DE19921076A1 - Identifizierung eines neuen Tumorsuppressorlocus (NRC-2) in der Chromosomenbande 3p14.2 durch Nachweis einer tumorsupprimierenden und einer seneszenzinduzierenden Aktivität des YAC 145F7-neo - Google Patents
Identifizierung eines neuen Tumorsuppressorlocus (NRC-2) in der Chromosomenbande 3p14.2 durch Nachweis einer tumorsupprimierenden und einer seneszenzinduzierenden Aktivität des YAC 145F7-neoInfo
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Description
Aberrationen des kurzen Arms des Chromosoms 3 (3p) gehören bei menschlichen
Tumorerkrankungen zu den häufigsten genetischen Veränderungen und sind bei den
unterschiedlichsten Tumorentitäten zu finden. Hierzu gehören vor allem kleinzellige und
nichtkleinzellige Bronchialkarzinome, Nierenzellkarzinome, Kopf-Halskarzinome,
Zervixkarzinome, Mammakarzinome, Tumore des Gastrointestinaltrakts sowie männliche und
weibliche Genitaltumoren (1-15). Interessant ist dabei, daß diese Läsionen bereits sehr frühe
Ereignisse im Zuge einer malignen Transformation darstellen können; sie werden oft schon in
histologisch präneoplastischem Gewebe nachgewiesen, z. B. Hyperplasien/Dysplasien der
Bronchialschleimhaut, Barrett's Ösophagus und Leukoplakien der Mundschleimhaut (16-19).
Zahlreiche Untersuchungen an Tumorzellinien und primärem Tumormaterial konnten die 3p-
Aberrationen vorwiegend auf die humanen Chromosomenregionen (HCR) 3cen-p14, 3p21.1-p23
und 3p24-p26 eingrenzen (12, 20). Hierbei handelt es sich meist um hemizygote interstitielle
(Verlust der Heterozygotie, "loss of heterozygosity", LOH) oder terminale Allelverluste, bei
einigen Tumorzellinien auch um homozygote Deletionen (21, 22). Bei hereditären
Nierenzellkarzinomen wurden darüber hinaus zwei Translokationen t(3; 8) und t(3; 6) beschrieben,
deren Chromosom-3-spezifische Bruchpunkte in die Region 3p14.2 bzw. 3114.1-p13 kartiert
werden konnten (23-25). Mikrosatellitenanalysen bei Nierenzellkarzinomen zeigten ferner eine
Häufung von Allelverlusten in den Regionen 3p12-p13, 3p14 und 3p21 (20, 26-28). Eine weitere
Translokation t(3; 6), deren Bruchpunkt ebenfalls in der Region 3p14 liegt, ist mit hämatologischen
Systemerkrankungen assoziiert (29). Darüber hinaus enthält die Region 3p14.2 die fragilste
Region des menschlichen Genoms, FRA3B (30-31). Diese Befunde deuten darauf hin, daß in den
genannten Chromosomenabschnitten Tumorsuppressorgene lokalisiert sein könnten.
Diese Annahme konnte durch funktionelle Daten untermauert werden. So ließ sich der tumorigene
Phänotyp von Nierenkarzinomzellinien mit 3p-Verlusten durch mikrozellvermittelten Transfer
eines normalen Chromosoms 3 supprimieren (32). In Harnblasenkarzinomzellinien wurden
interstitielle Deletionen im Bereich 3p13-p14.2 beschrieben. Nach Suppression durch ein
komplettes Chromosom 3 wiesen maligne Revertanten solcher Zellinien Verluste in der Region
3p13-p21 auf (33). Bei der Maus-Fibrosarkomzellinie A9 konnte durch Einbringen eines 2 Mb
großen Chromosomenfragments mit Sequenzen aus der Region 3p21 eine Reversion induziert
werden (34). Funktionelle Evidenz für die Präsenz von Tumorsuppressoraktivität in der Region
3p12 ergibt sich aus Befunden, wonach das tumorigene Wachstum einer humanen
Nierenkarzinomzellinie in Nacktmäusen durch die Präsenz dieses Chromosomenabschnitts
supprimiert wird (35, 36).
In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von C. Reznikoff, University of Wisconsin, Madison, USA,
haben wir in früheren Untersuchungen die Region kleinster gemeinsamer 3p-Deletionen bei
immortalen humanen Uroepithelialzellen (HUEZ) kartiert. HPV-16 E6 immortalisierte HUCs
weisen als konsistenteste, frühe genetische Alteration zytogenetisch erkennbare Deletionen im
Bereich des kurzen Arms von Chromosom 3 auf. Unter Berücksichtigung einer interstitiellen
Deletion in einer E7-immortalisierten HUEZ-Linie wurde der Bereich der kleinsten gemeinsamen
Überlappung dieser Deletionen in die Region 3p13-p14 kartiert (37). Diese Arbeiten dienten der
Lokalisierung eines in dieser Region vermuteten Seneszenzgens, das an der Immortalisierung o. g.
HUEZ maßgeblich beteiligt zu sein scheint (38).
Aus HCR 3p25 und 3p21 wurden bislang zwei Gene kloniert, die in Tumoren Mutationen
aufweisen. Für das in der Region 3p25.5 lokalisierte von-Hippel-Lindau (VHL-)Gen wurde
tumorsupprimierende Aktivität bereits experimentell bestätigt (39, 40). Das Proteinprodukt des in
der Region 3p21 lokalisierten MLH1-Gens ist an DNA-"Mismatch"-Reparaturprozessen beteiligt;
seiner funktionellen Inaktivierung wird eine Rolle bei der Pathogenese der hereditären Polyposis
coli (HNPCC) zugeschrieben (41, 42). Aus der Region 3p21 wurden putative Kandidatengene
isoliert, ohne daß deren Funktion als Tumorsuppressorgene bislang nachgewiesen wurde. Hierzu
gehört das UBE1L-1-Gen aus einer Subregion von 3p21, die in zwei Lungenkarzinomzellinien
homozygot deletiert ist (43). Mutationen dieses Gens in primärem Tumormaterial wurden jedoch
nicht gefunden. Gleiches gilt für das 3pk-Gen aus 3p21 (44).
Aus der von uns bearbeiteten HCR 3p14 wurden zwei mögliche Kandidatengene isoliert, für die
bisher jedoch keine tumorsupprimierende Aktivität nachgewiesen oder wahrscheinlich gemacht
werden konnte; so beispielsweise das HRCA-1-Gen, das dem oben erwähnten t(3; 8)-
Translokationsbruchpunkt in 3p14.2 benachbart ist (45); ferner das in 3p14.2 kartierte
Proteinphosphatase-gamma-Gen (46, 47). Mit Hilfe einer homozygoten Deletion in der Region
3p14.2, die zunächst in Tumorzellinien vornehmlich gastrointestinalen Ursprungs gefunden wurde,
konnte kürzlich das FHIT-Gen isoliert werden, dessen Proteinprodukt Homologien zu der
5', 5'''P1,
P4-Tetraphosplat-asymmetrischen Hydrolase von S. pombe aufweist. Das Gen überlappt sowohl
mit der FRA3B-Region als auch dem mehrfach erwähnten t(3; 8)-Translokationsbruchpunkt
hereditärer Nierenzellkarzinome. In gastrointestinalen Tumoren, in Bronchial- und
Mammakarzinomen, können bei einem Teil der Tumoren FHIT-Genmutationen nachgewiesen
werden. In Nierenzellkarzinomen waren Alterationen dieses Gens bislang nur sporadisch
nachweisbar (48-55). Bisherige Experimente lassen erkennen, daß das FHIT-Gen
tumorsupprimierende Eigenschaften aufweisen kann (56). Eine seneszenzinduzierende Aktivität
wurde bislang nicht publiziert. Eine Inaktivierung des FHIT-Gens kann nach vorliegenden Daten
auch durch transkriptionelle Herunterregulation erfolgen (57). Ein weiteres Gen mit
tumorsupprimierender und telomerasesupprimierender Aktivität, WNT-5A, wurde in der Region
3p14.3=21.1 identifiziert (58-60). Seine Bedeutung für die Pathogenese menschlicher Tumoren ist
bislang ungeklärt. Ein putativer Telomeraseinhibitor wurde kürzlich in die Region
3p14.2-21.1
kartiert (61-63). Dessen Bedeutung für die Pathogenese menschlicher Tumoren ist bislang
ebenfalls ungeklärt.
Die bisher identifizierten, o. g. Aberrationen in der Chromosomenregion 3p13-21.1 liegen in einem
großen, mehr als 30 Mbp umfassenden genomischen Bereich. Die Ergebnisse bisheriger LOH-
Analysen lassen vermuten, daß außer den o. g., bisher identifizierten Genen weitere Gene mit
tumorsupprimierender Aktivität in dieser Region lokalisiert sind. Ferner konnten bislang
Aberrationen der o. g., nachgewiesenen oder putativen Suppressorgene nur bei einigender von 3p-
Aberrationen betroffenen Tumorentitäten nachgewiesen werden (20, 55, 73). Somit ergibt sich
bislang kein einheitliches Modell, mit dem die Tumorigenese erklärt und mögliche diagnostische
und therapeutische Ansatzpunkte bei von 3p-Aberrationen betroffenen Tumoren entwickelt und
verfolgt werden können. Ferner fehlen bislang eindeutige Marker für die Diskrimination von
Normalgewebe und präneoplastischen Geweben sowie für den Übergang zu manifesten Tumoren
(16, 17, 19). Insbesondere nachteilig ist, daß bislang den meisten durch bekannte genomische
Marker repräsentierten Regionen keine Funktion zugeordnet werden kann.
Unser Ziel war es daher, durch den systematischen Transfer von künstlichen Hefechromosomen
(yeast artiflcial chromosomes, YACs) mit Inserts humaner genomischer DNA aus der
Chromosomenbande 3p14 in Tumorzellen solche Regionen zu identifizieren, die Gene mit
tumorsupprimierender, seneszenzinduzierender, zum Proliferationsarrest oder
Proliferationsverlangsamung oder zum Zelltod führender und/oder telomeraseinhibierender
Funktion enthalten. Dieser Ansatz soll ermöglichen, die für die Pathogenese von Tumoren bzw.
präneoplastischen Geweben mit 3p-Aberrationen funktionell relevanten Chromosomenabschnitte
zu definieren. Da solche 3p-Aberrationen in hoher Frequenz bei zahlreichen menschlichen
Tumoren höher Inzidenz gefunden werden, können sich mit Hilfe diese Kenntnisse möglicherweise
vielversprechende Perspektiven für die Entwicklung und Anwendung spezifischer diagnostischer
und prognostisch relevanter Testverfahren sowie therapeutisch relevante
Anwendungsmöglichkeiten bei einer großen Zahl prädisponierter Personen oder betroffener
Patienten ergeben.
Als Voraussetzung für die Durchführung dieses Vorhabens haben wir die Chromosomenbande
3p14 und angrenzende Bereiche aus den Banden 3p13 und 3p21.1 in Form eines sog. YAC-
"Contigs" kloniert (64-66), dessen Einzelklone vom Centre d'Etude du Polymorphisme Humain
(CEPH), Paris, zur Verfügung gestellt wurden (67). Diese Arbeiten sind in den Referenzen
(64-66) beschrieben. Zur möglichen Eingrenzung der funktionell relevanten Chromosomenregion
wurde im weiteren die Region kleinster gemeinsamer 3p-Deletionen bei immortalen humanen
Uroepithelialzellen (HUCs) in die Region 3p13-p14 kartiert (37). Als nächstes wurden die YACs
in Vorbereitung des Transfers in menschliche Tumorzellen durch homologe Rekombination
("retrofitting") mit einem Neomycin-Resistenzgen versehen (68), das eine Selektion erfolgreich
transduzierter Zellen in antibiotikahaltigen Medien erlaubt. Diese YACs wurden/werden mittels
der Technik der Sphäroplastenfusion in eine menschliche Nierenkarzinomzellinle eingebracht, die
eine Aberration auf dem kurzen Arm des Chromosoms trägt. Diese Arbeiten sind in der Referenz
(69) beschrieben. Nach erfolgtem YAC-Transfer wurden/werden das Proliferationsverhalten der
Tumorzellen, die Seneszenzinduktion und eine mögliche Telomerase-Suppression in vitro sowie
die Tumorigenität der Zellen in vivo im Nacktmausmodell geprüft.
Mit diesem experimentellen Ansatz ist es gelungen, ein klar abgrenzbares menschliches
genomisches Nukleinsäurefragment, repräsentiert durch das Nukleinsäureinsert des vom CEPH-
YAC 145F7 abgeleiteten YAC 145F7-neo, zu identifizieren, dessen Transfer in die verwendete
Nierenkarzinomzellinie, RCC-1, zur Seneszenzinduktion in vitro und darauffolgend zum
Absterben dieser Tumorzellen in vitro führte. Darüber hinaus konnte in mehreren Versuchsreihen
durch Transfer dieses YACs eine statistisch hochsignifikante Suppression der Tumorigenität
transduzierter Tumorzellen im Nacktmausmodell nachgewiesen werden. Die Entdeckung definiert
somit einen klar umschriebenen, relativ kleinen Genomabschnitt von nur 530 kbp, der ein Gen
oder Gene mit o. g. Funktionen enthält, und zukünftig eine diagnostische, progiostische und/oder
therapeutische Relevanz erlangen könnte. Diese Möglichkeiten sind in den Ansprüchen der
Erfindung/Entdeckung aufgeführt und könnten eine Vielzahl für eine mögliche Tumorentstehung
prädisponierter Personen oder von manifesten Tumoren betroffene Patienten betreffen.
Humane Genomabschnitte mit tumorsupprimierender Aktivität sollten durch den Transfer
künstlicher Hefechromosomen (yeast artiflcial chromosomes, YACs) in eine humane
Nierenkarzinomzellinie, RCC-1, identifiziert werden. Grundlage für diese Experimente ist ein sog.
YAC-"Contig", dessen Einzelklone vom Centre d'Etude du Polymorphisme Humain (CEPH),
Paris, zur Verfügung gestellt wurden und das die Chromosomenbande 3p14 sowie benachbarte
Regionen der Banden 3p13 und 3p21.1 umfaßt. Die YACs werden mit einem eukaryontischen
Selektionsmarker (neoR) versehen ("retrofitting") und mittels Sphäroplastenfusion in die
Tumorzellen eingebracht. Transduzierte Zellen werden selektioniert, expandiert und überprüft
bezüglich Proliferationsverhalten in Kultur, Seneszenzinduktion und Suppression der
Telomeraseaktivität in vitro sowie ihrer Tumorigenität im Nacktmausmodell in vivo. Mit dieser
Methodik ist es gelungen, ein ca. 530 kbp großes YAC, 145F7 bzw. 145F7-neo, zu identifizieren,
dessen Transfer in die RCC-1-Zellen zur Seneszenzinduktion und darauffolgendem Absterben der
Zellen in vitro führte. In vivo zeigten transduzierte Zellen eine hochsignifikante Suppression der
Tumorigenität. Weitere Einzelheiten zu den verwendeten Methoden und Arbeitsmaterialien und
Ergebnissen sind im beiliegenden, bisher unveröffentlichten Manuskript mit dem Titel
"Identification of a novel tumor suppressor gene locus in human chromosome region 3p14.2"
(Autoren: Knut Jülicher, Guido Marquitan, Nicola Werner, Walter Bardenheuer, Lydia Vieten,
Frank Bröcker, Hüsnü Topal, Siegfried Seeber, Bertram Opalka und Jochen Schütte) enthalten
und beschrieben.
Dieses YAC repräsentiert somit einen mittels funktioneller Komplementationsanalyse neu
identifizierten Nukleinsäure-/Genomabschnitt (Locus), der die vorläufige Arbeitsbezeichnung
"NRC-2" (non-papillary renal cell carcinoma-2) von uns erhalten hat und in dem ein Gen oder
mehrere Gene lokalisiert sind, deren Produkte seneszenzinduzierende und/oder
tumorsupprimierende Aktivität aufweisen. Die Analyse dieses(r) Gens(e) und ihres(r) Produkts(e)
oder gegen sie gerichtete Nukleinsäure- oder Antikörpermoleküle eröffnet Perspektiven für neue
diagnostische, prognostische und/oder therapeutische Anwendungen bei einer Vielzahl
menschlicher Tumorentitäten und Präneoplasien, die mit Chromosom 3p14.2-spezifischen
Aberrationen assoziiert sind. Ziel dieser Patentanmeldung ist es, jedwede kommerzielle Nutzung
der Gene, die in der durch das YAC 145F7 bzw. 145F7-neo repräsentierten Genomregion oder zu
ihr homologer bzw. syntener Regionen lokalisiert sind, deren cDNAs oder der Proteinprodukte
oder Abkömmlingen davon sowie gegen sie gerichteter Nukleinsäuren, Peptidnukleinsäuren,
Antikörper oder Peptide sowie deren Nutzung in transgenen Tieren patentrechtlich zu schützen.
Die Bezeichnung des YACs 145F7 entspricht der ursprünglichen YAC-Koordinate des CEPH,
Paris. Dieses YAC, sein Chimeritätsstatus (nichtchimär) und sein STS (sequence tagged site)
D3S1384 wurden zuvor von uns beschrieben (65). Der Transfer des von uns in einem Vektorarm
derivatisierten YACs 145F7-neo in RCC-1-Zellen wurde ebenfalls durch unsere Arbeitsgruppe
beschrieben (69). Die Daten funktioneller Analysen, die die Grundlage für die vorliegende
patentrechtliche Anmeldung bilden, wurden bislang nicht veröffentlicht (s. o.).
Die genannte Erfindung (Entdeckung) wurde im Rahmen eines von der Deutschen
Forschungsgemeinschaft, Bonn, and der Stiftung VerUm, München, geförderten Projekts
gemacht.
Die Nierenkarzinomzellinien RCC-1 wurde von Dr. T. Ebert, Universitätsklinikum Düsseldorf, zur
Verfügung gestellt. Die Zellen sind immortal, bilden keine Kolonien in Weichagar, zeigen unter
normalen Kulturbedingungen keine Seneszenz in vitro und sind tumorigen in Nacktmäusen, wobei die
Tumore histopathologisch humanen klarzelligen Nierenzellkarzinomen entsprechen. GM11713 ist eine
A9-Maus-Fibrosarkomzellinie, die ein pSV2neo-markiertes humanes Chromosom 3 aus Fibroblasten
enthält (NIGMS, NJ, USA). Alle Zellinien wie auch die RCC-1-Derivate wurden als
Monolayerkulturen in Dulbeccos Modifikation von Eagles Medium (DMEM) gehalten, das mit 10%
fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin supplementiert wurde. Zur Selektion wurden die
Zellen in Medium kultiviert, das 500 µg/ml aktives G418 (Life Technologies, Eggenstein, Germany)
enthielt.
Zur Bestimmung der Proliferationsrate und der Sättigungsdichte der parentalen RCC-1-Zellen und
ihrer Derivate wurden 2 × 105 Zellen in 75 cm2-Kulturflaschen ausgesät und die Zellen täglich über einen
Zeitraum von 12 Tagen in Quadruplikaten ausgezählt. Die Verdopplungszeit wurde aus dem
logarithmischen Teil der Wachstumskurve ermittelt. Die Sättigungsdichte wurde definiert als die
Anzahl der Zellen pro cm2 bei Erreichen der Konfluenz.
Es wurde eine modifizierte Methode von Fournier und Ruddle (70) angewendet. GM11713-Zellen
wurden zu 90% Konfluenz kultiviert und mit 0,2 µg/ml Colcemid (Life Technologies) für 48 h
behandelt. Mikronuklei wurden danach geerntet, indem die Flaschen mit vorgewärmtem Medium, das
10 µg/ml Cytochalasin B (Sigma, Deisenhofen, Germany) enthielt, aufgefüllt und die Mikronuklei in
einem JA-14-Festwinkelrotor in einer J2-21-Zentrifuge (Beckman, Düsseldorf) bei 24000 × g für 75 min
bei 34°C abzentrifugiert wurden. Die Mikrozellen wurden in DMEM resuspendiert und seriell
durch 8 µm-, 5 µm- und 3 µm-Polycarbonatmembranen (Nucleopore, Tübingen, Germany) filtriert.
Die filtrierten Mikrozellen wurden auf die adhärenten Rezipientenzellen zusammen mit 100 µg/ml
Phytohemagglutinin-P (Boehringer-Mannheim, Mannheim) gegeben und anschließend mit 50% PEG
1500 (Boehringer-Mannheim) und 10 mM CaCl2 in serumfreiem Medium bei 37°C inkubiert. Nach 1
minütiger Inkubation wurden die Zellen 1 : 2 mit nichtsupplementiertem DMEM verdünnt. Nach 5 min
wurden die Zellen zweimal mit nichtsupplementiertem DMEM gewaschen und nach 48 h in
Selektionsmedium kultiviert.
Die Sphäroplastenfusion und die FISH wurden wie anderweitig beschrieben durchgeführt, wobei
das nichtchimäre YAC 145F7 bzw. 145F7-neo und andere YACs aus der Chromosomenbande
3p14 verwendet wurden (64, 65, 69).
Die Messung der β-Galactosidaseaktivität wurde wie beschrieben durchgeführt (71). Die Zellen
wurden mit Formalin : Glutaraldehyd fixiert, mit phosphatgepufferter Saline (PBS) gewaschen und für
16 h in β-Galactosidase-Färbelösung inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen
und seneszierende, angefärbte Zellen am Umkehrmikroskop bestimmt.
Zur Bestimmung der Tumorigenität in vivo wurden 4 × 106 (Microzellfusionszellen und
Sphäroplastenfusionsserie I) oder 1 × 107 Zellen (Sphäroplastenfusionsserien II and III) subkutan
zwischen die Schulterblätter oder in die Flanke 4-6 Wochen alter weiblicher NMRI-Nacktmäuse
injiziert. Die Tiere wurden wöchentlich, nach Bedarf auch häufiger, auf Tumorbildung hin untersucht.
Tumore wurden entnommen, gewogen und vermessen und in den meisten Fällen in Kultur etabliert.
Die Telomeraseaktivität der RCC-1-Zellen und ihrer Derivate wurde wie beschrieben gemessen
(72).
Zur Berechnung der Signifikanz der unterschiedlichen Tumorinzidenz parentaler RCC-1-Zellen und
ihrer Derivate, die das YAC 145F7-neo. enthielten, wurde der 'two-tailed Fisher's exact'-Test
verwendet. Das tumorfreie Überleben der Mäuse wurde mit der Kaplan-Meier-Methode berechnet. Der
Vergleich der Überlebenskurven erfolgte mit dem 'log-rank'-Test (SPSSS-Software, 7.0, SPSS Inc.,
USA).
Die parentalen RCC-1-Zellen sind immortal, weisen keine Seneszenz in vitro auf und sind tumorigen in
Nacktmäusen. Typische Wachstumscharakteristika dieser Zellen in vitro sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Zytogenetisch zeigten diese Zellen einen annähernd tetraploiden Karyotyp mit interstitiellen Deletionen
im Chromosomenbereich 3p13-25, Additionen unbekannten Materials am kurzen Arm von
Chromosom 7 und Deletionen in der Chromosomenbande 11p11.2 (T. Ebert, persönliche Mitteilung).
In späteren Passagen in unserem Labor zeigten die Zellen einen triploiden Karyotyp mit Deletionen in
1p, 3p und 11p sowie Additionen an 11p. Durch FISH mit einer Chromosom 3-zentromerspezifischen
Sonde ließen sich drei Chromosomen 3 in < 85% der Zellen nachweisen, wobei eine Kopie dieses
Chromosoms eine Deletion auf dem kurzen Arm in einer Region aufwies, die zum YAC 145F7
korrespondiert (69). Diese Zellen wurden für die Microzellfusionen und die Sphäroplastenfusionsserie I
verwendet (Tabelle 2). Weitere FISH-Analysen derjenigen Zellen, die für die
Sphäroplastenfusionsserien II und III verwendet wurden, zeigten einen Verlust des deletierten
Chromosoms 3 in den meisten untersuchten Meta- und Interphasen (Daten nicht gezeigt).
Um zu zeigen, daß der tumorigene Phänotyp der parentalen RCC-1-Zellen durch Chromosom 3-
Sequenzen revertiert werden kann, wie es für andere Nierenzellkarzinomzellinien beschrieben ist,
wurde ein aus normalen Fibroblasten stammendes, mit einem Neomycin- (neoR)-Resistenzgen
markiertes Chromosom 3 aus der GM11713-Mauszellinie durch Mikrozellfusion in RCC-1-Zellen
eingebracht. Kontrollexperimente wurden mit RCC-1-Zellen durchgeführt, die mit dem Plasmid
pSV2Neo transfiziert worden waren. Aus zwei Mikrozellfusionsexperimenten wurden nach zwei bis
drei Wochen Kultivierung in Selektionsmedium 10 unabhängige G418-resistente Kolonien isoliert. Vier
dieser Klone wurden näher analysiert (Tabelle 1). Der Transfer des neoR-markierten Chromosoms 3 in
den Klon MF1-1 wurde durch Zweifarben-FISH mit einer Chromosom 3-spezifischen Zentromersonde
und einer neoR-spezifischen Sonde nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). Die in vitro-
Wachstumscharakteristika der, RCC-1-Mikrozellhybride sind in Tabelle 1 dargestellt. Die
Sättigungsdichten aller Hybridzellinien waren niedriger (8-9 × 104 Zellen/cm2) als die der
Parentalzellinie (14 × 104 Zellen/cm2). Während der exponenziellen Wachstumsphase hatten die
Mikrozellhybride Verdopplungszeiten (Generationszeiten) von 62-73 h im Gegensatz zu den 41 h, die
bei den RCC-1-Zellen beobachtet wurden. Der Transfer der pSV2Neo-Plasmid-DNA hatte keinen
meßbaren Effekt auf die in vitro-Wachstumsrate. Ein revertanter Subklon der MF1-1-Zellinie, MF1-
1del3p, hatte den größten Teil des kurzen Arms des eingebrachten Chromosoms 3 verloren, wie durch
FISH gezeigt werden konnte. MF1-1de13p-Zellen hauen eine Sättigungsdichte von 12 × 104 Zellen/cm2
und eine Generationszeit von 42 h, Werte, die mit denen der Parentalzellinie vergleichbar sind.
RCC-1-Hybridzellen mit einem zusätzlichen Chromosom 3 stellten die Proliferation nach 13-15
Passagen ein und starben anschließend ab. Ungefähr eine Woche zuvor ließ sich in ihnen die
seneszenzassoziierte β-Galactosidaseaktivität nachweisen. Im Gegensatz hierzu proliferierten parentale
RCC-1-Zellen, mit dem neoR-Gen transfizierte RCC-1-Zellen und MF1-1del3p-Zellen weiter und
zeigten keine seneszenzassoziierte β-Galactosidaseaktivität (Abb. 1). Die Tumorigenität in vivo
wurde bei zwei Hybridklonen überprüft. Im Gegensatz zu Kontrollzellen bildeten sie keine Tumore
über einen Zeitraum von 9 Monaten nach Injektion der Zellen (Tabelle 2). Diese Daten zeigen, daß der
maligne Phänotyp der Nierenkarzinomzellinie RCC-1 durch Chromosom 3-Sequenzen revertiert
werden kann.
Von 7 CEPH-YACs aus der Chromosomenregion 3p13-21.1, die mittels Sphäroplastenfusion nach
Einbringen des Neomycin-Resistenzgens in den YAC-Vektorarm (retrofitting; resultierend in
YAC 145F7-neo) in RCC-1 Zellen transferiert wurden, ergab das YAC 145F7-neo während der
ersten in vitro-Analysen Hinweise auf eine Hemmung der Zellproliferation und wurde
weitergehend untersucht. Die Dokumentation der YAC-Integration erfolgte mittels Fluoreszenz
in-situ-Hybridisierung (FISH) (69). Insgesamt wurden drei unabhängige Sphäroplastenfusionen
mit YAC 145F7-neo durchgeführt. Aus der ersten Serie (I) wurden vier individuelle Zellinien
etabliert (7A, 20E, 11L, 20R) und hinsichtlich ihres Wachstums-/Proliferationsverhaltens in vitro
analysiert (Tabelle 1). Drei dieser Klone (7A, 20E, 20R) sowie zwei (A1.4 und A33) bzw. drei
Klone (B1, B8, B12) der Fusionsserien II bzw. III wurden in Tumorigenitätsversuchen in vivo
analysiert (Tabelle 2).
Veränderungen der Zellmorphologie konnten mikroskopisch bei keiner der neun Zellinien
beobachtet werden, die das YAC 145F7-neo enthielten. Die Sättigungsdichte und die zelluläre
Verdopplungszeit in vitro wurden bei vier Zellinien (Tabelle 1) bestimmt und zeigten eine höhere
Verdopplungszeit (54-65 h) und eine geringere Sättigungsdichte (11-12 × 104 Zellen/cm2) als
parentale RCC-1 Kontrollzellen und RCC-1 Kontrollzellen, die nach Transfektion das Neomycin.-
Resistenzgen enthielten (Verdopplungszeit: 40-41 h; Sättigungsdichte: 14 × 104 Zellen/cm2). Eine
revertante Zellinie (E15-del145F7), die während der Kultivierung das transferierte YAC 145F7-
neo mit Ausnahme des rechten Vektorarms verloren hatte, zeigte eine den parentalen RCC-1
Zellen vergleichbare Verdopplungszeit und Sättigungsdichte (Tabelle 1).
Ein Proliferationsarrest wurden bei allen vier Zellinien der Fusionsserie I nach 12-13
Kultivierungspassagen, entsprechend ca. 80-90 Tagen nach Sphäroplastenfusion, beobachtet
(Tabelle 1). Nachfolgend starben diese Zellen innerhalb einer Woche ab. Dieses Ergebnis wurde in
zehn unabhängigen Experimenten für alle vier Zellinien mit intermittierend kryokonservierten
Zellpassagen reproduziert. Vergleichbar unseren Ergebnissen, die nach Transfer eines kompletten
Chromosoms 3 mittels Mikrozellfusion erzielt wurden, wurde etwa eine Woche vor Absterben der
Zellen eine Induktion der seneszenzassoziierten β-Galaktosidase beobachtet (Abb. 2). Nach
etwa 60 Tagen nach Sphäroplastenfusion war ein solcher Effekt in diesen Zellinien sowie in
parentalen RCC-1-Kontrollzellen und in der revertanten Zellinie E15-del145F7 nicht nachweisbar.
In den später etablierten Zellinien der Fusionsserien II und III, die eine zunehmende genetische
Instabilität gegenüber denen der Fusionsserie I aufwiesen, wurden eine Induktion der
seneszenzassoziierten β-Galaktosidase sowie ein Proliferationsarrest der Zellen nicht beobachtet.
Wir bestimmten die Telomerase-Aktivität der parentalen RCC-1-Zellen sowie der Zellinie MF1-1
(Passage 13), in die ein komplettes menschliches Chromosom 3 mittels Mikrozellfusion
eingebracht worden war und die eine Senesenzinduktion und einen Proliferationsarrest in vitro
zeigte. Eine Reduktion der Telomerase-Aktivität in der Zellinie MF1-1 wurde - verglichen mit der
parentalen RCC-1-Zellinie sowie mit 293-Zellen (als Positivkontrolle) nicht verzeichnet. Daraus
resultiert, daß ein möglicher telomeraseinhibierender Effekt des YAC 145F7-neo zwar vorhanden,
in diesem Zellsystem aber nicht analysiert werden kann (Daten hier nicht aufgeführt).
Tumorigenitätsanalysen im Nacktmausmodell wurden für acht Zellinien vorgenommen, die aus den
drei unabhängigen Sphäroplastenfusionen etabliert wurden (Tabelle 2). In der ersten
Tierexperimentserie, bestehend aus den Zellinien 7A, 20E und 20R der Fusionsserie I wurden
subkutan 4 × 106 Zellen in die Schulter-/Nackenpartie athymischer Mäuse (nu/nu) injiziert. In der
zweiten Serie von Tierexperimenten wurden jeweils 1 × 107 Zellen in die Flanke der Mäuse injiziert.
Diese Serie beinhaltet fünf Zellinien der Sphäroplastenfusionen II (A1.4, A33) und III (B1, B8,
B12; siehe oben).
In der ersten Tierexperimentserie wurde bei keiner der Mäuse, die die Zellinien 7A, 20E und 20R
(Tabelle 2) injiziert bekamen, eine Tumorbildung innerhalb eines Beobachtungszeitraums von 9
Monaten nachgewiesen. Demgegenüber entwickelten alle Kontrollmäuse (n=4), in die parentale
RCC-1-Zellen oder die revertante Zellinie E15-del145E7 injiziert wurden, Tumoren innerhalb
eines medianen Beobachtungszeitraums von 64 Tagen (Bereich: 64-77 Tage; p < 1 × 10-4; Tabelle
2).
In der zweiten Tierexperimentserie entwickelten neunzehn von zwanzig Mäusen, die
Kontrollzellen injiziert bekamen, einen Tumor innerhalb eines medianen Beobachtungszeitraums
von 42 Tagen (Bereich: 25-56 Tage): Tumoren bei Tieren mit parentalen RCC-1-Zellen: 14/15
Mäuse; Tumoren bei Tieren mit Zellinien, die mit anderen YACs als mit YAC 145F7-neo
transduziert waren: 5/5 Mäusen (Daten nicht aufgeführt). Von den Tieren, die eine der
YAC 145F7-neo-transduzierten Zellinien A1.4, A33, B1, B8 und B12 erhielten, waren 14/15
Mäusen für die Entstehung von Tumorwachstum evaluierbar. Eine Maus (B8) wurde als nicht
evaluierbar angesehen, da sie in Woche 13 einen "Tumor" entwickelte, der sich bei der versuchten
Dissketion als vollständig zystisch erwies und am ehesten als Ausdruck eines Seroms gedeutet
wurde. Drei Mäuse mußten nach Beobachtungszeiträumen von 11 (B12), 20 (A1.4) und 31 (A1.4)
Wochen infolge anderer, nicht tumorbezogener Ursachen getötet werden. Nach einem
Beobachtungszeitraum von 36 Wochen für die verbliebenen Tiere waren 4 Mäuse tumorfrei.
Diejenigen Tumoren, die sich ausbildeten, waren nach einer medianen Latenzzeit von ca. 13
Wochen (Bereich 8-28 Wochen) erkennbar.
Beide Tierexperimentserien zusammenfassend ergeben sich folgende Daten: Eine Tumorbildung
wurde bei 23 von insgesamt 24 Kontrollmäusen beobachtet, die entweder parentale RCC-1 Zellen,
die revertante Zellinie E15-del145F7 oder Zellinien injiziert bekamen, die mit anderen YACs als
mit YAC 145F7-neo transduziert worden waren. Die mediane tumorfreie Überlebenszeit dieser
Kontrollmäuse betrug 6,0 Wochen (Abb. 2). Im Gegensatz hierzu blieben 14 (61%) bzw. 13
(57%) der 23 Mäuse, die mit YAC 145F7-neo-transduzierten Zellinien injiziert waren, für einen
Beobachtungszeitraüm von < 6 bzw. < 9 Monaten tumorfrei (p < 1 × 10-5). Die mediane
tumorfreie Überlebenszeit dieser Mäuse ist zum aktuellen Beobachtungszeitraum noch nicht
erreicht (Abb. 2; p < 1 × 10-5). Diese Ergebnisse zeigen somit entweder eine komplette
Tumorsuppression oder - zumindest in einigen Tieren - eine hochsignifikante Verzögerung des
Tumorwachstums und zeigen somit, daß das YAC 145F7 bzw. 145F7-neo ein neues, bislang noch
nicht beschriebenes Tumorsuppressorelement enthält.
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71. Dimri, G. P., Lee, X., Basile, G., et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9363-9367
72. Kim, N. W., Piatyszek, M. A, Prowse, K. R., et al. (1994) Science 266: 2011-2015
73. Orikasa, K., Orikasa, S., Horii, A. (1998) Cancer Genet. Cytogenet. 104: 104-110
Claims (32)
1. Jedwede Nutzung der humanen Nukleinsäuresequenzen, zu ihnen syntener Sequenzen in
anderen Spezies oder hierzu homologer Sequenzen, deren exprimierter cDNAs und
jedweder von ihnen exprimierter Protein- oder Polypeptidprodukte sowie von ihnen
abgeleitete Nukleinsäuren, Peptidnukleinsäuren (PNA), Peptide, Proteine oder
Abkömmlinge oder Fragmente von ihnen oder gegen solche gerichtete Antikörper,
Nukleinsäuresonden, Antisense-Konstrukte oder Oligonukleotide für die
Polymerasekettenreaktion (PCR), die durch das humane genomische Insert des
tumorsupprimierenden und eine zelluläre Seneszenz induzierenden künstlichen
Hefechromosoms (yeast artificial chromosome) CEPH YAC 145F7 bzw. dessen Derivat
YAC 145F7-neo repräsentiert werden. Ausgenommen hiervon sind die Exons 9 und 10 des
benachbarten FHIT Gens, deren Nukleinsäureabkömmlinge und das FHIT-Protein und
deren Abkömmlinge bzw. gegen sie gerichtete Antikörper, für die anderweitige
Patentanmeldungen (WO9729119 sowie EP0892809) gelten.
2. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Nutzung prognostischen, diagnostischen
oder therapeutischen Zwecken dient.
3. Anspruch 2, gekennzeichnet dadurch, daß es sich um prämaligne Gewebsveränderungen,
Tumorerkrankungen oder andere Erkrankungen handelt, für die eine pathogenetische
Beteiligung von Genen oder Nukleinsäuresequenzen der Chromosomenbande 3p14
nachgewiesen ist oder vermutet wird.
4. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das/die Proteine (ein) menschliche(s) Protein(e)
ist/sind oder von einer anderen Spezies stammt/stammen.
5. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein Abkömmling des Proteins/der Proteine
verwendet wird mit mindestens 10 aufeinanderfolgenden Aminosäuren und mindestens
einer der o. g. funktionellen Aktivitäten.
6. Anspruch 4 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß ein Protein oder Proteinabkömmling oder
Proteinfragment verwendet wird mit der Eigenschaft, von spezifischen Antikörpern
gebunden zu werden oder insgesamt eine mindestens 70%ige Homologie zu dem/den
authentischen, van den in Anspruch 1 genannten Regionen kodierten Proteinen aufweist/en
oder funktionell für das YAC 145F7 bzw. 145F7-neo identifizierten Aktivitäten enthalten.
7. Ansprüche 4, 5 und 6, gekennzeichnet dadurch, daß chimäre Proteine verwendet werden,
deren Fremdanteile nicht van den in Anspruch 1 genannten Nukleinsäuresequenzen kodiert
werden.
8. Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß poly-, oligo- oder monoklonale oder
monospezifische Antikörper verwendet werden, die von unter Anspruch 1 genannten
Nukleinsäuresequenzen kodierte und den Ansprüchen 4, 5, 6 und 7 genügende Proteine
oder deren Abkömmlinge oder mutierte Formen davon erkennen.
9. Ansprüch 8, gekennzeichnet dadurch, daß jede, dem jeweils aktuellen Stand der Technik
entsprechende Methodik verwendet werden kann (z. B. ELISA, Immunhistochemie,
Immunzytochemie, Immunpräzipitation, Western-Blotting, Immunfluoreszenz,
Immunaffinitätsverfahren, etc.).
10. Anspruche 8 und 9, gekennzeichnet dadurch, daß ein Molekül verwendet wird, das ein
Antikörperfragment mit spezifischen variablen Sequenzen enthält und daneben beliebige
andere Aminosäuresequenzen beinhalten kann.
11. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein Nukleinsäurefragment verwendet wird, das
in YAC 145F7 bzw. 145F7-neo oder korrespondierenden menschlichen oder syntenen oder
homologen genomischen Nukleinsäuren enthaltene Gene/Genabschnitte enthält.
12. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß von dem in YAC 145F7 bzw. 145F7-neo
enthaltenen oder von korrespondierenden menschlichen oder homolgen bzw. syntenen
genomischen Nukleinsäuren kodierte cDNA verwendet wird.
13. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine Nukleinsäurefragment, das in YAC 145F7
bzw. 145F7-neo oder korrespondierenden menschlichen oder homologen bzw. syntenen
genomischen Nukleinsäuren enthaltene Gene/Genabschnitte in einen Expressionsvektor
kloniert wird/werden.
14. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß eine in YAC 145F7 bzw. 145F7-neo enthaltene
oder von korrespondierenden menschlichen oder homologen bzw. syntenen Nukleinsäuren
abgeleitete cDNA in einen Expressionsvektor kloniert wird.
15. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß ein in YAC 145F7 bzw. 145F7-neo enthaltenes
oder von korrespondierenden menschlichen oder homologen bzw. syntenen Nukleinsäuren
oder deren cDNA abgeleitetes Nukleinsäurefragment für Hybridisierungsexperimente aller
Art (z. B. Southern- oder Northern- oder Southwestern-Analysen) oder Analysen zur
Nukleinsäure-Protein-Interaktion verwendet wird.
16. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß rekombinante humane oder nichthumane Zellen
verwendet werden, die einen Vektor enthalten, in dem unter Ansprüchen 11, 12, 13 und 14
genannten Nukleinsäuresequenzen enthalten sind.
17. Anspruch 16, gekennzeichnet dadurch, daß solche Zellen zur Produktion, Aufreinigung
und Verwertung von unter Ansprüchen 4, 5, 6 und 7 genanntem/n Protein(en) oder
Polypeptiden verwendet werden.
18. Ansprüche 1, 16 und 17, gekennzeichnet dadurch, daß ein pharmazeutisches Präparat
jedweder Art und Zusammensetzung hergestellt wird, das unter den Ansprüchen 11, 12, 13
und 14 genannten Nukleinsäuresequenzen enthält und/oder unter den Ansprüchen 4, 5, 6
und 7 genannten Proteine bzw. deren Abkömmlinge kodiert, die unter den Ansprüchen 8, 9
und 10 genannten Antikörper bzw. deren Abkömmlinge beinhaltet und für diagnostische
und/oder therapeutische Zweck geprüft und verwendet werden kann.
19. Anspruch 18, gekennzeichnet dadurch, daß ein pharmazeutisches Präparat jedweder Art
und Zusammensetzung hergestellt wird, das unter den Ansprüchen 8 und 10 beschriebene
Komponenten enthält und für diagnostische und/oder therapeutische Zwecke geprüft und
eingesetzt werden kann.
20. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Methoden entwickelt, geprüft und verwendet
werden zum Screening auf, zur Prävention und/oder Behandlung einer Erkrankung dienen,
die mit Chromosom 3p14.2-14.3-Aberrationen, entsprechend den durch das YAC 145F7
bzw. 145F7-neo repräsentierten Nukleinsäuresequenzen oder deren fehlregulierter
Expression einhergehen.
21. Anspruch 20, gekennzeichnet dadurch, daß es sich um prämaligne Gewebsveränderungen,
benigne Tumoren, hyperproliferative Gewebsveränderungen oder benigne dysproliferative
Veränderungen, Gewebsveränderungen oder Erkrankungen mit fehlregulierter
Zellzykluskontrolle, resultierend in Hyperproliferation, Hyperplasie oder Dysplasie,
fehlregulierter Senszenzinduktion, Apoptose oder anderer Arten des physiologischen
Zelltods handelt.
22. Anspruch 20, gekennzeichnet dadurch, daß es sich um maligne
Erkrankungen/Tumorerkrankungen handelt.
23. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Methoden entwickelt, geprüft und eingesetzt
werden, in denen Antisense-Nukleinsäurefragmente verwendet werden, die die Regulation
und/oder Expression und/oder Funktion der Gene, Proteine oder deren Abkömmlingen
oder mutierten Formen beeinflussen, die von durch das YAC 145F7 bzw. 145F7-neo
repräsentierten oder homologe Nukleinsäuresequenzen kodiert werden.
24. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß durch das YAC 145F7 bzw. 145F7-neo
repräsentierte oder homologe Nukleinsäuresequenzen zur homologen Rekombination
verwendet werden.
25. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Methoden entwickelt, geprüft und verwendet
werden, bei denen Oligonukleotide verwendet werden, die mit mindestens sechs
Nukleotiden homolog sind zu durch das YAC 145F7 bzw. 145F7-neo repräsentierten oder
homologen Nukleinsäuresequenzen und deren RNA und/oder cDNA-Abkömmlingen.
26. Anspruch 25, gekennzeichnet dadurch, daß diese Oligonukleotide in jedweder Form
und/oder pharmazeutischen Zubereitung zu diagnostischen und/oder therapeutischen
Zwecken eingesetzt werden.
27. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die zur Anwendung kommenden
Nukleinsäuresequenzen als Peptidnukleinsäuren (PNA) vorliegen.
28. Anspruch 20, gekennzeichnet dadurch, daß die zu untersuchende Person ein Fötus, Kind
oder Erwachsener sein kann.
29. Ansprüche 20 und 21, gekennzeichnet dadurch, daß bei diesen Untersuchungen in vitro
translatierte RNA verwendet werden kann.
30. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Kits (Reagenzzusammenstellungen) hergestellt,
geprüft und verwendet werden, die es erlauben, (a) Aberrationen der von YAC 145F7
bzw. 145F7-neo repräsentierten bzw. homologen Nukleinsäuresequenzen auf genomischer
und RNA-Ebene sowie von ihnen kodierter Proteine und/oder Polypeptide und deren
Abkömmlinge nachzuweisen, (b) Nukleinsäuren oder Abkömmlinge der von YAC 145F7
bzw. 145F7-neo repräsentierten bzw. homologen Nukleinsäuresequenzen, Proteine
und/oder Polypeptide und deren Abkömmlinge sowie gegen sie gerichtete Antikörper und
Abkömmlinge davon enthalten, die es erlauben, aberrante Zellproliferation und
-differenzierung, Seneszenz, Tumorigenität und Apoptose zu beeinflussen.
31. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß methodische Ansätze entwickelt, geprüft und
angewendet werden, die es erlauben, zelluläre Moleküle zu identifizieren, die mit Proteinen
oder deren Abkömmlingen interagieren, die von YAC 145F bzw. 145F7-neo
repräsentierten bzw. homologen oder syntenen Nukleinsäuresequenzen bzw. deren cDNAs
oder Abkömmlingen kodiert werden.
32. Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß rekombinante Tiere- sowie deren Nachkommen
- erzeugt und/oder verwendet werden, in deren Genom von YAC 145F7 bzw. 145F7-neo
repräsentierte bzw. homologe oder syntene Nukleinsäuresequenzen bzw. deren cDNAs
oder Abkömmlinge eingebracht werden und von diesen kodierte Proteine/peptide oder
deren Abkömmlinge exprimiert werden.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19921076A DE19921076A1 (de) | 1999-05-08 | 1999-05-08 | Identifizierung eines neuen Tumorsuppressorlocus (NRC-2) in der Chromosomenbande 3p14.2 durch Nachweis einer tumorsupprimierenden und einer seneszenzinduzierenden Aktivität des YAC 145F7-neo |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE19921076A DE19921076A1 (de) | 1999-05-08 | 1999-05-08 | Identifizierung eines neuen Tumorsuppressorlocus (NRC-2) in der Chromosomenbande 3p14.2 durch Nachweis einer tumorsupprimierenden und einer seneszenzinduzierenden Aktivität des YAC 145F7-neo |
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DE19921076A1 true DE19921076A1 (de) | 2002-09-05 |
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ID=7907300
Family Applications (1)
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DE19921076A Withdrawn DE19921076A1 (de) | 1999-05-08 | 1999-05-08 | Identifizierung eines neuen Tumorsuppressorlocus (NRC-2) in der Chromosomenbande 3p14.2 durch Nachweis einer tumorsupprimierenden und einer seneszenzinduzierenden Aktivität des YAC 145F7-neo |
Country Status (1)
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DE (1) | DE19921076A1 (de) |
-
1999
- 1999-05-08 DE DE19921076A patent/DE19921076A1/de not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
BIOSIS, Ref. 1996:258102 * |
CAPLUS, Ref. 1998:477498 * |
JÜLICHER,Knut, et.al.: Short Communication Yeast Artifical Chromosome Transfer into Human Renal Carcinoma Cells by Spheroplast Fusion. In: GENOMICS 43, 1997, S.95-98 * |
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