CN104003923B - 蝼蛄中生物碱类化合物的提取方法及该化合物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了蝼蛄中生物碱类化合物的提取方法即该化合物的应用，包括提取浸膏、冷藏陈放后硅胶拌样、层析柱色谱分离、薄层色谱法分析和常压柱色谱分离提取各个化合物等步骤；通过该方法得到了两类5个来源于节肢动物蝼蛄中的生物碱类化合物，均是在节肢动物中首次报道发现的新化合物。该组分被测试有广谱的抗菌性能，可以作为广谱抗菌消毒剂或新的抗菌剂开发，本发明公开的新发现的来自于昆虫或节肢动物生物碱成分，将为该古老的传统药材提供一个新的用途。

Description

蝼蛄中生物碱类化合物的提取方法及该化合物的应用
技术领域
本发明属于中药有效成分提取技术领域，主要涉及一种蝼蛄中生物碱类化合物的提取方法及该化合物的应用。
背景技术
目前，天然产物方面的研究主要集中于陆生植物和海洋生物，而昆虫和无脊椎动物天然产物研究刚刚开始。另一方面，陆生药源日渐减少，而昆虫源中蕴藏的大量的生物活性物质，成为可发掘利用的宝贵资源。近年来由于现代分离、检测技术在天然产物化学研究中的快速发展，昆虫及无脊椎动物天然产物化学研究探索的问题不但可成功得到解决，而且提高了天然产物研究中微量成分、及复杂结构成分的发现几率和研究效率，因此昆虫天然产物的研究探索已引人瞩目。据中医药记载，蝼蛄为昆虫类药物，历史悠久。蝼蛄在分类上属昆虫纲，直翅目，蝼蛄科，在我国有关蝼蛄种类的分类不一，根据形态和分布，有的分为4种，有的分为3种。《本草纲目药物彩色图谱》提出有6种。常见的分布较广的为（非洲蝼蛄GryllotalpaafricanaPal.deBeauvois，又称东方蝼蛄)华东蝼蛄(GryllotalpaunispinaSauss)，其次为台湾蝼蛄GryllotalpaformosanaShiraki，还有分布较少的金秀蝼蛄Gryllotalpa.jinxiuensisYouetLin，河南蝼蛄G.henanaCaietNiu和普通蝼蛄Gryllotalpa.gryllotalpalinnaeus。形成药材的主要为前两种。
发明内容
本发明的目的是提供一种蝼蛄中生物碱类化合物的提取方法，通过该方法从蝼蛄中的含氮生物碱类化合物属于黄杨属含氮甾体类生物碱化合物的衍生物，被测试有广谱抗菌性能，可以作为广谱抗菌消毒剂或新的抗菌剂开发，为该古老的传统药材提供一个新的用途。
本发明实现上述目的采用的技术方案是：蝼蛄中生物碱类化合物的提取方法，包括以下步骤：
步骤一、取蝼蛄原材料，干燥，粉碎，得到蝼蛄粉，备用；在温度为30-50℃条件下，向蝼蛄粉中加入蝼蛄粉重量5-20倍的二氯甲烷脱除虫蜡，经固液分离后，将得到的虫渣风干，再向干燥的虫渣中加入虫渣重量10-20倍的质量浓度为70%的甲醇，在30-50℃条件下，超声辅助提取和过滤，将滤液蒸发浓缩，得到浸膏状物，备用；
步骤二、将步骤一得到的浸膏状物用质量浓度为70%的甲醇溶剂溶解，然后在-4℃条件下冷陈12h，冷陈结束后除去不溶物，并将得到的清液在50℃温度下减压浓缩，得到的浓缩液加入硅胶进行拌样，搅拌均匀后置于通风处干燥，得到拌料样品，备用；
步骤三、取步骤二得到的拌料样品以及拌料样品重量25-30倍的硅胶，先将硅胶装入层析柱，再将拌料样品进行湿法上样，然后依次用体积比为9:1、7:3、1:1、3:7和1:9的氯仿和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，洗脱得到的馏分均采用TLC进行分析，合并相似馏分，共得到的馏分段1-15，备用；
步骤四、将步骤三得到的馏分段5运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1和7:3的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为7:3的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，然后将有固体析出的馏分进行过滤，得到固体化合物，固体化合物进一步经环己烷-丙酮重结晶后即得到白色固体粉末，即化合物Ⅱ；
将步骤三得到的馏分段7运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3和1:1的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为1：1的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体，将白色固体重结晶后得到白色固体粉末，即化合物Ⅲ；
将步骤三得到的馏分段9运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3、1:1和3:7的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为3:7的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体和母液，将白色固体重结晶后得到白色固体粉末，即化合物Ⅳ；将母液放置28h，二次固体析出，经固液分离，得到白色粉末为化合物Ⅴ；
将步骤三得到的馏分段11运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3、1:1和3:7的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为3:7的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体，即化合物Ⅰ；
所述的化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的结构式分别为：
化合物Ⅰ；
化合物Ⅱ；
化合物Ⅲ；
化合物Ⅳ；
化合物Ⅴ。
所述的步骤一中将过滤得到的滤渣重复进行超声辅助提取和过滤，超声辅助提取和过滤共重复操作2次，每次超声辅助提取的时间为18-36h，然后合并所有滤液进行浓缩。
所述的步骤二中质量浓度为70%的甲醇溶剂的用量为浸膏状物重量的3-5倍。
所述的五个从蝼蛄中提取的生物碱类化合物是首次在节肢动物蝼蛄的次生代谢物中发现的，蝼蛄为非洲蝼蛄，或者华东蝼蛄，或者其他蝼蛄科蝼蛄属群。
本发明得到的生物碱类化合物被测试有广谱抗菌性能，可以作为广谱抗菌消毒剂或新的抗菌剂开发，为该古老的传统药材提供一个新的用途。
本发明的有益效果
其一、本发明提取得到的五个来源于节肢动物蝼蛄中的含氮生物碱类化合物，分为两类，其中四个属于黄杨属含氮甾体类生物碱化合物的衍生物。黄杨属生物碱类化合物属黄杨属植物的主要成分，该类化合物已经从黄杨属的植物中分离得到上百种，而本申请得到的新化合物是首次从昆虫动物中分离得到。结构分析表明，从动物中得到的黄杨属生物碱类化合物的结构是不同于植物的一类新衍生物化合物，主要体现在化合物中的苯甲酰基侧链被连接在C-30位上，而不是植物中常见的通常取代在C-3位上，另一个典型特征是动物该类衍生物都是多酰基的结构类型。
其二、本发明得到的生物碱类化合物被测试有广谱抗菌性能，可以作为广谱抗菌消毒剂或新的抗菌剂开发，为该古老的传统药材提供一个新的用途。同时，本发明对于节肢动物的次生代谢物的研究开发利用，提供了新的用途。
具体实施方式
蝼蛄中生物碱类化合物的提取方法，包括以下步骤：
步骤一、取蝼蛄原材料，干燥，粉碎，得到蝼蛄粉，备用；在温度为30-50℃条件下，向蝼蛄粉中加入蝼蛄粉重量5-20倍的二氯甲烷脱除虫蜡，经固液分离后，将得到的虫渣风干，再向干燥的虫渣中加入虫渣重量10-20倍的质量浓度为70%的甲醇，在30-50℃条件下，超声辅助提取和过滤，将滤液蒸发浓缩，得到浸膏状物，备用；
步骤二、将步骤一得到的浸膏状物用质量浓度为70%的甲醇溶剂溶解，然后在-4℃条件下冷陈12h，冷陈结束后除去不溶物，并将得到的清液在50℃温度下减压浓缩，得到的浓缩液加入硅胶进行拌样，搅拌均匀后置于通风处干燥，得到拌料样品，备用；
步骤三、取步骤二得到的拌料样品以及拌料样品重量25-30倍的硅胶，先将硅胶装入层析柱，再将拌料样品进行湿法上样，然后依次用体积比为9:1、7:3、1:1、3:7和1:9的氯仿和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，洗脱得到的馏分均采用TLC进行分析，合并相似馏分，共得到的馏分段1-15，备用；
步骤四、将步骤三得到的馏分段5运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1和7:3的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为7:3的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，然后将有固体析出的馏分进行过滤，得到固体化合物，固体化合物进一步经环己烷-丙酮重结晶后即得到白色固体粉末，即化合物Ⅱ；
将步骤三得到的馏分段7运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3和1:1的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为1：1的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体，将白色固体重结晶后得到白色固体粉末，即化合物Ⅲ；
将步骤三得到的馏分段9运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3、1:1和3:7的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为3:7的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体和母液，将白色固体重结晶后得到白色固体粉末，即化合物Ⅳ；将母液放置28h，二次固体析出，经固液分离，得到白色粉末为化合物Ⅴ；
将步骤三得到的馏分段11运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3、1:1和3:7的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为3:7的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体，即化合物Ⅰ；
所述的化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的结构式分别为：
化合物Ⅰ；
化合物Ⅱ；
化合物Ⅲ；
化合物Ⅳ；
化合物Ⅴ。
所述的步骤一中将过滤得到的滤渣重复进行超声辅助提取和过滤，超声辅助提取和过滤共重复操作2次，每次超声辅助提取的时间为18-36h，然后合并所有滤液进行浓缩。
所述的步骤二中质量浓度为70%的甲醇溶剂的用量为浸膏状物重量的3-5倍。
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明：
实施例1：
蝼蛄中生物碱类化合物的提取方法，包括以下步骤：
步骤一、取蝼蛄原材料，干燥，粉碎，得到蝼蛄粉，备用；在温度为30℃条件下，向蝼蛄粉中加入蝼蛄粉重量5倍的二氯甲烷脱除虫蜡，经固液分离后，将得到的虫渣风干，再向干燥的虫渣中加入虫渣重量10倍的质量浓度为70%的甲醇，在30℃条件下，超声辅助提取和过滤，再将过滤得到的滤渣重复进行超声辅助提取和过滤，超声辅助提取和过滤共重复操作2次，每次超声辅助提取的时间为18h，然后合并所有滤液进行浓缩，得到浸膏状物，备用；
步骤二、将步骤一得到的浸膏状物用质量浓度为70%的甲醇溶剂溶解，甲醇溶剂的用量为浸膏状物重量的3倍，然后在-4℃条件下冷陈12h，冷陈结束后除去不溶物，并将得到的清液在50℃温度下减压浓缩，得到的浓缩液加入硅胶进行拌样，搅拌均匀后置于通风处干燥，得到拌料样品，备用；
步骤三、取步骤二得到的拌料样品以及拌料样品重量25倍的硅胶，先将硅胶装入层析柱，再将拌料样品进行湿法上样，然后依次用体积比为9:1、7:3、1:1、3:7和1:9的氯仿和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，洗脱得到的馏分均采用TLC进行分析，合并相似馏分，共得到的馏分段1-15，备用；
步骤四、将步骤三得到的馏分段5运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1和7:3的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为7:3的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，然后将有固体析出的馏分进行过滤，得到固体化合物，固体化合物进一步经环己烷-丙酮重结晶后即得到白色固体粉末，即化合物Ⅱ；
将步骤三得到的馏分段7运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3和1:1的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为1：1的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体，将白色固体重结晶后得到白色固体粉末，即化合物Ⅲ；
将步骤三得到的馏分段9运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3、1:1和3:7的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为3:7的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体和母液，将白色固体重结晶后得到白色固体粉末，即化合物Ⅳ；将母液放置28h，二次固体析出，经固液分离，得到白色粉末为化合物Ⅴ；
将步骤三得到的馏分段11运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3、1:1和3:7的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为3:7的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体，即化合物Ⅰ。
实施例2：
蝼蛄中生物碱类化合物的提取方法，包括以下步骤：
步骤一、取蝼蛄原材料，干燥，粉碎，得到蝼蛄粉，备用；在温度为50℃条件下，向蝼蛄粉中加入蝼蛄粉重量20倍的二氯甲烷脱除虫蜡，经固液分离后，将得到的虫渣风干，再向干燥的虫渣中加入虫渣重量20倍的质量浓度为70%的甲醇，在50℃条件下，超声辅助提取和过滤，再将过滤得到的滤渣重复进行超声辅助提取和过滤，超声辅助提取和过滤共重复操作2次，每次超声辅助提取的时间为36h，然后合并所有滤液进行浓缩，得到浸膏状物，备用；
步骤二、将步骤一得到的浸膏状物用质量浓度为70%的甲醇溶剂溶解，甲醇溶剂的用量为浸膏状物重量的5倍，然后在-4℃条件下冷陈12h，冷陈结束后除去不溶物，并将得到的清液在50℃温度下减压浓缩，得到的浓缩液加入硅胶进行拌样，搅拌均匀后置于通风处干燥，得到拌料样品，备用；
步骤三、取步骤二得到的拌料样品以及拌料样品重量30倍的硅胶，先将硅胶装入层析柱，再将拌料样品进行湿法上样，然后依次用体积比为9:1、7:3、1:1、3:7和1:9的氯仿和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，洗脱得到的馏分均采用TLC进行分析，合并相似馏分，共得到的馏分段1-15，备用；
步骤四、将步骤三得到的馏分段5运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1和7:3的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为7:3的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，然后将有固体析出的馏分进行过滤，得到固体化合物，固体化合物进一步经环己烷-丙酮重结晶后即得到白色固体粉末，即化合物Ⅱ；
将步骤三得到的馏分段7运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3和1:1的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为1：1的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体，将白色固体重结晶后得到白色固体粉末，即化合物Ⅲ；
将步骤三得到的馏分段9运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3、1:1和3:7的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为3:7的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体和母液，将白色固体重结晶后得到白色固体粉末，即化合物Ⅳ；将母液放置28h，二次固体析出，经固液分离，得到白色粉末为化合物Ⅴ；
将步骤三得到的馏分段11运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3、1:1和3:7的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为3:7的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体，即化合物Ⅰ。
实施例3：
蝼蛄中生物碱类化合物的提取方法，包括以下步骤：
步骤一、取蝼蛄原材料，干燥，粉碎，得到蝼蛄粉，备用；在温度为40℃条件下，向蝼蛄粉中加入蝼蛄粉重量10倍的二氯甲烷脱除虫蜡，经固液分离后，将得到的虫渣风干，再向干燥的虫渣中加入虫渣重量15倍的质量浓度为70%的甲醇，在40℃条件下，超声辅助提取和过滤，再将过滤得到的滤渣重复进行超声辅助提取和过滤，超声辅助提取和过滤共重复操作2次，每次超声辅助提取的时间为27h，然后合并所有滤液进行浓缩，得到浸膏状物，备用；
步骤二、将步骤一得到的浸膏状物用质量浓度为70%的甲醇溶剂溶解，甲醇溶剂的用量为浸膏状物重量的4倍，然后在-4℃条件下冷陈12h，冷陈结束后除去不溶物，并将得到的清液在50℃温度下减压浓缩，得到的浓缩液加入硅胶进行拌样，搅拌均匀后置于通风处干燥，得到拌料样品，备用；
步骤三、取步骤二得到的拌料样品以及拌料样品重量28倍的硅胶，先将硅胶装入层析柱，再将拌料样品进行湿法上样，然后依次用体积比为9:1、7:3、1:1、3:7和1:9的氯仿和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，洗脱得到的馏分均采用TLC进行分析，合并相似馏分，共得到的馏分段1-15，备用；
步骤四、将步骤三得到的馏分段5运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1和7:3的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为7:3的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，然后将有固体析出的馏分进行过滤，得到固体化合物，固体化合物进一步经环己烷-丙酮重结晶后即得到白色固体粉末，即化合物Ⅱ；
将步骤三得到的馏分段7运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3和1:1的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为1：1的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体，将白色固体重结晶后得到白色固体粉末，即化合物Ⅲ；
将步骤三得到的馏分段9运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3、1:1和3:7的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为3:7的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体和母液，将白色固体重结晶后得到白色固体粉末，即化合物Ⅳ；将母液放置28h，二次固体析出，经固液分离，得到白色粉末为化合物Ⅴ；
将步骤三得到的馏分段11运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3、1:1和3:7的氯仿-甲醇溶液，收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为3:7的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体，即化合物Ⅰ。
本发明的蝼蛄中的含氮生物碱类化合物，成分的有效部位，是具有广谱的抗菌活性的，分析结果详见表1。
表1.蝼蛄70%甲醇提取物对受试菌种的抑菌效果
由表1可知，本发明得到的生物碱类化合物的有效部位被测试有广谱抗菌性能，可以作为广谱抗菌消毒剂或新的抗菌剂开发，为该古老的传统药材提供一个新的用途。同时，本发明对于节肢动物的次生代谢物的研究开发利用，提供了新的用途。

Claims (1)

1.蝼蛄中生物碱类化合物的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、取蝼蛄原材料，干燥，粉碎，得到蝼蛄粉，备用；在温度为30-50℃条件下，向蝼蛄粉中加入蝼蛄粉重量5-20倍的二氯甲烷脱除虫蜡，经固液分离后，将得到的虫渣风干，再向干燥的虫渣中加入虫渣重量10-20倍的质量浓度为70%的甲醇，在30-50℃条件下，超声辅助提取和过滤，将过滤得到的滤渣重复进行超声辅助提取和过滤，超声辅助提取和过滤共重复操作2次，每次超声辅助提取的时间为18-36h，然后合并所有滤液进行浓缩，得到浸膏状物，备用；
步骤二、将步骤一得到的浸膏状物用质量浓度为70%的甲醇溶剂溶解，甲醇溶剂的用量为浸膏状物重量的3-5倍，然后在-4℃条件下冷藏陈放12h，冷藏陈放结束后除去不溶物，并将得到的清液在50℃温度下减压浓缩，得到的浓缩液加入硅胶进行拌样，搅拌均匀后置于通风处干燥，得到拌料样品，备用；
步骤三、取步骤二得到的拌料样品以及拌料样品重量25-30倍的硅胶，先将硅胶装入层析柱，再将拌料样品进行湿法上样，然后依次用体积比为9:1、7:3、1:1、3:7和1:9的氯仿和甲醇的混合溶液进行梯度洗脱，洗脱得到的馏分均采用TLC进行分析，合并相似馏分，共得到的馏分段1-15，备用；
步骤四、将步骤三得到的馏分段5运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1和7:3的氯仿-甲醇溶液，梯度洗脱过程中收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为7:3的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，然后将有固体析出的馏分进行过滤，得到固体化合物，固体化合物进一步经环己烷-丙酮重结晶后即得到白色固体粉末，即化合物Ⅱ；
将步骤三得到的馏分段7运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3和1:1的氯仿-甲醇溶液，梯度洗脱过程中收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为1：1的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体，将白色固体重结晶后得到白色固体粉末，即化合物Ⅲ；
将步骤三得到的馏分段9运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3、1:1和3:7的氯仿-甲醇溶液，梯度洗脱过程中收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为3:7的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体和母液，将白色固体重结晶后得到白色固体粉末，即化合物Ⅳ；将母液放置28h，二次固体析出，经固液分离，得到白色粉末为化合物Ⅴ；
将步骤三得到的馏分段11运用常压柱色谱进行分离，梯度洗脱剂依次为体积比为9:1、7:3、1:1和3:7的氯仿-甲醇溶液，梯度洗脱过程中收集馏分，并将馏分在室温下放置，经洗脱剂为3:7的氯仿-甲醇溶液洗脱出的馏分有固体析出，将有固体析出的馏分进行离心得到白色固体，即化合物Ⅰ；
所述的化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的结构式分别为：
化合物Ⅰ；
化合物Ⅱ；
化合物Ⅲ；
化合物Ⅳ；
化合物Ⅴ。
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