DE19921076A1

DE19921076A1 - Identifizierung eines neuen Tumorsuppressorlocus (NRC-2) in der Chromosomenbande 3p14.2 durch Nachweis einer tumorsupprimierenden und einer seneszenzinduzierenden Aktivität des YAC 145F7-neo

Info

Publication number: DE19921076A1
Application number: DE19921076A
Authority: DE
Inventors: Hans-Joachim Schuette; Bertram Heinz Erich Opalka; Walter Bardenheuer; Knut Juelicher; Guido Marquitan; Nicole Susann Werner
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-05-08
Filing date: 1999-05-08
Publication date: 2002-09-05

Description

Stand der Forschung

Aberrationen des kurzen Arms des Chromosoms 3 (3p) gehören bei menschlichen Tumorerkrankungen zu den häufigsten genetischen Veränderungen und sind bei den unterschiedlichsten Tumorentitäten zu finden. Hierzu gehören vor allem kleinzellige und nichtkleinzellige Bronchialkarzinome, Nierenzellkarzinome, Kopf-Halskarzinome, Zervixkarzinome, Mammakarzinome, Tumore des Gastrointestinaltrakts sowie männliche und weibliche Genitaltumoren (1-15). Interessant ist dabei, daß diese Läsionen bereits sehr frühe Ereignisse im Zuge einer malignen Transformation darstellen können; sie werden oft schon in histologisch präneoplastischem Gewebe nachgewiesen, z. B. Hyperplasien/Dysplasien der Bronchialschleimhaut, Barrett's Ösophagus und Leukoplakien der Mundschleimhaut (16-19).

Zahlreiche Untersuchungen an Tumorzellinien und primärem Tumormaterial konnten die 3p- Aberrationen vorwiegend auf die humanen Chromosomenregionen (HCR) 3cen-p14, 3p21.1-p23 und 3p24-p26 eingrenzen (12, 20). Hierbei handelt es sich meist um hemizygote interstitielle (Verlust der Heterozygotie, "loss of heterozygosity", LOH) oder terminale Allelverluste, bei einigen Tumorzellinien auch um homozygote Deletionen (21, 22). Bei hereditären Nierenzellkarzinomen wurden darüber hinaus zwei Translokationen t(3; 8) und t(3; 6) beschrieben, deren Chromosom-3-spezifische Bruchpunkte in die Region 3p14.2 bzw. 3114.1-p13 kartiert werden konnten (23-25). Mikrosatellitenanalysen bei Nierenzellkarzinomen zeigten ferner eine Häufung von Allelverlusten in den Regionen 3p12-p13, 3p14 und 3p21 (20, 26-28). Eine weitere Translokation t(3; 6), deren Bruchpunkt ebenfalls in der Region 3p14 liegt, ist mit hämatologischen Systemerkrankungen assoziiert (29). Darüber hinaus enthält die Region 3p14.2 die fragilste Region des menschlichen Genoms, FRA3B (30-31). Diese Befunde deuten darauf hin, daß in den genannten Chromosomenabschnitten Tumorsuppressorgene lokalisiert sein könnten.

Diese Annahme konnte durch funktionelle Daten untermauert werden. So ließ sich der tumorigene Phänotyp von Nierenkarzinomzellinien mit 3p-Verlusten durch mikrozellvermittelten Transfer eines normalen Chromosoms 3 supprimieren (32). In Harnblasenkarzinomzellinien wurden interstitielle Deletionen im Bereich 3p13-p14.2 beschrieben. Nach Suppression durch ein komplettes Chromosom 3 wiesen maligne Revertanten solcher Zellinien Verluste in der Region 3p13-p21 auf (33). Bei der Maus-Fibrosarkomzellinie A9 konnte durch Einbringen eines 2 Mb großen Chromosomenfragments mit Sequenzen aus der Region 3p21 eine Reversion induziert werden (34). Funktionelle Evidenz für die Präsenz von Tumorsuppressoraktivität in der Region 3p12 ergibt sich aus Befunden, wonach das tumorigene Wachstum einer humanen Nierenkarzinomzellinie in Nacktmäusen durch die Präsenz dieses Chromosomenabschnitts supprimiert wird (35, 36).

In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von C. Reznikoff, University of Wisconsin, Madison, USA, haben wir in früheren Untersuchungen die Region kleinster gemeinsamer 3p-Deletionen bei immortalen humanen Uroepithelialzellen (HUEZ) kartiert. HPV-16 E6 immortalisierte HUCs weisen als konsistenteste, frühe genetische Alteration zytogenetisch erkennbare Deletionen im Bereich des kurzen Arms von Chromosom 3 auf. Unter Berücksichtigung einer interstitiellen Deletion in einer E7-immortalisierten HUEZ-Linie wurde der Bereich der kleinsten gemeinsamen Überlappung dieser Deletionen in die Region 3p13-p14 kartiert (37). Diese Arbeiten dienten der Lokalisierung eines in dieser Region vermuteten Seneszenzgens, das an der Immortalisierung o. g. HUEZ maßgeblich beteiligt zu sein scheint (38).

Aus HCR 3p25 und 3p21 wurden bislang zwei Gene kloniert, die in Tumoren Mutationen aufweisen. Für das in der Region 3p25.5 lokalisierte von-Hippel-Lindau (VHL-)Gen wurde tumorsupprimierende Aktivität bereits experimentell bestätigt (39, 40). Das Proteinprodukt des in der Region 3p21 lokalisierten MLH1-Gens ist an DNA-"Mismatch"-Reparaturprozessen beteiligt; seiner funktionellen Inaktivierung wird eine Rolle bei der Pathogenese der hereditären Polyposis coli (HNPCC) zugeschrieben (41, 42). Aus der Region 3p21 wurden putative Kandidatengene isoliert, ohne daß deren Funktion als Tumorsuppressorgene bislang nachgewiesen wurde. Hierzu gehört das UBE1L-1-Gen aus einer Subregion von 3p21, die in zwei Lungenkarzinomzellinien homozygot deletiert ist (43). Mutationen dieses Gens in primärem Tumormaterial wurden jedoch nicht gefunden. Gleiches gilt für das 3pk-Gen aus 3p21 (44).

Aus der von uns bearbeiteten HCR 3p14 wurden zwei mögliche Kandidatengene isoliert, für die bisher jedoch keine tumorsupprimierende Aktivität nachgewiesen oder wahrscheinlich gemacht werden konnte; so beispielsweise das HRCA-1-Gen, das dem oben erwähnten t(3; 8)- Translokationsbruchpunkt in 3p14.2 benachbart ist (45); ferner das in 3p14.2 kartierte Proteinphosphatase-gamma-Gen (46, 47). Mit Hilfe einer homozygoten Deletion in der Region 3p14.2, die zunächst in Tumorzellinien vornehmlich gastrointestinalen Ursprungs gefunden wurde, konnte kürzlich das FHIT-Gen isoliert werden, dessen Proteinprodukt Homologien zu der 5', 5'''P1, P4-Tetraphosplat-asymmetrischen Hydrolase von S. pombe aufweist. Das Gen überlappt sowohl mit der FRA3B-Region als auch dem mehrfach erwähnten t(3; 8)-Translokationsbruchpunkt hereditärer Nierenzellkarzinome. In gastrointestinalen Tumoren, in Bronchial- und Mammakarzinomen, können bei einem Teil der Tumoren FHIT-Genmutationen nachgewiesen werden. In Nierenzellkarzinomen waren Alterationen dieses Gens bislang nur sporadisch nachweisbar (48-55). Bisherige Experimente lassen erkennen, daß das FHIT-Gen tumorsupprimierende Eigenschaften aufweisen kann (56). Eine seneszenzinduzierende Aktivität wurde bislang nicht publiziert. Eine Inaktivierung des FHIT-Gens kann nach vorliegenden Daten auch durch transkriptionelle Herunterregulation erfolgen (57). Ein weiteres Gen mit tumorsupprimierender und telomerasesupprimierender Aktivität, WNT-5A, wurde in der Region 3p14.3=21.1 identifiziert (58-60). Seine Bedeutung für die Pathogenese menschlicher Tumoren ist bislang ungeklärt. Ein putativer Telomeraseinhibitor wurde kürzlich in die Region 3p14.2-21.1 kartiert (61-63). Dessen Bedeutung für die Pathogenese menschlicher Tumoren ist bislang ebenfalls ungeklärt.

Nachteile/Unzulänglichkeiten des Standes der Forschung

Die bisher identifizierten, o. g. Aberrationen in der Chromosomenregion 3p13-21.1 liegen in einem großen, mehr als 30 Mbp umfassenden genomischen Bereich. Die Ergebnisse bisheriger LOH- Analysen lassen vermuten, daß außer den o. g., bisher identifizierten Genen weitere Gene mit tumorsupprimierender Aktivität in dieser Region lokalisiert sind. Ferner konnten bislang Aberrationen der o. g., nachgewiesenen oder putativen Suppressorgene nur bei einigender von 3p- Aberrationen betroffenen Tumorentitäten nachgewiesen werden (20, 55, 73). Somit ergibt sich bislang kein einheitliches Modell, mit dem die Tumorigenese erklärt und mögliche diagnostische und therapeutische Ansatzpunkte bei von 3p-Aberrationen betroffenen Tumoren entwickelt und verfolgt werden können. Ferner fehlen bislang eindeutige Marker für die Diskrimination von Normalgewebe und präneoplastischen Geweben sowie für den Übergang zu manifesten Tumoren (16, 17, 19). Insbesondere nachteilig ist, daß bislang den meisten durch bekannte genomische Marker repräsentierten Regionen keine Funktion zugeordnet werden kann.

Aufgabe der Erfindung/Entdeckung

Unser Ziel war es daher, durch den systematischen Transfer von künstlichen Hefechromosomen (yeast artiflcial chromosomes, YACs) mit Inserts humaner genomischer DNA aus der Chromosomenbande 3p14 in Tumorzellen solche Regionen zu identifizieren, die Gene mit tumorsupprimierender, seneszenzinduzierender, zum Proliferationsarrest oder Proliferationsverlangsamung oder zum Zelltod führender und/oder telomeraseinhibierender Funktion enthalten. Dieser Ansatz soll ermöglichen, die für die Pathogenese von Tumoren bzw. präneoplastischen Geweben mit 3p-Aberrationen funktionell relevanten Chromosomenabschnitte zu definieren. Da solche 3p-Aberrationen in hoher Frequenz bei zahlreichen menschlichen Tumoren höher Inzidenz gefunden werden, können sich mit Hilfe diese Kenntnisse möglicherweise vielversprechende Perspektiven für die Entwicklung und Anwendung spezifischer diagnostischer und prognostisch relevanter Testverfahren sowie therapeutisch relevante Anwendungsmöglichkeiten bei einer großen Zahl prädisponierter Personen oder betroffener Patienten ergeben.

Lösung der Aufgabe

Als Voraussetzung für die Durchführung dieses Vorhabens haben wir die Chromosomenbande 3p14 und angrenzende Bereiche aus den Banden 3p13 und 3p21.1 in Form eines sog. YAC- "Contigs" kloniert (64-66), dessen Einzelklone vom Centre d'Etude du Polymorphisme Humain (CEPH), Paris, zur Verfügung gestellt wurden (67). Diese Arbeiten sind in den Referenzen (64-66) beschrieben. Zur möglichen Eingrenzung der funktionell relevanten Chromosomenregion wurde im weiteren die Region kleinster gemeinsamer 3p-Deletionen bei immortalen humanen Uroepithelialzellen (HUCs) in die Region 3p13-p14 kartiert (37). Als nächstes wurden die YACs in Vorbereitung des Transfers in menschliche Tumorzellen durch homologe Rekombination ("retrofitting") mit einem Neomycin-Resistenzgen versehen (68), das eine Selektion erfolgreich transduzierter Zellen in antibiotikahaltigen Medien erlaubt. Diese YACs wurden/werden mittels der Technik der Sphäroplastenfusion in eine menschliche Nierenkarzinomzellinle eingebracht, die eine Aberration auf dem kurzen Arm des Chromosoms trägt. Diese Arbeiten sind in der Referenz (69) beschrieben. Nach erfolgtem YAC-Transfer wurden/werden das Proliferationsverhalten der Tumorzellen, die Seneszenzinduktion und eine mögliche Telomerase-Suppression in vitro sowie die Tumorigenität der Zellen in vivo im Nacktmausmodell geprüft.

Vorteile der Erfindung/Entdeckung

Mit diesem experimentellen Ansatz ist es gelungen, ein klar abgrenzbares menschliches genomisches Nukleinsäurefragment, repräsentiert durch das Nukleinsäureinsert des vom CEPH- YAC 145F7 abgeleiteten YAC 145F7-neo, zu identifizieren, dessen Transfer in die verwendete Nierenkarzinomzellinie, RCC-1, zur Seneszenzinduktion in vitro und darauffolgend zum Absterben dieser Tumorzellen in vitro führte. Darüber hinaus konnte in mehreren Versuchsreihen durch Transfer dieses YACs eine statistisch hochsignifikante Suppression der Tumorigenität transduzierter Tumorzellen im Nacktmausmodell nachgewiesen werden. Die Entdeckung definiert somit einen klar umschriebenen, relativ kleinen Genomabschnitt von nur 530 kbp, der ein Gen oder Gene mit o. g. Funktionen enthält, und zukünftig eine diagnostische, progiostische und/oder therapeutische Relevanz erlangen könnte. Diese Möglichkeiten sind in den Ansprüchen der Erfindung/Entdeckung aufgeführt und könnten eine Vielzahl für eine mögliche Tumorentstehung prädisponierter Personen oder von manifesten Tumoren betroffene Patienten betreffen.

B. BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG/ENTDECKUNG/PATENTANMELDUNG 1. Zusammenfassung

Humane Genomabschnitte mit tumorsupprimierender Aktivität sollten durch den Transfer künstlicher Hefechromosomen (yeast artiflcial chromosomes, YACs) in eine humane Nierenkarzinomzellinie, RCC-1, identifiziert werden. Grundlage für diese Experimente ist ein sog. YAC-"Contig", dessen Einzelklone vom Centre d'Etude du Polymorphisme Humain (CEPH), Paris, zur Verfügung gestellt wurden und das die Chromosomenbande 3p14 sowie benachbarte Regionen der Banden 3p13 und 3p21.1 umfaßt. Die YACs werden mit einem eukaryontischen Selektionsmarker (neoR) versehen ("retrofitting") und mittels Sphäroplastenfusion in die Tumorzellen eingebracht. Transduzierte Zellen werden selektioniert, expandiert und überprüft bezüglich Proliferationsverhalten in Kultur, Seneszenzinduktion und Suppression der Telomeraseaktivität in vitro sowie ihrer Tumorigenität im Nacktmausmodell in vivo. Mit dieser Methodik ist es gelungen, ein ca. 530 kbp großes YAC, 145F7 bzw. 145F7-neo, zu identifizieren, dessen Transfer in die RCC-1-Zellen zur Seneszenzinduktion und darauffolgendem Absterben der Zellen in vitro führte. In vivo zeigten transduzierte Zellen eine hochsignifikante Suppression der Tumorigenität. Weitere Einzelheiten zu den verwendeten Methoden und Arbeitsmaterialien und Ergebnissen sind im beiliegenden, bisher unveröffentlichten Manuskript mit dem Titel "Identification of a novel tumor suppressor gene locus in human chromosome region 3p14.2" (Autoren: Knut Jülicher, Guido Marquitan, Nicola Werner, Walter Bardenheuer, Lydia Vieten, Frank Bröcker, Hüsnü Topal, Siegfried Seeber, Bertram Opalka und Jochen Schütte) enthalten und beschrieben.

Dieses YAC repräsentiert somit einen mittels funktioneller Komplementationsanalyse neu identifizierten Nukleinsäure-/Genomabschnitt (Locus), der die vorläufige Arbeitsbezeichnung "NRC-2" (non-papillary renal cell carcinoma-2) von uns erhalten hat und in dem ein Gen oder mehrere Gene lokalisiert sind, deren Produkte seneszenzinduzierende und/oder tumorsupprimierende Aktivität aufweisen. Die Analyse dieses(r) Gens(e) und ihres(r) Produkts(e) oder gegen sie gerichtete Nukleinsäure- oder Antikörpermoleküle eröffnet Perspektiven für neue diagnostische, prognostische und/oder therapeutische Anwendungen bei einer Vielzahl menschlicher Tumorentitäten und Präneoplasien, die mit Chromosom 3p14.2-spezifischen Aberrationen assoziiert sind. Ziel dieser Patentanmeldung ist es, jedwede kommerzielle Nutzung der Gene, die in der durch das YAC 145F7 bzw. 145F7-neo repräsentierten Genomregion oder zu ihr homologer bzw. syntener Regionen lokalisiert sind, deren cDNAs oder der Proteinprodukte oder Abkömmlingen davon sowie gegen sie gerichteter Nukleinsäuren, Peptidnukleinsäuren, Antikörper oder Peptide sowie deren Nutzung in transgenen Tieren patentrechtlich zu schützen.

Die Bezeichnung des YACs 145F7 entspricht der ursprünglichen YAC-Koordinate des CEPH, Paris. Dieses YAC, sein Chimeritätsstatus (nichtchimär) und sein STS (sequence tagged site) D3S1384 wurden zuvor von uns beschrieben (65). Der Transfer des von uns in einem Vektorarm derivatisierten YACs 145F7-neo in RCC-1-Zellen wurde ebenfalls durch unsere Arbeitsgruppe beschrieben (69). Die Daten funktioneller Analysen, die die Grundlage für die vorliegende patentrechtliche Anmeldung bilden, wurden bislang nicht veröffentlicht (s. o.).

Die genannte Erfindung (Entdeckung) wurde im Rahmen eines von der Deutschen Forschungsgemeinschaft, Bonn, and der Stiftung VerUm, München, geförderten Projekts gemacht.

2. Material und Methoden Zellinien und Kulturbedingungen

Die Nierenkarzinomzellinien RCC-1 wurde von Dr. T. Ebert, Universitätsklinikum Düsseldorf, zur Verfügung gestellt. Die Zellen sind immortal, bilden keine Kolonien in Weichagar, zeigen unter normalen Kulturbedingungen keine Seneszenz in vitro und sind tumorigen in Nacktmäusen, wobei die Tumore histopathologisch humanen klarzelligen Nierenzellkarzinomen entsprechen. GM11713 ist eine A9-Maus-Fibrosarkomzellinie, die ein pSV2neo-markiertes humanes Chromosom 3 aus Fibroblasten enthält (NIGMS, NJ, USA). Alle Zellinien wie auch die RCC-1-Derivate wurden als Monolayerkulturen in Dulbeccos Modifikation von Eagles Medium (DMEM) gehalten, das mit 10% fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin supplementiert wurde. Zur Selektion wurden die Zellen in Medium kultiviert, das 500 µg/ml aktives G418 (Life Technologies, Eggenstein, Germany) enthielt.

In vitro-Wachstumstests

Zur Bestimmung der Proliferationsrate und der Sättigungsdichte der parentalen RCC-1-Zellen und ihrer Derivate wurden 2 × 10⁵ Zellen in 75 cm²-Kulturflaschen ausgesät und die Zellen täglich über einen Zeitraum von 12 Tagen in Quadruplikaten ausgezählt. Die Verdopplungszeit wurde aus dem logarithmischen Teil der Wachstumskurve ermittelt. Die Sättigungsdichte wurde definiert als die Anzahl der Zellen pro cm² bei Erreichen der Konfluenz.

Mikrozellvermittelter Chromosomentransfer

Es wurde eine modifizierte Methode von Fournier und Ruddle (70) angewendet. GM11713-Zellen wurden zu 90% Konfluenz kultiviert und mit 0,2 µg/ml Colcemid (Life Technologies) für 48 h behandelt. Mikronuklei wurden danach geerntet, indem die Flaschen mit vorgewärmtem Medium, das 10 µg/ml Cytochalasin B (Sigma, Deisenhofen, Germany) enthielt, aufgefüllt und die Mikronuklei in einem JA-14-Festwinkelrotor in einer J2-21-Zentrifuge (Beckman, Düsseldorf) bei 24000 × g für 75 min bei 34°C abzentrifugiert wurden. Die Mikrozellen wurden in DMEM resuspendiert und seriell durch 8 µm-, 5 µm- und 3 µm-Polycarbonatmembranen (Nucleopore, Tübingen, Germany) filtriert.

Die filtrierten Mikrozellen wurden auf die adhärenten Rezipientenzellen zusammen mit 100 µg/ml Phytohemagglutinin-P (Boehringer-Mannheim, Mannheim) gegeben und anschließend mit 50% PEG 1500 (Boehringer-Mannheim) und 10 mM CaCl₂ in serumfreiem Medium bei 37°C inkubiert. Nach 1 minütiger Inkubation wurden die Zellen 1 : 2 mit nichtsupplementiertem DMEM verdünnt. Nach 5 min wurden die Zellen zweimal mit nichtsupplementiertem DMEM gewaschen und nach 48 h in Selektionsmedium kultiviert.

Sphäroplastenfusion und Fluoreszenz-In Situ-Hybridisierung (FISH)

Die Sphäroplastenfusion und die FISH wurden wie anderweitig beschrieben durchgeführt, wobei das nichtchimäre YAC 145F7 bzw. 145F7-neo und andere YACs aus der Chromosomenbande 3p14 verwendet wurden (64, 65, 69).

Messung der β-Galactosidase-Aktivitität

Die Messung der β-Galactosidaseaktivität wurde wie beschrieben durchgeführt (71). Die Zellen wurden mit Formalin : Glutaraldehyd fixiert, mit phosphatgepufferter Saline (PBS) gewaschen und für 16 h in β-Galactosidase-Färbelösung inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und seneszierende, angefärbte Zellen am Umkehrmikroskop bestimmt.

Tumorigenitätstests

Zur Bestimmung der Tumorigenität in vivo wurden 4 × 10⁶ (Microzellfusionszellen und Sphäroplastenfusionsserie I) oder 1 × 10⁷ Zellen (Sphäroplastenfusionsserien II and III) subkutan zwischen die Schulterblätter oder in die Flanke 4-6 Wochen alter weiblicher NMRI-Nacktmäuse injiziert. Die Tiere wurden wöchentlich, nach Bedarf auch häufiger, auf Tumorbildung hin untersucht. Tumore wurden entnommen, gewogen und vermessen und in den meisten Fällen in Kultur etabliert.

Telomerase Aktivitätsbestimmung

Die Telomeraseaktivität der RCC-1-Zellen und ihrer Derivate wurde wie beschrieben gemessen (72).

Statistische Analysen

Zur Berechnung der Signifikanz der unterschiedlichen Tumorinzidenz parentaler RCC-1-Zellen und ihrer Derivate, die das YAC 145F7-neo. enthielten, wurde der 'two-tailed Fisher's exact'-Test verwendet. Das tumorfreie Überleben der Mäuse wurde mit der Kaplan-Meier-Methode berechnet. Der Vergleich der Überlebenskurven erfolgte mit dem 'log-rank'-Test (SPSSS-Software, 7.0, SPSS Inc., USA).

Ergebnisse im Einzelnen Charakterisierung der parentalen RCC-1-Nierenkarzinomzellinie

Die parentalen RCC-1-Zellen sind immortal, weisen keine Seneszenz in vitro auf und sind tumorigen in Nacktmäusen. Typische Wachstumscharakteristika dieser Zellen in vitro sind in Tabelle 1 aufgeführt. Zytogenetisch zeigten diese Zellen einen annähernd tetraploiden Karyotyp mit interstitiellen Deletionen im Chromosomenbereich 3p13-25, Additionen unbekannten Materials am kurzen Arm von Chromosom 7 und Deletionen in der Chromosomenbande 11p11.2 (T. Ebert, persönliche Mitteilung). In späteren Passagen in unserem Labor zeigten die Zellen einen triploiden Karyotyp mit Deletionen in 1p, 3p und 11p sowie Additionen an 11p. Durch FISH mit einer Chromosom 3-zentromerspezifischen Sonde ließen sich drei Chromosomen 3 in < 85% der Zellen nachweisen, wobei eine Kopie dieses Chromosoms eine Deletion auf dem kurzen Arm in einer Region aufwies, die zum YAC 145F7 korrespondiert (69). Diese Zellen wurden für die Microzellfusionen und die Sphäroplastenfusionsserie I verwendet (Tabelle 2). Weitere FISH-Analysen derjenigen Zellen, die für die Sphäroplastenfusionsserien II und III verwendet wurden, zeigten einen Verlust des deletierten Chromosoms 3 in den meisten untersuchten Meta- und Interphasen (Daten nicht gezeigt).

Charakterisierung der mit einer zusätzlichen Kopie des humanen Chromosoms 3 transduzierten RCC-1-Mikrozellhybride

Um zu zeigen, daß der tumorigene Phänotyp der parentalen RCC-1-Zellen durch Chromosom 3- Sequenzen revertiert werden kann, wie es für andere Nierenzellkarzinomzellinien beschrieben ist, wurde ein aus normalen Fibroblasten stammendes, mit einem Neomycin- (neoR)-Resistenzgen markiertes Chromosom 3 aus der GM11713-Mauszellinie durch Mikrozellfusion in RCC-1-Zellen eingebracht. Kontrollexperimente wurden mit RCC-1-Zellen durchgeführt, die mit dem Plasmid pSV2Neo transfiziert worden waren. Aus zwei Mikrozellfusionsexperimenten wurden nach zwei bis drei Wochen Kultivierung in Selektionsmedium 10 unabhängige G418-resistente Kolonien isoliert. Vier dieser Klone wurden näher analysiert (Tabelle 1). Der Transfer des neoR-markierten Chromosoms 3 in den Klon MF1-1 wurde durch Zweifarben-FISH mit einer Chromosom 3-spezifischen Zentromersonde und einer neoR-spezifischen Sonde nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Die in vitro- Wachstumscharakteristika der, RCC-1-Mikrozellhybride sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Sättigungsdichten aller Hybridzellinien waren niedriger (8-9 × 10⁴ Zellen/cm²) als die der Parentalzellinie (14 × 10⁴ Zellen/cm²). Während der exponenziellen Wachstumsphase hatten die Mikrozellhybride Verdopplungszeiten (Generationszeiten) von 62-73 h im Gegensatz zu den 41 h, die bei den RCC-1-Zellen beobachtet wurden. Der Transfer der pSV2Neo-Plasmid-DNA hatte keinen meßbaren Effekt auf die in vitro-Wachstumsrate. Ein revertanter Subklon der MF1-1-Zellinie, MF1- 1del3p, hatte den größten Teil des kurzen Arms des eingebrachten Chromosoms 3 verloren, wie durch FISH gezeigt werden konnte. MF1-1de13p-Zellen hauen eine Sättigungsdichte von 12 × 10⁴ Zellen/cm² und eine Generationszeit von 42 h, Werte, die mit denen der Parentalzellinie vergleichbar sind.

RCC-1-Hybridzellen mit einem zusätzlichen Chromosom 3 stellten die Proliferation nach 13-15 Passagen ein und starben anschließend ab. Ungefähr eine Woche zuvor ließ sich in ihnen die seneszenzassoziierte β-Galactosidaseaktivität nachweisen. Im Gegensatz hierzu proliferierten parentale RCC-1-Zellen, mit dem neoR-Gen transfizierte RCC-1-Zellen und MF1-1del3p-Zellen weiter und zeigten keine seneszenzassoziierte β-Galactosidaseaktivität (Abb. 1). Die Tumorigenität in vivo wurde bei zwei Hybridklonen überprüft. Im Gegensatz zu Kontrollzellen bildeten sie keine Tumore über einen Zeitraum von 9 Monaten nach Injektion der Zellen (Tabelle 2). Diese Daten zeigen, daß der maligne Phänotyp der Nierenkarzinomzellinie RCC-1 durch Chromosom 3-Sequenzen revertiert werden kann.

YAC-Transfer in RCC-1-Zellen

Von 7 CEPH-YACs aus der Chromosomenregion 3p13-21.1, die mittels Sphäroplastenfusion nach Einbringen des Neomycin-Resistenzgens in den YAC-Vektorarm (retrofitting; resultierend in YAC 145F7-neo) in RCC-1 Zellen transferiert wurden, ergab das YAC 145F7-neo während der ersten in vitro-Analysen Hinweise auf eine Hemmung der Zellproliferation und wurde weitergehend untersucht. Die Dokumentation der YAC-Integration erfolgte mittels Fluoreszenz in-situ-Hybridisierung (FISH) (69). Insgesamt wurden drei unabhängige Sphäroplastenfusionen mit YAC 145F7-neo durchgeführt. Aus der ersten Serie (I) wurden vier individuelle Zellinien etabliert (7A, 20E, 11L, 20R) und hinsichtlich ihres Wachstums-/Proliferationsverhaltens in vitro analysiert (Tabelle 1). Drei dieser Klone (7A, 20E, 20R) sowie zwei (A1.4 und A33) bzw. drei Klone (B1, B8, B12) der Fusionsserien II bzw. III wurden in Tumorigenitätsversuchen in vivo analysiert (Tabelle 2).

In vitro Proliferationsverhalten der Sphäroplasten-Hybridzellinien

Veränderungen der Zellmorphologie konnten mikroskopisch bei keiner der neun Zellinien beobachtet werden, die das YAC 145F7-neo enthielten. Die Sättigungsdichte und die zelluläre Verdopplungszeit in vitro wurden bei vier Zellinien (Tabelle 1) bestimmt und zeigten eine höhere Verdopplungszeit (54-65 h) und eine geringere Sättigungsdichte (11-12 × 10⁴ Zellen/cm²) als parentale RCC-1 Kontrollzellen und RCC-1 Kontrollzellen, die nach Transfektion das Neomycin.- Resistenzgen enthielten (Verdopplungszeit: 40-41 h; Sättigungsdichte: 14 × 10⁴ Zellen/cm²). Eine revertante Zellinie (E15-del145F7), die während der Kultivierung das transferierte YAC 145F7- neo mit Ausnahme des rechten Vektorarms verloren hatte, zeigte eine den parentalen RCC-1 Zellen vergleichbare Verdopplungszeit und Sättigungsdichte (Tabelle 1).

Induktion zellulärer Seneszenz nach Transfer von YAC 145F7-neo

Ein Proliferationsarrest wurden bei allen vier Zellinien der Fusionsserie I nach 12-13 Kultivierungspassagen, entsprechend ca. 80-90 Tagen nach Sphäroplastenfusion, beobachtet (Tabelle 1). Nachfolgend starben diese Zellen innerhalb einer Woche ab. Dieses Ergebnis wurde in zehn unabhängigen Experimenten für alle vier Zellinien mit intermittierend kryokonservierten Zellpassagen reproduziert. Vergleichbar unseren Ergebnissen, die nach Transfer eines kompletten Chromosoms 3 mittels Mikrozellfusion erzielt wurden, wurde etwa eine Woche vor Absterben der Zellen eine Induktion der seneszenzassoziierten β-Galaktosidase beobachtet (Abb. 2). Nach etwa 60 Tagen nach Sphäroplastenfusion war ein solcher Effekt in diesen Zellinien sowie in parentalen RCC-1-Kontrollzellen und in der revertanten Zellinie E15-del145F7 nicht nachweisbar. In den später etablierten Zellinien der Fusionsserien II und III, die eine zunehmende genetische Instabilität gegenüber denen der Fusionsserie I aufwiesen, wurden eine Induktion der seneszenzassoziierten β-Galaktosidase sowie ein Proliferationsarrest der Zellen nicht beobachtet.

Telomerase-Aktivität

Wir bestimmten die Telomerase-Aktivität der parentalen RCC-1-Zellen sowie der Zellinie MF1-1 (Passage 13), in die ein komplettes menschliches Chromosom 3 mittels Mikrozellfusion eingebracht worden war und die eine Senesenzinduktion und einen Proliferationsarrest in vitro zeigte. Eine Reduktion der Telomerase-Aktivität in der Zellinie MF1-1 wurde - verglichen mit der parentalen RCC-1-Zellinie sowie mit 293-Zellen (als Positivkontrolle) nicht verzeichnet. Daraus resultiert, daß ein möglicher telomeraseinhibierender Effekt des YAC 145F7-neo zwar vorhanden, in diesem Zellsystem aber nicht analysiert werden kann (Daten hier nicht aufgeführt).

Tumorigenitätsanalysen

Tumorigenitätsanalysen im Nacktmausmodell wurden für acht Zellinien vorgenommen, die aus den drei unabhängigen Sphäroplastenfusionen etabliert wurden (Tabelle 2). In der ersten Tierexperimentserie, bestehend aus den Zellinien 7A, 20E und 20R der Fusionsserie I wurden subkutan 4 × 10⁶ Zellen in die Schulter-/Nackenpartie athymischer Mäuse (nu/nu) injiziert. In der zweiten Serie von Tierexperimenten wurden jeweils 1 × 10⁷ Zellen in die Flanke der Mäuse injiziert. Diese Serie beinhaltet fünf Zellinien der Sphäroplastenfusionen II (A1.4, A33) und III (B1, B8, B12; siehe oben).

In der ersten Tierexperimentserie wurde bei keiner der Mäuse, die die Zellinien 7A, 20E und 20R (Tabelle 2) injiziert bekamen, eine Tumorbildung innerhalb eines Beobachtungszeitraums von 9 Monaten nachgewiesen. Demgegenüber entwickelten alle Kontrollmäuse (n=4), in die parentale RCC-1-Zellen oder die revertante Zellinie E15-del145E7 injiziert wurden, Tumoren innerhalb eines medianen Beobachtungszeitraums von 64 Tagen (Bereich: 64-77 Tage; p < 1 × 10^-4; Tabelle 2).

In der zweiten Tierexperimentserie entwickelten neunzehn von zwanzig Mäusen, die Kontrollzellen injiziert bekamen, einen Tumor innerhalb eines medianen Beobachtungszeitraums von 42 Tagen (Bereich: 25-56 Tage): Tumoren bei Tieren mit parentalen RCC-1-Zellen: 14/15 Mäuse; Tumoren bei Tieren mit Zellinien, die mit anderen YACs als mit YAC 145F7-neo transduziert waren: 5/5 Mäusen (Daten nicht aufgeführt). Von den Tieren, die eine der YAC 145F7-neo-transduzierten Zellinien A1.4, A33, B1, B8 und B12 erhielten, waren 14/15 Mäusen für die Entstehung von Tumorwachstum evaluierbar. Eine Maus (B8) wurde als nicht evaluierbar angesehen, da sie in Woche 13 einen "Tumor" entwickelte, der sich bei der versuchten Dissketion als vollständig zystisch erwies und am ehesten als Ausdruck eines Seroms gedeutet wurde. Drei Mäuse mußten nach Beobachtungszeiträumen von 11 (B12), 20 (A1.4) und 31 (A1.4) Wochen infolge anderer, nicht tumorbezogener Ursachen getötet werden. Nach einem Beobachtungszeitraum von 36 Wochen für die verbliebenen Tiere waren 4 Mäuse tumorfrei.

Diejenigen Tumoren, die sich ausbildeten, waren nach einer medianen Latenzzeit von ca. 13 Wochen (Bereich 8-28 Wochen) erkennbar.

Beide Tierexperimentserien zusammenfassend ergeben sich folgende Daten: Eine Tumorbildung wurde bei 23 von insgesamt 24 Kontrollmäusen beobachtet, die entweder parentale RCC-1 Zellen, die revertante Zellinie E15-del145F7 oder Zellinien injiziert bekamen, die mit anderen YACs als mit YAC 145F7-neo transduziert worden waren. Die mediane tumorfreie Überlebenszeit dieser Kontrollmäuse betrug 6,0 Wochen (Abb. 2). Im Gegensatz hierzu blieben 14 (61%) bzw. 13 (57%) der 23 Mäuse, die mit YAC 145F7-neo-transduzierten Zellinien injiziert waren, für einen Beobachtungszeitraüm von < 6 bzw. < 9 Monaten tumorfrei (p < 1 × 10^-5). Die mediane tumorfreie Überlebenszeit dieser Mäuse ist zum aktuellen Beobachtungszeitraum noch nicht erreicht (Abb. 2; p < 1 × 10^-5). Diese Ergebnisse zeigen somit entweder eine komplette Tumorsuppression oder - zumindest in einigen Tieren - eine hochsignifikante Verzögerung des Tumorwachstums und zeigen somit, daß das YAC 145F7 bzw. 145F7-neo ein neues, bislang noch nicht beschriebenes Tumorsuppressorelement enthält.

Tabelle 1

In vitro-Wachstumscharakteristika der parentalen RCC-1-Zellen und deren Abkömmlingen nach Transfer eines kompletten menschlichen Chromosoms 3 (Mikrozellfusionstransfer) bzw. des 3p14-spezifischen YAC 145F7-neo (Sphäroplastenfusionstransfer)

Tabelle 2

Tumorigenität von RCC-1-Zellen und ihren Abkömmlingen nach Transfer eines kompletten menschlichen Chromosoms 3 (Mikrozellfusionstransfer) bzw. des 3p14-spezifischen YACs 145F7-neo (Sphäroplastenfusionstransfer)

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Claims

1. Jedwede Nutzung der humanen Nukleinsäuresequenzen, zu ihnen syntener Sequenzen in anderen Spezies oder hierzu homologer Sequenzen, deren exprimierter cDNAs und jedweder von ihnen exprimierter Protein- oder Polypeptidprodukte sowie von ihnen abgeleitete Nukleinsäuren, Peptidnukleinsäuren (PNA), Peptide, Proteine oder Abkömmlinge oder Fragmente von ihnen oder gegen solche gerichtete Antikörper, Nukleinsäuresonden, Antisense-Konstrukte oder Oligonukleotide für die Polymerasekettenreaktion (PCR), die durch das humane genomische Insert des tumorsupprimierenden und eine zelluläre Seneszenz induzierenden künstlichen Hefechromosoms (yeast artificial chromosome) CEPH YAC 145F7 bzw. dessen Derivat YAC 145F7-neo repräsentiert werden. Ausgenommen hiervon sind die Exons 9 und 10 des benachbarten FHIT Gens, deren Nukleinsäureabkömmlinge und das FHIT-Protein und deren Abkömmlinge bzw. gegen sie gerichtete Antikörper, für die anderweitige Patentanmeldungen (WO9729119 sowie EP0892809) gelten.

2. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Nutzung prognostischen, diagnostischen oder therapeutischen Zwecken dient.

3. Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß es sich um prämaligne Gewebsveränderungen, Tumorerkrankungen oder andere Erkrankungen handelt, für die eine pathogenetische Beteiligung von Genen oder Nukleinsäuresequenzen der Chromosomenbande 3p14 nachgewiesen ist oder vermutet wird.

4. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das/die Proteine (ein) menschliche(s) Protein(e) ist/sind oder von einer anderen Spezies stammt/stammen.

5. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein Abkömmling des Proteins/der Proteine verwendet wird mit mindestens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren und mindestens einer der o. g. funktionellen Aktivitäten.

6. Anspruch 4 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß ein Protein oder Proteinabkömmling oder Proteinfragment verwendet wird mit der Eigenschaft, von spezifischen Antikörpern gebunden zu werden oder insgesamt eine mindestens 70%ige Homologie zu dem/den authentischen, van den in Anspruch 1 genannten Regionen kodierten Proteinen aufweist/en oder funktionell für das YAC 145F7 bzw. 145F7-neo identifizierten Aktivitäten enthalten.

7. Ansprüche 4, 5 und 6, gekennzeichnet dadurch, daß chimäre Proteine verwendet werden, deren Fremdanteile nicht van den in Anspruch 1 genannten Nukleinsäuresequenzen kodiert werden.

8. Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß poly-, oligo- oder monoklonale oder monospezifische Antikörper verwendet werden, die von unter Anspruch 1 genannten Nukleinsäuresequenzen kodierte und den Ansprüchen 4, 5, 6 und 7 genügende Proteine oder deren Abkömmlinge oder mutierte Formen davon erkennen.

9. Ansprüch 8, gekennzeichnet dadurch, daß jede, dem jeweils aktuellen Stand der Technik entsprechende Methodik verwendet werden kann (z. B. ELISA, Immunhistochemie, Immunzytochemie, Immunpräzipitation, Western-Blotting, Immunfluoreszenz, Immunaffinitätsverfahren, etc.).

10. Anspruche 8 und 9, gekennzeichnet dadurch, daß ein Molekül verwendet wird, das ein Antikörperfragment mit spezifischen variablen Sequenzen enthält und daneben beliebige andere Aminosäuresequenzen beinhalten kann.

11. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein Nukleinsäurefragment verwendet wird, das in YAC 145F7 bzw. 145F7-neo oder korrespondierenden menschlichen oder syntenen oder homologen genomischen Nukleinsäuren enthaltene Gene/Genabschnitte enthält.

12. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß von dem in YAC 145F7 bzw. 145F7-neo enthaltenen oder von korrespondierenden menschlichen oder homolgen bzw. syntenen genomischen Nukleinsäuren kodierte cDNA verwendet wird.

13. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine Nukleinsäurefragment, das in YAC 145F7 bzw. 145F7-neo oder korrespondierenden menschlichen oder homologen bzw. syntenen genomischen Nukleinsäuren enthaltene Gene/Genabschnitte in einen Expressionsvektor kloniert wird/werden.

14. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine in YAC 145F7 bzw. 145F7-neo enthaltene oder von korrespondierenden menschlichen oder homologen bzw. syntenen Nukleinsäuren abgeleitete cDNA in einen Expressionsvektor kloniert wird.

15. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein in YAC 145F7 bzw. 145F7-neo enthaltenes oder von korrespondierenden menschlichen oder homologen bzw. syntenen Nukleinsäuren oder deren cDNA abgeleitetes Nukleinsäurefragment für Hybridisierungsexperimente aller Art (z. B. Southern- oder Northern- oder Southwestern-Analysen) oder Analysen zur Nukleinsäure-Protein-Interaktion verwendet wird.

16. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß rekombinante humane oder nichthumane Zellen verwendet werden, die einen Vektor enthalten, in dem unter Ansprüchen 11, 12, 13 und 14 genannten Nukleinsäuresequenzen enthalten sind.

17. Anspruch 16, gekennzeichnet dadurch, daß solche Zellen zur Produktion, Aufreinigung und Verwertung von unter Ansprüchen 4, 5, 6 und 7 genanntem/n Protein(en) oder Polypeptiden verwendet werden.

18. Ansprüche 1, 16 und 17, gekennzeichnet dadurch, daß ein pharmazeutisches Präparat jedweder Art und Zusammensetzung hergestellt wird, das unter den Ansprüchen 11, 12, 13 und 14 genannten Nukleinsäuresequenzen enthält und/oder unter den Ansprüchen 4, 5, 6 und 7 genannten Proteine bzw. deren Abkömmlinge kodiert, die unter den Ansprüchen 8, 9 und 10 genannten Antikörper bzw. deren Abkömmlinge beinhaltet und für diagnostische und/oder therapeutische Zweck geprüft und verwendet werden kann.

19. Anspruch 18, gekennzeichnet dadurch, daß ein pharmazeutisches Präparat jedweder Art und Zusammensetzung hergestellt wird, das unter den Ansprüchen 8 und 10 beschriebene Komponenten enthält und für diagnostische und/oder therapeutische Zwecke geprüft und eingesetzt werden kann.

20. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Methoden entwickelt, geprüft und verwendet werden zum Screening auf, zur Prävention und/oder Behandlung einer Erkrankung dienen, die mit Chromosom 3p14.2-14.3-Aberrationen, entsprechend den durch das YAC 145F7 bzw. 145F7-neo repräsentierten Nukleinsäuresequenzen oder deren fehlregulierter Expression einhergehen.

21. Anspruch 20, gekennzeichnet dadurch, daß es sich um prämaligne Gewebsveränderungen, benigne Tumoren, hyperproliferative Gewebsveränderungen oder benigne dysproliferative Veränderungen, Gewebsveränderungen oder Erkrankungen mit fehlregulierter Zellzykluskontrolle, resultierend in Hyperproliferation, Hyperplasie oder Dysplasie, fehlregulierter Senszenzinduktion, Apoptose oder anderer Arten des physiologischen Zelltods handelt.

22. Anspruch 20, gekennzeichnet dadurch, daß es sich um maligne Erkrankungen/Tumorerkrankungen handelt.

23. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Methoden entwickelt, geprüft und eingesetzt werden, in denen Antisense-Nukleinsäurefragmente verwendet werden, die die Regulation und/oder Expression und/oder Funktion der Gene, Proteine oder deren Abkömmlingen oder mutierten Formen beeinflussen, die von durch das YAC 145F7 bzw. 145F7-neo repräsentierten oder homologe Nukleinsäuresequenzen kodiert werden.

24. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß durch das YAC 145F7 bzw. 145F7-neo repräsentierte oder homologe Nukleinsäuresequenzen zur homologen Rekombination verwendet werden.

25. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Methoden entwickelt, geprüft und verwendet werden, bei denen Oligonukleotide verwendet werden, die mit mindestens sechs Nukleotiden homolog sind zu durch das YAC 145F7 bzw. 145F7-neo repräsentierten oder homologen Nukleinsäuresequenzen und deren RNA und/oder cDNA-Abkömmlingen.

26. Anspruch 25, gekennzeichnet dadurch, daß diese Oligonukleotide in jedweder Form und/oder pharmazeutischen Zubereitung zu diagnostischen und/oder therapeutischen Zwecken eingesetzt werden.

27. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die zur Anwendung kommenden Nukleinsäuresequenzen als Peptidnukleinsäuren (PNA) vorliegen.

28. Anspruch 20, gekennzeichnet dadurch, daß die zu untersuchende Person ein Fötus, Kind oder Erwachsener sein kann.

29. Ansprüche 20 und 21, gekennzeichnet dadurch, daß bei diesen Untersuchungen in vitro translatierte RNA verwendet werden kann.

30. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Kits (Reagenzzusammenstellungen) hergestellt, geprüft und verwendet werden, die es erlauben, (a) Aberrationen der von YAC 145F7 bzw. 145F7-neo repräsentierten bzw. homologen Nukleinsäuresequenzen auf genomischer und RNA-Ebene sowie von ihnen kodierter Proteine und/oder Polypeptide und deren Abkömmlinge nachzuweisen, (b) Nukleinsäuren oder Abkömmlinge der von YAC 145F7 bzw. 145F7-neo repräsentierten bzw. homologen Nukleinsäuresequenzen, Proteine und/oder Polypeptide und deren Abkömmlinge sowie gegen sie gerichtete Antikörper und Abkömmlinge davon enthalten, die es erlauben, aberrante Zellproliferation und -differenzierung, Seneszenz, Tumorigenität und Apoptose zu beeinflussen.

31. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß methodische Ansätze entwickelt, geprüft und angewendet werden, die es erlauben, zelluläre Moleküle zu identifizieren, die mit Proteinen oder deren Abkömmlingen interagieren, die von YAC 145F bzw. 145F7-neo repräsentierten bzw. homologen oder syntenen Nukleinsäuresequenzen bzw. deren cDNAs oder Abkömmlingen kodiert werden.

32. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß rekombinante Tiere- sowie deren Nachkommen - erzeugt und/oder verwendet werden, in deren Genom von YAC 145F7 bzw. 145F7-neo repräsentierte bzw. homologe oder syntene Nukleinsäuresequenzen bzw. deren cDNAs oder Abkömmlinge eingebracht werden und von diesen kodierte Proteine/peptide oder deren Abkömmlinge exprimiert werden.