JP2013540110A - 神経変性疾患に対して神経保護作用を有する製品の製造におけるフコキサンチンの応用 - Google Patents
神経変性疾患に対して神経保護作用を有する製品の製造におけるフコキサンチンの応用 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は神経変性疾患に関する神経保護作用、及び記憶改善作用を有する製品の製造におけるフコキサンチンの応用を開示する。本発明はさらに、神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品を開示する。本発明に係るフコキサンチンは細胞の酸化ストレスを抑制することができ、アルツハイマー病の予防や治療、及び記憶改善において役割が果たされる。
【選択図】図1
【選択図】図1
Description
本発明は、神経変性疾患に対する神経保護作用を有する製品に関し、具体的には、記憶改善製品へのフコキサンチンの応用、及び神経変性疾患に対して神経保護作用を有する製品へのフコキサンチンの応用に関する。前記神経変性疾患は、アルツハイマー病やパーキンソン病、ハンチントン舞踏病などがある。
β-カロチノイドや、リコピン、ルテイン、フコキサンチンなどのような天然カロチノイドは、その抗癌特性と優れたフリーラジカル除去機能を有するため、広く研究されている。フコキサンチン(fucoxanthin)はフェオフィチンともいい、ケルプや、サルガッソー、ヒバマタ、牛繁縷、フクロノリ、ツルモ、ワカメ、大型藻類、カラギーナン、コバタワラ(S. kjellmanianum Yendo)、ヒジキ、海蒿子(ホンダワラ属のトレポネータ)(S. pallidum) 及び珪藻など植物から由来し、特にフェオフィチンにおける含有量が多い。フコキサンチンの分子式はC42H58O6で、構造式は以下の通りである。
純粋フコキサンチンは赤褐色の結晶であり、キサントフィルの一種で、褐藻類に褐色を示させる物質であり、褐藻類の特有の色素でもある。フコキサンチンは糖尿病患者の血糖値調節、癌(乳腺癌、大腸癌、前立腺癌など)の死滅、優れた酸化防止機能など、多様な生理活性を有し、潜在的な開発利用価値を持っている。さらに、フコキサンチンはダイエットに効果があるという報告もある。
日本公開文献2001-335480Aに、フコキサンチンによって、脳虚血後の再潅流によるラット胎児の神経細胞の障害を抑制し、虚血再灌流から神経細胞を保護する活性を有することが報告された。脳虚血再灌流障害とは、脳の虚血状態が一定時間持続後、脳の血流量が回復すると、脳組織細胞への傷害が大きくなるということである。虚血性脳傷害は、虚血期間の原発性傷害と再灌流期間の続発性傷害とがあり、その病理過程の最初の段階は虚血で、重篤な場合に脳梗塞を引き起こすことがある。再灌流による障害を抑制することは現在、虚血性脳卒中の治療における肝心な一環となっている。日本国内特許において、フコキサンチンにより脳虚血再灌流のラット胎児の神経細胞の障害を抑制できることを証明し、その神経保護活性を報告したが、この特許で言及した脳虚血再灌流による神経細胞の障害は、年齢を問わない病理的原因による神経障害を対象にし、漸進的に発達する神経変性疾患とは関係がない。
本発明は、純品フコキサンチン及びその抽出物の神経変性疾患の治療及び予防における用途について論述する。神経変性疾患とは、特にアルツハイマー病(老人性痴呆症)を含み、認知及び記憶機能の悪化や、日常生活能力の漸進的衰減、さらに様々な神経精神症状や行動障害が臨床症状として現れる疾患である。神経変性疾患は、高齢に伴い、老衰と関係がある疾患である。したがって、本発明は年齢や老衰による神経変性疾患に関する神経保護を対象にする。
神経変性疾患とは、遺伝や環境の要因により誘発された慢性的で、長期な神経細胞減少疾患であり、アルツハイマー病(Alzheimer‘s Disease,AD)(老人性痴呆症ともいう)やパーキンソン病、ハンチントン舞踏病などがある。人口老齢化時代の到来に伴い、神経変性疾患はすでに中年と高齢者人口の健康を影響する主な要因の一つとなり、社会においても多額の経済的負担及び社会的負担をもたらしている。ADは発病率がもっとも高い神経変性疾患である。疫学研究によると、60歳以上の人口のAD発病率が1%で、85歳人口の発病率が30%である。また、AD患者の治療費用は、毎年合計839億ドルもかかるほど高く、且つ年々高くなる傾向があるということである。
ADの臨床症状は認知及び記憶機能の悪化や、日常生活能力の漸進的衰減であり、また様々な神経精神症状や行動障害が現れる。ある報告では、老人斑はADの主要な病理学的特徴で、β- アミロイド(β-Amyloid、Aβ)は、老人斑の重要な構成要素である。現在、Aβの堆積による酸化的ストレスが神経細胞障害の原因となる説は、公認されたADの主要な発病学説である。Aβが脳における過剰生成及び堆積により、細胞内のイオンが超負荷になり、細胞内の環境のバランスが破壊され、酸素ラジカル(ROS)とマロンジアルデヒド(MDA)などの生成が促進されるとともに、酸化的ストレスが引き起こされ、細胞内のスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)や、グルタチオンペルオキシダーゼ(GSH-PX)、及び総抗酸化能(T-AOC)などのような抗酸化因子のレベルが減少し、ニューロン特に記憶に関するニューロンの変性、さらに壊死を引き起こし、ADの発病が誘発される。ADの発病仮説は、以上のほかに、またtauタンパク質の異常、重金属、血管因子又はウイルス感染などがある。ADの損傷した領域は、主に大脳皮質や、前脳基底部、海馬などのような学習や記憶機能と関係する領域を含む。
現在、Aβ誘発のラット皮質神経細胞損傷モデルは、抗AD製品の研究における重要なモデルとして、初代培養のニューロンを標本にし、in vitro試験のターゲティング性を備えるとともに、体内実験の遺伝安定性を有するため、抗AD製品の選択や研究の有力な道具となり、製品に抗AD及び記憶改善の効用があるか否かを確実に確認することができる。
臨床において、ADに対する治療は、主に、抗アミロイドの治療、神経保護治療法、酸化防止剤、メマンチン、抗炎症薬、ホルモン補充療法、コリンエステラーゼ阻害剤などがある。しかし上記治療法は、認知機能の減衰を一時的に改善して遅延し、患者の症状を軽減しているが、病因を取り除き、病気を完全に治癒することができない。したがって、ADの治療に有効な薬物を探すことは緊急の課題となっている。そのため、世界各地の研究機関及び製薬企業が多額の費用を用いて研究を行っている。
近年、「自然に戻る」ことは人類の共通認識となっているため、天然や海洋植物より疾患を治療する有効な薬物を求めることは研究者及び研究・開発企業の関心を引き寄せ、また、顕著な進展を見せている。したがって、天然や海洋植物からADを治療する有効な薬物を求めることは、ADに対する治療に曙光をもたらすことになる。また、ADに対する分子レベルの治療標的を大量見つけたため、記憶改善や神経変性疾患の予防及び治療などの効用が果たされるような、ADを大幅に遅延し治療する天然又は海洋植物成分を必ず見つけることができると考えられる。
ADを予防・治療し、記憶力減退を改善する薬品や食品に対する探求において、フコキサンチンはAβ誘導のラット皮質神経細胞障害モデルに対する改善効果があることが発見されていた。細胞モデルの酸化ストレスを抑制することができることから、神経変性疾患に関する神経保護の役割が確認されている。
本発明は、Aβの活性フラグメントAβ25-35誘導の、記憶と緊密に関係する初代皮質神経細胞をモデルとして、フコキサンチンの抗AD活性を研究した。細胞生存率(MTT)、細胞形態学、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、グルタチオンペルオキシダーゼ(GSH-PX)、及び総抗酸化能(T-AOC)、マロンジアルデヒド(MAD)などの指標により、フコキサンチンの神経細胞に対する保護活性を評価する。スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)は人体の酸化及び抗酸化のバランスに対して非常に重要な役割を果たす。SODはスーパーオキシドアニオンラジカルを除去し、細胞を障害から守ることができるとともに、その活性のレベルは間接的に人体の酸素ラジカルに対する除去能力を反映する。グルタチオンペルオキシダーゼ(GSH-PX)は、過酸化水素を分解することを促進する体内の重要な酵素で、細胞膜の構造や機能の完全性を保護することができる。総抗酸化能(T-AOC)測定は、体系における総抗酸化物質の総抗酸化能のレベルを評価することができる。マロンジアルデヒド(MAD)の量は生体の脂質過酸化の程度を反映し、細胞のラジカルの攻撃による障害の程度を間接的に表すことができる。細胞形態学観察はHoechst/PI二重染色実験を採用する。PIとHoechst33342はいずれも細胞核DNA(又はRNA)と結合することができる。ただし、PIは正常な細胞膜を通過することができないが、Hoechstは膜通過性蛍光染料である。このため、細胞は、壊死又はアポトーシスの後期の場合、細胞膜が破壊され、PIにより赤色に着色される。また、正常な細胞と中早期のアポトーシス細胞はいずれもHoechstにより青色に着色されるが、アポトーシス細胞の核は凝集するため、明るい青色を見せる。このように、着色によって、正常(青色)、アポトーシス(明るい青色)及び壊死細胞(赤色)を区別することができる。ただし、明細書図面において色を表現する事ができないため、ここで中空円(青色)、灰色の円(明るい青色)及び黒の円(赤色)で表すことにする。
研究によると、純粋フコキサンチンA、フコキサンチンの粗抽出の粉末Fx−powderと、Fx−oilのいずれも、Aβ25−35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの生存率を顕著に高めることができ、神経変性疾患に関する神経保護の役割が果たされることが確認された。また、Aβ25−35誘導のラット皮質ニューロン細胞モデル培養液におけるニューロンSOD活性を高めることができ、Aβ25−35損傷ニューロンによるGSH−PX活性の大幅低下、及びAβ25−35によるニューロン損傷が原因である総抗酸化能T−AOCの大幅低下を逆転でき、Aβ25−35による損傷ニューロン培養液におけるMDAの含有量を顕著に降下することができる。さらに、ある程度の用量依存性を見せ、薬物の濃度が高まるにつれて、SOD活性が強くなる傾向を示している。上記4つの酸化損傷に関する指標の測定をまとめた結果、Fx−PowderとFx−oilはいずれも抗酸化損傷の役割が果たされることが確認されていた。実験システムにおいて、過酸化物の除去に関する酵素の活性や総抗酸化能の向上、及び過酸化損傷生成物の減少などに現れる。細胞形態学の測定した結果によると、異なる濃度において、Fx−powder及びFx−oilは細胞のアポトーシスや壊死の発生を抑制することができる。そのフコキサンチン粗抽出物Fx−01パウダーとFx−01オイルはいずれも、神経変性疾患に関する神経保護の役割が果たされ、記憶改善の活性を備える可能性がある。
動物実験の結果から明らかなように、ステップダウンテストと受動的回避実験において、フコキサンチン投与グループの動物の記憶獲得におけるエラー応答の潜伏期間(エラー応答待ち時間)が長く、エラー回数、エラー応答率が減少し、対照グループに比べ差異が顕著である。また、訓練及び重複実験した結果が一致しているため、フコキサンチンは記憶改善の機能があることが確認されていた。フコキサンチンはヘルスケア製品として、健康の増進や疾患の予防において、重要な役割が果たされ、特に脳の発育と記憶力において、広範な展望を持っている。
本発明は、フコキサンチンが記憶改善及び神経変性疾患に関する神経保護における新たな用途に関する。フコキサンチンは、神経変性疾患に関する神経保護に用いることができる。
本発明に係るフコキサンチンは、食品、ヘルスケア製品及び薬品を含む神経変性疾患に関する神経保護製品に用いられる。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティントン舞踏病を含む。
本発明に係るフコキサンチンの用途によると、前記製品はさらに、記憶改善の役割を含む。フコキサンチンは、アルツハイマー病や、パーキンソン病、ハンティントン舞踏病などのような神経変性疾患による記憶減退や障害を改善することができる。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記フコキサンチンを含有する製品の製剤は、パウダー、経口液体、錠剤、カプセル、顆粒剤、丸薬の少なくとも一つである。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記フコキサンチンの出所は、植物源、微生物源、又は合成した化合物源である。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記フコキサンチンの植物源は、海藻である。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記海藻は、ケルプや、サルガッソー、ヒバマタ、牛繁縷、フクロノリ、ツルモ、ワカメ、大型藻類、カラギーナン、コバタワラ(S. kjellmanianum Yendo)、ヒジキ、海蒿子(ホンダワラ属のトレポネータ)(S. pallidum)及び珪藻からなる群から選択される。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記フコキサンチンの含有量は、0.0001%〜60%であり、即ち、前記フコキサンチンの含有量は0.0001%〜10%、又は5%〜15%、あるいは10%〜20%、もしくは15%〜25%であり、25%〜35%、又は40%〜50%、あるいは50%〜60%であってもよい。本発明のフコキサンチンの用途によると、前記フコキサンチンの含有量は0.0001%〜10%であることがさらに好ましい。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記フコキサンチンのフコキサンチン抽出物における含有量は90〜100%である。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記フコキサンチンのフコキサンチン抽出物における含有量は95〜100%である。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記フコキサンチンにより製造された薬品は、錠剤、カプセル、マイクロペレットの形式を含む。
本発明のフコキサンチンの用途によると、実験対象が毎日服用したフコキサンチンの有効成分は0.001mg〜20mgで、即ち、実験対象が毎日服用するフコキサンチンの有効成分は2mg〜8mg、又は4mg〜9mg、もしくは10mg〜15mg、あるいは15mg〜20mgであってもよい。本発明の用途によると、実験対象が毎日服用するフコキサンチンの有効成分は0.001〜10mgである。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記製品に、神経変性疾患に関する疾患を有効に保護できるだけの量のフコキサンチンが含有される。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記製品にフコキサンチンが含有される。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記製品は、食品、ヘルスケア製品及び薬品を含む。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記フコキサンチンが含有される製品は、粉薬、経口液体、錠剤、カプセル、顆粒剤、及び丸薬からなる群の中の少なくとも一種である。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記フコキサンチンの出所は、植物源、微生物源、又は合成した化合物源を含む。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティントン舞踏病を含む。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記フコキサンチンが含有される製品は、さらに天然抽出物を含む。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記天然抽出物は、イチョウ葉抽出物、ドコサヘキサエン酸(DHA)、ホスファチジルセリン、レシチン、魚油、Omega−3、共役リノール酸からなる群から選択されたものである。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記フコキサンチンの植物源は海藻である。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記海藻は、ケルプや、サルガッソー、ヒバマタ、牛繁縷、フクロノリ、ツルモ、ワカメ、大型藻類、カラギーナン、コバタワラ(S. kjellmanianum Yendo)、ヒジキ、海蒿子(ホンダワラ属のトレポネータ)(S. pallidum)及び珪藻からなる群から選択されたものである。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記フコキサンチンの含有量は、0.0001%〜60%であり、即ち、前記フコキサンチンの含有量は0.0001%〜10%、又は5%〜15%、あるいは10%〜20%、もしくは15%〜25%であり、25%〜35%、又は40%〜50%、あるいは50%〜60%であってもよい。本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記フコキサンチンの含有量は0.0001%〜10%であることがさらに好ましい。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記フコキサンチンのフコキサンチン抽出物における含有量は90〜100%である。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記フコキサンチンのフコキサンチン抽出物における含有量は95〜100%である。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、実験対象が毎日服用するフコキサンチンの有効成分は0.001mg〜20mgで、即ち、実験対象が毎日取るフコキサンチンの有効成分は2mg〜8mg、又は4mg〜9mg、もしくは10mg〜15mg、あるいは15mg〜20mgであってもよい。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品より、実験対象が毎日服用するフコキサンチンの有効成分は0.001〜10mgである。
本発明に係る製品の記憶改善における用途は、アルツハイマー病や、パーキンソン病、ハンティントン舞踏病などのような神経変性疾患による記憶減退や障害を改善である。
本発明の実施例によると、本発明に係る製品は記憶力の改善において顕著な効果がある。本発明の一つの実施例における動物実験の結果によると、ステップダウン実験及び受動的回避実験において、フコキサンチンを投与したグループの動物の記憶獲得におけるエラー応答の潜伏期間(エラー応答待ち時間)が長く、エラー回数、エラー応答率が低減し、また対照グループと比較して、差異が顕著であるので、フコキサンチンは顕著な記憶改善の機能があることが確認できる。したがって、フコキサンチンは記憶改善における用途として、純粋フコキサンチンの形態、フコキサンチン抽出物の形態の両方で可能である。また高含有量のフコキサンチン、及びこれらの形態のフコキサンチンと他の原料と組み合わせた調剤の形態も可能である。フコキサンチンはヘルスケア製品として、健康の増進や神経変性疾患に関する神経疾患の予防及び治療において、重要な役割が果たされ、特に脳の発育と記憶力において、幅広い用途を持っている。
以下、具体的な実施例を通して、本発明に係るフコキサンチンの神経変性疾患における神経保護作用、特に抗ADや記憶改善における役割、及びフコキサンチンの神経変性疾患に関する神経保護における新しい用途を検証し、及び神経変性疾患に関する神経保護作用を有し、フコキサンチンが含有される製品を検証する。
以下、具体的な実験を通して、本発明に係るフコキサンチンの記憶改善における用途を説明する。βアミロイドペプチド(Aβ25〜35)誘導のラット脳皮質ニューロン細胞をモデルにして、その対照物A(純粋フコキサンチン)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(フコキサンチンパウダーFx−powder)とFx−01オイル(フコキサンチンオイルFx−oil)の神経保護作用を検出し、フコキサンチンのβアミロイドペプチド(Aβ25〜35)による細胞損傷に対する潜在的抵抗効果を評価する。以下述べる純粋フコキサンチンA、フコキサンチン抽出物、フコキサンチンパウダー、フコキサンチンオイルの製造方法はたくさんあるが、ここではそれぞれ1つの例により説明する。
純粋フコキサンチンAの製造方法:フコキサンチン抽出物を1グラム含有するサンプルをN−ヘキサン溶液に溶解し、シリカゲルを50グラム充填したクロマトグラフィーカラムを通過させ、N−ヘキサンと酢酸エルチとを98:2、95:5、90:10、85:15で次第にシリカゲルカラムを溶出し、薄層クロマトグラフィによってモニターして、硫酸エタノール溶液スプレーにより顕色し、同一純度の画分を合併させ、液相検出することで98%の純粋フコキサンチンが得られる。
フコキサンチンパウダーの製造方法:JP2009-261647とUS12/619474を参照。
フコキサンチンオイルの製造方法:フコキサンチン抽出物または純粋フコキサンチンを食用油に添加後、撹拌混合し製品におけるフコキサンチン含有量を必要な範囲内にする。
実施例1 in vitro薬理実験
(一)実験材料及び方法
1.材料
(一)実験材料及び方法
1.材料
1.1 動物
生後0〜4日齢のSDラット、北京大学医学部実験動物科学部から購入、実験動物許可証番号:SCXK(京)2006−0025。
生後0〜4日齢のSDラット、北京大学医学部実験動物科学部から購入、実験動物許可証番号:SCXK(京)2006−0025。
1.2 試薬
Aβ25〜35、MTTはいずれもSigma会社から購入する。総抗酸化能(T-AOC)キット、微量マロンジアルデヒド(MDA)テストボックス、グルタチオンペルオキシダーゼ(GSH−PX)テストボックス、SODテストボックスはいずれも南京建成生物工程研究所から購入し、細胞アポトーシス蛍光Hoechst33342/PI二重染色キットは南京KeyGen Biotech会社から購入した。
Aβ25〜35、MTTはいずれもSigma会社から購入する。総抗酸化能(T-AOC)キット、微量マロンジアルデヒド(MDA)テストボックス、グルタチオンペルオキシダーゼ(GSH−PX)テストボックス、SODテストボックスはいずれも南京建成生物工程研究所から購入し、細胞アポトーシス蛍光Hoechst33342/PI二重染色キットは南京KeyGen Biotech会社から購入した。
2.方法
2.1 ラット脳皮質ニューロン細胞初代培養
1)生後1〜4日齢のラットを屠殺し、75%のアルコールに2〜3秒漬け、滅菌シャーレに置き、脳を取り、冷却したDーHanks液が入った滅菌シャーレに入れて、脳膜と血管を取り除き、脳皮質を分離する。
2)分離された組織を0.125%のトリプシン溶液を適量含有する滅菌シャーレに入れ、組織を0.5mm×0.5mm×0.5mmの大きさに細切りして、室温で5分間置く。
3)組織ブロックを15mlの円遠心チューブに移転し、10%子うし血清を適量含有するDMEM―F12培地を添加して、消化を終了し、エルボーピペットにより軽く吹き付け、単子細胞浮遊液になるようにする。
4)400目のセルふるいにより細胞を慮過する。
5)1000rpmで5分間遠心分離後、上澄みを除去する。DーHanks液を添加し細胞を洗浄、1000rpmで5分間遠心分離後、上澄みを除去する。
6)所定量の10%の子うし血清を含有するDMEM―F12培地を添加し、細胞をカウントして、1×105個/mlの濃度で細胞を予め10μg/mlのポリエルリジンによりコーディングされた96及び24穴プレートに接種し、CO2孵卵器に入れ、37℃、5%のCO2において、培養する。
7)24時間後に、培地をシタラビン5mg/Lfと子うし血清10%を含有するDMEM−F12培地に交換する。さらに24時間後に、培地を2%B−27と10%子うし血清を含有するDMEM−F12培地に交換する。2日間ごとに培地を2%B−27と10%子うし血清を含有するDMEM−F12倍地に交換するように液体を交換する。
2.1 ラット脳皮質ニューロン細胞初代培養
1)生後1〜4日齢のラットを屠殺し、75%のアルコールに2〜3秒漬け、滅菌シャーレに置き、脳を取り、冷却したDーHanks液が入った滅菌シャーレに入れて、脳膜と血管を取り除き、脳皮質を分離する。
2)分離された組織を0.125%のトリプシン溶液を適量含有する滅菌シャーレに入れ、組織を0.5mm×0.5mm×0.5mmの大きさに細切りして、室温で5分間置く。
3)組織ブロックを15mlの円遠心チューブに移転し、10%子うし血清を適量含有するDMEM―F12培地を添加して、消化を終了し、エルボーピペットにより軽く吹き付け、単子細胞浮遊液になるようにする。
4)400目のセルふるいにより細胞を慮過する。
5)1000rpmで5分間遠心分離後、上澄みを除去する。DーHanks液を添加し細胞を洗浄、1000rpmで5分間遠心分離後、上澄みを除去する。
6)所定量の10%の子うし血清を含有するDMEM―F12培地を添加し、細胞をカウントして、1×105個/mlの濃度で細胞を予め10μg/mlのポリエルリジンによりコーディングされた96及び24穴プレートに接種し、CO2孵卵器に入れ、37℃、5%のCO2において、培養する。
7)24時間後に、培地をシタラビン5mg/Lfと子うし血清10%を含有するDMEM−F12培地に交換する。さらに24時間後に、培地を2%B−27と10%子うし血清を含有するDMEM−F12培地に交換する。2日間ごとに培地を2%B−27と10%子うし血清を含有するDMEM−F12倍地に交換するように液体を交換する。
2.2 実験のグループ分け及び処理方法
細胞生存率検出は、正常対照グループ(Control)と、モデルグループ(Model)、薬物濃度が異なる5つのグループ(薬物濃度(ここでいう薬物濃度とは、フコキサンチン純濃度):0.39、0.78、1.56、3.12、6.25μg/ml)、及び薬物対照グループ(6.25μg/ml)という合計8つのグループを設ける。その他の検出指標は、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、グルタチオンペルオキシダーゼ(GSH-PX)、総抗酸化能(T−AOC)、マロンジアルデヒド(MAD)及び細胞形態学観察があり、正常対照グループ、モデルグループ及び異なる濃度で薬物投与する3つのグループ(薬物濃度:0.39、0.78、1.56μg/ml)という合計5つのグループを設ける。
7日間培養した細胞を選び、薬物グループはそれぞれ対応する濃度の薬物を投与し、Control及びModelグループは等量の対応する溶液を添加し、16hインキュベート後、Controlグループ以外の各グループは5μM Aβ25〜35(予め37℃にて7日間老化させる)により24h処理する。細胞培養液でT−AOC、SOD、MDA及びGSH−PX検出を行い、MTT方式により細胞生存率を検出、又はHoechst/PI二重染色実験により形態学観察をする。
細胞生存率検出は、正常対照グループ(Control)と、モデルグループ(Model)、薬物濃度が異なる5つのグループ(薬物濃度(ここでいう薬物濃度とは、フコキサンチン純濃度):0.39、0.78、1.56、3.12、6.25μg/ml)、及び薬物対照グループ(6.25μg/ml)という合計8つのグループを設ける。その他の検出指標は、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、グルタチオンペルオキシダーゼ(GSH-PX)、総抗酸化能(T−AOC)、マロンジアルデヒド(MAD)及び細胞形態学観察があり、正常対照グループ、モデルグループ及び異なる濃度で薬物投与する3つのグループ(薬物濃度:0.39、0.78、1.56μg/ml)という合計5つのグループを設ける。
7日間培養した細胞を選び、薬物グループはそれぞれ対応する濃度の薬物を投与し、Control及びModelグループは等量の対応する溶液を添加し、16hインキュベート後、Controlグループ以外の各グループは5μM Aβ25〜35(予め37℃にて7日間老化させる)により24h処理する。細胞培養液でT−AOC、SOD、MDA及びGSH−PX検出を行い、MTT方式により細胞生存率を検出、又はHoechst/PI二重染色実験により形態学観察をする。
2.3実験指標測定方法
MTT方式による細胞生存率測定
96穴のプレートで細胞を培養し、薬物を投与し16h保護する。Aβ25〜35により24h損傷してから、培養液にMTTを5mg/ml添加し、4h培養し続けてから、培養を停止する。慎重に吸込み培養液を除去し、各穴にジメチルスルホキシド200μl添加し、結晶を十分に溶解させてから、マイクロプレートリーダーによりOD490nmのところで各穴の吸光値を測定し、対照グループを100%として細胞生存率を計算する。
Hoechst/PI二重染色実験方式は、キットの案内書を参照するとともに、改善を行った。24穴プレート(400μl培地)にHoechst33343を10μl添加し、37℃にて遮光して20min培養する。上澄みを慎重に吸込み、PBSにより3回洗浄する。各穴にBufferAを400μlとPIを3μlを添加して、37℃にて遮光して15min培養する。上澄みを慎重に吸込み、PBSにより3回洗浄し、各穴にBufferAを400μl添加する。共焦点レーザー顕微観察し、写真を撮る。
本実験の各指標の測定は、いずれも異なるサンプルで3回(Hoechst/PI二重染色実験により細胞形態を観察する実験は除く)重複して行い、実験結果は統計学分析により得られたものである。
MTT方式による細胞生存率測定
96穴のプレートで細胞を培養し、薬物を投与し16h保護する。Aβ25〜35により24h損傷してから、培養液にMTTを5mg/ml添加し、4h培養し続けてから、培養を停止する。慎重に吸込み培養液を除去し、各穴にジメチルスルホキシド200μl添加し、結晶を十分に溶解させてから、マイクロプレートリーダーによりOD490nmのところで各穴の吸光値を測定し、対照グループを100%として細胞生存率を計算する。
Hoechst/PI二重染色実験方式は、キットの案内書を参照するとともに、改善を行った。24穴プレート(400μl培地)にHoechst33343を10μl添加し、37℃にて遮光して20min培養する。上澄みを慎重に吸込み、PBSにより3回洗浄する。各穴にBufferAを400μlとPIを3μlを添加して、37℃にて遮光して15min培養する。上澄みを慎重に吸込み、PBSにより3回洗浄し、各穴にBufferAを400μl添加する。共焦点レーザー顕微観察し、写真を撮る。
本実験の各指標の測定は、いずれも異なるサンプルで3回(Hoechst/PI二重染色実験により細胞形態を観察する実験は除く)重複して行い、実験結果は統計学分析により得られたものである。
(二)結果と考察
1 薬物が細胞生存率に対する影響
対照物A(A)(純粋フコキサンチン)、及びその粗抽出物であるFx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの生存率に対する影響を測定した結果は表1に示す通りである。結果によると、Aβ25〜35に処置された細胞の生存率が76.03%であり、顕著に降下(p<0.01)した。Aβ25〜35による処置はニューロン細胞の損傷になったことが確認されたため、モデルは成功的である。また、いずれの薬物でもモデル化したニューロン細胞に対して保護作用を有する。Fx−powderはAと類似して、ニューロン損傷の抑制作用を有するが、用量依存関係が示されなかった。Fx−oilは、神経保護作用を有し、且つ薬物濃度の向上につれて保護作用が強くなるというような用量依存性が示されている。3種類の薬物を比較してみると、細胞生存率の影響から見て、薬物の神経保護作用は、対照物A>Fx−oil>Fx−powderとなる。薬物対照グループとControlグループとは顕著な差がない。
1 薬物が細胞生存率に対する影響
対照物A(A)(純粋フコキサンチン)、及びその粗抽出物であるFx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの生存率に対する影響を測定した結果は表1に示す通りである。結果によると、Aβ25〜35に処置された細胞の生存率が76.03%であり、顕著に降下(p<0.01)した。Aβ25〜35による処置はニューロン細胞の損傷になったことが確認されたため、モデルは成功的である。また、いずれの薬物でもモデル化したニューロン細胞に対して保護作用を有する。Fx−powderはAと類似して、ニューロン損傷の抑制作用を有するが、用量依存関係が示されなかった。Fx−oilは、神経保護作用を有し、且つ薬物濃度の向上につれて保護作用が強くなるというような用量依存性が示されている。3種類の薬物を比較してみると、細胞生存率の影響から見て、薬物の神経保護作用は、対照物A>Fx−oil>Fx−powderとなる。薬物対照グループとControlグループとは顕著な差がない。
2 薬物がSOD活性に対する影響
SOD活性の高さは間接的に人体の酸素ラジカルの消去能力を反映することができる。対照物A(A)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの培養液におけるSOD活性に対する影響を検出した結果は表2に示す通りである。結果によると、Aβ25〜35に処置された後、細胞培養液におけるSOD活性の降下があるが、顕著な差異がない。一方、いずれの薬物でもモデル化したニューロンSOD活性をある程度向上させることができ、また物濃度の向上についてSOD活性が強くなるという用量依存性が示されている。
SOD活性の高さは間接的に人体の酸素ラジカルの消去能力を反映することができる。対照物A(A)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの培養液におけるSOD活性に対する影響を検出した結果は表2に示す通りである。結果によると、Aβ25〜35に処置された後、細胞培養液におけるSOD活性の降下があるが、顕著な差異がない。一方、いずれの薬物でもモデル化したニューロンSOD活性をある程度向上させることができ、また物濃度の向上についてSOD活性が強くなるという用量依存性が示されている。
3 薬物がGSH−PX活性に対する影響
対照物A(A)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの培養液におけるGSH−PX活性に対する影響を検出した結果は表3に示す通りである。結果に示されたように、Aβ25〜35のニューロンに対する損傷は、GSH−PX活性を著しく降下(p<0.05)させた一方、3種類の薬物のいずれでもGSH−PX活性をある程度向上させていた。ただし、モデルとは顕著な差がなく、また用量依存関係が示されていない。
対照物A(A)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの培養液におけるGSH−PX活性に対する影響を検出した結果は表3に示す通りである。結果に示されたように、Aβ25〜35のニューロンに対する損傷は、GSH−PX活性を著しく降下(p<0.05)させた一方、3種類の薬物のいずれでもGSH−PX活性をある程度向上させていた。ただし、モデルとは顕著な差がなく、また用量依存関係が示されていない。
4 薬物の総抗酸化能(T−AOC)に対する影響
総抗酸化能(T−AOC)測定は、システムにおける総抗酸化物質の抗酸化能力の高さを評価することができる。対照物A(A)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの培養液におけるT−AOCに対する影響を検出した結果は表4に示す通りである。結果に示されたように、Aβ25〜35のニューロンに対する損傷は、培養液における抗酸化物質の総抗酸化能力を著しく降下(p<0.05)させた一方、3種類の薬物のいずれでも総抗酸化能をある程度向上させていた。Fx−powderは薬物濃度の向上につれて保護作用が強くなる傾向が示されたのに対して、AとFx−oilは総抗酸化能を高めることができたが、用量依存関係が示されていない。
総抗酸化能(T−AOC)測定は、システムにおける総抗酸化物質の抗酸化能力の高さを評価することができる。対照物A(A)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの培養液におけるT−AOCに対する影響を検出した結果は表4に示す通りである。結果に示されたように、Aβ25〜35のニューロンに対する損傷は、培養液における抗酸化物質の総抗酸化能力を著しく降下(p<0.05)させた一方、3種類の薬物のいずれでも総抗酸化能をある程度向上させていた。Fx−powderは薬物濃度の向上につれて保護作用が強くなる傾向が示されたのに対して、AとFx−oilは総抗酸化能を高めることができたが、用量依存関係が示されていない。
5 薬物のMDA含有量に対する影響
人体が酵素系及び非酵素系により酸化ラジカルを生成し、後者は生物膜における多価不飽和脂肪酸を攻撃することができ、脂質の過酸化反応を引き起し、さらにMDAなどのような脂質過酸化物を形成する。したがって、MDAの量は人体における脂質過酸化の程度を反映でき、さらに間接的に細胞がラジカルの攻撃による損傷の程度を反映することができる。対照物A(A)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの培養液におけるMDAに対する影響を検出した結果は表5に示す通りである。結果に示されたように、Aβ25〜35のニューロンに対する損傷は、培養液におけるMDAの含有量をわずかに向上させる。Fx−powderは、障害のニューロン細胞の培養液におけるMDAの含有量を顕著に低減できるとともに、薬物濃度の向上につれて保護作用が強くなるという用量依存関係を有する。Fx−oilもこのようなニューロン細胞の酸化損傷に対する保護作用を有するが、用量依存関係が顕著ではない。対照物Aは用量が低い場合、一定の保護作用が示されていた。しかし、中、高用量の場合このような作用が逆転されていたように見えるので、MDA含有量がかえって向上したが、Modelに比較して、統計学における差異がない。
人体が酵素系及び非酵素系により酸化ラジカルを生成し、後者は生物膜における多価不飽和脂肪酸を攻撃することができ、脂質の過酸化反応を引き起し、さらにMDAなどのような脂質過酸化物を形成する。したがって、MDAの量は人体における脂質過酸化の程度を反映でき、さらに間接的に細胞がラジカルの攻撃による損傷の程度を反映することができる。対照物A(A)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの培養液におけるMDAに対する影響を検出した結果は表5に示す通りである。結果に示されたように、Aβ25〜35のニューロンに対する損傷は、培養液におけるMDAの含有量をわずかに向上させる。Fx−powderは、障害のニューロン細胞の培養液におけるMDAの含有量を顕著に低減できるとともに、薬物濃度の向上につれて保護作用が強くなるという用量依存関係を有する。Fx−oilもこのようなニューロン細胞の酸化損傷に対する保護作用を有するが、用量依存関係が顕著ではない。対照物Aは用量が低い場合、一定の保護作用が示されていた。しかし、中、高用量の場合このような作用が逆転されていたように見えるので、MDA含有量がかえって向上したが、Modelに比較して、統計学における差異がない。
総じて言えば、上記4つの酸化損傷に関する指標に対して検出した結果をまとめると、3種類の薬物のいずれもある程度の抗酸化損傷の役割を有し、実験システムにおいて、過酸化物の除去に関する酵素の活性や、総抗酸化能の向上、及び過酸化損傷生成物の減少などが現れる。
6 ニューロンの形態学検出
形態学の検出結果は図1の通りである。正常対照グループの多くは青の正常細胞であり、そして、明るい青色のアポトーシス細胞が少量あるが、壊死細胞がない。モデルグループは、明るい青色のアポトーシス細胞が顕著に増加し、且つ明るい赤色の壊死細胞が現れた。Fx−powder0.39μg/mlグループのアポトーシス及び壊死細胞が減少し、0.78μg/mlグループのアポトーシス細胞が減少したが、壊死細胞が減少しなかった。1.56μg/mlグループの壊死細胞が減少したが、用量依存性を見せなかった。Fx−oil0.39μg/mlグループと0.78μg/mlグループのアポトーシス細胞が減少し、1.56μg/mlグループの壊死細胞とアポトーシス細胞がいずれも減少した。Fx−oilは、ある程度の用量依存性を見せていた。A0.39μg/mlグループの壊死細胞は減少があるが、0.78μg/mlグループと1.56μg/mlグループのアポトーシス細胞と壊死細胞が減少した。Aはある程度の用量依存関係がある。3種類の薬物を比較すると、Aの効果が最もよく、次はFx−oil、Fx−powderである。
形態学の検出結果は図1の通りである。正常対照グループの多くは青の正常細胞であり、そして、明るい青色のアポトーシス細胞が少量あるが、壊死細胞がない。モデルグループは、明るい青色のアポトーシス細胞が顕著に増加し、且つ明るい赤色の壊死細胞が現れた。Fx−powder0.39μg/mlグループのアポトーシス及び壊死細胞が減少し、0.78μg/mlグループのアポトーシス細胞が減少したが、壊死細胞が減少しなかった。1.56μg/mlグループの壊死細胞が減少したが、用量依存性を見せなかった。Fx−oil0.39μg/mlグループと0.78μg/mlグループのアポトーシス細胞が減少し、1.56μg/mlグループの壊死細胞とアポトーシス細胞がいずれも減少した。Fx−oilは、ある程度の用量依存性を見せていた。A0.39μg/mlグループの壊死細胞は減少があるが、0.78μg/mlグループと1.56μg/mlグループのアポトーシス細胞と壊死細胞が減少した。Aはある程度の用量依存関係がある。3種類の薬物を比較すると、Aの効果が最もよく、次はFx−oil、Fx−powderである。
(三)結論
1 対照物A及びその粗抽出物であるFx−01パウダーとFx−01オイルのいずれもある程度の神経変性疾患に関する神経保護作用を有し、また、記憶を改善する活性を有する可能性がある。
2 3種類の薬物の神経保護作用を比較すると、対照物Aが最も良く、次はFx−01オイル、Fx−01パウダーである。
3 3種類の薬物のいずれもある程度の抗酸化損傷作用を有する。
1 対照物A及びその粗抽出物であるFx−01パウダーとFx−01オイルのいずれもある程度の神経変性疾患に関する神経保護作用を有し、また、記憶を改善する活性を有する可能性がある。
2 3種類の薬物の神経保護作用を比較すると、対照物Aが最も良く、次はFx−01オイル、Fx−01パウダーである。
3 3種類の薬物のいずれもある程度の抗酸化損傷作用を有する。
実施例2 体内薬理実験
1 材料と方法
1 材料と方法
1.1 材料 純粋フコキサンチンは自社製造の試料を用いた。マウスの1日の推奨投与量は人体の1日投与量に相当する4mgであり、昆明産の白い雄マウス、生後6〜8週齢で、体重18〜22gである。
1.2 用量とグループ分け 人体の1日投与量である4mgの純粋フコキサンチンを投与グループとして、マウスの1日投与量に転換する。また、対照グループを設ける。
1.3 動物実験室の配置 動物実験室はSPFレベルであり、室温22±2℃、湿度60%〜80%である。
1.4 計器 ステップダウン計器、受動的回避計器
1.5 方法
1.51 ステップダウン実験 体重が18〜22グラムの雄マウスを20匹選び、対照グループと投与グループとをランダムにグループ分けする。投与グループに対して、毎日純粋フコキサンチンを強制経口投与し、30日連続投与後、ステップダウン訓練をさせる。動物を反応室に入れて3min順応させ、36Vの交流電を与える。この時の動物の正常反応は絶縁ステップに飛び戻すことである。多数の動物が再び又は数回に銅グリッドに戻し、電気刺激後、ステップに飛び戻す可能性がある。一回訓練してから、動物を反応室のステップに置いて、5min内のそれぞれのマウスが電気刺激された回数(エラー回数)をカウントし、これを学習成績とする。24h後に、もう一度テストして、電撃された動物の数、初回ステップから下へジャンプする潜伏期間、及び3min内のエラー回数を記録する。
1.52 受動的回避実験 動物の選択、実験グループ分け、試料の投与量、ルート、時間はすべてステップダウン実験と同様である。30日連続投与後、受動的回避訓練を行う。実験時にマウスの顔を穴の反対側に向けて、明室に入れるとともに、タイマーを起動する。動物が穴を通り抜けて暗室に入って電撃されたら、タイマーをストップして、マウスを取り出す。各マウスの明室に置かれてから暗室に入って電撃されるまでの時間、即ち潜伏期間を記録する。24h後の同一時間に、繰り返して実験を行い、各マウスの暗室に入る潜伏期間、5min内のエラー回数、及び暗室に入った動物の数を記録する。
1.6 データ処理 得られたデータをSPSS1010統計ソフトパケットにより、分散分析及びχ2検出の方法で統計処理をする。
1.2 用量とグループ分け 人体の1日投与量である4mgの純粋フコキサンチンを投与グループとして、マウスの1日投与量に転換する。また、対照グループを設ける。
1.3 動物実験室の配置 動物実験室はSPFレベルであり、室温22±2℃、湿度60%〜80%である。
1.4 計器 ステップダウン計器、受動的回避計器
1.5 方法
1.51 ステップダウン実験 体重が18〜22グラムの雄マウスを20匹選び、対照グループと投与グループとをランダムにグループ分けする。投与グループに対して、毎日純粋フコキサンチンを強制経口投与し、30日連続投与後、ステップダウン訓練をさせる。動物を反応室に入れて3min順応させ、36Vの交流電を与える。この時の動物の正常反応は絶縁ステップに飛び戻すことである。多数の動物が再び又は数回に銅グリッドに戻し、電気刺激後、ステップに飛び戻す可能性がある。一回訓練してから、動物を反応室のステップに置いて、5min内のそれぞれのマウスが電気刺激された回数(エラー回数)をカウントし、これを学習成績とする。24h後に、もう一度テストして、電撃された動物の数、初回ステップから下へジャンプする潜伏期間、及び3min内のエラー回数を記録する。
1.52 受動的回避実験 動物の選択、実験グループ分け、試料の投与量、ルート、時間はすべてステップダウン実験と同様である。30日連続投与後、受動的回避訓練を行う。実験時にマウスの顔を穴の反対側に向けて、明室に入れるとともに、タイマーを起動する。動物が穴を通り抜けて暗室に入って電撃されたら、タイマーをストップして、マウスを取り出す。各マウスの明室に置かれてから暗室に入って電撃されるまでの時間、即ち潜伏期間を記録する。24h後の同一時間に、繰り返して実験を行い、各マウスの暗室に入る潜伏期間、5min内のエラー回数、及び暗室に入った動物の数を記録する。
1.6 データ処理 得られたデータをSPSS1010統計ソフトパケットにより、分散分析及びχ2検出の方法で統計処理をする。
2 結果
2.1 ステップダウン実験 下表から分かるように、マウスに純粋フコキサンチンを30日経口投与した投与グループは、記憶獲得(訓練)の過程において、平均エラー回数が対照グループより少なく、またその差が顕著である。重複実験において、投与グループの、ステップから飛び下りる潜伏期間が対照グループより長く、平均エラー回数、エラー反応率は対照グループより低く、さらにその差は顕著(p<0.05)である。
2.1 ステップダウン実験 下表から分かるように、マウスに純粋フコキサンチンを30日経口投与した投与グループは、記憶獲得(訓練)の過程において、平均エラー回数が対照グループより少なく、またその差が顕著である。重複実験において、投与グループの、ステップから飛び下りる潜伏期間が対照グループより長く、平均エラー回数、エラー反応率は対照グループより低く、さらにその差は顕著(p<0.05)である。
2.2 受動的回避実験 下表から分かるように、マウスに純粋フコキサンチンを30日投与した投与グループは、平均潜伏期間が対照グループより長く、平均エラー回数が対照グループより少なく、さらにその差は顕著(p<0.05)である。
3 考察
薬理実験の結果によると、ステップダウン実験と受動的回避実験において、投与グループの動物の記憶獲得におけるエラー反応潜伏期間が長くなり、エラー回数、エラー反応率が低下し、その差は対照グループと比較して顕著である。よって、フコキサンチンが記憶を改善する機能を有することが証明されている。フコキサンチンはヘルスケア製品として、健康の促進や疾患の予防において、脳の発育及び記憶力の増進などのような重要な役割が果たされている。
薬理実験の結果によると、ステップダウン実験と受動的回避実験において、投与グループの動物の記憶獲得におけるエラー反応潜伏期間が長くなり、エラー回数、エラー反応率が低下し、その差は対照グループと比較して顕著である。よって、フコキサンチンが記憶を改善する機能を有することが証明されている。フコキサンチンはヘルスケア製品として、健康の促進や疾患の予防において、脳の発育及び記憶力の増進などのような重要な役割が果たされている。
実施例3 材料と方法
1.1 材料 昆明産の白い雄マウス、生後6〜8週齢、体重18〜22g。
1.2 投与量とグループ分け
表16の調剤に従う。対照グループを設ける。
1.3 動物実験室の配置 動物実験室はSPFレベルで、室温22±2℃、湿度60%〜80%である。
1.4 計器 ステップダウン計器、受動的回避計器
1.5 方法は実施例2と同様
1.6 データ処理 得られたデータの処理方法は実施例2と同様
1.1 材料 昆明産の白い雄マウス、生後6〜8週齢、体重18〜22g。
1.2 投与量とグループ分け
表16の調剤に従う。対照グループを設ける。
1.3 動物実験室の配置 動物実験室はSPFレベルで、室温22±2℃、湿度60%〜80%である。
1.4 計器 ステップダウン計器、受動的回避計器
1.5 方法は実施例2と同様
1.6 データ処理 得られたデータの処理方法は実施例2と同様
2 結果
2.1 ステップダウン実験 下表から分かるように、マウスに表16に示された調剤を30日経口投与した投与グループは、記憶獲得(訓練)の過程において、平均エラー回数が対照グループより少なく、さらにその差が顕著である。重複して実験した結果、投与グループの、ステップから飛び下りる潜伏期間が対照グループより長く、平均エラー回数が対照グループより少なく、エラー反応率が対照グループより低く、さらにその差が顕著(p<0.05)である。
2.1 ステップダウン実験 下表から分かるように、マウスに表16に示された調剤を30日経口投与した投与グループは、記憶獲得(訓練)の過程において、平均エラー回数が対照グループより少なく、さらにその差が顕著である。重複して実験した結果、投与グループの、ステップから飛び下りる潜伏期間が対照グループより長く、平均エラー回数が対照グループより少なく、エラー反応率が対照グループより低く、さらにその差が顕著(p<0.05)である。
3.2 受動的回避実験 下表から分かるように、マウスに表16に示された調剤を30日経口投与した薬物投与グループは、平均潜伏期間が対照グループより長く、平均エラー回数が対照グループより少なく、さらにその差が顕著(p<0.05)である。
4 考察
薬理実験の結果によると、ステップダウン実験及び受動的回避実験において、薬物投与グループの動物の記憶獲得におけるエラー潜伏期間が長く、エラー回数、エラー反応率が低くなり、その差は対照グループと比較して顕著である。フコキサンチンの調剤は記憶を改善する機能を有し、薬品とヘルスケア製品として、脳の発育及び記憶力を含む健康の促進や疾患の予防において重要な役割が果たされている。
薬理実験の結果によると、ステップダウン実験及び受動的回避実験において、薬物投与グループの動物の記憶獲得におけるエラー潜伏期間が長く、エラー回数、エラー反応率が低くなり、その差は対照グループと比較して顕著である。フコキサンチンの調剤は記憶を改善する機能を有し、薬品とヘルスケア製品として、脳の発育及び記憶力を含む健康の促進や疾患の予防において重要な役割が果たされている。
実施例4 フコキサンチン抽出物(フコキサンチン含有量95%)により製造されたハードカブセル(表8)
実施例5 フコキサンチン抽出物(フコキサンチン含有量60%)により製造されたフィルムコート錠(表9)
実施例6 フコキサンチン抽出物(フコキサンチン含有量0.1%)により製造されたソフトカプセル(表10)
実施例7 フコキサンチン抽出物(フコキサンチン含有量10%)により製造されたソフトカプセル(表11)
実施例8 フコキサンチン抽出物(フコキサンチン含有量100%)により製造されたハードカプセル(表12)
実施例9 フコキサンチン抽出物(フコキサンチン含有量0.1%)により製造されたソフトカプセル(表13)
実施例10 フコキサンチン1%オイルにより製造されたソフトカプセル(表14)
実施例11 フコキサンチンを60%含有するフコキサンチン抽出物により製造されたソフトカプセル
実施例12 100%フコキサンチン抽出物により製造されたマイクロペレット
言うまでもなく、本発明の本質を説明するために、本発明の特許請求の範囲に記載された原則及び範囲を逸脱しない限り、当業者であれば、ここで説明した詳細情報、材料及び調剤に対して、様々変更することができる。
本発明は、神経変性疾患に対する神経保護作用を有する製品に関し、具体的には、記憶改善製品へのフコキサンチンの応用、及び神経変性疾患に対して神経保護作用を有する製品へのフコキサンチンの応用に関する。
β-カロチノイドや、リコピン、ルテイン、フコキサンチンなどのような天然カロチノイドは、その抗癌特性と優れたフリーラジカル除去機能を有するため、広く研究されている。フコキサンチン(fucoxanthin)はフェオフィチンともいい、ケルプや、サルガッソー、ヒバマタ、牛繁縷、フクロノリ、ツルモ、ワカメ、大型藻類、カラギーナン、コバタワラ(S. kjellmanianum Yendo)、ヒジキ、海蒿子(ホンダワラ属のトレポネータ)(S. pallidum) 及び珪藻など植物から由来し、特にフェオフィチンにおける含有量が多い。フコキサンチンの分子式はC 42 H 58 O 6 で、構造式は以下の通りである。
純粋フコキサンチンは赤褐色の結晶であり、キサントフィルの一種で、褐藻類に褐色を示させる物質であり、褐藻類の特有の色素でもある。フコキサンチンは糖尿病患者の血糖値調節、癌(乳腺癌、大腸癌、前立腺癌など)の死滅、優れた酸化防止機能など、多様な生理活性を有し、潜在的な開発利用価値を持っている。さらに、フコキサンチンはダイエットに効果があるという報告もある。
日本公開文献2001-335480Aに、フコキサンチンによって、脳虚血後の再潅流によるラット胎児の神経細胞の障害を抑制し、虚血再灌流から神経細胞を保護する活性を有することが報告された。脳虚血再灌流障害とは、脳の虚血状態が一定時間持続後、脳の血流量が回復すると、脳組織細胞への傷害が大きくなるということである。虚血性脳傷害は、虚血期間の原発性傷害と再灌流期間の続発性傷害とがあり、その病理過程の最初の段階は虚血で、重篤な場合に脳梗塞を引き起こすことがある。再灌流による障害を抑制することは現在、虚血性脳卒中の治療における肝心な一環となっている。日本国内特許において、フコキサンチンにより脳虚血再灌流のラット胎児の神経細胞の障害を抑制できることを証明し、その神経保護活性を報告したが、この特許で言及した脳虚血再灌流による神経細胞の障害は、年齢を問わない病理的原因による神経障害を対象にし、漸進的に発達する神経変性疾患とは関係がない。
本発明は、純品フコキサンチン及びその抽出物の神経変性疾患の治療及び予防における用途について論述する。神経変性疾患とは、認知及び記憶機能の悪化や、日常生活能力の漸進的衰減、さらに様々な神経精神症状や行動障害が臨床症状として現れる疾患である。神経変性疾患は、高齢に伴い、老衰と関係がある疾患である。したがって、本発明は年齢や老衰による神経変性疾患に関する神経保護を対象にする。
神経変性疾患とは、遺伝や環境の要因により誘発された慢性的で、長期な神経細胞減少疾患である。人口老齢化時代の到来に伴い、神経変性疾患はすでに中年と高齢者人口の健康を影響する主な要因の一つとなり、社会においても多額の経済的負担及び社会的負担をもたらしている。
神経変性疾患の臨床症状は認知及び記憶機能の悪化や、日常生活能力の漸進的衰減であり、また様々な神経精神症状や行動障害が現れる。ある報告では、老人斑は生体が老衰する主要な特徴で、β- アミロイド(β-Amyloid、Aβ)は、老人斑の重要な構成要素である。現在、Aβの堆積による酸化的ストレスが神経細胞障害の原因となる説は、老人斑の主要な発病学説である。Aβが脳における過剰生成及び堆積により、細胞内のイオンが超負荷になり、細胞内の環境のバランスが破壊され、酸素ラジカル(ROS)とマロンジアルデヒド(MDA)などの生成が促進されるとともに、酸化的ストレスが引き起こされ、細胞内のスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)や、グルタチオンペルオキシダーゼ(GSH-PX)、及び総抗酸化能(T-AOC)などのような抗酸化因子のレベルが減少し、ニューロン特に記憶に関するニューロンの変性、さらに壊死を引き起こし、記憶力の減退が誘発される。
現在、Aβ誘発のラット皮質神経細胞損傷モデルは、神経の保護に関する重要なモデルとして、初代培養のニューロンを標本にし、in vitro試験のターゲティング性を備えるとともに、体内実験の遺伝安定性を有するため、神経変性疾患を予防或いは治療する製品の選択や研究の有力な道具となり、製品に記憶改善の効用があるか否かを確実に確認することができる。
臨床において、神経保護及び記憶力減退に対する治療は、主に、抗アミロイドの治療、神経保護治療法、酸化防止剤、メマンチン、抗炎症薬、ホルモン補充療法、コリンエステラーゼ阻害剤などがある。しかし上記治療法は、認知機能の減衰を一時的に改善して遅延し、患者の症状を軽減しているが、病因を取り除き、病気を完全に治癒することができない。したがって、神経変性疾患の予防、治療、記憶力減退の改善に有効な薬物を探すことは緊急の課題となっている。そのため、世界各地の研究機関及び製薬企業が多額の費用を用いて研究を行っている。
近年、「自然に戻る」ことは人類の共通認識となっているため、天然や海洋植物より疾患を治療する有効な薬物を求めることは研究者及び研究・開発企業の関心を引き寄せ、また、顕著な進展を見せている。したがって、天然や海洋植物から神経変性疾患を治療する、及び記憶力減退を改善する有効な薬物を求めることは、曙光をもたらすことができると考えられる。
神経変性疾患を予防・治療し、記憶力減退を改善する薬品や食品に対する探求において、フコキサンチンはAβ誘導のラット皮質神経細胞障害モデルに対する改善効果があることが発見されていた。細胞モデルの酸化ストレスを抑制することができることから、神経変性疾患に関する神経保護及び記憶力改善の役割が確認されている。
本発明は、Aβの活性フラグメントAβ25-35誘導の、記憶と緊密に関係する初代皮質神経細胞をモデルとして、フコキサンチンの神経変性疾患を予防・治療する、及び記憶力減退を改善する活性を研究した。細胞生存率(MTT)、細胞形態学、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、グルタチオンペルオキシダーゼ(GSH-PX)、及び総抗酸化能(T-AOC)、マロンジアルデヒド(MAD)などの指標により、フコキサンチンの神経細胞に対する保護活性を評価する。スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)は人体の酸化及び抗酸化のバランスに対して非常に重要な役割を果たす。SODはスーパーオキシドアニオンラジカルを除去し、細胞を障害から守ることができるとともに、その活性のレベルは間接的に人体の酸素ラジカルに対する除去能力を反映する。グルタチオンペルオキシダーゼ(GSH-PX)は、過酸化水素を分解することを促進する体内の重要な酵素で、細胞膜の構造や機能の完全性を保護することができる。総抗酸化能(T-AOC)測定は、体系における総抗酸化物質の総抗酸化能のレベルを評価することができる。マロンジアルデヒド(MAD)の量は生体の脂質過酸化の程度を反映し、細胞のラジカルの攻撃による障害の程度を間接的に表すことができる。細胞形態学観察はHoechst/PI二重染色実験を採用する。PIとHoechst33342はいずれも細胞核DNA(又はRNA)と結合することができる。ただし、PIは正常な細胞膜を通過することができないが、Hoechstは膜通過性蛍光染料である。このため、細胞は、壊死又はアポトーシスの後期の場合、細胞膜が破壊され、PIにより赤色に着色される。また、正常な細胞と中早期のアポトーシス細胞はいずれもHoechstにより青色に着色されるが、アポトーシス細胞の核は凝集するため、明るい青色を見せる。このように、着色によって、正常(青色)、アポトーシス(明るい青色)及び壊死細胞(赤色)を区別することができる。ただし、明細書図面において色を表現する事ができないため、ここで中空円(青色)、灰色の円(明るい青色)及び黒の円(赤色)で表すことにする。
研究によると、純粋フコキサンチンA、フコキサンチンの粗抽出の粉末Fx−powderと、Fx−oilのいずれも、Aβ25−35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの生存率を顕著に高めることができ、神経変性疾患に関する神経保護の役割が果たされることが確認された。また、Aβ25−35誘導のラット皮質ニューロン細胞モデル培養液におけるニューロンSOD活性を高めることができ、Aβ25−35損傷ニューロンによるGSH−PX活性の大幅低下、及びAβ25−35によるニューロン損傷が原因である総抗酸化能T−AOCの大幅低下を逆転でき、Aβ25−35による損傷ニューロン培養液におけるMDAの含有量を顕著に降下することができる。さらに、ある程度の用量依存性を見せ、薬物の濃度が高まるにつれて、SOD活性が強くなる傾向を示している。上記4つの酸化損傷に関する指標の測定をまとめた結果、Fx−PowderとFx−oilはいずれも抗酸化損傷の役割が果たされることが確認されていた。実験システムにおいて、過酸化物の除去に関する酵素の活性や総抗酸化能の向上、及び過酸化損傷生成物の減少などに現れる。細胞形態学の測定した結果によると、異なる濃度において、Fx−powder及びFx−oilは細胞のアポトーシスや壊死の発生を抑制することができる。そのフコキサンチン粗抽出物Fx−01パウダーとFx−01オイルはいずれも、神経変性疾患に関する神経保護の役割が果たされ、記憶改善の活性を備える可能性がある。
動物実験の結果から明らかなように、ステップダウンテストと受動的回避実験において、フコキサンチン投与グループの動物の記憶獲得におけるエラー応答の潜伏期間(エラー応答待ち時間)が長く、エラー回数、エラー応答率が減少し、対照グループに比べ差異が顕著である。また、訓練及び重複実験した結果が一致しているため、フコキサンチンは記憶改善の機能があることが確認されていた。フコキサンチンはヘルスケア製品として、健康の増進や疾患の予防において、重要な役割が果たされ、特に脳の発育と記憶力において、広範な展望を持っている。
本発明は、フコキサンチンが記憶改善及び神経変性疾患に関する神経保護における新たな用途に関する。フコキサンチンは、神経変性疾患に関する神経保護に用いることができる。
本発明に係るフコキサンチンは、食品、ヘルスケア製品及び薬品を含む神経変性疾患に関する神経保護製品に用いられる。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンティントン舞踏病を含む。
本発明に係るフコキサンチンの用途によると、前記製品はさらに、記憶改善の役割を含む。フコキサンチンは、パーキンソン病、ハンティントン舞踏病などのような神経変性疾患による記憶減退や障害を改善することができる。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記フコキサンチンを含有する製品の製剤は、パウダー、経口液体、錠剤、カプセル、顆粒剤、丸薬の少なくとも一つである。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記フコキサンチンの出所は、植物源、微生物源、又は合成した化合物源である。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記フコキサンチンの植物源は、海藻である。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記海藻は、ケルプや、サルガッソー、ヒバマタ、牛繁縷、フクロノリ、ツルモ、ワカメ、大型藻類、カラギーナン、コバタワラ(S. kjellmanianum Yendo)、ヒジキ、海蒿子(ホンダワラ属のトレポネータ)(S. pallidum)及び珪藻からなる群から選択される。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記フコキサンチンの含有量は、0.0001%〜60%であり、即ち、前記フコキサンチンの含有量は0.0001%〜10%、又は5%〜15%、あるいは10%〜20%、もしくは15%〜25%であり、25%〜35%、又は40%〜50%、あるいは50%〜60%であってもよい。本発明のフコキサンチンの用途によると、前記フコキサンチンの含有量は0.0001%〜10%であることがさらに好ましい。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記フコキサンチンのフコキサンチン抽出物における含有量は90〜100%である。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記フコキサンチンのフコキサンチン抽出物における含有量は95〜100%である。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記フコキサンチンにより製造された薬品は、錠剤、カプセル、マイクロペレットの形式を含む。
本発明のフコキサンチンの用途によると、実験対象が毎日服用したフコキサンチンの有効成分は0.001mg〜20mgで、即ち、実験対象が毎日服用するフコキサンチンの有効成分は2mg〜8mg、又は4mg〜9mg、もしくは10mg〜15mg、あるいは15mg〜20mgであってもよい。本発明の用途によると、実験対象が毎日服用するフコキサンチンの有効成分は0.001〜10mgである。
本発明のフコキサンチンの用途によると、前記製品に、神経変性疾患に関する疾患を有効に保護できるだけの量のフコキサンチンが含有される。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記製品にフコキサンチンが含有される。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記製品は、食品、ヘルスケア製品及び薬品を含む。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記フコキサンチンが含有される製品は、粉薬、経口液体、錠剤、カプセル、顆粒剤、及び丸薬からなる群の中の少なくとも一種である。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記フコキサンチンの出所は、植物源、微生物源、又は合成した化合物源を含む。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記神経変性疾患は、パーキンソン病、ハンティントン舞踏病を含む。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記フコキサンチンが含有される製品は、さらに天然抽出物を含む。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記天然抽出物は、イチョウ葉抽出物、ドコサヘキサエン酸(DHA)、ホスファチジルセリン、レシチン、魚油、Omega−3、共役リノール酸からなる群から選択されたものである。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記フコキサンチンの植物源は海藻である。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記海藻は、ケルプや、サルガッソー、ヒバマタ、牛繁縷、フクロノリ、ツルモ、ワカメ、大型藻類、カラギーナン、コバタワラ(S. kjellmanianum Yendo)、ヒジキ、海蒿子(ホンダワラ属のトレポネータ)(S. pallidum)及び珪藻からなる群から選択されたものである。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記フコキサンチンの含有量は、0.0001%〜60%であり、即ち、前記フコキサンチンの含有量は0.0001%〜10%、又は5%〜15%、あるいは10%〜20%、もしくは15%〜25%であり、25%〜35%、又は40%〜50%、あるいは50%〜60%であってもよい。本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記フコキサンチンの含有量は0.0001%〜10%であることがさらに好ましい。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記フコキサンチンのフコキサンチン抽出物における含有量は90〜100%である。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、前記フコキサンチンのフコキサンチン抽出物における含有量は95〜100%である。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品によると、実験対象が毎日服用するフコキサンチンの有効成分は0.001mg〜20mgで、即ち、実験対象が毎日取るフコキサンチンの有効成分は2mg〜8mg、又は4mg〜9mg、もしくは10mg〜15mg、あるいは15mg〜20mgであってもよい。
本発明の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品より、実験対象が毎日服用するフコキサンチンの有効成分は0.001〜10mgである。
本発明に係る製品の記憶改善における用途は、アルツハイマー病や、パーキンソン病、ハンティントン舞踏病などのような神経変性疾患による記憶減退や障害を改善である。
本発明の実施例によると、本発明に係る製品は記憶力の改善において顕著な効果がある。本発明の一つの実施例における動物実験の結果によると、ステップダウン実験及び受動的回避実験において、フコキサンチンを投与したグループの動物の記憶獲得におけるエラー応答の潜伏期間(エラー応答待ち時間)が長く、エラー回数、エラー応答率が低減し、また対照グループと比較して、差異が顕著であるので、フコキサンチンは顕著な記憶改善の機能があることが確認できる。したがって、フコキサンチンは記憶改善における用途として、純粋フコキサンチンの形態、フコキサンチン抽出物の形態の両方で可能である。また高含有量のフコキサンチン、及びこれらの形態のフコキサンチンと他の原料と組み合わせた調剤の形態も可能である。フコキサンチンはヘルスケア製品として、健康の増進や神経変性疾患に関する神経疾患の予防及び治療において、重要な役割が果たされ、特に脳の発育と記憶力において、幅広い用途を持っている。
以下、具体的な実施例を通して、本発明に係るフコキサンチンの神経変性疾患における神経保護作用、特に記憶改善における役割、及びフコキサンチンの神経変性疾患に関する神経保護における新しい用途を検証し、及び神経変性疾患に関する神経保護作用を有し、フコキサンチンが含有される製品を検証する。
以下、具体的な実験を通して、本発明に係るフコキサンチンの記憶改善における用途を説明する。βアミロイドペプチド(Aβ25〜35)誘導のラット脳皮質ニューロン細胞をモデルにして、その対照物A(純粋フコキサンチン、Fxと略称する)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(フコキサンチンパウダーFx−powder)とFx−01オイル(フコキサンチンオイルFx−oil)の神経保護作用を検出し、フコキサンチンのβアミロイドペプチド(Aβ25〜35)による細胞損傷に対する潜在的抵抗効果を評価する。以下述べる純粋フコキサンチンA、フコキサンチン抽出物、フコキサンチンパウダー、フコキサンチンオイルの製造方法はたくさんあるが、ここではそれぞれ1つの例により説明する。
純粋フコキサンチンAの製造方法:フコキサンチン抽出物を1グラム含有するサンプルをN−ヘキサン溶液に溶解し、シリカゲルを50グラム充填したクロマトグラフィーカラムを通過させ、N−ヘキサンと酢酸エルチとを98:2、95:5、90:10、85:15で次第にシリカゲルカラムを溶出し、薄層クロマトグラフィによってモニターして、硫酸エタノール溶液スプレーにより顕色し、同一純度の画分を合併させ、液相検出することで98%の純粋フコキサンチンが得られる。
フコキサンチンパウダーの製造方法:JP2009-261647とUS12/619474を参照。
フコキサンチンオイルの製造方法:フコキサンチン抽出物または純粋フコキサンチンを食用油に添加後、撹拌混合し製品におけるフコキサンチン含有量を必要な範囲内にする。
実施例1 in vitro薬理実験
(一)実験材料及び方法
1.材料
(一)実験材料及び方法
1.材料
1.1 動物
生後0〜4日齢のSDラット、北京大学医学部実験動物科学部から購入、実験動物許可証番号:SCXK(京)2006−0025。
生後0〜4日齢のSDラット、北京大学医学部実験動物科学部から購入、実験動物許可証番号:SCXK(京)2006−0025。
1.2 試薬
Aβ25〜35、MTTはいずれもSigma会社から購入する。総抗酸化能(T-AOC)キット、微量マロンジアルデヒド(MDA)テストボックス、グルタチオンペルオキシダーゼ(GSH−PX)テストボックス、SODテストボックスはいずれも南京建成生物工程研究所から購入し、細胞アポトーシス蛍光Hoechst33342/PI二重染色キットは南京KeyGen Biotech会社から購入した。
Aβ25〜35、MTTはいずれもSigma会社から購入する。総抗酸化能(T-AOC)キット、微量マロンジアルデヒド(MDA)テストボックス、グルタチオンペルオキシダーゼ(GSH−PX)テストボックス、SODテストボックスはいずれも南京建成生物工程研究所から購入し、細胞アポトーシス蛍光Hoechst33342/PI二重染色キットは南京KeyGen Biotech会社から購入した。
2.方法
2.1 ラット脳皮質ニューロン細胞初代培養
1)生後1〜4日齢のラットを屠殺し、75%のアルコールに2〜3秒漬け、滅菌シャーレに置き、脳を取り、冷却したDーHanks液が入った滅菌シャーレに入れて、脳膜と血管を取り除き、脳皮質を分離する。
2)分離された組織を0.125%のトリプシン溶液を適量含有する滅菌シャーレに入れ、組織を0.5mm×0.5mm×0.5mmの大きさに細切りして、室温で5分間置く。
3)組織ブロックを15mlの円遠心チューブに移転し、10%子うし血清を適量含有するDMEM―F12培地を添加して、消化を終了し、エルボーピペットにより軽く吹き付け、単子細胞浮遊液になるようにする。
4)400目のセルふるいにより細胞を慮過する。
5)1000rpmで5分間遠心分離後、上澄みを除去する。DーHanks液を添加し細胞を洗浄、1000rpmで5分間遠心分離後、上澄みを除去する。
6)所定量の10%の子うし血清を含有するDMEM―F12培地を添加し、細胞をカウントして、1×105個/mlの濃度で細胞を予め10μg/mlのポリエルリジンによりコーディングされた96及び24穴プレートに接種し、CO2孵卵器に入れ、37℃、5%のCO2において、培養する。
7)24時間後に、培地をシタラビン5mg/Lfと子うし血清10%を含有するDMEM−F12培地に交換する。さらに24時間後に、培地を2%B−27と10%子うし血清を含有するDMEM−F12培地に交換する。2日間ごとに培地を2%B−27と10%子うし血清を含有するDMEM−F12倍地に交換するように液体を交換する。
2.1 ラット脳皮質ニューロン細胞初代培養
1)生後1〜4日齢のラットを屠殺し、75%のアルコールに2〜3秒漬け、滅菌シャーレに置き、脳を取り、冷却したDーHanks液が入った滅菌シャーレに入れて、脳膜と血管を取り除き、脳皮質を分離する。
2)分離された組織を0.125%のトリプシン溶液を適量含有する滅菌シャーレに入れ、組織を0.5mm×0.5mm×0.5mmの大きさに細切りして、室温で5分間置く。
3)組織ブロックを15mlの円遠心チューブに移転し、10%子うし血清を適量含有するDMEM―F12培地を添加して、消化を終了し、エルボーピペットにより軽く吹き付け、単子細胞浮遊液になるようにする。
4)400目のセルふるいにより細胞を慮過する。
5)1000rpmで5分間遠心分離後、上澄みを除去する。DーHanks液を添加し細胞を洗浄、1000rpmで5分間遠心分離後、上澄みを除去する。
6)所定量の10%の子うし血清を含有するDMEM―F12培地を添加し、細胞をカウントして、1×105個/mlの濃度で細胞を予め10μg/mlのポリエルリジンによりコーディングされた96及び24穴プレートに接種し、CO2孵卵器に入れ、37℃、5%のCO2において、培養する。
7)24時間後に、培地をシタラビン5mg/Lfと子うし血清10%を含有するDMEM−F12培地に交換する。さらに24時間後に、培地を2%B−27と10%子うし血清を含有するDMEM−F12培地に交換する。2日間ごとに培地を2%B−27と10%子うし血清を含有するDMEM−F12倍地に交換するように液体を交換する。
2.2 実験のグループ分け及び処理方法
細胞生存率検出は、正常対照グループ(Control)と、モデルグループ(Model)、薬物濃度が異なる5つのグループ(薬物濃度(ここでいう薬物濃度とは、フコキサンチン純濃度):0.39、0.78、1.56、3.12、6.25μg/ml)、及び薬物対照グループ(6.25μg/ml)という合計8つのグループを設ける。その他の検出指標は、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、グルタチオンペルオキシダーゼ(GSH-PX)、総抗酸化能(T−AOC)、マロンジアルデヒド(MAD)及び細胞形態学観察があり、正常対照グループ、モデルグループ及び異なる濃度で薬物投与する3つのグループ(薬物濃度:0.39、0.78、1.56μg/ml)という合計5つのグループを設ける。
7日間培養した細胞を選び、薬物グループはそれぞれ対応する濃度の薬物を投与し、Control及びModelグループは等量の対応する溶液を添加し、16hインキュベート後、Controlグループ以外の各グループは5μM Aβ25〜35(予め37℃にて7日間老化させる)により24h処理する。細胞培養液でT−AOC、SOD、MDA及びGSH−PX検出を行い、MTT方式により細胞生存率を検出、又はHoechst/PI二重染色実験により形態学観察をする。
細胞生存率検出は、正常対照グループ(Control)と、モデルグループ(Model)、薬物濃度が異なる5つのグループ(薬物濃度(ここでいう薬物濃度とは、フコキサンチン純濃度):0.39、0.78、1.56、3.12、6.25μg/ml)、及び薬物対照グループ(6.25μg/ml)という合計8つのグループを設ける。その他の検出指標は、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、グルタチオンペルオキシダーゼ(GSH-PX)、総抗酸化能(T−AOC)、マロンジアルデヒド(MAD)及び細胞形態学観察があり、正常対照グループ、モデルグループ及び異なる濃度で薬物投与する3つのグループ(薬物濃度:0.39、0.78、1.56μg/ml)という合計5つのグループを設ける。
7日間培養した細胞を選び、薬物グループはそれぞれ対応する濃度の薬物を投与し、Control及びModelグループは等量の対応する溶液を添加し、16hインキュベート後、Controlグループ以外の各グループは5μM Aβ25〜35(予め37℃にて7日間老化させる)により24h処理する。細胞培養液でT−AOC、SOD、MDA及びGSH−PX検出を行い、MTT方式により細胞生存率を検出、又はHoechst/PI二重染色実験により形態学観察をする。
2.3 実験指標測定方法
MTT方式による細胞生存率測定
96穴のプレートで細胞を培養し、薬物を投与し16h保護する。Aβ25〜35により24h損傷してから、培養液にMTTを5mg/ml添加し、4h培養し続けてから、培養を停止する。慎重に吸込み培養液を除去し、各穴にジメチルスルホキシド200μl添加し、結晶を十分に溶解させてから、マイクロプレートリーダーによりOD490nmのところで各穴の吸光値を測定し、対照グループを100%として細胞生存率を計算する。
Hoechst/PI二重染色実験方式は、キットの案内書を参照するとともに、改善を行った。24穴プレート(400μl培地)にHoechst33343を10μl添加し、37℃にて遮光して20min培養する。上澄みを慎重に吸込み、PBSにより3回洗浄する。各穴にBufferAを400μlとPIを3μlを添加して、37℃にて遮光して15min培養する。上澄みを慎重に吸込み、PBSにより3回洗浄し、各穴にBufferAを400μl添加する。共焦点レーザー顕微観察し、写真を撮る。
本実験の各指標の測定は、いずれも異なるサンプルで3回(Hoechst/PI二重染色実験により細胞形態を観察する実験は除く)重複して行い、実験結果は統計学分析により得られたものである。
MTT方式による細胞生存率測定
96穴のプレートで細胞を培養し、薬物を投与し16h保護する。Aβ25〜35により24h損傷してから、培養液にMTTを5mg/ml添加し、4h培養し続けてから、培養を停止する。慎重に吸込み培養液を除去し、各穴にジメチルスルホキシド200μl添加し、結晶を十分に溶解させてから、マイクロプレートリーダーによりOD490nmのところで各穴の吸光値を測定し、対照グループを100%として細胞生存率を計算する。
Hoechst/PI二重染色実験方式は、キットの案内書を参照するとともに、改善を行った。24穴プレート(400μl培地)にHoechst33343を10μl添加し、37℃にて遮光して20min培養する。上澄みを慎重に吸込み、PBSにより3回洗浄する。各穴にBufferAを400μlとPIを3μlを添加して、37℃にて遮光して15min培養する。上澄みを慎重に吸込み、PBSにより3回洗浄し、各穴にBufferAを400μl添加する。共焦点レーザー顕微観察し、写真を撮る。
本実験の各指標の測定は、いずれも異なるサンプルで3回(Hoechst/PI二重染色実験により細胞形態を観察する実験は除く)重複して行い、実験結果は統計学分析により得られたものである。
(二)結果と考察
1 薬物が細胞生存率に対する影響
対照物A(A)(純粋フコキサンチン)、及びその粗抽出物であるFx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの生存率に対する影響を測定した結果は表1に示す通りである。結果によると、Aβ25〜35に処置された細胞の生存率が76.03%であり、顕著に降下(p<0.01)した。Aβ25〜35による処置はニューロン細胞の損傷になったことが確認されたため、モデルは成功的である。また、いずれの薬物でもモデル化したニューロン細胞に対して保護作用を有する。Fx−powderはAと類似して、ニューロン損傷の抑制作用を有するが、用量依存関係が示されなかった。Fx−oilは、神経保護作用を有し、且つ薬物濃度の向上につれて保護作用が強くなるというような用量依存性が示されている。3種類の薬物を比較してみると、細胞生存率の影響から見て、薬物の神経保護作用は、対照物A>Fx−oil>Fx−powderとなる。薬物対照グループとControlグループとは顕著な差がない。
1 薬物が細胞生存率に対する影響
対照物A(A)(純粋フコキサンチン)、及びその粗抽出物であるFx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの生存率に対する影響を測定した結果は表1に示す通りである。結果によると、Aβ25〜35に処置された細胞の生存率が76.03%であり、顕著に降下(p<0.01)した。Aβ25〜35による処置はニューロン細胞の損傷になったことが確認されたため、モデルは成功的である。また、いずれの薬物でもモデル化したニューロン細胞に対して保護作用を有する。Fx−powderはAと類似して、ニューロン損傷の抑制作用を有するが、用量依存関係が示されなかった。Fx−oilは、神経保護作用を有し、且つ薬物濃度の向上につれて保護作用が強くなるというような用量依存性が示されている。3種類の薬物を比較してみると、細胞生存率の影響から見て、薬物の神経保護作用は、対照物A>Fx−oil>Fx−powderとなる。薬物対照グループとControlグループとは顕著な差がない。
2 薬物がSOD活性に対する影響
SOD活性の高さは間接的に人体の酸素ラジカルの消去能力を反映することができる。対照物A(A)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの培養液におけるSOD活性に対する影響を検出した結果は表2に示す通りである。結果によると、Aβ25〜35に処置された後、細胞培養液におけるSOD活性の降下があるが、顕著な差異がない。一方、いずれの薬物でもモデル化したニューロンSOD活性をある程度向上させることができ、また物濃度の向上についてSOD活性が強くなるという用量依存性が示されている。
SOD活性の高さは間接的に人体の酸素ラジカルの消去能力を反映することができる。対照物A(A)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの培養液におけるSOD活性に対する影響を検出した結果は表2に示す通りである。結果によると、Aβ25〜35に処置された後、細胞培養液におけるSOD活性の降下があるが、顕著な差異がない。一方、いずれの薬物でもモデル化したニューロンSOD活性をある程度向上させることができ、また物濃度の向上についてSOD活性が強くなるという用量依存性が示されている。
3 薬物がGSH−PX活性に対する影響
対照物A(A)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの培養液におけるGSH−PX活性に対する影響を検出した結果は表3に示す通りである。結果に示されたように、Aβ25〜35のニューロンに対する損傷は、GSH−PX活性を著しく降下(p<0.05)させた一方、3種類の薬物のいずれでもGSH−PX活性をある程度向上させていた。ただし、モデルとは顕著な差がなく、また用量依存関係が示されていない。
対照物A(A)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの培養液におけるGSH−PX活性に対する影響を検出した結果は表3に示す通りである。結果に示されたように、Aβ25〜35のニューロンに対する損傷は、GSH−PX活性を著しく降下(p<0.05)させた一方、3種類の薬物のいずれでもGSH−PX活性をある程度向上させていた。ただし、モデルとは顕著な差がなく、また用量依存関係が示されていない。
4 薬物の総抗酸化能(T−AOC)に対する影響
総抗酸化能(T−AOC)測定は、システムにおける総抗酸化物質の抗酸化能力の高さを評価することができる。対照物A(A)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの培養液におけるT−AOCに対する影響を検出した結果は表4に示す通りである。結果に示されたように、Aβ25〜35のニューロンに対する損傷は、培養液における抗酸化物質の総抗酸化能力を著しく降下(p<0.05)させた一方、3種類の薬物のいずれでも総抗酸化能をある程度向上させていた。Fx−powderは薬物濃度の向上につれて保護作用が強くなる傾向が示されたのに対して、AとFx−oilは総抗酸化能を高めることができたが、用量依存関係が示されていない。
総抗酸化能(T−AOC)測定は、システムにおける総抗酸化物質の抗酸化能力の高さを評価することができる。対照物A(A)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの培養液におけるT−AOCに対する影響を検出した結果は表4に示す通りである。結果に示されたように、Aβ25〜35のニューロンに対する損傷は、培養液における抗酸化物質の総抗酸化能力を著しく降下(p<0.05)させた一方、3種類の薬物のいずれでも総抗酸化能をある程度向上させていた。Fx−powderは薬物濃度の向上につれて保護作用が強くなる傾向が示されたのに対して、AとFx−oilは総抗酸化能を高めることができたが、用量依存関係が示されていない。
5 薬物のMDA含有量に対する影響
人体が酵素系及び非酵素系により酸化ラジカルを生成し、後者は生物膜における多価不飽和脂肪酸を攻撃することができ、脂質の過酸化反応を引き起し、さらにMDAなどのような脂質過酸化物を形成する。したがって、MDAの量は人体における脂質過酸化の程度を反映でき、さらに間接的に細胞がラジカルの攻撃による損傷の程度を反映することができる。対照物A(A)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの培養液におけるMDAに対する影響を検出した結果は表5に示す通りである。結果に示されたように、Aβ25〜35のニューロンに対する損傷は、培養液におけるMDAの含有量をわずかに向上させる。Fx−powderは、障害のニューロン細胞の培養液におけるMDAの含有量を顕著に低減できるとともに、薬物濃度の向上につれて保護作用が強くなるという用量依存関係を有する。Fx−oilもこのようなニューロン細胞の酸化損傷に対する保護作用を有するが、用量依存関係が顕著ではない。対照物Aは用量が低い場合、一定の保護作用が示されていた。しかし、中、高用量の場合このような作用が逆転されていたように見えるので、MDA含有量がかえって向上したが、Modelに比較して、統計学における差異がない。
人体が酵素系及び非酵素系により酸化ラジカルを生成し、後者は生物膜における多価不飽和脂肪酸を攻撃することができ、脂質の過酸化反応を引き起し、さらにMDAなどのような脂質過酸化物を形成する。したがって、MDAの量は人体における脂質過酸化の程度を反映でき、さらに間接的に細胞がラジカルの攻撃による損傷の程度を反映することができる。対照物A(A)及びその粗抽出物Fx−01パウダー(Fx−powder)とFx−01オイル(Fx−oil)の、Aβ25〜35誘導のラット脳皮質ニューロン細胞モデルの培養液におけるMDAに対する影響を検出した結果は表5に示す通りである。結果に示されたように、Aβ25〜35のニューロンに対する損傷は、培養液におけるMDAの含有量をわずかに向上させる。Fx−powderは、障害のニューロン細胞の培養液におけるMDAの含有量を顕著に低減できるとともに、薬物濃度の向上につれて保護作用が強くなるという用量依存関係を有する。Fx−oilもこのようなニューロン細胞の酸化損傷に対する保護作用を有するが、用量依存関係が顕著ではない。対照物Aは用量が低い場合、一定の保護作用が示されていた。しかし、中、高用量の場合このような作用が逆転されていたように見えるので、MDA含有量がかえって向上したが、Modelに比較して、統計学における差異がない。
総じて言えば、上記4つの酸化損傷に関する指標に対して検出した結果をまとめると、3種類の薬物のいずれもある程度の抗酸化損傷の役割を有し、実験システムにおいて、過酸化物の除去に関する酵素の活性や、総抗酸化能の向上、及び過酸化損傷生成物の減少などが現れる。
6 ニューロンの形態学検出
形態学の検出結果は図1の通りである。正常対照グループの多くは青の正常細胞であり、そして、明るい青色のアポトーシス細胞が少量あるが、壊死細胞がない。モデルグループは、明るい青色のアポトーシス細胞が顕著に増加し、且つ明るい赤色の壊死細胞が現れた。Fx−powder0.39μg/mlグループのアポトーシス及び壊死細胞が減少し、0.78μg/mlグループのアポトーシス細胞が減少したが、壊死細胞が減少しなかった。1.56μg/mlグループの壊死細胞が減少したが、用量依存性を見せなかった。Fx−oil0.39μg/mlグループと0.78μg/mlグループのアポトーシス細胞が減少し、1.56μg/mlグループの壊死細胞とアポトーシス細胞がいずれも減少した。Fx−oilは、ある程度の用量依存性を見せていた。A0.39μg/mlグループの壊死細胞は減少があるが、0.78μg/mlグループと1.56μg/mlグループのアポトーシス細胞と壊死細胞が減少した。Aはある程度の用量依存関係がある。3種類の薬物を比較すると、Aの効果が最もよく、次はFx−oil、Fx−powderである。
形態学の検出結果は図1の通りである。正常対照グループの多くは青の正常細胞であり、そして、明るい青色のアポトーシス細胞が少量あるが、壊死細胞がない。モデルグループは、明るい青色のアポトーシス細胞が顕著に増加し、且つ明るい赤色の壊死細胞が現れた。Fx−powder0.39μg/mlグループのアポトーシス及び壊死細胞が減少し、0.78μg/mlグループのアポトーシス細胞が減少したが、壊死細胞が減少しなかった。1.56μg/mlグループの壊死細胞が減少したが、用量依存性を見せなかった。Fx−oil0.39μg/mlグループと0.78μg/mlグループのアポトーシス細胞が減少し、1.56μg/mlグループの壊死細胞とアポトーシス細胞がいずれも減少した。Fx−oilは、ある程度の用量依存性を見せていた。A0.39μg/mlグループの壊死細胞は減少があるが、0.78μg/mlグループと1.56μg/mlグループのアポトーシス細胞と壊死細胞が減少した。Aはある程度の用量依存関係がある。3種類の薬物を比較すると、Aの効果が最もよく、次はFx−oil、Fx−powderである。
(三)結論
1 対照物A及びその粗抽出物であるFx−01パウダーとFx−01オイルのいずれもある程度の神経変性疾患に関する神経保護作用を有し、また、記憶を改善する活性を有する可能性がある。
2 3種類の薬物の神経保護作用を比較すると、対照物Aが最も良く、次はFx−01オイル、Fx−01パウダーである。
3 3種類の薬物のいずれもある程度の抗酸化損傷作用を有する。
1 対照物A及びその粗抽出物であるFx−01パウダーとFx−01オイルのいずれもある程度の神経変性疾患に関する神経保護作用を有し、また、記憶を改善する活性を有する可能性がある。
2 3種類の薬物の神経保護作用を比較すると、対照物Aが最も良く、次はFx−01オイル、Fx−01パウダーである。
3 3種類の薬物のいずれもある程度の抗酸化損傷作用を有する。
実施例2 体内薬理実験
1 材料と方法
1 材料と方法
1.1 材料 純粋フコキサンチンは自社製造の試料を用いた。マウスの1日の推奨投与量は人体の1日投与量に相当する4mgであり、昆明産の白い雄マウス、生後6〜8週齢で、体重18〜22gである。
1.2 用量とグループ分け 人体の1日投与量である4mgの純粋フコキサンチンを投与グループとして、マウスの1日投与量に転換する。また、対照グループを設ける。
1.3 動物実験室の配置 動物実験室はSPFレベルであり、室温22±2℃、湿度60%〜80%である。
1.4 計器 ステップダウン計器、受動的回避計器
1.5 方法
1.51 ステップダウン実験 体重が18〜22グラムの雄マウスを20匹選び、対照グループと投与グループとをランダムにグループ分けする。投与グループに対して、毎日純粋フコキサンチンを強制経口投与し、30日連続投与後、ステップダウン訓練をさせる。動物を反応室に入れて3min順応させ、36Vの交流電を与える。この時の動物の正常反応は絶縁ステップに飛び戻すことである。多数の動物が再び又は数回に銅グリッドに戻し、電気刺激後、ステップに飛び戻す可能性がある。一回訓練してから、動物を反応室のステップに置いて、5min内のそれぞれのマウスが電気刺激された回数(エラー回数)をカウントし、これを学習成績とする。24h後に、もう一度テストして、電撃された動物の数、初回ステップから下へジャンプする潜伏期間、及び3min内のエラー回数を記録する。
1.52 受動的回避実験 動物の選択、実験グループ分け、試料の投与量、ルート、時間はすべてステップダウン実験と同様である。30日連続投与後、受動的回避訓練を行う。実験時にマウスの顔を穴の反対側に向けて、明室に入れるとともに、タイマーを起動する。動物が穴を通り抜けて暗室に入って電撃されたら、タイマーをストップして、マウスを取り出す。各マウスの明室に置かれてから暗室に入って電撃されるまでの時間、即ち潜伏期間を記録する。24h後の同一時間に、繰り返して実験を行い、各マウスの暗室に入る潜伏期間、5min内のエラー回数、及び暗室に入った動物の数を記録する。
1.6 データ処理 得られたデータをSPSS1010統計ソフトパケットにより、分散分析及びχ2検出の方法で統計処理をする。
1.2 用量とグループ分け 人体の1日投与量である4mgの純粋フコキサンチンを投与グループとして、マウスの1日投与量に転換する。また、対照グループを設ける。
1.3 動物実験室の配置 動物実験室はSPFレベルであり、室温22±2℃、湿度60%〜80%である。
1.4 計器 ステップダウン計器、受動的回避計器
1.5 方法
1.51 ステップダウン実験 体重が18〜22グラムの雄マウスを20匹選び、対照グループと投与グループとをランダムにグループ分けする。投与グループに対して、毎日純粋フコキサンチンを強制経口投与し、30日連続投与後、ステップダウン訓練をさせる。動物を反応室に入れて3min順応させ、36Vの交流電を与える。この時の動物の正常反応は絶縁ステップに飛び戻すことである。多数の動物が再び又は数回に銅グリッドに戻し、電気刺激後、ステップに飛び戻す可能性がある。一回訓練してから、動物を反応室のステップに置いて、5min内のそれぞれのマウスが電気刺激された回数(エラー回数)をカウントし、これを学習成績とする。24h後に、もう一度テストして、電撃された動物の数、初回ステップから下へジャンプする潜伏期間、及び3min内のエラー回数を記録する。
1.52 受動的回避実験 動物の選択、実験グループ分け、試料の投与量、ルート、時間はすべてステップダウン実験と同様である。30日連続投与後、受動的回避訓練を行う。実験時にマウスの顔を穴の反対側に向けて、明室に入れるとともに、タイマーを起動する。動物が穴を通り抜けて暗室に入って電撃されたら、タイマーをストップして、マウスを取り出す。各マウスの明室に置かれてから暗室に入って電撃されるまでの時間、即ち潜伏期間を記録する。24h後の同一時間に、繰り返して実験を行い、各マウスの暗室に入る潜伏期間、5min内のエラー回数、及び暗室に入った動物の数を記録する。
1.6 データ処理 得られたデータをSPSS1010統計ソフトパケットにより、分散分析及びχ2検出の方法で統計処理をする。
2 結果
2.1 ステップダウン実験 下表から分かるように、マウスに純粋フコキサンチンを30日経口投与した投与グループは、記憶獲得(訓練)の過程において、平均エラー回数が対照グループより少なく、またその差が顕著である。重複実験において、投与グループの、ステップから飛び下りる潜伏期間が対照グループより長く、平均エラー回数、エラー反応率は対照グループより低く、さらにその差は顕著(p<0.05)である。
2.1 ステップダウン実験 下表から分かるように、マウスに純粋フコキサンチンを30日経口投与した投与グループは、記憶獲得(訓練)の過程において、平均エラー回数が対照グループより少なく、またその差が顕著である。重複実験において、投与グループの、ステップから飛び下りる潜伏期間が対照グループより長く、平均エラー回数、エラー反応率は対照グループより低く、さらにその差は顕著(p<0.05)である。
2.2 受動的回避実験 下表から分かるように、マウスに純粋フコキサンチンを30日投与した投与グループは、平均潜伏期間が対照グループより長く、平均エラー回数が対照グループより少なく、さらにその差は顕著(p<0.05)である。
3 考察
薬理実験の結果によると、ステップダウン実験と受動的回避実験において、投与グループの動物の記憶獲得におけるエラー反応潜伏期間が長くなり、エラー回数、エラー反応率が低下し、その差は対照グループと比較して顕著である。よって、フコキサンチンが記憶を改善する機能を有することが証明されている。フコキサンチンはヘルスケア製品として、健康の促進や疾患の予防において、脳の発育及び記憶力の増進などのような重要な役割が果たされている。
薬理実験の結果によると、ステップダウン実験と受動的回避実験において、投与グループの動物の記憶獲得におけるエラー反応潜伏期間が長くなり、エラー回数、エラー反応率が低下し、その差は対照グループと比較して顕著である。よって、フコキサンチンが記憶を改善する機能を有することが証明されている。フコキサンチンはヘルスケア製品として、健康の促進や疾患の予防において、脳の発育及び記憶力の増進などのような重要な役割が果たされている。
実施例3 材料と方法
1.1 材料 昆明産の白い雄マウス、生後6〜8週齢、体重18〜22g。
1.2 投与量とグループ分け
表16の調剤に従う。対照グループを設ける。
1.3 動物実験室の配置 動物実験室はSPFレベルで、室温22±2℃、湿度60%〜80%である。
1.4 計器 ステップダウン計器、受動的回避計器
1.5 方法は実施例2と同様
1.6 データ処理 得られたデータの処理方法は実施例2と同様
1.1 材料 昆明産の白い雄マウス、生後6〜8週齢、体重18〜22g。
1.2 投与量とグループ分け
表16の調剤に従う。対照グループを設ける。
1.3 動物実験室の配置 動物実験室はSPFレベルで、室温22±2℃、湿度60%〜80%である。
1.4 計器 ステップダウン計器、受動的回避計器
1.5 方法は実施例2と同様
1.6 データ処理 得られたデータの処理方法は実施例2と同様
2 結果
2.1 ステップダウン実験 下表から分かるように、マウスに表16に示された調剤を30日経口投与した投与グループは、記憶獲得(訓練)の過程において、平均エラー回数が対照グループより少なく、さらにその差が顕著である。重複して実験した結果、投与グループの、ステップから飛び下りる潜伏期間が対照グループより長く、平均エラー回数が対照グループより少なく、エラー反応率が対照グループより低く、さらにその差が顕著(p<0.05)である。
2.1 ステップダウン実験 下表から分かるように、マウスに表16に示された調剤を30日経口投与した投与グループは、記憶獲得(訓練)の過程において、平均エラー回数が対照グループより少なく、さらにその差が顕著である。重複して実験した結果、投与グループの、ステップから飛び下りる潜伏期間が対照グループより長く、平均エラー回数が対照グループより少なく、エラー反応率が対照グループより低く、さらにその差が顕著(p<0.05)である。
3.2 受動的回避実験 下表から分かるように、マウスに表16に示された調剤を30日経口投与した薬物投与グループは、平均潜伏期間が対照グループより長く、平均エラー回数が対照グループより少なく、さらにその差が顕著(p<0.05)である。
4 考察
薬理実験の結果によると、ステップダウン実験及び受動的回避実験において、薬物投与グループの動物の記憶獲得におけるエラー潜伏期間が長く、エラー回数、エラー反応率が低くなり、その差は対照グループと比較して顕著である。フコキサンチンの調剤は記憶を改善する機能を有し、薬品とヘルスケア製品として、脳の発育及び記憶力を含む健康の促進や疾患の予防において重要な役割が果たされている。
薬理実験の結果によると、ステップダウン実験及び受動的回避実験において、薬物投与グループの動物の記憶獲得におけるエラー潜伏期間が長く、エラー回数、エラー反応率が低くなり、その差は対照グループと比較して顕著である。フコキサンチンの調剤は記憶を改善する機能を有し、薬品とヘルスケア製品として、脳の発育及び記憶力を含む健康の促進や疾患の予防において重要な役割が果たされている。
実施例4 フコキサンチン抽出物(フコキサンチン含有量95%)により製造されたハードカブセル(表8)
言うまでもなく、本発明の本質を説明するために、本発明の特許請求の範囲に記載された原則及び範囲を逸脱しない限り、当業者であれば、ここで説明した詳細情報、材料及び調剤に対して、様々変更することができる。
Claims (26)
- 神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品におけるフコキサンチンの用途であって、
前記製品は、食品、ヘルスケア製品、及び薬品を含む。 - 前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティントン舞踏病を含むことを特徴とする請求項1に記載のフコキサンチンの用途。
- 前記製品は、さらに記憶力改善の役割を含むことを特徴とする請求項2に記載のフコキサンチンの用途。
- 前記フコキサンチンの出所は、植物源、微生物源、または合成した化合物源を含むことを特徴とする請求項1に記載のフコキサンチンの用途。
- 前記フコキサンチンの植物源は、海藻であり、ケルプ、サルガッソー、ヒバマタ、牛繁縷、フクロノリ、ツルモ、ワカメ、大型藻類、カラギーナン、コバタワラ(S. kjellmanianum Yendo)、ヒジキ、海蒿子及び珪藻からなる群から選ばれることを特徴とする請求項4に記載のフコキサンチンの用途。
- 前記フコキサンチンの前記製品における含有量は、0.0001%〜60%であることを特徴とする請求項1に記載のフコキサンチンの用途。
- 前記フコキサンチンの前記製品における含有量は、0.0001%〜10%であることを特徴とする請求項1に記載のフコキサンチンの用途。
- 前記フコキサンチンの前記フコキサンチン抽出物における含有量は、90%〜100%であることを特徴とする請求項1に記載のフコキサンチンの用途。
- 前記フコキサンチンの前記フコキサンチン抽出物における含有量は、95%〜100%であることを特徴とする請求項1に記載のフコキサンチンの用途。
- 実験対象に1日に投与するフコキサンチンの有効成分は0.001mg〜20mgであることを特徴とする請求項1〜3に記載のフコキサンチンの用途。
- 実験対象に1日に投与するフコキサンチンの有効成分は0.001mg〜10mgであることを特徴とする請求項1〜3に記載のフコキサンチンの用途。
- 前記製品は、神経変性疾患を予防する、または治療するだけの有効用量のフコキサンチンを含むことを特徴とする請求項1に記載のフコキサンチンの用途。
- 神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品であって、
前記製品は、フコキサンチンを含有する。 - 前記製品は、食品、ヘルスケア製品、及び薬品を含むことを特徴とする請求項13に記載の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品。
- 前記フコキサンチンの出所は、植物源、微生物源、または合成した化合物源を含むことを特徴とする請求項13に記載の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品。
- 前記フコキサンチンの前記製品における含有量は、0.0001%〜60%であることを特徴とする請求項13に記載の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品。
- 前記フコキサンチンの前記製品における含有量は、0.0001%〜10%であることを特徴とする請求項13に記載の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品。
- 前記フコキサンチンの前記フコキサンチン抽出物における含有量は、90%〜100%であることを特徴とする請求項13に記載の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品。
- 前記フコキサンチンの前記フコキサンチン抽出物における含有量は、95%〜100%であることを特徴とする請求項13に記載の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品。
- 前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティントン舞踏病を含むことを特徴とする請求項13に記載の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品。
- 前記フコキサンチンを含有する製品は、さらに天然抽出物を含むことを特徴とする請求項13に記載の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品。
- 前記天然抽出物は、イチョウ抽出物、ドコサヘキサエン酸(DHA)、リン脂質セリン、レシチン、魚油、Omega-3、共役リノール酸からなる群から選択されるものであることを特徴とする請求項17に記載の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品。
- 前記フコキサンチンの植物源は、海藻であり、ケルプ、サルガッソー、ヒバマタ、牛繁縷、フクロノリ、ツルモ、ワカメ、大型藻類、カラギーナン、コバタワラ(S. kjellmanianum Yendo)、ヒジキ、海蒿子及び珪藻からなる群から選ばれることを特徴とする請求項13に記載の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品。
- 実験対象に1日に投与するフコキサンチンの有効服用量は、0.001mg〜20mgであることを特徴とする請求項13〜15に記載の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品。
- 実験対象に1日に投与するフコキサンチンの有効服用量は、0.001mg〜10mgであることを特徴とする請求項13〜15に記載の神経変性疾患に関する神経保護作用を有する製品。
- 請求項13に記載の製品の記憶力改善における用途。
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