WO2013187381A1 - Ｐｐａｒ活性化剤の製造方法及びｐｐａｒ活性化剤 - Google Patents

Ｐｐａｒ活性化剤の製造方法及びｐｐａｒ活性化剤 Download PDF

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WO2013187381A1
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ppar
fragrance
val
cyclo
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PCT/JP2013/066006
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松浦　信康
文武 桝谷
勇史 丸
祐太 高知
義雄 辻野
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日本恒順株式会社
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    • A61K31/4985—Pyrazines or piperazines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a PPAR activator from perfume and a PPAR activator comprising a perfume extract or a fraction thereof.
  • Koan has long been used as a seasoning in China, and is mainly produced by fermenting and aging long-term rice.
  • Kaoru has a higher content of organic compounds such as amino acids than rice vinegar, which is a vinegar commonly used in Japan, and has recently been used as a health food in Japan.
  • a technique for using this fragrance for improving health has been studied.
  • the present inventors have disclosed a composition comprising a koji or a concentrated extract of koji as an active ingredient.
  • This composition is expected to have a beauty-oriented effect such as reduction of visceral fat, improvement of lipid metabolism, improvement of skin elasticity and elasticity.
  • a method for producing this concentrated extract it is described that the fragrance is concentrated about 5 times by an evaporator.
  • Patent Document 2 disclose a peroxisome proliferator-responsive receptor ⁇ -activator and ⁇ -activator that contain a lower alkanol extract of persimmon as an active ingredient.
  • PPAR peroxisome proliferator-activated receptor
  • the composition containing the fragrance or the concentrated extract of fragrance disclosed in Patent Document 1 has a flavor and odor peculiar to vinegar, and it may be difficult to ingest a certain amount or more. Therefore, it is required to remove a flavor component peculiar to vinegar from a koji and selectively extract a useful component contained in the koji to obtain a composition that can be easily taken.
  • the lower alkanol extract of perfume disclosed in Patent Document 2 is obtained by neutralizing perfume with sodium hydroxide and then extracting with butanol.
  • the effect confirmation of the PPAR ⁇ and PPAR ⁇ activation action of the lower alkanol (butanol) extract of this perfume is generally carried out in an experimental system in which the reaction conditions are adjusted as compared to in vivo.
  • the alkanol extract is added to the cell culture medium at a high rate of 1.0% (that is, 10,000 ppm), it has been confirmed that there is an effect of activating PPAR ⁇ and PPAR ⁇ . Therefore, when using this lower alkanol extract of a persimmon as a PPAR activator, it is necessary to add or ingest it in large quantities.
  • the present inventors can extract a component having a high PPAR activation action selectively from fragrance, thereby effectively producing a PPAR activation action and making it possible to adjust the amount of addition or intake.
  • research was advanced based on the idea that it could be used as a drug or food.
  • an object of the present invention is to provide a method for selectively producing an extract or a fraction having a high PPAR activation action from fragrance, and a PPAR activator produced by the method.
  • the method for producing the PPAR activator of the present invention includes a step of obtaining an extract from an incense extract, and an extract from the incense extract, And a step of detecting Cyclo (-Pro-Val-) represented by:
  • the inventors of the present invention performed various fractionation or partitioning treatments on koji, and as a result of studying the fractionation method and the obtained fraction, fractions having both high PPAR ⁇ activation activity and PPAR ⁇ activation activity. It was discovered that a large amount of Cyclo (-Pro-Val-) represented by the chemical formula (1) was contained in the fraction. Therefore, this Cyclo (-Pro-Val-) can be used as an index of PPAR activation action. According to this method, by detecting Cyclo (-Pro-Val-) contained in the scent extract, the presence or absence of the PPAR activation action in the scent extract, which is the subject, and the effect thereof are evaluated. be able to.
  • the step of detecting Cyclo (-Pro-Val-) preferably includes a step of analyzing the fragrant extract by liquid chromatography. By performing liquid chromatography on the fragrance extract to be analyzed and the standard substance Cyclo (-Pro-Val-) and comparing the chromatograms of both, Cyclo (-Pro-Val- ) Presence / absence, concentration, etc. can be detected.
  • the step of obtaining the fragrance extract includes the step of adding at least one solvent selected from butanol, ethanol, ethyl acetate, butylene glycol, or chloroform to the fragrance to obtain the solvent extract of fragrance.
  • a fragrant extract having a high PPAR ⁇ activation action and a PPAR ⁇ activation action can be easily obtained by a solvent extraction treatment using a suitable solvent.
  • the fragrant extract having PPAR activation has an effect of improving pathological conditions involving PPAR such as insulin resistance, diabetes, hyperlipidemia, hypertension, visceral fat obesity, and fatty liver. Therefore, a PPAR activator that can be widely applied to foods, drugs, and the like useful for improving these pathological conditions can be produced from incense, a familiar food material.
  • the step of obtaining the fragrant extract includes a step of separating the fragrant solvent extract by chromatography and collecting a plurality of fractions. Chromatography is performed on the solvent extract of fragrance to obtain a fraction having a PPAR activation action, that is, a fraction containing Cyclo (-Pro-Val-), thereby further selectively having a PPAR activation action. Ingredients can be obtained.
  • the chromatography is preferably silica gel chromatography using benzene-acetone as the mobile phase. By performing this chromatography, components having a PPAR activating action are preferably fractionated.
  • the chromatography is preferably reverse phase silica gel chromatography using water-methanol as the mobile phase. By performing this chromatography, a component having a PPAR activation effect is more preferably fractionated.
  • the PPAR activator of the present invention comprises a step of adding at least one solvent selected from butanol, ethanol, ethyl acetate, butylene glycol, or chloroform to koma to obtain a solvent extract of koma, Separating the solvent extract by chromatography and collecting a plurality of fractions, and in the plurality of fractions, Is produced from a step of obtaining a fraction having Cyclo (-Pro-Val-).
  • a fragrant extract or fraction having both PPAR ⁇ activation activity and PPAR ⁇ activation activity so that high PPAR ⁇ activation activity and PPAR ⁇ activation activity can be selected.
  • a PPAR activator having both can be easily produced.
  • This PPAR activator can be used to improve pathologies involving PPAR such as insulin resistance, diabetes, hyperlipidemia, hypertension, visceral fat obesity, and fatty liver.
  • a PPAR activator that can be widely applied to foods, medicines, and the like that are useful for improving the above-mentioned pathological conditions can be produced from incense that is a familiar material for foods.
  • the manufacturing method of the PPAR activator P1 in this embodiment includes an incense (step for preparing) S0, an extraction processing step S1 for obtaining an incense extract from incense S0, and Cyclo ( -Pro-Val-) detection step S2.
  • This perfume (flavored vinegar) S0 is obtained by adding rice bran to alcoholic fermentation, adding rice husk and acetic acid fermentation, extracting by adding water, and aging the extract for a certain period of time. .
  • the type of incense is sometimes classified according to the age of this aging.
  • the fragrance used in the present embodiment preferably has a long aging period, more preferably aging for 1 year or more, and further preferably aging for 8 years or more. Specifically, although not particularly limited, 8-year-aged Hengjun Koma (Nihon Hengjun Co., Ltd.) is preferably used.
  • the extraction process step S1 shown in FIG. 1 will be described.
  • the target component having the PPAR activation action is extracted from the fragrance S0 efficiently.
  • the incense S0 is added using a distribution process in which an organic solvent is added and the target component is moved to the organic solvent phase, or a suitable chromatography method. Separation or fractionation is performed into a plurality of fractions.
  • These extraction processes that is, the distribution process and the separation / fractionation process are not limited to a single process, and the same process can be performed a plurality of times, or a plurality of types of processes can be combined.
  • Cyclo (-Pro-Val-) detection step S2 shown in FIG. 1 will be described.
  • Cyclo (-Pro-Val-) is detected for the fragrance extract obtained in the extraction processing step S1 described above.
  • This Cyclo (-Pro-Val-) is a substance that is abundantly contained in the fragrant extract having both a high PPAR ⁇ activation action and a PPAR ⁇ activation action, and is used as an indicator of the PPAR activation action. Therefore, by detecting Cyclo (-Pro-Val-) contained in the fragrance extract, it is possible to evaluate the presence or absence of the PPAR activation action in the fragrance extract, which is the subject, and the effect thereof. .
  • This detection is carried out by detecting the presence or absence of Cyclo (-Pro-Val-) in the fragrant extract as the specimen or measuring the content of Cyclo (-Pro-Val-).
  • the detection method in the detection step S2 it is preferable to analyze the fragrant extract by liquid chromatography from the viewpoint that it can be detected quantitatively and is quick and easy. More specifically, liquid chromatographic analysis is performed on the fragrant extract as a specimen and Cyclo (-Pro-Val-) as a standard substance, and the chromatograms of the two are compared. Thereby, it is possible to detect the presence and content of Cyclo (-Pro-Val-) in the fragrance extract as the subject.
  • the Cyclo (-Pro-Val-)-containing fraction P1 selected in this detection step S2 has properties of both PPAR ⁇ activation and PPAR ⁇ activation, that is, properties as a dual agonist.
  • PPAR activation activity is synonymous with “PPAR agonist activity”.
  • PPAR means PPAR ⁇ and PPAR ⁇ , or any one of these.
  • This Cyclo (-Pro-Val-) includes cases where the valine and proline bound to each other are any combination of L-type amino acids or D-type amino acids, both of which are composed of L-type amino acids. That is, a product in which L-type proline and L-type valine are bound cyclically is particularly preferable.
  • a PPAR activation effect test that is usually performed, that is, a reporter gene assay by linking a luciferase structural gene to a PPAR expression plasmid, and other PPARs It is also possible to carry out tests that measure the expression of genes involved in protein, protein levels, lipid levels, cytokine levels, and the like.
  • cyclo (-Pro-Val-)-containing fraction P1 obtained in this embodiment as a PPAR activator, other substances may be added.
  • ingredients such as extracts derived from incense or black vinegar, and other substances used in pharmaceuticals, such as preservatives, seasonings, fragrances, coloring agents or nutrients such as vitamins, minerals or amino acids Also good.
  • the method for producing the PPAR activator P1 in this embodiment includes: koji (preparing step) S0, partitioning step S1a by solvent extraction, fractionation step S1b by chromatography, Cyclo ( -Pro-Val-) detection step S2.
  • the distribution step S1a by solvent extraction shown in FIG. 2 will be described.
  • a solvent is added to the fragrance S0, and the target component having the PPAR activation action is transferred to the added solvent.
  • an organic solvent is preferably used, and is not particularly limited, but alkanol such as n-butanol or ethanol, ethyl acetate, butylene glycol, chloroform and the like can be used.
  • the distribution process S1a by the solvent extraction is not limited to a single process, and the extraction process with the same solvent can be performed a plurality of times, or a plurality of types of solvent extraction processes can be combined.
  • an alkanol extraction process of fragrance using alkanol as an organic solvent will be described.
  • an alkanol is added to the koji, and the target component having the PPAR activation action is transferred to the alkanol phase.
  • alkanol is added to the fragrance and stirred well, and the target component having PPAR activation activity is transferred to the alkanol phase, and then the alkanol phase is used with a centrifuge or the like. It is carried out by separating into an aqueous phase and recovering the alkanol phase. This operation is preferably performed a plurality of times.
  • the component having PPAR activating action contained in the fragrance is presumed to be a hydrophobic component because it is suitably extracted with alkanol.
  • alkanol lower alkanols are preferable, ethanol and butanol are preferably used, and n-butanol is particularly preferably used.
  • the amount of alkanol added is preferably about 10% to 1000% by weight of the aqueous phase (scent), and most preferably about half to twice the amount of the aqueous phase (scent). From the recovered alkanol phase, the solvent can be easily removed by a vacuum concentration treatment or the like, and a solid or concentrated fragrant alkanol extract can be obtained.
  • the defoliation process of the fragrance S0 may be performed for the purpose of removing excess fat components contained in the fragrance S0. it can.
  • the degreasing treatment of the fragrance S0 excess lipid components contained in the fragrance are removed, so that the target component can be effectively extracted in the subsequent extraction process such as the distribution step S1a. It becomes possible.
  • an organic solvent is added to the incense S0, and the mixture is stirred well to move excess fat components to the organic solvent phase, and then the aqueous phase and the organic solvent phase using a centrifuge or the like. And the aqueous phase can be recovered.
  • This operation is preferably performed a plurality of times.
  • Any organic solvent may be used as long as it has a degreasing effect.
  • petroleum organic solvents and alcohols are preferably used, and n-hexane is particularly preferably used.
  • the amount of the organic solvent to be used is preferably about 10% to 1000% by weight, and most preferably about half to twice the amount of the fragrance.
  • chloroform is added to Koyo S0, and the target component having the PPAR activation action is efficiently transferred to the chloroform phase.
  • the cocoon and chloroform are distributed using a separatory funnel, and the chloroform phase is recovered.
  • the distribution is preferably performed a plurality of times.
  • the amount of chloroform to be added is preferably about 10% to 1000% by weight of the aqueous phase (scent), and most preferably about half to twice the amount of the aqueous phase.
  • the component having a PPAR activating action contained in the fragrance is presumed to be a fat-soluble substance because it is suitably extracted with chloroform, and is considered not to be a simple amino acid or carbohydrate. From the recovered chloroform phase, the solvent can be easily removed by a vacuum concentration treatment or the like, and a solid or concentrated chloroform extract of fragrance can be obtained.
  • chloroform extraction treatment can be performed not only on the perfume S0 but also on the perfume alkanol extract described above. Specifically, chloroform is added to a suspension of an alkanol extract of perfume in water and distributed using a separatory funnel, and the chloroform phase is recovered. Thereby, the component which has the target PPAR activation effect
  • fractionation step S1b by chromatography shown in FIG. 2 The purpose of these fractionation steps S1b is to further purify and separate components having a PPAR activating action contained in the solvent extract obtained in step S1a.
  • Chromatography can be used as appropriate by combining molecular weight exclusion, adsorption such as ion exchange, normal phase or reverse phase, or a combination of one or more types. As described below, two types using silica gel and reverse phase silica gel are used. The separation is preferably performed by chromatography.
  • fractionation step S1b a fractionation process by silica gel chromatography will be described.
  • the purpose of this fractionation treatment is to perform silica gel chromatography on the solvent extract obtained in step S1a to obtain a plurality of fractions. Specifically, although not particularly limited, it is carried out by placing silica gel on which a chloroform extract is adsorbed on a chromatographic tube filled with silica gel, and flowing and eluting a predetermined mobile phase from the top.
  • the mobile phase benzene-acetone is preferably used.
  • elution with a mobile phase having a gradient of benzene: acetone from 20: 1 to 1: 1 can be preferably performed. is there.
  • the Cyclo (-Pro-Val-) detection step S2 will be described.
  • this step by detecting Cyclo (-Pro-Val-) contained in a plurality of fractions (fractions) obtained in step S1b, the presence or absence of a PPAR activation effect in the fraction that is the subject and its The effect etc. can be evaluated. Thereby, it is possible to select a fraction having a PPAR activation action quickly and easily without performing a confirmation test such as a gene expression assay usually performed to confirm the PPAR activation action.
  • Other configurations and operations are the same as those in the Cyclo (-Pro-Val-) detection step S2 in the first embodiment.
  • a fraction having a PPAR activation effect is obtained. Minutes can be easily recovered.
  • the fraction selected (collected) in the detection step S2 in the present embodiment is further subjected to other chromatographic treatment S1b and Cyclo (-Pro-Val-) detection treatment S2, and components having a PPAR activation action are obtained.
  • High purification is also possible.
  • the fractionation process by reverse phase silica gel chromatography will be described.
  • reverse-phase silica gel chromatography is performed on the fraction obtained by the silica gel chromatography described above and selected in step S2.
  • a methanol solution of the fraction obtained by silica gel chromatography is added to reverse phase silica gel packed in a chromatographic tube, and a predetermined mobile phase is passed from above to elute.
  • the mobile phase water-methanol is preferably used.
  • elution with a mobile phase having a gradient of 10% methanol aqueous solution, 20% methanol aqueous solution, 100% methanol, or the like can be suitably separated. is there.
  • Cyclo (-Pro-Val-) is detected in the obtained plurality of fractions (fractions), and the fraction containing Cyclo (-Pro-Val-) is collected.
  • action can be collect
  • the thus obtained Cyclo (-Pro-Val-)-containing fraction P1 has a PPAR ⁇ activation action and a PPAR ⁇ activation action, and can be used as a PPAR activator.
  • This Cyclo (-Pro-Val-)-containing fraction P1 can be further processed to a form that is easy to use by further concentrating or dissolving it.
  • another substance can also be added. For example, you may add other components, such as an extract derived from a persimmon or black vinegar. It is also possible to add other substances used in pharmaceuticals such as preservatives, seasonings, fragrances, coloring agents, or nutrients such as vitamins, minerals or amino acids.
  • the PPAR activator P1 obtained in these embodiments described above can be used for the treatment of diseases and medical conditions related to PPAR and the improvement of disease states.
  • the treatment and improvement of the disease state here include prevention and prognosis treatment for these diseases and disease states.
  • the PPAR activator is particularly preferably a PPAR ⁇ activator and a PPAR ⁇ activator.
  • Diseases involving PPAR ⁇ include a wide range of diseases involving stimulation of fatty acid oxidation and mediating action of serum lipids.
  • Diseases involving PPAR ⁇ widely include those involved in adipocyte differentiation.
  • PPAR activator P1 obtained in the present embodiment can be used for treatment or improvement of one or more pathologies of these diseases.
  • the measuring method of the PPAR activation test in the following examples is as follows.
  • (1) Preparation of PPAR ⁇ activation test (1-1) Preparation of reporter gene assay
  • a plasmid pSEAP-control vector (Clontech product) for conversion efficiency correction was prepared.
  • COS-1 cells derived from African green monkey kidney
  • Dulbecco's modified Eagle medium “Nissui” 2 containing 10% FBS (fetal bovine serum), 0.06% L-glutamine and 0.2% NaHCO 3 DMEM, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • secretory alkaline phosphatase (SEAP) activity was measured on 96-well plates from which 25 ⁇ L of the culture solution was collected. 25 ⁇ L of 1 ⁇ Dilution Buffer (5 ⁇ Dilution Buffer: NaCl 4.38 g, Tris 2.42 g dissolved in 90 ml of ultrapure water, adjusted to pH 7.2 with hydrochloric acid and diluted with water) in each well After addition and incubation at 65 ° C. for 30 minutes, the mixture was cooled at 4 ° C. for 5 minutes.
  • 1 ⁇ Dilution Buffer 5 ⁇ Dilution Buffer: NaCl 4.38 g, Tris 2.42 g dissolved in 90 ml of ultrapure water, adjusted to pH 7.2 with hydrochloric acid and diluted with water
  • Example 1 Verification of extraction solvent The fragrance (8-year-old temperament scented scent, Nippon Shunshun Co., Ltd.) was adjusted to pH 3. The fragrance was sequentially distributed with chloroform, ethyl acetate and n-butanol, and the chloroform layer, ethyl acetate layer and n-butanol layer were recovered. Each collected layer was concentrated under reduced pressure to remove the solvent, and then dissolved in DMSO to obtain each crude fragrant extract. Each of the obtained crude aroma extracts was subjected to a PPAR ⁇ activation test and a PPAR ⁇ activation test, and the PPAR agonist activity of each crude aroma extract was evaluated. Furthermore, the same test was also performed on the incense adjusted to pH 7 and pH 10 (8-year-old tempered decoction, Nippon Hengjun Co., Ltd.).
  • the PPAR ⁇ agonist activity of each crude extract of perfume is shown in FIG. 3a, and the PPAR ⁇ agonist activity is shown in FIG. 3b.
  • the ordinate indicates the luminescence intensity of luciferase
  • the abscissa indicates the control group (WY14643 or troglitazone)
  • the extraction solvent of each fragrant crude extract for each pH adjustment value Specifically, Cl; chloroform, EA; ethyl acetate, Bu; n-butanol, H 2 O; water are shown.
  • the component having PPAR activation activity was considered to be a fat-soluble substance. .
  • Example 2 Production of scent extract
  • (1) Degreasing treatment After adding 1.2 l of koji (8-year-old Hengjun Kouen, Nippon Hengjun Co., Ltd.) to an equal volume of n-hexane and stirring well, centrifuge at 1000 rpm for 10 minutes. And the aqueous layer was collected. This distribution operation was performed three times to remove excess lipid components contained in the fragrance.
  • Example 3 [Examination of optimum separation conditions by Example 3 thin layer chromatography (TLC)]
  • TLC thin layer chromatography
  • the perfume extract obtained in Example 2 was dissolved in acetone to a concentration of 10 mg / ml.
  • the collected supernatant was concentrated under reduced pressure to remove the solvent and dissolved in 200 ⁇ L of DMSO.
  • DMSO solution of each fraction and the DMSO solution of the fragrance extract obtained in Example 2 10 mg of the fragrance extract dissolved in 200 ⁇ L of DMSO
  • the PPAR ⁇ activation test and the PPAR ⁇ activity was evaluated for each fraction.
  • the PPAR ⁇ agonist activity of each fraction is shown in FIG. 5a, and the PPAR ⁇ agonist activity is shown in FIG. 5b.
  • the vertical axis represents the luminescence intensity of luciferase
  • the horizontal axis represents the control group (WY14643 or troglitazone), each fraction (Fr. 1 to Fr. 7), and the fragrant extract.
  • the concentration of each fraction is 500 ( ⁇ g / mL), but this value is not the component concentration of each fraction but a value based on 10 mg of fragrant extract before TLC separation (after separation by TLC, each fraction Minute was dissolved in 200 ⁇ L of DMSO).
  • FIGS. 5a and 5b it was found that in both the PPAR ⁇ agonist activity and the PPAR ⁇ agonist activity, the fraction having a low Rf value (Fr. 5 to Fr. 7) has high activity.
  • Example 5 Separation of active fractions by silica gel column chromatography
  • 4600 mg of the fragrant extract obtained in Example 2 was dissolved in a small amount of acetone and adsorbed on about 6.0 g of silica gel (silica gel 60N: Kanto Chemical).
  • silica gel silica gel
  • about 60 g of silica gel was packed in a glass chromatograph tube (40 ⁇ 2 cm, 120 mL), and the silica gel adsorbed with the fragrant extract was placed thereon.
  • Benzene: acetone 20: 1, 10: 1, 5: 1, 3: 1, 1: 1, and 300% of the solvent in the order of 100% acetone, and fractions in two portions of 150 mL each except 100% acetone.
  • Example 6 Examination of optimum separation conditions by reversed-phase high-performance liquid chromatography
  • optimal separation conditions by reverse phase high performance liquid chromatography was examined.
  • the optimal separation conditions were examined using reverse phase high performance liquid chromatography (used column; Mightysil RP-18 GP 150-2.0 (5 ⁇ m): Kanto Chemical Co., Inc.).
  • Example 7 Fractionation of active fraction by reverse phase silica gel column chromatography
  • a glass chromatographic tube 40 ⁇ 2 cm, 120 mL was charged with 300 mL of preparative reverse phase C 18 filler (fully porous spherical silica gel, Cosmosil 140C 18 -OPN, Nacalai Tesque, Inc.) suspended in methanol.
  • 300 mL of degassed methanol was poured into this filler so as not to form bubbles, and flowed. The filler was then equilibrated with 10% of the filler (3 L) degassed 10% methanol.
  • Example 8 Determination of structure of components contained in refined scent
  • the 20% methanol elution fraction obtained in Example 7 (hereinafter referred to as “purified perfume”) was dissolved in methanol D4, and high-resolution positive ion FAB-MS, 1 H and 13 C, and various two-dimensional NMR spectra were obtained.
  • the structure was analyzed using this. From the high-resolution positive ion FAB-MS, it became clear that the compositional formula of the main component contained in this refined fragrant product is C 10 H 16 N 2 O 2 .
  • Example 9 Activity measurement of purified fragrance product
  • the PPAR ⁇ activation test and the PPAR ⁇ activation test were performed using the purified fragrant product obtained in Example 7 as a test sample, and the PPAR agonist activity of each fraction was evaluated.
  • the added concentrations of the purified scented product are 100 ⁇ g / mL, 50 ⁇ g / mL, and 25 ⁇ g / mL (assuming that only the Cyclo (-Pro-Val-) analyzed in Example 8 is included in the purified scented product).
  • the addition concentration of this compound was 500 ⁇ M, 250 ⁇ M, and 125 ⁇ M, respectively).
  • the same test was performed at the same concentration as the molar concentration of proline simple substance and valine simple substance, assuming that only Cyclo (-Pro-Val-) was contained in the purified fragrance.
  • the PPAR ⁇ agonist activity in each test group is shown in FIG. 8a, and the PPAR ⁇ agonist activity in FIG. 8b.
  • the vertical axis of these figures is the ratio of the activity of the test section to the activity of the control substance (WY14643; 50 ⁇ M, or troglitazone; 10 ⁇ M).
  • the purified fragrant product has PPAR ⁇ agonist activity and PPAR ⁇ agonist activity almost in a concentration-dependent manner.
  • the single amino acids proline and valine have been shown to have little PPAR agonist activity.
  • this refined fragrant product shows activity at a low concentration while the alkanol extract of Patent Document 2 has a content of 0.5 to 1% in the culture solution. From this result, it was also shown that this refined fragrant product has a high specific activity.
  • PPAR ⁇ promotes the differentiation of preadipocytes and increases small adipocytes. As a result, the secretion amount of the insulin-sensitive hormone adiponectin is increased from the adipocytes, and the triglyceride amount is decreased.
  • a test was conducted to confirm the effect of the purified fragrance product on adiponectin secretion and triglyceride (TG) accumulation in adipocytes. The test was conducted as follows.
  • 3T3-L1 cells were seeded on a 12-well plate at 1 ⁇ 10 4 cells / mL. After culturing for 7 to 8 days, the cells were added to DMEM medium containing 10% FBS so that the final concentrations were 0.25 mM DEX, 10 mg / mL insulin, 0.5 mM IBMX, and differentiation into adipocytes was induced. Thereafter, a purified fragrant product dissolved in DMSO as a test sample was added to 10 ⁇ g / mL, and troglitazone was added to 10 ⁇ M as a comparative sample. DMSO was used as a control substance.
  • the medium was replaced with a medium in which insulin was added to DMEM medium containing 10% FBS at a final concentration of 5 mg / mL to promote differentiation into adipocytes.
  • the cells after 8 days were measured for the amount of adiponectin and the amount of triglyceride.
  • the triglyceride amount was measured using Triglyceride E-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • FIG. 9a The result of the amount of adiponectin is shown in FIG. 9a, and the result of the amount of triglyceride is shown in FIG. 9b.
  • the vertical axis of these figures indicates the amount of adiponectin or triglyceride, respectively.
  • FIG. 9a and FIG. 9b it was found that the refined fragrant product has the effect of increasing the amount of adiponectin secreted and decreasing the amount of triglyceride accumulated. This result confirms that this purified fragrant product has an action of activating PPAR ⁇ and is a PPAR activator.
  • aP2 (Adipose fatty acid binding protein) is a target gene of PPAR ⁇ .
  • a test was conducted to confirm the effect of the purified fragrance product on the expression of the aP2 gene. The test was performed in the same manner as in Example 10, and the mRNA was collected from the cells after 8 days after replacement with a differentiation promoting medium, and the amount of mRNA was quantified. mRNA quantification was performed using a light cycler (Roche Applied Science). The results are shown in FIG.
  • shaft of a figure is ratio of the aP2 expression level of the refined fragrance
  • the purified perfume product has an action of increasing the expression level of aP2. This result confirms that this purified fragrant product has an action of activating PPAR ⁇ and is a PPAR activator.
  • the present invention provides a method for producing a PPAR activator that prevents or ameliorates lifestyle-related diseases and other pathological conditions in which PPAR is involved, and thus is widely useful in the medical and functional food industries.

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Abstract

　香醋から高いＰＰＡＲ活性化作用を有する抽出物又は分画物を選択的に製造する方法、及びその方法により製造されたＰＰＡＲ活性化剤を提供する。ＰＰＡＲ活性化剤の製造方法は、香醋から香醋抽出物を得る工程と、香醋抽出物における、　【化１】 で表されるＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を検出する工程を含む。

Description

ＰＰＡＲ活性化剤の製造方法及びＰＰＡＲ活性化剤
　本発明は、香醋からＰＰＡＲ活性化剤を製造する方法及び香醋抽出物又はその分画物を含むＰＰＡＲ活性化剤に関する。
　香醋（香酢）は、中国において古くから調味料として用いられ、主に糯米を発酵させ長期間熟成させて製造されている。香醋は、日本で一般的に用いられる酢である米酢よりもアミノ酸等の有機化合物の含有率が高く、近年は日本でも健康食品として用いられている。この香醋を、健康状態の改善に用いる技術が研究されている。
　例えば、本発明者らは特許文献１において、香醋又は香醋の濃縮エキスを有効成分として含有してなる組成物を開示している。この組成物は、内臓脂肪の減少、脂質代謝の改善、皮膚の弾力性やハリを改善するといった美容志向の効果を期待するものである。この濃縮エキスの製造方法としては、エバポレータにより香醋を約５倍に濃縮することが記載されている。
　さらに、本発明者らは特許文献２において、香醋の低級アルカノール抽出物を有効成分として含有するペルオキシソーム増殖剤応答性受容体α活性化剤及びγ活性化剤を開示している。これによれば、香醋の低級アルカノール抽出物に、脂肪酸酸化の刺激及び血清脂質の仲介作用に関与し糖代謝を改善するペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）αの活性化作用、並びに脂肪細胞の分化に関与し血糖値及び血中脂質の低下等をもたらすＰＰＡＲγの活性化作用が認められることが記載されている。
特開２０１１－５１９５２号公報 特開２００９－２４９３２２号公報
　しかしながら、特許文献１で開示された香醋又は香醋の濃縮エキスを含む組成物は、酢特有の風味や匂いを有しており、一定量以上を経口摂取することが困難な場合がある。そのため、香醋から酢特有の風味成分等を除くと共に香醋に含まれる有用な成分を選択的に抽出し、摂取が容易な組成物を得ることが求められている。
　他方、特許文献２で開示された香醋の低級アルカノール抽出物は、香醋を水酸化ナトリウムで中和処理したのち、ブタノールで抽出することによって得られている。しかしながら、この香醋の低級アルカノール（ブタノール）抽出物のＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγ活性化作用に関する効果確認は、一般に生体内に比べて反応条件が整えられた実験系で行われているところ、香醋の低級アルカノール抽出物を１．０％（すなわち、１００００ｐｐｍ）という高い割合で細胞培養液に添加した場合において、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγ活性化効果のあることが確認されている。よって、この香醋の低級アルカノール抽出物をＰＰＡＲ活性化剤として使用するにあたっては、これを多量に添加または摂取する必要がある。
　本発明者らは、香醋から選択的に高いＰＰＡＲ活性化作用を有する成分を抽出することで、ＰＰＡＲ活性化作用を有効に生じさせると共に添加量または摂取量の調整を可能にすることができ、さらには、薬剤や食品としての利用を可能にできるという考えのもと、研究を進めていった。
　従って、本発明の目的は、香醋から高いＰＰＡＲ活性化作用を有する抽出物又は分画物を選択的に製造する方法、及びその方法により製造されたＰＰＡＲ活性化剤を提供することにある。
　本発明のＰＰＡＲ活性化剤の製造方法は、香醋から香醋抽出物を得る工程と、この香醋抽出物における、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 で表されるＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を検出する工程を含む。
　本発明者らは、香醋に種々の分画又は分配処理等を施し、分画方法や得られた分画物を検討した結果、高いＰＰＡＲα活性化作用及びＰＰＡＲγ活性化作用の両方を有する分画物中に、上記化学式（１）で示されるＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）が多く含まれていることを発見した。よって、このＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）をＰＰＡＲ活性化作用の指標として用いることができる。この方法によれば、香醋抽出物に含まれるＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を検出することによって、被検体である香醋抽出物中のＰＰＡＲ活性化作用の有無やその効果等を評価することができる。それゆえ、時間も手間もかかるＰＰＡＲ活性化作用を確認するためのアッセイ（遺伝子発現量やＰＰＡＲに関与する物質の検出など）を行うことなく、迅速かつ容易にＰＰＡＲ活性化作用を有する香醋抽出物を選択することが可能である。
　このＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を検出する工程には、液体クロマトグラフィーによって香醋抽出物を分析する工程が含まれることが好ましい。分析対象である香醋抽出物と、標準物質のＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）について液体クロマトグラフィーを行い、両者のクロマトグラムを比較することによって、さらに迅速かつ容易にＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）の有無、濃度等を検出することができる。
　また、香醋抽出物を得る工程には、香醋にブタノール、エタノール、酢酸エチル、ブチレングリコール又はクロロホルムから選択される少なくとも１つの溶媒を加え、香醋の溶媒抽出物を得る工程が含まれる。この製造方法によれば、好適な溶媒を用いた溶媒抽出処理により、高いＰＰＡＲα活性化作用及びＰＰＡＲγ活性化作用を有する香醋抽出物を容易に得ることができる。このＰＰＡＲ活性化作用を有する香醋抽出物はインスリン抵抗性、糖尿病、高脂血、高血圧、内臓脂肪型肥満、及び脂肪肝などのＰＰＡＲが関与する病態を改善する効果を有している。そのため、食品として身近な素材である香醋から、これらの病態の改善に役立つ食品、薬剤等に広く応用可能なＰＰＡＲ活性化剤を製造することができる。
　また、香醋抽出物を得る工程には、香醋の溶媒抽出物をクロマトグラフィーにより分離して、複数の画分を回収する工程が含まれることも好ましい。香醋の溶媒抽出物をクロマトグラフィーにかけ、ＰＰＡＲ活性化作用を有する画分、すなわち、Ｃｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）が含まれる画分を得ることにより、さらに選択的にＰＰＡＲ活性化作用を有する成分を得ることができる。
　クロマトグラフィーが、移動相にベンゼン－アセトンを用いたシリカゲルクロマトグラフィーであることが好ましい。このクロマトグラフィーを行うことにより、好適にＰＰＡＲ活性化作用を有する成分が分画される。
　クロマトグラフィーが移動相に水－メタノールを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィーであることが好ましい。このクロマトグラフィーを行うことによって、さらに好適にＰＰＡＲ活性化作用を有する成分が分画される。
　また、本発明のＰＰＡＲ活性化剤は、香醋にブタノール、エタノール、酢酸エチル、ブチレングリコール又はクロロホルムから選択される少なくとも１つの溶媒を加えて香醋の溶媒抽出物を得る工程と、香醋の溶媒抽出物をクロマトグラフィーにより分離して、複数の画分を回収する工程と、この複数の画分における、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 で表されるＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を検出し、Ｃｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を有する画分を得る工程から製造される。
　本発明によれば、ＰＰＡＲα活性化作用及びＰＰＡＲγ活性化作用の両方を有する香醋抽出物又は分画物を迅速かつ容易に選択することができるため、高いＰＰＡＲα活性化作用及びＰＰＡＲγ活性化作用の両方を有するＰＰＡＲ活性化剤を容易に製造することができる。このＰＰＡＲ活性化剤はインスリン抵抗性、糖尿病、高脂血、高血圧、内臓脂肪型肥満、及び脂肪肝などのＰＰＡＲが関与する病態を改善するために使用することができる。このように、食品として身近な素材である香醋から、上述のような病態の改善に役立つ食品、薬剤等に広く応用可能なＰＰＡＲ活性化剤を製造することができる。
本発明の第一の実施形態に係る香醋由来のＰＰＡＲ活性化剤の製造方法を概略的に説明するフローチャートである。 本発明の第二の実施形態に係る香醋由来のＰＰＡＲ活性化剤の製造方法を概略的に説明するフローチャートである 本発明の実施例１における各種香醋抽出物のＰＰＡＲαアゴニスト活性を示すグラフである。 本発明の実施例１における各種香醋抽出物のＰＰＡＲγアゴニスト活性を示すグラフである。 本発明の実施例３におけるＴＬＣの結果を示す写真である。 本発明の実施例４における分取ＴＬＣによる各画分のＰＰＡＲαアゴニスト活性を示すグラフである。 本発明の実施例４における分取ＴＬＣによる各画分のＰＰＡＲγアゴニスト活性を示すグラフである。 本発明の実施例６における逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラムである。 本発明の実施例７における逆相高速液体クロマトグラフィーの結果を示すクロマトグラムである。 本発明の実施例９における香醋精製物のＰＰＡＲαアゴニスト活性を示すグラフである。 本発明の実施例９における香醋精製物のＰＰＡＲγアゴニスト活性を示すグラフである。 本発明の実施例１０におけるアディポネクチン量の結果を示すグラフである。 本発明の実施例１０におけるトリグリセライド量の結果を示すグラフである。 本発明の実施例１１におけるａＰ２遺伝子の発現量の結果を示すグラフである。
　以下、図１を参照して、本発明の第一の実施形態について説明する。
　図１に示すように、本実施形態におけるＰＰＡＲ活性化剤Ｐ１の製造方法は、香醋（を準備する工程）Ｓ０と、香醋Ｓ０から香醋抽出物を得る抽出処理工程Ｓ１と、Ｃｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）検出工程Ｓ２とから構成される。
　この香醋（香酢）Ｓ０は、糯米に麹を添加してアルコール発酵させ、籾殻を添加して酢酸発酵させ、水を添加して抽出し、その抽出液を一定期間熟成させたものである。香醋の種類はこの熟成の期間によって分類されていることがある。本実施形態で用いられる香醋は、ＰＰＡＲ活性化作用に優れる観点から熟成期間が長いものが望ましく、１年以上熟成したものがより望ましく、８年以上熟成したものがさらに望ましい。具体的には、特に限定されないが、８年熟成恒順香醋（日本恒順株式会社）が好適に用いられる。
　図１に示す抽出処理工程Ｓ１について説明する。この抽出処理工程Ｓ１では、香醋Ｓ０から目的となるＰＰＡＲ活性化作用を有する成分を効率よく抽出することが行われる。具体的には、以下で説明する第二の実施形態で説明するが、有機溶媒を加えて有機溶媒相に目的成分を移動させる分配処理や、好適なクロマトグラフィー法を用いて、香醋Ｓ０を複数の画分に分離又は分画することが行われる。これらの抽出処理、すなわち、分配処理及び分離・分画処理は、単一の処理に限られず、同じ処理を複数回行うことや、複数種類の処理を組み合わせて行うことも可能である。
　次に、図１に示すＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）検出工程Ｓ２について説明する。この検出工程Ｓ２では、上述した抽出処理工程Ｓ１で得られた香醋抽出物について、Ｃｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を検出することが行われる。このＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）は、高いＰＰＡＲα活性化作用及びＰＰＡＲγ活性化作用の両方を有する香醋抽出物中に多く含まれる物質であり、ＰＰＡＲ活性化作用の指標として用いられる。それゆえ、香醋抽出物に含まれるＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を検出することによって、被検体である香醋抽出物中のＰＰＡＲ活性化作用の有無やその効果等を評価することができる。この検出は、被検体である香醋抽出物中のＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）の有無を検出すること、又はＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）の含有量を測定すること等により行われる。これにより、通常ＰＰＡＲ活性化作用を確認するために行われている遺伝子発現アッセイ等の確認試験を行わなくとも、迅速かつ容易にＰＰＡＲ活性化作用を有する香醋抽出物を選択することが可能である。選択基準としては、特に限定されないが、香酢抽出物の精製状況を考慮したうえで、その都度設定することが好ましい。
　この検出工程Ｓ２における検出方法としては、定量的に検出することができ、迅速かつ容易でもある観点から、香醋抽出物を液体クロマトグラフィーにかけて分析することが好ましい。具体的には、被検体である香醋抽出物と、標準物質のＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）について液体クロマトグラフィー分析を行い、両者のクロマトグラムを比較することが行われる。これにより、被検体である香醋抽出物中のＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）の有無及び含有量も検出することが可能である。
　この検出工程Ｓ２により選択されたＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）含有画分Ｐ１は、ＰＰＡＲα活性化作用及びＰＰＡＲγ活性化作用の両方の性質、すなわち、デュアルアゴニストとしての性質を有するものである。なお、本明細書において、「ＰＰＡＲ活性化作用」とは、「ＰＰＡＲアゴニスト活性」と同義である。また、本明細書において、ＰＰＡＲとは、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγ、又はこれらのうちいずれかのことをいう。また、いったん選択されたＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）含有画分Ｐ１について、さらに分画・分配処理等を行うことにより精製し、再度Ｃｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）検出処理Ｓ２を行って、さらに精製することも可能である。
　なお、このＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）は、互いに結合するバリン及びプロリンがそれぞれＬ型アミノ酸又はＤ型アミノ酸のいずれの組み合わせである場合も含まれるが、いずれもＬ型アミノ酸から構成されるもの、すなわち、Ｌ型のプロリンとＬ型のバリンが環状に結合したものが特に好ましい。
　さらに、Ｃｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）検出処理の対照試験として、通常行われているＰＰＡＲ活性化作用試験、すなわち、ＰＰＡＲ発現プラスミドにルシフェラーゼ構造遺伝子を連結させることによるレポーター遺伝子アッセイや、その他のＰＰＡＲが関与する遺伝子の発現やタンパク質量、脂質量、サイトカイン量などを測定する試験を合わせて行うことも可能である。
　本実施形態で得られたＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）含有画分Ｐ１をＰＰＡＲ活性化剤として使用する際には、他の物質を添加してもよい。例えば、香醋又は黒酢に由来するエキスなどの成分や、医薬品等に用いられる他の物質、例えば保存料、調味料、香料、着色料又はビタミン、ミネラル若しくはアミノ酸等の栄養素等を添加してもよい。
　次に、図２を参照して、本発明の第二の実施形態について説明する。
　図２に示すように、本実施形態におけるＰＰＡＲ活性化剤Ｐ１の製造方法は、香醋（を準備する工程）Ｓ０と、溶媒抽出による分配工程Ｓ１ａ及びクロマトグラフィーによる分画工程Ｓ１ｂと、Ｃｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）検出工程Ｓ２とから構成される。
　まず、図２に示す溶媒抽出による分配工程Ｓ１ａについて説明する。なお、香醋Ｓ０の構成等については、上述した第一の実施形態で用いられた香醋Ｓ０と同様である。この分配工程Ｓ１ａでは、香醋Ｓ０に溶媒を加え、加えた溶媒に目的となるＰＰＡＲ活性化作用を有する成分を移動させることが行われる。用いられる溶媒としては、有機溶媒が好適に用いられ、特に限定されないが、ｎ－ブタノール又はエタノールなどのアルカノール、酢酸エチル、ブチレングリコール及びクロロホルム等を用いることができる。これらの溶媒抽出による分配処理Ｓ１ａは、単一の処理に限られず、同じ溶媒での抽出処理を複数回行うことや、複数種類の溶媒抽出処理を組み合わせて行うことも可能である。
　図２に示す分配工程Ｓ１ａの一例として、有機溶媒としてアルカノールを用いた、香醋のアルカノール抽出処理について説明する。このアルカノール抽出処理では、香醋にアルカノールを加え、アルカノール相に目的となるＰＰＡＲ活性化作用を有する成分を移動させることが行われる。具体的には、特に限定されないが、香醋にアルカノールを加えてよく撹拌し、アルカノール相に目的となるＰＰＡＲ活性化作用を有する成分を移動させた後、遠心分離機などを用いてアルカノール相と水相とに分離し、アルカノール相を回収することにより行われる。この操作は複数回行われることが好ましい。香醋に含まれているＰＰＡＲ活性化作用を有する成分はアルカノールで好適に抽出されることから疎水性成分であると推測される。アルカノールとしては、低級アルカノールが好ましく、エタノールやブタノールなどが好適に用いられ、特にｎ－ブタノールが好適に用いられる。アルカノールの添加量としては、水相（香醋）の１０重量％から１０００重量％程度が好ましく、水相（香醋）の量の半分から２倍程度が最も好ましい。回収されたアルカノール相は、減圧濃縮処理等により溶媒を簡単に除去することができ、固形または濃縮された香醋のアルカノール抽出物を得ることができる。
　なお、上述した香醋のアルカノール抽出処理等の溶媒抽出による分配工程Ｓ１ａの前に、香醋Ｓ０に含まれている余分な脂肪成分を除去する目的で、香醋Ｓ０の脱脂処理を行うこともできる。香醋Ｓ０の脱脂処理を行うことにより、香醋に含まれている余分な脂質成分が除去されるため、後に行われる分配工程Ｓ１ａ等の抽出処理において目的とする成分を有効に抽出することが可能となる。具体的には、特に限定されないが、香醋Ｓ０に有機溶媒を加えてよく撹拌し、有機溶媒相に余分な脂肪成分を移動させた後、遠心分離機などを用いて水相と有機溶媒相とに分離し、水相を回収することにより行うことができる。この操作は複数回行われることが好ましい。有機溶媒としては、脱脂効果を有するものであればよく、たとえば、石油系有機溶媒やアルコール類などが好適に用いられ、特にｎ－ヘキサンが好適に用いられる。用いる有機溶媒の量としては、香醋の１０重量％から１０００重量％程度が好ましく、香醋の量の半分から２倍程度が最も好ましい。
　また、図２に示す分配工程Ｓ１ａの他の例として、有機溶媒としてクロロホルムを用いた際の抽出処理について説明する。このクロロホルム抽出処理では、香醋Ｓ０にクロロホルムを加え、クロロホルム相に目的となるＰＰＡＲ活性化作用を有する成分を効率よく移動させることが行われる。具体的には、たとえば香醋とクロロホルムとを分液漏斗を用いて分配し、クロロホルム相を回収することにより行われる。この場合、分配は複数回行われることが好ましい。クロロホルムの添加量としては、水相（香醋）の１０重量％から１０００重量％程度が好ましく、水相の量の半分から２倍程度が最も好ましい。香醋に含まれているＰＰＡＲ活性化作用を有する成分は、クロロホルムで好適に抽出されることから脂溶性物質であると推測され、単なるアミノ酸や糖質ではないものと考えられる。回収されたクロロホルム相は、減圧濃縮処理等により溶媒を簡単に除去することができ、固形または濃縮された香醋のクロロホルム抽出物を得ることができる。
　上述したクロロホルム抽出処理は、香醋Ｓ０に対してだけでなく、先に説明した香醋のアルカノール抽出物に対して行うことも可能である。具体的には、香醋のアルカノール抽出物を水に懸濁させたものにクロロホルムを加えて分液ロートを用いて分配し、クロロホルム相を回収することにより行われる。これにより目的となるＰＰＡＲ活性化作用を有する成分を精製することができる。
　次に、図２に示すクロマトグラフィーによる分画工程Ｓ１ｂについて説明する。これらの分画工程Ｓ１ｂでは、工程Ｓ１ａで得られた溶媒抽出物に含まれているＰＰＡＲ活性化作用を有する成分をさらに精製分離することを目的としている。クロマトグラフィーは分子量排除、イオン交換などの吸着、順相又は逆相などを１種又は複数種組み合わせて適宜使用することができるが、以下説明するように、シリカゲル及び逆相シリカゲルを用いた２種のクロマトグラフィーによって分離を行うことが好ましい。
　図２に示す分画工程Ｓ１ｂの一例として、シリカゲルクロマトグラフィーによる分画処理について説明する。この分画処理では、工程Ｓ１ａで得られた溶媒抽出物についてシリカゲルクロマトグラフィーを行い、複数の画分を得ることを目的としている。具体的には、特に限定されないが、シリカゲルが充填されたクロマト管の上にクロロホルム抽出物を吸着させたシリカゲルをのせ、その上から所定の移動相を流して溶出させることにより行われる。移動相としては、ベンゼン－アセトンが好適に用いられ、例えば、ベンゼン：アセトンの比を２０：１から１：１までの勾配とした移動相で溶出することにより、好適に分離することが可能である。
　次にＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）検出工程Ｓ２について説明する。この工程では、工程Ｓ１ｂで得られた複数の画分（フラクション）に含まれるＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を検出することによって、被検体である画分中のＰＰＡＲ活性化作用の有無やその効果等を評価することができる。これにより、通常ＰＰＡＲ活性化作用を確認するために行われている遺伝子発現アッセイ等の確認試験を行わなくとも、迅速かつ容易にＰＰＡＲ活性化作用を有する画分を選択することが可能である。その他の構成及び作用については、第一の実施形態におけるＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）検出工程Ｓ２と同様である。このようにして、得られた複数の画分についてＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を検出し、Ｃｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を含む画分を回収することにより、ＰＰＡＲ活性化作用を有する画分を容易に回収することが可能である。
　また、本実施形態における検出工程Ｓ２で選択（回収）された画分について、さらに他のクロマトグラフィー処理Ｓ１ｂ及びＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）検出処理Ｓ２を行い、ＰＰＡＲ活性化作用を有する成分を高度に精製することも可能である。一例として、逆相シリカゲルクロマトグラフィーによる分画処理について説明する。この分画処理では、上述したシリカゲルクロマトグラフィー処理により得られた画分であって、工程Ｓ２で選択された画分について逆相シリカゲルクロマトグラフィーを行っている。具体的には、特に限定されないが、シリカゲルクロマトグラフィーで得られた画分のメタノール溶液をクロマト管に充填した逆相シリカゲルに添加し、その上から所定の移動相を流して溶出させることにより行われる。移動相としては、水－メタノールが好適に用いられ、例えば、１０％メタノール水溶液、２０％メタノール水溶液、１００％メタノール等の勾配にした移動相で溶出することにより、好適に分離することが可能である。そして、得られた複数の画分（フラクション）について、上述したようにＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を検出し、Ｃｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を含む画分を回収する。これにより、容易にＰＰＡＲ活性化作用を有する画分を回収することができる。
　このようにして得られたＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）含有画分Ｐ１は、ＰＰＡＲα活性化作用及びＰＰＡＲγ活性化作用を有し、ＰＰＡＲ活性化剤として使用することができる。このＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）含有画分Ｐ１について、適宜さらに濃縮や溶解などを行い、使用しやすい形態に加工することができる。また、本実施形態で得られた画分Ｐ１をＰＰＡＲ活性化剤として使用する際には、他の物質を添加することもできる。例えば、香醋又は黒酢に由来するエキスなどの他の成分を添加してもよい。また、医薬品等に用いられる他の物質、例えば保存料、調味料、香料、着色料又はビタミン、ミネラル若しくはアミノ酸等の栄養素等を添加することも可能である。
　上述したこれらの実施形態で得られたＰＰＡＲ活性化剤Ｐ１はＰＰＡＲが関与する疾患や病状の治療や病態の改善に用いることができる。ここでの治療や病態の改善には、これらの疾患や病態に対する予防や予後の処置も含まれる。また、ＰＰＡＲ活性化剤とは、ＰＰＡＲα活性化剤及びＰＰＡＲγ活性化剤であることが特に好ましい。ＰＰＡＲαが関与する疾病には、脂肪酸酸化の刺激及び血清脂質の仲介作用に関与するものが広く含まれる。ＰＰＡＲγが関与する疾病には、脂肪細胞の分化に関与するものが広く含まれる。特にインスリン抵抗性、糖尿病、高脂血、高血圧、内臓脂肪型肥満若しくは脂肪肝、又はこれらに関連する疾患は、これらＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγが関与する疾患の中に広く含まれる。本実施形態で得られたＰＰＡＲ活性化剤Ｐ１は、これらの疾患の一つ又は複数の病状に対する治療や病態の改善に用いられ得る。
　以下の実施例におけるＰＰＡＲ活性化試験の測定方法は、下記の通りである。
（１）ＰＰＡＲα活性化試験
（１－１）準備
　レポーター遺伝子アッセイを行うため、ＰＰＡＲαＧａｌ４融合タンパク質発現プラスミドのｐＰＰＡＲα－Ｇａｌ４、Ｇａｌ４タンパク質結合配列の下流にルシフェラーゼ構造遺伝子を連結したプラスミドのｐＧａｌ４－Ｌｕｃ及び形質転換効率補正用プラスミドのｐＳＥＡＰ－コントロールベクター（クロンテック製品）を準備した。他方、ＣＯＳ－１細胞（アフリカミドリザル腎由来）の培地として、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、０．０６％Ｌ－グルタミン及び０．２％ＮａＨＣＯ３を含むダルベッコ変法イーグル培地「ニッスイ」２(ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社)を調整した。この培地を用いて６０ｍｍシャーレにＣＯＳ－１細胞を５×１０５ｃｅｌｌｓとなるように播き、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養を行った。
（１－２）ＣＯＳ－１細胞の形質転換
　２４時間培養後の細胞に、０．２５μｇのｐＰＰＡＲα－Ｇａｌ４、１μｇのｐＧａｌ４－Ｌｕｃ、及び１μｇのｐＳＥＡＰ－ｃｏｎｔｒｏｌベクターをコトランスフェクトし、ＣＯＳ－１細胞の形質転換を行った。形質転換にはEffectence Transfection Reagent（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用した。形質転換操作後、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて１６時間インキュベートを行った。
（１－３）被検試料の添加
　インキュベート後、トリプシン処理によりＣＯＳ－１細胞を回収し、６ｍＬの培地に懸濁した。懸濁した細胞を９６ｗｅｌｌプレートに１２５μＬ／ｗｅｌｌ（０．８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）ずつ播き、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて１～２時間インキュベートを行った。インキュベート後、被検試料として香醋抽出物、対照物質であるＤＭＳＯ、ＰＰＡＲαアゴニストであるＷＹ１４６４３（最終濃度：５０μＭ／Ｌ）をそれぞれ１．２５μＬ／ｗｅｌｌ添加し、その後３７℃、５％ＣＯ２存在下にて２４時間インキュベートを行った。
（１－４）ルシフェラーゼ活性及びＳＥＡＰ活性の測定
　９６ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌから培養液２５μＬを回収し、別の９６ｗｅｌｌプレートに移した。その後、元の９６ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌにルシフェラーゼ活性測定液（６０ｍＭのトリシン　ｐＨ７．８，１６ｍＭの酢酸マグネシウム，０．４ｍＭのＥＤＴＡ，１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，０．５ｍＭのＤ－ルシフェリンカリウム塩，１．５ｍＭのＡＴＰ，０．５ｍＭのＣｏＡ及び０．１ｍＭのβメルカプトエタノール）を１００μＬずつ添加し、暗室にて３５分間インキュベートした後、プレートリーダーにて発光強度を測定した。
　他方、培養液２５μＬを分取した９６ｗｅｌｌプレートについて、分泌性アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）活性を測定した。各ｗｅｌｌに２５μＬの１×Ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（５×Ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ：ＮａＣｌ４．３８ｇ，Ｔｒｉｓ２．４２ｇを９０ｍｌの超純水に溶解させた後、塩酸でｐＨ７．２に調整、を水で希釈したもの）を添加して６５℃で３０分間インキュベートした後、４℃で５分間冷却した。各ｗｅｌｌに９０μＬのＡｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌ－ホモアルギニン塩酸塩０．９ｇとＭｇＣｌ２０．０４ｇとを超純水１５８ｍｌに溶解させた後、ジエタノールアミン４２ｍｌを加え、塩酸でｐＨ９．８に調整したもの）を添加し、２５℃で５分間放置した。次に各ｗｅｌｌに１０μＬのＭＵＰ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１×Ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ２．７μＬ，　Ａｓｓａｙ　Ｂｕｆｆｅｒ７μＬ，１０×ＭＵＰ０．３μＬを使用直前に混合したもの。１０×ＭＵＰは、１×Ｄｉｌｌｕｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ　１ｍＬにリン酸４－メチルウンベリフェリル（ＭＵＰ）２．５６ｍｇを溶解させたもの）を添加して攪拌した。暗室にて６０分間２５℃条件下で反応させた後、４－メチルウンベリフェロンに基づく蛍光強度（Ｅｘ＝６０ｎｍ，Ｅｍ＝４６０ｎｍ）を測定した。ＰＰＡＲアゴニスト活性評価に際しては、ルシフェラーゼ活性をＳＥＡＰ活性にて補正した。ＰＰＡＲα活性化作用の評価系最適化においては、ＷＹ１４６４３（５０μＭ）をコントロール物質として用いた。
（２）ＰＰＡＲγ活性化試験
　レポーター遺伝子アッセイに際し、ｐＰＰＡＲα－Ｇａｌ４に変えてＰＰＡＲγＧａｌ４融合タンパク質発現プラスミドのｐＰＰＡＲγ－Ｇａｌ４を用い、被検試料の添加に際し、ＷＹ１４６４３に変えてＰＰＡＲγアゴニストであるトログリタゾン（最終濃度：１０μＭ）を用いた他は、ＰＰＡＲα活性化試験と同様に行った。
　［実施例１　抽出溶媒の検証］
　香醋（８年熟成恒順香醋、日本恒順株式会社）をｐＨ３に調整した。この香醋について、クロロホルム、酢酸エチル及びｎ－ブタノールにて順次分配を行い、クロロホルム層、酢酸エチル層及びｎ－ブタノール層をそれぞれ回収した。回収した各層について減圧下濃縮を行って溶媒を除去したのち、ＤＭＳＯに溶解させ、各香醋粗抽出物を得た。得られた各香醋粗抽出物を被検試料として、ＰＰＡＲα活性化試験及びＰＰＡＲγ活性化試験を行い、各香醋粗抽出物のＰＰＡＲアゴニスト活性を評価した。さらに、ｐＨ７、ｐＨ１０に調整した香醋（８年熟成恒順香醋、日本恒順株式会社）についても同様の試験を行った。
　各香醋粗抽出物のＰＰＡＲαアゴニスト活性を図３ａに、ＰＰＡＲγアゴニスト活性を図３ｂに示す。これらの図の縦軸はルシフェラーゼの発光強度、横軸は対照区（ＷＹ１４６４３又はトログリタゾン）と、各香醋粗抽出物の抽出溶媒をｐＨ調整値ごとに示している。具体的には、Ｃｌ；クロロホルム、ＥＡ；酢酸エチル、Ｂｕ；ｎ－ブタノール、Ｈ２Ｏ；水を示している。図３ａ及び図３ｂに示すように、ＰＰＡＲαアゴニスト活性及びＰＰＡＲγアゴニスト活性のいずれにおいても、クロロホルム抽出物の活性が高いことから、ＰＰＡＲ活性化作用を有する成分は、脂溶性物質であると考えられた。
　［実施例２　香醋抽出物の製造］
　（１）脱脂処理
　香醋（８年熟成恒順香醋、日本恒順株式会社）１．２Ｌに対して、等量のｎ－ヘキサンを加えてよく撹拌したのち、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、水層を回収した。この分配操作を３回行い、香醋に含まれる余分な脂質成分を除去した。
　（２）アルカノール抽出処理
　次に、回収した水層に等量の水飽和ｎ－ブタノールを加えてよく撹拌したのち、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、水飽和ｎ－ブタノール層を回収した。この分配操作を３回行った。３回目に回収された水飽和ｎ－ブタノール層について減圧下濃縮を行って溶媒を除去し、ブタノール粗抽出物を得た。
　（３）クロロホルム抽出処理
　上述のようにして得たブタノール粗抽出物を水２００ｍＬに懸濁させた。２００ｍＬのクロロホルムを加え、分液ロートを用いて３回分配操作を行い、クロロホルム層を回収した。回収したクロロホルム層の減圧下濃縮を行って溶媒を除去し、４６９０ｍｇの香醋抽出物を得た。
　［実施例３　薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による最適分離条件の検討］
　実施例２で得た香醋抽出物をさらに抽出・精製し、ＰＰＡＲアゴニスト活性を有する香醋精製物を得るため、ＴＬＣによる最適分離条件の検討を行った。実施例２で得た香醋抽出物を１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにアセトンに溶かした。このアセトン溶液を１ｃｍ×１０ｃｍのＴＬＣにスポットし、種々の展開溶媒で最適分離条件の検討を行った。これにより、実施例２で得た香醋抽出物はベンゼン：アセトン＝１：１の条件において最適な分離が行われることがわかった。この最適分離を示した条件（ベンゼン：アセトン＝１：１）におけるＴＬＣの結果を図４に示す。実施例２で得た香醋抽出物はこの条件において、７つの画分（Ｆｒ．１～Ｆｒ．７）に分離された。
　［実施例４　分取ＴＬＣによる各画分のＰＰＡＲアゴニスト活性］
　実施例２で得た香醋抽出物１０ｍｇを少量のアセトンに溶解させた。その後、１０ｃｍ×２０ｃｍのＴＬＣプレートの下から２ｃｍのところにこの試料をのせ、最適溶媒（ベンゼン：アセトン＝１：１）において展開させた。展開後、ＵＶランプを使用し、素早く鉛筆を用いて７つの画分（Ｆｒ．１～Ｆｒ．７）を分け、各画分のシリカゲルを１５ｍＬチューブにそれぞれ回収した。回収したシリカゲルにアセトンを約６ｍＬ加えて撹拌し、３５００ｒｐｍで３分間遠心分離を行い、上清を回収した。この抽出操作を２回行った。回収した上清の減圧下濃縮を行って溶媒を除去し、２００μＬのＤＭＳＯに溶解させた。この各画分のＤＭＳＯ溶液及び実施例２で得た香醋抽出物のＤＭＳＯ溶液（香醋抽出物１０ｍｇを２００μＬのＤＭＳＯに溶解させたもの）を被検試料として、ＰＰＡＲα活性化試験及びＰＰＡＲγ活性化試験を行い、各画分のＰＰＡＲアゴニスト活性を評価した。
　各画分のＰＰＡＲαアゴニスト活性を図５ａに、ＰＰＡＲγアゴニスト活性を図５ｂに示す。これらの図の縦軸はルシフェラーゼの発光強度、横軸は対照区（ＷＹ１４６４３又はトログリタゾン）と、各画分（Ｆｒ．１～Ｆｒ．７）及び香醋抽出物を示している。各画分の濃度は５００(μｇ／ｍＬ)となっているが、この値は各画分の成分濃度ではなく、ＴＬＣ分離前の香醋抽出物１０ｍｇに基づく値（ＴＬＣで分離後、各画分を２００μＬのＤＭＳＯに溶解させた）を意味している。図５ａ及び図５ｂに示すように、ＰＰＡＲαアゴニスト活性及びＰＰＡＲγアゴニスト活性のいずれにおいても、Ｒｆ値の低い画分（Ｆｒ．５～Ｆｒ．７）に高い活性があることがわかった。
　［実施例５　シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる活性画分の分離］
　実施例２で得た４６００ｍｇの香醋抽出物を少量のアセトンに溶かし、約６．０ｇのシリカゲル（シリカゲル６０Ｎ：関東化学）に吸着させた。次に、ガラスクロマト管（４０×２ｃｍ、１２０ｍＬ）にシリカゲルを約６０ｇ充填し、その上に香醋抽出物を吸着させたシリカゲルをのせた。ベンゼン：アセトン＝２０：１、１０：１、５：１、３：１、１：１及びアセトン１００％の順番に３００ｍＬずつ溶媒を流し、アセトン１００％溶媒以外は１５０ｍＬずつ２回に画分を分けて回収し、アセトン１００％溶媒は３００ｍＬ全て回収した。回収した各画分を１ｍｌずつ２ｍＬチューブに取って減圧下濃縮を行い、溶媒を除去して少量のアセトンに溶かした。この各画分のアセトン溶液と、実施例２で得た香醋抽出物とを１０ｃｍ×１０ｃｍのＴＬＣにスポットし、ベンゼン：アセトン＝１：１の溶媒で展開して分離状況を確認した。この分離状況の確認により、ベンゼン：アセトン＝３：１及び１：１の溶出画分に目的とする高いＰＰＡＲ活性化作用を有する成分が存在することがわかった。
　［実施例６　逆相高速液体クロマトグラフィーによる最適分離条件の検討］
　実施例５で得た、ベンゼン：アセトン＝３：１画分及び１：１画分をさらに精製し、ＰＰＡＲアゴニスト活性を有する香醋精製物を得るため、逆相高速液体クロマトグラフィーによる最適分離条件の検討を行った。ベンゼン：アセトン＝３：１画分及び１：１画分を合わせて、１０ｍｇ／ｍＬ濃度になるようメタノールで調整した。そして、逆相高速液体クロマトグラフィー（使用カラム；Mightysil RP-18 GP 150-2.0（５μｍ）：関東化学株式会社）を用いて最適分離条件の検討を行った。この結果、注入量：１０μＬ、溶媒：水，メタノール、０分；２０％ＭｅＯＨ－５０分；７０％ＭｅＯＨの条件下において最適に分離できることがわかった。この条件における分離のクロマトグラムを図６に示す。このクロマトグラムには複数の成分を示すピークが存在する。このピークを構成する成分をそれぞれ分離することによって、さらに高いＰＰＡＲ活性化作用を有する抽出物を得ることを試みた。
　次に、実施例５で得た、ベンゼン：アセトン＝３：１画分及び１：１画分を合わせ、メタノールにより１０ｍｇ／ｍＬ濃度に調整し、上記の最適分離条件において逆相高速液体クロマトグラフィーを行った。溶出時間０分－３８分まで２分毎に各溶出液を試験管に回収した。回収した各溶出液をそれぞれ減圧下濃縮して溶媒を除去した後、少量のメタノールを加えて撹拌した。この各メタノール溶液をそれぞれ１．５ｍＬチューブに移して減圧下濃縮を行い、溶媒を除去し、５０μＬのＤＭＳＯに溶解させた。これを被検試料として、ＰＰＡＲα活性化試験及びＰＰＡＲγ活性化試験を行い、各試料のＰＰＡＲアゴニスト活性を評価した。この結果、１０～１４分に回収した溶出液の画分に目的とする高いＰＰＡＲ活性化作用を有する成分が存在することがわかった。よって、図６に示すクロマトグラムの１０～１４分のピークを構成する物質がＰＰＡＲ活性化作用を有するものと認められる。
　［実施例７　逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる活性画分の分取］
　ガラスクロマト管（４０×２ｃｍ、１２０ｍＬ）に分取用逆相Ｃ１８充填剤（全多孔性球状シリカゲル、コスモシール　１４０Ｃ１８－ＯＰＮ、ナカライテスク株式会社）３００ｍＬをメタノールで懸濁させて充填した。脱気したメタノール１００％を、気泡を作らないようにこの充填剤に３００ｍＬ注いで流した。次に、充填剤の１０倍量（３Ｌ）の脱気したメタノール１０％で充填剤を平衡化した。そして、実施例５で得た、ベンゼン：アセトン＝３：１画分及び１：１画分を集めてメタノールにより４００ｍｇ／ｍｌ濃度に調整し、これを１０ｍＬ充填剤の上から添加した。そして、脱気した１０％メタノール、２０％メタノール及び１００％メタノール（全量９００ｍｌ）の順に溶媒を流し、１０％メタノール溶媒は２回に分けて回収し、２０％メタノール溶媒は４回に分けて回収した。回収した各画分の溶出液を３００μＬずつサンプルカップ（信和化工株式会社）に移し、ベンゼン：アセトン＝３：１画分及び１：１画分と一緒に逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて分離状況の確認を行った。この結果、２０％メタノール溶出画分に目的とする活性成分が存在することがわかった。２０％メタノール溶出画分のクロマトグラムを図７に示す。この図７に示すクロマトグラムでは、図６（ベンゼン：アセトン＝３：１画分及び１：１画分）で示された１０～１４分に存在するピーク（ＰＰＡＲ活性化作用を有する成分）と同じ位置に主なピークが存在している。これにより、この２０％メタノール溶出画分に含まれる成分がＰＰＡＲ活性化作用を有すると推定される。得られた２０％メタノール溶出画分を減圧下濃縮して溶媒を除去し、保存した。
　［実施例８　香醋精製物中に含まれる成分の構造決定］
　実施例７で得た２０％メタノール溶出画分（以下、「香醋精製物」という）をメタノールＤ４に溶解し、高分解能positive ion ＦＡＢ－ＭＳ、１Ｈ及び１３Ｃ及び各種２次元ＮＭＲスペクトルを用いて構造解析を行った。高分解能positive ion ＦＡＢ－ＭＳより、この香醋精製物に含まれている主な成分の組成式はＣ１０Ｈ１６Ｎ２Ｏ２であることが明らかとなった。さらに１Ｈおよび１３Ｃ－ＮＭＲ、さらに各種２次元ＮＭＲスペクトルを詳細に解析した結果、このＣ１０Ｈ１６Ｎ２Ｏ２はバリン及びプロリンから構成される環状ジペプチド、Ｃｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）であることが明らかとなった。これにより、このＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を含む画分にＰＰＡＲ活性化作用があることがわかった。また、この香醋精製物についてキラル薄層クロマトグラフィーを行い、Ｃｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を構成するアミノ酸の立体配置を検討したところ、いずれもＬ型であることが明らかとなった。
　［実施例９　香醋精製物の活性測定］
　実施例７で得た香醋精製物を被検試料として、ＰＰＡＲα活性化試験及びＰＰＡＲγ活性化試験を行い、各画分のＰＰＡＲアゴニスト活性を評価した。香醋精製物の添加濃度は１００μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ（香醋精製物中に実施例８で解析されたＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）のみが含まれていると仮定すると、この化合物の添加濃度はそれぞれ５００μＭ、２５０μＭ、１２５μＭとなる）とした。また、比較のためにプロリン単体及びバリン単体についても香醋精製物についてＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）のみが含まれていると仮定した場合のモル濃度と同濃度において同様の試験を行った。
　各試験区のＰＰＡＲαアゴニスト活性を図８ａに、ＰＰＡＲγアゴニスト活性を図８ｂに示す。これらの図の縦軸はコントロール物質（ＷＹ１４６４３；５０μＭ、又はトログリタゾン；１０μＭ）の活性に対する試験区の活性の比である。図８ａ及び図８ｂに示すように、香醋精製物は、ほぼ濃度依存でＰＰＡＲαアゴニスト活性及びＰＰＡＲγアゴニスト活性を有することがわかった。他方、単一のアミノ酸であるプロリン及びバリンにはほとんどＰＰＡＲアゴニスト活性がないことが示された。
　また、この香醋精製物は、特許文献２のアルカノール抽出物が培養液中に０．５～１％の含有量であるのに対して、低濃度の添加量で活性を示している。この結果から、この香醋精製物が高い比活性を有することも示された。
　［実施例１０　アディポネクチン分泌量とトリグリセライド蓄積量の測定］
　ＰＰＡＲγは、前駆脂肪細胞の分化を促進し、小型脂肪細胞を増加させる結果、脂肪細胞からインスリン感受性ホルモンのアディポネクチンの分泌量を増大させ、トリグリセライド量を低下させる。香醋精製物のＰＰＡＲγアゴニストとしての作用を確認するため、脂肪細胞のアディポネクチン分泌やトリグリセライド（ＴＧ）蓄積に対する香醋精製物の作用を確認する試験を行った。試験は次のように行った。まず、３Ｔ３－Ｌ１細胞を１２ｗｅｌｌプレートに１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種した。７～８日間培養後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に、最終濃度が０．２５ｍＭ ＤＥＸ、１０ｍｇ／ｍＬ ｉｎｓｕｌｉｎ、０．５ｍＭ ＩＢＭＸとなるように添加し、脂肪細胞への分化誘導を行った。その後、被検試料としてＤＭＳＯに溶解させた香醋精製物が１０μｇ／ｍＬとなるように添加し、比較試料としてトログリタゾンが１０μＭとなるように添加した。また、コントロール物質としてはＤＭＳＯを用いた。２日後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地にｉｎｓｕｌｉｎを最終濃度５ｍｇ／ｍＬ添加した培地に培地交換し、脂肪細胞への分化促進を行った。８日後の細胞について、アディポネクチン量及びトリグリセライド量の測定を行った。トリグリセライド量の測定は、トリグリセライドＥ－テストワコー（和光純薬株式会社）を用いて行った。
　アディポネクチン量の結果を図９ａに、トリグリセライド量の結果を図９ｂに示す。これらの図の縦軸はそれぞれアディポネクチン又はトリグリセライドの量を示す。図９ａ及び図９ｂに示すように、香醋精製物はアディポネクチン分泌量を上昇させ、トリグリセライド蓄積量を低下させる作用のあることがわかった。この結果は、この香醋精製物がＰＰＡＲγを活性化させる作用を有し、ＰＰＡＲ活性化剤であることを裏付けるものである。
　［実施例１１　ａＰ２遺伝子発現量の測定］
　ａＰ２（Adipose fatty acid binding protein）はＰＰＡＲγの標的遺伝子である。香醋精製物のＰＰＡＲγアゴニストとしての作用を確認するため、ａＰ２遺伝子の発現に対する香醋精製物の作用を確認する試験を行った。試験は実施例１０と同様に行い、分化促進培地に交換後、８日後の細胞についてｍＲＮＡを回収し、ｍＲＮＡ量を定量した。ｍＲＮＡ定量は、ライトサイクラー（ロシュ・アプライド・サイエンス）を用いて行った。結果を図１０に示す。図の縦軸はコントロール物質のａＰ２発現量に対する香醋精製物のａＰ２発現量の比である。図１０に示すように、香醋精製物はａＰ２の発現レベルを上昇させる作用のあることがわかった。この結果は、この香醋精製物がＰＰＡＲγを活性化させる作用を有し、ＰＰＡＲ活性化剤であることを裏付けるものである。
　以上述べた実施例は全て本発明を例示的に示すものであって限定的に示すものではなく、本発明は他の種々の変形態様及び変更態様で実施することができる。従って本発明の範囲は特許請求の範囲及びその均等範囲によってのみ規定されるものである。
　本発明はＰＰＡＲが関与する生活習慣病やその他病態を予防又は改善するＰＰＡＲ活性化剤の製造方法を提供するため、医療や機能性食品分野の産業において幅広く役立つものである。
　Ｓ０　香醋
　Ｓ１　抽出処理工程
　Ｓ２　Ｃｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）検出工程
　Ｐ１　Ｃｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）含有画分（ＰＰＡＲ活性化剤）
　Ｓ１ａ　溶媒抽出による分配工程
　Ｓ１ｂ　クロマトグラフィーによる分画工程

Claims (7)

  1. 　香醋から香醋抽出物を得る工程と、
    　前記香醋抽出物における、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     で表されるＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を検出する工程を含むことを特徴とするＰＰＡＲ活性化剤の製造方法。
  2. 　前記Ｃｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を検出する工程には、液体クロマトグラフィーによって前記香醋抽出物を分析する工程が含まれることを特徴とする請求項１に記載のＰＰＡＲ活性化剤の製造方法。
  3. 　前記香醋抽出物を得る工程には、香醋にブタノール、エタノール、酢酸エチル、ブチレングリコール又はクロロホルムから選択される少なくとも１つの溶媒を加え、香醋の溶媒抽出物を得る工程が含まれることを特徴とする請求項１又は２に記載のＰＰＡＲ活性化剤の製造方法。
  4. 　前記香醋抽出物を得る工程には、前記香醋の溶媒抽出物をクロマトグラフィーにより分離して、複数の画分を回収する工程が含まれることを特徴とする請求項３に記載のＰＰＡＲ活性化剤の製造方法。
  5. 　前記クロマトグラフィーが、移動相にベンゼン－アセトンを用いたシリカゲルクロマトグラフィーであることを特徴とする請求項４に記載のＰＰＡＲ活性化剤の製造方法。
  6. 　前記クロマトグラフィーが移動相に水－メタノールを用いた逆相シリカゲルクロマトグラフィーであることを特徴とする請求項４に記載のＰＰＡＲ活性化剤の製造方法。
  7. 　香醋にブタノール、エタノール、酢酸エチル、ブチレングリコール又はクロロホルムから選択される少なくとも１つの溶媒を加えて香醋の溶媒抽出物を得る工程と、
    　前記香醋の溶媒抽出物をクロマトグラフィーにより分離して、複数の画分を回収する工程と、
    　前記複数の画分における、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     で表されるＣｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を検出し、該Ｃｙｃｌｏ（－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－）を有する画分を得る工程から製造されることを特徴とするＰＰＡＲ活性化剤。
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