｊｕｎ活性化ドメイン部分（ｃＪ＝ＡＡ１−２２
３；３３＝ＡＡ３３−２２３；４３＝ＡＡ４３−２２
３；５６＝ＡＡ５６−２２３；Ａ６３，７３＝ＡＡ１−
２４６（Ａｌａ６３／７３））およびＣＡＴレポーター
を含む細胞のＣＡＴ活性を示す。

【図１２】ＦＩＧ．９は、Ａ）Ｈａ−ｒａｓまたはＢ）
ＵＶ照射の存在下または非存在下におけるｖ−Ｊｕｎお
よびｃ−Ｊｕｎをトランスフェクトさせた³²Ｐおよび³⁵
Ｓ標識Ｆ９細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。

【図１３】ＦＩＧ．１０は、ｃ−Ｊｕｎのヌクレオチド
および推定アミノ酸配列を示す。矢印はアミノ酸残基３
３−７９を表す。

【図１４】ＦＩＧ．１０の続きである。

【図１５】ＦＩＧ．１０の続きである。

【図１６】ＦＩＧ．１０の続きである。

【図１７】ＦＩＧ．１０の続きである。

【図１８】ＦＩＧ．１１Ａは、Ｊｕｒｋａｔ細胞の全細
胞質ＲＮＡのノザンブロットを示す。細胞を単独または
組み合わせた５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ（Ｔ）、１μｇ／
ｍｌのＡ２３１８７（Ａ）または１００ｎｇ／ｍｌのサ
イクロスポリンＡ（ＣｓＡ）とともに４０分間、表示の
ようにインキュベートした。ｃ−ｊｕｎ、ｊｕｎ−Ｂ、
ｊｕｎ−Ｄ、ｃ−ｆｏｓおよびα−チュブリン発現レベ
ルは、ランダムな位置から合成を開始したｃＤＮＡプロ
ーブに対するハイブリダイゼーションによって決定し
た。ＦＩＧ．１１Ｂは、可溶性抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、
２μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８（９．３）、または５
０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡおよび１μｇ／ｍｌのＡ２３８１
７（Ｔ／Ａ）との組み合わせとともに４０分間表示のと
おりインキュベートした後のＪｕｒｋａｔ細胞を示す。
全細胞ＲＮＡを分離し、１０μｇのサンプルをｃ−ｊｕ
ｎ、ｊｕｎ−Ｄおよびｃ−ｆｏｓプローブを用いて分析
した。同じ処理によるＩＬ−２誘発は、６時間の刺激
後、ＩＬ−２およびα−チュブリン特異的プローブを用
いたブロットハイブリダイゼーションによって測定し
た。

【図１９】ＦＩＧ．１１Ｃは、−７３Ｃｏｌ−ＬＵＣま
たは−６０Ｃｏｌ−ＬＵＣレポータープラスミド１０μ
ｇをトランスフェクトさせたＪｕｒｋａｔ細胞を示す。
トランスフェクト後２４時間して、細胞を適量ずつ２４
穴プレートに入れ、表示の通り５０ｎｇ／ｍｌのＴＰ
Ａ、１μｇ／ｍｌのＡ２３１８７または１００ｎｇ／ｍ
ｌを単独または組み合わせてＣｓＡとともにインキュベ
ートした。細胞を採集し、ルシフェラーゼ活性を決定し
た。表示した結果は３穴１組として実施した３回の実験
の平均である。

【図２０】ＦＩＧ．１２Ａは、０．５μｇのＳＲα−ｃ
Ｊｕｎ発現ベクターをトランスフェクトさせ、２４時間
後に³²Ｐ−オルソホスフェート（１ｍＣｉ／ｍｌ）で３
時間標識付けしたＪｕｒｋａｔ細胞（１０６細胞／レー
ン）を示す。１５分後、表示の通り単独または組み合わ
せた５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡ（Ｔ）、１μｇ／ｍｌのＡ
２３１８７（Ａ）および１００ｎｇ／ｍｌのＣｓＡで処
理し、細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解し、免疫沈降でｃ−
Ｊｕｎを分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。ｃ−Ｊ
ｕｎバンドは指標で示した。ＦＩＧ．１２Ｂは、³⁵Ｓ−
メチオニン（９００μＣｉ／ｍｌ）または³²Ｐ−オルソ
ホスフェート（１ｍＣｉ／ｍｌ）のいずれかで３時間標
識付けした２×１０ ⁷Ｊｕｒｋａｔ細胞を示す。１００
ｎｇ／ｍｌのＣｓＡの存在下または非存在下で５０ｎｇ
／ｍｌのＴＰＡ＋１μｇ／ｍｌのＡ２３１７８（Ｔ／
Ａ）とともに、あるいは表示の通り添加せずに１５分間
インキュベートした後、細胞をＲＩＰＡ緩衝液で溶解
し、免疫沈降によってｃ−Ｊｕｎを分離し、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで解析した。ｃ−Ｊｕｎバンドは指標で示した。

【図２１】ＦＩＧ．１２Ｃは、ゲルから切り出し、トリ
プシン消化リンペプチドマッピングを行った、等しい数
の細胞から単離した１２Ａで示したｃ−Ｊｕｎ特異タン
パク質の全てのバンドを示している。ここには典型的な
結果を示した（この実験は少なくとも３回繰り返し
た）。Ｎ−非刺激細胞；Ｔ−５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡで
処理された細胞；Ｔ／Ａ：５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡおよ
び１μｇ／ｍｌのＡ２３１８７で処理された細胞；Ｔ／
Ａ＋ＣｓＡ：Ｔ／Ａと１００ｎｇ／ｍｌのＣｓＡで処理
された細胞。ａ、ｂ、ｃ、ｘおよびｙは、ボイルらおよ
びスミールらが先に記載したｃ−Ｊｕｎの種々のトリプ
シン消化リンペプチドに対応する（Boyleら、Cell 64:
573-584(1991); Smeal ら、Nature 354:494-496(199
1)）。Ｔ１およびＴ２はマイナーなリン酸化部位、Ｔｈ
ｒ９１、９３および９５に対応する（Hibiら、Genes &
Dev., 7:000(1993))。

【図２２】ＦＩＧ．１３Ａは、単独または組み合わせた
ＴＰＡ（Ｔ、５０ｎｇ／ｍｌ）、Ａ２３１８７（Ａ、１
μｇ／ｍｌ）またはＣｓＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）ととも
に１５分間インキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞の全細
胞抽出物（ＷＣＥ）を、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２２
３）の存在下または非存在下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０
０μｇタンパク質／レーン）でゲル上で分離したものを
示す。ゲルを復元プロトコル(renaturation protocol)
に付し、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ含有キナーゼ緩衝液中でイン
キュベートした。ＪＮＫの５５ｋＤおよび４６ｋＤ形に
対応するタンパク質バンドは指標で示す。ＦＩＧ．１３
Ｂは、上記のように処理したＪｕｒｋａｔ細胞のＷＣＥ
（５０μｇ）を、１０μｇのＧＳＴ−ｃＪｕｎ（１−２
２３）で被覆した５μｌのＧＳＨアガロースビーズによ
り４℃で１２時間処理したものを示す。十分に洗浄した
後、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ含有キナーゼ緩衝液で３０℃、２
０分インキュベートし、その後ＳＤＳサンプル緩衝液で
インキュベートしてタンパク質を分離させてからＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分離した。４９ｋＤバンドはＧＳＴ−ｃＪ
ｕｎ（１−２２３）に対応する。ＦＩＧ．１３Ｃは、Ｆ
ＩＧ．１３Ａで述べたように処理し、ＧＳＴ−ｃＪｕｎ
（１−２２３）−ＧＳＨアガロースビーズでインキュベ
ートしたＪｕｒｋａｔ細胞のＷＣＥ（２００μｇ）を示
す。結合分画をＳＤＳサンプル緩衝液で溶出させ、ＧＳ
Ｔ−ｃＪｕｎ（１−２２３）含有ゲル上でＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分離した。ゲルを復元し、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ
含有キナーゼ緩衝液でインキュベートしてＪＮＫポリペ
プチドを標識した。

【図２３】ＦＩＧ．１４は、表示の通りＴＰＡ（５０ｎ
ｇ／ｍｌ、Ｔ）、Ａ２３８１７（１μｇ／ｍｌ、Ａ）お
よび／またはＣｓＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で１
５分間インキュベートしたＦＲ３Ｔ３、ＣＶ−１、ＰＣ
１２およびマウス胸腺細胞培養のリン酸化アッセーを示
す。樹立細胞株については２−４×１０５細胞、胸腺細
胞の初代培養物については１．５×１０６細胞から調製
したＷＣＥをＧＳＴｃＪｕｎ（１−２２３）−ＧＳＨア
ガロースビーズとともにインキュベートした。洗浄後、
ＪＮＫ活性を固相リン酸化アッセーで求めた。

【図２４】ＦＩＧ．１５は、γ−³²Ｐ−ＡＴＰ含有キナ
ーゼ緩衝液中で２０分間キナーゼ欠失ＥＲＫ１とともに
インキュベートしたＪｕｒｋａｔ（パネルＡ）またはマ
ウス胸腺細胞（パネルＣ）のＷＣＥ（５μｇ）を示す。
リン酸化タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、変異
体ＥＲＫ１に対応するバンドは指標で示した。上記に記
載したように処理したＪｕｒｋａｔ（パネルＡ）または
マウス胸腺細胞（パネルＣ）のＷＣＥ（２０μｇ）を抗
ＥＲＫ抗体で免疫沈降させた。この免疫複合体を洗浄
し、γ−³²Ｐ−ＡＴＰおよび２μｇのＭＢＰを含むキナ
ーゼ緩衝液で１５分３０℃でインキュベートした。リン
酸化タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。リン酸
化ＭＢＰに対応するバンドをパネルＢおよびＤで指標に
よって示した。

【図２５】ＦＩＧ．１６Ａは、表示のとおり１００ｎｇ
／ｍｌのＣｓＡの存在下または非存在下で正常なマウス
の血清、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および／または２μｇ
／ｍｌの抗ＣＤ２８とともに１５分間インキュベートし
たＪｕｒｋａｔ細胞（１×１０７）を示す。ＷＣＥを調
製し、１００μｇのサンプルを、ゲル内キナーゼアッセ
ーを用いてＪＮＫ活性について解析した。ＦＩＧ．１６
Ｂは、ＦＩＧ．１６Ａで述べたように処理し、ＧＳＴｃ
Ｊｕｎ（１−２２３）−ＧＳＨアガロースビーズととも
にインキュベートし、固相キナーゼアッセーを用いてＪ
ＮＫ活性について解析したＪｕｒｋａｔ細胞のＷＣＥ
（５０μｇ）を示す。これと同じＷＣＥ（２０μｇ）を
抗ＥＲＫ２抗体で免疫沈降させ、ＭＢＰキナーゼ活性に
ついて解析した。ＦＩＧ．１６Ｃは、ＦＩＧ．１６Ａで
述べたように種々の刺激を単独でまたはそれらを組み合
わせて処理し、ＧＳＴｃＪｕｎ（１−２２３）−ＧＳＨ
アガロースビーズとともにインキュベートし、固相キナ
ーゼアッセーを用いてＪＮＫ活性について解析したＪｕ
ｒｋａｔ細胞のＷＣＥ（５０μｇ）を示す。これと同じ
サンプル（２０μｇ）をまた、ＦＩＧ．１６Ｂで述べた
ようにＭＢＰ−キナーゼ活性について解析した。

【図２６】ＦＩＧ．１７Ａは、³²Ｐ−オルソホスフェー
ト０．４ｍＣｉで３時間標識付けし、さらに、表示の通
り非特異的抗体（１μｇ／ｍｌマウスＩｇＧ；コントロ
ール）、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３、２μｇ／ｍｌの抗Ｃ
Ｄ２８、１０ｎｇ／ｍｌのＴＰＡまたは５００ｎｇ／ｍ
ｌのＡ２３１８７（Ａ）とともにインキュベートしたＪ
ｕｒｋａｔ細胞（２×１０６細胞／ポイント）を示す。
２分後、細胞を採集して溶解し、免疫沈降によってＨａ
−Ｒａｓを単離した。Ｈａ−Ｒａｓに結合したグアニン
ヌクレオチドを抽出し、薄層クロマトグラフィーで分離
し定量した。表示した値は、２列で１組として実施した
別々の２回の実験の平均を表す。ＦＩＧ．１７Ｂは、³²
Ｐ−オルソホスフェートで標識付けし、ＴＰＡまたは抗
ＣＤ３で刺激したＪｕｒｋａｔ細胞を示す。表示した時
点で細胞を採集し、Ｈａ−ＲａｓのＧＴＰ含有量を求め
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/32 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/48 Ｚ 1/48 Ｃ１２Ｎ 9/12 // Ｃ１２Ｎ 9/12 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者カリン、マイケルアメリカ合衆国 92122 カリフォルニア州サンディエゴチャルスドニー 2565 (72)発明者ヒビ、マサヒコアメリカ合衆国 92122 カリフォルニア州サンディエゴナンバー 418 チャーマントドライブ 7528 (72)発明者リン、アニンアメリカ合衆国 92093 カリフォルニア州ラホイヤヴィアマヨルカドライブ 8655 アパートメント 93

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ．還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定した場
合４６ｋＤの分子量を有し、ｂ．セリンおよびスレオニンキナーゼ活性を有し、ｃ．ｃ−ＪｕｎＮ−末端活性化ドメインをリン酸化す
る、という特徴を有する単離ポリペプチド。
【請求項２】請求項１記載のポリペプチドをコードす
る単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】請求項２記載のポリヌクレオチドを含む
宿主細胞。
【請求項４】請求項２記載のポリヌクレオチドを含む
組換え体発現ベクター。
【請求項５】ウイルスである、請求項４記載のベクタ
ー。
【請求項６】前記ウイルスがＲＮＡウイルスである、
請求項５記載のベクター。
【請求項７】前記ＲＮＡウイルスがレトロウイルスで
ある請求項６記載のベクター。
【請求項８】前記ベクターがプラスミドである、請求
項４記載のベクター。
【請求項９】請求項１記載のポリペプチドと結合する
抗体またはそのフラグメント。
【請求項１０】前記抗体がポリクローナルである、請
求項９記載の抗体。
【請求項１１】前記抗体がモノクローナルである、請
求項９記載の抗体。
【請求項１２】ａ．還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定した
場合、５５ｋＤの分子量を有し、ｂ．セリンおよびスレ
オニンキナーゼ活性を有し、ｃ．ｃ−ＪｕｎＮ−末端活
性化ドメインをリン酸化する、という特徴を有する単離
ポリペプチド。
【請求項１３】請求項１２記載のポリペプチドをコー
ドする単離ポリヌクレオチド。
【請求項１４】ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼに影響を
与える組成物を同定する方法であって、当該方法が、ａ．前記組成物と前記キナーゼまたは該キナーゼをコー
ドするポリヌクレオチドを含む成分とを、該成分が相互
に作用するために十分な条件下でインキュベートし、ｂ．前記キナーゼまたは該キナーゼをコードするポリヌ
クレオチドに対する組成物の作用を測定すること、を含
み、前記キナーゼが請求項１又は請求項12記載の単離ポ
リペプチドである、上記同定方法。
【請求項１５】前記作用がキナーゼの抑制である、請
求項１４記載の方法。
【請求項１６】前記作用がキナーゼの刺激である、請
求項１４記載の方法。
【請求項１７】前記ポリヌクレオチドが請求項２記載
のポリヌクレオチドである、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】前記組成物が免疫抑制剤である、請求
項１４記載の方法。
【請求項１９】ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼに連関す
る細胞増殖性疾患の治療用組成物であって、キナーゼ活
性を調整する試薬を前記疾患の対象者に治療的に有効な
量で含む前記細胞増殖性疾患の治療用組成物。
【請求項２０】前記試薬がアンチセンスポリヌクレオ
チド配列である、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】前記試薬が抗体である、請求項１９記
載の組成物。
【請求項２２】前記抗体がモノクローナルである、請
求項２１記載の組成物。
【請求項２３】前記試薬が、配列番号１の合成ペプチ
ドに結合する抗体である、請求項１９記載の組成物。
【請求項２４】前記試薬が、配列番号１のアミノ酸配
列をもつ合成ペプチドおよびその保守的変形である、請
求項１９記載の組成物。
【請求項２５】前記試薬が抗イディオタイプ抗体であ
る、請求項１９記載の組成物。
【請求項２６】前記抗イディオタイプ抗体が、配列番
号１のアミノ酸配列に結合する抗体のパラトープに結合
する、請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】前記細胞増殖性疾患が、虚血性心疾
患、白血病、類リューマチ性関節炎、大腸癌、腎細胞
癌、前立腺癌、肺の非小細胞癌、小腸の癌、食道癌、後
天性免疫不全症候群、脈管炎、および免疫病理学的疾患
から成る群から選ばれる、請求項１９記載の組成物。
【請求項２８】ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ活性をも
つ細胞を同定する方法であって、当該方法が、ｃ−Ｊｕ
ｎＮ−末端キナーゼ活性を伴う細胞成分を、該成分と結
合する試薬に接触させ、該成分と試薬との相互作用を測
定することを含む、前記細胞の同定方法。
【請求項２９】前記成分が核酸である、請求項２８記
載の方法。
【請求項３０】前記核酸がＲＮＡである、請求項２９
記載の方法。
【請求項３１】前記成分がタンパク質である、請求項
２８記載の方法。
【請求項３２】前記試薬がプローブである、請求項２
８記載の方法。
【請求項３３】前記プローブが核酸である、請求項３
２記載の方法。
【請求項３４】前記プローブがタンパク質である、請
求項３２記載の方法。
【請求項３５】前記タンパク質がｃ−Ｊｕｎタンパク
質である、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】前記ｃ−Ｊｕｎタンパク質が融合タン
パク質である、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】前記融合タンパク質がｃ−Ｊｕｎおよ
びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）か
ら成る、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】前記プローブが抗体である、請求項３
２記載の方法。
【請求項３９】前記抗体がモノクローナルである、請
求項３８記載の方法。
【請求項４０】前記プローブが検出できるように標識
されている、請求項３２記載の方法。
【請求項４１】前記標識が、放射性同位元素、生物発
光化合物、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレー
ト、または酵素から成る群から選ばれる、請求項４０記
載の方法。
【請求項４２】ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼに結合す
る抗体を含むｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼの検出に有用
なキットであって、当該キットが、１つまたは２つ以上
の容器を閉塞状態で収納する区画されたキャリア手段を
含み、該抗体と特異的に反応するプローブを含む容器を
含む前記ｃ−ＪｕｎＮ−末端キナーゼ検出用キット。
【請求項４３】前記プローブが抗体である、請求項４
２記載のキット。
【請求項４４】前記抗体が検出できるように標識され
ている、請求項４３記載のキット。