CN104189884A - Urantide的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及及医药和生物技术领域，具体为Urantide的应用。本发明以健康雄性Wistar大鼠为研究对象，建立AS模型，通过一系列实验证实了Urantide可使动脉壁内的胶原蛋白降解加速，血清中的胶原蛋白以HYP形式随尿液排出体外，大鼠AS症状缓解；Urantide可下调炎症介质CRP及MCP-1的表达，并上调IL-6及TGF-β的表达，对动脉炎症损伤有抑制作用；Urantide可改善大鼠胸主动脉AS病变程度，并下调胸主动脉U II及其受体GPR14基因和蛋白的表达水平，对AS大鼠胸主动脉有抗损伤作用。

Description

Urantide的应用

技术领域

本发明涉及医药和生物技术领域，具体涉及Urantide的应用。

背景技术

随着化学和生命科学的进步，近年来多肽类药物的研发和上市出现了逐步加速的趋势，与小分子化学药相比，多肽类药物往往具有更为安全、副作用小，很少引起严重的免疫反应的优势。Urantide是在h U II基础上衍生的肽类U II受体拮抗剂，目前被认为是最有效的肽类U II受体拮抗剂，其拮抗效应较其它化合物高50～100倍。随着对特异性、高亲和力的U II受体拮抗剂Urantide研发的深入，Urantide在心血管系统疾病，尤其是AS的病理生理作用将得到进一步的阐明，同时Urantide作为临床治疗AS药物亦展现出广泛的应用前景。。

发明内容

本发明旨在将Urantide用于加速动脉壁内的胶原蛋白降解，使血清中的胶原蛋白以HYP形式随尿液排出体外。

本发明还将Urantide用于下调炎症介质CRP及MCP-1的表达，并上调IL-6及TGF-β的表达，抑制动脉炎症损伤。

本发明还将Urantide用于改善胸主动脉AS病变程度，并下调胸主动脉U II及其受体GPR14基因和蛋白的表达水平。

本发明以健康雄性Wistar大鼠为研究对象，建立AS模型，研究AS大鼠胸主动脉及AS病变细胞中U II及其受体GPR14的变化，探讨了Urantide对大鼠AS的作用及其作用下U II、GPR14、炎症因子和胶原代谢的变化规律，

结果显示：

(1)Urantide可使动脉壁内的胶原蛋白降解加速，血清中的胶原蛋白以HYP形式随尿液排出体外，大鼠AS症状缓解；

(2)Urantide可下调炎症介质CRP及MCP-1的表达，并上调IL-6及TGF-β的表达，对动脉炎症损伤有抑制作用；

(3)Urantide可改善大鼠胸主动脉AS病变程度，并下调胸主动脉U II及其受体GPR14基因和蛋白的表达水平，对AS大鼠胸主动脉有抗损伤作用。

本发明通过一系列实验证实了U II与其受体GPR14结合后可促进AS的发生，而U II受体特异性拮抗剂Urantide则可减轻AS炎症反应，减少ECM积聚增加，改善AS症状，阐明Urantide抑制AS发生、发展的具体机制，为临床应用Urantide防治AS提供了依据。

附图说明

图1为Urantide对动脉粥样硬化大鼠肝系数的影响图。

图2为Urantide对动脉粥样硬化大鼠胸主动脉U II表达的影响图

A：正常对照组；B：AS模型对照组；C：阳性药对照组；D-F分别为Urantide给药3d、7d及14d组(DAB，×200)

图3为Urantide对动脉粥样硬化大鼠胸主动脉GPR14表达的影响图

A：正常对照组；B：AS模型对照组；C：阳性药对照组；D-F分别为Urantide给药3d、7d及14d组(DAB，×200)

图4为Urantide对动脉粥样硬化大鼠胸主动脉U II及GPR14mRNA表达的影响图。

其中，*P＜0.05，**P＜0.01vs NC group；^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01vs ASgroup

图5为Urantide对动脉粥样硬化大鼠胸主动脉U II及GPR14蛋白表达的影响图

其中，*P＜0.05，**P＜0.01vs NC group；^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01vs ASgroup

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本具体实施以健康雄性Wistar大鼠为研究对象，从体内和体外两方面研究Urantide对NF-κ B炎症通路相关信号分子蛋白及基因表达的抑制作用及其作用机制。

实施例1

S1、配制高脂饲料：基础饲料、3.5％胆固醇、10％猪油、0.2％丙基硫氧嘧啶、0.5％胆酸钠及5％白糖。

S2、将健康雄性Wistar大鼠，随机分为3组：正常组，饲以普通饲料；高脂组，饲以高脂饲料；AS模型组，实验开始时在饲以高脂饲料基础上，每只大鼠给予腹腔注射VD₃70U/kg(分3次注射)。所有实验动物均为单笼饲养，自由饮水，每周称取体重。实验周期为4周。

S3、使用全自动生化分析仪检测大鼠血清中的TC、TG、HDL、LDL、Ca²⁺的含量；羟脯氨酸测试盒测定血清、尿中HYP含量；U II和GPR14试剂盒检测血尿中U II及其受体GPR14含量。

S4、大鼠胸主动脉用10％甲醛固定，石蜡包埋，4μm厚的切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，常规HE染色。应用链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶法检测各组大鼠胸主动脉U II及其受体GPR14的表达情况，以及与AS炎症通路有关的信号分子、炎症因子和胶原的表达情况。

S5、采用贴块法进行VSMC及内皮细胞的原代培养。常规HE染色，光学显微镜下进行形态学观察。细胞鉴定采用免疫化学染色S-ABC法，按试剂盒操作说明进行，一抗为α-SMA和VIII因子抗体，按1∶100比例稀释，新鲜配置的DAB显色液，室温下显色约为3～5min，复染，封片。光学显微镜100倍视野下观察计数阳性细胞，计算阳性细胞数的百分比。

S6、高脂血清制备：复制AS动物模型4周时，部分AS模型组大鼠用戊巴比妥(30mg/kg体重)腹腔麻醉，分离胸主动脉，在肾动脉分叉处下方剪开胸主动脉，用5mL注射器采集动脉血，用3000r/min离心15min，分离出血清，过滤灭菌，-20℃保存备用。

S7、Ox-LDL的制备：ox-LDL在氧化前，LDL先用无EDTA的PBS液透析24小时，以除去EDTA；再将LDL在含10μmol/LCuSO4的PBS中，于37℃氧化12h，后于4℃，在含100mg/LEDTA的PBS中透析，每8h换液一次，透析24h；最后过滤除菌，4℃保存。

S8、将细胞接种及同步化后，换含高脂血清和ox-LDL的培养液，培养48～72h，终止培养，结晶紫染色观察细胞增殖情况，制备扫描电镜照片，电镜下观察细胞超微结构改变，如可见细胞浆内含大量脂滴，细胞器丰富，呈增殖旺盛状态，则表明成功的复制AS细胞模型。

S9、选对数生长期的细胞，0.25％胰蛋白酶消化制成单个细胞悬液，计数并稀释至终浓度为1×10³，接种96孔板，10％胎牛血清的DMEM培养液培养24h。各实验组处理时间分别为8h、12h、24h、48h、72h，每个时间段采用MTT法进行增殖曲线测定。

S10、按照流式细胞仪使用说明进行检测。各实验组在培养48h后，0.25％胰酶消化收集细胞(1×10⁶个/mL)，PBS洗涤，经70％冷乙醇固定过夜，离心沉淀，加入PI工作液，4℃避光反应30min，上机检测不同周期分布的细胞，Modfit LT 3.0分析。

S11、对数生长期细胞用0.25％胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，调整细胞密度约为1×10⁴个/mL接种至24孔板。待细胞80％融合后，加入含0.5％血清培养基同步生长24h后，分别加入条件培养液，于48h收集培养上清，用ELISA法检测上清中信号分子、炎症因子及ECM的含量。

S12、根据目的基因序列设计特异性的引物和荧光探针；提取DNA/RNA，紫外分光光度计检测其完整性和浓度，反转录酶将RNA反转录为cDNA；引物预实验，筛选出特异性最强的引物；荧光定量PCR，采用双标准曲线法，结合内参与目的基因的CT值，进行实验结果分析。

S13、采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到硝酸纤维素薄膜上，硝酸纤维素薄膜以非共价键形式吸附蛋白质。以硝酸纤维素薄膜上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)及电喷雾质谱法(ESI-MS)检测合成的Urantide纯度和分子结构。

RP-HPLC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80％左右。工作原理：用非极性的十八烷基键合固定相，化学键合固定相是在薄壳型或全多孔硅胶微粒上，通过化学反应把有机分子键合到无机担体表面，其优点是固定相表面更加均匀一致，能灵活的改变吸附剂表面性质，提高选择性，增强稳定性，延长柱的寿命；再加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂作为流动相(极性流动相)，用以分离非极性或极性小的化合物。RP-HPLC法对合成的Urantide进行检测肽纯度(Peptide Purity)＞95％。

这种ESI-MS具有很高灵敏度，且电离的分子可以带有多电荷，这种多电荷离子的产生大大扩展了普通质谱仪能分析的质量范围，使质谱仪可以分析分子量为几十万质量单位的蛋白质分子。工作原理：ESI-MS是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。ESI-MS对合成的Urantide进行检测Expected MS为1388.60。

动脉壁钙化和动脉壁上的脂质沉积是AS最显著的特征。本实验拟建立一种实验周期短、病变重的AS模型复制的新方法。高脂饲料配制方法，在传统的高脂饲料中添加了丙基硫氧嘧啶、胆酸钠及白糖，目的是抑制甲状腺功能、促进胆固醇吸收，同时能克服丙基硫氧嘧啶的苦味并促进大鼠的血糖的升高；更重要的是通过腹腔注射VD370 U/kg体重作为钙离子诱导剂，引起动脉钙超负荷。胸主动脉HE染色结果发现，正常组血管内皮完整，中膜可见梭形平滑肌细胞，弹力纤维层结构清晰完整；模型组病变部位内膜明显增厚，血管内皮细胞排列不完整，平滑肌细胞在内膜增生显著，大量堆积的泡沫细胞，出现典型AS病理改变。

本实验室所构建的AS模型与以往的模型相比，具有实验周期短、动物存活率高及模型稳定性高的优点。

AS模型复制成功后，模型组再随机分3组：AS模型组(AS group)、阳性药组(氟伐他汀Flu group)、Urantide组。正常组和AS模型组每日尾静脉注射生理盐水30μg·kg-1，连续14d；阳性药组每日灌胃给予Flu 5μg·kg-1，连续14d；Urantide组，每日尾静脉注射Urantide 30μg·kg-1，给药时间分别为3d、7d和14d。

尿标本的采集：实验结束时收集大鼠24h尿液，留尿期间禁食，不禁水，将大鼠放入金属代谢笼内，收集、记录尿量后留取3mL，1 500r/min离心10min。去除沉渣，分装于Eppendorf管中，-20℃冰箱保存备用。

血标本的采集：实验结束时，各组动物禁食过夜，大鼠用戊巴比妥(30mg/kg体重)腹腔麻醉后，分离胸主动脉，用5mL注射器采集动脉血，用3 000r/min离心15min，吸取血清分装于Eppendorf管中，-20℃冰箱保存备用。

胸主动脉标本的采集：大鼠取血后，取胸主动脉约为1cm，一部分分装入标本袋，立即放入液氮中速冻，而后-80℃保存备用；另一部分则用4％多聚甲醛固定，留做组织学检测之用。

肝脏标本采集：大鼠取血后，立即摘取肝脏，生理盐水洗去血迹后称重，计算肝系数(肝系数＝肝脏重量/体重)。而后用4％多聚甲醛固定，留做形态学检测之用。

各组大鼠在实验前体重及一般状态无明显差异。实验结束时，正常组大鼠精神状态良好，皮毛有光泽，活泼好动，体重随饲养时间的增加而增长；AS模型组大鼠皮毛色泽暗淡，活动减少，精神状态较差，食欲降低，与正常组比较体重明显减少(P＜0.01)；给药前，各给药组大鼠体重与AS模型组比较无统计学意义；给药后，各给药组与AS模型组比较大鼠体重有不同程度的增加，Urantide给药组大鼠体重的增加与阳性药组近似，各给药组大鼠的精神状态及食欲均有所改善，具体结果如表1所示。

表1 Urantide对动脉粥样硬化大鼠体质量的影响

其中，**P＜0.01vs NC group；^ΔΔP＜0.01vs AS group

全自动生化分析仪检测大鼠血清中的TG、TC、HDL、LDL和Ca2+的含量。具体结果如表2所示，AS模型组血清中Ca2+、TG、TC、HDL及LDL含量与正常组比较均明显升高，具有统计学意义(P＜0.01)；阳性药组与AS模型组相比，血清中Ca2+、TG、TC、HDL及LDL含量均明显降低(P＜0.01)；Urantide组在给药后，血清中各项指标均随给药时间的延长呈现逐渐降低的趋势，达到或接近阳性药组的水平。

表2 Urantide对动脉粥样硬化大鼠血清生化指标的影响

其中，**P＜0.01vs NC group；^ΔΔP＜0.01vs AS group

动脉壁内胶原蛋白的合成、分泌及降解是一种动态平衡过程。任何因素刺激动脉壁合成和分泌胶原蛋白的速率超过降解，胶原蛋白就会在动脉内沉积下来参与AS的发生、发展。HYP为胶原纤维所特有，在胶原蛋白中占13.4％，因此测定HYP的含量，可反映结缔组织疾病的胶原代谢情况。本实验利用HYP测试盒检测各组大鼠血清及尿液中HYP含量，结果发现，Urantide各给药组血清中HYP含量血清中HYP含量降低接近于阳性药组；而尿液中HYP的含量较AS模型组有明显增加(P＜0.01)。由此我们推测，随Urantide给药时间的增加，Urantide使动脉壁内的胶原蛋白降解加速，血清中的胶原蛋白以HYP形式随尿液排出体外，大鼠AS症状缓解。具体结果如表3所示。

表3 Urantide对AS大鼠羟脯氨酸表达的影响

其中，*P＜0.05，**P＜0.01vs NC group；^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01vs AS group

肝脏是脂肪代谢的重要场所，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)时由于血脂水平明显升高，超过了肝脏的代谢能力，使其功能和结构受损而致脂肪肝的出现。Schwimmer等认为脂肪肝不仅仅是AS的检测指标，而且还是AS早期调节因子，促进AS的发生发展。Urantide是在h U II基础上衍生的肽类UII受体拮抗剂，本实验室大量的研究证实Urantide对AS大鼠有一定的保护作用，那么urantide对AS大鼠的肝脏是否也具有保护作用呢？结果显示Urantide可降低肝系数减轻大鼠的肝细胞的脂肪变性。由此证实了我们的假设，Urantide通过对肝脏脂肪变性的抑制作用，减轻了肝损伤后AS致病因子的释放，缓解大鼠的AS病变症状。

AS模型组与正常组相比，肝系数明显增加(P＜0.01)；Urantide组及阳性药组肝系数较AS模型组明显减少(P＜0.01)；但各给药组组间比较无统计学意义，具体结果如图1所示

肝形态学检测结果判定标准按肝脏变性细胞或泡沫细胞的数量分以下4级：(1)I级；正常肝细胞；(2)II级(轻度)：变性细胞或泡沫细胞数＜25％；(3)III级(中度)：变性细胞或泡沫细胞数≥25％(＜50％)；(4)IV级(重度)：变性细胞或泡沫细胞数≥50％。正常组大鼠肝脏形态规则，边缘锐利，色红有光泽；HE染色切片观察，肝细胞排列正常，细胞核大而圆、居中，胞浆中无泡沫细胞，无炎症细胞浸润，为I级。AS模型组和各给药组大鼠肝脏体积较正常组有不同程度的增大，包膜紧张，边缘较钝，质地略软，切面均呈淡黄色而稍隆起，包膜外翻，触之油腻感；镜下AS模型组肝细胞内泡沫细胞大而多，散布在整个胞浆中，肝细胞出现重度的脂肪变性和大量的炎症细胞浸润，脂肪变性细胞数≥50％，为IV级(重度)脂肪变性；而阳性药组肝细胞内泡沫细胞较AS模型组数量减少，且大小不等，多分布在核的周围，变形细胞数≥25％(＜50％)，为III级(中度)脂肪变性；Urantide组给药3d时与AS模型组相比，脂肪变性减轻，但与阳性药组相比脂肪变性减轻不明显，变性细胞数≥25％(＜50％)，为III级(中度)脂肪变性；Urantide组给药7d和14d时与模型组相比，脂肪变性进一步减轻，接近与阳性药组，变形细胞数≥25％(＜50％)，为III级(中度)脂肪变性。

本实验采用S-ABC法进行免疫组化染色，每张切片随机选取10个高倍镜视野(×400)，用Introduction to Image-Proplus 6.0病理图像分析软件对所选视野内的免疫组化阳性信号进行图像分析，计算各组大鼠胸主动脉阳性信号的平均光密度值(A)。结果显示，U II在AS中能促进CRP、MCP-1、IL-6及TGF-β的表达，而Urantide对炎症因子CRP、MCP-1的表达有下调作用，对炎症因子IL-6及TGF-β的表达则有上调作用(P＜0.01或P＜0.05)。强调的是IL-6虽然是致炎因子，但是它在本实验中与TGF-β一样在AS中表现抗炎性。炎症反应贯穿于AS发生和发展的整个过程，是AS的重要病理机制之一。本研究证实，U II与AS的发生、发展有密切关系，在AS过程中U II对动脉炎症损伤起到一定促进作用；而U II受体拮抗剂Urantide对动脉炎症损伤则有抑制作用，改善AS症状。具体结果如柱形如表4所示。

表4 Urantide对动脉粥样硬化大鼠胸主动脉炎症因子表达的影响(A，n＝3)

其中，**P＜0.01vs NC group；^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01vs AS group

有文献报道，在正常大鼠胸主动脉组织中，U II及受体GPR14主要分布于血管外膜，在血管内膜及中膜有微量表达，但在人的冠状AS斑块以及脂质沉积的平滑肌细胞和巨噬细胞丰富的区域含有大量的U II。本实验免疫组化结果显示，正常组大鼠胸主动脉内膜及中膜U II及GPR14阳性颗粒微量表达，在AS组胸主动脉斑块内可见大量的U II及GPR14阳性颗粒表达；Urantide组U II及受体GPR14阳性染色强度和范围较AS组减少。RT-PCR和Western blot结果也表明，AS组胸主动脉中U II及受体GPR14基因和蛋白的表达也增多，这一结果与文献报道相一致。提示U II可能直接或间接的参与AS的发生、发展。RT-PCR及Western blot结果还进一步证实，Urantide随给药时间的增加，逐渐减少U II及GPR14基因和蛋白表达。说明Urantide对大鼠AS有一定的保护作用。Urantide的作用机制可能是通过拮抗U II及其受体GPR14结合得以实现的。光学显微镜下观察，正常组大鼠胸主动脉内膜、中膜和外膜分界清楚，血管内皮完整，中膜可见梭形平滑肌细胞，弹力纤维层结构清晰完整，呈环行排列，外膜为疏松结缔组织。AS组大鼠胸主动脉内膜下出现明显的钙化、炎细胞浸润、VSMC增生及泡沫样细胞，弹力纤维发生变性、断裂和崩解，中膜萎缩，为典型AS病理变化；阳性药组大鼠胸主动脉中膜未见钙化，仅见少量炎细胞浸润、VSMC轻度增生及少量泡沫样细胞，AS病理改变较AS组有所减轻；Urantide组随给药时间的增加，AS病理改变逐渐减轻，给药14d时大鼠胸主动脉的AS病理改变接近阳性药。

S-ABC免疫组化染色结果发现，(1)正常组大鼠在胸主动脉在内膜及中膜内U II阳性颗粒微量表达；AS组大鼠胸主动脉内膜明显增厚，大量U II阳性颗粒在内膜及中膜斑块表达；阳性药组与AS组比较，U II阳性颗粒减少，染色减弱(P＜0.01)；Urantide组与AS组比较，阳性染色的强度和范围明显减少(P＜0.01)，给药14d时减少最明显，优于阳性药组。具体结果如图3所示。

正常组大鼠在胸主动脉在内膜及中膜内GPR14阳性颗粒微量表达；AS组与正常组比较，GPR14阳性颗粒在胸主动脉内膜及中膜斑块内的表达增加，染色增强；阳性药组与AS组比较，胸主动脉AS斑块内GPR14阳性颗粒减少(P＜0.01)；Urantide阳性染色的强度和范围随给药时间的延长而逐渐减少，且给药14d时GPR14阳性染色强度接近阳性药组。具体结果如图4所示。

RT-PCR结果显示，AS组与正常组相比，大鼠胸主动脉U II及GPR14mRNA表达增加(P＜0.01)。Urantide各实验组及阳性药组与AS组相比，均可下调U II及GPR14mRNA的表达水平(P＜0.01)。其中，Urantide各实验组的U II及GPR14mRNA表达量随给药时间的延长而逐渐减少，以给药14d时减少最明显。具体结果如图4所示.

Western blot结果显示，AS组大鼠U II及GPR14蛋白表达与正常组比较，明显增加(P＜0.01)；Urantide组与AS组比较，U II及GPR14蛋白表达均减少(P＜0.01或P＜0.05)，以给药14d时减少最明显。具体结果如图5所示。

结论：Urantide不但可减轻AS大鼠肝脏系数和脂肪变性；而且还可改善胸主动脉AS病变，减少U II及其受体GPR14基因和蛋白的表达水平，下调炎症介质CRP及MCP-1的表达，并上调IL-6及TGF-β的表达，证明了Urantide可抑制大鼠AS的发生、发展，为临床应用Urantide治疗AS提供了理论基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.Urantide用于加速动脉壁内的胶原蛋白降解，使血清中的胶原蛋白以HYP形式随尿液排出体外。

2.Urantide用于下调炎症介质CRP及MCP-1的表达，并上调IL-6及TGF-β的表达，抑制动脉炎症损伤。

3.Urantide用于改善胸主动脉AS病变程度，并下调胸主动脉U II及其受体GPR14基因和蛋白的表达水平。