CN109516903A

CN109516903A - 一类用于治疗肝损伤的茋类化合物、其制备方法及其应用

Info

Publication number: CN109516903A
Application number: CN201710845511.7A
Authority: CN
Inventors: 戴荣继; 高梦旦; 刘青青; 王慧婷; 吕芳; 刘秀洁; 邓玉林
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2017-09-19
Filing date: 2017-09-19
Publication date: 2019-03-26

Abstract

本发明提供一种用于治疗肝损伤的茋类化合物、其制备方法及其应用。所述茋类化合物从天然产物百样解中分离提取，或者人工合成获得。经验证其具有治疗肝纤维化的作用。

Description

一类用于治疗肝损伤的茋类化合物、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及医药化学领域，具体地说，涉及一种用于治疗肝损伤的茋类化合物及其衍生物、其制备方法及其应用。

背景技术

保肝I号为西双版纳州傣医院院内复方制剂，由十大功劳、竹叶兰、山楂、五味子、丹参、龙胆和柴胡等方组成，具有清热解毒、保肝利胆、增强免疫力、抗炎抗氧化等功效。目前临床主要将其应用于肝纤维化、慢性乙型肝炎和肝硬化的治疗。对保肝I号的研究工作包括：保肝I号半成品的水提工艺放大研究及半成品质量控制标准的制定，包括水分控制、薄层鉴别(TLC)及含量测定(HPLC)方法的建立及方法学考察；“保肝I号”颗粒剂工艺研究，水分控制及薄层鉴别(TLC)方法的建立；保肝I号水提物特征图谱的建立及特征峰药材归属研究；保肝I号中的主药配伍合理性的研究。药效学研究表明在卡介苗加脂多糖致小鼠免疫性肝损伤模型中保肝Ⅰ号能显著降低血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活力和肝脏指数(HI)，在刀豆蛋白A(ConA)致小鼠免疫性急性肝损伤模型能显著降低AST，ALT，TNF-α的活力，在CCl₄复合因素致肝纤维化模型中能显著降低AST、ALT，升高羟脯氨酸(Hyp)和白蛋白(Alb)含量^[21]，对四氯化碳/二甲基亚硝胺所致大鼠急/慢性肝损伤模型均有保护作用,其含药血清可显著抑制HSC增殖并下调TGF-β表达^[22]。保肝Ⅰ号能减轻各模型动物肝脏病变，对急慢性肝损伤具有较好的保护作用。

目前尚无FDA批准上市的抗肝纤维化药物，因此从肝纤维化发生的机制出发，寻找具有治疗肝纤维化可能的相关的靶点，对逆转和控制肝纤维化病理进程至关重要。近年来，化学药物因为疗效不够稳定，对肝脏细胞损伤较大，副作用大，所以应用于临床非常少。天然产物在治疗肝纤维化中更具有优势。

肝纤维化是继发于各种慢性肝损伤(如病毒性肝炎、酒精性肝病、某些代谢性疾病、药物及化学毒物损伤及肝寄生虫病等)之后组织修复过程中的代偿反应，也是所有慢性肝病的共同病理过程，其终末阶段将发展为肝硬化、门脉高压、肝衰竭及肝细胞癌。世界范围内每年因肝纤维化等慢性肝病致死人数众多，我国也有相当数量的人口可能因携带乙肝、丙型肝炎病毒而发展为肝纤维化及肝硬化，防治肝纤维化已成为世界范围内亟待解决的重大医学问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有治疗肝纤维化活性的茋类化合物及其衍生物。

本发明的另一目的是提供上述化合物的制备方法。

本发明的再一目的是提供上述化合物的用途，所述用途为在制备用于抗肝纤维化的药物中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种具有治疗肝纤维化活性的茋类化合物，所述茋类化合物分别为：

其中，R1为H、OBn、对羟基苄基或异戊烯基，R2为OH、OCH₃、OBn、H、对羟基苄基或异戊烯基，R3、R4、R5、R7分别为H、OCH₃或OH，R6为OH或OCH₃，R8为H。

优选，通式(Ⅰ)中所述茋类化合物为：

所述茋类化合物为：

其中，R1、R3分别为H、OH或OCH₃，R2为OH、OCH₃，R4为H，R5-R7分别为H或OCH₃。

优选的，所述茋类化合物为：

其中，如下10个化合物采用从天然产物百样解中分离提取而成。

化合物1：7-羟基-2,4-二甲氧基-9,10-二氢菲

化合物2：4,7-二羟基-2-甲氧基-9,10-二氢菲

化合物3：2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲

化合物4：3,3′-二羟基-5-甲氧基-联苄

化合物5：7-羟基-2，8-二甲氧基-菲-1,4-二酮

化合物6：7-羟基-2，10-二甲氧基-菲-1,4-二酮

化合物7：7-羟基-2-甲氧基-9,10-二氢菲-1,4-二酮

化合物8：7-羟基-2-甲氧基-菲-1,4-二酮

化合物9：1-(对-羟基苄基)-7-羟基-2,4-二甲氧基-9,10-二氢菲

化合物10：4,7-二羟基-1-(对-羟基苄基)-2-甲氧基-9,10-二氢菲

本发明所述茋类化合物从天然产物百样解中分离的具体过程如下：

1)取百样解干燥茎粉碎成粗粉，用8-10倍量80％乙醇加热回流提取3-4次，每次1-2h，醇提液过滤、合并，减压浓缩至浸膏状；

2)浸膏加水混悬后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取，各萃取部分分别旋转蒸发至干；

3)对乙酸乙酯萃取部分进行硅胶柱色谱分离，通过石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱将乙酸乙酯部分分为石油醚：乙酸乙酯＝6：1、石油醚：乙酸乙酯＝5：1、石油醚：乙酸乙酯＝4：1、石油醚：乙酸乙酯＝3：1、石油醚：乙酸乙酯＝2：1、石油醚：乙酸乙酯＝1：1、乙酸乙酯、甲醇共8个洗脱部分，对石油醚：乙酸乙酯＝5:1、3:1、2:1、1:1洗脱部分进行进一步分离纯化；

4)采用开放ODS柱色谱对5:1洗脱部分以甲醇：水＝80:20进行等度洗脱，得到单体化合物1；

5)通过反向半制备型液相色谱分别以流动相比例甲醇：水＝70：30、60：40等度洗脱3：1、2：1部分，制得单体化合物2-10。

经验证，本发明所述的茋类化合物在制备用于治疗肝损伤药物中的应用。优选为用于治疗肝纤维化。

同时将上述从百样解中分离得到茋类化合物通过化学合成的方法进行基团的修饰和改造，并经试验验证，该茋类化合物也具有抗肝纤维化活性。

附图说明

图1为本发明百样解分离流程图；

图2为百样解各提取部分抑制HSC增殖IC₅₀；

图3为百样解中茋类化合物1-10抑制HSC增殖IC₅₀；

图4为化合物1-10对HSC的TGF-β1分泌影响(ng/L)；

图5为化合物1-10对HSC的TNF-α分泌影响(ng/L)；

图6为化合物1-10对HSC的MMP-9分泌影响(ng/L)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1从百样解提取

取百样解干燥茎8kg粉碎成粗粉，用10倍量80％乙醇加热回流提取3次，每次2h，醇提液过滤、合并，减压浓缩至浸膏状并称重。浸膏加水混悬后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取，各萃取部分分别旋转蒸发至干并称重。对乙酸乙酯萃取部分进行硅胶柱色谱分离，通过石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱将乙酸乙酯部分分为石油醚：乙酸乙酯＝6：1、石油醚：乙酸乙酯＝5：1、石油醚：乙酸乙酯＝4：1、石油醚：乙酸乙酯＝3：1、石油醚：乙酸乙酯＝2：1、石油醚：乙酸乙酯＝1：1、乙酸乙酯、甲醇共8个洗脱部分，对石油醚：乙酸乙酯＝5:1、3:1、2:1、1:1洗脱部分进行进一步分离纯化。采用开放ODS柱色谱对5:1洗脱部分以甲醇：水＝80:20进行等度洗脱，得到单体化合物1；通过反向半制备型液相色谱分别以流动相比例甲醇：水＝70：30、60：40等度洗脱3：1、2：1部分，制得单体化合物2-10。

化合物结构式的验证

化合物1：7-羟基-2,4-二甲氧基-9,10-二氢菲

无色菱形晶体，高效GF254薄层板上于365nm下观察呈暗紫色，喷FeCl₃溶液显蓝色，喷磷钼酸溶液显深蓝色。

ESI-MS(Neg.)(m/z)显示准分子离子峰255.1053[M-H]^-。¹H-NMR谱中化学位移值δ:8.11(1H,d,J＝8.5Hz),6.74(1H,dd,J＝8.5,2.5Hz)和6.71(1H,J＝2.5Hz)为苯环ABX耦合系统的质子信号，归属为H-5,H-6和H-8；6.45(1H,d,J＝2.5Hz)和6.41(1H,d,J＝2.5Hz)为另外一个芳香环上间位偶合的质子信号，归属为H-1和H-3；3.87(3H,s)和3.84(3H,s)为2个甲氧基上的质子信号；2.72(2H,m)和2.73(2H,m)为9,10位的两组亚甲基质子信号。

化合物2：4,7-二羟基-2-甲氧基-9,10-二氢菲

粉红色粉末，GF254薄层板上于365nm紫外下观察呈暗紫色，喷FeCl3溶液显蓝色，喷磷钼酸溶液显深蓝色。

ESI-MS(Neg.)(m/z)显示准分子离子峰241.0912[M-H]^-。¹H-NMR谱显示δ:8.10(1H,d,J＝9.5Hz),6.73(1H,d,J＝2.5Hz),6.70(1H,dd,J＝9.5Hz,2.5Hz)为典型ABX耦合系统的质子谱图特征，归属为H-5,H-8和H-6；6.42(1H,d,J＝2.5Hz)和6.35(1H,d,J＝2.5Hz)为另外一个芳香环上的一对间位偶合质子信号，归属为H-3和H-1；3.85(3H,s)为甲氧基的质子信号；2.70(4H,s)为9,10位的两组亚甲基质子信号。

化合物3：2,7-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲

白色长方状结晶，GF254薄层板上于365nm紫外下呈暗紫色，喷FeCl₃溶液显蓝色，喷磷钼酸溶液显深蓝色。

ESI-MS(Neg.)(m/z)显示241.0897[M-H]^-。¹H-NMR谱显示δ:7.94(1H,d,J＝9.5Hz),6.76(1H,dd,J＝9.5Hz,2.5Hz)和6.75(1H,d,J＝2.5Hz)为苯环ABX耦合系统的质子谱图特征，归属为H-5,H-6和H-8；6.42(1H,d,J＝2.5Hz,H-3)和6.36(1H,d,J＝2.5Hz,H-1)为另外一个芳香环上间位偶合的质子信号，归属为H-1和H-3；3.80(3H,s)为甲氧基上的质子信号；2.96(2H,m)和2.89(2H,m)为联苄上9,10位的两组亚甲基质子信号。

化合物4：3,3′-二羟基-5-甲氧基-联苄

白色针晶，GF₂₅₄薄层板上365nm紫外下观察呈暗紫色，磷钼酸溶液显深蓝色。

ESI-MS(Neg.)(m/z)显示243.1046[M-H]^-。¹H-NMR谱显示δ:8.16(2H,s)为两个酚羟基质子信号；7.09(1H,t,J＝9.5Hz),6.68(2H,t,J＝2.5Hz),δ6.65(1H,dd,J＝9.5Hz,2.5Hz)说明三个氢原子处于邻位，即3’-H，4’-H，5’-H；6.72(1H,重叠)归属为2’-H，δ6.34(1H,m,重叠)，6.32(1H,m,重叠)和6.25(1H,t,J＝2.8Hz)为另外一个芳香环上处于间位的3个芳香质子。δ3.72(3H,s)为甲氧基上的质子信号；2.80(4H，m)为联苄上的两组亚甲基质子信号。

化合物5：7-羟基-2，8-二甲氧基-菲-1,4-二酮

橘红色粉末，易溶于丙酮及二甲基亚砜。

ESI-MS(Neg.)(m/z)显示准分子离子峰283.0644[M-H]^-。¹H-NMR谱显示δ:6.19(1H,s)孤立的芳香质子信号归属为H-3；9.20(1H,d,J＝9.5Hz),7.33(1H,d,J＝9.5Hz)为AB偶合系统，质子分别归属为H-5,H-6；8.34(1H,d,J＝9.0Hz),8.08(1H,d,J＝9.0Hz)为AB偶合系统，质子分别归属为H-9,H-10；3.91(3H,s)和3.90(3H,s)为两个甲氧基上的质子信号。结合文献与百样解中茋类化合物的生源途径初步确定化合物结构如上。

化合物6：7-羟基-2,10-二甲氧基-菲-1,4-二酮

橘红色粉末，易溶于丙酮及二甲基亚砜。

ESI-MS(Neg.)(m/z)显示准分子离子峰283.0645[M-H]^-。¹H-NMR谱显示δ:7.44(1H,s)孤立的芳香质子信号归属为H-9；9.40(1H,d,J＝9.5Hz),7.24(1H,dd,J＝9.5Hz,2.7Hz),7.53(1H,d,J＝2.7Hz)为ABX偶合系统，三个质子分别归属为H-5，H-6和H-8；6.08(1H,s)为孤立的芳香质子信号，归属为H-3；3.91(3H,s),3.89(3H,s)为甲氧基上的质子信号。结合文献与百样解中茋类化合物的生源途径初步确定化合物结构如上。

化合物7：7-羟基-2-甲氧基-9,10-二氢菲-1,4-二酮

深红色粉末，易溶于丙酮及二甲基亚砜。

GF254薄层板上365nm紫外下观察呈暗紫色，磷钼酸溶液显深蓝色，ESI-MS(Neg.)(m/z)显示255.0704[M-H]^-。¹H-NMR谱显示δ:7.90(1H,d,J＝9.4Hz),6.69(1H,dd,J＝9.4Hz,2.5Hz),6.68(1H,d,J＝2.5Hz)为ABX系统偶合，三个质子分别归属为H-5,H-6和H-8；5.98(1H,s)为孤立的芳香氢质子，归属为H-3。3.84(3H,s)为2-甲氧基质子信号；2.72(1H,m)和2.62(1H,m)归属为联苄上的两组亚甲基质子信号(H-9,H-10)。

化合物8：7-羟基-2-甲氧基-菲-1,4-二酮

橘红色粉末，易溶于丙酮及二甲基亚砜。

ESI-MS(Neg.)(m/z)显示准分子离子峰253.0547[M-H]^-。¹H-NMR谱显示δ:8.03(1H,d,J＝8.6Hz),7.94(1H,d,J＝8.6Hz)为AB偶合系统，分别归属为H-9和H-10；9.41(1H,d,J＝9.5Hz),7.26(1H,dd,J＝9.5Hz,2.6Hz),7.15(1H,d,J＝2.6Hz)为ABX偶合系统，三个质子分别归属为H-5,H-6和H-8；6.18(1H,s)为孤立的芳香质子信号，归属为H-3；3.91(3H,s)为甲氧基上的质子信号。

化合物9：7-羟基-1-(对-羟基苄基)-2,4-二甲氧基-9,10-二氢菲

粉红色针晶,GF254薄层板上于365nm下观察呈暗紫色，喷FeCl₃溶液显蓝色，喷磷钼酸溶液显深蓝色。

ESI-MS(Neg.)(m/z)显示361.1478[M-H]^-(C₂₃H₂₂O₄)。¹H-NMR谱中化学位移值δ:6.88(2H,d,J＝8.5Hz)和6.64(2H,d,J＝8.5Hz)为A₂B₂系统的质子谱图特征，归属为2’(6’)及3’(5’)位质子；6.62(1H，s)为一孤立的芳香氢质子信号；8.00(1H,d,J＝8.5Hz),6.61(1H,m,重叠)和6.60(1H,m,重叠)为ABX系统的芳香质子谱图特征，归属为H-5,H-8和H-6；3.93(2H,s)为α位的亚甲基质子信号；3.88(3H,s)和3.84(3H,s)为2个甲氧基质子信号；2.58(2H，m)和2.50(2H，m)为联苄上的两组亚甲基质子信号。

化合物10：4,7-二羟基-1-(对-羟基苄基)-2-甲氧基-9,10-二氢菲

棕黄色晶体，GF254薄层板上于365nm下呈暗紫色，喷FeCl3溶液显蓝色，喷磷钼酸溶液显深蓝色。

ESI-MS(Neg.)(m/z)显示347.1324[M-H]^-，¹H-NMR谱中显示δ:6.94(2H,d,J＝8.5Hz)和6.64(2H,d,J＝8.5Hz)为A₂B₂系统的质子特征，归属为对位取代的芳香质子信号；6.51(1H,s)为一孤立的芳香氢质子信号，归属为H-3；7.96(1H,d,J＝8.3Hz),6.61(1H,m,重叠)和6.59(1H,m,重叠)为ABX系统的质子特征，归属为H-5,H-6和H-8；3.94(2H,s)为连接两个苯环的亚甲基质子信号；3.82(3H,s)为甲氧基上的质子信号；2.54(2H,m)和2.49(2H,m)为联苄上的两组亚甲基质子信号。

实施例2

由于从百样解中分离得到茋类化合物操作复杂且含量少，不能进行基团的修饰和改造，所以将采用化学合成的方法以菲类化合物为母核合成了一系列茋类化合物，并经试验验证，该类化合物也具有抗肝纤维化活性。

合成一系列茋类化合物

优选，通式(Ⅰ)中所述茋类化合物为：

所述茋类化合物为：

优选的，所述茋类化合物为：

总体合成路线：

1.合成化合物5、9-33

1)磷脂化合物的制备

100mL三口烧瓶中加入0.0lmol苄基卤代物，0.015mol亚磷酸三乙酯，0.1-0.2g四丁基碘化铵，搅拌，油浴加热至110-115℃，反应6h，将反应物90℃以下减压蒸馏，除去过量的亚磷酸三乙酯，瓶中剩余的浅黄色油状物即为产物，直接用于下一步反应。

2)二苯乙烯类化合物的制备

制备的磷酸酯溶于25mL干燥四氢吠喃(THF)中，冰盐浴冷却至0℃以下，搅拌下迅速加入1.0g(6 0％,25mmol)NaH粉末，搅拌30min。搅拌下缓慢滴加9.6mmo1所需取代基的苯甲醛溶于25mL THF的溶液。将反应升温(约14-25℃)，搅拌6-8h。将反应液倾入冰水中，以lmol/LHC1溶液中和至偏酸性，以乙酸乙酯萃取(50mL、4次)，有机相用饱和NaCl水溶液洗涤，合并后的萃取液以无水硫酸钠干燥。回收溶剂，残留物中加少量乙醇重结晶，得到固体。

3)菲类化合物的制备

采用光环化的方法：1.3mmol制备的二苯乙烯类化合物溶于130mL新蒸馏的环己烯中，与0.07mmol的碘在水冷光反应器中用360nm光照射直至反应物消耗。用色谱柱分离后，重结晶。

2.合成化合物34-40

路线1：直接氧化

CAN(硝酸铈铵)氧化：0.4mmol菲类化合物溶于0.6mL水与1.4mL乙腈，与0.2g吡啶-2,6-二羧酸N-氧化物、2mL乙腈/水(1:1)溶解的0.5gCAN反应，在0℃下搅拌30min，在反应完成后，用水猝灭反应。色谱柱纯化，重结晶。

路线2：苯乙烯与苯醌的加成反应

将10mmol苯乙烯、12mmol甲基三苯基溴化膦、48mmol碳酸钾、30mg18-冠醚-6溶于30mLTHF中，在氮气保护的条件下，60℃搅拌3-6h。除去溶剂后，用色谱柱分离，得到对应的苯乙烯产物。用3.4mmol苯乙烯与对应的17mmol苯醌在甲苯中加热至100℃，用色谱柱分离后，除去溶剂，得到产物。

实施例3

1.化合物的药理作用：

1)MTT法：

分别精密称取百样解乙醇提取物、石油醚萃取部分、氯仿萃取部分、乙酸乙酯萃取部分、正丁醇萃取部分的干燥样品，DMSO溶解后加入1640培养基稀释至1000、500、250、100、50、10、5、1μg/mL，DMSO终浓度不超过0.1％；HSC细胞在10％FBS-1640培养基中于37℃、5％CO₂培养箱内常规传代培养。取对数生长期细胞HSC，调节浓度至1×10⁵/mL接种于96孔板中，每孔90μL。将96孔板置于37℃、5％CO₂培养箱中，培养24h后加入上述各组样品10μL，每组设6个平行，以0.1％DMSO为空白对照。培养24小时后通过MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)于酶标仪上570nm下测定吸光度。根据吸光度值得出各药物在不同浓度下的抑制率：抑制率％＝(对照孔OD-给药孔OD)/对照孔OD×100％。

表1百样解各提取部分对HSC增殖抑制率(％)

由上表知，1-1000μg/mL给药浓度下百样解醇提及各萃取部分对大鼠肝星状细胞均具有一定抑制增殖的作用；百样解醇提及各萃取部分的增殖抑制作用均呈现一定量效关系：随加药浓度增大抑制率增加；相同作用浓度下乙酸乙酯部分对HSC生长抑制率高于粗提及各萃取部分。

表2百样解各提取部分抑制HSC增殖IC₅₀

百样解中茋类化合物对大鼠肝星状细胞增殖的影响自百样解中分离出的10个茋类化合物分别用DMSO溶解后加入1640培养基稀释至100、50、10μg/mL并使DMSO终浓度不超过0.1％；以0.1％DMSO为空白对照。取对数生长期细胞HSC调节浓度至1×10⁵/mL，接种于96孔板中，每孔90μL。将96孔板置于37℃、5％CO2培养箱中，培养24h后每孔加入上述各组样品10μL，每组6个平行复孔。继续培养24小时后通过MTT法于酶标仪上570nm下测定吸光度。抑制率计算方法同上。

表3百样解中茋类化合物对HSC增殖抑制率(％)

由上表知，在10，50，100μg/mL的给药浓度下，百样解中茋类化合物对大鼠肝星状细胞均具有一定抑制增殖的作用且相同浓度下的各化合物单体抑制率均远高于粗提及各萃取部分的抑制率，实现了有效化学成分的富集和纯化；百样解中茋类化合物的抑制增殖作用随加药浓度增大抑制率显著增加，具有一定量效关系；相同作用浓度下化合物5对HSC生长抑制率最高(100μg/mL给药浓度下达86.02±4.74％)，化合物7对HSC生长抑制率最弱(100μg/mL给药浓度下达27.87±0.68％)。

表4百样解茋类化合物抑制HSC增殖的IC₅₀

抑制率通过Origin Pro 8进行统计学分析，各组测定值以表示。通过剂量对数值与抑制率拟合S型曲线，求得各萃取部分及各单体化合物的IC₅₀。

(1)虚拟筛选

构建配体分子数据库：以自百样解中分离得到的10个茋类化合物为配体分子，对二维小分子进行原子类型及化学键归属并转换成三维结构，结构优化后建立了本虚拟筛选研究的配体三维分子数据库。

受体建模：自蛋白数据库(PDB www.rcsb.org/pdb/home)下载三个与肝纤维化相关靶蛋白的蛋白文件：TGF-β1(4KV5)，TNF-α(1FT4)，MMP-9(2OW2)，并进行质子化、电荷补充、受损残基修复、赋予电力场以及能量结构优化等预处理并考察活性位点位置。

分子对接：将配体分子数据库中的化合物依次对接到相关靶蛋白的活性位点，依据几何匹配和能量匹配结果排序评价。

下载TGF-β1蛋白文件4KV5，进行删除水分子及配体、加氢等预处理，完成靶蛋白准备工作；通过Discovery Studio软件中的自动搜寻位点的Define Site From ReceptorCavities操作，以球心为(X＝-4.07142,Y＝11.1501,Z＝32.2274)，半径r＝15的球状区域为对接活性位点。将配体分子库中10个茋类化合物分子与靶蛋白进行对接，按照Libdockscore进行排序，得分最高的前五个化合物见表8。10个茋类化合物分子共产生211个构像，其中化合物9未能实现对接，化合物10得分最高、产生的与靶蛋白有结合趋势的构象异构体数量最多、与TGF-β1结合趋势最为明显。化合物10的优势构象中菲环与LYS A:97存在疏水作用，取代苯环可与氨基酸残基LYS A:95形成诱导偶极作用。

表5百样解中茋类化合物与TGF-β1对接结果

下载TNF-α蛋白文件1FT4，进行删除水分子和配体、加氢等预处理，完成靶蛋白准备工作；采用Discovery Studio软件中的自动搜寻位点的Define Site From ReceptorCavities操作，选定球心为(X＝5.5397,Y＝8.27462,Z＝72.693)半径r＝10的球状区域为活性位点。将配体分子库中10个茋类化合物分子与靶蛋白进行对接，按照Libdock score进行排序，见表6。10个茋类化合物分子共产生211个构像，其中茋类化合物5和8与TNF-α有结合趋势，化合物8得分较高。化合物8的优势构象中菲醌环与LYS B：19形成诱导偶极作用，羰基氧可与CYSA：52形成氢键作用，另侧苯环与THR B:31有疏水作用，取代基酚羟基与THR A:31存在氢键作用。

表6百样解中茋类化合物与TNF-α对接结果

下载MMP-9蛋白文件2OW2，进行删除水分子及配体、加氢等预处理，完成靶蛋白准备工作；采用Discovery Studio软件中的自动搜寻位点的Define Site From ReceptorCavities操作，选定球心为(X＝8.782,Y＝25.8,Z＝59.9126)半径r＝10的球状区域为活性位点。将配体分子库中10个茋类化合物分子与靶蛋白进行对接，按照Libdock score进行排序，见表7。化合物5、4、1、8与MMP-9有结合趋势，其中化合物5得分最高。化合物5的优势构象中菲醌环可与GLU B：416形成疏水作用、与ARG B：424形成诱导偶极作用；羰基氧可与GLUB：416和ARG B：424形成氢键作用；另侧苯环与GLU B：416存在有疏水作用，与ARG B：424形成诱导偶极作用。

表7百样解中茋类化合物与MMP-9对接结果

化合物	ΔG(kJ/mol)	得分
			5	-34.9208	106.276
4	-49.8004	94.5429
			1	-40.1215	91.5396
8	-33.1621	56.1117

(2)筛选结果的体外验证

10个茋类化合物对大鼠HSC-T6的TGF-β1、TNF-α、MMP-9分泌的影响：将处于对数生长期的人大鼠HSC-T6(1×10⁵/mL)接种于96孔细胞培养板中，24h后加入(1)给药组：DMSO溶解茋类化合物1-10，分别于细胞培养孔中加入10μL，终浓度为10、50、100μg/mL；(2)空白对照组：同体积的0.1％DMSO。37.5℃、5％CO₂条件下培养24h后收取细胞上清，ELISA试剂盒分别检测TGF-β1、TNF-α、MMP-9的含量。不同样品浓度下HSC相关蛋白分泌量采用单因素方差分析，各试验组数据与同期对照组数据分别进行显著性检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01有极显著性差异(表格中分别用*和**标记)。

表8不同给药浓度下化合物1-10对HSC中的TGF-β1分泌量(ng/L)

在100，50，10μg/mL三个给药浓度下茋类化合物1-10均呈现出抑制TGF-β1分泌的作用；随着给药浓度增大，TGF-β1分泌抑制作用明显，呈现一定剂量依赖性；除化合物3外，其余茋类化合物在50μg/mL和100μg/mL的给药浓度下TGF-β1分泌量与空白对照相比均呈现显著差异(P<0.05)；相同给药浓度下化合物1-10抑制TGF-β1分泌程度不同：化合物2和5抑制TGF-β1分泌能力较强，与计算机虚拟筛选结果基本吻合。TGF-β1可通过激活HSC、促进ECM的合成以及抑制ECM的降解促进纤维化进程，是目前已知最重要的致纤维化细胞因子之一。能够调节TGF-β1活性和通路的分子具有成为重要的抗纤维化先导化合物的潜力。

表9不同给药浓度下化合物1-10对HSC的TNF-α分泌量影响(ng/L)

在100μg/mL，50μg/mL两个给药浓度下，茋类化合物1-10均呈现出抑制TNF-α分泌的作用：除化合物1外，其余茋类化合物在50μg/mL和100μg/mL给药浓度下TNF-α分泌量与空白对照相比均呈现显著差异(P<0.05)。除化合物8外其余茋类化合物在10μg/mL给药浓度下抑制TNF-α分泌作用不明显。随给药浓度增至50μg/mL和100μg/mL，化合物1-10对TNF-α分泌抑制作用增大，呈现一定量效关系；相同给药浓度下化合物1-10抑制TNF-α分泌程度不同：化合物5、8、9、10抑制TNF-α分泌能力较强，与计算机虚拟筛选结果基本吻合。TNF-α可促进肝内纤维母细胞增殖，还可与白细胞介素等形成重要的炎症介质，刺激HSC细胞的增殖。实验及临床研究证明，在肝损伤过程中，酒精性肝炎患者使用TNF-α单克隆抗体治疗，其肝炎及纤维化症状都得到改善。能抑制TNF-α进而减轻肝纤维化的化合物分子有可能成为活性良好的先导化合物。

表10化合物1-10对HSC的MMP-9分泌量影响(ng/L)

除化合物10外的茋类化合物对MMP-9的分泌均具有一定促进作用，且随给药浓度增至50μg/mL和100μg/mL，上述9个茋类化合物对MMP-9分泌促进作用增大，呈现一定量效关系；除化合物2和7外的茋类化合物在100μg/mL,50μg/mL两个给药浓度下的MMP-9分泌量与空白对照相比均具有显著性差异，除化合物9外其余茋类化合物在10μg/mL给药浓度下对MMP-9分泌促进作用均不显著。相同给药浓度下化合物1-9对MMP-9的分泌促进作用有一定差异：化合物5、1、7、8、9促进MMP-9分泌作用较好，与计算机虚拟筛选结果基本吻合。MMP-9可与MMP-2共同维持肝脏修复过程中细胞环境结构的完整及肝窦基底膜的正常形态，MMP-9被激活后形成Ⅳ型胶原酶，降解破坏ECM和基底膜，从而减轻肝纤维化进程，以MMP-9为靶点的先导化合物有可能成为活性好的靶向治疗肝纤维化药物。

本发明明确从天然产物百样解中分离出的茋类化合物具有一定的抗肝纤维化活性，设计并合成一系列的茋类化合物后，我们利用DS虚拟筛选平台通过模拟药物分子与受体结合部位的相互作用，并评价结合的强弱优劣进而实现药物的筛选。首先确定抗肝纤维化的药物靶点或通过同源建模获得三维蛋白结构，再由分离及合成化合物的化学结构来构建三维配体分子数据库，进行化合物与靶蛋白的半柔性对接(即配体小分子的构象可变化、靶蛋白构象不可改变)，并进行打分排序，用于生物活性评价。因为属于母核相似的茋类化合物具有一定的分子相似性，利用分子整体结构特点，与分离的化合物1-10进行比较，从拟合成的化合物数据库中搜索符合条件的化合物，设计合成的化合物11-40与活性相近，因此，人工合成的系列茋类化合物的衍生物也具有抗肝纤维化活性。

虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。

Claims

1.用于治疗肝损伤的茋类化合物，其特征在于，所述茋类化合物为：

2.根据权利要求1所述的茋类化合物，其特征在于，所述茋类化合物为如下取代基的化合物：

3.用于治疗肝损伤的茋类化合物，其特征在于，所述茋类化合物为：

4.根据权利要求3所述的茋类化合物，其特征在于，所述茋类化合物为如下取代基的化合物：

5.用于治疗肝损伤的茋类化合物，其特征在于，所述茋类化合物为：3,3′-二羟基-5-甲氧基-联苄或7-羟基-2-甲氧基-9,10-二氢菲-1,4-二酮。

6.权利要求1-5任意一项所述的茋类化合物在制备用于治疗肝损伤药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肝损伤为肝纤维化。