ES2283147T3 - Diana de farmacos en candida albicans. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico, que consiste en mARN o cADN que codifica un polipéptido que es crítico para la supervivencia y crecimiento de la levadura Candida albicans, molécula de ácido nucleico que es al menos un 70% homóloga a la secuencia de nucleótidos ilustrada en la SEQ ID No 1.

Description

Diana de fármacos en Candida albicans.

La presente invención se refiere a la identificación de un gen de Candida albicans que es crítico para el crecimiento y la división celular, gen que puede ser usado como una diana de fármacos selectivos para tratar infecciones asociadas con Candida albicans. Se proporciona también una secuencia de ácidos nucleicos de Candida albicans y que codifica el polipéptido que es crítico para el crecimiento de Candida albicans.

Las infecciones oportunistas en hospedantes inmunodeprimidos representan una causa crecientemente común de mortalidad y morbilidad. Las especies Candida están entre los agentes págatenos fúngicos más comúnmente identificados asociados con estas infecciones oportunistas, y Candida albicans es la especie más común. Estas infecciones fúngicas son por tanto problemáticas, por ejemplo, en poblaciones con SIDA además de mujeres sanas normales en las que las levaduras de Candida albicans representan la causa más común de vulvovaginitis.

Aunque existen compuestos para tratar estos trastornos, como anfotericina, estos fármacos son generalmente limitados en su tratamiento debido a su toxicidad y efectos secundarios. Por lo tanto, existe una necesidad de nuevos compuestos que puedan ser usados para tratar infecciones asociadas con Candida además de compuestos que sean selectivos en su acción contra Candida albicans.

Las aproximaciones clásicas para identificar compuestos anti-fúngicos han estado basadas casi exclusivamente en la inhibición del crecimiento fúngico o de levaduras como un punto final. Las bibliotecas de productos naturales, productos químicos semi-sintéticos o sintéticos son seleccionadas en cuanto a su capacidad para destruir o detener el crecimiento del agente patógeno diana o un organismo de modelo no patógeno relacionado. Estos ensayos son dificultosos y no proporcionan ninguna información sobre un mecanismo de acción del compuesto. Los principales compuestos prometedores que surgieron de estas selecciones deben ser seguidamente ensayados en cuanto a una posible toxicidad para el hospedante y posteriormente deben ser realizados estudios del mecanismo detallado de acción para identificar la diana molecular afectada.

Los presentes inventores han identificado ahora una secuencia de ácidos nucleicos de Candida albicans que codifica un polipéptido que es crítico para su supervivencia y crecimiento. Está secuencia representa una nueva diana que puede ser incorporada en un ensayo para identificar selectivamente compuestos capaces de inhibir la expresión de estos polipéptidos y su uso potencial para aliviar enfermedades o estados asociados con una infección de Candida albicans.

Por lo tanto, según un primer aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es crítico para la supervivencia y crecimiento de las levadura Candida albicans, molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias de nucleótidos ilustradas en la ID de secuencia nº 1.

Aunque las moléculas definidas en la presente memoria descriptiva se ha establecido que son críticas para el crecimiento y el metabolismo de Candida albicans, para algunas de las moléculas no ha sido asignada ninguna funcionalidad aparente debido al hecho de que no se pudo encontrar ninguna secuencia funcionalmente relacionada en otro organismo procariótico o eucariótico en bases de datos representativas. Por tanto, ventajosamente, estas secuencias pueden ser especies específicas, en cuyo caso pueden ser usadas como dianas selectivas para el tratamiento de enfermedades mediadas por una infección de Candida albicans.

Las letras utilizadas en la secuencia según la invención, que no son reconocibles como letras del código genético, significan una posición en la secuencia de ácidos nucleicos en la que una o más bases A, G, C o T pueden ocupar la posición de los nucleótidos. La letras representativas usadas para identificar la gama de bases que pueden ser usadas son como sigue:

M:

A o C

R:

A o G

W:

A o T

S:

C o G

Y:

C o T

K:

G o T

V:

A o C o G

H:

A o C o T

D:

A o G o T

B:

C o G o T

N:

G o A o T o C

En una realización de cada uno de los aspectos anteriormente identificados de la invención, el ácido nucleico puede comprender una molécula de mARN o, alternativamente, una molécula de ADN y preferentemente de cADN.

También se proporciona mediante la presente invención una molécula de ácido nucleico capaz de hibridarse a las moléculas de ácidos nucleicos ilustradas en la Figura 1 bajo condiciones de alta restricción, condiciones que son generalmente conocidas por los expertos en la técnica.

El carácter restrictivo de la hibridación como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a condiciones bajo las cuales son estables los poli(ácidos nucleicos). La estabilidad de los híbridos es reflejada en la temperatura de fusión (Tm) de los híbridos. La Tm puede resultar aproximada por medio de la fórmula:

81,5^{o}C + 16.6 (Log_{10}[Na^{+}]+0.41(%G&C)-600L/L

en la L es la longitud de los híbridos en los nucleótidos. La Tm disminuye aproximadamente en 1-1,5ºC con cada disminución de 1% en la homólogia de las secuencias.

El término "restrictivo" se refiere a las condiciones de hibridación en las que un ácido nucleico de cadena única se une a una cadena complementaria cuando las bases de purina o pirrilidina en la misma se emparejan con su correspondiente base mediante un enlace de hidrógeno. Las condiciones altamente restrictivas favorecen un emparejamiento de bases homólogas, mientras que las condiciones de poco restrictivas desfavorecen el emparejamiento de bases no homólogas.

Las condiciones "poco restrictivas" comprenden, por ejemplo, una temperatura de aproximadamente 37ºC o menos, una concentración de formamida de menos de aproximadamente 50% y una concentración de sales (SSC) moderada a baja; o alternativamente, una temperatura de aproximadamente 50ºC o menos y una concentración de sales moderada a alta (SSPE), por ejemplo, NaCl 1 M.

Las condiciones "altamente restrictivas" comprenden, por ejemplo, una temperatura de aproximadamente 42ºC o menos, una concentración de formamida de menos de aproximadamente 20% y una concentración baja de sales (SSC); o, alternativamente, una temperatura de aproximadamente 65ºC o menos y una concentración de sales baja (SSPE). Por ejemplo, las condiciones altamente restrictivas comprenden una hibridación en NaHPO_{4} 0,5 M, dodecil-sulfato de sodio (SDS) al 7%, EDTA a 1 mM a 65ºC (Ausubel, F. M. y cols. Current Protocols in Molecular Bioloav, Vol. I, 1989; Green Inc. New York, at 2.10.3).

"SSC" comprende una solución de hibridación y lavado. Una solución SSC de madre 20X contiene cloruro de sodio 3 M, citrato de sodio 0,3 M, pH 7,0.

"SSPE" comprende una solución de hibridación y lavado. Una solución SSPE 1X contiene NaCl 180 mM, Na_{2}HPO_{4} 9 mM y EDTA 1 mM, pH 7,4.

El ácido nucleico capaz de hibridarse a moléculas de ácidos nucleicos según la invención será generalmente al menos un 70%, preferentemente al menos 80 o 90% y más preferentemente al menos 95% homólogo a las secuencias de nucleótidos ilustrada en la Figura 1.

Las moléculas de ADN según la invención pueden estar incluidas, ventajosamente, en un vector de expresión adecuado para expresar polipéptidos codificados a partir del mismo en un hospedante adecuado, que sean críticos para el crecimiento y supervivencia Candida albicans.

Un vector de expresión según la invención incluye un vector que tiene un ácido nucleico según la invención funcionalmente unido a secuencias reguladoras, como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de dichos fragmentos de ADN. La expresión "funcionalmente unidas" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en la manera prevista. Estos vectores pueden ser transformados en una célula hospedante adecuada para proporcionar la expresión de un polipéptido según la invención. Por tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento para preparar polipéptidos según la invención, que comprende cultivar una célula hospedante, transformada, transfectada o infectada con un vector de expresión como se describió anteriormente, bajo condiciones que proporcionen la expresión por medio del vector de una secuencia codificadora que codifique los polipéptidos, y recuperar los polipéptidos expresados.

Los vectores pueden ser por ejemplo, vectores de plásmidos, virus o fagos con un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho nucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más marcadores seleccionables como, por ejemplo, resistencia a la ampicilina.

Los elementos reguladores necesarios para la expresión incluyen secuencias de promotores para unir ARN polimerasa y secuencias de inicio de la transcripción para la unión de ribosomas. Por ejemplo, un vector de expresión bacteriana puede incluir un promotor como el promotor Lac y para el inicio de la traducción la secuencia de Shine-Dalgarno y el codon de inicio AUG. Análogamente, un vector de expresión eucariótico puede incluir un promotor heterólogo u homólogo para ARN polimerasa II, una señal de poliadenilación en dirección descendente, el codon de inicio AUG y un codon de terminación para la separación del ribosoma. Estos vectores pueden ser obtenidos comercialmente o ser constituidos a partir de las secuencias descritas mediante métodos bien conocidos en la técnica.

Los polinucleótidos según la invención pueden ser insertados en los vectores descritos en una orientación antisentido con el fin de proporcionar la producción de ARN antisentido. El ARN antisentido u otros ácidos nucleicos antisentido pueden ser producidos mediante medios sintéticos.

De acuerdo con la presente invención, un ácido nucleico definido incluye no solamente el ácido nucleico idéntico sino también cualesquiera variaciones menores de bases que incluyen, en particular, sustituciones en bases que dan lugar a un codon sinónimo (un codon diferente que especifica el mismo residuo de aminoácido) debido al código degenerado. La expresión "secuencia de ácidos nucleicos" incluye también la secuencia complementaria a cualquier secuencia dada de cadena única independientemente de las variaciones de bases.

La presente invención comprende también dentro de su alcance las proteínas o polipéptidos expresados mediante las moléculas de ácidos nucleicos según la invención o un equivalente funcional, derivado o bioprecursor de las mismas.

Las secuencias de ácidos nucleicos de al menos aproximadamente 10 nucleótidos contiguos de un ácido nucleico según la invención y preferentemente, de 10 a aproximadamente 120 nucleótidos, y las secuencias de ácidos nucleótidos proporcionadas a partir de 10 a 50 nucleótidos, pueden ser ventajosamente usadas como sondas o cebadores para iniciar la replicación o similar. Estas secuencias de ácidos nucleicos pueden ser producidas según técnicas bien conocidas en el estado de la técnica, como a través de medios recombinantes o sintéticos. Pueden ser usadas también en estuches de ensayo de diagnóstico o similares para detectar la presencia de un ácido nucleico según la invención. Estos ensayos comprenden generalmente poner en contacto la sonda con la muestra bajo condiciones de hibridación y detectar la presencia de cualquier formación dúplex o tríplex entre la sonda y cualquier ácido nucleico en la muestra.

Estas sondas pueden estar ancladas a un soporte sólido. Preferentemente están presentes en una hilera de forma que múltiples sondas se puedan hibridar simultáneamente a una única muestra biológica. Las sondas pueden ser esparcidas sobre la hilera o ser sintetizadas in situ en la hilera. Véase la publicación de Lockhart y cols., Nature Biotechnology, vol. 14, Diciembre de 1996, "Expression monitoring by hybridization to high-density oliginucleotide arrays". Una única hilera puede contener más de un millón de sondas diferentes en lugares discretos.

Ventajosamente, las secuencias de ácidos nucleicos según la invención pueden ser producidas usando estos medios recombinantes o sintéticos como, por ejemplo, usando mecanismos de clonación por PCR que incluyen generalmente preparar un par de cebadores, que pueden tener entre aproximadamente 100 y 120 nucleótidos hasta una región del gen que se desea que sea clonada, poniendo los cebadores en contacto con mARN, cADN o ADN genómico de una célula, realizando una reacción de cadena de polimerasa bajo condiciones que lleven a cabo la amplificación de la región deseada, aislando la región o fragmento amplificado y recuperando el ADN amplificado. Generalmente, estas técnicas como las definidas en la presente memoria descriptiva son bien conocidas en el estado de la técnica, como se describe por Sambrook y cols. (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989).

Los ácidos nucleicos u oligonucleótidos según la invención pueden portar una etiqueta reveladora. Las etiquetas adecuadas incluyen radioisótopos como P^{32} o S^{39}, etiquetas de enzimas u otras etiquetas de proteínas como biotina o marcadores fluorescentes. Estas etiquetas pueden ser añadidas a los ácidos nucleicos u oligonucleótidos de la invención y pueden ser detectadas usando técnicas conocidas por sí mismas.

El polipéptido o proteína según la invención incluye todas las posibles variantes de aminoácidos codificadas por la molécula de ácidos nucleicos según la invención, que incluye un polipéptido codificado por dicha molécula y que tiene cambios conservadores de aminoácidos. Los polipéptidos según la invención incluyen adicionalmente variantes de estas secuencias, que incluyen variantes alélicas que se producen de forma natural, que son sustancialmente homólogas a dichos polipéptidos. En este contexto, una homología sustancial es considerada como una secuencia que tiene al menos un 70%, preferentemente 80% o 90% de homología de aminoácidos con los polipéptidos codificados por las moléculas de ácidos nucleicos según la invención.

Las secuencias de nucleótidos según la invención son particularmente ventajosas como dianas terapéuticas selectivas para tratar infecciones asociadas a Candida albicans. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido capaz de unirse a la secuencia de ácidos nucleicos ilustrada en la Figura 1 puede ser usado para inhibir selectivamente la expresión de los correspondientes polipéptidos, conduciendo a un crecimiento dificultado del Candida albicans con reducciones de patologías o enfermedades asociadas.

La molécula de ácido nucleico de polipéptido según la invención puede ser usada como un medicamento, o en la preparación de un medicamento, para tratar enfermedades o estados asociados con una infección de Candida albicans.

Ventajosamente, la molécula de ácido nucleico o el polipéptido según la invención puede ser proporcionado en una composición farmacéutica junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable para el mismo.

La tecnología antisentido puede ser usada para regular la expresión génica a través de la formación de hélices triples de ADN o ARN antisentido, y los dos métodos están basados en la unión de un polinucleótido a ADN o ARN. Un oligonucleótido de ADN es diseñado para ser complementario a una región del gen involucrada en la transcripción (hélice triple: véase la publicación de Lee y cols. Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney y cols., Science, 241: 456 (1988); y Dervar y cols., Science, 251: 1360 (1991), Evitando así la transcripción y la producción de la correspondiente proteína. El oligonucleótido de ARN antisentido se hibrida al mARN in vivo y bloquea la traducción de una molécula de mARN en la correspondiente proteína (antisentido; Okano, J. Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)).

Los anticuerpos para la proteína o polipéptido de la presente invención pueden ser preparados, ventajosamente, mediante técnicas que son conocidas en el estado de la técnica. Por ejemplo, pueden ser preparados anticuerpos policlonales inoculando un animal hospedante, como un ratón, con el polipéptido según la invención o un epitopo del mismo y recuperando suero inmune. Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados según técnicas conocidas como es descrito por Kohler R. and Milstein C., Nature (1975) 256,495-497.

Los anticuerpos pueden ser usados también en un método para detectar la esencia de un polipéptido según la invención, método que comprende hacer reaccionar el anticuerpo con una muestra e identificar cualquier proteína unida a dicho anticuerpo. Puede ser proporcionado también un estuche de ensayo para realizar dicho método, que comprende un anticuerpo según la invención y medios para hacer reaccionar el anticuerpo con dicha muestra.

Las proteínas que pueden interaccionar con el polipéptido de la invención pueden ser identificadas investigando las interacciones de proteína-proteína usando el sistema de dos vectores híbridos propuesto en primer lugar por Chien y cols. (1991).

Esta técnica está basada en la reconstitución funcional in vivo de un factor de transcripción que activa un gen reportero. Más particularmente, la técnica comprende proporcionar una célula hospedante apropiada con una construcción de ADN que comprende un gen reportero, bajo el control de un promotor regulado por un factor de transcripción que tiene un dominio de unión a ADN y un dominio de activación, expresar en la célula hospedante una primera secuencia de ADN hibrida que codifique una primera fusión de un fragmento o la totalidad de una secuencia de ácidos nucleicos según la invención y dicho dominio de unión a ADN o bien dicho dominio de activación del factor de transcripción, expresar en el hospedante al menos una secuencia de ADN híbrida como una biblioteca o similar, que codifique proteínas de unión putativa que van a ser investigadas junto con el dominio de unión o activación de ADN del factor de transcripción que no es incorporado en la primera fusión; detectar cualquier unión de las proteínas que van a ser investigadas con una proteína según la invención detectando la presencia de cualquier producto de gen reportero en la célula hospedante; y opcionalmente aislar las segundas secuencias de ADN híbridas que codifican la proteína de unión.

Un ejemplo de esta técnica utiliza la proteína GAL4 en levadura. La GAL4 es un activador trasncripcional del metabolismo de galactosa en levadura y tiene un dominio separado para la unión a activadores en dirección ascendente de los genes que metabolizan galactosa, así como un dominio de unión a proteínas. Pueden ser construidos vectores de nucleótidos, uno de los cuales comprende los residuos de nucleótidos que codifican el dominio de unión a ADN de GAL4. Estos residuos del dominio de unión pueden ser fusionados a una secuencia que codifique proteínas conocidas como, por ejemplo, los ácidos nucleicos según la invención. El otro vector comprende los residuos que codifican el dominio de unión a proteínas de GAL4. Estos residuos son fusionados a residuos que codifican una proteína de ensayo. Cualquier interacción entre polipéptidos codificados por el ácido nucleico según la invención y la proteína que va a ser ensayada conduce a la activación transcripcional de una molécula reportera en una célula de levadura deficiente en transcripción de GAL4, en que han sido transformados los vectores. Preferentemente, una molécula reportera como \beta-galatosidasa es activada tras la restauración de la transcripción de los genes de metabolismo de galactosa de levadura.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para identificar compuestos que inhiben o interfieren selectivamente con la expresión o la funcionalidad de polipéptidos expresados a partir de las secuencias de nucleótidos expresadas en la Figura 1 o las trayectorias metabólicas en las que están involucrados estos polipéptidos y que son críticas para el crecimiento y la supervivencia de Candida Albicans, método que comprende (a) poner en contacto un compuesto que va a ser ensayado con un a o más células de Candida Albicans que tienen un mutación en una molécula de ácido nucleico según la invención, mutación que da lugar a la sobreexpresión o infraexpresión de dichos polipéptidos además de una o más células de Candida de tipo salvaje, (b) verificar el crecimiento y/o la actividad de dicha célula mutada en comparación con dicho tipo salvaje, en que el crecimiento o actividad diferenciadas de una o más de dichas células de Candida mutadas proporciona una indicación de la acción selectiva de dicho compuesto sobre dicho polipéptido u otro polipéptido en la misma trayectoria o una paralela.

Los compuestos identificables o identificados usando el método según la invención pueden ser usados ventajosamente como un medicamento, o en la preparación de un medicamento para tratar enfermedades o estados asociados con una infección de Candida Albicans. Estos compuestos pueden ser también ventajosamente incluidos en una composición farmacéutica junto con un vehículo diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable para los mismos.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un método para identificar secuencias de ADN de una célula u organismo, ADN que codifica polipéptidos que son críticos para el crecimiento o la supervivencia, método que comprende (a) preparar una biblioteca de cADN o genómica a partir de dicha célula u organismo en un vector de expresión adecuado, vector que es tal que puede integrarse en el genoma en dicha célula o bien que permite la transcripción de ARN antisentido a partir de las secuencias de nucleótidos en dicho cADN o biblioteca genómica, (b) seleccionar transformantes que exhiban un crecimiento dificultado y que determinen la secuencia de nucleótidos del cADN o secuencia genómica de la biblioteca incluida en el vector de dicho transformante. Preferentemente, la célula o organismo puede ser cualquier levadura u hongo filamentoso como, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe o Candida albicans.

Un aspecto adicional de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico o un polipéptido según la invención con un vehículo diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable para el mismo.

Las composiciones preferidas incluyen un vehículo o diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable como, por ejemplo, solución salina fisiológica. Pueden ser usados también otros vehículos farmacéuticamente aceptables que incluyan otras sales no toxicas, agua esterilizada o similar. Puede estar presente también un tampón adecuado que permita que las composiciones sean liofilizadas y almacenadas en condiciones estériles antes de la reconstitución mediante la adicción de agua esterilizada para una posterior administración. La incorporación de los polipéptidos de la invención en una matriz sólida o semisólida biológicamente compatible puede llevarse a cabo, la cual puede ser implantada en tejidos que requieren tratamiento.

El vehículo puede contener también otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar otras estados como el pH, osmolaridad, viscosidad, esterilidad, lipofilicidad, solubilidad o similares. Pueden ser incluidos también excipientes farmacéuticamente aceptables que permitan la liberación sostenida o retardada a continuación de la administración.

El polipéptido o molécula de ácido nucleico según la invención puede ser administrado por vía oral. En esta realización, pueden ser encapsulados y combinados con vehículos adecuados en formas de dosificación sólidas que serán bien conocidas por los expertos en la técnica.

Como será bien conocido por los expertos en la técnica, el régimen de dosificación específica puede ser calculado según el área superficial corporal del paciente o el volumen de espacio corporal que va a ser ocupado que depende de la vía de administración particular que va a ser usada. La cantidad de la composición realmente administrada, sin embargo, será determinada por un facultativo medico basándose en las circunstancias referentes al trastorno que va a ser tratado, como la gravedad de los síntomas, la composición que va a ser administrada, la edad, peso y respuesta del paciente individual y la vía de administración escogida.

La presente invención puede ser más fácilmente comprendida con referencia al ejemplo que se acompaña, que es meramente ilustrativo, con referencia a los dibujos que se acompañan, en los cuales

Figura 1: secuencia de nucleótidos aislada de Candida albicans y que tiene un función identificada basada en la homología de secuencias con proteínas de otros organismos, y secuencia que no está presente en el dominio público.

Figura 2: es una representación en diagrama del plásmido pGALlPNiST-1.

Figura 3: es una secuencia de nucleótidos del plásmido pGALlPNiST-1 de la Figura 10.

Figura 4: es una representación en diagrama del plásmido pGALlPSiST-1.

Figura 5: es una secuencia de nucleótidos del plásmido pGALlPSiST-1 de la Figura 12.

Figura 6: son secuencias de aminoácidos de las secuencias de ADN apropiadamente correspondientes ilustradas en la figura 1 con referencia a la tabla 1.

Figuras 7 y 8 son curvas de crecimiento de cepas de Candida albicans que muestran una reducción inducida antisentido en el crecimiento.

Figuras 9 y 12 son curvas de crecimiento de cepas de Candida albicans que incluyen deficiencias en el gen relevante identificado.

Ejemplo 1

Identificación de nuevas dianas de fármacos C. albicans mediante integración antisentido y de ruptura

El principio de la aproximación esta basado en el hecho de que cuando un mARN de C. albicans particular es inhibido produciendo el ARN antisentido complementario, disminuirá la correspondiente proteína. Si esta proteína es crítica para el crecimiento o la supervivencia, la célula que produce

\hbox{el
ARN antisentido crecerá más lentamente  o morirá.}

Como la inhibición antisentido se produce del ARN, el número de copias de genes es irrelevante, permitiendo así aplicaciones de la estrategia incluso en organismos diploides.

El ARN antisentido es producido de forma endógena a partir de un plásmido integrativo o episomal con un promotor inducible; la inducción del promotor conduce a la producción de un ARN codificado por el inserto del plásmido. Este inserto diferirá de un plásmido a otro en la biblioteca. Los insertos derivarán de fragmentos de ADN genómico o de cADN para cubrir en la medida de lo posible, el genoma completo.

El vector es un vector propietario que permite la integración mediante recombinación homóloga en el inserto homólogo o bien en la secuencia promotora en el genoma de Candida. Después de introducir plásmidos de cADN o bibliotecas genómicas en C. albicans, los transformantes son seleccionados en cuanto a la inducción del crecimiento dificultado después del promotor (por tanto, antisentido) en presencia de acetato de litio. El acetato de litio prolonga la fase G1 y, por tanto, permite que el antisentido actúe durante un periodo de tiempo prolongado durante el ciclo celular. Son seleccionados también transformantes que muestran crecimiento dificultado en medios tanto inducidos como no inducidos, mostrando por tanto un defecto de crecimiento debido a una ruptura integrativa.

Los transformantes que muestran un crecimiento dificultado se supone que contiene plásmidos que producen ARN antisentido para mARNs crítico para el crecimiento o supervivencia. El crecimiento es verificado mediando cuervas de crecimiento durante un periodo de tiempo en un dispositivo (Bioscreen Analyzer, Labsystems) que permite la mediación simultánea de curvas de crecimiento de 200 transformantes.

Posteriormente los plásmidos pueden ser recuperados de los transformantes y la secuencia de sus insertos puede ser determinada revelando así el mRNS que inhiben. Con el fin de hacer posible la recuperación del inserto genómico o de cADN que se ha integrado en el genoma de Candida, es aislado ADN genómico, cortado con un enzima que corta solamente una vez en el vector de la biblioteca (y se estima que aproximadamente cada 4096 bp (pares de bases) en el genoma) y es nuevamente ligado. La PCR con cebadores que flanquean el inserto producirá insertos genómicos (parciales) o de cADN en forma de fragmentos de PCR que pueden ser directamente secuenciados. Este análisis PCR (en la reacción de ligadura) mostrara también cuantas integraciones se producen. Alternativamente, la reacción de ligadura es transformada en E. coli y el análisis PCR es realizado sobre colonias o sobre ADN de plásmido derivado de las mismas.

Este método es empleado para una búsqueda amplia de genoma para nuevos genes de C. Albicans que son importantes para el crecimiento o supervivencia.

Materiales y métodos Construcción de pGal1PNiST-1

La cadena principal del vector pGALlPNiST-1 (vector antisentido integrativo SfiI-NotI) es pGEMllZf (+) (Promega Inc.). en primer lugar, el fragmento de promotor CaMAL2 EcoRI/SalI de PBV50 (D. H. Brown y cols. 1996) fue ligado en pGEMllZf (+) abierto a EcoRI/SalI dando lugar a la construcción intermedia pGEMMAL2P-1. En este último (MscI/CIP) el marcador de selección CaURA3 fue clonado como fragmento Eco47III/XmnI derivado de pRM2. El vector pGEMMAL2P-2 resultante estaba abierto en NotI/HindIII con el fin de aceptar el cassette NotI-stuffer-SfiI de pPCKlNiSCYCT-1 (fragmento EagI/HindIII): pMAL2PNiST-1. Finalmente, el plásmido pGALlPNiST-1 fue construido intercambiando el promotor SalI/Ecll36II MAL2 en pMAL2PNiST-1 mediante el fragmento del promotor XhoI/SmaI GAL1 derivado de pRM2GALlP.

Construcción de pGal1PSiST-1

El vector pGALlPSiST-1 fue creado para clonar los fragmentos pequeños de ADN genómico (flanqueados por sitios SfiI) detrás de promotor GAL1. La única diferencia pGALlPNiST-1 es que el fragmento de inserto hIFN\beta (fragmento stuffer) en pGALlPSiST-1 está flanqueado por dos sitios SfiI en lugar de SfiI y un sitio NotI como en pGALlPNiST-1. Para construir pGALlPSiST-1, el fragmento EcoRI HindIII, que contenía hIFN\beta flanqueado por un sitio SfiI y NotI, de pMAL2pHiET-3 (no publicado) fue intercambiado por el fragmento EcoRI-HindIII, que contenía hIFNss flanqueado por dos sitios SfiI, de YCp50S-S (Un vector de lanzamiento de E. coli/S. cerevisiae derivado del plásmido YCp50S-S, que está depositado en la colección ATCC (numero 37419; Tras y cols., 1985); un fragmento EcoRI-HindIII que contenía el gen hIFN\beta, que está flanqueado por dos sitios SfiI, fue insertado en YCp50S creando YCp50S-S), dando lugar el plásmido pMAL2PSiST-1. El promotor MAL2 de pMAL2PSiST-1 (por un digesto NaeI-balI) fue adicionalmente sustituido por el promotor GAL1 de pGAL1PNiST-1 (a través de un digesto Xhoy-FSPI), creando el vector pGAL1PSiST-1.

Librería genómica de Candida albicans * Preparación de fragmentos de ADN genómico

Se preparó una biblioteca de ADN genómico de Candida albicans con fragmentos pequeños de ADN (400 a 1.000 bp). Se alisto ADN genómico de Candida albicans B2630 siguiendo un protocolo modificado Blin y Stafford (1976). La calidad del ADN genómico aislado fue verificada mediante electroforesis sobre gel. El ADN sin digerir fue colocado sobre el gel por encima de la banda de marcador de 26.282 bp. Estuvo presente un pequeño frotis provocado por la fragmentación del ADN. Para obtener un enriquecimiento de los fragmentos de ADN genómico del tamaño deseado, el ADN Genómico fue parcialmente digerido. Fueron ensayadas varias enzimas de restricción (AluI, HaeIII y RsaI; todas las cuales creaban extremos romos). Las condiciones apropiadas del digesto fueron determinadas mediante titulación de la enzima. El enriquecimiento de fragmentos de ADN fue obtenido con 70 unidades de AluI en 10 \mug o ADN genómico durante 20 minutos. Se añadieron T4 ADN polimerasa (Boehringer) y dNTPs (Boehringer) para pulir los extremos del ADN. Después de una extracción con fenol-cloroformo, la digestión fue sometida a fraccionamiento de tamaño en un gel de agarosa. Los fragmentos de ADN genómico con una longitud de 500 a 1.250 bp fueron eluidos del gel por filtración centrífuga (Zhu y cols., 1985). Se unieron adaptares SfiI (5'GTTGGCCTTTT) o (5'AGGCCAAC) a los extremos de ADN (romos) para facilitar la clonación de los fragmentos en el vector. Por lo tanto, un oligonucleótido 8-mero y 11-mero (que comprendía el sitio SfiI) fueron quinatasados y reasociados. Después de la ligadura de estos adaptares a los fragmentos de ADN se realizo un segundo fraccionamiento de tamaños en un gel de azarosa. Los fragmentos de ADN de 400 a 1.150 bp fueron eluidos del gel por filtración
centrífuga.

* Preparación del fragmento de vector pGALlPSiST-1

Los fragmentos pequeños de ADN genómico fueron clonados después del promotor GAL1 en el vector pGALlPSIST-1. Se digirió ADN de plásmido pGALlPSiST-1 purificado Qiagen con SEIT y el fragmento más largo del vector fue elido del gel por filtración centrífuga (Zhu y cols., 1985). Se realizó una ligadura con un fragmento de ADN testigo, flanqueado por sitios SfiI como un testigo. Las mezcla de ligadura fue sometida a electroporación a células de E. coli MC1061. Se analizó ADN de plásmidos de 24 clones. En todos los casos el fragmento testigo fue insertado en el fragmento de vector pGALlPSiST-1.

* Enriquecimiento

Todos los fragmentos de ADN genómico (450 ng) fueron ligados en el vector pGALlPSiST-1 (20 ng). Después de una electroporación a 2500 V, se obtuvieron 400.000 clones de 40 \muF. Estos clones fueron reunidos en tres grupos y almacenados en cultivos inclinados de glicerol. Se preparó también ADN purificado con Qiagen a partir de estos clones. Un análisis de los clones mostró una longitud media de los insertos de 600 bp y un porcentaje de 91 para los clones con un inserto. El tamaño de la biblioteca corresponde a 5 veces el genoma diploide. Los insertos de ADN genómico son de orientación sentido o antisendido en el vector.

Biblioteca cADN de Candida albicans

El ARN total fue extraído de Candida albicans B2630 crecido respectivamente en medio mínimo (SD) y enriquecido (YPD) como se describe por Chirgwin y cols. in Sambrook y cols 1996. Se preparó mARN a partir de ARN total usando el procedimiento de Invitrogen Fast Track.

En primer lugar cADN de la cadena es sintetizado con la transcriptasa inversa Superscript (BRL) y con un adaptadores de cebadores de oligo dT-NotI. Después de una segunda síntesis de cadenas, el cADN es pulido con enzima Klenow y purificado sobre una columna giratoria Sephacryl S-400. Seguidamente adaptadores SfiI fosforilados son ligados al cADN, si seguidamente se hace una digestión con la enzima de restricción NotI. El cADN de SfiI/NotI es seguidamente purificado y dimensionado en una columna Biogel A150M.

La primera fracción contiene aproximadamente 38.720 clones por transformación, y la segunda fracción solamente 1540 clones. Análisis de Clones:

Fr. I: 22/24 insertos, 16^{3} 1000 bp, 4^{3} 2000 bp, tamaño medio: 1500 bp.

Fr. II: 9/12 insertos, 3^{3} 1000 bp, tamaño medio: 960 bp. El cADN fue ligado en un vector pGALlPNiST-1 abierto en NotI/SfiI (antisentido).

Transformación de Candida

La cepa hospedante usada para la trasformación es una mutante de C. albicans ura3, CAI-4, que contiene una deleción en orotidina-5'-fosfatodescarboxilasa y fue obtenida de William Fonzi, Georgetown University (Fonzi y Irwin). La CAI-4 was transformada con la biblioteca de cADN anteriormente descrita o biblioteca genómica que usa el módulo de Pichia spheroplast (Invitrogen). Los transformantes resultantes fueron expuestos en placas de medio mínimo complementado con glucosa (SD, 0,67% o 1,34% de base de nitrógeno de levaduras con o sin aminoácidos + 2% glucosa) y fueron incubados durante 2-3 días a 30ºC.

Selección de mutantes

Los cultivos de partida fueron ajustados inoculando cada colonia en 1 ml de medio SD e incubando durante una noche a 30ºC y 300 rpm. Las densidades celulares fueron determinadas usando un contador Coulter (Coulterl; Coulter electronics limited). Se inocularon 250.000 células/ml en 1 ml de medio SD y los cultivos fueron incubados durante 24 horas a 30ºC y 30 rpm. Los cultivos fueron lavados en medio mínimo sin glucosa (S) y el sedimento se volvió a poner en suspensión en 65 \mul de medio S. Se usaron 8 \mul de este cultivo para inocular cultivos de 400 \mul en una placa Honeywell-100 (analizador Bioscreen; Labsystems). Cada transformante se hizo crecer durante 3 días S que contenía LiAc; pH 6,0, con 2% glucosa/2% maltosa o 2% galactosa/2% maltosa respectivamente, mientras se agitaba cada 3 minutos durante 20 segundos. La densidades ópticas fueron medidas cada hora durante 3 días consecutivos y se generaron cuervas de crecimiento (analizador Bioscreen; Labsystems).

Las curvas de crecimiento de transformantes crecidos respectivamente en medio no inductor antisentido (glucosa/maltosa) e inductor (galactosa/maltosa) son comparadas y los transformantes que muestran un crecimiento dificultado tras una inducción antisentido son seleccionados para un análisis adicional. Los transformantes que muestran un crecimiento dificultado debido a la integración en un gen crítico son también seleccionados.

Aislamiento de insertos genómicos o de cADN

Los transformantes putativamente interesantes se hacen crecer en 1,5 ml de SD durante una noche y el ADN genómico es aislado usando el estuche de ensayo de levaduras Nucleon MI (Clontech). La concentración de ADN genómico es estimada analizando una muestra en un gel de agarosa.

Se digieren 20 ng de ADN genómico durante tres horas con una enzima que corta únicamente en el vector de la biblioteca (SacI para la biblioteca genómica; PstI para la biblioteca de cADN) y se trata con ARNsa. Las muestras se extraen con fenol/cloroformo y se precipitan usando NaOAc/etanol.

El sedimento resultante se vuelve a poner en suspensión en 500 \mul de mezcla de ligadura (1 x tampón de ligadura y 4 unidades de T4 ADN ligasa; ambas de la empresa Boehringer) y se incuba durante una noche a 16ºC.

Después de la desnaturalización (20 minutos, 65ºC) purificación (extracción con fenol/cloroformo) y precipitación (NaOAc/etanol) en sedimento se vuelve a poner en suspensión en 10 \mul de agua MilliQ (Millipore).

Análisis PCR

Se realiza una PCR inversa en 1 \mul de la reacción de ligadura precipitada usando cebadores específicos del vector de la biblioteca (oligo23 5'TGC-AGC-TCG-ACC-TCG-ACT-G 3' y oligo25 5'GCG-TGA-ATG-TAA-GCG-TGA-C 3' para la biblioteca genómica; cebador: 3pGALNistPCR: 5'TGAGCAGCTCGCCGTCGCGC 3' y cebador 5pGALNistPCR: 5'GAGTTATACCCTGCAGCTCGAC 3' para la biblioteca genómica cADN; ambos de la empresa Eurogentec) durante 30 ciclos que consistían cada uno en (a) 1 minuto a 95ºC, (b) 1 minuto a 57ºC, y (c) 3 minuto a 72ºC. En la mezcla de reacción se usaron 2,5 unidades de Taq polimerasa (Boehringer) con anticuerpo TaqStart (Clontech) (1:1) y las concentraciones finales fueron 0,2 \muM de cada cebador, MgCl_{2} 3 mM (Perkin Elmer Cetus) y dNTPs 200 \muM (Perkin Elmer Cetus). La PCR se realizó en un dispositivo Robocycler (Stratagene).

Determinación de las secuencias

Los productos de PCR resultantes fueron purificados usando un estuche de ensayo de purificación por PCR (Qiagen) y fueron cuantificados mediante comparación de la intensidad de bandas en gel de agarosa teñido con EtBr con la intensidad de las bandas de marcadores de ADN. La cantidad de producto de PCR (expresada en ng) usada en la reacción de secuenciado se calcula como la longitud del producto de PCR en pares de bases dividido por 10. La reacciones de secuenciado se realizaron usando el estuche de ensayo de reacciones listas de secuenciado en ciclo ABI Prism BigDye Terminator según las instrucciones del fabricante (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) excepto en cuanto a las siguientes modificaciones.

El volumen total de la reacción se redujo a 15 \mul. El volumen de reacción de los reactivos individuales se cambió en consecuencia. Se sustituyeron 6,0 \mul de mezcla de reacción Terminator Ready con una mezcla de 3,0 \mul de mezcla de reacción Terminator Ready + 3,0 \mul de Half Term (GENPAK Limited, Brighton, Reino Unido). Después del ciclo de secuenciado, las mezclas de reacción fueron purificadas sobre columnas Sephadex G50 preparadas sobre placas de microtitulación opacas Multiscreen HV (Millipore, Molsheim, Francia) y fueron secadas en un dispositivo speedVac. Los productos de reacción se volvieron a poner en suspensión en 3 \mul de tampón de carga. Después de una desnaturalización durante 2 minutos a 95ºC, se aplicó 1 \mul de muestra sobre un gel Long Ranger al 5% (36 cm de pocillo a lectura) preparado a partir de envases únicos según las instrucciones del fabricante (FMC BioProducts, Rockland, ME). Las muestras se realizaron durante 7 horas 2X por experimento en un dispositivo de secuenciado de ADN ABI 377XL. Los paquetes de software de recogida de datos versión 2.0 y análisis de secuencia versión 3.0 (para determinación de bases) son de la empresa PE Applied Biosystems. Los archivos de texto de las secuencias resultantes fueron copiados en un servidor para un análisis adicional.

Análisis de secuencias

Fueron importadas secuencias de nucleótidos en el paquete de software VectorNTI (InforMax Inc, North Bethesda, MD, USA), y se identificaron el vector y las regiones de insertos de las secuencias. Se realizaron búsquedas de analogías de secuencias frente a bases de datos de secuencias publicas y comerciales con el paquete de software BLAST (Altschul y cols., 1990) versión 1.4. Se usaron tanto la secuencia de nucleótidos originales como las traducciones conceptuales de seis marcos de la región del inserto como secuencias de consulta. Las bases de datos publicas usadas fueron la base de datos de secuencia de nucleótidos EMBL (Stoesser y cols., 1998), la base de datos de secuencias de proteínas SWISS-PROT y su complemento TrEMBL (Bairoch and Apweiler, 1998), y la base de datos de secuencias de Candida albicans ALCES (Stanford University, Universidad de Minnesota). Las bases de datos de secuencias comerciales usadas fueron las bases de datos genomitas microbianas LifeSeq® humana and PathoSeq® (Incyte Pharmaceuticals Inc., Palo Alto, CA, USA), y la base de datos de secuencias de patentes GENESEQ (Derwent, Londres, Reino Unido). Se obtuvieron tres resultados principales sobre la base de las búsquedas de analogías de secuencias: función, novedad y especificad. Se dedujo una función putativa sobre la base de la analogía consecuencias con una función conocida, y la novedad estaba basada en la ausencia o presencia de las secuencias en bases de datos públicas y la especificad se baso en la analogía con homólogos de
vertebrados.

Métodos

Blastx de las secuencias de ácidos nucleicos frente a las bases de datos de proteínas apropiadas: Swiss-Prot para clones cuya secuencia completa está presente en el dominio publico, y paorfp (PathoSeq®) para clones cuyas secuencias completas no están presentes en el dominio público.

La proteína a la que corresponde la secuencia de ácidos nucleicos traducidos es usada como punto de partida. Las diferencias entre esta proteína y las secuencias de ácidos nucleicos traducidos del solicitante son marcadas con una línea doble y anotadas por encima de la secuencia de proteínas. Se usan los siguientes símbolos:

a código de una letra de aminoácidos o la ambigüedad código X es usada si la secuencia de ácidos nucleicos traducidos del solicitante tiene otro aminoácido en una cierta posición,

el signo * de codon de terminación es usado si la secuencia de ácidos nucleicos traducidos del solicitante tiene un codon de terminación en una cierta posición,

las letras fs (desplazamiento de marco) son usadas si se produce un desplazamiento de marco en la secuencia de ácidos nucleicos traducidos del solicitante, y es usado otro marco de lectura,

las palabras ambigüedad y ambigüedades son usadas si una parte de la secuencia se ácidos nucleicos traducidos del solicitante está presente en las proteínas, pero no es visible en las alineaciones de los resultados de blastos,

la expresión "secuencia ausente" es usada si la secuencia de ácidos nucleicos traducidos no comprende esa parte de la proteína.

Blastx: compra los productos de traducción conceptual de seis marcos de una secuencia de consulta de nucleótidos (las dos cadenas) frente a una base de datos de secuencias de proteínas.

Deficiencias génicas

Para verificar que el efecto de crecimiento era debido a la interferencia con el gen identificado y apoyar la especifidad del efecto antisentido, se hicieron deficiencias génicas de alelos únicos en los genes identificados (figuras 28 a 31) usando el método URA-blaster (Fonzi y Irwin 1993).

Selección de compuestos que modulan la expresión de polipéptidos críticos para el crecimiento y supervivencia de C. albicans

El método propuesto está basado en observaciones (Sandbaken y cols., 1990; Hinnebusch and Liebman 1991; Ribogene PCT WO 95/11969, 1995) que sugieren que la infraexpresión o sobreexpresión de cualquier componente de un procedimiento (por ejemplo, traducción) podría conducir a una sensibilidad alterada para un inhibidor de una etapa relevante en ese procedimiento. Este inhibidor pondría ser más potente frente a una célula limitada por una deficiencia en la macromolécula que cataliza esa etapa y/o menos potente frente a una célula que contenga un exceso de es macromolécula, en comparación con la célula de tipo salvaje (WT).

Las cepas de levaduras mutantes, por ejemplo, han mostrado que algunas etapas de traducción son sensibles a la estequiometría de las macromoléculas involucradas (Sandbaken y cols. 1996). Estas cepas son más sensibles a compuestos que perturban específicamente la traducción (actuando sobre un componente que participa en la traducción) pero son igualmente sensibles a compuestos con otros mecanismos de acción.

Por tanto, este método no solamente proporciona un medio para identificar si un compuesto de ensayo perturba un cierto procedimiento, sino también una indicación del sitio en el que ejercen su efecto. El componente que está presente en forma alterada o en una cantidad en una célula cuyo crecimiento está afectado por un compuesto del ensayo, es potencialmente el sitio de acción de compuesto del ensayo.

El ensayo que va a ser ajustado incluye la medición del crecimiento de una cepa isogénica que ha sido modificada solamente en un cierto alelo especifico, con relación a la cepa de C. albicans de tipo salvaje (WT), en presencia de compuestos R. Las cepas pueden ser unas en las que la expresión de una proteína esencial específica está dificultada tras la introducción de un antisentido o sepas que portan rupturas en un gen esencial. Se realizará una aproximación in silico para descubrir nuevos genes esenciales en C. albicans. Un cierto número de genes esenciales identificados de este modo estarán rotos (en un alelo) y las cepas resultantes pueden ser usadas para una selección de crecimiento comparativo.

Ensayo para una selección de producción elevada para fármacos

Se trasfieren 35 \mul de medio mínimo (medio S + 2% galactosa + 2% maltosa) a una placa de 96 pocillos de fondo liso transparente usando un sistema de pipeteo automatizado (Multidrop, Labsystems). Un dispositivo de pipeteo de 96 canales (Hydra, Robbins Scientific) transfiere 2,5 \mul de compuesto R a 10^{-3} en DMSO desde una placa madre a la placa de ensayo.

Las cepas de C. albicans seleccionadas (cepa mutante y parental (CAI-4)) son almacenadas como componentes de reserva en glicerol (15%) a -70ºC. Las cepas son dispuestas en placas selectivas (medio SD) e incubadas durante dos días a 30ºC. Para la cepa parental, CAI-4, el medio está siempre complementado con 20 \mug/ml de uridina. Una única colonia es recogida y nuevamente puesta en suspensión en 1 ml de medio mínimo (medio S + 2% de galactosa + 2% de maltosa). Las células se incuban a la 30ºC durante 8 horas mientras se agita a 250 rpm. Un cultivo de 10 ml es inoculado a 250.000 células/ml. Los cultivos son incubados a 30ºC durante 24 horas mientras se agita a 250.000 rpm. Las células son contadas en un contador Coulter y el cultivo final (medio S + 2% de galactosa + 2% de maltosa) es inoculado a 20.000 hasta 50.000 células/ml. Los cultivos se hacen crecer a 30ºC mientras se agita a 250 rpm hasta que se alcanza un OD final de 0,24 (+/-0,04) 600 nM.

Se añaden 200 \mul de esta suspensión de levadura a todos los pocillos de placas MW96 que contiene compuestos R en un volumen total de 450 (o 250) \mul. Las placas MW96 con incubadas (estáticas) a 30ºC durante 48 horas.

Las densidades ópticas son medidas después de 48 horas.

El crecimiento del ensayo es expresado como un porcentaje de crecimiento de testigo positivo tanto para cepas de tipo tanto mutantes (x) como salvaje (y). Se calcula la relación (x/y) de estas variables derivadas.

Referencias

Altschul, S.F., W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, and D.J. Lipman, 1990, Basic Local Alignment Search Tool, J. Mol. Biol. 215: 403-410.

Thrash C., Bankier A. T., Barrell B. G. and Stemgianz R. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4374-4378.

Blin N. and Stafford D. W. (1976) Nucleic Acids Res. 3: 2303-2308.

Zhu J., Kempenaers W., Van Der Straeten D., Contreras R., and Fiers W. (1985) Bio/Technology 3: 1014-1016.

Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

Fonzi W. and Irwin H. (1993) Genetics 134:717-728. Altschul S.F, Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. (1990) J. Mol. Biol. 215 (3) :403-410.

Bairoch A. and Apweiler R. (1998) Nucleic Acids Res. 26 (1) :38-42.

Stoesser G., Moseley M.A., Sleep J., McGowran M., Garcia-Pastor M., Sterk P. (1998) Nucleic Acids Res. 26 (1):8-15.

Chien et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88, 9578-9582.

Sandbaken M.G. Lupisella J.A., DiDomenico B. and Chakraburtty K., J. Biol. Chem. 265:15838-15844, 1990.

Hinnebusch A.G. and Liebman S.W., in : The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Broach J.R., Pringle J.R. and Jones E.W., eds., CSH Laboratory Press; NY 1991.

Patent application RiboGene Inc., PCT WO 95./11969, 1995.

Brown, D.H. et al., Molecular General Genetics 251 (1) 75-80, 1996.

Altschul, S.F., W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, and D.J. Lipman. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410.

Arndt, G.M., D. Atkins, M. Patrikakis, and J.G. Izant 1995. Gene regulation by antisense RNA in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Mol. Gen. Genet. 248: 293-300.

Atkins, D., and W.L. Gerlach. 1994. Artificial ribozyme and antisense gene expression in S. cerevisiae. Antisense research and development 4:109-117.

Atkins, D., G.M. Arndt, and J.G. Izant 1994. Antisense gene expression in yeast. Biol. Chem. Hoppe-Seyler. 375: 721-729.

Atkins, D., M. Patrikakis, J.G. Izant 1995. The ade6 gene of the fission yeast as a target for antisense and ribozyme RNA-mediated suppression. Antisense Research & Development. 5(4):295-305.

Bairoch, A., and R. Apweiler. 1998. The SWISS-PROT protein sequence data bank and its supplement TrEMBL in 1998. Nucleic Acids Res. 26: 38-42.

Baudin, A., O. Ozier-Kalogeropoulos, A. Denouel, F. Lacroute, C. Cullin. 1993. A simple and efficient method for direct gene deletion in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 21(14):3329-30.

Blin, N., and D.W. Stafford. 1976. Nucleic Acids Res. 3: 2303-2308.

Dujon, B. 1998. European Functional Analysis Network (EUROFAN) and the functional analysis of the Saccharomyces cerevisiae genome. Electrophoresis. 19:617-624.

Del Rosario, M., J.C. Stephans, J. Zakel, J. Escobedo, and K. Giese. 1996. Positive selection system to screen for inhibitors of human immunodeficiency virus-1 transcription. Nature Biotechnology. 14:1592-1596.

Fairhead, C., A. Thierry, F. Denis, M. Eck, and B. Dujon. 1998. "Mass-murder" of ORFs from three regions of chromosome XI from Saccharomyces cerevisiae. Gene. 223:33-46.

Ferbeyre, G., J. Bratty, H. Chen, R. Cedergren. 1996. Cell cycle arrest promotes trans-hammerhead ribozyme action in yeast. Journal of Biological Chemistry. 271(32):19318-23.

Fleischmann, R.D., M.D. Adams, O. White, R.A. Clayton, E.F. Kirkness, A.R. Kerlavage, C.J. Bult, J.F. Tomb, B.A. Dougherty, J.M. Merrick. 1995. Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae. Science. 269: 496-512

Fonzi, W.A., and M.Y. Irwin. 1993. Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans. Genetics 134:717-728.

Fraser, C.M., J.D. Gocayne, O. White, M.D. Adams, R.A. Clayton, R.D. Fleischmann, C.J. Bult, A.R. Kervalage, G. Sutton, J.M. Kelley. 1995. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium. Science 270:397-403.

Giese, K. 1997. Method and construct for screening for inhibitors of transcriptional activation. International patent application WO 97/10360.

Hahn, S. Guarente L. 1988. Yeast HAP2 and HAP3: transcriptional activators in a heteromeric complex. Science. 240(4850):317-21

Heid, C.A., J. Stevens, K.J. Livak, and P.M. Williams. 1996. Real time quantitative PCR. Genome Methods 6:986-994.

Jayaram, M., A. Sutton, J.R. Broach. 1985. Properties of REP3: a cis-acting locus required for stable propagation of the Saccharomyces cerevisiae plasmid 2 microns circle. Molecular & Cellular Biology. 5(9):2466-75.

Jeong, S.W., W.H. Lang, R.H. Reeder. 1996. The yeast transcription terminator for RNA polymerase I is designed to prevent polymerase slippage. Journal of Biological Chemistry. 271(27):16104-10.

Johnson, F.B., D.A. Sinclair, and L. Guarente. 1999. Molecular Biology of aging. Cell. 96:291-302.

Leuker, C.E., A. Sonneborn, S. Delbruck, J.F. Ernst. 1997. Sequence and promoter regulation of the PCK1 gene encoding phosphoenolpyruvate carboxykinase of the fungal pathogen Candida albicans. Gene. 192(2):235-40.

Lie, Y.S., and C.J. Petropoulos. 1998. Advances in quantitative PCR technology: 5' nuclease assays. Current Opinion in Biotechnology 9:43-48.

Livak, K.J., S.J. Flood, J. Marmaro, W. Giusti, K. Deetz. 1995. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. Genome Research. 4(6):357-62.

\newpage

Mandart, E. 1998. Effects of mutations in the Saccharomyces cerevisiae RNA14 gene on the abundance and polyadenylation of its transcripts. Mol. Gen. Genet. 258:16-25.

McMahon, S.B., H.A. Van Buskirk, K.A. Dugan, T.D. Copeland, and M.D. Cole. 1998. The novel ATM-related protein TRRAP is an essential cofactor for the c-Myc and E2F oncoproteins. Cell. 94:363-74.

Murray, J.A.H., M. Scarpa, N. Rossi, G. Cesareni. 1987. Antagonistic controls regulate copy number of the yeast 2 \mu. plasmid. EMBO J. 6:4205-4212.

Nasr, F., A. Bécam, P.P. Slonimski, and C.J. Herbert. 1994. YBR1012, an essential gene from S. cerevisiae: construction of an RNA-antisense conditional allele and isolation of a multicopy suppressor. CR Acad. Sci. Paris. 317: 607-613.

Nasr, F., A. Bécam, S.C. Brown, D. De Nay. P.P. Slonimski, and C.J. Herbert. 1995. Artificial antisense regulation of YBR1012 an essential gene from S. cerevisiae which is important for progression through G1/S. Mol. Gen: Genet. 249:51-57.

Nomura, T., N. Fujita, A. Ishihama. 1985. Promoter selectivity of E. coli RNA polymerase: analysis of the promoter system of convergently-transcribed dnaQ-rnh genes. Nucleic Acids Research. 13(21):7647-61.

Orlando, C., P. Pinzani, and M. Pazzagli. 1998. Developments in quantitative PCR. Clin. Chem. Lab. Med. 36(5): 255-269.

Pla, J., C. Gil, F. Monteoliva, M. Sanchez, and C. Nombela. 1996. Understanding Candida albicans at the molecular level. Yeast. 12:1677-1702.

Reeder, R.H. and W.H. Lang. 1997. Terminating transcription in eukaryotes: lessons learned from RNA polymerase I. Trends in Biochemical Sciences. 22(12):473-7, 1997.

Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

Sinclair, D.A., L. Guarente. 1997. Extrachromosomal rDNA circles- -a cause of aging in yeast. Cell. 91(7):1033-42.

Smith, V., D. Botstein, and P. O. Brown. 1995. Genetic footprinting: A genomic strategy for determining a gene's function given its sequence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:6479-6483.

Stoesser, G., Moseley M.A., Sleep J., McGowran M., Garcia-Pastor M., Sterk P. 1998. Nucleic Acids Res. 26(1):8-15.

Thompson-Jager, S. Domdey H. 1990. The intron of the yeast actin gene contains the promoter for an antisense RNA. Current Genetics. 17(3):269-73.

Thompson, J.R., E. Register, J. Curotto, M. Kurtz, and R. Kelly. 1998. An improved protocol for the preparation of yeast cells for transformation by electroporation. Yeast. 14:565-571.

Thrash, C., A.T. Bankier, B.G. Barrell, and R. Sternglanz. 1985. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4374-4378.

Van Duin, M., J. van Den Tol, J.H. Hoeijmakers, D. Bootsma, I.P. Rupp, P. Reynolds, L. Prakash, and S. Prakash. 1989. Conserved pattern of antisense overlapping transcription in the homologous human ERCC-1 and yeast RAD10 DNA repair gene regions. Molecular & Cellular Biology. 9(4):1794-8.

Wach, A., A. Brachat, R. Pohlmann, P. Philippsen. 1994. New heterologous modules for classical or PCR-based gene disruptions in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 10(13):1793-808.

Wilson, R.B., D. Davis, A.P. Mitchell. 1999. Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions. Journal of Bacteriology. 181(6):1868-74.

Zhu, J., W. Kempenaers, D. van der Straeten, R. Contreras, and W. Fiers. 1985. A method for fast and pure DNA elution from agarose gels by centrifugal filtration. Bio/Technology. 3: 1014-1016.

TABLA

1

<110> Janssen Pharmaceutica N. V.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Dianas de fármacos en Candida Albicans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 53731/000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 982204122.0

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-12-04

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 438

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida albicans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1380

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida albicans

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2283

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida albicans

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 826

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida albicans

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 978

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida albicans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 679

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida albicans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2319

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida albicans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida albicans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida albicans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida albicans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 426

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida albicans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 699

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PTR

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida albicans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

18

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 295

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida albicans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

20

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PTR

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida albicans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 773

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PTR

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida albicans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

23

24

25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PTR

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Candida albicans

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

27

Claims (16)

1. Una molécula de ácido nucleico, que consiste en mARN o cADN que codifica un polipéptido que es crítico para la supervivencia y crecimiento de la levadura Candida albicans, molécula de ácido nucleico que es al menos un 70% homóloga a la secuencia de nucleótidos ilustrada en la SEQ ID No 1.

2. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es crítico para la supervivencia y crecimiento de la levadura Candida albicans, molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos ilustrada en SEQ ID No. 1.

3. Un polipéptido que tiene una homología de aminoácidos de al menos 70% con la SEQ ID No. 10.

4. Un polipéptido según la reivindicación 3, que consiste en la SEQ ID No. 10.

5. Una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, o la secuencia de nucleótidos ilustrada en la SEQ ID No. 1 para ser usada como un medicamento.

6. Uso de una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, o la secuencia de nucleótidos ilustrada en la SEQ ID No. 1 en la preparación de un medicamento para tratar enfermedades asociadas con Candida albicans.

7. Un polipéptido según la reivindicación 3 ó 4, para ser usado como un medicamento.

8. Uso de un polipéptido según la reivindicación 3 ó 4, en la preparación de un medicamento para tratar infecciones asociadas con Candida albicans.

9. Una composición farmacéutica, que comprende una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 o un polipéptido según la reivindicación 3 ó 4 junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable para el mismo.

10. Una construcción de ADN recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2.

11. Una construcción de ADN recombinante según la reivindicación 10, en la que dicha molécula de ácido nucleico es insertada en la orientación antisentido.

12. Una construcción de ADN recombinante según la reivindicación 10 ó 11, en la que dicha construcción de ADN recombinante es un vector de expresión.

13. Una construcción según la reivindicación 12, que comprende un promotor inducible.

14. Una construcción según la reivindicación 12 ó 13, que comprende una secuencia que codifica una molécula reportera.

15. Células que contienen una construcción de ADN recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en que dichas células son bacterianas o eucarióticas.

16. Un método para identificar compuestos que modulan selectivamente la expresión o funcionalidad de polipéptidos o trayectorias metabólicas en las que están involucrados estos polipéptidos y que son cruciales para el crecimiento y la supervivencia de Candida albicans, método que comprende:

(a) poner en contacto un compuesto que va a ser ensayado con una o más células de Candida Albicans que tienen un mutación en una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, mutación que da lugar a la sobreexpresión o infraexpresión de dichos polipéptidos además de poner en contacto una o más células de Candida de tipo salvaje con dicho compuesto,

(b) verificar el crecimiento y/o la actividad de dicha célula mutada en comparación con dicho tipo salvaje, en que el crecimiento o actividad diferencial de dichas una o más de células de Candida mutadas es indicativo de una acción selectiva de dicho compuesto sobre un polipéptido u otro polipéptido en la misma trayectoria o una paralela.