DE69535337T2

DE69535337T2 - Transkriptionsfaktor e2f-5

Info

Publication number: DE69535337T2
Application number: DE69535337T
Authority: DE
Inventors: Nicholas Barrie Laboratory Of Eukary La Thangue; Rene Division of Molecular Carcinoge BERNARDS; Eleonore Marielle Division of Molecu HIJMANS
Original assignee: Topotarget UK Ltd
Current assignee: Topotarget UK Ltd
Priority date: 1995-02-14
Filing date: 1995-04-18
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2015-04-19
Also published as: AU701913B2; JPH11500903A; US6448376B1; DE69535337D1; EP0809695B1; ATE348154T1; WO1996025494A1; DK0809695T3; ES2279512T3; PT809695E; EP0809695A1; CA2211975A1; AU2221595A; JP2006340730A; GB9502873D0

Description

Diese Erfindung betrifft einen neuen Transkriptionsfaktor und dessen Produktion und Verwendung.
Die molekularen Vorkommnisse, die während des Zellzyklus auftreten, müssen in die Transkriptionsvorrichtung integriert werden, so dass die Genexpression mit dem Fortschreiten des Zellzyklus synchronisiert werden kann.
Vor kurzem wurde ein Transkriptionsfaktor mit dem Namen E2F (oder DRTF1) identifiziert, und es wurde gezeigt, dass dieser an pRb, das Proteinprodukt des Retinoblastom-Anfälligkeitsgens, ein Anti-Onkogen oder Tumorsuppressor-Gen (siehe z.B. Wagner und Green, Nature 352, 189-190 (1991)) bindet. Es herrscht die weit verbreitete Annahme, dass der zelluläre Transkriptionsfaktor E2F als Schlüsselkomponente in der Steuerung des Zellzyklus fungiert, da er mit wichtigen zellzyklusregulierenden Proteinen assoziiert, wie z.B. dem Retinoblastom-Genprodukt (pRb), p107, Cyclinen und cyclinabhängigen Kinasen, weiters wird seine Transkriptionsaktivität durch gewisse virale Onkoproteine, wie z.B. das Adenovirus Ela, das große SV40-T-Antigen und das E7-Protein des menschlichen Papillomvirus, moduliert.
Es wird davon ausgegangen, dass der Transkriptionsfaktor E2F (oder DRTF1) eine wichtige Rolle in der Integration der Vorkommnisse des Zellzyklus in die Transkriptionsvorrichtung spielt, da er während des Fortschreitens des Zellzyklus bei Säugetierzellen einer Reihe periodischer Wechselwirkungen mit Molekülen eingeht, von denen bekannt ist, dass sie wichtige Regulatoren der zellulären Proliferation sind. Das Retinoblastom-Tumorsuppressor-Genprodukt (pRb) etwa, das das Fortschreiten von G1 in die S-Phase negativ reguliert und in Tumorzellen häufig modifiziert ist, bindet an E2F. Auf ähnliche Art und Weise tritt das pRb-verwandte Protein p107 vorherrschend in einem S-Phasen-Komplex mit E2F auf. Sowohl pRb als auch p107 unterdrücken die Transkriptionsaktivität von E2F, das mit großer Wahrscheinlichkeit von fundamentaler Bedeutung für die Regulation der zellulären Proliferation ist, da E2F-Bindungsstellen in den Kontrollregionen einer Reihe von Genen auftreten, die in die Proliferation involviert sind, wie z.B. c-myc und p34^cdc2. Weiters gelingt es mutierten Rb-Proteinen, für die Allele kodieren, die aus Tumorzellen isoliert wurden, nicht, an E2F zu binden, weshalb sie nicht in der Lage sind, die ortsabhängige E2F-Transkriptionsaktivierung zu stören. Ein weiteres wichtiges Merkmal von E2F ist, dass gewisse virale Onkoproteine, wie z.B. das Adenovirus Ela, das große SV40-T-Antigen und das menschliche Papillomvirus E7, seine Aktivität durch Abtrennen von pRb und p107 von dem inaktiven Transkriptionsfaktor modulieren. Diese Wirkung erfordert Regionen in diesen viralen Proteinen, die für die Transformation von Gewebekulturzellen und daher für die Überwindung der Wachstumssteuerung notwendig sind. Daher kann die Fähigkeit dieser Onkoproteine, E2F zu regulieren, jenes Mittel sein, mit dem sie die normalen Mechanismen der zellulären Wachstumssteuerung umgehen, und umgekehrt kann die Transkriptionsunterdrückung durch pRb die Basis der pRb-vermittelten negativen Wachstumssteuerung sein.
Ein potentieller Mechanismus für die Integration der transkriptionsregulierenden Eigenschaften von pRb und p107 mit anderen Zellzyklusvorkommnissen wurde durch die Identifizierung von Cyclin A und der cdc2-verwandten cyclinabhängigen Kinase p33^cdk2 im E2F-Komplex angedeutet. Cyclin A ist für das Durchlaufen der S-Phase notwendig, eine Funktion, die vielleicht durch ihre Fähigkeit, die cyclinabhängige Kinase p33^cdk2 zu E2F zu rekrutieren, vermittelt werden könnte. Zusammen deuten diese Daten darauf hin, dass E2F ein Transkriptionsfaktor ist, dessen Hauptrolle es sein könnte, Zellzyklusvorkommnisse über Moleküle, wie z.B. ein pRb, p107, Cycline und cdks, auf die Transkriptionsvorrichtung zu übertragen und dadurch eine synchronisierte und in den fortscheitenden Zellzyklus integrierte Genexpression sicherzustellen.
Vor kurzem wurde ein Transkriptionsfaktor mit den Eigenschaften von E2F kloniert und sequenziert (Helin et al., Cell 70, 337-350 (1992) und Kaelin et al., Cell 70, 351-364 (1992)).
Nun haben die Erfinder überraschenderweise zwei weitere neue Proteine entdeckt, die neue Mitglieder der E2F-Genfamilie zu sein scheinen, die sie E2F-5 genannt haben. Die cDNA-Sequenz von menschlichem E2F-5 ist in 1A dargestellt, wie auch die Aminosäuresequenz dieses Proteins. Die entsprechenden Sequenzen für muri nen E2F-5 sind in 9A dargestellt. Diese neuen Proteine werden als E2F-5 bezeichnet, und diese Nomenklatur wird innerhalb dieser Beschreibung gebraucht.
Es wurde herausgefunden, dass E2F-5 zu einer Familie von verwandten Transkriptionsfaktorkomponenten gehört. Von den Mitgliedern dieser Familie wird angenommen, dass sie mit DP-Proteinen wechselwirken, um eine Reihe von Transkriptionsfaktoren zu bilden. DP-Proteine (oder Polypeptide) umfassen DP-1, DP-2 und DP-3, obwohl das Erstere normalerweise den anderen vorgezogen wird.
Die Erfindung stellt in einem ersten Aspekt ein in 1A oder 9A dargestelltes Protein, Homologe davon und Fragmente der Sequenz und Homologe davon bereit, die als Säugetier-Transkriptionsfaktor fungieren können. Insbesondere stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit (vorzugsweise in im Wesentlichen isolierter Form), das Folgendes umfasst:

(a) das Protein aus 1A oder 9A;
(b) ein Protein mit zumindest 90 % Aminosäureidentität mit (a), das als Säugetier-Transkriptionsfaktor fungieren kann;
(c) ein Fragment des Proteins aus 1A oder 9A aus zumindest 30 Aminosäuren, die in der Lage sind, einen Komplex mit einem DP-Protein, p107 und/oder p130, zu bilden.

Alle Polypeptide innerhalb dieser Definition werden unten stehend als Polypeptide) gemäß der Erfindung bezeichnet.
Die Proteine pRb, p107, DP-Proteine und p130 werden hierin als komplexierende Proteine oder „Komplexoren" bezeichnet, da sie einen Komplex mit den Proteinen der Erfindung bilden können. Unter bestimmten Bedingungen kann E2F-5 nur schwach an pRb binden.
Ein Polypeptid der Erfindung liegt in im Wesentlichen isolierter Form vor, falls es in einer Form vorkommt, die frei von anderen Polypeptiden ist, mit denen es in seinem natürlichen Umfeld (z.B. dem Körper) assoziiert sein kann. Es wird davon ausgegan gen, dass das Polypeptid mit Trägern oder Verdünnungsmitteln vermischt sein kann, die den beabsichtigten Zweck des Polypeptids nicht stören, und es trotzdem als im Wesentlichen isoliert angesehen werden kann.
Das Polypeptid der Erfindung kann auch in im Wesentlichen gereinigter Form vorkommen, wobei es in diesem Fall im Allgemeinen das Polypeptid in einem Präparat umfasst, in dem mehr als 90 %, z.B. 95 %, 98 % oder 99 %, des Polypeptids in dem Präparat ein Polypeptid der Erfindung sind.
Mutierte Polypeptide besitzen eine oder mehrere Mutationen, die Additionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäureresten sind. Vorzugsweise beeinflussen die Mutationen die Struktur und/oder die Funktion und/oder die Eigenschaften des Polypeptids nicht oder im Wesentlichen nicht. Daher besitzen die Mutanten geeigneterweise die Fähigkeit, mit DP-Proteinen, pRb, p107 und/oder p130 zu komplexieren. Mutanten können entweder natürlich vorkommen (d.h. aus natürlicher Quelle gereinigt oder isoliert sein) oder synthetisch anfallen (z.B. durch Durchführung von ortsspezifischer Mutagenese auf der kodierenden DNA). Es ist daher offensichtlich, dass Polypeptide der Erfindung entweder natürlich vorkommen oder rekombinant (d.h. unter Verwendung von gentechnischer Modifizierung hergestellt) sein können.
Eine allele Variante ist eine Variante, die in einem Menschen oder in einem, z.B. murinen, Tier natürlich vorkommt und die auf eine im Wesentlichen ähnliche Art und Weise wie das Protein in 1A oder 9A eine Regulation der Genexpression bewirkt.
In ähnlicher Weise ist ein Spezies-Homolog des Proteins das äquivalente Protein, das in anderen Spezies natürlich vorkommt und das die äquivalente Funktion in dieser Spezies ausführt wie das Protein aus 1A oder 9A. Innerhalb einer beliebigen Spezies kann ein Homolog in Form von mehreren allelen Varianten vorkommen, und diese werden alle als Homologe des Proteins angesehen. Allele Varianten und Spezies-Homologe können durch Befolgen der hierin beschriebenen Verfahren zur Produktion des Proteins aus 1A oder 9A und Durchführung solcher Verfahren mit einer geeigneten Zellquelle erhalten werden, z.B. aus einem Menschen oder einem Nagetier, die eine allele Variante oder eine andere Spezies in sich trägt. Da das Protein während der Evolution konserviert werden kann, ist die Verwendung eines Polynucleotids der Erfindung zur Sondierung von Bibliotheken möglich, die aus menschlichen, Nagetier- oder anderen Zellen bestehen, um Klone zu erhalten, die für die allelen oder Spezies-Varianten kodieren. Die Klone können durch herkömmliche Verfahren zur Identifikation eines Polypeptids der Erfindung manipuliert werden, das anschließend mittels an sich bekannter Rekombinations- oder Syntheseverfahren produziert werden kann. Bevorzugte Spezies-Homologe umfassen Säugetier- oder Amphibien-Spezies-Homologe.
Ein Protein, das zumindest 70 % homolog zu jenem in 1A oder 9A ist, ist von der Erfindung umfasst, sowie auch Proteine, die zumindest 80 % oder 90 % und noch bevorzugter zumindest 95 % Homologie zu dem in diesen Figuren gezeigten Protein aufweisen. Dies umfasst im Allgemeinen eine Region aus zumindest 20, vorzugsweise zumindest 30, z.B. zumindest 40, 60 oder 100 oder mehr, zusammenhängenden Aminosäuren. Verfahren zur Messung der Proteinhomologie sind nach dem Stand der Technik bekannt, und im vorliegenden Kontext ist einem Fachmann klar, dass Homologie normalerweise auf Basis der Aminösäureidentität berechnet wird (manchmal als „hard homology" bezeichnet).
Im Allgemeinen sind die Fragmente des Polypeptids in 1A oder 9A oder seiner allelen Varianten oder Spezies-Homologe, die in der Lage sind, einen Komplex mit den Komplexoren zu bilden, zumindest 10, vorzugsweise zumindest 15, z.B. zumindest 20, 25, 30, 40, 50 oder 60, Aminosäuren lang.
Es ist möglich, zu bestimmen, ob Fragmente einen Komplex mit dem Komplex von Proteinen bilden, indem sie das Komplexor-Protein und das Fragment unter Bedingungen vorlegen, unter denen sie normalerweise einen transaktivierenden Transkriptionsfaktor bilden, und bestimmen, ob sich ein Komplex gebildet hat oder nicht. Die Bestimmung kann beispielsweise durch Messen der Fähigkeit des Komplexes, in vitro eine E2F-Bindungsstelle zu binden, oder alternativ dazu durch Bestimmen des Molekulargewichts des mutmaßlichen Komplexes durch Verfahren, wie z.B. SDS-PAGE, durchgeführt werden.
Bevorzugte Fragmente umfassen jene, die in der Lage sind, einen Transaktivierungskomplex mit DP-1 oder anderen Komplexoren zu bilden. Die Beispiele hierin beschreiben eine Reihe von Verfahren zur Analyse der Funktion des Proteins, und diese können adaptiert werden, um zu untersuchen, ob ein Polypeptid in der Lage ist, einen Transaktivierungskomplex mit dem DP-1-Protein zu bilden oder nicht. Das Polypeptid kann dem Komplexor beispielsweise in Gegenwart eines Reportergenkonstrukts zugesetzt werden, das adaptiert wurde, um durch den DP-1/E2F-5-Komplex aktiviert zu werden (z.B. siehe 10 aus WO-A-94/10307 im Namen des Medical Research Council). Solch ein Experiment kann bestimmen, ob das Polypeptidfragment die notwendige Aktivität aufweist.
Ein Polypeptid der Erfindung kann mit einer "aufschlussreichen" oder detektierbaren Markierung markiert werden. Die (aufschlussreiche) Markierung kann eine beliebige Markierung sein, die eine Detektion des Polypeptids ermöglicht. Geeignete Markierungen umfassen Radioisotope, z.B. ¹²⁵I, Enzyme, Antikörper und Linker, wie z.B. Biotin. Markierte Polypeptide der Erfindung können in diagnostischen Verfahren, wie z.B. Immuntests, verwendet werden, um die Menge an E2F-5-Protein in einer Probe zu bestimmen.
Ein Polypeptid oder ein markiertes Polypeptid gemäß der Erfindung kann auch an eine feste Phase gebunden sein, z.B. an der Wand eines Immuntest-Gefäßes.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung bezieht sich auf ein Polynucleotid, das Folgendes umfasst:

(a) eine in 1A oder 9A gezeigte Nucleotidsequenz;
(b) eine zu (a) komplementäre Sequenz; oder
(c) eine für ein in Anspruch 1 definiertes Polypeptid kodierende Sequenz.

Weiters stellt die Erfindung ein Polynucleotid bereit, das aus einem Fragment mit einer Länge von zumindest 25 Nucleotiden der die in 1A oder 9A dargestellten Sequenz aufweisenden Polynucleotide besteht.
Polynucleotide der Erfindung umfassen eine DNA-Sequenz aus 1A oder 9A und Fragmente davon, die in der Lage sind, selektiv an die Sequenz aus 1A oder 9A zu hybridisieren. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt DNA bereit, die für das Protein aus 1A oder 9A oder ein Fragment davon kodiert.
Das Polynucleotid kann auch RNA umfassen. Es kann sich dabei auch um ein Polynucleotid handeln, das in sich synthetische oder modifizierte Nucleotide umfasst. Nach dem Stand der Technik sind eine Reihe verschiedener Modifikationstypen bei Oligonucleotiden bekannt. Diese umfassen Methylphosphonat- und Thiophosphat-Hauptketten, die Addition von Acridin- oder Polylysinketten am 3'- und/oder am 5'-Ende des Moleküls. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll davon ausgegangen werden, dass die hierin beschriebenen Oligonucleotide durch jedes beliebige, nach dem Stand der Technik verfügbare Verfahren modifiziert werden können. Solche Modifikationen können durchgeführt werden, um die In-vivo-Aktivität oder Lebensspanne von Oligonucleötiden der Erfindung zu verlängern, die in Therapieverfahren verwendet werden.
Ein Polynucleotid, das in der Lage ist, selektiv an die DNA aus 1A oder 9A zu hybridisieren, weist im Allgemeinen über eine Region aus zumindest 20, vorzugsweise zumindest 30, z.B. zumindest 40, 60 oder 100 oder mehr, zusammenhängenden Nucleotiden zumindest 70 %, vorzugsweise zumindest 80 oder 90 % und im Optimalfall zumindest 95 %, Homologie mit der DNA aus 1A oder 9A auf. Diese Polynucleotide liegen im Rahmen der Erfindung.
Ein Polynucleotid der Erfindung liegt üblicherweise in im Wesentlichen isolierter Form vor, wenn es in einer Form vorkommt, die frei von anderen Polynucleotiden ist, mit denen es in seinem natürlichen Umfeld (normalerweise dem Körper) assoziiert sein kann. Es wird davon ausgegangen, dass das Polynucleotid mit Trägern oder Verdün nungsmitteln, die den beabsichtigten Zweck des Polynucleotids nicht stören, vermischt sein und trotzdem als im Wesentlichen isoliert angesehen werden kann.
Ein Polynucleotid gemäß der Erfindung kann verwendet werden, um einen Primer herzustellen, wie z.B. einen PCR-Primer, eine Sonde, die z.B. auf herkömmliche Weise unter Verwendung radioaktiver oder nichtradioaktiver Markierungen mit einer aufschlussreichen oder detektierbaren Markierung markiert wird, oder das Polynucleotid kann in einen Vektor kloniert werden. Solche Primer, Sonden und andere Fragmente der DNA aus 1A oder 9A sind zumindest 15, vorzugsweise zumindest 20, z.B. zumindest 25, 30 oder 40, Nucleotide lang und liegen ebenfalls im Schutzumfang der Erfindung.
Polynucleotide, wie z.B. DNA-Polynucleotide, der Erfindung können rekombinant, synthetisch oder durch ein beliebiges Verfahren hergestellt werden, das dem Fachmann nach dem Stand der Technik zur Verfügung steht. Mit Verweis auf die hierin offenbarten Verfahren können sie auch kloniert werden.
Die Erfindung umfasst ein doppelsträngiges Polynucleotid, das ein Polynucleotid gemäß der Erfindung und dessen Komplement umfasst.
Ein dritter Aspekt der Erfindung betrifft einen (z.B. Expressions-) Vektor, der für die Replikation und Expression eines Polynucleotids, insbesondere eines DNA- oder RNA-Polynucleotids, gemäß der Erfindung geeignet ist. Die Vektoren können z.B. Plasmid-, Virus- oder Phagen-Vektoren sein, die einen Replikationsstartpunkt, gegebenenfalls einen Promotor für die Expression des Polynucletotids sowie gegebenenfalls einen Regulator des Promotors aufweisen. Der Vektor kann ein oder mehrere selektierbare Markergene enthalten, z.B. ein Ampicillin-Resistenz-Gen im Fall eines bakteriellen Plasmids oder ein Neomycin-Resistenz-Gen für einen Säugetier-Vektor. Der Vektor kann in vitro verwendet werden, z.B. für die Herstellung von RNA, oder er kann verwendet werden, um eine Wirtszelle zu transfizieren oder zu transformieren. Der Vektor kann auch für die Verwendung in vivo adaptiert werden, z.B. in einem Gentherapie-Verfahren.
Vektoren des dritten Aspekts sind vorzugsweise rekombinant replizierbare Vektoren. Der Vektor kann daher verwendet werden, um die DNA zu replizieren. Die DNA im Vektor ist vorzugsweise operabel an eine Kontrollsequenz gebunden, die in der Lage ist, für die Expression der kodierenden Sequenz durch eine Wirtszelle zu sorgen. Der Begriff „operabel gebunden" bezieht sich auf eine benachbarte Lage, in der sich die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung befinden, die es ihnen erlaubt, auf ihre beabsichtigte Art und Weise zu funktionieren. Eine „operabel" an eine kodierende Sequenz gebundene Kontrollsequenz wird auf solch eine Art und Weise ligiert, dass die Expression der kodierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind. Solche Vektoren können ein eine geeignete Wirtszelle transformiert oder transfiziert werden, um für die Expression eines Polypeptids der Erfindung zu sorgen.
Ein vierter Aspekt der Erfindung bezieht sich daher auf Wirtszellen, die mit den Vektoren des dritten Aspekts transformiert oder transfiziert wurden. Dies kann die Replikation und Expression eines Polynucleotids gemäß der Erfindung ermöglichen, unter anderem der Sequenz aus 1A oder 9A oder des offenen Leserasters davon. Die Zellen werden so ausgewählt, dass sie mit dem Vektor kompatibel sind, und können z.B. bakterielle, Hefe-, Insekten- oder Säugetier-Zellen sein.
Ein Polynucleotid gemäß der Erfindung kann auch in Antisense-Ausrichtung in die oben beschriebenen Vektoren insertiert werden, um die Produktion von Antisense-RNA zu ermöglichen. Antisense-RNA oder andere Antisense-Polynucleotide können auch mittels synthetischer Verfahren hergestellt werden. Solche Antisense-Polynucleotide können in einem Verfahren zur Steuerung der Mengen des E2F-5-Proteins in einer Zelle verwendet werden. Solch ein Verfahren kann das Einführen des Antisense-Polynucleotids in eine Zelle in einer Menge umfassen, die wirksam ist, um das Ausmaß der Translation von E2F-5-mRNA zu Protein zu inhibieren oder zu reduzieren. Die Zelle kann eine Zelle sein, die sich auf unkontrollierte Art und Weise vermehrt, wie z.B. eine Tumorzelle.
Daher stellt die Erfindung in einem fünften Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß der Erfindung bereit, umfassend das Züchten einer mit einem (Expressions-) Vektor des dritten Aspekts transformierten oder transfizierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Expression (durch den Vektor) einer kodierenden Sequenz führen, die für das Polypeptid kodiert, sowie die Gewinnung des exprimierten Polypeptids.
Es werden auch (monoklonale oder polyklonale) Antikörper beschrieben, die für ein Polypeptid gemäß der Erfindung spezifisch sind. Antikörper der Erfindung umfassen Fragmente davon sowie Mutanten, die die Bindungsaktivität des Antikörpers beibehalten. Es wird auch ein Verfahren für die Produktion monoklonaler oder polyklonaler Antikörper für ein Polypeptid der Erfindung beschrieben. Monoklonale Antikörper können mittels herkömmlicher Hybridomverfahren unter Verwendung der Proteine oder Peptidfragmente davon als Immunogen hergestellt werden. Polyklonale Antikörper können auch mittels herkömmlicher Verfahren hergestellt werden, die das Impfen eines Wirtstieres, z.B. einer Ratte oder eines Kaninchens, mit einem Polypeptid der Erfindung und das Gewinnen des Immunserums umfassen.
Fragmente monoklonaler Antikörper, die ihre Antigenbindungsaktivität beibehalten können, wie z.B. Fv-, F(ab')- und F(ab₂)'-Fragmente, sind in diesem Aspekt der Erfindung inkludiert. Zusätzlich können monoklonale Antikörper gemäß der Erfindung analysiert werden (z.B. durch eine DNA-Sequenzanalyse der Gene, die diese Antikörper exprimieren) und es können humanisierte Antikörper mit komplementaritätsbestimmenden Regionen eines Antikörpers gemäß der Erfindung hergestellt werden, z.B. in Einklang mit den in EP-A-0.239.400 (Winter) offenbarten Verfahren.
Polypeptide der Erfindung können in Zusammensetzungen zusammen mit einem Träger oder Verdünnungsmittel vorliegen. Diese Zusammensetzungen umfassen pharmazeutische Zusammensetzungen, in denen der Träger oder das Verdünnungsmittel pharmazeutisch annehmbar ist.
Pharmazeutisch annehmbare Träger oder Verdünnungsmittel umfassen jene, die in zur oralen, rektalen, nasalen, lokalen (unter anderem buccalen und sublingualen), vaginalen oder parenteralen (unter anderem subkutanen, intramuskulären, intravenösen, intradermalen, intrathekalen und epiduralen) Verabreichung geeigneten Formulierungen verwendet werden. Die Formulierungen können geeigneterweise in Form von Dosiereinheiten vorliegen und können durch ein beliebiges, nach dem Stand der Technik der Pharmazie wohlbekanntes Verfahren hergestellt werden. Solche Verfahren umfassen den Schritt des Assoziierens des Wirkstoffs mit dem Träger, der ein oder mehrere Hilfsstoffe) darstellt. Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch einheitliches und enges Assoziieren des Wirkstoffs mit flüssigen Trägern oder fein verteilten festen Trägern oder beiden und, falls notwendig, durch darauf folgendes Formen des Produkts hergestellt.
Formulierungen, die z.B. zur parenteralen Verabreichung geeignet sind, umfassen wässrige und nicht wässrige, sterile Injektionslösungen, die Antioxidanzien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung isotonisch mit dem Blut des beabsichtigten Rezipienten machen; ebenso wässrige und nicht wässrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel und Verdickungsmittel enthalten können, sowie Liposomen oder andere Mikropartikelsysteme, die darauf ausgerichtet sind, das Polypeptid auf Blutkomponenten oder auf ein oder mehrere Organe abzielen zu lassen.
Polypeptide gemäß der Erfindung und die oben genannten Zusammensetzungen können für die Behandlung, Regulierung oder Diagnose von Erkrankungen verwendet werden, unter anderem für proliferative Erkrankungen bei einem Säugetier, unter anderem beim Menschen. Solche Krankheiten umfassen jene, die mit abnormaler (z.B. in einem ungewöhnlich hohen oder niedrigen Ausmaß) und/oder abweichender (z.B. aufgrund einer Mutation in der Gensequenz) Expression eines oder mehrerer Transkriptionsfaktoren, wie z.B. DP- oder E2F-Proteine oder verwandte Familienmitglieder, assoziiert sind. Die Bedingungen umfassen auch jene, die durch abnormale Expression eines Gens herbeigeführt werden, dessen Genprodukt durch das Protein aus 1A oder 9A reguliert wird. Die Behandlung oder Regulierung der Bedingun gen mit den oben genannten Peptiden, Antikörpern, Fragmenten davon und Zusammensetzungen etc. umfasst normalerweise das Verabreichen einer wirksamen Menge eines Polypeptids, Antikörpers, Fragments davon oder einer Zusammensetzung, je nach Eignung, an einen Rezipienten, der eine solche Behandlung benötigt.
Es werden auch Antikörper und Fragmente davon beschrieben, die auf diese Region abzielen, um die Aktivierung des Transkriptionsfaktors über die Störung der Bildung des E2F-5DP-Proteinkomplexes zu inhibieren.
Es wird auch ein Verfahren zur Durchführung eines Immuntests zum Nachweis der Gegenwart oder der Abwesenheit eines Polypeptids der Erfindung in einer Probe beschrieben, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

(a) die Bereitstellung eines Antikörpers gemäß der Erfindung;
(b) das Inkubieren der Probe mit dem Antikörper unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes ermöglichen; und
(c) die Detektion des Antikörper-Antigen-Komplexes, falls vorhanden.

In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung einen neuen Test zur Identifikation von mutmaßlichen chemotherapeutischen Mitteln zur Behandlung proliferativer oder viraler Erkrankungen bereit, der das Kontaktieren eines DP-Proteins oder eines Derivats davon, eines Polypeptids der Erfindung und eines mutmaßlichen chemotherapeutischen Mittels, sowie das Messen des Inhibierungsgrads der Bildung des DP/E2F-5-Proteinkomplexes, der durch das Mittel bewirkt wird, umfassen. Es muss nicht notwendig sein, das vollständige DP-1- und/oder E2F-5-Protein in dem Test zu verwenden, solange eine ausreichende Menge jedes Proteins bereitgestellt wird, so dass sie unter den Bedingungen des Tests in Abwesenheit des Mittels ein Heterodimer bilden.
Das Klonieren und Sequenzieren von DP-1 (und E2F-1, -2 und -3) sind nach dem Stand der Technik bekannt, und Verfahren zur rekombinanten Expression und Herstellung von Antikörpern gegen DP-1 sind in WO 94/10307 zu finden.
Die Erfindung stellt daher ein Screeningverfahren zur Identifikation von mutmaßlichen chemotherapeutischen Mitteln zur Behandlung proliferativer Erkrankungen bereit, das Folgendes umfasst:

(A) das Kontaktieren von: (i) einem DP-Polypeptid; (ii) einem Polypeptid des ersten Aspekts; und (iii) einem mutmaßlichen chemotherapeutischen Mittels; und zwar unter Bedingungen, in denen die Komponenten (i) und (ii) in Abwesenheit von (iii) einen Komplex bilden; und
(B) das Messen des Ausmaßes, in dem Komponente (iii) in der Lage ist, diesen Komplex zu zerstören.

In diesem Test können eine oder mehrere der drei Komponente(n) markiert sein, unter anderem mit einer radioaktiven oder einer kolorimetrischen Markierung, um das Messen des Resultats des Tests zu ermöglichen. Mutmaßliche chemotherapeutische Mittel umfassen auch Peptide der Erfindung.
Varianten, Homologe und Fragmente von DP-Proteinen sind entsprechend den Varianten, Homologen und Fragmenten des E2F-5-Proteins definiert.
Der Komplex von (i) und (ii) kann z.B. durch seine Fähigkeit, in vitro eine E2F-DNA-Bindungsstelle zu binden, gemessen werden. Alternativ dazu kann der Test ein Invivo-Test sein, in dem die Fähigkeit des Komplexes, einen Promotor zu aktivieren, der eine E2F-Bindungsstelle umfasst, die an ein Reportergen gebunden ist, gemessen wird. Der In-vivo-Test kann z.B. durch Verweis auf die Beispiele durchgeführt werden, die einen solchen Test bei Hefe-, Insekten-, Amphibien- oder Säugetierzellen zeigen.
Potenzielle therapeutische Mittel, die in dem Test gemessen werden können, umfassen nicht nur Polypeptide des ersten Aspekts, sondern insbesondere Fragmente aus 10 oder mehr Aminosäuren von:

(a) dem Protein aus 1A oder 9A;
(b) einer Allelvariante oder eines Spezies-Homologs davon; oder
(c) einem Protein, das zumindest 70 % Homologie zu (a) aufweist.

Es können Vektoren in einem Verfahren der Gentherapie verwendet werden, die ein Polypeptid gemäß der Erfindung oder eine Nucleinsäure, die für ein Polypeptid gemäß der Erfindung kodiert, in sich tragen. Solch eine Gentherapie kann eingesetzt werden, um unkontrollierte Proliferation von Zellen, z.B. einer Tumorzelle, zu behandeln. Verfahren der Gentherapie umfassen das Versorgen einer Zelle eines Patienten, der eine Behandlung benötigt, mit einer wirksamen Menge des Vektors, der in der Lage ist, in der Zelle entweder ein Antisense-Polynucleotid der Erfindung zu exprimieren, um die Translation von E2F-5-mRNA in E2F-5-Protein zu inhibieren oder zu reduzieren, oder mit einem Polypeptid, das die Bindung von E2F-5 an ein DP-Protein oder ein verwandtes Familienmitglied stört.
Der Vektor ist geeigneterweise ein viraler Vektor. Der virale Vektor kann ein beliebiger Vektor sein, der nach dem Stand der Technik verfügbar ist, um auf Tumorzellen abzuzielen. Huber et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8039 (1991)) berichten beispielsweise über die Verwendung amphotropher Retroviren für die Transformation von Hepatom-, Brust-, Kolon- oder Hautzellen. Culver et al. (Science 256, 1550-1552 (1992)) beschreiben auch die Verwendung retroviraler Vektoren in der virusgesteuerten Enzym-Prodrug-Therapie, wie dies auch Ram et al. (Cancer Research 53, 83-88 (1993)) tun. Englehardt et al. (Nature Genetics 4, 27-34 (1993)) beschreiben die Verwendung von adenovirusbasierten Vektoren zur Anlieferung des Mukoviszidose-Transmembran-Leitfähigkeitsprodukts (CFTR) an Zellen.
Die Erfindung zieht eine Reihe von Tests in Betracht. Im Großen und Ganzen können diese wie folgt klassifiziert werden.

1. Die Durchführung eines Tests, um einen Inhibitor der E2F-5-Trans-Aktivierung zu finden (d.h. die Inhibierung der Aktivierung der Transkription). Dieser Inhibitor kann daher die Bindung von E2F-5 an DNA (normalerweise an die E2F-Bindungsstelle) inhibieren. Potentiell geeignete Inhibitoren sind Proteine und können eine ähnliche oder dieselbe Wirkung wie p107 aufweisen. Daher können geeignete inhibitorische Moleküle Fragmente, Mutanten, Allelvarianten oder Spezies-Homologe von p107 auf dieselbe Art und Weise umfassen, wie sie für Proteine des ersten Aspekts definiert wurden.
2. Das Testen auf Inhibitoren von (Hetero-)Dimerisierung. Solche Inhibitoren können die Dimerisierung von E2F-5 (oder eines Polypeptids des ersten Aspekts) mit einem Komplexor, z.B. einem DP-Protein, wie etwa DP-1, verhindern. Natürlich kann der Inhibitor auf eine ähnliche Art und Weise, wie für die Proteine des ersten Aspekts definiert wurde, ein Fragment, Mutant, eine Allelvariante oder ein Spezies-Homolog eines DP-Proteins sein.
3. Eine dritte Kategorie eines Tests besteht im Aufspüren von Inhibitoren von Phosphorylierung. Es wird davon ausgegangen, dass E2F-5 (und andere Proteine des ersten Aspekts) durch Phosphorylierung aktiviert werden könnten. Daher besteht die Wahrscheinlichkeit, dass ein Inhibitor von Phosphorylierung die E2F-5-Trans-Aktivierungseigenschaften inhibiert (und könnte daher schlussendlich dieselbe Wirkung wie die Inhibitoren aufweisen, die in beiden der zwei vorigen Tests zu finden sind). Phosphorylierung erfolgt durch cdks, und daher ist ein Inhibitor dieser Phosphorylierung einer, der bei solchen Tests in Betracht gezogen wird.

Die Erfindung zieht eine Reihe von therapeutischen Verwendungsmöglichkeiten in Betracht. Zu diesen zählt unter anderem die Gentherapie unter Verwendung einer Nucleinsäure, einer Sequenz, die in Antisense-Ausrichtung zu E2F-5 vorliegt. Moleküle, die an ein DP-1-Protein binden können und daher einen inaktiven Komplex mit dem DP-Protein bilden, werden zusätzlich in Betracht gezogen. Geeignete Moleküle umfassen jene des ersten Aspekts, außer E2F-5 selbst. Diese Moleküle können Mutanten von E2F-5 sein und werden daher nach dem Stand der Technik oftmals als dominante negative Moleküle bezeichnet.
Die Erfindung zieht die Behandlung oder Prophylaxe von Erkrankungen in Betracht, die auf der unkontrollierten Proliferation von Zellen beruhen, oder in Fällen, in denen die unkontrollierte Proliferation ein wichtiger oder essentieller pathologischer Aspekt der Erkrankung ist. Dies umfasst Krebs, virale Erkrankungen, die Selbstproliferation selbst sowie Autoimmunerkrankungen, wie z.B. Psoriasis. Es kann auch die temporäre Inhibierung des Wachstums von sich teilenden Zellen gewünscht werden, z.B. von hämatopoetischen Stammzellen und/oder Knochenmarkszellen. In diesen Aspekten wird im Allgemeinen versucht, die Aktivität von E2F-5 zu behindern, zu inhibieren oder zu stören.
Im Gegensatz dazu können einige Erkrankungen und Leiden durch eine erhöhte E2F-5-Expression behandelt werden, z.B. durch die Förderung oder Herbeiführung einer Überexpression. Dies führt vorzugsweise zu einer Apoptose, manchmal auch als programmierter Zelltod bekannt. Eine Überexpression des E2F-5-Proteins kann zum Tod der Zelle führen und daher kann dieser Aspekt auch in der Behandlung von Krebs verwendet werden. Ein Ziel ist es daher, die Aktivität von E2F-5 zu steigern. Ähnliche Verwendungsweisen sind für E2F-1 bekannt (Qin et al., PNAS USA 91 (in Druck)).
Es sollte in Betracht gezogen werden, dass das E2F-5-Gen in Tumorzellen mutiert sein könnte. In diesem Fall könnte das mutierte Gen zur Diagnose einer Erkrankung verwendet werden, die von der Mutation herrührt. Es bietet sich auch für eine Behandlung über das mutierte Gen an.
Die folgenden zwei Beispiele beschreiben die Isolierung und Charakterisierung des neuen Proteins und der DNA der Erfindung aus menschlicher bzw. muriner Quelle. Es liegen jedoch auch andere, z.B. Säugetier-Quellen, im Umfang der vorliegenden Erfindung, und andere Säugetier-Homologe des Proteins können auf analoge Art und Weise isoliert werden. Die Beispiele werden hier zur Veranschaulichung dargestellt und sind nicht als Einschränkung der Erfindung anzusehen.
BEISPIEL 1
Zusammenfassung
E2F-DNA-Bindungsstellen sind in einer Reihe von Genen zu finden, deren Expresssion während des Zellzyklus strikt reguliert ist. Die Aktivität der E2F-Transkriptionsfaktoren wird durch die Assoziation mit spezifischen Repressor-Molekülen reguliert, die die E2F-Transaktivierungsdomäne binden und inhibieren können. Für E2F-1, -2 und -3 ist der Repressor das Produkt des Retinoblastom-Gens, pRb. E2F-4 wechselwirkt mit dem pRb-verwandten p107 und nicht mit pRb selbst. Vor kurzem wurde eine cDNA isoliert, die für ein drittes Mitglied der Retinoblastom-Genfamilie, p130, kodiert. p130 wechselwirkt auch mit der Bindungsaktivität der E2F-DNA, hauptsächlich in der G₀-Phase des Zellzyklus. Die Erfinder berichten hier über die Klonierung eines fünften Mitglieds der E2F-Genfamilie. Die menschliche E2F-5-cDNA kodiert für ein 346-Aminosäure-Protein mit einer prognostizierten Molekularmasse von 38 kDa. E2F-5 ist enger mit E2F-4 verwandt (78 % Ähnlichkeit) als mit E2F-1 (57 % Ähnlichkeit). E2F-5 ähnelt den anderen E2Fs darin, dass es auf kooperative Art und Weise mit DP-1 an eine Konsensus-E2F-Stelle bindet. Unter Verwendung eines spezifischen E2F-5-Antiserums zeigen die Erfinder, dass E2F-5 unter physiologischen Bedingungen vorzugsweise mit p130 wechselwirkt.
Einleitung
E2F ist die Bezeichnung einer Gruppe von heterodimeren Transkriptionsfaktoren, die aus einer E2F-ähnlichen und einer DP-ähnlichen Untereinheit bestehen [27]. E2F-DNA-Bindungsstellen sind in den Promotoren einer Reihe von Genen vorhanden, deren Expression währen des Zellzyklus reguliert wird, und es gibt Beweise, die darauf hindeuten, dass die Gegenwart dieser E2F-Stellen zu der zellzyklusregulierten Expression dieser Gene beiträgt [13, 28, 38].
E2F-DNA-Bindungsaktivität wurde in Komplexen mit dem Retinoblastom-Protein (pRb) und pRb-verwandtem p107 und p130 gefunden [6, 10, 29, 37]. Diese Gruppe von Proteinen teilt ein konserviertes Motiv, die „Pocket", die sowohl in die Bindung von zellulären als auch von viralen Proteinen involviert ist. Aus diesem Grund ist die Gruppe von pRb-ähnlichen Proteinen zusammen als die Pocket-Proteinfamilie bekannt. Komplexe zwischen E2F und den verschiedenen Pocket-Proteinen besitzen wahrscheinlich verschiedene Funktionen in der Zellzyklus-Regulierung, da sich ihr Aussehen während des Zellzyklus voneinander unterscheidet. E2F in einem Komplex mit pRb wird hauptsächlich in der G₁-Phase des Zellzyklus angetroffen [5-7, 11]. Im Gegensatz dazu bestehen Komplexe zwischen p107 und E2F während des Zellzyklus weiter, ihre Zusammensetzung ist jedoch variabel. In G₁ sind, abgesehen von E2F und p107, Cyclin E und cdk2 vorhanden. In der S-Phase wird Cyclin E durch Cyclin A im E2F/p107-Komplex ersetzt [29, 37]. Die funktionelle Bedeutung der Gegenwart dieser Cyclin/cdk-Komplexe im p107/E2F-Komplex ist im Moment noch nicht klar. In ruhenden Zellen ist ein Komplex zwischen E2F und p130 die prominenteste E2F-DNA-Bindungsart. Dieser Komplex verschwindet mit dem Hervortreten der Zellen aus dem Ruhezustand, was auf eine Rolle für die p130-wechselwirkende E2F-Aktivität beim Eintritt in den Zellzyklus hindeutet [10].
Die Fähigkeit von E2F, die Transkription zu aktivieren, wird durch die Komplexbildung mit den Pocket-Proteinen reguliert. Die Komplexbildung zwischen E2F und pRb ist der Regulierung durch die Phosphorylierung unterworfen. Nur die hypophosphorylierten Spezies von pRb wechselwirken mit E2F, was darauf hindeutet, dass die Phosphorylierung von pRb durch Cyclin/cdk-Komplexe die Wechselwirkung zwischen E2F und pRb während des Zellzyklus steuert [5-7, 11].
Die entscheidende Rolle von E2F-Transkriptionsfaktoren in der Zellzyklusregulierung wird durch die Entdeckung betont, dass eine verstärkte Expression der E2F-DNA-Bindungsaktivität eine Weiterentwicklung der Zellen von G₁ in die S- und die G₂/M-Phasen des Zellzyklus [3] bewirkt, und E2F kann ruhende Zellen stimulieren, die DNA-Synthese zu initiieren [23]. Es ist wichtig, anzumerken, dass Überexpression von E2F zusammen mit einem aktivierten ras-Onkogen eine onkogene Transformation von primären Nagetier-Fibroblasten herbeiführen kann [3].
Bis jetzt wurden vier verschiedene E2F-ähnliche Polypeptide isoliert. E2F-1, -2 und -3 werden nur in einem Komplex mit pRb gefunden, wohingegen E2F-4 vorzugsweise mit p107 wechselwirkt [3, 15, 19, 22, 24, 30, 36]. Wie die Komplexbildung zwischen E2F und p107 und E2F und p130 reguliert wird, ist im Moment noch unbekannt. Zu Beginn der Forschungen zum Thema der Regulierung des E2F/p107-Komplexes und des E2F/p130-Komplexes haben die Erfinder nach zusätzlichen Mitgliedern der E2F-Genfamilie gesucht. Die Erfinder berichten hier über die Klonierung eines fünften Mitglieds der E2F-Genfamilie, das vorzugsweise mit p130 wechselwirkt.
Materialien und Verfahren
Hefe-Doppelhybrid-Screening
Der Hefestamm Y190 [17], enthaltend das „Köder"-Plasmid pPC97-p107, wurde unter Verwendung des Lithiumacetat-Verfahrens [34] mit einer Tag-14,5-CD1-Mausembryo-Bibliothek [8] transformiert. Es wurden zwei Millionen Transformaten für das Wachstum auf Platten ausgewählt, denen Histidin fehlte, und es wurde mit 25 mM 3-Aminotriazol ergänzt und schließlich, wie zuvor beschrieben, auf β-Galactosidase-Aktivität analysiert [12]. Die Bibliotheksplasmide von cDNAs, die von doppelt positiven Hefekolonien abstammten, wurden durch erneute Transformation mit verschiedenen Gal4-DBD-Fusionsplasmiden auf ihre Zielspezifität getestet: pPC97-p107 pPC97-bmi und pPC97 ohne Insert. Die partielle Maus-E2F-5-cDNA wurde verwendet, um zusätzliche menschliche cDNA-Bibliotheken zu screenen. Die hier beschriebene menschliche E2F-5-cDNA voller Länge wurde aus der T84-Kolonkarzinom-Bibliothek isoliert (Stratagene).
Plasmide
pPC97-p107 wurde durch Klonieren der Pocket-Region von p107 (Aminosäuren 240-816) im Rahmen mit der Gal4-DNA-Bindungsdomäne (Aminosäuren 1-147) von pPC97 [8] erzeugt. pGST-E2F-5 (A) und (B) wurden durch Klonieren eines Fragments menschlicher E2F-5-cDNA konstruiert, das für die Aminosäuren 89-200 (A) oder die Aminosäuren 89-346 (B) in pGEX-2T kodiert. Für Transfektionsexperimente wurden die folgenden Plasmide verwendet: pSG-Gal4-E2F-1 enthält die Aminosäuren 284-437 von menschlichem E2F-1 [19]. pJ3-Gal4-E2F-4 und pJ3-Gal4-E2F-5 wurden im Rahmen mit der DNA-Bindungsdomäne von Gal4 in pJ3Ω [33] durch Klonieren eines Fragments der menschlichen cDNA von E2F-4 (für die Aminosäuren 276-412 kodierend) oder E2F-5 (für die Aminosäuren 222-346 kodierend) erhalten. pJ3-E2F-5 wurde durch Klonieren der menschlichen E2F-5-cDNA voller Länge (der die letzten 184 Nucleotide der nichtkodierenden 3'-Sequenz fehlten) in den Säugetier-Expressionsvektor pJ3Ω konstruiert. Dem Translationsstartcodon von E2F-5 ging das 10-Aminosäure-Epitop (HA) voraus, das vom monoklonalen Antikörper 12CA5 erkannt wird.
pCMV-DP-1, pCMV-pRb, pCMV-p107, pCMV-p107DE, PCMV-pRbΔ22 wurden bereits früher beschrieben [20, 41].
Zelllinien
U2-OS- und CAMA-Zellen wurden in Dulbeccos Modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % bzw. 20 % fötalem Kälberserum, kultiviert.
Transfektionen wurden unter Verwendung des Calciumphosphat-Präzipitationsverfahrens durchgeführt [39],
CAT-Tests
U2-OS-Zellen wurden mit den angegebenen Expressionsvektoren zusammen mit 5 μg (Gal4)₅-CAT [25] oder 2 μg E2F₄-CAT [20], 0,2 μg RSV-Luciferase und Heringspermien-Träger-DNA bis zu einer Gesamtmenge von 20 μg/10-cm-Platte vorübergehend transfiziert. Die Zellen wurden, wie zuvor beschrieben, auf CAT- und Luciferase-Aktivität getestet [2, 3].
Northern-Blot-Analyse
Für die E2F-5-Expressionsanalyse wurde zytoplasmatische Gesamt-RNA aus einer Gruppe von Zelllinien hergestellt. 20 mg der zellulären Gesamt-RNA wurden auf 1-%-Formaldehyd-Agarose-Gel, wie beschrieben, Elektrophorese unterzogen, auf Nitrozellulose transferiert und mit [³²P]-markierter, partieller menschlicher E2F-5-cDNA (nt. 666-1038) sondiert. Anschließend wurde derselbe Filter mit einer Ratten-α-Tubulin-cDNA sondiert, um die Menge an RNA zu kontrollieren, die in jede Spur geladen wurde.
Immunologische Reagenzien und Immunpräzipitationen
Um Antikörper gegen E2F-5 zu erzeugen, wurden GST-E2F-5-(A)- und -(B)-Proteine (siehe Plasmide) in E. coli hergestellt und unter Verwendung von Gluthation-Sepharoseperlen gereinigt. Beide Proteine wurden in gleichen Mengen einem Kaninchen injiziert. Nach drei Immunisierungsrunden wurde polyklonales Serum erhalten.
Monoklonale Antikörper gegen E2F-1 (KH20), E2F-4 (RK13), pRb (XZ77) und p107 (SD-4 und -9) wurden bereits früher beschrieben [3, 20, 21, 41]. Das polyklonale p130-(C20-)Kaninchen-Antiserum wurde von Santa Cruz Biotechnology Inc. erhalten. CAMA-Zellen und transfizierte U2-OS-Zellen wurden, wie zuvor beschrieben, markiert und Immunpräzipitation unterzogen [3].
Gel-Refentionstests
Gel-Retentionstests für vorübergehend transfizierte U-2-OS-Zellen wurden, wie zuvor beschrieben [20], mit geringen Modifikationen durchgeführt. 10 μg des Gesamt-Zellextrakts wurden in Bindungspuffer verwendet, der 20 mM HEPES (pH 7,4), 0,1 M KCl, 1 mM MgCl₂, 0,1 mM EDTA, 7 % Glycerin, 1 mM NaF und 1 μg beschallte Lachsspermien-DNA in 20 μl Reaktionsvolumen mit 0,5 ng [³²P]-markiertem Oligonucleotid enthielt, das die Konsensus-E2F-DNA-Bindungsstelle spezifiziert (Santa Cruz Biotechnology). Während einer Inkubation von 20 Minuten bei RT wurde die Bindung von DNA-Proteinkomplexen ermöglicht. Die Reaktionsprodukte wurden auf 3,5-%-Polyacrylamidgel in 0,25 × TBE bei 90 V bei RT für eine Zeitspanne von 2,5 Stunden aufgetrennt. Das Gel wurde anschließend getrocknet und damit Film belichtet.
Ergebnisse
Isolierung von p107-bindenden Proteinen
Um cDNAs zu identifizieren, die für Polypeptide kodieren, die mit p107 Wechselwirken, wurde ein Hefe-Doppel-Hybrid-Screening durchgeführt [14]. Der Hefe-Stamm Y190 [17], der zwei chromosomal angeordnete Gal4-induzierbare Reportergene, HIS3 und LacZ [12], enthielt, wurde mit dem „Köder"-Plasmid co-transformiert, das die Pocket-Region (Aminosäuren 240-816) von p107 enthielt, fusioniert an die DNA-Bindungsdomäne (DBD) von Gal4 und eine Tag-14,5-CD1-Mausembryo-cDNA-Bibliothek, in der jede cDNA individuell an die Transaktivierungsdomäne von Gal4 fusioniert ist [8]. Es wurde eine Gesamtanzahl von 2 Millionen Transformanten auf Platten, denen Histidin fehlte, selektiert. Siebenundachtzig überlebende Kolonien wurden auf Expression von β-Galactosidase gescreent. cDNA-hältige Plasmide wurden aus sechzehn doppelt positiven Hefekolonien gerettet. Die Spezifität der p107-Bindung wurde durch erneute Transformation mit Plasmiden, die für andere Gal4-BDB-Fusionen kodierten, bestätigt. Von allen sechzehn Hybridproteinen wurde herausgefunden, dass sie spezifisch mit Gal4-p107 wechselwirkten. DNA-Sequenzanalyse zeigte, dass die sechzehn cDNA-Bibliotheksplasmide, die aus den Hefekolonien gerettet wurden, von 10 verschiedenen Genen stammten. Drei cDNAs stammten von demselben Gen und zeigten signifikante Homologie zu den vier bekannten E2Fs. Deshalb nannten die Erfinder das von dieser cDNA kodierte Protein E2F-5.
Die partielle Maus-E2F-5-cDNA wurde anschließend verwendet, um durch Screening einer menschlichen Kolon-Karzinom-cDNA-Bibliothek einen menschlichen cDNA-Klon voller Länge zu erhalten. Die längste cDNA (2,1 kb) wurde sequenziert und ent hielt einen 1038-bp-offenen-Leseraster, der für ein 346-Aminosäure-Protein mit einem prognostizierten Molekulargewicht von 38 kDa kodierte. 1A zeigte die E2F-5-cDNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz.
E2F-5 ist enger mit E2F-4 (78 % Ähnlichkeit) verwandt als mit E2F-1 (57 % Ähnlichkeit). Im Vergleich mit E2F-1 und E2F-4 können drei Regionen mit Homologie in E2F-5 beobachtet werden (1 B). Die DNA-Bindungsdomäne (Aminosäuren 43-115 von E2F-5) weisen eine Ähnlichkeit von 93 % mit der E2F-4-DNA-Bindungsregion auf, wohingegen die danebenliegende DP-1-Dimerisierungsdomäne eine Ähnlichkeit von 81 % zwischen E2F-4 und E2F-5 aufweist. Schließlich besitzt die carboxylterminale Pocketprotein-Wechselwirkungsdomäne von E2F-4 und -5 eine Ähnlichkeit von 83 %. E2F-4 und E2F-5 unterscheiden sich von E2F-1 dahingehend, dass beiden Proteinen das aminoterminale Motiv von E2F-1 fehlt, das in die Cyclin-A-Bindung involviert ist. E2F-5 unterscheidet sich von E2F-4 dahingehend, dass ihm die Serin-Repeat-Region von E2F-4 fehlt.
Um die mRNA-Expressionsmengen von E2F-5 zu analysieren, wurde menschliche E2F-5-cDNA verwendet, um einen Northern Blot zu sondieren, der die zytoplasmatische Gesamt-RNA aus einer Reihe menschlicher Zelllinien enthielt. Die E2F-5-Sonde detektierte geringe Mengen eines einzigen 2,1-kb-Transkripts in den meisten Zelllinien. Die menschliche CAMA-Brustkarzinom-Zelllinie exprimierte etwas größere Mengen an E2F-5 (2).
E2F-5 enthält eine carboxylterminale Transaktivierungsdomäne
E2F-1 und E2F-4 enthalten eine carboxylterminale Transaktivierungsdomäne, die mit der Pocketprotein-Bindungsstelle [3, 18] überlappt. Um zu testen, ob E2F-5 auch eine Transaktivierungsdomäne enthält, fusionierten die Erfinder den Carboxylterminus des menschlichen E2F-5 an die DNA-Bindungsdomäne von Gal4 im Säugetierexpressionsvektor pJ3Ω. U2-OS-Osteosarkom-Zellen wurden vorübergehend mit einem CAT-Reportergen transfiziert, das fünf stromauf gelegene Gal4-Stellen in sich trug, oder mit dem Reportergen und den Gal4-E2F-Expressionsvektoren co-transfi ziert. 3 zeigt, dass die Co-Transfektion des Gal4-Reporterplasmids mit den Gal4-E2F-5-Expressionsvektoren zu 50facher Aktivierung des CAT-Reportergens führte. Die Co-Transfektion mit Gal4-E2F-1 oder Gal4-E2F-4 führte zu einer zwei- bis dreifach stärkeren Aktivierung des CAT-Reportergens (3). Die Erfinder schließen daraus, dass E2F-5 eine starke carboxylterminale Transaktivierungsdomäne enthält.
E2F-5 erfordert DP-1 für DNA-Bindung
Sowohl E2F-1 als auch E2F-4 erfordern eine Dimerisierung mit DP-1 zur effizienten DNA-Bindung [1, 3, 20, 26]. Um zu untersuchen, ob E2F-5 an eine Konsensus-E2F-DNA-Bindungsstelle binden kann und ob E2F-5 eine DP-1-Dimerisierung erfordert, um DNA zu binden, führten die Erfinder ein vorübergehendes Transfektionsexperiment durch. Menschliche U2-OS-Osteosarkom-Zellen wurden mit einem CAT-Reporterplasmid transfiziert, in dem ein Core-Promotor an vier stromauf gelegene E2F-Stellen gebunden war. 4 zeigt, dass das E2F-CAT-Reporter-Plasmid nur sehr geringe Aktivität besitzt, wenn es alleine in die Osteosarkomzellen transfiziert wird. Die separate Transfektion von DP-1- oder E2F-5-Expressionsvektoren führte nicht zur Aktivierung des E2F-CAT-Reporters (4, Balken 2 und 6). Die Co-Transfektion von DP-1- und E2F-5-Expressionsvekforen führte zu einer starken, dosisabhängigen synergistischen Aktivierung des CAT-Reporters (4, Balken 3-5). Diese Daten deuten darauf hin, dass E2F-5 die Konsensus-E2F-Stelle binden kann und dass. die DNA-Bindung von DP-1 abhängig ist. Basierend auf diesen Resultaten kann man schließen, dass E2F-5 ein echtes Mitglied der E2F-Genfamilie ist.
E2F-5-Transaktivierung wird durch Pocket-Proteine unterdrückt
Die Transaktivierung von E2F-1 und E2F-4 wird durch die Pocketprotein-Bindung unterdrückt, da die Transaktivierungsdomäne dieser E2Fs mit der Pocketprotein-Wechselwirkungsoberfläche überlappt. Um die Wirkung der Pocketprotein-Expression auf die E2F-5-Transaktivierung zu testen, verwendeten die Erfinder einen vorübergehenden Transfektionstest. Da sowohl E2F-1 als auch E2F-4 eine DP-1-Dimerisierung zur effizienten Bindung ihrer jeweiligen Pocketproteine [3, 20] erfordern, maßen die Erfin der die Wirkung der Pocketprotein-Expression auf E2F-5 plus DP-1-aktivierte Transkription. U2-OS-Zellen wurden mit dem E2F-CAT-Reporterplasmid zusammen mit E2F-5 und DP-1 transfiziert. 5 (Balken 3) zeigte, dass die Co-Transfektion von E2F-5 und DP-1 zu einer mehr als 100fachen Aktivierung des E2F-CAT-Reportergens führte. Die E2F-5-stimulierte Transkription wurde durch die Co-Transfektion mit pRb-, p107- und p130-Expressionsvektoren auf dosisabhängige Art und Weise inhibiert. Mutanten von pRb (pRbΔ22) und p107 (p107DE), denen eine intakte Pocket-Domäne fehlte, waren nicht der Lage, die E2F-5-Transaktivierung zu unterdrücken (5, Balken 6 und 9). Signifikanterweise fehlt diesen Mutantenformen von pRb und p107 auch die wachstumsinhibierende Wirkung [41]. Daher ermöglichte dieses Experiment keine unzweideutige Identifikation des bevorzugten Bindungspartners von E2F-5, es deutete darauf hin, dass die E2F-5-Transaktivierung durch die Pocketprotein-Bindung inhibiert wird und, dass es eine enge Korrelation zwischen der Fähigkeit von pRb und p107, einen Wachstumsstillstand herbeizuführen und ihrer Fähigkeit, die E2F-5-Transaktivierung zu inhibieren, gibt. Es ist wichtig zu betonen, dass die U2-OS-Zellen, die in diesem Experiment verwendet werden, gegenüber pRb- oder p107-induziertem Wachstumsstillstand unempfindlich sind [41]. Die beobachteten Auswirkungen auf die E2F-5-Transaktivierung sind daher wahrscheinlich nicht auf die nichtspezifischen Zellzyklus-Auswirkungen von pRb oder p107 zurückzuführen.
E2F-5 wechselwirkt in einem Band-Shift-Test vorzugsweise mit p130
Um die Spezifität der Pocket-Proteinbindung durch E2F-5 weiter zu untersuchen, führten die Erfinder einen Elektrophorese-Mobilitäts-Shift-Test (EMSA) durch. U2-OS-Zellen wurden vorübergehend mit DP-1- und E2F-5-Expressionsvektoren mit oder ohne pRb-, p107- oder p130-Expressionsvektoren transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden Gesamt-Zellextrakte aus transfizierten Zellen präpariert und mit einem [³²P]-markierten Oligonucleotid inkubiert, das eine Konsensus-E2F-Stelle spezifiziert. DNA-Proteinkomplexe wurden auf einem Polyacrylamidgel getrennt und mittels Radiographie sichtbar gemacht. 6 zeigt, dass die Transfektion von E2F-5- und DP-1-Expressionsvektoren zum Auftreten eines neuen Komplexes führt, der in den scheintransfizierten Zellen nicht beobachtet wurde (6, vergleiche Spuren 1 und 2). Bei diesem Komplex konnte mittels Co-Transfektion des p130-Expressionsvektors, jedoch nicht der p107- oder pRb-Expressionsvektoren, ein Supershift erzeugt werden (6, Spuren 3-5). Diese Daten deuten darauf hin, dass von den drei getesteten Pocketproteinen p130 die höchste Affinität für das E2F-5/DP-1-Heterodimer aufweist.
E2F-5 wechselwirkt in vivo bevorzugt mit p130
Unter physiologischen Bedingungen bindet E2F-1 vorzugsweise an pRb und E2F-4 an p107 [3, 15, 19, 24]. In vorübergehenden Transfektionsexperimenten kann jedoch sowohl die E2F-1- als auch die E2F-4-aktivierte Genexpression sowohl durch pRb als auch durch p107 unterdrückt werden [3, 40]. Dieser Verlust der Spezifität wird wahrscheinlich durch die vorübergehende Überexpression dieser Proteine hervorgerufen. Um herauszufinden, welches der drei Mitglieder der Retinoblastom-Proteinfamilie mit E2F-5 unter physiologischen Bedingungen wechselwirkt, erzeugten die Erfinder ein polyklonales Kaninchen-Antiserum gegen das menschliche E2F-5. Anfängliche Immunpräzipitationsexperimente unter Verwendung von in vitro transkribiertem und translatiertem E2F-1, E2F-4 und E2F-5 deuteten darauf hin, dass das polyklonale E2F-5-Serum E2F-5 spezifisch erkannte (Daten nicht dargestellt). Das E2F-5-Antiserum wurde anschließend in einem sequenziellen Immunpräzipitationsexperiment verwendet. CAMA-Brustkarzinom-Zellen wurden metabolisch mit [³²P]-Orthophosphat markiert, und es wurden nicht ionische Detergenslysate hergestellt. Diese Lysate wurden einer Immunpräzipitation mit pRb-spezifischem Antikörper, p107-Antikörper oder p130-spezifischem Antiserum unterzogen. Proteine, die mit pRb, p107 oder p130 co-immungefällt wurden, wurden durch Kochen in SDS-hältigem Puffer freigesetzt, verdünnt und erneut mit E2F-5-spezifischem Antiserum immungefällt. 6 Abschnitt B zeigt, dass ein Protein von 47 kDa erneut spezifisch mit E2F-5-Antiserum aus dem p130-Immunpräzipitat immungefällt werden konnte, jedoch nicht aus den pRb- oder p107-Immunpräzipitaten. Dieses 47-kDa-Protein comigriert auf SDS-Polyacrylamidgelen mit vorübergehend transfiziertem E2F-5 (Daten nicht dargestellt). Als Kontrolle verifizierten die Erfinder, ob pRb- und p107-Immun präzipitate ihre jeweiligen E2Fs enthielten. 6 Abschnitt C zeigte, dass pRb tatsächlich zu einer Coimmunpräzipitation von E2F-1 führte und dass p107 E2F-4 senkte. Zusammen genommen deuten diese Daten darauf hin, dass E2F-5 vorzugsweise mit p130 in vivo wechselwirkt.
Diskussion
Die Erfinder berichten hier über die Isolierung eines fünften Mitglieds der E2F-Genfamilie. E2F-5 besitzt alle Charakteristika eines echten E2F-Familienmitglieds: Er enthält eine hochgradig konservierte DNA-Bindungsdomäne, eine DP-1-Dimerisierungsdomäne und eine carboxylterminale Transaktivierungsdomäne. Weiters bindet E2F-5 eine Konsensus-E2F-DNA-Bindungsstelle in Kooperation mit DP-1 und kann die Expression eines E2F-Stellen-hältigen Reportergens aktivieren.
Die Erfinder führten daher drei Arten von Experimenten durch, um herauszufinden, mit welchem der drei Pocket-Proteine E2F-5 in vivo bevorzugt wechselwirkt. Bei vorübergehenden Transfektionsexperimenten konnte die E2F-5-Transaktivierung von allen drei Mitgliedern der Retinoblastom-Proteinfamilie, pRb, p107 und p130, unterdrückt werden. In dieser Hinsicht ähnelt E2-F-5 E2F-1 und E2F-4, da sowohl die E2F-1- als auch E2F-4-Transaktivierung in vorübergehenden Transfektionstests von pRb wie auch von p107 inhibiert werden kann [3, 40]. Dieses offensichtliche Fehlen von. Spezifität in einem vorübergehenden Transfektionstest ist wahrscheinlich das Resultat der hohen vorübergehenden Expressionsmengen von sowohl E2F als auch der Pocket-Proteine in den vorübergehend transfizierten Zellen. Das relativ geringe Ausmaß der Inhibierung der E2F-5-Transaktivierung durch p130 in dem vorübergehenden Transfektionsexperiment (5) ist das Resultat des niedrigen Ausmaßes der p130-Expression, da herausgefunden wurde, dass in den vorübergehend transfizierten Zellen p107 in einem 10fach höheren Ausmaß exprimiert wurde als im Vergleich mit p130 (Daten nicht dargestellt). Es wurden zwei zusätzliche Experimente durchgeführt, um die Pocket-Protein-Spezifität von E2F-5 zu untersuchen. Im ersten Experiment wurden Zellen vorübergehend mit E2F-5- und DP-1-Expressionsvektoren in Gegenwart oder Abwesenheit von Expressionsvektoren für alle drei Pocket-Proteine transfiziert. Anschließend wurden Band-Shift-Tests unter Verwendung von Extrakten der transfizierten Zellen mit einem Oligonucleotid durchgeführt, das eine Konsensus-E2F-Bindungsstelle spezifiziert. Nur eine Co-Transfektion von p130 konnte einen Supershift des E2F-5/DP-1-Komplexes bewirken (6). Im Band-Shift-Experiment werden nur Komplexe zwischen Pocket-Proteinen und E2F-5 als E2F/Pocket-Protein-„Supershift"-Komplexe detektiert, die über längere Zeiträume stabil sind. Daher war der Komplex zwischen E2F-5 und p130 stabiler als der p107/E2F-5-Komplex, obwohl p130 in geringerem Ausmaß exprimiert wurde als p107 (6). In einem ähnlichen Experiment waren die Erfinder in der Lage, einen „Supershift" eines E2F-4-DNA-Bindungskomplexes mit p107 zu erzeugen, jedoch nicht mit pRb (R.L.B und R.B., unveröffentlichte Daten). Dieses Resultat deutet darauf hin, dass Mobilitäts-Shift-Experimente potentiell von Nutzen sein könnten, um die Pocket-Protein-Spezifität von E2Fs zu untersuchen. In Einklang mit den Resultaten der Mobilitäts-Shift-Tests fanden die Erfinder heraus, dass E2F-5 in den nicht transfizierten, metabolisch markierten CAMA-Brustkarzinom-Zellen mit p130 co-immungefällt werden konnte, jedoch nicht mit p107 oder pRb (7). Zusammengenommen deuten die Daten der Erfinder darauf hin, dass E2F-5 unter physiologischen Bedingungen vorzugsweise mit p130 assoziiert.
Die Erkenntnis, dass E2F-5 mit p130, jedoch nicht mit p107 wechselwirkte, kam etwas überraschend, da p130 und p107 strukturell eng verwandt sind, und tatsächlich haben p107 und p130 die Fähigkeit, die Cycline A und E zu binden, gemein [16, 32, 41]. Auf der anderen Seite unterscheiden sich p107 und p130 in ihrer Fähigkeit, in vivo mit Typ-D-Cyclinen wechselzuwirken, da nur p107 und nicht p130 mit Anti-Typ-D-Cyclin-Antikörpern co-immungefällt [32]. Wichtig ist, dass sich das Aussehen der p130/E2F- und p107/E2F-Komplexe im Zellzyklus unterscheidet [9, 10, 29, 35, 37]. Dies deutet darauf hin, dass p107 und p130 während des Zellzyklus unterschiedliche Funktionen haben. Die bevorzugte Bindung von E2F-5 durch p130 befindet sich in Einklang mit solch einer unterschiedlichen Rolle von p130 in der Zellzyklusregulation.
Die Erkenntnis der Erfinder, dass E2F-5 an eine Konsensus-E2F-Stelle binden kann, schließt auf keinen Fall die Möglichkeit einer Wechselwirkung von E2F-5 mit einem getrennten Subset an E2F-Stellen in vivo aus, das sich von den E2F-Stellen unterscheidet, die von den anderen Mitgliedern der E2F-Genfamilie gebunden werden. In Einklang mit solch einer Bindungsstellen-Vorliebe der verschiedenen E2Fs befindet sich die Erkenntnis, dass die E2F-Stellen, die im Thymidin-Kinase-Genpromotor und im b-myb-Promotor vorhanden sind, vorzugsweise mit E2F/p107-Komplexen Wechselwirken [28, 31]. Da solche Komplexe zwischen E2F und p130 meist in ruhenden Zellen zu finden sind und nach dem Erwachen der Zellen aus dem Ruhezustand schnell verschwinden, ist es wahrscheinlich, dass auf E2F-5 reagierende Gene in die frühen Reaktionen ruhender Zellen auf die Wachstumsfaktor-Stimulierung involviert sind [10]. Die Verfügbarkeit des mit p130 wechselwirkenden E2F-5 sollte es den Erfindern ermöglichen, E2F-5-reagierende Gene zu identifizieren.
Danksagung
Die Erfinder danken P. Chevray für den Erhalt der Mausembryo-cDNA-Bibliothek und der Hefe-Expressionsvektoren, S. Elledge für den Hefestamm Y1090, M. Alkema für den Gal4-bmi-Hefe-Expressionsvektor, G. Hannon für den Erhalt des p130-Expressionsvektors, A. Bes-Gennissen für den Erhalt der menschlichen Zelllinien-RNA und Y. Ramos für die Herstellung des Northern-Blots.
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) unterstützt.
Literaturzitate zu Beispiel 1

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BEISPIEL 2
Zusammenfassung
Der Transkriptionsfaktor DRTF1/E2F ist aufgrund seiner Wechselwirkung mit Schlüssel-Regulatoren der Weiterentwicklung des Zellzyklus, wie z.B. dem Retinoblastom-Tumorsuppressor-Genprodukt und verwandten Pocket-Proteinen, Cyclinen und cyclinabhängigen Kinasen, in die Steuerung der zellulären Proliferation verwickelt. Die DRTF1/E2F-DNA-Bindungsaktivität entsteht, wenn ein Mitglied zweier unterschiedlicher Proteinfamilien, DP und E2F, als DP/E2F-Heterodimer wechselwirkt. Hier berichten die Erfinder über die Isolierung und die Charakterisierung eines neuen Mitglieds der E2F-Proteinfamilie, genannt E2F-5. E2F-5 wurde durch einen Hefe-Doppel-Hybrid-Test isoliert, in dem eine 14,5-d.p.c-Mausembryo-Bibliothek auf Moleküle gescreent wurde, die in der Lage sind, an murines DP-1 zu binden, steht jedoch auch in Wechselwirkung mit allen bekannten Mitgliedern der DP-Proteinfamilie. E2F-5 liegt als physiologisches Heterodimer mit DP-1 in der allgemeinen DRTF1/E2F-DNA-Bindungsaktivität vor, die in Säugetier-Zellextrakten vorhanden ist, eine Wechselwirkung, die zu kooperativer DNA-Bindungsaktivität und Transkriptionsaktivierung durch die E2F-Stelle führt. Eine starke Transkriptionsaktivierungsdomäne, die sowohl in Hefe- als auch in Säugetierzellen funktioniert und in der C-Terminusregion von E2F-5 sitzt, sowie die Expression des pRb-verwandten Proteins p107, mehr als pRb, inaktiviert die Transkriptionsaktivität von E2F-5. Ein Vergleich der Sequenz von E2F-5 mit, anderen Mitgliedern der Familie deutet darauf hin, dass E2F-5 ein höheres Ausmaß an Ähnlichkeit zu E2F-4 aufweist als zu E2F-1, -2 und -3. Die strukturelle und funktionelle Ähnlichkeit von E2F-5 und E2F-4 definiert eine Unterfamilie von E2F-Proteinen.
Einleitung
Zahlreiche Beweise deuten darauf hin, dass der zelluläre Transkriptionsfaktor DRTF1/E2F in die Koordination der Transkription mit der Weiterentwicklung des Zellzyklus involviert ist. DRTF1/E2F scheint z.B. eines der Hauptziele zu sein, durch den das Retinoblastom-Tumorsuppressor-Genprodukt (pRb) seine negativen Wirkungen auf die zelluläre Proliferation ausübt (La Thangue (1994)). Daher ist pRb durch die Regulierung der Transkriptionsaktivität von DRTF1/E2F und daher der Aktivität der Zielgene, von denen viele für Proteine kodieren, die für die Weiterentwicklung des Zellzyklus erforderlich sind (Nevins (1992)), in der Lage, das Durchlaufen des frühen Zellzyklus zu beeinflussen. Natürliche Mutationen in Rb, die in menschlichen Tumorzellen auftreten, kodieren für Proteine, die nicht an DRTF1/E2F binden können (Bandara et al. (1992); Heibert et al. (1992); Zamanian und La Thangue (1992)), wodurch die Korrelation zwischen der Deregulierung von DRTF1/E2F und abnormalem Zellwachstum unterstrichen wird. Weiters korreliert die transformierende Aktivität viraler Onkoproteine, wie z.B. Adenovirus Ela, das menschliche Papillomavirus E7 und das große SV40-T-Antigen, mit ihrer Fähigkeit, DRTF1/E2F durch die Abtrennung von pRb und verwandten Proteinen (Nevins (1992)) zu deregulieren, was diesem Ansatz weitere Unterstützung gibt.
Andere Moleküle, die eine zentrale Rolle im Zellzyklus spielen, stehen auch in Wechselwirkung mit DRTF1/E2F. Die Cycline A und E, zusammen mit der katalytischen Untereinheit cdk2, binden an DRTF1/E2F entweder direkt durch Kontaktieren der DNA-Bindungskomponenten im Transkriptionsfaktor (Krek et al. (1994)) oder indirekt durch Kontakte, die in der Spacer-Region der pRb-verwandten Pocket-Proteine p107 oder p130 auftreten. (Lees of al. (1992); Cobrinik et al. (1993)). Obwohl die Rolle des Cyklin-cdk-Komplexes, der mit p107 und p130 assoziiert, noch aufgeklärt werden muss, wurde doch von der direkten Wechselwirkung zwischen dem Cyclin-A/cdk2-Kinase-Komplex und DRTF1/E2F gezeigt, dass sie dessen DNA-Bindungsaktivität beeinflusst (Krek et al. (1994)).
Die molekulare Zusammensetzung von DRTF1/E2F wird nun schrittweise enthüllt. Es ist nun klar, dass die allgemeine DNA-Bindungsaktivität von DRTF1/E2F entsteht, wenn Mitglieder zweier verschiedener Proteinfamilien als DP/E2F-Heterodimere wechselwirken (La Thangue (1994)), wobei die Prototyp-Moleküle jeder Familie DP-1 (Girling et al. (1993)) und E2F-1 sind (Helin et al. (1992); Kaelin et al. (1992); Shan et al. (1992)). Eine kleine Region mit Ähnlichkeit zwischen beiden Proteinen ermöglicht es ihnen, als Heterodimer wechselzuwirken (Bandara et al. (1993); Helin et al. (1993); Krek et al. (1993)), wobei diese Region in allen DP- und E2F-Familienmitglie dern, die bis heute isoliert wurden, konserviert blieb (Girling et al. (1994)), wodurch das Auftreten verschiedener kombinatorischer Wechselwirkungen ermöglicht wird.
Während des Durchlaufens des Zellzyklus tritt die Assoziation von pRb, p107 und p130 in einer temporal regulierten Art und Weise auf, wobei jedes Protein sein eigenes, charakteristisches Wechselwirkungsprofil mit DRTF1/E2F besitzt (Shirodkar et al. (1992); Schwarz et al. (1993), Cobrinik et al. (1993)). Von den bis jetzt isolierten E2F-Familienmitgliedern erkennen E2F-1, -2 und -3 pRb (Ivey-Hoyle et al. (1993); Lees et al. (1993)) und E2F-4 das p107-Protein (Beijersbergen et al. (1994); Ginsberg et al. (1994)), wobei eine wahrscheinliche Erklärung jene ist, dass die zeitlichen Wechselwirkungen von Pocket-Proteinen die regulierte Zusammensetzung und/oder die Verfügbarkeit des E2F-Familienmitglieds im E2F/DP-Heterodimer widerspiegeln.
Obwohl DP-1 in vielen Zelltypen eine häufig auftretende DNA-Bindungskomponente von DRTF1/E2F ist, vorhanden in den variierenden Formen, die während des fortschreitenden Zellzyklus auftreten (Bandara et al. (1994)), so werden andere DP-Familienmitglieder, wie z.B. DP-2, auf geweberestriktive Art und Weise exprimiert (Girling et al. (1994)). Eine Beeinflussung der molekularen Zusammensetzung von DRTF1/E2F durch den fortschreitenden Zellzyklus und durch den Phänotypen der Zelle erschien daher möglich.
Die Komplexität der E2F-Proteinfamilie muss erst noch ergründet werden. Um diese Frage zu untersuchen, führten die Erfinder ein hefebasiertes Doppel-Hybrid-Screening durch, um neue Mitglieder der Familie zu bestimmen. Hier berichten die Erfinder über die Isolierung und die Charakterisierung von murinem E2F-5, einem neuen Mitglied der E2F-Familie. E2F-5 steht in Wechselwirkung mit allen bekannten Mitgliedern der DP-Proteinfamilie. In Säugetierzellextrakten liegt E2F-5 als physiologisches Heterodimer mit DP-1 vor, eine Wechselwirkung, die zu kooperativer DNA-Bindung sowie zur Transkriptionsaktivierung durch die E2F-Stelle führt. E2F-5 besitzt eine starke Trans-Aktivierungsdomäne, die nach der Pocket-Protein-Bindung spezifisch inaktiviert wird. Die Proteinsequenz und die molekulare Organisation von E2F-5 ist enger mit E2F-4 verwandt als mit anderen Mitgliedern der Familie, wodurch erstmals eine Unterfamilie der E2F-Proteine definiert wird, die funktionell und strukturell verwandt sind.
Ergebnisse
Isolierung von E2F-5
Um die Diversität der E2F-Proteinfamilie zu erkunden, verwendeten die Erfinder ein Hefe-Doppel-Hybrid-basiertes Verfahren (Fields und Song (1989)), um neue Mitglieder zu identifizieren (8). Die Erfinder entschieden sich dazu, DP-1 als Köder zu verwenden, da DP-1 ein physiologischer und häufig anzutreffender Partner von E2F-Familienmitgliedern ist (Bandara et al. (1993); Bandara et al. (1994)). Eine mit einer Aktivierungsdomäne markierte cDNA-Bibliothek, hergestellt aus einem 14,5-d.p.c.-Mausembryo (Chevray und Nathans (1992)) wurde auf Hybridproteine gescreent, die in der Lage waren, mit LexA-DP-1 wechselzuwirken. Einer der identifizierten Klone kodierte für ein Hybridprotein, das mehreren Kriterien zufolge spezifisch mit LexA-DP-1 wechselwirkte. Eine partielle Analyse der cDNA-Sequenz deutete auf eine umfassende Ähnlichkeit mit E2F-Familienmitgliedern hin, daher wurde weiters ein für die vollständige Proteinsequenz kodierender cDNA-Klon aus einer F9-EC-cDNA-Bibliothek isoliert. Ein Vergleich der Proteinsequenz mit anderen Mitgliedern der E2F-Familie deutete darauf hin, dass der cDNA-Klon für ein neues Mitglied kodierte. Der für die zuvor isolierten E2F-Proteine gewählten Bezeichnung E2F-1, -2, -3 und -4 folgend, bezeichnen die Erfinder diesen Klon als E2F-5.
Die prognostizierte Größe von murinem E2F-5 beträgt 335 Reste (9a). Diese Prognose basiert auf der Position des ersten potentiell inhibierenden Methionins, zusammen mit der umfassenden Homologie, die zu der menschlichen E2F-5-Sequenz besteht, in der die Translation beim selben Methionin beginnt (Hijmans et al., eingereicht). E2F-5 enthält umfassende Sequenzähnlichkeit mit den zwischen anderen E2F-Familienmitgliedern konservierten Domänen (Ivey-Hoyle et al. (1993); Lees et al. (1993); Beijersbegen et al. (1994); Ginsberg et al. (1994)). Die DNA-Bindungsdomäne z.B. zeigt eine Identität von 48 % mit E2F-1 und 87 % mit E2F-4 (9b und c). Innerhalb dieses Bereichs enthält eine C-Terminus-Subdomäne die einzige Region mit Ähnlichkeit mit Mitgliedern der DP-Familie (in 9b und c). Diese Region, die als die DEF-Box bekannt ist (Girling et al. (1994); Lam und La Thangue (1994)), ist eng an der Bildung des DP/E2F-Heterodimers beteiligt (Bandara et al. (1993); Bandara und La Thangue, in Vorbereitung). Die in der DEF-Box zwischen den DP- und E2F-Proteinen konservierten Reste sind auch auch innerhalb von E2F-5 bestens konserviert (9c), was die potentielle Bedeutung dieser Subdomäne bei der Bildung des DP/E2F-Heterodimers unterstreicht.
Zwischen E2F-5 und den anderen Familienmitgliedern sind einige zusätzliche Regionen konserviert. Die markierte Box (Lees et al. (1993)) sowie die Pocket-Protein-Bindungsdomäne zeigen 58 % und 50 % Identität mit diesen Regionen in E2F-1 und 75 % und 72 % mit denselben Regionen in E2F-4 (9b und 9c). Die Positionen der hydrophoben Reste in der Leucin-Zipper-Region sind auch bei anderen E2F-Familienmitgliedern konserviert (9c). Tatsächlich kann E2F-5 einen längeren Zip als E2F-1, -2 und -3 bilden, da hydrophobe Reste in E2F-5 mit dem Heptad-Repeat an zwei weiteren C-terminalen Positionen übereinstimmend angeordnet sind (L144 und V151; siehe 9c).
Die Merkmale von E2F-5 deuten auf eine engere Beziehung mit E2F-4 anstatt mit E2F-5, -1, -2 und -3 hin. Seine Organisation ähnelt jener von E2F-4 insofern, als das Protein nicht viel weiter reicht als der N-Terminus der DNA-Bindungsdomäne, weiters fehlt beiden Proteinen die N-terminate Cyclin-A-Bindungsdomäne, die in den anderen E2Fs auftritt (9b). Der Proteinsequenz-Vergleich deutet weiters darauf hin, dass E2F-5 und -4 stärker miteinander verwandt sind als es jedes der beiden mit den verbleibenden Familienmitgliedern ist. Dies ist besonders über die konservierten Domänen hinweg offensichtlich, wo viele Reste zwischen E2F-5 und -4 häufig auftreten, jedoch nicht zwischen E2F-1-, -2 und -3 (9c). Im Großen und Ganzen enthält E2F-5 70 % Aminosäurereste, die mit E2F-4 identisch sind und 38 % mit E2F-1. Basierend auf dieser Ähnlichkeit stellen E2F-5 und -4 daher eine Unterfamilie der E2F-Proteinfamilie dar, während E2F-1, -2 und -3 aufgrund ihrer großen Ähnlichkeit eine andere repräsentieren.
Bindung und transkriptionelle Kooperation mit DP-Familienmitgliedern
Die allgemeine DRTF1/E2F-DNA-Bindungsaktivität entsteht, wenn ein DP-Familienmitglied mit einem E2F-Familienmitglied wechselwirkt (La Thangue (1994)). Für DP-1 und E2F-1 führt die Wechselwirkung zu einer kooperativen Transkriptionsaktivierung, DNA-Bindung und Wechselwirkung mit pRb (Bandara et al. (1993); Helin et al. (1993); Krek et al. (1993)). Die Erfinder waren daher daran interessiert, zu bestimmen, ob E2F-5 mit DP-Familienmitgliedern kooperieren konnte.
Um diese Fragen zu beantworten, verwendeten die Erfinder zuerst den Hefe-Doppel-Hybrid-Test mit unterschiedlichen DP-Molekülen, die im Hybrid-Köder als LexA-Fusionsproteine dargestellt waren (8). Entweder E2F-5 oder E2F-1 wurden als aktivierungsdomänen- (GAD-) markierte Hybridproteine exprimiert, und das Ausmaß der Transkriptionsaktivierung eines LexA-Reporterkonstrukts wurde durch Messen der β-Galactosidase-Aktivität untersucht. Sowohl E2F-5 als auch E2F-1 waren gleichermaßen in der Lage, mit allen bekannten Mitgliedern der DP-Proteinfamilie, d.h. DP-1, -2, -3 und Drosophila-DP, wechselzuwirken (Daten nicht dargestellt).
Die Erfinder untersuchten als nächstes, ob E2F-5 mit DP-1 kooperieren konnte, um die Transkription durch die E2F-Bindungsstelle zu aktivieren. Dafür verwendeten die Erfinder einen Hefe-Test, in dem E2F-5 und DP-1 zusammen oder alleine exprimiert wurden und die Transkriptionsaktivität des E2F-Stellen-Reporterkonstrukts p4xWT-CYC1 gemessen wurde (10a). In vorhergehenden Studien wurde dieser Test verwendet, um die Kooperation zwischen E2F-1 und DP-1 zu messen (Bandara et al (1993)). Die Transkriptionsaktivierung des Reporters wurde nach der Expression der DP-1-Hybridproteine nicht signifikant und durch das E2F-5-Hybrid nur marginal beeinträchtigt (10b). Wurden beide jedoch zusammen exprimiert, so kam es zu einer mehr als 6fachen Stimulierung der Reporteraktivität (10b). Die Aktivität von p4xMT-CYC1, ein Derivat von p4xWT-CYC1, das Mutanten-E2F-Bindungsstellen trägt (10a; Bandara et al. (1993)), blieb unter denselben Bedingungen unbeeinträchtigt (Daten nicht dargestellt). Die Erfinder schließen daher daraus, dass E2F-5 mit DP-1 kooperiert.
Transkriptionsaktivierung und Pocket-Protein-Regulierung von E2F-5
Die Fähigkeit von E2F-5, die Transkription zu aktivieren, wurde sowohl in Hefe- als auch in Säugetierzellen untersucht. Um die Transkriptionsaktivität in Hefe zu testen, wurde eine C-terminate Region (von Rest 198 bis 335) von E2F-5 an LexA fusioniert, und die Aktivität eines von LexA-Bindungsstellen gesteuerten Reporter-Konstrukts wurde untersucht (11a). Das E2F-5-Protein enthält eine starke Trans-Aktivierungs-Domäne, da die Aktivität des Reporters in Gegenwart von pLEX.E2F-5 viel stärker war als bei alleiniger Expression des Vektors (11b); auf ähnliche Art und Weise war LexA-E2F-1 in der Lage, die Transkription zu aktivieren (11b). Somit aktiviert E2F-5 die Transkription wirksam in Hefe.
Um diese Resultate in Säugetierzellen zu bestätigen und um die funktionellen Konsequenzen der Wechselwirkung von Pocket-Proteinen mit E2F-5 zu untersuchen, fusionierten die Erfinder dieselbe Region von E2F-5 an die Gal4-DNA-Bindungsdomäne und verwendeten vorübergehende Transfektionstests, um die Transkriptionsaktivität eines durch Gal4-Bindungsstellen gesteuerten Reporter-Konstrukts, pGAL-CAT, zu untersuchen (12a). In 3T3-Zellen aktivierte E2F-5 die Transkription wirksam im Verhältnis zur alleinigen Aktivität der Gal4-DNA-Bindungsdomäne (12b), da die Transkriptionsaktivität von pGAL-CAT im Verhältnis zu pG4 in Gegenwart von pGAL-E2F-5 15fach höher war. Ähnliche Resultate wurden in einer Reihe anderer Zelltypen erhalten (Daten nicht dargestellt), was, darauf hindeutet, dass E2F-5 eine Trans-Aktivierungsdomäne enthält, die in Säugetierzellen ihren Zweck erfüllt.
Die Erfinder verwendeten anschließend die Transkriptionsaktivität von E2F-5, um die funktionellen Konsequenzen einer Wechselwirkung mit entweder pRb oder p107 zu untersuchen. Als Kontrolle für Wildtyp-pRb und -p107 studierten die Erfinder die Aktivität von RbΔ22, ein Protein, für das ein natürlich vorkommendes Mutantenallel von Rb kodiert und das nicht mit DRTF1/E2F (Zamanian und La Thangue (1992)) und der Aktivität von Antisense-p107-RNA echselwirken kann (Zamanian und La Thangue (1993)). Weder Wildtyp-pRb noch RbΔ22 beeinträchtigten die Aktivität von E2F- 5 signifikant, da in Gegenwart von entweder pCMVHRb oder pCMVHRbΔ22 die Aktivität von pGAL-CAT nicht beeinträchtigt wurde (12b). Im Gegensatz dazu reduzierte eine Coexpression von p107 (aus pCMV107) mit E2F-5 die Transkriptionsaktivität von E2F-5, eine Wirkung, die spezifisch war, da Antisense-p107 (aus pCMV107AS) keine Auswirkungen hatte (12b). Die Erfinder schlossen daraus, dass p107 die Transkriptionsaktivität von E2F-5 in Säugetierzellen aktivierte. Unter Verwendung einer ähnlichen experimentellen Strategie wurde gezeigt, dass das p130-Protein die Transkriptionsaktivität von E2F-5 inaktivierte (Daten nicht dargestellt).
E2F-5 ist eine physiologische DNA-Bindungskomponente von DRTF1/E2F
Um zu bestimmen, ob E2F-5 eine physiologische DNA-Bindungskomponente der allgemeinen DRTF1/E2F-DNA-Bindungsaktivität ist, die in aus Säugetierzellen hergestellten Extrakten definiert wurde, wurden zwei verschiedene Anti-E2F-5-Peptid-Sera gegen unterschiedliche Peptidsequenzen hergestellt; beide Antisera reagierten spezifisch mit einem GST-E2F-5-Fusionsprotein (Daten nicht dargestellt).
Die Wirkung dieser Antisera auf die DRTF1-/E2F-DNA-Bindungsaktivität wurde mittels Gel-Retentionstests studiert, die mit Extrakten muriner F9-Embryonalkarzinom-(F9-EC-)Zellen durchgeführt wurden. Vorhergehende Studien haben gezeigt, dass DP-1 eine häufig anzutreffende, möglicherweise universelle, Komponente der DRTF1/E2F-DNA-Bindungsaktivität in F9-EC-Zellextraken ist (Girling et al. (1993); Bandara et al. (1993)), ein Beispiel derer in 13 dargestellt wird (Spuren 1 bis 4). Beide Anti-E2F-5-Sera zerstörten die DRTF1/E2F-DNA-Bindungsaktivität, eine Wirkung, die als spezifisch angesehen wurde, da sie in der Gegenwart des homologen Peptids nicht offensichtlich war (13, Spuren 5 bis 12). Obwohl Anti-E2F-5 eine signifikante Verringerung der DNA-Bindungsaktivität hervorrief, war die Wirkung deutlich weniger stark ausgeprägt als jene, die durch Anti-DP-1 hervorgerufen wurde (13, vergleiche Spuren 1-4 bis 5-12). Dies könnte dadurch bedingt sein, dass E2F-5 in einer Subpopulation an DP-1/E2F-Heterodimeren in F9-EC-Zellextrakten vorhanden ist, eine Situation, die in Kontrast mit jener steht, die bei DP-1 beobachtet wurde.
DNA-Eindungseigenschaften von E2F-5
Um die DNA-Bindungseigenschaften von E2F-5 zu untersuchen, exprimierten und reinigten die Erfinder E2F-5 als ein GST-Fusionsprotein. In Einklang mit früheren Resultaten (Bandara et al. (1993)) kooperierte GST-DP-1 mit GST-E2F-1 bei Bindung an die E2F-Stelle, obwohl E2F-1 eine signifikante DNA-Bindungsaktivität aufwies, als es alleine getestet wurde (14, vergleiche Spuren 1 bis 4). E2F-5 alleine besaß eine kaum detektierbare DNA-Bindungsaktivität (14, Spuren 5 bis 7). Die Kooperation zwischen E2F-5 und DP-1 war jedoch bedeutend stärker als zwischen E2F-1 und DP-1 (13, Spuren 8 bis 10). Daher kooperieren E2F-5 und DP-1 bezüglich der DNA-Bindungsaktivität.
E2F-5-RNA-Mengen
Die Erfinder waren daran interessiert, die Mengen der E2F-5-RNA in verschiedenen Zelllinien zu bestimmen und weiters die E2F-5-Mengen mit anderen Mitgliedern der E2F-Familie zu vergleichen. Dafür wurde RNA aus asynchronen Kulturen von F9-EC-Zellen zusammen mit einer Reihe von leukämischen Zelllinien hergestellt und die E2F-5-RNA-Menge wurde mittels Northern-Blot-Test untersucht. Die Menge der E2F-5-RNA variierte bedeutend von Zelllinie zu Zelllinie; F9-EC-Zellen und einige der leukämischen Zelllinien, z.B. DAUDI und RAGI, exprimierten große Mengen (15, Spuren 1, 7 und 8). Im Gegensatz dazu enthielten HL60 und TF1 geringe E2F-5-RNA-Mengen (15, Spuren 4 und 6). Dieses Profil der E2F-5-RNA-Mengen unterschied sich bedeutend von den E2F-1-Mengen. Es waren z.B. im Gegensatz zu E2F-5 signifikante E2F-1-RNA-Spiegel in K562-, HL60- und TF1-Zellen vorhanden (15, Spuren 3, 4 und 6). Die gegenteilige Situation trat auf offensichtliche Art und Weise in EL4-Zellen auf, in denen die E2F-5-Mengen hoch waren und jene von E2F-1 gering (15, Spur 10). Die Erfinder schlossen daher, dass die E2F-5-RNA-Mengen durch den Zelltyp beeinflusst werden und dass es wenig Korrelation zwischen den E2F-5-Mengen und E2F-1-RNA gibt.
Diskussion
E2F-5 und E2F-4 sind eine Unterfamilie der E2F-Proteine
Die Erfinder berichten über die Isolierung und die Charakterisierung des fünften Mitglieds der E2F-Proteinfamilie, E2F-5. Obwohl viele der Domänen in E2F-5, wie z.B. der potentielle Leucin-Zip, die markierte Box und die Pocket-Protein-Bindungsregion, mit anderen Mitgliedern der E2F-Familie konserviert sind, so deutet das Fehlen der N-terminalen Sequenz außerhalb der DNA-Bindungsdomäne auf eine strukturelle Organisation hin, die E2F-4 ähnelt (Beijersbergen et al. (1994); Ginsberg et al. (1994)). Die anderen Mitglieder der E2F-Familie, E2F-1, -2 und -3, besitzen ausgedehnte N-Termini, innerhalb derer eine Domäne vorhanden ist, die in der Lage ist, mit Cyclin-A wechselzuwirken (Krek et al. (1994)). Es wurde vorgeschlagen, es könnte die Rolle dieser Domäne sein, eine Cyclin-A/cdk2-Kinase zum DP-1/E2F-Heterodimer zu rekrutieren, was zu der anschließenden Phosphorylierung von DP-1 führt, wodurch die funktionelle Konsequenz eine reduzierte DNA-Bindungsaktivität des DP-1/E2F-Heterodimers ist (Krek et al. (1994)). Solch ein Mechanismus kann zu späteren Zeitpunkten während des Durchlaufens des Zellzyklus in der Regulierung der Transkriptionsaktivität von E2F-stellenabhängigen Genen von Bedeutung sein. Das Fehlen einer Cyclin-A-Bindungsdomäne von E2F-5 (und E2F-4) deutet darauf hin, dass die DNA-Bindungsaktivität des E2F-5/DP-1-Heterodimers mittels anderer Mechanismen herabreguliert werden kann. Tatsächlich, würde ein mögliches Szenario, mit dem dies erreicht werden könnte, die Proteine p107 und/oder p130 umfassen, da die Spacer-Region in diesen Proteinen entweder Cyclin-A/cdk2- oder Cyclin-E/cdk2-Komplexe binden kann (Lees et al. (1993); Cobrinik et al. (1993); Hannon et al. (1993); Li et al. (1993)). Es ist möglich, dass diese Pocket-Proteine die Rolle Cyclin-A-bindender E2F-Familienmitglieder ersetzen und Cyclin/cdk-Komplexe zum DP/E2F-Heterodimer rekrutieren.
Ein Vergleich der Proteinsequenz von E2F-5 mit anderen Mitgliedern der E2F-Familie deutete auf ein engeres Verhältnis mit E2F-4 hin als mit E2F-1, -2 und -3. Interessanterweise ist E2F-4 das einzige bekannte Mitglied der Familie, das in der Lage ist, mit p107 unter physiologischen Bedingungen wechselzuwirken (Beijersbergen et al. (1994); Ginsberg et al. (1994)). Die Erfinder haben gezeigt, dass die Transkriptionsaktivität von E2F-5 durch p107 oder p130 anstatt durch pRb inaktiviert werden kann. Dies könnte jedoch das engere Verhältnis von p107 zu p130 als mit pRb widerspiegeln (Ewen et al. (1991); Cobrinik et al. (1993); Li et al. (1993)) und könnte daher nicht nur physiologische Wechselwirkungen widerspiegeln. Dieser Gedanke steht in Einklang mit dem Resultat, dass die Wechselwirkung von menschlichem E2F-5 mit p130 unter physiologischen Bedingungen gezeigt wurde (Hijmans et al., eingereicht).
Kooperation zwischen E2F-5 und DP-1
Bezüglich der DNA-Bindungs- und der Transkriptionsaktivität kooperierte E2F-5 mit DP-1. In dieser Hinsicht besitzt E2F-5 ähnliche Eigenschaften wie andere Mitglieder der E2F-Familie. Es ist jedoch interessanterweise anzumerken, dass die Kooperation zwischen E2F-5 und DP-1 z.B. bedeutend größer war, als die Kooperation, die unter äquivalenten experimentellen Bedingungen zwischen E2F-1 und DP-1 beobachtet wurde (siehe z.B. 14). Falls dieser Test funktionelle Eigenschaften innerhalb von Zellen widerspiegelt, so ist es möglich, dass in einem intrazellulären Umfeld an überschüssigem DP-1 äquivalente Zunahmen der Menge an E2F-5 und E2F-1 zu einem verhältnismäßig höheren Ausmaß an E2F-5/DP-1-DNA-Bindungsaktivität führen. Weiters können diese Unterschiede in der DNA-Bindungsaktivität Unterschiede in der Transkriptionsaktivität widerspiegeln, falls es bevorzugte Zielgene für bestimmte E2F/DP-Heterodimere gibt.
Die genauen Rollen der verschiedenen E2F-Proteine in der Zellzyklussteuerung müssen erst erforscht werden. Es ist jedoch möglich, dass sie die Transkriptionsaktivität von Zielgenen während einzelner Phasen des fortschreitenden Zellzyklus regulieren. Die Tatsache, dass z.B. E2F-1, -2 und -3 mit pRb wechselwirken (Helin et al. (1992); Kaelin et al. (1992); Ivey-Hoyle et al. (1993); Lees et al (1993)), deutet darauf hin, dass sie das Durchlaufen des Zellzyklus durch G1 regulieren. Im Gegensatz dazu assoziiert p107 mit DRTF1/E2F gegen Ende von G1, mit einem Spitzenwert während der S-Phase (Shirodkar et al. (1992)), während p130 vorzugsweise während des Durchlaufens des frühen Zellzyklus, hauptsächlich während G0, assoziiert (Cobrinik et al. (1993)). Die E2F-1- und E2F-5-Spiegel in einer Reihe von Zelltypen deuten jedoch darauf hin, dass die Expression der E2F-Familienmitglieder nicht nur durch die Zellzyklus-Phase, sondern auch durch den Phänotypen beeinflusst wird. Es ist möglich, dass Zellen ein bevorzugtes Subset an E2F-Proteinen verwenden, die den Anforderungen ihres Zellzyklus am meisten entsprechen.
Die hier beschriebenen molekularen und funktionellen Charakteristika von E2F-5, zusammen mit dessen Wechselwirkung mit DP-Familienmitgliedern, deuten darauf hin, dass theoretisch eine Reihe von Heterodimeren zwischen E2F- und DP-Familienmitgliedern möglich sind. Ein Hauptziel zukünftiger Studien wird es sein, die physiologische Rolle eines jeden dieser Transkriptionsfaktoren in der Zellzyklussteuerung zu verstehen.
Materialen und Verfahren
Hefe-Stämme, Medien und Verfahren.
Die Saccharomyces-cerevisiae-Stämme, die in dieser Studie verwendet wurden, waren Folgende: W3031a (Mata ade2-100 trp1-1 leu2-3, 112 his3-11 ura3); CTY10-5d (Mata ade2 trp1-901 leu2-3, 112 his3-200 gal4 ga180 URA3::lexAop-lacZ) und PCY2 (Matα gal14 gal80 URA3::GAL1-lacZ lys2-801 his3-200 trp1-63 leu2 ade2-101) und JZ1 (Jooss et al. (1994); Matα lys2-801 ade2-10 leu2Δ1 trpΔ63 his3Δ200 URA3::lexAop-CYC1-lacZ. Hefe-Stämme wurden in YPD- oder YNB-Medien gezüchtet und unter Verwendung einer Modifikation des Lithiumacetat-Verfahrens transformiert. Der Koloniefarbe-β-Galactosidaseaktivitäts-Test wurde mittels herkömmlicher Verfahren durchgeführt. Die β-Galactosidase-Aktivität einzelner Transformanten wurde in Mid-Log-Phasen-Kulturen für zumindest drei unabhängige Transformanten quantifiziert.
Bibliotheks-DNA, Plasmide und Oligonucleotide.
pPC67 ist eine 14,5-d.p.c.-CD1-Mausembryo-oligo-dT-geprimte cDNA-Bibliothek, die stromab von Hefesequenzen fusioniert ist, die für die Trans-Aktivierungsdomäne des GAL4-Proteins kodieren (GAD; Chevray und Nathans (1992)). Es wurden vollständige cDNA-Klone aus einer λZapII-F9-EC-Bibliothek von gerichtet klonierter poly-dT-geprimter cDNA isoliert (Schöler et al. (1990)).
Das Plasmid pTR27 ist ein Derivat von pBTM116 (Bandara et al. (1993)), in dem die Polylinker-Sequenzen ausgeweitet wurden; pLEX.DP-1, pGAD.E2F-1, p4xWT-CYC1 und p4xMT-CYC1 wurden zuvor bereits beschrieben (Bandara et al. (1993)). pLEX(HIS).DP-1 kodiert für eine Fusion des vollständigen bakteriellen LexA-Proteins mit DP-1 (aus Aminosäurerest 59 bis 410) im Plasmid pLEX(HIS), ein Derivat von pBTM116, in dem TRP1 mit HIS3 ersetzt wurde. pGAD.E2F-5 enthält die gesamte kodierende Sequenz von E2F-5, exprimiert als Hybridprotein mit der Aktivierungsdomäne des Hefe-GAL4-Proteins (768-881) im Plasmid pACTII (Durfee et al. (1993)). pLEX.E2F-5 enthält die E2F-5-kodierende Sequenz aus Aminosäurerest 198 bis 335, exprimiert als ein Hybridprotein stromab der vollständigen kodierenden Sequenz des LexA-Proteins im Plasmid pTR27. pLEX.E2F-1 trägt in pTR27 E2F-1 voller Länge (1-437) in sich. Das Plasmid pG4 (zuvor pG4m-polyII genannt; Webster et al. (1989)) kodiert für die GAL4-DNA-Bindungsdomäne (1-148) unter der Steuerung des frühen SV40-Promotors. Das Plasmid pGAL4.E2F-5 enthält die E2F-5-kodierende Sequenz aus Rest 198 bis 335, die stromab der GAL4-Sequenzen in pG4 fusioniert ist. Die Plasmide pCMVHRb, pCMVHRbΔ22, pCMV107 und pCMV107AS wurden bereits zuvor beschrieben (Zamanian und La Thangue (1992; 1993)).
Bibliotheksscreening.
40 μg pPC67-Bibliotheks-DNA wurde mit 40 μg pLEX(HIS).DP-1 in CTY10-5d co-transformiert. Etwa 400.000 Transformanten, die auf selektiven Agar-Platten wuchsen, wurden durch den In-situ-Filterpapier-β-Galactosidase-Test gescreent. Um die Bibliotheksplasmide zu retten, wurden blaue Kolonien isoliert und durch Züchten bis zur Sättigung in selektiven flüssigen Medien in Gegenwart von Histidin von pLEX(HIS).DP-1 geheilt. Nach dem Replika-Plattieren auf selektivem minimalen Agar wurde Plasmid-DNA aus Trp⁺-His-Kolonien, die beim Testen auf β-Galactosidase keine blaue Farbe aufweisen konnten, in E.-coli-HW87 elektroporiert. Die Plasmide wurden gewonnen und entweder mit pLEX(HIS).DP-1 oder dem Kontrollplasmid (pLEX(HIS)) erneut in CTY10-5d transformiert. Ein Plasmid, das einen Trp⁺-Phänotypen verlieh, der nur in Gegenwart von pLEX(HIS).DP-1 eine blaue Koloniefarbe ergab, wurde zur weiteren Analyse ausgewählt. Um eine cDNA voller Länge zu erhalten, wurde das Insert ausgeschnitten, radiomarkiert und verwendet, um etwa 10⁶ Plaques aus der λZapII-F9EC-Bibliothek zu screenen, aus der eine E2F-5-cDNA voller Länge isoliert wurde und in pBluescript gerettet wurde.
Vorübergehende Transfektion von 3T3-Zellen.
Transfektionen und Tests wurden, wie zuvor beschrieben, durch das herkömmliche Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren durchgeführt (Zamanian und La Thangue (1992)). Die β-Galactosidase-Aktivität, die von pCMV-βgal abstammt, zur internen Kontrolle wurde, wie zuvor beschrieben, gemessen (Zamanian und La Thangue (1992)).
Antisera und Gel-Retentionsanalysen.
Kaninchen-Antisera, die gegen zwei verschiedene Peptidsequenzen gezüchtet wurden, die von E2F-5 abstammten, genannt Anti-E2F-5(1) und Anti-E2F-5(2), wurden hergestellt und auf ihre Wirkung auf die DRTF1/E2F-DNA-Bindungsaktivität in F9-EC-Zellextrakten getestet, wie dies zuvor beschrieben wurde (Girling et al. (1993)). Die E2F-Bindungsstelle wurde aus dem Adenovirus-E2a-Promotor entnommen (La Thangue et al. (1990)). Es wurde entweder homologes (+) oder ein unverwandtes (–) Peptid zu dem DNA-Bindungstest hinzugefügt, um, wie zuvor beschrieben, die Spezifität zu untersuchen (Girling et al. (1993)). Das Anti-DP-1-(24)-Antiserum wurde gegen ein Peptid gezüchtet, das aus der C-Terminus-Sequenz von DP-1 stammt. DNA-Bindungstests, durchgeführt mit GST-Fusionsproteinen, erfolgten, wie zuvor bereits beschrieben (Bandara et al. (1993; 1994)). GST-DP-1, -E2F-1 (Bandara et al. (1993)) und -E2F-5 (Aminosäurereste 2 bis 335) wurden gemäß herkömmlicher Verfahren exprimiert und gereinigt.
Northern-Analyse.
Eine Northern-Analyse bezüglich der RNA-Mengen wurde mit RNA durchgeführt, die mittels herkömmlicher Verfahren aus den angegebenen Zelllinien präpariert wurde. Die E2F-5-Sonde enthielt 840 Nucleotide, die sich in die untranslatierte 3'-Region erstreckten. Die E2F-1-Sonde enthielt die gesamte kodierende Sequenz des durch PCR erzeugten Gens und eine Sonde für GAPDH diente als innere Kontrolle.
Literaturzitate zu Beispiel 2

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Legende zu den Figuren
1: Human-E2F-5-Struktur

(A) Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von menschlicher E2F-5-cDNA.
(B) Schematische Darstellung von E2F-5 im Vergleich zu E2F-1 und E2F-4. Die Grenzen der konservierten Domänen werden durch die Aminosäurenummer angezeigt. SS in E2F-4 deutet auf das serin-reiche Motiv hin.

2: Expressionsmuster von E2F-5 in menschlichen Zelllinien
(A) Ein Northern-Blot, enthaltend zytoplasmatische Gesamt-RNA aus den angegebenen menschlichen Zelllinien, wurde an eine Human-E2F-5-cDNA-Sonde hybridisiert. Es wurden RNAs aus den folgenden menschlichen Zelllinien verwendet: CAMA, menschliches Brustkarzinom; A549, Lungenkarzinom; MDA, MDA-MD157-Brustkarzinom; OVCAR, Ovarialkarzinom; HS 578T, Brustkarzinom; LUCY, Ovarialkarzinom; HT29, Kolonkarzinom, CEM, T-Zellen-Leukämie; K562, Erythroleukämie. (B) Derselbe Filter hybridisierte mit einer Ratten-α-Tubulin-Sonde.
3: E2F-5 besitzt eine carboxylterminale Transaktivierungsdomäne.
U-2-OS-Zellen wurden mit einem CAT-Reporterplasmid transfiziert, das stromauf Gal4-Stellen in sich trug (5 μg), und zwar in Gegenwart oder in Abwesenheit von Gal-4-E2F-Expressionsvektoren (1 μg) und 0,2 μg pRSV-Luciferase als innere Kontrolle. Die CAT-Aktivität wurde für jede Probe auf die Luciferase-Aktivität normalisiert. Die CAT-Aktivität wurde zwei Tage nach der Transfektion getestet. Es wird die x-fache Aktivierung von Gal4-E2F über das CAT-Reportergen alleine dargestellt. Die Daten sind für zumindest drei unabhängige Experimente, die jeweils zweifach ausgeführt wurden, repräsentativ.
4: E2F-5 und DP-1 kooperieren bei der Transaktivierung
U2-OS-Osteosarkom-Zellen wurden, wie angegeben, mit ansteigenden Mengen des pJ3-E2F-5-Expressionsvektors (1,2 oder 5 μg) zusammen mit 100 ng pCMV-DP-1 transfiziert. Bei jeder Transfektion wurden 2 μg Reporterkonstrukt (E2F₄-CAT) und 0,2 μg pRSV-Luciferase hinzugefügt. Die CAT-Aktivität wurde bei jeder Probe auf die Luciferase-Aktivität normalisiert. Die Daten sind für zumindest drei unabhängige Experimente, die jeweils zweifach ausgeführt wurden, repräsentativ.
5: Inhibierung der E2F-5-Transaktivierung durch Pocket-Proteine
U2-OS-Zellen wurden mit 5 μg pJ3-E2F-5 und 100 ng pCMV-DP-1 in Kombination mit pCMV-Rb (50 und 100 ng), pCMV-RbΔ22 (100 ng), pCMV-p107 (50 und 100 ng), pCMVp107DE (100 ng) oder pCMV-HA-p130 (50, 100 und 500 ng) transfiziert. Zusammen mit den Expressionsplasmiden wurden die Zellen mit 2 μg E2F₄-CAT und 0,2 μg pRSV-Luciferase transfiziert. Die CAT-Aktivität wurde auf die innere Luciferase-Kontrolle normalisiert. Die x-fache Aktivierung wurde entsprechend dem Basalwert von E2F₄-CAT berechnet, der auf einen einheitlichen Wert (1,0) eingestellt wurde. Die Daten sind für zumindest drei unabhängige Experimente, die jeweils zweifach ausgeführt wurden, repräsentativ.
6: E2F-hältige Komplexe in vorübergehend transfizierten U2-OS-Zellen
U2-OS-Osteosarkom-Zellen wurden, wie angegeben, vorübergehend mit E2F-5- und DP-1-Expressionsvektoren in Gegenwart oder Abwesenheit von pRb-, p107- oder p130-Expressionsvektoren transfiziert. Nach zwei Tagen wurden Gesamtzellenextrakte hergestellt und mit einem [³²P]-markierten Oligonucleotid, das eine Konsensus-E2F-DNA-Bindungsstelle enthielt, inkubiert und Gel-Elektrophorese unterzogen. Die Position der freien Sonde, des E2F-5/DP-1-DNA-Komplexes und des E2F-5/Pocket-Protein-Komplexes ist angegeben.
7: E2F-5 wechselwirkt vorzugsweise in vivo mit p130
Menschliche CAMA-Brustkarzinom-Zellen wurden mit [³²P]-Orthophosphat markiert, und nichtionische Detergenslysate wurden sequentieller Immunpräzipitation unterzogen. In einer ersten Immunpräzipitation wurden Lysate, wie angeben, mit pRb-, p107- oder p130-Antikörpern inkubiert. Gruppe A zeigt die ersten Immunpräzipitationen mit pRb-, p107- und p130-spezifischen Antikörpern aus CAMA-Zellen. Die pRb-, p107- und p130-assoziierten Proteine wurden aus den immungefällten Pocket-Proteinen durch Kochen in SDS-hältigem Puffer freigesetzt und erneut Immunpräzipitation mit E2F-5-spezifischem Antiserum unterzogen (Gruppe B). Als. Kontrolle wurden Proteine, die aus pRb- und p107-Immunpräzipitaten freigesetzt wurden, erneut Immunpräzipitation mit Anti-E2F-1-(KH20-) oder E2F-4-(RK13-)Antikörpern unterzogen (Gruppe C). Die immungefällten Proteine wurden auf 7,5-%-SDS-Polyacrylamid-Gelen getrennt, die Gele wurden getrocknet und die Proteine wurden mittels Autoradiographie detektiert.
8: Strategie zur Isolierung von murinem E2F-5
Der „Köder", LEXA-DP-1, wurde verwendet, um eine 14,5-d.p.c.-Mausembryo-Aktivierungsdomänen-markierte cDNA-Bibliothek zu screenen.
9: Sequenz und Vergleich von murinem E2F-5 mit anderen Mitgliedern der E2F-Familie

(a) Nucleotidsequenz zusammen mit der prognostizierten Aminosäurerest-Sequenz von E2F-5.
(b) Diagrammartige Darstellung und Vergleich von E2F-5 (Mitte) mit E2F-1 (oben) und E2F-4 (unten). Die Prozentsätze der Identitätswerte auf der Ebene der Proteinsequenz sind zwischen E2F-5 und E2F-1 und E2F-5 und E2F-4 angegeben. Die zwischen den Mitgliedern der E2F-Familie geteilten Domänen sind auch angebeben. (Lees et al. (1993)).
(c) Vergleich der Aminosäurerest-Sequenz in den konservierten Domänen innerhalb der E2F-Familienmitglieder. Die hervorgehobenen Reste sind bei allen Familienmitgliedern gleichermaßen zu finden, wohingegen die eingerahmten Reste bei E2F-4 und E2F-5 zu finden sind. Beide Reste in der Leucin-Zip-Region deuten auf eine Hydrophobie im Heptad-Repeat hin. Die Reste in der DEF-Box-Region, die von E2F-Familienmitgliedern und DP-1 geteilt werden, sind durch die Linien dargestellt.

10: Aktivierung der E2F-stellenabhängigen Transkription durch E2F-5 und DP-1 in Hefe

(a) Zusammenfassung der Reporter- und Effektor-Konstrukte
(b) Die angegebenen E2F-5- und DP-1-Expressionsvektoren wurden entweder alleine (Spuren 2 und 3) oder zusammen (Spur 4) in Hefe transformiert, und die Aktivität von p4xWT-CYC1, das vier Wildtyp-E2F-Stellen besitzt, wurde bewertet. In Parallelexperimenten wurde die Aktivität von p4xMT-CYC1 unter keiner der Bedingungen beeinträchtigt. Die dargestellten Daten wurden durch dreifache Ablesungen erhalten.

11: Transkriptionsaktivierung durch E2F-5 in Hefe

(a) Zusammenfassung der Reporter- und Effektor-Konstrukte
(b) Die Transkriptionsaktivität von entweder pLEX.E2F-1 (Spur 2) oder pLEX.E2F-5 (Spur 3) wurde in Hefe durch das Testen der Aktivität von pLexA-CYC1-lacZ untersucht. Die dargestellten Daten wurden durch dreifache Ablesungen erhalten.

12: Pocket-Protein-Regulierung von E2F-5

(a) Zusammenfassung der Reporter- und Effektor-Konstrukte
(b) Die Transkriptionsaktivität von Gal-E2F-5 (Spur 2) wurde in Gegenwart von Wildtyp-pRb (Spur 3), pRbΔ22 (Spur 4), p107 (Spur 5) und p107AS (Spur 6) untersucht. Zum Vergleich wurden ähnliche Behandlungen mit pG4 (Spuren 7 bis 10) durchgeführt. Die dargestellten Daten wurden durch dreifache Ablesungen erhalten.

13: E2F-5 ist eine physiologische DNA-Bindungskomponente von DRTF1/E2F in F9-EC-Zellen
Zwei Arten von Antisera, die gegen verschiedene Peptide aus verschiedenen Regionen innerhalb von E2F-5 gezüchtet wurden, wurden auf ihre Wirkung auf die F9-EC-Zellen-DRTF1/E2F-DNA-Bindungsaktivität untersucht. Die Anti-E2F-5-Sera, Anti-Peptid 1 (Spuren 5 bis 8) und Anti-Peptid 2 (Spuren 9 bis 12), wurden in Gegenwart entweder des homologen (+; Spuren 5, 7, 9 und 11) oder eines nicht verwandten (–; Spuren 6, 8, 10 und 12) Peptids untersucht. Zum Vergleich wurde die Wirkung von Anti-DP-1(24) (Spuren 1 bis 4) in Gegenwart entweder des homologen (Spuren 1 und 3) oder eines nicht verwandten Peptids (Spuren 2 und 4) untersucht. Jedes Spuren-Paar (+ zusammen mit –) stellt die Behandlung mit einem anderen Antiserum-Präparat dar. Die DRTF1/E2F-b/c-DNA-Bindungs-Komplexe werden auch dargestellt (La Thangue et al. (1990)).
14: DNA-Bindungseigenschaften von E2F-5
E2F-5, E2F-1 und DP-1 wurden als GST-Fusionsproteine exprimiert, gereinigt, und es wurde ihre DNA-Bindungsaktivität mittels Gel-Retention getestet. E2F-1 oder E2F-5 wurden entweder alleine getestet (Spuren-1 und 2 und 5, 6 bzw. 7) oder zusammen mit einer konstanten Konzentration an DP-1 (Spuren 3 und 4 und 8, 9 und 10). Spur 11 zeigt die Sonde alleine. Die Menge der hinzugefügten Proteine lag bei E2F-1 bei etwa 50 ng (Spuren 1 und 3) oder bei 100 ng (Spuren 2 und 4), bei E2F-5 bei 25 ng (Spuren 5 und 8), bei 50 ng (Spuren 6 und 9) oder bei 100 ng (Spuren 7 und 10) und bei DP-1 bei 50 ng während des gesamten Vorgangs.
15: E2F-5-RNA-Mengen
Die E2F-5-RNA-Mengen wurden in den angegebenen Zelllinien mit E2F-1 verglichen. Die GAPDH-RNA-Menge wurde als innerer Kontrollwert untersucht.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid, umfassend: (a) das Protein aus 1A oder 9A; (b) ein Protein mit zumindest 90 % Aminosäureidentität mit (a), das als Säugetiertranskriptionsfaktor dienen kann; (c) ein Fragment des Proteins aus 1A oder 9A aus zumindest 30 Aminosäuren, das in der Lage ist, einen Komplex mit einem DP-Protein, p107 und/oder p130 zu bilden.
Polypeptid nach Anspruch 1, das eine kennzeichnende oder detektierbare Markierung trägt.
Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, das an einer festen Phase befestigt ist.
Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2 zusammen mit einem Träger oder Verdünnungsmittel umfasst.
Polynucleotid, umfassend: (a) eine Sequenz von Nucleotiden, wie sie in 1A oder 9A dargestellt ist; (b) eine Sequenz, die zu (a) komplementär ist; oder (c) eine Sequenz, die für ein Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert.
Polynucleotid nach Anspruch 5, das ein DNA-Polynucleotid ist.
Doppelsträngiges Polynucleotid, das ein Polynucleotid nach Anspruch 5 oder 6 und seine komplementäre Sequenz umfasst.
Polynucleotid, das aus einem Fragment mit einer Länge von zumindest 25 Nucleotiden des Polynucleotids mit der in 1A oder 9A dargestellten Sequenz besteht.
Polynucleotid nach Anspruch 5 oder 6, das eine kennzeichnende oder detektierbare Markierung trägt.
Vektor, der ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 5 bis 7 oder 9 umfasst.
Vektor nach Anspruch 10, bei dem es sich um einen rekombinanten replizierbaren Vektor handelt, der eine Kodiersequenz umfasst, die für ein Polypeptid nach Anspruch 1 kodiert.
Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 10 umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 12, die durch einen rekombinanten Vektor nach Anspruch 11 transformiert oder damit transfiziert ist.
Wirtszelle, die durch einen rekombinanten Vektor nach Anspruch 10 transformiert ist, worin die Kodiersequenz operabel an eine Kontrollsequenz gebunden ist, die in der Lage ist, für die Expression der Kodiersequenz durch die Wirtzszelle zu sorgen.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 1, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 12 bis 14 unter Bedingungen, die für die Expression des rekombinanten Vektors der Kodiersequenz sorgen, und das Gewinnen des exprimierten Polypeptids umfasst.
Screening-Test zur Identifikation möglicher chemotherapeutischer Wirkstoffe für die Behandlung einer proliferativen oder viralen Erkrankung, umfassend: (A) das In-Kontakt-Bringen (i) eines DP-Polypeptids; (ii) eines Polypeptids nach Anspruch 1; und (iii) eines möglichen chemotherapeutischen Wirkstoffs; unter Bedingungen, unter denen die Komponenten (i) und (ii) in Abwesenheit von (iii) einen Komplex bilden; und (B) das Messen des Ausmaßes, in dem die Komponente (iii) in der Lage ist, den Komplex aufzubrechen, zu beeinträchtigen oder seine Aktivität zu hemmen.
Test nach Anspruch 16, worin die Fähigkeit des Komplexes aus (i) und (ii) gemessen wird, in vitro an eine E2F-DNA-Bindungsstelle zu binden.
Test nach Anspruch 16, worin die Fähigkeit des Komplexes aus (i) und (ii) gemessen wird, in vivo einen Promotor zu aktivieren, der eine E2F-Bindungsstelle an ein Reportergen gebunden umfasst.
Test nach Anspruch 18, worin der Test in einer Hefezelle, Insektenzelle oder Säugetierzelle durchgeführt wird.
Test nach einem der Ansprüche 16 bis 19, worin der mögliche chemotherapeutische Wirkstoff ein Fragment aus 10 oder mehr Aminosäuren eines Polypeptids ist, wie es in den Teilen (a) bis (c) von Anspruch 1 definiert ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, Vektor nach Anspruch 10 oder 11 oder Wirtszelle nach Anspruch 12, 13 oder 14 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach Anspruch 1, einen Vektor nach Anspruch 10 oder 11 oder eine Wirtszelle nach Anspruch 12, 13 oder 14 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Exzipienten umfasst.