CN106928035A - 一种竹叶兰茋类化合物提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种竹叶兰茋类化合物提取物及其制备方法和应用,属于天然药物或天然产物研究领域。该方法包括如下步骤:竹叶兰干燥切碎,乙醇溶剂浸泡,热回流提取,过滤,合并提取液,减压浓缩,得到竹叶兰乙醇提取物浓缩液;将竹叶兰乙醇提取物浓缩液与硅胶拌匀,蒸干,先用石油醚热回流洗脱,然后用乙酸乙酯热回流洗脱,收集乙酸乙酯洗脱液;将乙酸乙酯洗脱液,减压浓缩至干,即得到竹叶兰茋类化合物提取物。本发明的制备方法中采用的提取和萃取溶剂环保、无毒或毒性很小,工艺简单,效率高,回流连续提取,减少了溶剂的消耗。本发明的提取物具有抑菌、抗感染的作用,可用于制备抑菌、抗感染产品。

Description

一种竹叶兰茋类化合物提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于天然药物或天然产物研究领域,具体的说,本发明涉及一种竹叶兰茋类化合物提取物及其制备方法和应用。
背景技术
竹叶兰(Arundina graminifolia),别名长杆兰,为兰科竹叶兰属多年生草本植物,广泛分布于热带、亚热带地区。
在中国西双版纳地区,傣族人民称之为“农尚嗨”、“百样解”。“农尚嗨”意为吃了就好,“百样解”意为解百毒,是一种傣医别具特色的解毒良药。《中药大辞典》中记载竹叶兰具有清热解毒,祛风除湿,散瘀止痛,消炎、利尿的作用,用于治疗黄疸,热淋,水肿,脚气水肿,疝气腹痛,风湿痹痛,胃痛,尿路感染,毒蛇咬伤,疮痈肿毒,跌打损伤等。
发明内容
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足,本发明的首要目的在于提供一种竹叶兰茋类化合物提取物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法制备得到的竹叶兰茋类化合物提取物。
本发明的再一目的在于提供上述竹叶兰茋类化合物提取物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种竹叶兰茋类化合物提取物的制备方法,包括如下步骤:
(1)竹叶兰干燥切碎,按每克原料药1~100mL的用量加入体积浓度30%~100%乙醇溶剂浸泡0~24h,热回流提取1~4次,每次0.5~4h,过滤,合并提取液,减压浓缩,得到竹叶兰乙醇提取物浓缩液;
(2)将步骤(1)得到的竹叶兰乙醇提取物浓缩液与100~400目硅胶按干膏与硅胶质量比1:0.1~1:20,拌匀,蒸干,先用石油醚热回流洗脱0.5~48h,除去脂溶性杂质,然后用乙酸乙酯热回流洗脱0.5~48h,收集乙酸乙酯洗脱液;
(3)将步骤(2)收集的乙酸乙酯洗脱液,减压浓缩至干,即得到竹叶兰茋类化合物提取物。
优选的,步骤(1)中所述的切碎为切碎至2~3cm长度的小段,更优选为3cm长度的小段。
优选的,步骤(1)中所述的乙醇溶剂的体积浓度为70%~100%。
优选的,步骤(1)中所述的乙醇溶剂的用量为5~15mL/g竹叶兰;更优选为8~11mL/g竹叶兰。
优选的,步骤(1)中所述的浸泡的时间为2~12h。
优选的,步骤(1)中所述的提取是提取次数2~3次,每次2h;更优选是提取次数3次,每次2h。
优选的,步骤(2)中所述的硅胶为100~200目硅胶,所述的浓缩液干膏与硅胶质量比1:1~1:5;更优选为1:1~1:3。
优选的,步骤(2)中所述的用石油醚热回流洗脱的时间为10~30h;更优选为20h;
优选的,步骤(2)中所述的用乙酸乙酯热回流洗脱的时间为20~40h;更优选为20h。
优选的,步骤(3)中收集乙酸乙酯洗脱液,减压浓缩干燥后,得到竹叶兰茋类化合物提取物。
一种竹叶兰茋类化合物提取物,通过上述制备方法制备得到。
所述的竹叶兰茋类化合物提取物中含有多种活性茋类化合物,主要包括但不局限于blestriarene A(1),shancidin(2),densiflorol B(3),ephemeranthouinone(4),coelonin(5),lusianthridin(6),所述的竹叶兰茋类化合物结构式如下:
所述的竹叶兰茋类化合物提取物在生物医药方面的应用。
所述的竹叶兰茋类化合物提取物具有抑菌、抗感染的作用,用于制备抑菌、抗感染的产品。
优选的,所述的菌为金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌或大肠杆菌;
更优选的,所述的菌为金黄色葡萄球菌。
优选的,所述的抗感染为抗金黄色葡萄球菌感染。
优选的,所述的产品的剂型为胶囊、口服液等。
本发明相对于现有技术,具有如下的优点及效果:
(1)本发明采用一定浓度的乙醇溶剂进行提取,提取浓缩液用粗硅胶吸附分散后,装入恒压分液漏斗,通过“液固萃取法”,先用石油醚加热回流洗脱除去脂溶性杂质,然后用乙酸乙酯洗脱,收集乙酸乙酯洗脱物,减压干燥,得到具抑菌、抗感染作用的茋类化合物提取物。本发明采用“液固萃取”技术,可以特异性富集竹叶兰中茋类化合物,采用的提取和萃取溶剂环保、无毒或毒性很小,石油醚脱脂除杂处理后,再用乙酸乙酯洗脱,即可得到富含茋类化合物的提取物,操作简单,回流连续提取,减少了溶剂的消耗。
(2)本发明的制备方法工艺简单环保,效率高,节约溶剂。本发明的提取物可用于制备抑菌、抗感染产品。
附图说明
图1是竹叶兰茋类化合物提取物及对照品的HPLC液相图;其中,A:竹叶兰茋类化合物提取物,B:对照品;1、densiflorol B,2、coelonin,3、ephemeranthouinone,4、lusianthridin,5、shancidin,6、blestriarene A。
图2是竹叶兰茋类化合物提取物对金黄色葡萄球菌S.aureus、枯草芽孢杆菌B.subtilis、大肠杆菌E.coli的抑菌效果图。
图3是竹叶兰茋类化合物提取物对金黄色葡萄球菌溶血毒素所致红细胞损伤的保护作用;其中,(a)正常红细胞;(b)金黄色葡萄球菌溶血毒素损伤的红细胞;(c)竹叶兰茋类化合物提取物与金黄色葡萄球菌溶血毒素共同作用后的红细胞。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1竹叶兰茋类化合物提取物的制备
取干燥切碎的竹叶兰全草100g,用体积分数70%的乙醇溶剂800mL浸泡2h后,加热回流提取3次,每次2h,合并提取液,减压浓缩,得到的浓缩液与100~200目硅胶,按照干膏与硅胶质量比1:1拌匀,蒸干后,装入恒压分液漏斗,先用石油醚热回流洗脱20h,洗脱除去杂质,再用乙酸乙酯加热回流洗脱20h,收集乙酸乙酯部分流出洗脱液,减压浓缩干燥,得到竹叶兰茋类化合物提取物。
实施例2竹叶兰茋类化合物提取物的制备
取干燥切碎的竹叶兰全草100g,用体积分数80%的乙醇溶剂900mL浸泡4h,然后加热回流提取3次,每次2h,合并提取液,减压浓缩,得到的浓缩液与100~200目硅胶,按照干膏与硅胶质量比1:2拌匀,蒸干后,装入恒压分液漏斗,先用石油醚热回流洗脱10h,洗脱除去杂质,再用乙酸乙酯加热回流洗脱30h,收集乙酸乙酯洗脱,液减压浓缩干燥,得到竹叶兰茋类化合物提取物。
实施例3竹叶兰茋类化合物提取物的制备
取干燥切碎的竹叶兰全草100g,用体积分数95%的乙醇溶剂1000mL浸泡5h,加热回流提取3次,每次2h,合并提取液,减压浓缩,得到的浓缩液与200~300目硅胶,按照干膏与硅胶质量比1:3拌匀,蒸干后,装入恒压分液漏斗,先用石油醚热回流洗脱10h,洗脱除去杂质,再用乙酸乙酯加热回流洗脱40h,收集乙酸乙酯洗脱,液减压浓缩干燥,得到竹叶兰茋类化合物提取物。
实施例4竹叶兰茋类化合物提取物的制备
取干燥切碎的竹叶兰全草100g,用体积分数100%的乙醇1100mL浸泡12h,加热回流提取3次,每次2h,合并提取液,减压浓缩,得到的浓缩液与300~400目硅胶,按照干膏与硅胶质量比1:3拌匀,蒸干后,装入恒压分液漏斗,先用石油醚热回流洗脱30h,洗脱除去杂质,再用乙酸乙酯加热回流洗脱40h,收集乙酸乙酯洗脱,液减压浓缩干燥,得到竹叶兰茋类化合物提取物。
实施例5高效液相色谱分析竹叶兰茋类化合物提取物成分
供试品溶液的配制:按实施例1方法制得竹叶兰茋类化合物提取物用适量的甲醇溶解;
分析方法:
高相液相色谱仪:Agilent
色谱柱:BDC C18(4.6×200mm,5μm);
流动相:乙腈-水30:70;
检测波长:279nm;
柱温:30℃;
进样量:10μL。
对10批不同产地、批次的竹叶兰制备的茋类化合物提取物进行分析,建立指纹图谱进行匹配,结果保留时间4.6、11.1、15.2、18.4、23.2、33.8min的峰在10批样品色谱图中均出现,因此标定6个峰为共有指纹峰,据此建立该提取物的HPLC指纹图谱,结果如图1所示。
实施例6竹叶兰茋类化合物提取物胶囊的制备
按实施例1方法制得竹叶兰茋类化合物提取物,加入适量二氧化硅,混匀,制成胶囊。
实施例7竹叶兰茋类化合物提取物口服液的制备
按实施例1方法制得竹叶兰茋类化合物提取物,加入适量水稀释,静置滤过,加入糖浆、苯甲酸钠,再加水搅匀,冷藏,滤过,封装于10mL易拉瓶中,灭菌,即得。
实施例8竹叶兰茋类化合物提取物的抗菌活性研究
按照实施例1中的方法制备竹叶兰茋类化合物提取物,测定该提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌的抑菌圈。
菌种及试剂来源:金黄色葡萄球菌S.aureus ATCC 29213,枯草芽孢杆菌B.subtilis CMCC 63501,大肠杆菌E.coli CMCC 44825购自广东省菌种保藏中心。DMSO由天津市富宇精细化工有限公司提供。牛肉膏蛋白胨培养基依药典配制。
菌种活化:从保存完好的固体培养基上挑取单个菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中,37℃恒温培养16~18h,转速100rpm。
采用牛津杯法测定抑菌圈大小。取100μL 106CFU/mL菌悬液加入灭菌凝固后的牛肉膏蛋白胨固体培养基,均匀涂布。将直径为6mm的牛津杯置于平板上,每个牛津杯中加入100μL 10mg/mL的供试品溶液,37℃恒温培养24h后用直尺测量抑菌圈大小。每个平板放三个牛津杯作为平行。以DMSO为阴性对照。结果如表1和图2所示。
表1竹叶兰茋类化合物提取物(10mg/mL)的抑菌圈直径。
抑菌圈直径/mm
金黄色葡萄球菌 11
枯草芽孢杆菌 12
大肠杆菌 13
竹叶兰茋类化合物提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌的最小抑菌浓度及最小杀菌浓度测定。
二倍稀释法测最小抑菌浓度:100μL牛肉膏蛋白胨液体培养基逐孔加入96孔板,然后取100μL供试品溶液(10mg/mL)加入第1孔,吹打均匀后,吸取100μL加入第2孔,第2孔混匀后,取100μL加入第3孔,依次类推至第6孔。第7孔和第8孔不加药液。取100μL制备好的105CFU/mL的菌悬液加入第1至7孔,第8孔不加菌液。将96孔板置于恒温震荡器中37℃培养24h。培养后培养液澄清,即无明显细菌生长的最低浓度为最小抑菌浓度。吸取培养24h后仍然澄清的培养液100μL,涂布于固体平板上,37℃代培养24h。无菌落生长的最低浓度记为最小杀菌浓度。每组实验三个平行样,以5%~0.16%的DMSO为阴性对照。结果如表2所示。
表2竹叶兰茋类化合物提取物最小抑菌浓度及最小杀菌浓度
最小抑菌浓度(μg/mL) 最小杀菌浓度(μg/mL)
金黄色葡萄球菌 625 2500
枯草芽孢杆菌 625 >2500
大肠杆菌 625 >2500
从表1、表2中得知,通过抑菌圈、最小抑菌浓度、最小杀菌浓度的测定,表明竹叶兰茋类化合物提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌有一定的抑制作用,尤其是金黄色葡萄球菌。
本发明通过如下实验说明竹叶兰茋类化合物提取物具有抗感染作用。
竹叶兰茋类化合物提取物对金黄色葡萄球菌外毒素诱导的红细胞损伤的保护作用。
溶血毒素的收集:活化后的金黄色葡萄球菌,接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中,于37℃,150rpm条件下,培养3天(确保细菌已进入对数生长末期,溶血毒素大量释放于牛肉膏蛋白胨液体培养基中)。然后3000rpm离心10min,收集上清液,0.22μm滤膜过滤除菌,备用。
取0.225mL 4%红细胞与样品混合,37℃保温10min后,加入0.05mL溶血毒素溶液,用磷酸盐缓冲溶液补加体积至0.5mL(提取物终浓度为0,400,500,600,700,800μg/mL),37℃孵育1h,3000rpm离心10min,上清液在540nm处测吸光度,红细胞置于倒置显微镜下观察形态(图3)。红细胞溶血抑制率计算公式如下:
红细胞的溶血抑制率I%=(1-A/A0)×100%
表3竹叶兰茋类化合物提取物对金黄色葡萄球菌外毒素诱导的红细胞溶血的抑制率(n=3)
表3及图3的实验结果表明,竹叶兰茋类化合物提取物能够缓解由金黄色葡萄球菌溶血毒素对红细胞造成的损伤,有助于维持红细胞的形态特征。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种竹叶兰茋类化合物提取物的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)竹叶兰干燥切碎,按每克原料药1~100mL的用量加入体积浓度30%~100%乙醇溶剂浸泡0~24h,热回流提取1~4次,每次0.5~4h,过滤,合并提取液,减压浓缩,得到竹叶兰乙醇提取物浓缩液;
(2)将步骤(1)得到的竹叶兰乙醇提取物浓缩液与100~400目硅胶按干膏与硅胶质量比1:0.1~1:20,拌匀,蒸干,先用石油醚热回流洗脱0.5~48h,除去脂溶性杂质,然后用乙酸乙酯热回流洗脱0.5~48h,收集乙酸乙酯洗脱液;
(3)将步骤(2)收集的乙酸乙酯洗脱液,减压浓缩至干,即得到竹叶兰茋类化合物提取物。
2.根据权利要求1所述的竹叶兰茋类化合物提取物的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述的切碎为切碎至2~3cm长度的小段。
3.根据权利要求1所述的竹叶兰茋类化合物提取物的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述的乙醇溶剂的体积浓度为70%~100%;
步骤(1)中所述的乙醇溶剂的用量为5~15mL/g竹叶兰。
4.根据权利要求1所述的竹叶兰茋类化合物提取物的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述的浸泡的时间为2~12h;
步骤(1)中所述的提取是提取次数2~3次,每次2h。
5.根据权利要求1所述的竹叶兰茋类化合物提取物的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述的硅胶为100~200目硅胶,所述的浓缩液干膏与硅胶质量比1:1~1:5。
6.根据权利要求1所述的竹叶兰茋类化合物提取物的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述的用石油醚热回流洗脱的时间为10~30h;
步骤(2)中所述的用乙酸乙酯热回流洗脱的时间为20~40h。
7.一种竹叶兰茋类化合物提取物,其特征在于通过权利要求1~6任一项所述的制备方法制备得到。
8.根据权利要求7所述的竹叶兰茋类化合物提取物,其特征在于:所述的竹叶兰茋类化合物提取物中含有多种活性茋类化合物,包括但不局限于blestriarene A(1),shancidin(2),densiflorol B(3),ephemeranthouinone(4),coelonin(5),lusianthridin(6),结构式如下:
9.权利要求7或8所述的竹叶兰茋类化合物提取物在生物医药方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于:所述的竹叶兰茋类化合物提取物在制备抑菌、抗感染的产品中的应用。
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