WO2001000822A2 - cDNA-SEQUENZEN VON ZWEI INTERAKTOREN FANCIP2 UND FANCIP3 DES FANCONI-ANÄMIE-PROTEINS DER KOMPLEMENTATIONSGRUPPE A - Google Patents

cDNA-SEQUENZEN VON ZWEI INTERAKTOREN FANCIP2 UND FANCIP3 DES FANCONI-ANÄMIE-PROTEINS DER KOMPLEMENTATIONSGRUPPE A Download PDF

Info

Publication number
WO2001000822A2
WO2001000822A2 PCT/EP2000/005878 EP0005878W WO0100822A2 WO 2001000822 A2 WO2001000822 A2 WO 2001000822A2 EP 0005878 W EP0005878 W EP 0005878W WO 0100822 A2 WO0100822 A2 WO 0100822A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
protein
fancip3
fancip2
polypeptide
Prior art date
Application number
PCT/EP2000/005878
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2001000822A3 (de
Inventor
Hans Joachim Gross
Tanja Reuter
Helmut Hanenberg
Sabine Herterich
Matthias Wagner
Original Assignee
Multigene Biotech Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Multigene Biotech Gmbh filed Critical Multigene Biotech Gmbh
Priority to JP2001506815A priority Critical patent/JP2003503053A/ja
Priority to AU58198/00A priority patent/AU5819800A/en
Priority to EP00943885A priority patent/EP1194547A2/de
Publication of WO2001000822A2 publication Critical patent/WO2001000822A2/de
Publication of WO2001000822A3 publication Critical patent/WO2001000822A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the cDNAs of two interactors (FANCIP2 and FANCIP3) of the Fanconi anemia protein of complementation group A (FANCA) and the proteins encoded thereby.
  • Other subjects include the corresponding genes, antibodies directed against the proteins, FANCIP2 or FANCIP3 transgenic organisms and cells, and the use of FANCIP2 or FANCIP3 for effector screening and the pharmaceutical use of the nucleic acids, the proteins and the antibodies.
  • Fanconi anemia (hereinafter referred to as "FA") is an autosomal recessive hereditary disease that manifests itself clinically with symptoms such as progressive pancytopenia, congenital malformations and an increased risk of cancer (Glanz and Fraser, 1982). At least 15% of the FA- Patients develop myeloid leukaemias (Auerbach and Allen, 1991).
  • FA cells are cytogenetic due to a hypersensitivity towards DNA cross-linking agents, e.g. Mitomycin C (MMC) and Diepoxybutan (DEB), characterized, which manifests itself in chromosome breaks and aberrations (Auerbach, 1993).
  • MMC Mitomycin C
  • DEB Diepoxybutan
  • FA lymphocytes and fibroblasts show a delay or an arrest in the G2 phase of the cell cycle after treatment with MMC (Kubbies et al., 1985; Seyschab et al., 1995).
  • MMC Mitomycin C
  • DEB Diepoxybutan
  • FA lymphocytes and fibroblasts show a delay or an arrest in the G2 phase of the cell cycle after treatment with MMC (Kubbies et al., 1985; Seyschab et al., 1995).
  • increased sensitivity to oxygen can be observed in FA cells (Joenje et al., 1981; Schindler and Hoehn, 1988; Po
  • the object of the present invention was to find interactors of the Fanconi anemia proteins FANCA and FANCC. Based on the FA pathogenesis as a model system for mechanisms for maintaining genetic stability, the aim was to identify components of a protein complex or a protein cascade that play a role in DNA repair, cell cycle regulation and / or oncogenesis.
  • the present invention describes the identification of two cDNAs that are responsible for
  • FANCIP Fanconi anemia protein interacting protein
  • the FANCIP2 or FANCIP3 cDNA and the proteins encoded thereby, but also the corresponding genes and antibodies directed against the proteins are therefore suitable as diagnostic, therapeutic or preventive agents for diseases which are associated with DNA repair defects, cell cycle disorders, Cytopenias, tumorigenesis and / or tumor progression are associated. They can also serve as targets for effector screening procedures to develop new drugs for the treatment of the aforementioned diseases.
  • the present invention relates to two nucleic acids, which
  • nucleotide sequences shown or a protein-coding section thereof b) one of the sequences from a) nucleotide sequences corresponding to the degeneracy of the genetic code, c) a nucleotide sequence hybridizing with the sequences from a) and / or b) under stringent conditions or d) comprises sequences complementary to the sequences from a) and / or b).
  • the nucleotide sequence for FANCIP2 shown in FIG. 1 contains an open reading frame which corresponds to a protein with a length of 408 amino acids.
  • the amino acid sequence of this protein is shown in Fig. 2.
  • the nucleotide sequence for FANCIP3 shown in FIG. 3 contains an open reading frame which corresponds to a protein with a length of 1117 amino acids.
  • the amino acid sequence of this protein is shown in Fig. 4.
  • Variants are possible for FANCIP2, which differ from one another by the presence or absence of an 18 bp or 45 bp sequence section (bold sections in FIG. 1).
  • the sequence database "GenBank” at the "National Center for Biotechnology Information” (NCBI) contains two human cDNA sequences which largely correspond to the nucleotide sequence for FANCIP2 shown in FIG. 1.
  • the first sequence with the accession number AF151813 was determined using a comparative proteomics approach (Lai et al., 2000) and contains a possible open reading frame which is intended to code for a protein called CGI-55, the biological function of which is not explained.
  • the open reading frame differs from the open reading frame of the FANCIP2 sequence at three nucleotide positions, which leads to two differences in the deduced amino acid sequence.
  • the 45 bp section mentioned above is missing.
  • the second sequence with the accession number AL080119 was published after the FANCIP2 first registration and corresponds to FANCIP2, whereby both the 18 bp and the 45 bp section are missing. A biological function is also not described here.
  • the FANCIP2 sequence shown here has a further 34 nucleotides at the ⁇ 'end.
  • the EST database at the NCBI contains cDNA fragments which correspond to subregions of the nucleotide sequence shown in FIG. 1.
  • Examples are 50 human ESTs with 94% to 100% homology: accession numbers AL042397, AW467413, AW247188, AI872327, AI859542, AW732223, AW276167, AW957122, AW103463, AI814716, BE019064, AA158242, AW967070, AA3145255, AW243816, AW085671, AL036093, AW409749, AA429442, AA211632, AI499075, BE046106, AA693961, AA456789, AA160534, AW246719, AA224150, AA160357, AW518167, AA160629, AA1513709309269, AA28138F9309, 12928 , AW408542, AA112544, AA232104, AA307167, AA129629, AW250602, AW440390 and AA101431.
  • the sequences represent variants without deletion, with 45 bp deletion and with 18 bp and 45 bp deletion.
  • the EST access numbers contain no information about a complete open reading frame or about a possible biological function.
  • FANCIP3 there are two cDNA sequences in the "GenBank" sequence database at the NCBI, which correspond to part of the open reading frame of the nucleotide sequence shown in FIG. 3. The first sequence was published after the first registration of FANCIP3 under the accession number AL096751 and corresponds to the sequence indicated in FIG. 3 from nucleotide 1090. This region differs from the FANCIP3 sequence at 2 nucleotide positions and contains a 102 bp deletion. There is no explanation of the biological function under this access number.
  • the second sequence under the accession number X98258 corresponds to the sequence mentioned in FIG. 3 from nucleotide 2967 over a range of 554 nucleotides 100%.
  • This sequence is the part of a cDNA that codes for a so-called M-phase phosphoprotein 9 (MPP9).
  • MPP9 M-phase phosphoprotein 9
  • This protein was identified by expression cloning together with other M-phase phosphoproteins (Matsumoto-Taniura et al., 1996). A function in cell division not previously explained is suspected.
  • MPP9 could be localized in the cell during the interphase in the Golgi apparatus and during the M phase of mitosis in the cytoplasm. The sizes 150 and 160 kDa were determined for MPP9 by immunoprecipitation.
  • the calculated size of the FANCIP3 mentioned in FIG. 4 is 125 kDa.
  • EST database at the NCBI there are further cDNA fragments which correspond to partial areas of the nucleotide sequence shown in FIG. 3. Examples include 23 human ESTs with 94% to 100% homology: accession numbers AA306650, AI650373, AI630343, AW449069, AA847224, AA833889, AI377129, AW905060, AA313182, AA830355, AA973835, AA504104, AI656864, AA47145, AA4714256, AA47142523 AW393430, AA626158, AW610204, AI867901, AA736979 and AA442623.
  • the FANCIP3 cDNA sequence shown in FIG. 3 thus contains a complete open reading frame for the
  • the present invention also includes nucleotide sequences Nucleotide sequences that hybridize with one of the aforementioned sequences.
  • hybridization according to the present invention is used as in Sambrook et al. (1989) used.
  • Nucleic acids according to the invention can be isolated from mammals according to known techniques using short sections of the nucleotide sequence shown in FIG. 1 or FIG. 3 as hybridization probes and / or primers according to known methods. Furthermore, nucleic acids according to the invention can also be produced by chemical synthesis, it being possible to use modified nucleotide building blocks (for example methylated or 2'-0-alkylated nucleotides or phosphorothioates) instead of the customary nucleotide building blocks. Nucleic acids consisting partially or entirely of modified nucleotide building blocks can be used, for example, as therapeutic agents, e.g. as antisense nucleic acids or as ribozymes.
  • modified nucleotide building blocks for example methylated or 2'-0-alkylated nucleotides or phosphorothioates
  • the present invention further relates to a vector which contains at least one copy of one of the nucleic acids according to the invention.
  • This vector can be any prokaryotic or eukaryotic vector on which a DNA sequence according to the invention is located and / or which enables the expression of a nucleic acid according to the invention in a suitable host cell.
  • prokaryotic vectors are chromosomal vectors, such as bacteriophages, and extrachromosomal vectors, such as circular plasmid vectors.
  • eukaryotic vectors are yeast vectors or vectors suitable for higher cells, such as plasmid vectors or viral vectors.
  • the invention also relates to a vector which preferably contains at least a 15 nucleotide long section of the sequences shown in FIG. 1 or FIG. 3.
  • This section preferably has a nucleotide sequence which comes from the protein-coding region of the sequences shown in FIG. 1 or FIG. 3 or from a region which is essential for the expression of the protein.
  • These nucleic acids are particularly suitable for the production of therapeutically usable antisense nucleic acids.
  • the present invention includes proteins encoded by the above nucleic acids. These proteins have the amino acid sequence shown in FIG. 2 (SEQ ID Nos. 5-8) or FIG. 4 (SEQ ID NO. 10) or a homology of more than 60%, preferably more than 70%, to that in FIG. 2 or 4 shown amino acid sequence.
  • the invention also relates to variants and fragments of the protein shown in FIGS. 2 and 4. Variants are understood to mean sequences which differ from the amino acid sequence shown in FIG. 2 or FIG. 4 by substitution, deletion and / or insertion of individual amino acids or short amino acid segments.
  • This term also includes chemically modified polypeptides. This includes Polypeptides that are modified on the termini and / or on reactive amino acid side groups by acylation or amidation.
  • the invention also relates to methods which lead to the production of the proteins according to the invention and comprise both the cultivation of appropriately transformed cells and the isolation of the proteins according to the invention.
  • the invention further relates to the use of polypeptides according to the invention or fragments of these polypeptides as immunogens for the production of antibodies.
  • Antibodies can be produced in a customary manner by immunizing experimental animals with the complete polypeptide or fragments thereof and then obtaining the resulting polyclonal antisera.
  • Monoclonal antibodies can be produced by known methods.
  • the present invention thus also includes antibodies against FANCIP2 or FANCIP3 or a variant thereof.
  • the FANCIP2 or FANCIP3 encoded by the nucleic acids according to the invention can be used as a target for a targeted search for effectors.
  • Substances which have an inhibitory or activating effect on proteins according to the invention are able to selectively influence the cell functions controlled by these proteins. Therefore, they can be used in the therapy of corresponding clinical pictures, such as cytopenias or tumors.
  • the invention thus also relates to a method for identifying effectors of FANCIP2 or FANCIP3, in which cells which express the protein are brought into contact with various potential effector substances and the cells are subjected to changes, for example cell-activating, cell-inhibiting, cell-proliferative and / or cell genetic changes.
  • the invention relates to pharmaceutically active effector substances determined in the above-mentioned manner.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition which contains nucleic acids, vectors, cells, polypeptides, antibodies and / or effector substances as indicated above as the active component and furthermore pharmaceutically customary excipients, auxiliaries and / or additives and optionally further active components may contain.
  • the pharmaceutical composition which contains nucleic acids, vectors, cells, polypeptides, antibodies and / or effector substances as indicated above as the active component and furthermore pharmaceutically customary excipients, auxiliaries and / or additives and optionally further active components may contain.
  • Composition can be used in particular for the diagnosis, therapy or prevention of diseases which are associated with DNA repair defects, cell cycle disorders, cytopenias, tumor genesis and / or tumor progression. This also applies to the diagnosis of a predisposition to such diseases in individuals, in particular in the diagnosis of a risk for cytopenias and / or tumor diseases. Furthermore, a targeted diagnosis of diseases is made possible which are directly or indirectly linked to changes in the activity of FANCIP2 or FANCIP3. These tests can be carried out with the help of specific nucleic acid probes for detection at the nucleic acid level, e.g. at the gene or transcript level, or with the help of antibodies against i-ANCIP2 or FANCIP3 for detection at the protein level.
  • gene therapy treatment can be carried out which involves the transmission of a nucleic acid coding for the FANCIP2 or FANCIP3 by means of vectors, e.g. viral vectors, into the appropriate target tissue.
  • vectors e.g. viral vectors
  • the present invention also relates to a method for diagnosing the abovementioned diseases, in which a patient or a sample originating from a patient, for example a sample of a body fluid or a tissue, is brought into contact with a pharmaceutical composition according to the invention and the nucleotide sequence and / or the Expression of the nucleic acid according to the invention determined qualitatively or quantitatively.
  • a pharmaceutical composition according to the invention and the nucleotide sequence and / or the Expression of the nucleic acid according to the invention determined qualitatively or quantitatively.
  • These determination methods can be used, for example, at the nucleic acid level by using nucleic acid hybridization probes or via reverse transcription / PCR or at the protein level by antibodies according to cyto- or histochemical methods.
  • the pharmaceutical composition can be used as a marker for the occurrence of cytopenias, tumors or other proliferation-associated diseases or as a predisposition for the pathophysiological changes mentioned.
  • the present invention also relates to a method for the therapy or prevention of one of the aforementioned diseases, wherein the patient is administered a pharmaceutical composition according to the invention which contains the active component in an amount effective against the disease.
  • a pharmaceutical composition according to the invention which contains the active component in an amount effective against the disease.
  • pharmaceutical compositions which are suitable for therapeutic purposes are, for example, bispecific antibodies and antibody toxins or antibody-enzyme conjugates.
  • Further preferred pharmaceutical compositions for therapeutic purposes are antisense nucleic acids, gene therapeutic vectors or effector substances, e.g. in the form of low molecular weight activators or inhibitors.
  • the complete coding sequence of the FANCA protein was cloned into the vector pEG202 via the EcoRI interface in the reading frame with the region coding for the LexA DNA-binding domain.
  • the vector pJG4-5 was used for the expression of the prey protein, which allows the construction of fusion proteins with the B42-transactivating domain.
  • a HeLa cDNA library cloned into this vector as a fusion gene library was screened with the FANCA bait protein.
  • the yeast strain EGY48 served as the host organism. A positive interaction was demonstrated by transcription activation of the LEU2 gene, resulting in growth of the yeasts on leucine-free medium.
  • EGY48 cotransformed with pEG202FANCA and the B42 fusion library were pre-selected on leucine-containing medium to obtain both vectors and recorded.
  • To search for interacting yeast clones aliquots were plated on leucine-free medium and incubated for 3 to 5 days at 30 ° C. A total of aliquots were screened for an amount of 1 x 10 6 transfectants. The dependence of the transcription activation of positive clones on the expression of the prey protein was checked on leucine-free glucose medium.
  • the interactor plasmids were isolated after growing the yeast in glucose medium without tryptophan, electroporation of the nucleic acid isolate in the E. coli strain XLIblue (Stratagene) and plasmid preparation from the bacterial cells. To confirm the interactions, retransformations of the isolated prey
  • the 573 'RACE Kit (Boehringer-Roche) was used to determine the 5' partial sequences which were still missing.
  • the sequence-specific primers FANCIP2-SP1 (5'-CTT CGT TCA CGA GGT GGT CG-3 ') and FANCIP2-SP2 (5'-CTT CCA ACT CGT CTT ATT CC-3') were used for FANCIP2 and the sequence-specific primers for FANCIP3 FANCIP3-SP1 (5'-CAC ATG ACA CTC TTC AGG AG- 3 ') and FANCIP3-SP2 (5'-CCT TTG GGA ACA TCT ATG TGC-3') are used.
  • the PCR products obtained were electrophoretically purified and directly sequenced using the above-mentioned primers FANCIP2-SP2 and FANCIP3-SP3.
  • the affiliation of the nucleotide fragments obtained to the plasmid-inserted interactor fragments was confirmed in each case by overlapping sequence regions.
  • the sequence information from the above-mentioned GenBank entry AL096751 was used to design a corresponding 3' primer.
  • FANCIP2 and FANCIP3 cDNA sequences were amplified from the total cDNA using PCR and sequence-specific 5 'and 3' primers.
  • the primers were FANCIP2-P (5'-GCC ACC ATC ATG CCT GGG C-3 ') and FANCIP2-M (5'-GCA TCC AGT TAA GCC AGA GC-3') or FANCIP3-P ( 5 "-GAA GCC TCT GAA GAT GAC ACG-3 ') and FANCIP3-M (5'-ATA ACT GGA ACA CTG ACT GGC-3').
  • the PCR products were cloned via the Smal interface into the vector pUC19
  • the inserted PCR products for FANCIP2 and FANCIP3 were completely sequenced from transformed E. coli cells after plasmid preparation, using additional internal FANCIP2- or FANCIP3-specific as well as external pUC19-specific primers.
  • the result for the FANCIP2 cDNA was a 1471 nucleotide long sequence (FIG. 1) with a possible open reading frame of 1224 nucleotides or 408 codons.
  • the open reading frame contains two sequence areas with 18 bp and 45 bp (bold sections in FIG. 1), which are present independently of one another may or may not.
  • the FANCIP3 cDNA resulted in a 3580 nucleotide long sequence (FIG. 3) with a possible open reading frame of 3351 nucleotides or 1117 codons.
  • NCBI National Center of Biotechnology Information
  • SEQ ID NO. 9 a nucleotide sequence which contains an open reading frame coding for FANCIP3,
  • Figure 9 shows the nucleic acid primers used for PCR amplification of the FANCIP3 open reading frame.
  • the Fanconi anemia gene FANCF encodes a novel protein with homology to ROM. Nat. Genet. 24, 15-16

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die cDNAs von zwei Interaktoren (FANCIP2 und FANCIP3) des Fanconi-Anämie-Proteins der Komplementationsgruppe A (FANCA) sowie die davon codierten Proteine. Weitere Gegenstände sind die entsprechenden Gene, gegen die Proteine gerichtete Antikörper, FANCIP2- bzw. FANCIP3-transgene Organismen und Zellen sowie die Verwendung von FANCIP2 bzw. FANCIP3 zum Effektor-Screening und die pharmazeutische Anwendung der Nukleinsäuren, der Proteine und der Antikörper.

Description

cDNA-Sequenzen von zwei Interaktoren FANCIP2 und FANCIP3 des Fanconi- Anämie-Proteins der Komplementationsgruppe A
Beschreibung
Umfang der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die cDNAs von zwei Interaktoren (FANCIP2 und FANCIP3) des Fanconi-Anämie Proteins der Komplementationsgruppe A (FANCA) sowie die davon codierten Proteine. Weitere Gegenstände sind die entsprechenden Gene, gegen die Proteine gerichtete Antikörper, FANCIP2- bzw. FANCIP3-transgene Organismen und Zellen sowie die Verwendung von FANCIP2 bzw. FANCIP3 zum Effektor-Screening und die pharmazeutische Anwendung der Nukleinsäuren, der Proteine und der Antikörper.
Hintergrund der Erfindung
Fanconi-Anämie (im folgenden als „FA" bezeichnet) ist eine autosomal rezessiv erbliche Erkrankung, die sich klinisch mit Symptomen wie progressive Pancytopenie, angeborenen Mißbildungen und erhöhtem Risiko für Krebserkrankungen manifestiert (Glanz und Fräser, 1982). Mindestens 15% der FA-Patienten entwickeln myeloische Leukämien (Auerbach und Allen, 1991).
Cytogenetisch sind FA-Zellen durch eine Hypersensitivität gegenüber DNA- quervernetzenden Agenzien, wie z.B. Mitomycin C (MMC) und Diepoxybutan (DEB), charakterisiert, die sich in Chromosomenbrüchen und -aberrationen manifestiert (Auerbach, 1993). FA-Lymphozyten und -Fibroblasten weisen nach Behandlung mit MMC eine Verzögerung bzw. einen Arrest in der G2-Phase des Zellzyklus auf (Kubbies et al., 1985; Seyschab et al., 1995). Zudem ist bei FA-Zellen eine erhöhte Sauerstoffempfindlichkeit zu beobachten (Joenje et al., 1981 ; Schindler und Hoehn, 1988; Poot et al., 1996).
Anhand somatischer Zellfusionsstudien konnten für FA mindestens acht verschiedene Komplementationsgruppen (A bis H) unterschieden werden (Joenje et al., 1997). Bisher wurden die Gene für vier Komplementationsgruppen identifiziert: FANCC (Strathdee et al., 1992; W093/22435), FANCA (Lo Ten Foe et al., 1996; The Fanconi anaemia/Breast cancer consortium, 1996; W098/14462), FANCG (Saar et al., 1998; De Winter et al., 1998) und FANCF (De Winter et al., 2000). Obwohl die molekulare Wirkungsweise der FA-Proteine immer noch unbekannt ist, deutet der zelluläre Phänotyp und das erhöhte Krebsrisiko bei einem Gendefekt auf eine Beteiligung bei der DNA-Reparatur, der Zellzyklus-Regulation und/oder der Hämatopoiese hin. Die Ähnlichkeit des klinischen und zellulären Phänotyps der verschiedenen Komplementationsgruppen und die Erkenntnis, daß das FANCA- und das FANCC-Protein unter FANCA-Phosphorylierung interagieren und als Komplex in den Zellkern transportiert werden (Kupfer et al., 1997a, Yamashita et al., 1998), lassen auf eine Protein-Kaskade oder ein funktionelles Zusammenwirken in einem Komplex schließen. Für FANCG konnte die Beteiligung an diesem Komplex ebenfalls gezeigt werden (Garcia-Higuera et al., 1999; Waisfisz et al., 1999; Reuter et al., 2000).
Entscheidende Fortschritte bei der Entschlüsselung der molekularen Ursachen der FA-Pathogenese können über die Identifikation der beteiligten Gene bzw. Proteine erzielt werden. Als FANCC-Interaktoren sind beispielsweise die Cyclin-abhängige Kinase cdc2 (Kupfer et al., 1997b), das Chaperon GRP94 (Hoshino et al., 1998) und die NADPH.Cytochrom c-Reduktase (Kruyt et al., 1998) veröffentlicht, als potentiell Pathogenese-relevant wurden die Fanconi-Gene 1 und 2 eingestuft (Planitzer et al., 1998; W098/16637 und W098/45428).
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, Interaktoren der Fanconi- Anämie-Proteine FANCA und FANCC zu finden. Auf Grundlage der FA-Pathogenese als Modellsystem für Mechanismen zur Aufrechterhaltung genetischer Stabilität war das Ziel, Bestandteile eines Proteinkomplexes bzw. einer Proteinkaskade zu identifizieren, die eine Rolle bei der DNA-Reparatur, der Zellzyklusregulation und/oder der Onkogenese spielen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Identifizierung von zwei cDNAs, die für
Proteine codieren, welche mit FANCIP2 bzw. FANCIP3 bezeichnet wurden (FANCIP = Fanconi anemia protein interacting protein). Die cDNA-Sequenzen wurden unter Verwendung einer Interaction Trap-Version des Hefe-Two Hybrid-Systems (Fields und Song, 1989; Finley Jr. et al., 1996) gefunden, wobei das Protein der Komplementationsgruppe A (FANCA) als Köder diente. Die durch die FANCIP2- bzw. FANCIP3-cDNA codierten Proteine interagieren mit FANCA und können somit Teil des Komplexes bzw. der Signaltransduktionskaskade sein, die bei Defekt zur FA- Pathogenese führt. Die FANCIP2- bzw. FANCIP3-cDNA und die davon codierten Proteine, aber auch die entsprechenden Gene und gegen die Proteine gerichtete Antikörper sind daher als diagnostische, therapeutische oder präventive Mittel für Erkrankungen geeignet, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind. Sie können weiterhin als Targets für Verfahren zum Effektor-Screening dienen, um neue Medikamente zur Behandlung der zuvor genannten Erkrankungen zu entwickeln.
Die vorliegende Erfindung betrifft zwei Nukleinsäuren, welche
a) die in Fig. 1 (SEQ ID Nos. 1 - 4; FANCIP2) bzw. Fig. 3 (SEQ ID
NO 9; FANCIP3) dargestellten Nukleotidsequenzen oder einen Protein-codierenden Abschnitt davon, b) eine der Sequenzen aus a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenzen, c) eine mit den Sequenzen aus a) und/oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisierenden Nukleotidsequenzen oder d) zu den Sequenzen aus a) und/oder b) komplementäre Sequenzen umfaßt.
Die in Fig. 1 dargestellte Nukleotidsequenz für FANCIP2 enthält einen offenen Leserahmen, der einem Protein mit einer Länge von 408 Aminosäuren entspricht. Die Aminosäuresequenz dieses Proteins ist in Fig. 2 dargestellt. Die in Fig. 3 dargestellte Nukleotidsequenz für FANCIP3 enthält einen offenen Leserahmen, der einem Protein mit einer Länge von 1117 Aminosäuren entspricht. Die Aminosäuresequenz dieses Proteins ist in Fig. 4 dargestellt. Für FANCIP2 sind Varianten möglich, die sich durch das Vorhandensein bzw. NichtVorhandensein eines 18 bp- bzw. 45 bp-Sequenzabschnittes voneinander unterscheiden (fettgedruckte Abschnitte in Fig. 1). Es finden sich in der Sequenzdatenbank "GenBank" am "National Center for Biotechnology Information" (NCBI) zwei humane cDNA-Sequenzen, die weitgehend der in Fig. 1 angegebenen Nucleotidsequenz für FANCIP2 entsprechen. Die erste Sequenz mit der Zugangsnummer AF151813 wurde über einen vergleichenden Proteomics-Ansatz ermittelt (Lai et al., 2000) und enthält einen möglichen offenen Leserahmen, der für ein CGI-55 genanntes Protein codieren soll, dessen biologische Funktion nicht erläutert ist. Der offene Leserahmen unterscheidet sich an drei Nukleotidpositionen vom offenen Leserahmen der FANCIP2-Sequenz, was zu zwei Unterschieden in der abgeleiteten Aminosäuresequenz führt. Zudem fehlt der oben erwähnte 45 bp- Abschnitt. Die zweite Sequenz mit der Zugangsnummer AL080119 wurde nach der FANCIP2-Erstanmeldung veröffentlicht und entspricht FANCIP2, wobei sowohl der 18 bp- als auch der 45 bp-Abschnitt fehlen. Eine biologische Funktion ist auch hier nicht beschrieben. Im Vergleich zu den genannten Sequenzen besitzt die hier dargestellte FANCIP2-Sequenz am δ'-Ende weitere 34 Nukleotide. In der EST- Datenbank am NCBI finden sich cDNA-Fragmente, die Teilbereichen der in Fig. 1 angegebenen Nukleotidsequenz entsprechen. Als Beispiele sind 50 humane ESTs mit 94% bis 100% Homologie genannt: Zugangsnummern AL042397, AW467413, AW247188, AI872327, AI859542, AW732223, AW276167, AW957122, AW103463, AI814716, BE019064, AA158242, AW967070, AI830170, AA314255, AW245102, AW473618, AW243816, AW085671, AL036093, AW409749, AA429442, AA211632, AI499075, BE046106, AA693961 , AA456789, AA160534, AW246719, AA224150, AA160357, AW518168, AA160629, AA158709, AW802813, AI926926, F30767, AA314911 , AI 559262, AA812340, AW243739, AW074545, AW408542, AA112544, AA232104, AA307167, AA129629, AW250602, AW440390 und AA101431. Die Sequenzen repräsentieren Varianten ohne Deletion, mit 45 bp-Deletion sowie mit 18 bp- und 45 bp-Deletion. Unter den EST-Zugangsnummem finden sich keine Angaben über einen vollständigen offenen Leserahmen oder über eine mögliche biologische Funktion. Für FANCIP3 finden sich in der Sequenzdatenbank "GenBank" am NCBI zwei cDNA- Sequenzen, die einem Teil des offenen Leserahmens der in Fig. 3 angegebenen Nukleotidsequenz entsprechen. Die erste Sequenz wurde nach Erstanmeldung von FANCIP3 unter der Zugangsnummer AL096751 veröffentlicht und entspricht der in Fig. 3 angegebenen Sequenz ab Nukleotid 1090. Dieser Bereich unterscheidet sich an 2 Nukleotidpositionen von der FANCIP3-Sequenz und enthält eine 102 bp- Deletion. Unter dieser Zugangsnummer findet sich keine Erläuterung zur biologischen Funktion. Die zweite Sequenz unter der Zugangsnummer X98258 entspricht der in Fig. 3 genannten Sequenz ab Nukleotid 2967 über einen Bereich von 554 Nukleotiden zu 100%. Es handelt sich bei dieser Sequenz um den Teilbereich einer cDNA, die für ein sogenanntes M-Phasen-Phosphoprotein 9 (MPP9) codiert. Dieses Protein wurde durch Expressionsklonierung gemeinsam mit weiteren M-Phasen-Phosphoproteinen identifiziert (Matsumoto-Taniura et al., 1996). Man vermutet eine bisher nicht näher erläuterte Funktion bei der Zellteilung. Mittels Immunfluoreszenz konnte MPP9 innerhalb der Zelle während der Interphase im Golgi-Apparat, während der M-Phase der Mitose im Cytoplasma lokalisiert werden. Durch Immunopräzipitation wurden für MPP9 die Größen 150 und 160 kDa ermittelt. Die berechnete Größe des in Fig. 4 genannten FANCIP3 beträgt 125 kDa. In der EST-Datenbank am NCBI finden sich weitere cDNA-Fragmente, die Teilbereichen der in Fig. 3 angegebenen Nukleotidsequenz entsprechen. Als Beispiele sind 23 humane ESTs mit 94% bis 100% Homologie genannt: Zugangsnummern AA306650, AI650373, AI630343, AW449069, AA847224, AA833889, AI377129, AW905060, AA313182, AA830355, AA973835, AA504104, AI656864, AA431023, AI674714, AA759180, AA525346, AW393430, AA626158, AW610204, AI867901 , AA736979 und AA442623. Unter diesen Zugangsnummern finden sich jedoch keine Angaben über einen vollständigen offenen Leserahmen oder über eine mögliche biologische Funktion. Im Gegensatz zu den oben genannten Sequenzen enthält die in Fig. 3 gezeigte FANCIP3-cDNA-Sequenz also zum ersten Mal einen kompletten offenen Leserahmen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt neben der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 gezeigten Nukleotidsequenz und einer dieser Sequenzen im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechenden Nukleotidsequenzen auch noch Nukleotidsequenzen, die mit einer der zuvor genannten Sequenzen hybridisiert. Der Begriff "Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al. (1989) verwendet.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren umfassen einen Protein-codierenden Abschnitt der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellten Nukleotidsequenz oder eine Sequenz, die eine Homologie von mehr als 65%, vorzugsweise mehr als 80% oder einen vorzugsweise mindestens 15 Nukleotide langen Abschnitt davon aufweist. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen auch RNAs oder Nukleinsäureanaloga, z.B. Peptid-Nukleinsäuren, umfassen.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuren können aus Säugern nach bekannten Techniken unter Verwendung kurzer Abschnitte der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 gezeigten Nukleotidsequenz als Hybridisierungssonden und/oder Primer nach bekannten Methoden isoliert werden. Weiterhin können erfindungsgemäße Nukleinsäuren auch durch chemische Synthese hergestellt werden, wobei anstelle der üblichen Nukleotidbausteine auch modifizierte Nukleotidbausteine (z.B. methylierte oder 2'-0- alkylierte Nukleotide oder Phosphorthioate) eingesetzt werden können. Nukleinsäuren, die teilweise oder vollständig aus modifizierten Nukleotidbausteinen bestehen, können beispielsweise als therapeutische Mittel, z.B. als Antisense- Nukleinsäuren oder als Ribozyme, eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor, der mindestens eine Kopie einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthält. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryotischer oder eukaryotischer Vektor sein, auf dem sich eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz befindet und/oder der die Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht. Beispiele für prokaryotische Vektoren sind chromosomale Vektoren, wie Bakteriophagen, und extrachromosomale Vektoren, wie zirkuläre Plasmidvektoren. Beispiele für eukaryotische Vektoren sind Hefevektoren oder für höhere Zellen geeignete Vektoren, wie Plasmidvektoren oder virale Vektoren. Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der vorzugsweise mindestens einen 15 Nukleotide langen Abschnitt der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellten Sequenzen enthält. Vorzugsweise besitzt dieser Abschnitt eine Nukleotidsequenz, die aus dem Protein-codierenden Bereich der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellten Sequenzen oder einem für die Expression des Proteins wesentlichen Bereich stammt. Diese Nukleinsäuren eignen sich besonders zur Herstellung von therapeutisch einsetzbaren Antisense-Nukleinsäuren.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter eine Zelle, die mit einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist. Die Zelle kann sowohl eine eukaryotische als auch eine prokaryotische Zelle sein. Beispiele eukaryotischer Zellen sind insbesondere Säugerzellen. Ebenfalls Gegenstand sind FANCIP2- bzw. FANCIP3-transgene Organismen, wie z.B. knock in- oder knock out-Tiermodelle. Tiermodelle, die das Produkt der Nukleinsäure stabil exprimieren, werden als knockin-Tiermodelle, jene, deren entsprechendes natürliches Gen gezielt zerstört wurde, als knockout- Tiermodelle bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung umfaßt von den oben angegebenen Nukleinsäuren codierte Proteine. Diese Proteine weisen die in Fig. 2 (SEQ ID Nos. 5 - 8) bzw. Fig. 4 (SEQ ID NO. 10) dargestellte Aminosäuresequenz oder eine Homologie von mehr als 60%, vorzugsweise mehr als 70% zu der in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Aminosäuresequenz auf. Die Erfindung betrifft auch Varianten und Fragmente des in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Proteins. Unter Varianten sind Sequenzen zu verstehen, die sich durch Substitution, Deletion und/oder Insertion einzelner Aminosäuren oder kurzer Aminosäureabschnitte von der in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Aminosäuresequenz unterscheiden. Hierunter fallen sowohl natürlich vorkommende allelische Variationen oder Spleißvariationen von FANCIP2 bzw. FANCIP3 als auch durch rekombinante DNA-Technologie, insbesondere durch in vitro-M utagenese mit Hilfe von chemisch synthetisierten Oligonukleofiden erzeugte Proteine, die hinsichtlich ihrer biologischen und/oder immunologischen Aktivität den in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Proteinen im wesentlichen entsprechen. Ebenfalls fallen unter diesen Begriff auch chemisch modifizierte Polypeptide. Hierzu gehören Polypeptide, die an den Termini und/oder an reaktiven Aminosäureseitengruppen durch Acylierung oder Amidierung modifiziert sind.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Proteine führen und sowohl die Kultivierung entsprechend transformierter Zellen als auch die Isolierung der erfindungsgemäßen Proteine umfassen.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung erfindungsgemäßer Polypeptide oder Fragmente dieser Polypeptide als Immunogene zur Herstellung von Antikörpern. Die Herstellung von Antikörpern kann dabei auf übliche Weise durch Immunisierung von Versuchstieren mit dem vollständigen Polypeptid oder Fragmenten davon und anschließende Gewinnung der resultierenden polyklonalen Antiseren erfolgen. Nach bekannten Methoden können monoklonale Antikörper hergestellt werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt somit auch Antikörper gegen FANCIP2 bzw. FANCIP3 oder eine Variante davon.
Das von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren codierte FANCIP2 bzw. FANCIP3 kann als Target für eine gezielte Suche nach Effektoren eingesetzt werden. Substanzen, die auf erfindungsgemäße Proteine inhibitorisch oder aktivierend wirken, sind in der Lage, die durch diese Proteine gesteuerten Zellfunktionen selektiv zu beeinflussen. Daher können sie bei der Therapie entsprechender Krankheitsbilder, wie z.B. Cytopenien oder Tumoren, eingesetzt werden. Ein Gegenstand der Erfindung ist somit auch ein Verfahren zur Identifizierung von Effektoren des FANCIP2 bzw. FANCIP3, wobei man Zellen, die das Protein exprimieren, mit verschiedenen potentiellen Effektorsubstanzen, in Kontakt bringt und die Zellen auf Veränderungen, z.B. zeilaktivierende, zeilinhibierende, zellproliferative und/oder zellgenetische Veränderungen, analysiert. Zudem können auf diese Weise Bindedomänen des FANCIP2 bzw. FANCIP3 identifiziert werden. Gegenstand der Erfindung sind auf obengenannte Weise ermittelte pharmazeutisch wirksame Effektor-Substanzen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponente Nukleinsäuren, Vektoren, Zellen, Polypeptide, Antikörper und/oder Effektor-Substanzen wie zuvor angegeben enthält und weiterhin pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe sowie gegebenenfalls weitere aktive Komponenten enthalten kann. Die pharmazeutische
Zusammensetzung kann insbesondere zur Diagnostik, Therapie oder Prävention von Erkrankungen eingesetzt werden, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus- Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind. Dies gilt auch für die Diagnostik einer Prädisposition für solche Erkrankungen bei Individuen, insbesondere bei der Diagnostik eines Risikos für Cytopenien und/oder Tumorerkrankungen. Weiterhin wird eine gezielte Diagnostik von Krankheiten ermöglicht, die mit Veränderungen der Aktivität des FANCIP2 bzw. FANCIP3 direkt oder indirekt verbunden sind. Diese Untersuchungen können mit Hilfe spezifischer Nukleinsäuresonden zum Nachweis auf Nukleinsäureebene, z.B. auf Gen- oder Transkriptebene, oder mit Hilfe von Antikörpern gegen i-ANCIP2 bzw. FANCIP3 zum Nachweis auf Proteinebene durchgeführt werden.
Bei Krankheitsbildern, die auf einen Ausfall des FANCIP2 bzw. FANCIP3 zurückzuführen sind, kann eine gentherapeutische Behandlung erfolgen, welche die Übertragung einer für das FANCIP2 bzw. FANCIP3 codierenden Nukleinsäure mittels Vektoren, z.B. viralen Vektoren, in das entsprechende Zielgewebe umfaßt. Andererseits kann bei Krankheitsbildern, die auf eine unkontrollierte Expression des FANCIP2 bzw. FANCIP3 zurückzuführen sind, eine gentherapeutische Behandlung erfolgen, welche zu einer Blockierung dieser Expression führt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Diagnostik der oben genannten Erkrankungen, wobei man einen Patienten oder eine aus einem Patienten stammende Probe, z.B. eine Probe einer Körperflüssigkeit oder eines Gewebes, mit einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung in Kontakt bringt und die Nukleotidsequenz und/oder die Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure qualitativ oder quantitativ bestimmt. Diese Bestimmungsmethoden können beispielsweise auf Nukleinsäureebene durch Verwendung von Nukleinsäure- Hybridisierungssonden oder über Reverse Transkription/PCR bzw. auf Proteinebene durch Antikörper nach cyto- oder histochemischen Methoden erfolgen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann als Marker für das Auftreten von Cytopenien, Tumoren oder anderer proliferationsassoziierter Erkrankungen oder einer Prädisposition für die genannten pathophysiologischen Veränderungen verwendet werden.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Therapie oder Prävention einer der zuvor genannten Erkrankungen, wobei man dem Patienten eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die die aktive Komponente in einer gegen die Erkrankung wirksamen Menge enthält. Spezifische Beispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen, welche für therapeutische Zwecke geeignet sind, sind beispielsweise bispezifische Antikörper und Antikörper- Toxine bzw. Antikörper-Enzymkonjugate. Weitere bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzungen für therapeutische Zwecke sind Antisense-Nukleinsäuren, gentherapeutische Vektoren oder Effektor-Substanzen, z.B. in Form niedermolekularer Aktivatoren oder Inhibitoren.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung Interaction Trap
Zur Klonierung von cDNAs, deren Genprodukte mit dem Fanconi-Anämie-Protein FANCA interagieren und damit eine Rolle bei der FA-Pathogenese spielen können, wurde eine Interaction Trap-Version des Hefe-Two Hybrid-Systems (Fields und Song, 1989; Finley Jr. et al., 1996) eingesetzt.
Für die Konstruktion des FANCA-Köderproteins wurde die komplette codierende Sequenz des FANCA-Proteins in den Vektor pEG202 über die EcoRI-Schnittstelle im Leserahmen mit der für die LexA-DNA-bindende Domäne codierenden Region kloniert. Für die Expression des Beuteproteins wurde der Vektor pJG4-5 verwendet, der die Konstruktion von Fusionsproteinen mit der B42-transaktivierenden Domäne erlaubt. Mit dem FANCA-Köderprotein wurde eine in diesen Vektor als Fusionsgenbank Monierte HeLa-cDNA-Bibliothek durchmustert. Als Wirtsorganismus diente der Hefestamm EGY48. Der Nachweis einer positiven Interaktion erfolgte durch Trankriptionsaktivierung des LEU2-Gens, woraus Wachstum der Hefen auf Leucin-freiem Medium resultiert.
Vor Durchführung des Interaction Traps wurde durch Ausplattieren pEG202FANCA- transformierter EGY48-Hefen auf Glucose-Medium ohne Histidin und Leucin sichergestellt, daß keine intrinsische transaktivierende Eigenschaft des FANCA- Köder-Fusionskonstruktes vorliegt.
Mit pEG202FANCA und der B42-Fusionsgenbank cotransformierte EGY48 wurden auf Leucin-haltigem Medium auf Erhalt beider Vektoren vorselektiert und aufgenommen. Für die Suche nach interagierenden Hefeklonen wurden Aiiquots auf Leucin-freiem Medium ausplattiert und 3 bis 5 Tage bei 30 °C inkubiert. Insgesamt wurden Aiiquots entsprechend einer Menge von 1 x 106 Transfektanten durchmustert. Die Abhängigkeit der Transkriptionsaktivierung positiver Klone von der Expression des Beuteproteins wurde auf Leucin-freiem Glucose-Medium überprüft. Die Isolierung der Interaktor-Plasmide erfolgte nach Aufzucht der Hefen in Glucose- Medium ohne Tryptophan, Elektroporation des Nukleinsäure-Isolats im E. coli-Stamm XLIblue (Stratagene) und Plasmidpräparation aus den Bakterienzellen. Zur Bestätigung der Interaktionen wurden Retransformationen des isolierten Beute-
Interaktors in Kombinationen mit unterschiedlichen Köderkonstrukten durchgeführt. In Kombination mit pEG202FANCA wurde die zuvor beobachtete Interaktion bestätigt. Außerdem wurden mögliche Interaktionen mit dem LexA-Fusionspartner ausgeschlossen, indem einerseits mit dem pEG202-Leervektor co-retransformiert wurde und andererseits mit einem LexA-DNA-Ligase-Köderfusionskonstrukt als Negativkontrolle.
Sequenzanalyse der FANCIP2- bzw. FANCIP3-cDNA Die Länge der Genbank-cDNAs der isolierten Interaktorklone wurde durch EcoRI/Xhol-Restriktionshydrolyse bestimmt. Die Ansequenzierung der cDNAs erfolgte durch eine automatisierte Cycle Sequencing-Methode (Applied Biosystems) unter Verwendung des Nukleinsäureprimers Bco I (5'- ACC AGC CTC TTG CTG AGT GGA GAT G-3'). Die vollständige Sequenzierung der Vektor-inserierten FANCIP2- bzw. FANCIP3-cDNA-Fragmente erfolgte mit den Nukleinsäureprimern Bco I und Bco II (5'-GAC AAG CCG ACA ACC TTG ATT GGA G-3').
Zur Ermittlung der jeweils noch fehlenden 5'-Teilsequenzen wurde der 573' RACE Kit (Boehringer-Roche) verwendet. Hierbei kamen für FANCIP2 die sequenzspezifischen Primer FANCIP2-SP1 (5'-CTT CGT TCA CGA GGT GGT CG-3') sowie FANCIP2- SP2 (5'-CTT CCA ACT CGT CTT ATT CC-3') und für FANCIP3 die sequenzspezifischen Primer FANCIP3-SP1 (5'-CAC ATG ACA CTC TTC AGG AG- 3') sowie FANCIP3-SP2 (5'-CCT TTG GGA ACA TCT ATG TGC-3') zum Einsatz. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden elektrophoretisch gereinigt und unter Verwendung der oben genannten Primer FANCIP2-SP2 bzw. FANCIP3-SP3 direkt sequenziert. Die Zugehörigkeit der erhaltenen Nukleotidfragmente zu den Plasmid-inserierten Interaktor-Fragmenten wurde jeweils durch überlappende Sequenzbereiche bestätigt. Bei der Komplettierung des 3'-Bereichs der FANCIP3-cDNA wurde die Sequenzinformation des oben genannten GenBank-Eintrags AL096751 verwendet, um einen entsprechenden 3'-Primer zu konzipieren.
Zur Klonierung der kompletten offenen Leserahmen der FANCIP2- und FANCIP3- cDNA-Sequenzen wurden diese mittels PCR und sequenzspezifischer 5'- und 3'- Primer aus Gesamt-cDNA amplifiziert. Bei den Primern handelte es sich um FANCIP2-P (5'-GCC ACC ATC ATG CCT GGG C-3') und FANCIP2-M (5'-GCA TCC AGT TAA GCC AGA GC-3') bzw. FANCIP3-P (5"-GAA GCC TCT GAA GAT GAC ACG-3') und FANCIP3-M (5'-ATA ACT GGA ACA CTG ACT GGC-3'). Die Klonierung der PCR-Produkte erfolgte über die Smal-Schnittstelle in den Vektor pUC19. Die inserierten PCR-Produkte für FANCIP2 und FANCIP3 wurden nach Plasmidpräparation aus transformierten E. coli-Zellen komplett sequenziert, wobei zusätzliche interne FANCIP2- bzw. FANCIP3-spezifische sowie externe pUC19- spezifische Primer verwendet wurden.
Als Resultat ergab sich für die FANCIP2-cDNA eine 1471 Nukleotide lange Sequenz (Fig. 1) mit einem möglichen offenen Leserahmen von 1224 Nukleotiden bzw. 408 Codons. Der offene Leserahmen enthält zwei Sequenzbereiche mit 18 bp und 45 bp (fettgedruckte Abschnitte in Fig. 1), die unabhängig voneinander vorhanden sein können oder nicht. Für die FANCIP3-cDNA ergab sich eine 3580 Nukleotide lange Sequenz (Fig. 3) mit einem möglichen offenen Leserahmen von 3351 Nukleotiden bzw. 1117 Codons.
Um ähnliche Nukleotidsequenzen in der Sequenzdatenbank des "National Center of Biotechnology Information" (NCBI) zu finden, wurden die cDNA-Sequenzen von FANCIP2 bzw. FANCIP3 unter Verwendung des Blast-Programms am NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast?Jform=1) analysiert.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Es zeigen:
Fig. 1 (SEQ ID NOs. 1 - 4) Nukleotidsequenzen, die einen für FANCIP2 codierenden offenen Leserahmen enthalten,
Fig. 2 (SEQ ID NO. 5 - 8) Aminosäuresequenzen eines offenen Leserahmens der in Fig. 1 gezeigten Nukleotidsequenzen,
Fig. 3 (SEQ ID NO. 9) eine Nukleotidsequenz, die einen für FANCIP3 codierenden offenen Leserahmen enthält,
Fig. 4 (SEQ ID NO. 10) die Aminosäuresequenz eines offenen Leserahmens der in Fig. 3 gezeigten Nukleotidsequenz,
Fig. 5 (SEQ ID NOs. 11 und 12) die Nukleinsäureprimer, die zur Sequenzierung der Plasmid-inserierten FANCIP2- bzw. FANCIP3-Nukleotidsequenzen verwendet wurden,
Fig. 6 (SEQ ID NOs. 13 und 14) die Nukleinsäureprimer, die zur 5'-RACE-Analyse von FANCIP2 verwendet wurden,
Fig. 7 (SEQ ID NOs. 15 und 16) die Nukleinsäureprimer, die zur 5'-RACE-Analyse von FANCIP3 verwendet wurden, Fig. 8 (SEQ ID NOs. 17 und 18) die Nukleinsäureprimer, die zur PCR-Amplifikation des offenen Leserahmens von FANCIP2 verwendet wurden,
Fig. 9 (SEQ IDs NOs. 19 und 20) die Nukleinsäureprimer, die zur PCR-Amplifikation des offenen Leserahmens von FANCIP3 verwendet wurden.
Zitierte Literatur
Auerbach, A.D. und Allen, R. (1991). Leukemia and preleukemia in Fanconi anemia patients. Cancer Genet. Cytogenet. 51 , 1-12
Auerbach, A.D. (1993). Fanconi anemia diagnosis and the diepoxybutane (DEB) test. Exp. Hematol. 21 , 731-733
De Winter, J.P., Waisfisz, Q., Rooimans, M.A., van Berkel, C.G.M., Bosnoyan- Collins, L, Alon, N., Carreau, M., Bender, O., Demuth, I., Schindler, D., Pronk, J.C, Arwert, F., Hoehn, H., Digweed, M., Buchwald, M. und Joenje, H. (1998). The Fanconi anemia group G gene is identical with the human XRCC9. Nat. Genet. 20, 281 -283
De Winter, J.P., Rooimans, M.A., van der Weel, L., van Berkel, CG., Alon, N., Bosnoyan-Collins, L., de Groot, J., Zhi, Y., Waisfisz, Q., Pronk, J.C., Arwert, F., Mathew, CG., Scheper R.J., Hoatlin, M.E., Buchwald, M. und Joenje, H. (2000). The Fanconi anaemia gene FANCF encodes a novel protein with homology to ROM. Nat. Genet. 24, 15-16
The Fanconi anaemia/Breast cancer consortium (1996). Positional cloning of the Fanconi anaemia group A gene. Nat. Genet. 14, 324-328
Fields, S. und Song, O. (1989). A novel genetic System to detect protein-protein interactions. Nature 340, 245-246 Finley Jr., R.L. und Brent, R. (1996). Interaction trap cloning with yeast. In DNA Cloning-Expression Systems (Hrsg. D. Glover und B.D. Hanes), Oxford University Press, Oxford, England
Garcia-Higuera, I., Kuang, Y., Naf, D., Wasik, J. und D'Andrea, A.D. (1999). Fanconi anemia proteins FANCA, FANCC, and FANCG/XRCC9 interact in a functional nuclear complex. Mol. Cell Biol. 19, 4866-4873
Glanz, A. und Fräser, F. (1982). Spectrum of anomalies in Fanconi's anemia. J. Med. Genet. 19, 412-416
Hoshino, T., Wang, J., Devetten, M.P., Iwata, N., Kajigaya, S., Wise, R., Liu, J.M. und Youssoufian, H. (1998). Molecular chaperone GRP94 binds to the Fanconi anemia group C protein and regulates its intracellular expression. Blood 91 , 4379-4386
Joenje, H., Arwert, F., Eriksson, A., De Koning, H. und Oostra, A. (1981 ). Oxygen dependence of chromosomal aberrations in Fanconi's anemia. Nature 290, 142-143
Joenje, H., Oostra, A.B., Wijker, M., di Summa, F.M., van Berkel, C.G.M., Rooimans, M.A., Ebell, W., van Weel, M., Pronk, J.C, Buchwald, M. und Arwert, F. (1997). Evidence for at least eight Fanconi anemia genes. Am. J. Hum. Genet. 61 , 940-944
Kruyt, F.A.E., Hoshino, T., Liu, J.M., Joseph, P., Jaiswal, A.K. und Youssoufian, H. (1998). Abnormal microsomal detoxification implicated in Fanconi anemia group C by interaction of the FAC protein with NADPH cytochrome P450 reductase. Blood 92, 3050-3056
Kubbies, M., Schindler, D., Hoehn, H. und Rabinovitch, P. (1985). Endogenous blockage and delay of the chromosome cycle despite normal recruitment and growth phase explain poor proliferation and frequent endomitosis in Fanconi anemia cells. Am. J. Human. Genet. 37, 1022-1030 Kupfer, G.M., Näf, D., Suliman, A., Pulsipher, M. und D'Andrea, A.D. (1997a). The Fanconi anaemia proteins, FAA and FAC, interact to form a nuclear complex. Nat. Genet. 17, 487-490
Kupfer, G.M., Yamashita, T., Näf, D., Suliman, A., Asano, S. und D'Andrea, A.D. (1997b). The Fanconi anemia polypeptide, FAC, binds to the cyclin-dependent kinase, cdc2. Blood 90, 1047-1054
Lai, C.H., Chou, C.Y., Ch'ang, L.Y., Liu, C.S. und Lin, W.C. (2000). Identification of novel human genes evolutionary conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10, 703-713
Lo Ten Foe, J.R., Rooimans, M.A., Bosnoyan-Collins, L., Alon, N., Wijker, M., Parker, L., Lightfoot, J., Carreau, M., Callen, D.F., Savoia, A., Cheng, N.C, van Berkel, C.G.M., Strunk, M.H.P., Gille, J.J.P., Pals, G., Kruyt, F.A.E., Pronk, J.C, Arwert, F., Buchwald, M. und Joenje, H. (1996). Expression cloning of a cDNA for the major Fanconi anaemia gene, FAA. Nat. Genet. 14, 320-323
Matsumoto-Taniura, N., Pirollet, F., Monroe, R., Gerace, L. und Westendorf, J.M. (1996). Identification of novel M phase phosphoproteins by expression cloning. Mol. Biol. Cell 7, 1455-1469
Planitzer, S.A., Machl, A.W., Rueckels, M. und Kubbies, M. (1998). Identification of a novel c-DNA overexpressed in Fanconi's anemia fibroblasts partially homologous to a putative L-3-phosphoserine-phosphatase. Gene 210, 297-306
Poot, M., Groß, O., Epe, B., Pflaum, M. und Hoehn, H. (1996). Cell cycle defect in connection with oxygen and iron sensitivity in Fanconi anemia lymphoblastoid cells. Exp. Cell Res. 222, 262-268
Reuter, T., Herterich, S., Bernhard, O., Hoehn, H. und Gross, H.J. (2000). Strong FANCA/FANCG but weak FANCA/FANCC interaction in the yeast two-hybrid System. Blood 95, 719-720 Saar, K., Schindler, D., Wegner, R.D., Reis, A., Wienker, T.F., Hoehn, H., Joenje, H., Sperling, K. und Digweed, M. (1998). Localisation of a new Fanconi anemia gene to chromosome 9p. Eur. J. Hum. Genet. 6, 501-508
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York
Schindler, D. und Hoehn, H. (1988). Fanconi anemia mutation causes cellular susceptibility to ambient oxygen. Am. J. Hum. Genet. 43, 429-435
Seyschab, H., Friedl, R., Sun, Y., Schindler, D., Hoehn, H., Hentze S. und Schroeder-Kurth, T. (1995). Comparative evaluation of diepoxybutane sensitivity and cell cycle blockage in the diagnosis of Fanconi anemia. Blood 85, 2233-2237
Poot, M., Groß, O., Epe, B., Pflaum, M. und Hoehn, H. (1996). Cell cycle defect in connection with oxygen and iron sensitivity in Fanconi anemia lymphoblastoid cells. Exp. Cell Res. 222, 262-268
Strathdee, CA., Gavish, H., Shannon, W.R. und Buchwald, M. (1992). Cloning of cDNAs for Fanconi's anaemia by functional complementation. Nature 256, 763-767
Waisfisz, Q., de Winter, J.P., Kruyt, F.A., de Groot, J., van der Weel, L., Dijkmans, L.M., Zhi, Y., Arwert, F., Scheper, R.J., Youssoufian, H., Hoatlin, M.E. und Joenje, H. (1999). A physical complex of the Fanconi anemia proteins FANCG/XRCC9 and FANCA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96, 10320-10325
Yamashita, T., Kupfer, G.M., Näf, D., Suliman, A., Joenje, H., Asano, S. und D'Andrea, A.D. (1998). The Fanconi anemia pathway requires FAA phosphorylation and FAA/FAC nuclear aecumulation. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95, 13085-13090

Claims

Patentansprüche
1. Nukleinsäure, die a) die in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellte Nukleotidsequenz oder einen Proteincodierenden Abschnitt davon, b) eine den Sequenzen aus a) im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes entsprechende Nukleotidsequenz, c) eine mit den Sequenzen aus a) und/oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisierende Nukleotidsequenz oder d) eine zu den Sequenzen aus a) und/oder b) komplementäre Sequenz umfaßt.
2. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 , die einen vorzugsweise mindestens 30 Nukleotide umfassenden Protein-codierenden Abschnitt der in Fig. 1 bzw. Fig. 3 dargestellten Nukleotidsequenz umfaßt.
3. Nukleinsäure, die eine Homologie von mehr als 65% zu der Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 oder einem Abschnitt davon aufweist.
4. Modifizierte Nukleinsäure oder Nukleinsäureanalogon, die eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 umfassen.
5. Rekombinanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einen Abschnitt davon enthält.
6. Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 5, der die Expression der Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle ermöglicht.
7. Mit einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem Vektor gemäß Anspruch 5 oder 6 transformierte Zelle, ein entsprechender transgener Organismus oder Tiermodelle, die das Produkt der Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 stabil exprimieren (knock-in) oder deren entsprechendes natürliches Gen gezielt zerstört wurde (knock-out).
8. Polypeptid oder dessen Salz, das von einer Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert ist.
9. Polypeptid gemäß Anspruch 8, das a) die in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellte Aminosäuresequenz oder b) eine Homologie von mehr als 60% zu der in Fig. 2 bzw. Fig. 4 dargestellten Aminosäuresequenz aufweist, oder dessen Salz.
10. Fragment des Polypeptids gemäß Anspruch 8 oder 9 mit mindestens 100 Aminosäuren oder dessen Salz.
11. Modifiziertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 8 oder 9 umfaßt.
12. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids gemäß Anspruch 8 oder 9, das die Kultivierung von Zellen gemäß Anspruch 7 umfaßt sowie die Isolierung des Polypeptids gemäß Anspruch 8 oder 9.
13. Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 8 oder 9 oder von Fragmenten dieses Polypeptids als Immunogen zur Herstellung von Antikörpern.
14. Antikörper gegen ein Polypeptid gemäß Anspruch 8 oder 9.
15. Verfahren zur Identifizierung von Effektoren eines Proteins gemäß Anspruch 8 oder 9, mit dessen Hilfe verschiedene potentielle Effektorsubstanzen an Zellen getestet werden können, die das Protein exprimieren.
16. Substanz, die mit Hilfe des Verfahrens gemäß Anspruch 15 erhalten wurde und die mit mindestens einem Bereich des Proteins gemäß Anspruch 8 oder 9 reagiert und/oder dieses verändert.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung, die als aktive Komponente a) eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, b) einen Vektor gemäß Anspruch 5 oder 6, c) eine Zelle gemäß Anspruch 7, d) ein Polypeptid gemäß Anspruch 8, 9,10 oder 11 , e) einen Antikörper gemäß Anspruch 14 umfaßt oder f) eine Substanz gemäß Anspruch 16 und pharmazeutisch übliche Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe enthält.
18. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Diagnostik von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind, oder einer Prädisposition solcher Erkrankungen.
19. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus- Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind.
20. Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 zur Gentherapie von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind.
21. Verfahren zur Diagnostik von Erkrankungen, die mit DNA-Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind oder einer Prädisposition für solche Erkrankungen, bei dem man einen Patienten oder eine aus dem Patienten stammende Probe mit einer Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 in Kontakt bringt und die Nukleotidsequenz und/oder die Expression einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 bestimmt.
2. Verfahren zur Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die mit DNA- Reparatur-Defekten, Zellzyklus-Störungen, Cytopenien, Tumorgenese und/oder Tumorprogression assoziiert sind, bei dem man einem Patienten eine Zusammensetzung gemäß Anspruch 17 verabreicht, die die aktive Komponente in einer gegen die Erkrankung wirksamen Menge enthält.
PCT/EP2000/005878 1999-06-29 2000-06-26 cDNA-SEQUENZEN VON ZWEI INTERAKTOREN FANCIP2 UND FANCIP3 DES FANCONI-ANÄMIE-PROTEINS DER KOMPLEMENTATIONSGRUPPE A WO2001000822A2 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001506815A JP2003503053A (ja) 1999-06-29 2000-06-26 ファンコーニ貧血相補群Ａタンパク質の２相互作用子ＦＡＮＣＩＰ２とＦＡＮＣＩＰ３のｃＤＮＡ配列
AU58198/00A AU5819800A (en) 1999-06-29 2000-06-26 Cdna sequences of two interacting fancip2 and fancip3 of the fanconi anemia complementation group a protein
EP00943885A EP1194547A2 (de) 1999-06-29 2000-06-26 cDNA-SEQUENZEN VON ZWEI INTERAKTOREN FANCIP2 UND FANCIP3 DES FANCONI-ANÄMIE-PROTEINS DER KOMPLEMENTATIONSGRUPPE A

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19929887A DE19929887A1 (de) 1999-06-29 1999-06-29 cDNA-Sequenzen von zwei Interakoren FANCIP2 und FANCIP3 des Fanconi-Anämie-Proteins der Komplementationsgruppe A
DE19929887.4 1999-06-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2001000822A2 true WO2001000822A2 (de) 2001-01-04
WO2001000822A3 WO2001000822A3 (de) 2001-07-05

Family

ID=7913003

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2000/005878 WO2001000822A2 (de) 1999-06-29 2000-06-26 cDNA-SEQUENZEN VON ZWEI INTERAKTOREN FANCIP2 UND FANCIP3 DES FANCONI-ANÄMIE-PROTEINS DER KOMPLEMENTATIONSGRUPPE A

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1194547A2 (de)
JP (1) JP2003503053A (de)
AU (1) AU5819800A (de)
DE (1) DE19929887A1 (de)
WO (1) WO2001000822A2 (de)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998014462A1 (en) * 1996-10-04 1998-04-09 Fanconi Anemia Research Fund, Inc. cDNA FOR FANCONI ANEMIA COMPLEMENTATION GROUP A

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU6765098A (en) * 1997-03-19 1998-10-12 Genetics Institute Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998014462A1 (en) * 1996-10-04 1998-04-09 Fanconi Anemia Research Fund, Inc. cDNA FOR FANCONI ANEMIA COMPLEMENTATION GROUP A

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE EMBL [Online] Entry AF151813, 1. Juni 1999 (1999-06-01) LIN W.-C.: "Homo sapiens CGI-55 protein mRNA, complete cds." Database accession no. AF151813 XP002159188 & LAI C.-H. ET AL.: "Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics" GENOME RESEARCH, Bd. 10, Nr. 5, 2000, Seiten 703-713, XP000929862 *
DATABASE EMBL [Online] Entry HSMPP9, 8. Januar 1997 (1997-01-08) WESTENDORF J.M.: "H. sapiens mRNA for M-phase phosphoprotein, mpp9" Database accession no. X98258 XP002159189 & NAOKO MATSUMOTO-TANIURA ET AL.: "Identification of novel M phase phosphoproteins by expression cloning" MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL, Bd. 7, Nr. 9, September 1996 (1996-09), Seiten 1455-1469, XP000979479 *
DATABASE SWALL [Online] Entry Q9Y4S3, 1. November 1999 (1999-11-01) WAMBUTT R. ET AL.: "Hypothetical 42.4 kDa protein" Database accession no. Q9Y4S3 XP002159190 *
HOSHINO T ET AL: "Molecular chaperone GRP94 binds to the Fanconi anemia group C protein and regulates its intracellular expression." BLOOD, (1998 JUN 1) 91 (11) 4379-86. , XP002159187 *
STANLEY FIELDS ET AL.: "A novel genetic system to detect protein-protein interactions" NATURE, Bd. 340, Nr. 6230, 1989, Seiten 245-246, XP000103144 LONDON GB in der Anmeldung erw{hnt *

Also Published As

Publication number Publication date
DE19929887A1 (de) 2001-01-11
JP2003503053A (ja) 2003-01-28
EP1194547A2 (de) 2002-04-10
AU5819800A (en) 2001-01-31
WO2001000822A3 (de) 2001-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE19964269B4 (de) Verfahren zur Detektion des Proliferationspotentials von Zellen
DE69635482T2 (de) Säugetieren apoptosis inhibitorprotein genfamilie, primers, probes und verfahren zur nachweis
DE69631540T2 (de) Materialien und methoden mit bezug zur identifizierung und sequenzierung des krebs-suszeptilitaetsgens brca2 und dessen anwendungen
DE69838905T2 (de) Transkriptionsfaktor islet-brain 1 (ib1)
DE69839105T2 (de) XAF Gene und Polypeptide und deren Verwendung zur Modulation der Apoptose
DE60109430T2 (de) An entzündlichen darmerkrankungen beteiligte gene und deren verwendung
EP1483389B1 (de) Differentiell in tumoren exprimierte genprodukte und deren verwendung
DE60128830T2 (de) Regulierung der expression von eer-7, ein mitglied der lysyl oxidase genfamilie, durch oestrogenrezeptoren
DE10215321A1 (de) Trp-p8 Splice Varianten und regulatorische RNA
DE69733861T2 (de) Verwendung von neuronalem apoptose-inhibitorprotein
DE60025480T2 (de) Methoden zur identifizierung von modulatoren wechselwirkender proteine
EP0805204B1 (de) Nebenhoden-spezifisches Rezeptorprotein und dessen Verwendung
DE60117788T2 (de) Menschliche wingless-ähnliche gene
DE60107431T2 (de) Ein neues mitglied der epha-rezeptor familie
DE69734890T2 (de) Rdgb-proteine
DE69934580T2 (de) Mit cd40 und traf interagierende proteine
WO2001000822A2 (de) cDNA-SEQUENZEN VON ZWEI INTERAKTOREN FANCIP2 UND FANCIP3 DES FANCONI-ANÄMIE-PROTEINS DER KOMPLEMENTATIONSGRUPPE A
WO2001040461A2 (de) cDNA-SEQUENZEN VON ZWEI INTERAKTOREN FANCIP4 UND FANCIP5 DER FANCONI-ANÄMIE-PROTEINE DER KOMPLEMENTATIONSGRUPPEN A UND C
WO2000046244A1 (de) cDNA-SEQUENZ EINES INTERAKTORS FANCIP1 DES FANCONI-ANÄMIE-PROTEINS DER KOMPLEMENTATIONSGRUPPE A
DE69933690T2 (de) Apoptosis induzierender faktor
DE60033146T2 (de) Inhibitorprotein der transkriptionsaktivierung
DE69823022T2 (de) Neues, menschliches tumorsuppressorgen.
DE60123754T2 (de) Neuer transkriptionsfaktor carp-2
DE60024862T2 (de) "insulinabhängiges sequenz dna bindendes protein-1" (irsdbp-1), dafür kodierendes gen und ihre verwendungen
DE60122684T2 (de) Akuter neuronal-induzierter liganden des calcium-bindenden protein-1

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AL AM AU AZ BA BB BG BR BY CA CN CR CU CZ DM EE GD GE HR HU ID IL IN IS JP KG KP KR KZ LC LK LR LT LV MA MD MG MK MN MX NO NZ PL RO RU SG SI SK TJ TM TR TT TZ UA US UZ VN YU ZA

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AE AL AM AU AZ BA BB BG BR BY CA CN CR CU CZ DM EE GD GE HR HU ID IL IN IS JP KG KP KR KZ LC LK LR LT LV MA MD MG MK MN MX NO NZ PL RO RU SG SI SK TJ TM TR TT TZ UA US UZ VN YU ZA

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000943885

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000943885

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10018723

Country of ref document: US

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 2000943885

Country of ref document: EP