TWI429431B - 自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物Ｄｉｈｙｄｒｏｓｉｎｕｌａｒｉｎ方法及其用於治療神經退化性疾病 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin方法，及關於該天然物dihydrosinularin用於治療神經退化性疾病。
近年來許多研究顯示自柔軟指形軟珊瑚可取得具有抗癌潛力[Duh et al.，1995；Kamel et al.，2007]或具有其它生物活性的天然物[Sheu et al. ，2008]。一般而言，柔軟指形軟珊瑚可為自珊瑚礁海域採集到的野生型[wild type]及亦可為經養殖得到的養殖型[cultured type]。近年的研究顯示目前自柔軟指形軟珊瑚亦可成功分離取得具有生物活性的海洋天然物及其它相關的化合物。
目前為止，有關自柔軟指形軟珊瑚或其天然物之技術極少提示或揭露於世界各國專利資料之技術內容；例如：中華民國專利、美國專利、歐盟專利、日本專利或中國專利等。是以，至今為止，有關自柔軟指形軟珊瑚如何取得有用天然物技術係屬於極少的專門技術。事實上，目前對於自養殖型柔軟指形軟珊瑚如何取得具有生物活性的海洋天然物或其它具有重要經濟價值的化合物，必然存在強烈的需求。
就中樞神經系統疾病而言，如脊髓或腦創傷[trauma]、阿茲海默症[Alzheimer’s disease]及帕金森氏症[Parkinson’s disease，PD]等，在臨床上皆因神經細胞出現死亡現象，因而導致感覺、運動功能出現障礙。這些因神經細胞出現死亡現象產生的神經退化性疾病[Neurodegenerative diseases，ND]，會隨著年齡增加越發嚴重。然而，目前為止，有關神經退化性疾病尚無有效的治療方式及藥物。在臨床上只能針對症狀給予藥物進行改善。事實上，長期使用這些藥物皆產生嚴重的副作用。尤其是用於治療帕金森氏症藥物所伴隨產生的副作用尤為嚴重[Waldmeier et al.，2004]，因此積極發展具有治療帕金森氏症的新藥是非常重要的課題之一。
帕金森氏症在病理學上的主要特徵為中腦[midbrain]黑質[substantia nigra]的多巴胺神經元[dopaminergic neuron]發生漸行性退化，因而導致紋狀體[striatum]的多巴胺神經細胞[dopamine]逐漸凋亡[apoptosis][Beal，2000；Newhouse et al.，2004]。當黑質腹外側區域[ventrolateral tier]的多巴胺神經細胞的凋亡達60%以上時，臨床症狀就會開始顯著表現[Lee et al.，1994；Fearnley and Lees，1991]。
近來已有許多研究證實發炎反應過程[inflammatory process]在黑質區多巴胺神經元細胞凋亡，進而誘發帕金森氏症上扮演重要角色[Moussa et al.，2003；Beal，2003；Mazzio et al.，2004]。一般而言，目前對於中樞神經系統發炎性反應認為：中樞神經系統在受到內生性及外生性的壓力後，小神經膠質細胞[microglia]會活化腦中的免疫系統，藉著清除細胞內多餘物質、殺死細菌病源體，以達成保護神經系統的目的[12. Hirsch EC and Hunot S，2009]。然而，伴隨著小神經膠質細胞活化產生的麩胺酸[glutamate]、發炎前驅因子[pro-inflammatory factors]、活性氧等物質卻會造成神經細胞的損傷及死亡，並藉著適當的發炎反應及細胞趨化作用[chemotaxis]通過血腦屏障[blood-brain barrier]進而造成中樞神經系統[central nervous system，CNS]永久性的神經損傷。目前已有研究報告指出利用抗發炎的策略[如投予抗發炎藥物]，可促使神經細胞受到保護，進而減緩神經細胞凋亡、針對帕金森氏症等神經退化性疾病具治療之效果[Reynolds et al.，2007；Kim and Shu，2009]。
目前已知神經退化性疾病-帕金森氏症與多巴胺神經元的細胞凋亡之間有密切之關聯，而PI3K/Akt訊息傳遞路徑活化是抑制細胞凋亡的可能路徑之一。經由研究指出活化的磷酰肌醇-3激酶[Phosphoinositide 3-Kinase，PI 3-kinase]可將磷脂醯肌醇4，5-二磷酸[Phosphatidyl-Inositol-4,5-bisphosphate，PIP2]轉變成磷脂醯肌醇3，4，5-三磷酸[Phosphatidyl-Inositol-3,4,5-Triphosphate，PIP3]，PIP3則會活化蛋白質激酶B[Protein kinase B或稱Akt，PKB/Akt][Maehama and Dixon，1998]。Akt是PI 3-kinase開始之訊息傳遞路經中最初的中介者。當Akt經由PIP3作用活化後，可藉由磷酸化作用活化CREB，以及去活化Bad和procaspase-9，促進細胞存活。且活化的Akt蛋白質分子可促進Bcl-2蛋白表現，Bcl-2可以藉由干擾高活性的氧分子來抑制細胞凋亡現象[Hockenbery et al.，1990；Sadoul，1998]，且Bcl-2亦可藉由抑制半胱氨酸蛋白酶[caspase]活化，抑制細胞色素c[cytochrome c]釋放至細胞質中，達到抑制細胞凋亡之目的[Blum et al.，2001；Yamada et al.，1999]。因此，在帕金森氏症神經退化性疾病研究中，若能活化PI3-kinase，促使PI3K/Akt訊息傳遞路徑活化，便可抑制神經細胞凋亡的現象，成為治瘉帕金森氏症的手段之一。
在帕金森氏症相關研究中發現，人類神經母瘤細胞SH-SY5Y具有多巴胺運輸者[dopamine transporter]，屬於神經多巴胺細胞之一，可因為6-OHDA的作用誘發細胞凋亡，模擬人類帕金森氏症之神經退化性疾病[Newhouse et al.，2004；Fernandez-Gomez et al.，2006]。
目前為止，有關治療神經退化性疾病之技術揭露於許多國內專利資料之技術內容。舉例而言，中華民國專利第I286933號、第I276439號、第I246421號、第559558號、第523410號、第427907號、第381073號及第224940號；中華民國專利公開第200918051號、第200848063號、第200843785號、第200838549號、第200824678號、第200820984號、第200804400號、第200732012號、第200727911號、第200602297號、第200539875號、第200538551號、第200510329號、第200510351號、第200505409號、第200424203號、第200420550號、第200407156號及第200301100號。前述我國專利資料僅為本發明技術背景之參考及說明目前技術發展狀態而已，其並非用以限制本發明之範圍。
另外，前述有關治療神經退化性疾病之技術亦已揭示於許多美國專利資料內容。舉例而言，美國專利第7,335,505號、第7,244,423號、第7,226,746號、第7,211,054號、第7,105,183號、第6,815,431號、第6,683,058號、第6,653,344號、第6,492,407號、第6,184,236號、第6,022,683號、第5,958,684號、第5,707,821號、第5,602,299號及第5,256,690號；美國專利公開第20090075984號、第20090062330號、第20090023794號、第20080280824號、第20080274093號、第20080261226號、第20080242680號、第20080207604號、第20080161239號、第20080090908號、第20080051337號、第20080020393號、第20070299011號、第20070255186號、第20070249554號、第20070161595號、第20070122813號、第20070054399號、第20070037768號、第20060168673號、第20060160161號、第20060159775號、第20060141541號、第20060121014號、第20060115867號、第20060115856號、第20060115855號、第20060115854號、第20060057624號、第20060051790號、第20060051322號、第20060046982號、第20050260669號、第20050250673號、第20050203180號、第20050186591號、第20050181068號、第20050143310號、第20050123516號、第20050086711號、第20050043264號、第20050020945號、第20040224958號、第20040220132號、第20040162255號、第20040141953號、第20040128706號、第20040110250號、第20040078835號、第20040058852號、第20030177510號、第20030077573號、第20030060487號、第20030051262號、第20030050335號、第20030045564號、第20030009104號、第20020187921號、第20020165349號、第20020115689號、第20020106350號、第20020045651號、第20020010947號及第20010051602號。前述美國專利資料僅為本發明技術背景之參考及說明目前技術發展狀態而已，其並非用以限制本發明之範圍。
顯然，目前對於治療神經退化性疾病之其他藥物或化合物而言，其必然存在強烈的需求。事實上，近年來許多研究顯示自柔軟指形軟珊瑚可取得具有抗癌潛力或對其它疾病具有療效的天然物。
有鑑於此，本發明為了考量上述需求，其提供一種自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin方法，如此本發明能達成提供自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin技術方法之目的；其亦提供該天然物dihydrosinularin用於治療神經退化性疾病，如此本發明能達成治療神經退化性疾病之目的。
本發明之主要目的係提供一種自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin方法，以乙醇萃取及管柱層析法及梯度沖提方式分離天然物dihydrosinularin，其達成提供自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin技術方法之目的。
本發明之另一目的係提供一種用於治療神經退化性疾病之天然物dihydrosinularin，該dihydrosinularin具抗發炎活性，其達成可用以治療神經退化性疾病之目的。
為了達成上述目的，本發明之自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin方法包含步驟如下：利用乙醇自柔軟指形軟珊瑚進行萃取，以提取一萃取液；利用二氯甲烷/水將該萃取液進行分配，以取得一二氯甲烷層及一水層；將該二氯甲烷層以管柱層析法進行初步分離，並利用一第一沖提溶液進行沖提，以取得數個劃分層提取液；將適當選擇該劃分層提取液之一指定分層進行分離，並利用一第二沖提溶液進行沖提，以取得天然物dihydrosinularin。
本發明較佳實施例之該柔軟指形軟珊瑚選自柔軟指形軟珊瑚碎片。
本發明較佳實施例之該第一沖提溶液為甲醇/乙酸乙酯[EtOAc]/正己烷之混合溶媒。
本發明較佳實施例之該第一沖提溶液係由[100%正己烷]、[1%乙酸乙酯/正己烷]、[3%乙酸乙酯/正己烷]、[5%乙酸乙酯/正己烷]、[10%乙酸乙酯/正己烷]、[20%乙酸乙酯/正己烷]、[25%乙酸乙酯/正己烷]、[30%乙酸乙酯/正己烷]、[40%乙酸乙酯/正己烷]、[50%乙酸乙酯/正己烷]、[70%乙酸乙酯/正己烷]、[90%乙酸乙酯/正己烷]、[100%乙酸乙酯]、[90%乙酸乙酯/甲醇]、[80%乙酸乙酯/甲醇]、[60%乙酸乙酯/甲醇]、[50%乙酸乙酯/甲醇]、[100%甲醇]，依序增加該第一沖提溶劑之極性，並分成25個劃分層[F1~F25]。
本發明較佳實施例之該指定分層為由該第一沖提溶液之[11%乙酸乙酯/正己烷]沖提取得之第10號劃分層[F10]。
本發明較佳實施例之該第二沖提溶液為11%乙酸乙酯/正己烷與10%乙酸乙酯/正己烷。
本發明較佳實施例之該天然物dihydrosinularin用於治療神經退化性疾病。
為了充分瞭解本發明，於下文將例舉較佳實施例並配合所附圖式作詳細說明，且其並非用以限定本發明。
本發明較佳實施例之自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離〝天然物Ya-s 14〞之天然物名稱於此定義為dihydrosinularin化合物，即本發明於說明書中可使用〝Ya-s 14〞名稱表示dihydrosinularin化合物，合先敘明。
第1圖揭示本發明較佳實施例之自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin方法之流程方塊圖。請參照第1圖所示，本發明較佳實施例之自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin方法具有四個步驟S1、S2、S3及S4。是以，前述四個步驟S1至S4在不脫離本發明的實質範圍下可予以適當修改，因此該四個步驟S1至S4並非用以限制本發明之範圍。
請再參照第1圖所示，本發明之自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin方法做為生產[或產出]天然物dihydrosinularin的方法。本發明之自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin方法首先在第一步驟S1中，利用乙醇自柔軟指形軟珊瑚進行萃取，以提取一萃取液。本發明較佳實施例之該柔軟指形軟珊瑚選自切成小塊之柔軟指形軟珊瑚碎片，其由將解凍的柔軟指形軟珊瑚樣品[例如：濕重1.5kg]切碎形成碎片。本發明較佳實施例係利用乙醇反覆多次[例如：5次]萃取方式取得該萃取液，並將該萃取液減壓濃縮，但其並非用以限制本發明之範圍。
請再參照第1圖所示，本發明之自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin方法接著在第二步驟S2中，利用二氯甲烷/水將該萃取液進行分配，以取得一二氯甲烷層及一水層，其中將該二氯甲烷層於下一步驟中用於進一步分離。本發明較佳實施例係利用二氯甲烷/水將該萃取液進行多次分配，最後方取得該二氯甲烷層及水層，但其並非用以限制本發明之範圍。
請再參照第1圖所示，本發明之自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin方法接著在第三步驟S3中，將該二氯甲烷層以管柱層析法進行初步分離[preliminary isolation]，並利用一第一沖提溶液進行沖提，以取得數個劃分層提取液。本發明較佳實施例利用該管柱層析法在初步分離時，選用的填充劑為矽膠凝體[silica gel 60，230-400 mesh]。
本發明較佳實施例之該第一沖提溶液為甲醇/乙酸乙酯[EtOAc]/正己烷之混合溶媒。本發明較佳實施例之該第一沖提溶液係由[100%正己烷]、[1%乙酸乙酯/正己烷]、[3%乙酸乙酯/正己烷]、[5%乙酸乙酯/正己烷]、[10%乙酸乙酯/正己烷]、[20%乙酸乙酯/正己烷]、[25%乙酸乙酯/正己烷]、[30%乙酸乙酯/正己烷]、[40%乙酸乙酯/正己烷]、[50%乙酸乙酯/正己烷]、[70%乙酸乙酯/正己烷]、[90%乙酸乙酯/正己烷]、[100%乙酸乙酯]、[90%乙酸乙酯/甲醇]、[80%乙酸乙酯/甲醇]、[60%乙酸乙酯/甲醇]、[50%乙酸乙酯/甲醇]、[100%甲醇]，依序增加該第一沖提溶劑之極性，並分成25個劃分層[F1~F25]，但其並非用以限制本發明之範圍。
請再參照第1圖所示，本發明之自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin方法接著在第四步驟S4中，將適當選擇該劃分層提取液之一指定分層以管柱層析法進行分離，並利用一第二沖提溶液進行沖提，以取得西柏烷[cembrane]類純化合物Ya-s 14。本發明較佳實施例之該指定分層為該第一沖提溶液之[11%乙酸乙酯/正己烷]之劃分層[F10]。本發明較佳實施例之該第二沖提溶液為11%乙酸乙酯/正己烷與10%乙酸乙酯/正己烷，並進行反覆多次以管柱層析，但其並非用以限制本發明之範圍。
第2圖揭示本發明較佳實施例之自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin方法之分離流程示意圖。請參照第2圖所示，本發明較佳實施例之方法係由1.5kg的濕柔軟指形軟珊瑚取得20.8mg的天然物dihydrosinularin，其為白色粉末，但其並非用以限制本發明之範圍。第2圖之分離流程對照於第1圖之流程方塊，因此關於其他細節技術部分，於此不予詳細贅述。
請參照第3圖所示，其揭示本發明較佳實施例之dihydrosinularin化合物之結構示意圖，於此併入參考。
本發明較佳實施例之天然物dihydrosinularin，經由初選離體抗發炎活性測驗後，發現dihydrosinularin具有抗發炎活性，並利用錐蟲藍排除法[trypan blue exclusion]初步篩選後，發現其具有神經保護活性，再經由相關訊息傳遞路徑研究發現，其具有活化PI3K/Akt訊息傳遞路徑、活化Bc-2及抑制caspase-3,7的功能，其可促進神經細胞存活，因而成為治療帕金森氏症等神經退化性疾病的可能藥物之一。
本發明之自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin方法係自養殖型柔軟指形軟珊瑚Sinularia flexibilis
中得到的純cembrane類化合物，鑑定其性質之說明如下：化合物Ya-s 14[dihydrosinularin]為白色粉末[20.8mg]，在低解析質譜儀[ESIMS]圖譜的主要離子峯為359[M+Na]+
；熔點為116-118℃；比旋光度為[α]25 D
=-13.2[c
0.28，CHCl3
]；紅外光光譜[IR]v max
3397cm-1
的羥甲基[hydroxyl，OH]官能基及1726cm-1
的羰基[Carbonyl group][C=1]官能團吸收，以上數據和文獻資料大致符合；且再藉由1
H-NMR和13
C-NMR圖譜數據與過去文獻比對發現與化合物Ya-s 14的NMR圖譜資料及物理性質相同，因而其可確定本化合物確為羥，因而確定化合物Ya-s 14之結構。
SH-SY5Y為人類兒茶酚胺類神經母瘤細胞株[American Type Culture Collection，No. CRL2266]。使用Dulbecco’s Modified Eagle Medium[DMEM][Invitrogen Corpofation，Carlsbad，California，USA]細胞培養液，其包含10%熱鈍化[heat-inactivated]FBS、2mM穀胺醯胺[glutamine]、1mM丙酮酸鹽[pyruvate]、4.5g/l葡萄糖[glucose]、50U/ml盤尼西林[penicillin]及50μg/ml鍊黴素[streptomycin]，並將細胞置於37℃、5% CO2
、95%空氣的培養箱[Thermo electron corporation,Waltham，USA]中培養。
將SH-SY5Y解凍置於DMEM細胞培養液中，培養細胞於溫度37℃、5% CO2
、95%空氣的培養箱環境中。當細胞增殖至九分滿時，將細胞培養液收至離心管備用，以適量之磷酸鹽緩衝溶液[phosphate buffered saline，PBS][137mM NaCl、2.68mM KCl、10mM Na2
HPO4
、1.76mM KH2
HPO4
、pH 7.2]潤洗細胞一次，移除PBS後加入適量之胰蛋白酶[0.25% trypsin EDTA][TrypLETM
Express Stable Trypsin Replacement Enzyme without Phenol Red，Invitrogen Corporation，USA]處理，以肉眼觀察到大部份細胞飄起之情形後，再以大量細胞培養液將全部細胞沖刷下來，統一收至離心管離心[180xg，時間8分鐘，溫度25℃]，離心後將上清液移除，加入新鮮細胞培養液後，依照適當細胞數量將細胞分至24小格培養盤[16×104
顆/孔]及96小格培養盤[2×104
顆/孔]與直徑10公分培養皿中，在溫度37℃、5% CO2
、95%空氣的培養箱中培養24小時以進行實驗。細胞繼代超過四次後，便丟棄不再使用。
請參照第4圖所示，將SH-SY5Y細胞種在24小格培養盤中[16×104
顆/孔]，待細胞完全和24小格培養盤底部貼附後，始可以進行不同藥物之測試[Levites et al.，2002]。不同組別的細胞中，分別加入不同、欲測試的海洋天然物、二甲基硫[Dimethyl sulfoxide，DMSO][Sigma，St. Louis MO，USA]及六羥基多巴胺[6-hydroxydopamine，6-OHDA][Sigma，St. Louis MO，USA]。在溫度37℃、5% CO2
、95%空氣的培養箱中培養18個小時，而後將細胞培養液收至離心管備用，以適量之磷酸鹽緩衝溶液潤洗細胞一次，移除磷酸鹽緩衝溶液後加入適量之胰蛋白酶處理，再以大量細胞培養液將全部細胞沖刷下來，統一收至離心管離心[180xg，時間8分鐘，溫度25℃]，離心後抽掉舊的細胞培養液，以適量的PBS將沉澱物稀釋、打散，由此細胞懸浮液中取出20μl和等量的錐蟲藍[trypan blue，0.4%][Sigma，St. Louis MO，USA]均勻混合，最後取出10ml的細胞混和液置於血球計數器[Supe Rior Marienfeld，Germany]上作細胞計算。細胞計數的方式如下：
25方格中活細胞數×2×104
=活細胞數/ml
請參照第5圖所示，活細胞的粒線體作用可使原本為藍色的alamar blue[Biosource，Camarillo，CA]轉變成粉紅色，透過吸光質的讀取及計算，可回推出活細胞於全部細胞中之比例關係。將SH-SY5Y細胞以2×104
顆/孔的數量培養於96小格培養盤中。在溫度37℃、5% CO2
、95%空氣的培養箱中培養24小時，待細胞完全和96小格培養盤底部貼附後，開始以各種不同藥物進行處理，而後以6-OHDA處理15小時，加入10%的alamar blue，繼續培養3小時；然後，利用酵素免疫判讀機[ELISA reader][Thermo electron corporation，Multixkan EX，USA]測量吸光值，藉此分析6-OHDA對神經細胞產生的毒性。在海洋天然物的組別中，於6-OHDA處理之前以海洋天然物預先處理1小時，藉以分析海洋天然物對神經細胞是否具有保護作用。
計算公式仿自Lee等人[2005]所發表之方法，透過公式計算後，便可以得知細胞存活率：
[(實驗組-背景值)/(控制組-背景值)]*100
依照Lee等人[2006]發表之方法則可推估相對保護率[Relative protection]：
[(治療組-6OHDA組)/(控制組-6OHDA組)]*100
請參照第6圖所示，將SH-SY5Y細胞種在96小格培養盤中[3×104
顆/孔]，經過24小時培養，待細胞完全和96小格培養盤底部貼附後，始可以進行不同藥物之測試[Levites et al.，2002]。在不同組別的細胞中，分別加入不同、欲測試的海洋天然物與DMSO做一個小時的前處理，而後加入6-OHDA[20μM]，依照不同實驗需求，在溫度37℃、5% CO2
、95%空氣的培養箱中處理0、3、6、8、12、18個小時[et al.，2004]，而後利用CaspaTagTM
Caspase 3,7 In Situ Assay Kit進行細胞凋亡分析。在6-OHDA處理完成前一小時以1：30的稀釋比例加入新鮮配製之FLICA試劑，在培養箱培養1個小時後，移除細胞培養液，以稀釋成1倍之Wash buffer潤洗細胞兩次，加入稀釋好待用之Fixative，以倒立螢光顯微鏡觀察其細胞凋亡之情形。各組細胞caspase-3及caspase-7之活化比例同樣依照Zhao等人在2007年提出之方式計算。每孔細胞以隨機[Random]方式利用倒立螢光顯微鏡拍出五張螢光圖以及相同位置之五張可見光圖，分別計算細胞數後，以產生caspase-3及caspase-7活化現象之細胞數除總細胞數，得細胞中caspase-3及caspase-7活化比例，而後加以平均為該孔真實caspase-3及caspase-7之活化比例[1. Zhao et al.,2007]。
細胞依照之前藥物處理後的時間點，以刮刀將貼附在培養皿表面的細胞刮下後和細胞培養液一並放入離心管，在溫度4℃下，以180xg離心10分鐘後，將舊的DMEM培養液抽去。先用1ml PBS將沉澱物打散後，加入4ml PBS，在溫度4℃下，以180xg離心10分鐘，再利用1ml PBS將沉澱物打散後收至1.5ml離心管中，在溫度4℃下，以1620xg離心10分鐘，抽掉上層的PBS，下層沉澱物則為待測細胞。
細胞依照之前藥物處理後的時間點，以適量PBS搖晃潤洗細胞，移去舊的PBS，如此重複兩次。加入1ml新鮮的PBS，利用刮刀將貼附在培養皿表面的細胞刮下後放入1.5ml離心管，在溫度4℃下，將1620xg離心10分鐘，抽掉上層的PBS，下層沉澱物則為待測細胞。
加入4℃的Lysis buffer[50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、2% Triton X-100、100μg/mL phenylmethy lsulfonyl fluoride、1μg/mL aprotinin]將細胞沉澱物打散，靜置反應，輕微震盪後，置入高速離心機內，在溫度4℃下，將20817xg超高轉速離心30分鐘後取出上清液，此上清液為待測蛋白質。
將細胞蛋白質萃取後之上清液中蛋白質的含量以Bradford法進行定量[Bio-Rad，Hercules，CA，USA]。樣品以Lysis buffer稀釋成相同蛋白質濃度後加入sample buffer，其包含2% SDS、10%甘油[glycerol]、0.1%溴酚藍[bromophenol blue]、2%2-硫氫乙醇[2-mercaptoethanol]、50mM Tris-HCl，其pH為7.2。將樣品與sample buffer以3：1混合均勻。以溫度95℃加熱10分鐘後始可開始實驗。
先配置10% separating gel，其包含30%丙烯醯胺溶液[acrylamide solution][29：1][Bio-Rad，Hercules，CA，USA]3ml、3.0M Tri-HCl pH 8.45 3ml、40%甘油[glycerol]3ml、10%過硫酸銨[ammonium persulfate，APS][Sigma，St. Louis MO，USA]45ml，最後加入TEMED[Sigma，St. Louis MO，USA]4.5ml。迅速混合均勻後，以3ml塑膠滴管加入裝置好的玻璃製膠檯中[加入量約插入樣品梳下0.8公分高的位置]，上面加入95%酒精用以隔絕空氣，並可使膠體表面平整，待膠凝結後，倒掉95%酒精。之後將配置好的4%Stacking gel，其包含30%丙烯醯胺溶液[acrylamide solution][29：1]0.5ml、3.0M Tri-HCl pH 8.45 1.25ml，DDW 2ml、10%過硫酸銨[ammonium persulfate，APS][Sigma，St. Louis MO，USA]25ml，最後加入TEMED 5ml。迅速均勻混合後，以3ml塑膠滴管加入裝置好的玻璃製膠檯中，插入樣品梳，待膠體凝結後再取出。
將上述配置好之SDS-PAGE架好至電泳槽[Hoefer，Germany]中，倒入Running buffer[25mM Tris、186mM Glycine、0.1% SDS]，在SDS-PAGE鋸齒狀洞[well]中等量[35ml]加入製備好、相同濃度的蛋白質樣品。先以70伏特電壓至蛋白質樣品跑出Stacking gel，將電壓調高至120伏特60分鐘。關掉電泳槽電源，取出電泳膠體置於電泳轉移緩衝液[transfer buffer][50mM Tris-HCl、380mM氨基乙酸[glycine]、1% SDS及20%甲醇[methanol]中備用。
先用甲醇將裁剪成適當大小之PVDF[Millipore，USA]膜浸潤約30秒，以DDW大量潤洗後置於電泳轉移緩衝液備用。在電泳轉印專用的gel cassette[GE Healthcare Bio-sciences Corp，USA]中，由上而下依序放入3M分析濾紙-SDS-PAGE gel-PVDF膜-3M分析濾紙，刮除多餘水分確保PVDF膜與SDS-PAGE gel之間緊密貼合後置入電泳轉印槽[transfer tank][Hoefer TE 22 Mini Tank Transfer Gel Electrophoresis Unit，Amersham Bioscience crop，San Francisco，USA]中，加入適量轉印緩衝液[transfer buffer][約至電泳轉印槽minimum與maximum兩標示刻度中間]，以電流135毫安培執行12-16小時。
將轉印好的PVDF膜以新鮮的TTBS溶液[Tris-Tween buffer saline][20mM Tris、137mM NaCl、0.1% Tween 20、pH 7.4]沖洗三次，每次10分鐘，然後置於含5%脫脂牛奶的TTBS液中，將PVDF膜上之孔洞填滿，需約40分鐘blocking。接著，加入目標蛋白質的一級抗體，混合binding 1小時，再取出PVDF膜，並重複上述以TTBS沖洗至blocking 5%脫脂牛奶的步驟。而後，加入對一級抗體有專一性的二級抗體，予以震盪1小時。取出PVDF膜，將其置入新鮮的TTBS液中震盪三次，每次10分鐘。最後將PVDF膜浸入冷光呈色[Millipore，USA]液均勻搖晃反應後，以影像分析系統[UVP，BioSpectrum AC Imaging System，USA & Canada]拍照並加以計算。
第一組：單純細胞的控制組，不加任何藥物處理。
第二組：加DMSO後，經過一小時再加入6-OHDA。
第三組：加入海洋天然物經過一小時後，加入6-OHDA。該組可因加入之海洋天然物最終濃度之不同，再細分成更細的組別。
第四組：只有細胞培養液之背景值組。
所有實驗數據以mean ± SEM方式呈現。兩組間數據比較，依照t-test進行統計分析。多組間數據比較，則利用one-way analysis of variance[ANOVA]進行數據統計分析，並根據Duncan's Method進行多重組間差異性比較。當P值小於0.5時，表示有顯著差異。
請參照第7圖所示，在給予不同濃度之海洋天然物dihydrosinularin做一小時的前處理後，加入6-OHD A 20μM，可以抑制因6-OHDA造成的SH-SY5Y細胞死亡現象。在10-5
、10-4
、10-3
、10-2
、10-1
、10及1μM dihydrosinularin前處理組別中，SH-SY5Y細胞的相對保護率可達30.8%、22.1%、21.3%、53.4%、35.6%、25.0%、41.3%。其中dihydrosinularin在10-5
、10-4
、10-3
、10-2
、10-1
、1及10μM的組別與控制組具有顯著差異。
請參照第8圖所示，利用西方點墨法觀察SH-SY5Y細胞內Akt磷酸化情形，在單純以6-OHDA 20μM處理15、30分鐘的組別中，phospho-Akt的量較控制組少，先以化合物dihydrosinularin 10μM前處理一小時，再給予6-OHDA 20μM的組別，其phospho-Akt的表現量顯著比單純的6-OHDA 20μM處理組別多；請參照第9圖所示，且各組間作為內控制組之β-actin蛋白質表現量沒有顯著差異，推測天然化合物dihydrosinularin可經由增加SH-SY5Y細胞的Akt磷酸化作用，進而活化細胞中PI3K/Akt訊息傳遞路徑，因此可以利用PI3K/Akt之抑制劑作進一步之探討。
請參照第10圖所示，以海洋天然化合物dihydrosinularin 10μM前處理1小時後合併給與6-OHDA 20μM處理6小時之組別，較單純給予6-OHDA 20μM處理6小時組，其Bcl-2蛋白質表現量有顯著增加之情形，且各組間作為內控制組之β-actin蛋白質表現量沒有顯著差異。
請參照第11圖所示，經由CaspaTagTM
Caspase-3,7 In Situ Assay Kit可以偵測細胞內caspase-3,7的活化情形。FAM-DEVD-FMK探針會進入細胞，和活化的caspase-3,7進行共價鍵結停留在細胞內，並水解成可以放出螢光的物質，未形成共價鍵結的染劑則會被洗去，而後可用螢光顯微鏡觀測到以綠色螢光標記出活化的caspase-3,7。在此實驗結果中，以單純給予6-OHDA 20μM處理8小時組，如附照1所示，其caspase-3,7活化率為1；以海洋天然物dihydrosinularin前處理1小時，再加入6-OHDA 20μM處理8小時，可以有效抑制SH-SY5Y細胞內caspase-3,7的活化，如附照2所示。
請參照第12圖所示，dihydrosinularin可以抑制6-OHDA造成的SH-SY5Y細胞凋亡現象，LY294002則可以抑制dihydrosinularin的神經細胞保護作用。以單純給予6-OHDA 20μM處理18小時的組別其細胞相對保護率為0%時，給予dihydrosinularin前處理一小時，可使細胞相對保護率顯著上升至35.9%，但這個相對保護率上升的現象經過LY294002 1μM及10μM處理後，顯著下降為9.74%及1.03%。
前述較佳實施例僅舉例說明本發明及其技術特徵，該實施例之技術仍可適當進行各種實質等效修飾及/或替換方式予以實施；因此，本發明之權利範圍須視後附申請專利範圍所界定之範圍為準。
S1．．．第一執行步驟
S2．．．第二執行步驟
S3．．．第三執行步驟
S4．．．第四執行步驟
第1圖：本發明較佳實施例之自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin方法之流程方塊圖。
第2圖：本發明較佳實施例之自養殖型柔軟指形軟珊瑚分離天然物dihydrosinularin方法之分離流程示意圖。
第3圖：本發明較佳實施例之天然物dihydrosinularin用於治療神經退化性疾病之dihydrosinularin化合物之結構示意圖。
第4圖：本發明將SH-SY5Y利用細胞錐蟲藍排除法，並以血球計數器進行計算細胞之流程示意圖。
第5圖：本發明將SH-SY5Y利用Alamar blue測試以酵素免疫判讀機測量吸光值後，進行計算細胞之流程示意圖。
第6圖：本發明將SH-SY5Y利用Caspase-3,7 In Situ Assay Kit進行細胞凋亡分析，並利用倒立螢光顯微鏡觀察其細胞凋亡，以計算細胞之流程示意圖。
第7圖：本發明較佳實施例之天然物dihydrosinularin抑制6-OHDA造成SH-SY5Y細胞存活率下降情形之示意圖。
第8圖：本發明較佳實施例之天然物dihydrosinularin與6-OHDA 20μM對SH-SY5Y細胞Akt磷酸化作用[Akt phosphorylation]影響之示意圖。
第9圖：本發明較佳實施例之天然物dihydrosinularin與6-OHDA對SH-SY5Y細胞β-actin蛋白質表現量影響之示意圖。
第10圖：本發明較佳實施例之天然物dihydrosinularin與6-OHDA對SH-SY5Y細胞Bcl-2蛋白質、β-actin蛋白質表現量影響之示意圖。
第11圖：本發明較佳實施例以定量分析天然物dihydrosinularin之抑制6-OHDA 20μM造成caspase-3,7活化情形之示意圖。
第12圖：本發明較佳實施例利用LY294002對於天然物dihydrosinularin之抑制6-OHDA 20μM造成SH-SY5Y細胞凋亡影響之示意圖。
附照1：本發明較佳實施例以6-OHDA 20mM處理8小時之細胞影像。
附照2：本發明較佳實施例之dihydrosinularin前處理1小時後，再以6-OHDA 20μM處理8小時之細胞影像。
S1．．．第一執行步驟
S2．．．第二執行步驟
S3．．．第三執行步驟
S4．．．第四執行步驟
Claims (10)
- 一種天然物dihydrosinularin之用途，其用於製備抗發炎治療之藥物。
- 一種天然物dihydrosinularin之用途，其用於製備治療神經退化性疾病之藥物。
- 一種天然物dihydrosinularin之用途，其用於製備抗發炎治療及治療神經退化性疾病之藥物。
- 依申請專利範圍第1、2或3項所述之天然物dihydrosinularin之用途，其中該dihydrosinularin分離自養殖型柔軟指形軟珊瑚。
- 依申請專利範圍第4項所述之天然物dihydrosinularin之用途，其中該dihydrosinularin自養殖型柔軟指形軟珊瑚的分離方法包含步驟：利用乙醇自養殖型柔軟指形軟珊瑚進行萃取，以提取一養殖型軟珊瑚萃取液；利用二氯甲烷/水將該養殖型軟珊瑚萃取液進行分配，以取得一二氯甲烷層及一水層；將該二氯甲烷層以管柱層析法進行初步分離，並利用一第一沖提溶液進行沖提，以取得數個劃分層提取液；將適當選擇該劃分層提取液之一指定分層進行分離，並利用一第二沖提溶液進行沖提，以便自該養殖型柔軟指形軟珊瑚取得dihydrosinularin。
- 依申請專利範圍第4項所述之天然物dihydrosinularin之用途，其中該養殖型柔軟指形軟珊瑚選自切成小塊之柔軟指形軟珊瑚碎片。
- 依申請專利範圍第5項所述之天然物dihydrosinularin之用途，其中該第一沖提溶液為甲醇/乙酸乙酯〔EtOAc〕/正己烷之混合溶媒。
- 依申請專利範圍第5項所述之天然物dihydrosinularin之用途，其中該第一沖提溶液係由〔100%正己烷〕、〔1%乙酸乙酯/正己烷〕、〔3%乙酸乙酯/正己烷〕、〔5%乙酸乙酯/正己 烷〕、〔10%乙酸乙酯/正己烷〕、〔20%乙酸乙酯/正己烷〕、〔25%乙酸乙酯/正己烷〕、〔30%乙酸乙酯/正己烷〕、〔40%乙酸乙酯/正己烷〕、〔50%乙酸乙酯/正己烷〕、〔70%乙酸乙酯/正己烷〕、〔90%乙酸乙酯/正己烷〕、〔100%乙酸乙酯〕、〔90%乙酸乙酯/甲醇〕、〔80%乙酸乙酯/甲醇〕、〔60%乙酸乙酯/甲醇〕、〔50%乙酸乙酯/甲醇〕、〔100%甲醇〕，依序增加該第一沖提溶劑之極性，並分成25個劃分層。
- 依申請專利範圍第8項所述之天然物dihydrosinularin之用途，其中該指定分層為由該第一沖提溶液之沖提取得之第10號劃分層。
- 依申請專利範圍第5項所述之天然物dihydrosinularin之用途，其中該第二沖提溶液為11%乙酸乙酯/正己烷與10%乙酸乙酯/正己烷。
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