JPH02222690A - ヒト５―リポキシゲナーゼの酵母による製造法 - Google Patents
ヒト５―リポキシゲナーゼの酵母による製造法Info
- Publication number
- JPH02222690A JPH02222690A JP4171689A JP4171689A JPH02222690A JP H02222690 A JPH02222690 A JP H02222690A JP 4171689 A JP4171689 A JP 4171689A JP 4171689 A JP4171689 A JP 4171689A JP H02222690 A JPH02222690 A JP H02222690A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lipoxygenase
- human
- ding
- yeast
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101000620009 Homo sapiens Polyunsaturated fatty acid 5-lipoxygenase Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 20
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 48
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 description 28
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 12
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000001381 Arachidonate 5-Lipoxygenase Human genes 0.000 description 7
- 108010093579 Arachidonate 5-lipoxygenase Proteins 0.000 description 7
- 108090000128 Lipoxygenases Proteins 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 6
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000003820 Lipoxygenases Human genes 0.000 description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JNUUNUQHXIOFDA-JGKLHWIESA-N 5(S)-HPETE Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C=C/[C@@H](OO)CCCC(O)=O JNUUNUQHXIOFDA-JGKLHWIESA-N 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- UFPQIRYSPUYQHK-VRKJBCFNSA-N Leukotriene A4 Natural products CCCCCC=C/CC=C/C=C/C=C/[C@@H]1O[C@H]1CCCC(=O)O UFPQIRYSPUYQHK-VRKJBCFNSA-N 0.000 description 3
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 3
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- UFPQIRYSPUYQHK-WAQVJNLQSA-N leukotriene A4 Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C=C/C=C/[C@@H]1O[C@H]1CCCC(O)=O UFPQIRYSPUYQHK-WAQVJNLQSA-N 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- CWJSCIWGSUCULS-UHFFFAOYSA-N 2-hydroperoxyicosa-2,4,6,8-tetraenoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC=CC=CC=CC=C(OO)C(O)=O CWJSCIWGSUCULS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150081243 STA1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- BAAVRTJSLCSMNM-CMOCDZPBSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 BAAVRTJSLCSMNM-CMOCDZPBSA-N 0.000 description 1
- YRIZYWQGELRKNT-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-trichloro-1,3,5-triazinane-2,4,6-trione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C(=O)N(Cl)C1=O YRIZYWQGELRKNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025230 2-amino-3-ketobutyrate coenzyme A ligase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- RDEYORKJEDLLDB-DQVHGTJVSA-N 5-Hydroperoxyeicosatetraenoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC\C=C\C=C\C(\OO)=C\C=C\C(O)=O RDEYORKJEDLLDB-DQVHGTJVSA-N 0.000 description 1
- KGIJOOYOSFUGPC-MSFIICATSA-N 5-Hydroxyeicosatetraenoic acid Chemical compound CCCCCC=CCC=CCC=C\C=C\[C@@H](O)CCCC(O)=O KGIJOOYOSFUGPC-MSFIICATSA-N 0.000 description 1
- KGIJOOYOSFUGPC-XRXZHELTSA-N 5-hydroxyeicosatetraenoic acid Natural products CCCCCC=CCC=CCC=C\C=C\C(O)CCCC(O)=O KGIJOOYOSFUGPC-XRXZHELTSA-N 0.000 description 1
- 208000016557 Acute basophilic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000014654 Adna Species 0.000 description 1
- 108010087522 Aeromonas hydrophilia lipase-acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N Asp-Gly Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O JHFNSBBHKSZXKB-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100440696 Caenorhabditis elegans cor-1 gene Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N Fluorane Chemical compound F KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- JPXZQMKKFWMMGK-KQYNXXCUSA-K IDP(3-) Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 JPXZQMKKFWMMGK-KQYNXXCUSA-K 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSNCEEGOMTYXKY-JTQLQIEISA-N Lycoperodine 1 Natural products N1C2=CC=CC=C2C2=C1CN[C@H](C(=O)O)C2 FSNCEEGOMTYXKY-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108091006587 SLC13A5 Proteins 0.000 description 1
- 201000008754 Tenosynovial giant cell tumor Diseases 0.000 description 1
- 244000111306 Torreya nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006732 Torreya nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101710112930 Trypsin inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101150101554 UL3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003280 cupric chloride Drugs 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 208000035647 diffuse type tenosynovial giant cell tumor Diseases 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960002050 hydrofluoric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- VNYSSYRCGWBHLG-AMOLWHMGSA-M leukotriene B4(1-) Chemical compound CCCCC\C=C/C[C@@H](O)\C=C\C=C\C=C/[C@@H](O)CCCC([O-])=O VNYSSYRCGWBHLG-AMOLWHMGSA-M 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 101150056494 midn gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N phosphamidon Chemical compound CCN(CC)C(=O)C(\Cl)=C(/C)OP(=O)(OC)OC RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000016160 smooth muscle contraction Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 1
- CXVGEDCSTKKODG-UHFFFAOYSA-N sulisobenzone Chemical compound C1=C(S(O)(=O)=O)C(OC)=CC(O)=C1C(=O)C1=CC=CC=C1 CXVGEDCSTKKODG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 208000002918 testicular germ cell tumor Diseases 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 108010032276 tyrosyl-glutamyl-tyrosyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000007221 ypg medium Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明はアラキドン酸を５−ヒドロペルオキシエイコサ
テトラエン酸に、さちにこれをロイコトリエンＡ４に変
換する酵素の一種であるヒト５−リポキシゲナーゼの製
造法に関する。
テトラエン酸に、さちにこれをロイコトリエンＡ４に変
換する酵素の一種であるヒト５−リポキシゲナーゼの製
造法に関する。
［従来の技術］
５−リポキシゲナーゼは、アラキドン酸から５−ヒドロ
ペルオキシ−６、８，１１，１４−エイコサテトラエン
酸（５−ＨＰＥＴＥ）の形成を触媒し、さらにこれを５
．６−オキシド−７，９゜１１．１４−エイコサテトラ
エン酸（ロイコトリエンＡ４ ）に変換する酵素である
。ロイコトリエンＡ４はさらに他の酵素によってペプチ
ドロイコトリエンやロイコトリエンＢ４に変換される。
ペルオキシ−６、８，１１，１４−エイコサテトラエン
酸（５−ＨＰＥＴＥ）の形成を触媒し、さらにこれを５
．６−オキシド−７，９゜１１．１４−エイコサテトラ
エン酸（ロイコトリエンＡ４ ）に変換する酵素である
。ロイコトリエンＡ４はさらに他の酵素によってペプチ
ドロイコトリエンやロイコトリエンＢ４に変換される。
すなわち、５−リポキシゲナーゼはロイコトリエンの生
合成における最初の２段階を触媒し、また口イコトリエ
ンとは構造が異なるがアラキドン酸から由来するリボキ
シンの形成にも関与している。
合成における最初の２段階を触媒し、また口イコトリエ
ンとは構造が異なるがアラキドン酸から由来するリボキ
シンの形成にも関与している。
ロイコトリエンおよびリボキシンの生物活性は未だ不明
の点が多い、しかし現在、ロイコトリエンは平滑筋の収
縮や炎症惹起に関して重要゛な役割を持っていることが
明らかになっている。
の点が多い、しかし現在、ロイコトリエンは平滑筋の収
縮や炎症惹起に関して重要゛な役割を持っていることが
明らかになっている。
５−リポキシゲナーゼは、ヒト白血球［プロシーディン
グ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンス、米国、第８２巻、６０４０頁（１９８５）、同第
８２巻、７５０５頁（１９８５）、同第８３巻、８５７
頁（１９８６）］、ブタ白血球［ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー 第２６１巻、７９８２頁
（１９８６）コ、マウス骨髄由来マスト細胞〔プロシー
ディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス、米国、第８３巻、４１７５頁（１９８６）
］、およびラット好塩基球性白血病細胞［プロスタグラ
ンデイン、第２９巻、６８９頁（１９８５）］から単離
されている。これらから単離された５−リポキシゲナー
ゼは、活性発現のためにカルシウムイオンを要求すると
いう点では共通しているが、他の活性化因子については
異なった結果を示している。さらにその分子量について
も、８０Ｋ （ヒト）、７２Ｋ（ブタ）、７５Ｋ（マウ
ス）および７３Ｋ（ラット）と異なり、それぞれが異な
ったポリペプチドからなっていることを示唆している。
グ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンス、米国、第８２巻、６０４０頁（１９８５）、同第
８２巻、７５０５頁（１９８５）、同第８３巻、８５７
頁（１９８６）］、ブタ白血球［ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー 第２６１巻、７９８２頁
（１９８６）コ、マウス骨髄由来マスト細胞〔プロシー
ディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス、米国、第８３巻、４１７５頁（１９８６）
］、およびラット好塩基球性白血病細胞［プロスタグラ
ンデイン、第２９巻、６８９頁（１９８５）］から単離
されている。これらから単離された５−リポキシゲナー
ゼは、活性発現のためにカルシウムイオンを要求すると
いう点では共通しているが、他の活性化因子については
異なった結果を示している。さらにその分子量について
も、８０Ｋ （ヒト）、７２Ｋ（ブタ）、７５Ｋ（マウ
ス）および７３Ｋ（ラット）と異なり、それぞれが異な
ったポリペプチドからなっていることを示唆している。
すなわち、ヒト５−リポキシゲナーゼは現在までのとこ
ろヒト白血球から単離精製する以外にその獲得手段はな
い。
ろヒト白血球から単離精製する以外にその獲得手段はな
い。
本発明者は、Ｍ換えＤＮＡ技法によりヒト５−リポキシ
ゲナーゼを製造する方法について研究を行ってきた。そ
の結果、先にヒト胎盤および肺のｃＤＮＡライブラリー
から免疫化学的方法またはプローブハイブリダイゼーシ
ョン法を用いてヒト５−リポキシゲナーゼｃＤＮＡを単
離した。さらにヒト５−リポキシゲナーゼをコードする
遺伝子の全塩基配列含決定した［プロシーディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、
米国、第８５巻、２６頁（１９８８）および同第８５巻
、３４０６頁（１９８８）］、 また、デイクソン（
Ｄｉｘｏｎ）らはジメジルスルフォキシドとデキサメタ
シンで分化させたＨＬ−６０細胞のｃＤＮＡライブラリ
ーからオリゴヌクレオチド１０−ブを用いてヒト５−リ
ポキシゲナーゼｃＤＮＡを単離し、その塩基配列を決定
した［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス、米国、第８５巻、４１６頁
（１９８８）コ、しかしこの遺伝子を微生物に組み込み
、微生物にヒト５−リポキシゲナーゼを生産させ、採取
することには未だ成功していない。
ゲナーゼを製造する方法について研究を行ってきた。そ
の結果、先にヒト胎盤および肺のｃＤＮＡライブラリー
から免疫化学的方法またはプローブハイブリダイゼーシ
ョン法を用いてヒト５−リポキシゲナーゼｃＤＮＡを単
離した。さらにヒト５−リポキシゲナーゼをコードする
遺伝子の全塩基配列含決定した［プロシーディング・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、
米国、第８５巻、２６頁（１９８８）および同第８５巻
、３４０６頁（１９８８）］、 また、デイクソン（
Ｄｉｘｏｎ）らはジメジルスルフォキシドとデキサメタ
シンで分化させたＨＬ−６０細胞のｃＤＮＡライブラリ
ーからオリゴヌクレオチド１０−ブを用いてヒト５−リ
ポキシゲナーゼｃＤＮＡを単離し、その塩基配列を決定
した［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス、米国、第８５巻、４１６頁
（１９８８）コ、しかしこの遺伝子を微生物に組み込み
、微生物にヒト５−リポキシゲナーゼを生産させ、採取
することには未だ成功していない。
［発明が解決しようとする問題点］
ヒト５−リポキシゲナーゼは現在までのところヒト白血
球あるいはラーリボキシゲナーゼを産生するヒトの臓器
から単離精製する以外にその獲得手段はなく、さらにこ
れを永続的に供給することは不可能に近い、したがって
本発明の目的は、ヒト５−リポキシゲナーゼを大量に生
産するための製造法を提供することである。
球あるいはラーリボキシゲナーゼを産生するヒトの臓器
から単離精製する以外にその獲得手段はなく、さらにこ
れを永続的に供給することは不可能に近い、したがって
本発明の目的は、ヒト５−リポキシゲナーゼを大量に生
産するための製造法を提供することである。
Ｅ問題点を解決するための手段］
本願発明者らは、鋭意研究の結果、酵母グルコアミラー
ゼ遺伝子のプロモーターを利用した発現用ベクターを構
築し、これにヒト５−リポキシゲナーゼをコードする遺
伝子を組み込んで酵母へ導入することにより、この酵母
がヒト５−リポキシゲナーゼを生産することを見い出し
、本発明な完成した。
ゼ遺伝子のプロモーターを利用した発現用ベクターを構
築し、これにヒト５−リポキシゲナーゼをコードする遺
伝子を組み込んで酵母へ導入することにより、この酵母
がヒト５−リポキシゲナーゼを生産することを見い出し
、本発明な完成した。
すなわち、構築した発現用ベクター内にヒト５−リポキ
シゲナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ組換え体Ｄ
ＮＡを含む酵母を培養し、該培養物中にヒト５−リポキ
シゲナーゼを生成蓄積させ、該培養物からヒト５−リポ
キシゲナーゼを採取することを特徴とするヒト５−リポ
キシゲナーゼの製造法である。
シゲナーゼをコードする遺伝子を組み込んだ組換え体Ｄ
ＮＡを含む酵母を培養し、該培養物中にヒト５−リポキ
シゲナーゼを生成蓄積させ、該培養物からヒト５−リポ
キシゲナーゼを採取することを特徴とするヒト５−リポ
キシゲナーゼの製造法である。
以下本発明の詳細な説明する。
まず本発明は、酵母サツカロマイセスのグルコアミラー
ゼを支配している遺伝子のプロモーターを利用し、有用
な蛋白質の遺伝子をこのプロモーターの制御下に生産さ
せるための酵母菌ベクターを提供する。さらに本発明は
ヒト５−リボキシゲナーゼの製造法を提供する。すなわ
ち、ヒト５−リポキシゲナーゼをコードする遺伝子を、
合成プローブを用いたハイブリダイゼーション法により
、ヒト胎ｍ ｃ Ｄ Ｎ Ａライブラリーから採取し、
該遺伝子を組み込んだ組換え体プラスミドを調製する。
ゼを支配している遺伝子のプロモーターを利用し、有用
な蛋白質の遺伝子をこのプロモーターの制御下に生産さ
せるための酵母菌ベクターを提供する。さらに本発明は
ヒト５−リボキシゲナーゼの製造法を提供する。すなわ
ち、ヒト５−リポキシゲナーゼをコードする遺伝子を、
合成プローブを用いたハイブリダイゼーション法により
、ヒト胎ｍ ｃ Ｄ Ｎ Ａライブラリーから採取し、
該遺伝子を組み込んだ組換え体プラスミドを調製する。
さらに該組換え体プラスミドを宿主微生物に挿入する。
該組換え体プラスミドを有する微生物を培養することに
より、ヒト５−リポキシゲナーゼを安価に大量に製造す
ることができる。
より、ヒト５−リポキシゲナーゼを安価に大量に製造す
ることができる。
ヒト５−リポキシゲナーゼをコードする遺伝子をベクタ
ーに組み込む方法は種々のものが可能であり、以下に記
載するものに限定されないことはいうまでもない。
ーに組み込む方法は種々のものが可能であり、以下に記
載するものに限定されないことはいうまでもない。
（１）異種蛋白質遺伝子の酵母自発現用ベクターｐＭＮ
１９１の構築 本発明は酵母サツカロマイセスのグルコアミラーゼを支
配している遺伝子−（エエＬ」と略称することもある）
のプロモーターを利用した異種蛋白質遺伝子の酵母自発
現用ベクターを提供する（第１図）、このベクターは上
記プロモーターの他に、従来よりこの分野において周知
の他の発現用ベクターと同様、宿主内で複製するための
複製開始点と、上記プロモーターの後に連結する例えば
二二ム３ターミネータ−のようなターミネータ−と例え
ば１．ｌＬ２マーカーのような適当な選択マーカー さ
らには大腸菌内で複製するための複製開始点と例えば大
腸菌において有効な抗生物質耐性のような適当な選択マ
ーカーを有する。
１９１の構築 本発明は酵母サツカロマイセスのグルコアミラーゼを支
配している遺伝子−（エエＬ」と略称することもある）
のプロモーターを利用した異種蛋白質遺伝子の酵母自発
現用ベクターを提供する（第１図）、このベクターは上
記プロモーターの他に、従来よりこの分野において周知
の他の発現用ベクターと同様、宿主内で複製するための
複製開始点と、上記プロモーターの後に連結する例えば
二二ム３ターミネータ−のようなターミネータ−と例え
ば１．ｌＬ２マーカーのような適当な選択マーカー さ
らには大腸菌内で複製するための複製開始点と例えば大
腸菌において有効な抗生物質耐性のような適当な選択マ
ーカーを有する。
本発明の発現ベクターは例えば以下のようにして調製す
ることができる。なお本発明のベクターの調製方法は種
々のものが可能であり、以下に記載するものに限定され
ないことは言うまでもない プラスミドｐＩＹ１６９（第１図）は５ＴＡ１のＮ末端
領域内に８ｍａｒの左且ｆＩリンカ−を挿入して作製し
た変異５ＴＡＩを酵母−大腸菌シャトルベクター（ｐＢ
Ｒ３２２由来の大ＨＪ菌複製起点、２μｍ Ｄ Ｎ Ａ
由来の酵母複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、Ｌ立上
２遺伝子、およびＵＬ３遺伝子からなる）内に組み込ん
だものである。このプラスミドｐＩＹ１６９には１二Ｌ
１プロモーターの直後にχｈｏＩサイトが１つ、そして
止且五３ターミネータ−の直前にＳｍａＩサイトが１つ
存在し、この２つの制限酵素切断部位の間に、シャトル
ベクター内には存在しない数種の制限酵素切断部位をも
つＤＮＡ断片を挿入することにより目的の発現ベクター
を得ることができる。
ることができる。なお本発明のベクターの調製方法は種
々のものが可能であり、以下に記載するものに限定され
ないことは言うまでもない プラスミドｐＩＹ１６９（第１図）は５ＴＡ１のＮ末端
領域内に８ｍａｒの左且ｆＩリンカ−を挿入して作製し
た変異５ＴＡＩを酵母−大腸菌シャトルベクター（ｐＢ
Ｒ３２２由来の大ＨＪ菌複製起点、２μｍ Ｄ Ｎ Ａ
由来の酵母複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、Ｌ立上
２遺伝子、およびＵＬ３遺伝子からなる）内に組み込ん
だものである。このプラスミドｐＩＹ１６９には１二Ｌ
１プロモーターの直後にχｈｏＩサイトが１つ、そして
止且五３ターミネータ−の直前にＳｍａＩサイトが１つ
存在し、この２つの制限酵素切断部位の間に、シャトル
ベクター内には存在しない数種の制限酵素切断部位をも
つＤＮＡ断片を挿入することにより目的の発現ベクター
を得ることができる。
（２）ヒト５−リポキシゲナーゼをコードする遺伝子の
構築 第２図に後述の実施例においてクローニングしたヒト５
−リポキシゲナーゼの全アミノ酸配列および全塩基配列
を示した。ヒト５−リポキシゲナーゼをコードする遺伝
子の翻訳領域は、第２図に示した塩基番号１−３のＡＴ
Ｇから始まり塩基番号２０２３−２０２５のＴＧＡで終
わる領域であるが、ヒト５−リポキシゲナーゼの成熟蛋
白質のＮ末端アミノ酸は、プロリンであることが明らか
になっている［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス、米国、第８５巻、
２６頁（１９８８＞］、したがって、Ｎ末Ｎ末端領域内
上流のメチオニンは、細胞内プロセッシングにより前駆
体から成熟体に変換される際に切断されると考えられる
。
構築 第２図に後述の実施例においてクローニングしたヒト５
−リポキシゲナーゼの全アミノ酸配列および全塩基配列
を示した。ヒト５−リポキシゲナーゼをコードする遺伝
子の翻訳領域は、第２図に示した塩基番号１−３のＡＴ
Ｇから始まり塩基番号２０２３−２０２５のＴＧＡで終
わる領域であるが、ヒト５−リポキシゲナーゼの成熟蛋
白質のＮ末端アミノ酸は、プロリンであることが明らか
になっている［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス、米国、第８５巻、
２６頁（１９８８＞］、したがって、Ｎ末Ｎ末端領域内
上流のメチオニンは、細胞内プロセッシングにより前駆
体から成熟体に変換される際に切断されると考えられる
。
遺伝子工学的手法による製造では、ヒξ５−リポキシゲ
ナーゼのＮ末端プロリンの上流に、発現プラスミドベク
ターを構築する際に必要なリンカ−に由来するアミノ酸
を含む融合蛋白質として目的とする蛋白質が発現される
。
ナーゼのＮ末端プロリンの上流に、発現プラスミドベク
ターを構築する際に必要なリンカ−に由来するアミノ酸
を含む融合蛋白質として目的とする蛋白質が発現される
。
生理活性を有するポリペプチドにおいて、少数のアミノ
酸が置換し、欠失し、または少数のアミノ酸が付加され
ても、そのポリペプチドの生理活性が影響を受けないこ
とがあることは、当業者において広く認識されているこ
とである。したがって、第２図に示す上述した翻訳領域
において、少数の塩基が置換し、欠失し、または付加さ
れた結果、この領域がコードするアミノ酸配列のうちの
少数のアミノ酸が置換し、欠失し、または付加された場
合であっても、ヒト５−リポキシゲナーゼの機能すなわ
ち、その生物活性が実質的に影響を受けない場合には、
その領域は第２図に示されたものと実質的に同一であり
、本願発明の範囲内に含まれることは明かである。
酸が置換し、欠失し、または少数のアミノ酸が付加され
ても、そのポリペプチドの生理活性が影響を受けないこ
とがあることは、当業者において広く認識されているこ
とである。したがって、第２図に示す上述した翻訳領域
において、少数の塩基が置換し、欠失し、または付加さ
れた結果、この領域がコードするアミノ酸配列のうちの
少数のアミノ酸が置換し、欠失し、または付加された場
合であっても、ヒト５−リポキシゲナーゼの機能すなわ
ち、その生物活性が実質的に影響を受けない場合には、
その領域は第２図に示されたものと実質的に同一であり
、本願発明の範囲内に含まれることは明かである。
さらにまた、−ｍに一つのアミノ酸をコードするコドン
は複数存在する。第２図に示したアミノ酸配列をコード
する他の塩基配列も、第２図に示す塩基配列とともにヒ
ト５−リポキシゲナーゼをコードする遺伝子と解釈する
。
は複数存在する。第２図に示したアミノ酸配列をコード
する他の塩基配列も、第２図に示す塩基配列とともにヒ
ト５−リポキシゲナーゼをコードする遺伝子と解釈する
。
本発明の遺伝子は、合成プローブを用いたハイブリダイ
ゼーション法により、ヒト胎ｆｉｌ ｅ Ｄ ＮＡライ
ブラリー（クロンチック社製）からヒト５−リポキシゲ
ナーゼをコードする遺伝子として単離することができる
。得られるほぼ完全な鎖長のｃＤＮＡ （２，５５ｋｂ
Ｐ）には、人工１１サイト間に５１個の本来存在しない
塩基対が繰り遅して存在しているので、この遺伝子を市
販のプラスミドｐＵｃ１１８に組み込んだ後、Ｘ」ｍ」
２Ｉサイト間のＤＮＡ断片（４２２ｂｐ）を切り出し、
繰り返し塩基対を含まないＤＮＡ断片（３７１ｂｐ）と
交換し、方向性を持たせて結合させる０次に、ヒト５−
リポキシゲナーゼをコードする遺伝子の発現に必要な翻
訳開始コドンＡＴＧと、プロモータ一部位との間の塩基
数を１ｌｌＵできるようにするため、ＡＴＧの上流の非
翻訳領域を削除し、ＡＴＧの直前に１二ｍＲＩサイトを
付加し、さらにターミネータ一部位との間の塩基数も調
製できるようにするために３°側の非翻訳領域の一部も
削除する。
ゼーション法により、ヒト胎ｆｉｌ ｅ Ｄ ＮＡライ
ブラリー（クロンチック社製）からヒト５−リポキシゲ
ナーゼをコードする遺伝子として単離することができる
。得られるほぼ完全な鎖長のｃＤＮＡ （２，５５ｋｂ
Ｐ）には、人工１１サイト間に５１個の本来存在しない
塩基対が繰り遅して存在しているので、この遺伝子を市
販のプラスミドｐＵｃ１１８に組み込んだ後、Ｘ」ｍ」
２Ｉサイト間のＤＮＡ断片（４２２ｂｐ）を切り出し、
繰り返し塩基対を含まないＤＮＡ断片（３７１ｂｐ）と
交換し、方向性を持たせて結合させる０次に、ヒト５−
リポキシゲナーゼをコードする遺伝子の発現に必要な翻
訳開始コドンＡＴＧと、プロモータ一部位との間の塩基
数を１ｌｌＵできるようにするため、ＡＴＧの上流の非
翻訳領域を削除し、ＡＴＧの直前に１二ｍＲＩサイトを
付加し、さらにターミネータ一部位との間の塩基数も調
製できるようにするために３°側の非翻訳領域の一部も
削除する。
（３）発現４ｆｉ換え体の構築
本発明は上記の遺伝子を含み、宿主中でヒト５−リポキ
シゲナーゼを発現させることができる発現ベクターを提
供する。この発現ベクターは、上記遺伝子の他に、従来
よりこの分野において周知の他の発現ベクターと同様、
宿主内で複製するための複製開始点と、上記遺伝子の上
流に存在する、例えばグルコアミラーゼ遺伝子（ＳＴＡ
Ｉと略称することもある）プロモーターのようなプロモ
ーター 上記遺伝子の下流に存在する、例えばＬＬＬＡ
３ターミネータ−のようなターミネータ−と、例えばＬ
ＥＵ２マーカーのような適当な選択マーカー さらには
大腸菌内で複製するなめの複製開始点と、例えば大腸菌
において有効な抗生物質耐性のような適当な選択マーカ
ーを有する。
シゲナーゼを発現させることができる発現ベクターを提
供する。この発現ベクターは、上記遺伝子の他に、従来
よりこの分野において周知の他の発現ベクターと同様、
宿主内で複製するための複製開始点と、上記遺伝子の上
流に存在する、例えばグルコアミラーゼ遺伝子（ＳＴＡ
Ｉと略称することもある）プロモーターのようなプロモ
ーター 上記遺伝子の下流に存在する、例えばＬＬＬＡ
３ターミネータ−のようなターミネータ−と、例えばＬ
ＥＵ２マーカーのような適当な選択マーカー さらには
大腸菌内で複製するなめの複製開始点と、例えば大腸菌
において有効な抗生物質耐性のような適当な選択マーカ
ーを有する。
本発明の発現ベクターは、例えば以下のようにして調製
することができる。なお、本発明のベクターの調製方法
は種々のものが可能であり、以下に記載するものに限定
されないことは言うまでもない。
することができる。なお、本発明のベクターの調製方法
は種々のものが可能であり、以下に記載するものに限定
されないことは言うまでもない。
上記（１）で調製した異種蛋白質遺伝子の醇母内発現用
ベクターｐＭＮ１９１にはクローニングサイトとしてＸ
ｈｏＩとｍＩが存在する。
ベクターｐＭＮ１９１にはクローニングサイトとしてＸ
ｈｏＩとｍＩが存在する。
そこで上記（２）のようにして調製したヒト５−リボキ
シゲナーゼをコードする遺伝子をこのクローニングサイ
トに方向性を持たせて挿入し、目的の本発明の発現ベク
ターを得る。
シゲナーゼをコードする遺伝子をこのクローニングサイ
トに方向性を持たせて挿入し、目的の本発明の発現ベク
ターを得る。
本発明は上述したように上記本発明の発現ベクターで形
質転換された酵母を提供する。酵母の形質転換はこの分
野において周知の方法をそのまま適用することができ、
例えばＨｉｎｎｅｎ、Ａ［プロシーディング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンス、米国、
第７５巻、１９２９頁（１９７８）］の方法により形質
転換を行い、発現ベクターが有する栄養非要求性のよう
な選択マーカーによって選択することができる。
質転換された酵母を提供する。酵母の形質転換はこの分
野において周知の方法をそのまま適用することができ、
例えばＨｉｎｎｅｎ、Ａ［プロシーディング・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミ−・オプ・サイエンス、米国、
第７５巻、１９２９頁（１９７８）］の方法により形質
転換を行い、発現ベクターが有する栄養非要求性のよう
な選択マーカーによって選択することができる。
本発明はさらに、上記の形質転換酵母を培養し、培養物
からヒト５−リポキシゲナーゼを採取することからなる
ヒト５−リポキシゲナーゼの製造方法を提供する。形質
転換株の培養はグルコース濃度の低い培地条件下で増殖
させ、この低グルコース濃度の環境によって遺伝子の発
現を誘導する。この誘導に用いる培地としては、３％グ
リセロールを含むＹＰＧ培地を用いることができる。
からヒト５−リポキシゲナーゼを採取することからなる
ヒト５−リポキシゲナーゼの製造方法を提供する。形質
転換株の培養はグルコース濃度の低い培地条件下で増殖
させ、この低グルコース濃度の環境によって遺伝子の発
現を誘導する。この誘導に用いる培地としては、３％グ
リセロールを含むＹＰＧ培地を用いることができる。
これにより菌体内でヒト５−リポキシゲナーゼが生産さ
れ蓄積される。
れ蓄積される。
菌体内に蓄積されるヒト５−リポキシゲナーゼの回収、
精製は例えば以下のようにして行うことができる。菌体
懸濁液を遠心分離にかけて集菌し、これを蛋白質分解酵
素阻害剤を含む緩衝液に再び懸濁させ、これをグラスビ
ーズによって破砕し、この破砕液を遠心分離して上清を
得る。この上清を硫酸アンモニウムで塩析し、硫敢アン
モニラム濃度が３０％−６０％の範囲で塩析される蛋白
質画分中にヒト５−リポキシゲナーゼが回収される。こ
れを透析し、得られる蛋白質画分と５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（以下５ＤＳ−ＰＡＧＥと略記す
る）にかけると、ヒト５−リポキシゲナーゼに相当する
バンドが確認できる。
精製は例えば以下のようにして行うことができる。菌体
懸濁液を遠心分離にかけて集菌し、これを蛋白質分解酵
素阻害剤を含む緩衝液に再び懸濁させ、これをグラスビ
ーズによって破砕し、この破砕液を遠心分離して上清を
得る。この上清を硫酸アンモニウムで塩析し、硫敢アン
モニラム濃度が３０％−６０％の範囲で塩析される蛋白
質画分中にヒト５−リポキシゲナーゼが回収される。こ
れを透析し、得られる蛋白質画分と５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（以下５ＤＳ−ＰＡＧＥと略記す
る）にかけると、ヒト５−リポキシゲナーゼに相当する
バンドが確認できる。
この蛋白質画分が、ヒト５−リポキシゲナーゼの生物活
性を有することは確認している。
性を有することは確認している。
［実施例］
以下、本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に
説明する。もつとも、本発明は、下記実施例に限定され
るものではないことは明かである。
説明する。もつとも、本発明は、下記実施例に限定され
るものではないことは明かである。
なお、下記の実施例において、各操作は、特に明示がな
い限り、Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら、 ［Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍ、ａｎｕａｌ、 （１９８２）Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ］記載の方法により
行った。また、制限酵素は市販のものを用い、その具体
的使用法は市販品の指示書に従った。
い限り、Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら、 ［Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍ、ａｎｕａｌ、 （１９８２）Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ］記載の方法により
行った。また、制限酵素は市販のものを用い、その具体
的使用法は市販品の指示書に従った。
第１図に示したプラスミドｐＩＹ１６９は、酵母グルコ
アミラーゼ遺伝子（シエＡ１と略称することもある）の
Ｎ末端領域内に８ｍａ ｒのｘ上皇Ｉリンカ−を挿入し
て作製した変異影工五１を酵母−大腸菌シャトルベクタ
ー（ｐＢＲ３２２由来大腸菌復製起点、２μｍＤＮＡ由
来酵母複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、Ｌ二ｉ」ユ
２ ｉｉ伝子、およびＵＲＡ３遺伝子からなる）内に組
み込んだものである。
アミラーゼ遺伝子（シエＡ１と略称することもある）の
Ｎ末端領域内に８ｍａ ｒのｘ上皇Ｉリンカ−を挿入し
て作製した変異影工五１を酵母−大腸菌シャトルベクタ
ー（ｐＢＲ３２２由来大腸菌復製起点、２μｍＤＮＡ由
来酵母複製起点、アンピシリン耐性遺伝子、Ｌ二ｉ」ユ
２ ｉｉ伝子、およびＵＲＡ３遺伝子からなる）内に組
み込んだものである。
まずｉｏｆｇのｐＩＹｉ６９を１０単位のむａＩで消化
反応し、エタノール沈１ ｔａ−Ｔ Ｅバッファーに溶
解した。これに１０単位のＸｈｏＩ（日本ジーン社製）
を加え、５０バの＆丘ユＩ反応液［６ｍＭＴｒ ｉ ５
−ＨＣ−Ｑ （ｐＨ７，９）、１５０ｍＭＮａＣｆｆ、
６ｍＭＭｇＣＲ２，６ｍＭ２−メルカプトエタノール］
中で３７℃、３時間反応させた。該反応物をアガロース
ゲル電気泳動にて分離し、約飢 ８ｋｂｐのＤＮＡ断片
をＤＥＡＥペーパー法［ドレツェン（Ｄｒｅｔｚｅｎ）
ら、アナリティカル・バイオケミストリー 第１１２巻
、２９５頁（１９８１）］にて回収した１次に、１７
ｒｎ ｅ ｒの ５ ’−ＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧ
ＡＣＣＣ−３’と１３ｍｅｒの５ ’−ＧＧＧＴＣＧＡ
ＣＡＧＡＴＣ−５°を合成し、これをアニーリングさせ
たＤＮＡ断片５０ｐｍｏ ｌ ｅを先に回収したＤＮＡ
断片（約９．８ｋｂｐ）を含む２虜の溶液に加え、さら
に１縛の１０倍濃度のリガーゼバッファーおよび１バの
１０ｍＭＡＴＰを加えて１０縛の溶液とし、これに６単
位のＴ、ＤＮＡリガーゼを加えて１４°Ｃで１６時間結
合反応を行った。該反応溶液を用いて常法により大腸菌
ＭＶ１１８４株を形質転換し、アンピシリン耐性（ＡＰ
Ｒ）のコロニーを得、このコロニーより１ラスミドＤＮ
Ａを回収した０回収したプラスミドＤＮＡ（ｐＭＮ１９
１）が目的とするものかどうかは、左ｉ工Ｉ、１ｘユＩ
Ｉ、ｌ立Ｊ工および１旦１１のそれぞれで切断してアガ
ロースゲル電気泳動にて確認した。またＳＴＡ １プロ
モーターとＵ Ｒ，Ａ３ターミネータ−との間の配列が
、 ５ ’−ＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧ
−３’３ ’−ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧ
ＣＣＣ−５゜であることを配列５°−ＣＴＡＡＴＴＧＡ
ＡＡＡＴＡＴＡＣＴ−３′の１７ｍｅ ｒのオリゴヌク
レオチドを合成し、これをプライマーとしてダイデオキ
シシーケンス法で決定した。その結果Ｘ ｈ ｏ Ｉ、
Ｂ−（」−Ｉ Ｉ、ＳａＲ工およびＳｍａＩ−の４
種のクローニングサイトを持つ異種蛋白質遺伝子の酵母
自発現用ベクターｐＭＮ１９１を得ることができた（第
１図）。
反応し、エタノール沈１ ｔａ−Ｔ Ｅバッファーに溶
解した。これに１０単位のＸｈｏＩ（日本ジーン社製）
を加え、５０バの＆丘ユＩ反応液［６ｍＭＴｒ ｉ ５
−ＨＣ−Ｑ （ｐＨ７，９）、１５０ｍＭＮａＣｆｆ、
６ｍＭＭｇＣＲ２，６ｍＭ２−メルカプトエタノール］
中で３７℃、３時間反応させた。該反応物をアガロース
ゲル電気泳動にて分離し、約飢 ８ｋｂｐのＤＮＡ断片
をＤＥＡＥペーパー法［ドレツェン（Ｄｒｅｔｚｅｎ）
ら、アナリティカル・バイオケミストリー 第１１２巻
、２９５頁（１９８１）］にて回収した１次に、１７
ｒｎ ｅ ｒの ５ ’−ＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧ
ＡＣＣＣ−３’と１３ｍｅｒの５ ’−ＧＧＧＴＣＧＡ
ＣＡＧＡＴＣ−５°を合成し、これをアニーリングさせ
たＤＮＡ断片５０ｐｍｏ ｌ ｅを先に回収したＤＮＡ
断片（約９．８ｋｂｐ）を含む２虜の溶液に加え、さら
に１縛の１０倍濃度のリガーゼバッファーおよび１バの
１０ｍＭＡＴＰを加えて１０縛の溶液とし、これに６単
位のＴ、ＤＮＡリガーゼを加えて１４°Ｃで１６時間結
合反応を行った。該反応溶液を用いて常法により大腸菌
ＭＶ１１８４株を形質転換し、アンピシリン耐性（ＡＰ
Ｒ）のコロニーを得、このコロニーより１ラスミドＤＮ
Ａを回収した０回収したプラスミドＤＮＡ（ｐＭＮ１９
１）が目的とするものかどうかは、左ｉ工Ｉ、１ｘユＩ
Ｉ、ｌ立Ｊ工および１旦１１のそれぞれで切断してアガ
ロースゲル電気泳動にて確認した。またＳＴＡ １プロ
モーターとＵ Ｒ，Ａ３ターミネータ−との間の配列が
、 ５ ’−ＣＴＣＧＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＣＣＣＧＧＧ
−３’３ ’−ＧＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＧＣＴＧＧＧ
ＣＣＣ−５゜であることを配列５°−ＣＴＡＡＴＴＧＡ
ＡＡＡＴＡＴＡＣＴ−３′の１７ｍｅ ｒのオリゴヌク
レオチドを合成し、これをプライマーとしてダイデオキ
シシーケンス法で決定した。その結果Ｘ ｈ ｏ Ｉ、
Ｂ−（」−Ｉ Ｉ、ＳａＲ工およびＳｍａＩ−の４
種のクローニングサイトを持つ異種蛋白質遺伝子の酵母
自発現用ベクターｐＭＮ１９１を得ることができた（第
１図）。
第２図に示したヒト５−リポキシゲナーゼをコードする
ＤＮＡは、プロシーディング・オブ・ザ・ナシ−ナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス、米国、第８５巻、２６
頁（１９８８＞および同第８５巻、３４０６頁（ＩＱ８
８）に記載した方法を参考にし、合成プローブを用いた
ハイブリダイゼーション法によりヒト胎ｍ ｃ Ｄ Ｎ
Ａライブラリーから単離した。得られたほぼ完全な鎖
長のｃＤＮＡ（２，５５ｋｂｐ）には、翻訳領域内の２
個の尺皿１１サイト間すなわち第２図に示す塩基番号１
２２９から１２７９までの５１個の塩基対が繰り返され
て塩基番号１２２８と１２２９の間に存在していた。他
の不完全鎖長のｃＤＮＡ（２−２ｋｂｐおよび１．６ｋ
ｂＰ）には、この繰り返し塩基対は存在しなかった。し
たがってこの５１個の塩基対の繰り遅し構造はｃＤＮＡ
合成時に生じた１本来のヒト５−リポキシゲナーゼのｃ
ＤＮＡには存在しない人工物と結論付けられた。そこで
、この繰り返し構造を削除するために２．５５ｋ ｂ
ｐのｃＤＮＡ中の２個のＬユｘＩサイトではさまれてい
る繰り返しの゛５１塩基対を含むＤＮＡ断片を切り出し
、１．６ｋｂｐのｃＤＮＡ中の２個の人工１１サイトで
はさまれている繰り返し塩基対を含まないＤＮＡ断片と
交換し連結した。まず２．５５ｋｂｐのｃＤＮＡを２５
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ （ｐＨ７，８＞、５０ｍＭＮａ
Ｃ９，１０ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ５１２を含む４０βの溶
液に溶かして１０単位の制限酵素ＢｃＲＩ（ファルマシ
ア社製）を加え５０℃で３時間消化反応を行った。つづ
いて該溶液のＮ：ａＣＱｐ度を１００ｍＭとなるよう調
整し、１０単位の１立ｘＲＩ（日本ジーン社製）を加え
、３７℃で３時間消ｆヒ反応を行った。これをフェノー
ル処理し、エタノール沈澱後、ＴＥバッフｙ−（１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭＴｒ ｉＳ二ＨＣＲ５ｐＨ８，
０）に溶解した０次にベクタープラスミドｐＵ０１１８
（宝酒造社製）を２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ！９ （ｐ
Ｈ７，ｓ＞、 １００ｍ Ｍ Ｎ ａ ＣＱおよびｌＯ
ｍＭＭｇＣ’１２’５：含む４０バの溶液に溶解して１
０単位のＥｃｏＲＩおよびＩＬＬＪｎＨＩを加え３７゛
Ｃで３時間消化反応を行った。これをさらにフェノール
処理し、エタノール沈澱後、ＴＥバッファーに溶解した
。上記で得た二二工ＲＩ−ＥｒΣＪ Ｉ Ｄ Ｎ Ａ断
片（約２．３ｋｂｐ）を含む５バの溶液、ｐＵｃ１１８
の１立左ＲＩ −ＬＬＩｎＨＩ Ｄ Ｎ Ａ断片（約３
．２ｋｂｐ）を含む２縛の溶液、１縛の１０倍濃度のり
ガーゼバッファー および１ΔのｉｏｍＭＡＴＰを含む
１０バの溶液に６単位のＴ ４ Ｄ Ｎ Ａリガーゼ（
宝酒造社製）を加え、１４℃で１６時間結合反応を行っ
た。該反応溶液を用いて大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転
換し、Ａｐ々のコロニーを得、このコロニより１ラスミ
ドＤＮＡを回収し、ｐＨ５ＬＯＬＪ１を得たく第３図中
、工程１）、ｐＨ５ＬＯＵ１の２カ所の尺皿ＩＩサイト
ではさまれている部分の４２２ｂｐ （人工的に生じた
５１ｂｐを含む）のＤＮＡを同酵素（ＩＢＩ社製）で切
り出し不完全鎖長のｃＤＮＡのｘＪＬｉＩサイトではさ
まれている部分の３７１ｂｐ（人工物を含まない）のＤ
ＮＡと交換し、Ｔ ａ Ｄ Ｎ Ａリガーゼにより再び
結合してＰＨ５ＬＯＵ２を得た（第３図中、工程２）。
ＤＮＡは、プロシーディング・オブ・ザ・ナシ−ナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス、米国、第８５巻、２６
頁（１９８８＞および同第８５巻、３４０６頁（ＩＱ８
８）に記載した方法を参考にし、合成プローブを用いた
ハイブリダイゼーション法によりヒト胎ｍ ｃ Ｄ Ｎ
Ａライブラリーから単離した。得られたほぼ完全な鎖
長のｃＤＮＡ（２，５５ｋｂｐ）には、翻訳領域内の２
個の尺皿１１サイト間すなわち第２図に示す塩基番号１
２２９から１２７９までの５１個の塩基対が繰り返され
て塩基番号１２２８と１２２９の間に存在していた。他
の不完全鎖長のｃＤＮＡ（２−２ｋｂｐおよび１．６ｋ
ｂＰ）には、この繰り返し塩基対は存在しなかった。し
たがってこの５１個の塩基対の繰り遅し構造はｃＤＮＡ
合成時に生じた１本来のヒト５−リポキシゲナーゼのｃ
ＤＮＡには存在しない人工物と結論付けられた。そこで
、この繰り返し構造を削除するために２．５５ｋ ｂ
ｐのｃＤＮＡ中の２個のＬユｘＩサイトではさまれてい
る繰り返しの゛５１塩基対を含むＤＮＡ断片を切り出し
、１．６ｋｂｐのｃＤＮＡ中の２個の人工１１サイトで
はさまれている繰り返し塩基対を含まないＤＮＡ断片と
交換し連結した。まず２．５５ｋｂｐのｃＤＮＡを２５
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＱ （ｐＨ７，８＞、５０ｍＭＮａ
Ｃ９，１０ｍ Ｍ Ｍ ｇ Ｃ５１２を含む４０βの溶
液に溶かして１０単位の制限酵素ＢｃＲＩ（ファルマシ
ア社製）を加え５０℃で３時間消化反応を行った。つづ
いて該溶液のＮ：ａＣＱｐ度を１００ｍＭとなるよう調
整し、１０単位の１立ｘＲＩ（日本ジーン社製）を加え
、３７℃で３時間消ｆヒ反応を行った。これをフェノー
ル処理し、エタノール沈澱後、ＴＥバッフｙ−（１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭＴｒ ｉＳ二ＨＣＲ５ｐＨ８，
０）に溶解した０次にベクタープラスミドｐＵ０１１８
（宝酒造社製）を２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ！９ （ｐ
Ｈ７，ｓ＞、 １００ｍ Ｍ Ｎ ａ ＣＱおよびｌＯ
ｍＭＭｇＣ’１２’５：含む４０バの溶液に溶解して１
０単位のＥｃｏＲＩおよびＩＬＬＪｎＨＩを加え３７゛
Ｃで３時間消化反応を行った。これをさらにフェノール
処理し、エタノール沈澱後、ＴＥバッファーに溶解した
。上記で得た二二工ＲＩ−ＥｒΣＪ Ｉ Ｄ Ｎ Ａ断
片（約２．３ｋｂｐ）を含む５バの溶液、ｐＵｃ１１８
の１立左ＲＩ −ＬＬＩｎＨＩ Ｄ Ｎ Ａ断片（約３
．２ｋｂｐ）を含む２縛の溶液、１縛の１０倍濃度のり
ガーゼバッファー および１ΔのｉｏｍＭＡＴＰを含む
１０バの溶液に６単位のＴ ４ Ｄ Ｎ Ａリガーゼ（
宝酒造社製）を加え、１４℃で１６時間結合反応を行っ
た。該反応溶液を用いて大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転
換し、Ａｐ々のコロニーを得、このコロニより１ラスミ
ドＤＮＡを回収し、ｐＨ５ＬＯＬＪ１を得たく第３図中
、工程１）、ｐＨ５ＬＯＵ１の２カ所の尺皿ＩＩサイト
ではさまれている部分の４２２ｂｐ （人工的に生じた
５１ｂｐを含む）のＤＮＡを同酵素（ＩＢＩ社製）で切
り出し不完全鎖長のｃＤＮＡのｘＪＬｉＩサイトではさ
まれている部分の３７１ｂｐ（人工物を含まない）のＤ
ＮＡと交換し、Ｔ ａ Ｄ Ｎ Ａリガーゼにより再び
結合してＰＨ５ＬＯＵ２を得た（第３図中、工程２）。
ｐ Ｈ５ＬＯＵ ２が目的とする約２．２ｋｂｐのＤＮ
ＡＩｔｌｒ片を含むことをＢＬｉｉＲ工およびＨｉ ｒ
ｌｄＩＩＩで切断し、さらに旦−Ｌ」１１ Ｉで切断し
てアガロースゲル電気泳動にて確認した０次にヒト５−
リポキシゲナーゼをコードするＤＮＡの翻訳開始コドン
ＡＴＧの上流の非翻訳領域を削除し、ＡＴＧの直面に１
立ユＲＩサイトを付加した７ そのためにまず、下記の
４９ｍａｒの一本鎖ＤＮＡを常法によりアプライドバイ
オシステムズ社製ＤＮＡ合成装置３８１Ａを用いて合成
した。
ＡＩｔｌｒ片を含むことをＢＬｉｉＲ工およびＨｉ ｒ
ｌｄＩＩＩで切断し、さらに旦−Ｌ」１１ Ｉで切断し
てアガロースゲル電気泳動にて確認した０次にヒト５−
リポキシゲナーゼをコードするＤＮＡの翻訳開始コドン
ＡＴＧの上流の非翻訳領域を削除し、ＡＴＧの直面に１
立ユＲＩサイトを付加した７ そのためにまず、下記の
４９ｍａｒの一本鎖ＤＮＡを常法によりアプライドバイ
オシステムズ社製ＤＮＡ合成装置３８１Ａを用いて合成
した。
５’−ＣＧＧ Ｇ ＣＣＧＴＧＴＡＧＯＡＧＧＧＣＡＴ
ＧＡＡＴＴＣＧ ＡＡＴＣＡＴＧＩ’；Ｔ翻訳領域
Ｅ、ｃｏＲＩ ベクターＣＡＴＡＧＣＴＧ
−３’ この４９ｍａｒの一本ＭＤＮＡ３２ｐｍｏｌｅを５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣ５ｉ （ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇ
ｃ２２．１０ｍＭジチオスレイトールお上び１ｍＭＡＴ
Ｐを含む２０縛の溶液に溶解し、６単位のＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造社製）を加え、３７℃で１５
分間リン酸化反応を行い、７０°Ｃで１０分間加熱して
酵素を失活させた０次に上記で得たｐＨ５ＬＯＵ２の１
μｇを用いて大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転換し、ＡＰ
Ｒのコロニーを得、この形質転換体を０．０１％チアミ
ン、１５０席／−アンピシリンを含む２ｘＴＹ培地（バ
クトドリプトン１６ｇ／Ｑ、イーストエキストラクト１
０ ｇ／ Ｑ、 ＮａＣＱ ５ ｇ７Ｅ、ｐＨ７，６
）３艷にて３７℃で培養し、約１時間後へルバーファー
ジＭ １３ Ｋ Ｏ７を多重感染率＝１０で感染させ、
さらに１時間後カナマイシンを７０７ａ／ｍ１２になる
ように添加した。３７℃で１８時時間上う培養したのち
に１艷の培養液をエッベンドルフチュー・ブに移し、１
２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この遠心上清に
２０％ポリエチレングリコール６０００を含む２．５Ｍ
ＮａＣ９溶液２００虜を加え、混合後、室温で１５分間
放置した。これを１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し
て沈澱を得た。この沈澱を１００縛のＴＥバッファーで
完全に溶解させた。これをフェノール処理し、エタノー
ル沈澱後、減圧乾燥して一本鎖ＤＮＡを調製した（第３
図中、工程３）、以下のオリゴヌクレオチドを用いた部
位特異的イン・ビトロ変異体の調製はアマ−ジャム（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）社のオリゴヌクレオチド・グイレフテ
ッド・イン・ビトロ・ミュータージエネシス・システム
・ハンドブック（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄ
ｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）に従って行った。上記
で得た８μｍｏ ｌ ｅの４９ ｍ ａ ｒの合成オリ
ゴヌクレオチドをｐＨ５ＬＯＵ２の一本ｆｉＤＮＡ１０
Ｊ！ｇのヒト５−リポキシゲナーゼ遺伝子の５′末端翻
訳領域と１立旦ＲＩリンカ−を含むベクター領域にアニ
ールさせ（第３図中、工程４）ど ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ
α−３，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在下で、ＤＮＡポ
リメラーゼ■クレノウ断片およびＴ ４ Ｄ Ｎ Ａリ
ガーゼを働かせて二本ｇＤＮＡを合成した。チオＺクレ
オチドを含んでいないＤＮＡ鎖を制限酵素連立ユＩで切
断し、エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理した０次にｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在下でＤ
ＮＡポリメラーゼＩおよびＴ ａ Ｄ Ｎ Ａリガーゼ
を働かせて目的の塩基対を欠失した二本Ｍｉ Ｄ Ｎ
Ａ ｐ Ｈ５Ｌ ＯＵ３を調製した（第３図中、工程５
）、このようにして５−リポキシゲナーゼの５′非翻訳
領域を欠失し、５−リポキシゲナーゼの翻訳領域の開始
コドンであるＡ Ｔ Ｇの直前にＬ立ｘＲＩす・イ゛ト
分付加した変異体を得た（第３図＞、ｐＨ５ＬＯＵＢ中
のヒト５−リポキシゲナーゼのＮ末端付近をコードする
ＤＮＡの配列は ５ ’−ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡ
ＡＴＴＣＡＴＧＣＣＣＴＣＣＴＡＣ−３’ＧＴＣＧＡＴ
ＡＣＴＧＧＴＡＣＴＡＡＴＧＣＴＴＡＡＧ’［ぷ房辺左
匹尤四ベクター ＥｃｏＲＩ ＭｅｔＰｒｏＳｅｒ
Ｔｙｒであることを配列う−ＡＴＧＴＡＧＴＣＧＴＣＡ
ＧＴＧＣＣ−３’の１７ｍａ ｒのオリゴヌクレオチド
を合成し、これを１ライマーとしてグイデオキシシーケ
ンス法で決定した。その結果ｐＨ５ＬＯＵ３はヒト５−
リポキシゲナーゼをコードするＤＮＡを含むことがわか
った。
ＧＡＡＴＴＣＧ ＡＡＴＣＡＴＧＩ’；Ｔ翻訳領域
Ｅ、ｃｏＲＩ ベクターＣＡＴＡＧＣＴＧ
−３’ この４９ｍａｒの一本ＭＤＮＡ３２ｐｍｏｌｅを５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣ５ｉ （ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇ
ｃ２２．１０ｍＭジチオスレイトールお上び１ｍＭＡＴ
Ｐを含む２０縛の溶液に溶解し、６単位のＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼ（宝酒造社製）を加え、３７℃で１５
分間リン酸化反応を行い、７０°Ｃで１０分間加熱して
酵素を失活させた０次に上記で得たｐＨ５ＬＯＵ２の１
μｇを用いて大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転換し、ＡＰ
Ｒのコロニーを得、この形質転換体を０．０１％チアミ
ン、１５０席／−アンピシリンを含む２ｘＴＹ培地（バ
クトドリプトン１６ｇ／Ｑ、イーストエキストラクト１
０ ｇ／ Ｑ、 ＮａＣＱ ５ ｇ７Ｅ、ｐＨ７，６
）３艷にて３７℃で培養し、約１時間後へルバーファー
ジＭ １３ Ｋ Ｏ７を多重感染率＝１０で感染させ、
さらに１時間後カナマイシンを７０７ａ／ｍ１２になる
ように添加した。３７℃で１８時時間上う培養したのち
に１艷の培養液をエッベンドルフチュー・ブに移し、１
２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この遠心上清に
２０％ポリエチレングリコール６０００を含む２．５Ｍ
ＮａＣ９溶液２００虜を加え、混合後、室温で１５分間
放置した。これを１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し
て沈澱を得た。この沈澱を１００縛のＴＥバッファーで
完全に溶解させた。これをフェノール処理し、エタノー
ル沈澱後、減圧乾燥して一本鎖ＤＮＡを調製した（第３
図中、工程３）、以下のオリゴヌクレオチドを用いた部
位特異的イン・ビトロ変異体の調製はアマ−ジャム（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）社のオリゴヌクレオチド・グイレフテ
ッド・イン・ビトロ・ミュータージエネシス・システム
・ハンドブック（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄ
ｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）に従って行った。上記
で得た８μｍｏ ｌ ｅの４９ ｍ ａ ｒの合成オリ
ゴヌクレオチドをｐＨ５ＬＯＵ２の一本ｆｉＤＮＡ１０
Ｊ！ｇのヒト５−リポキシゲナーゼ遺伝子の５′末端翻
訳領域と１立旦ＲＩリンカ−を含むベクター領域にアニ
ールさせ（第３図中、工程４）ど ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ
α−３，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在下で、ＤＮＡポ
リメラーゼ■クレノウ断片およびＴ ４ Ｄ Ｎ Ａリ
ガーゼを働かせて二本ｇＤＮＡを合成した。チオＺクレ
オチドを含んでいないＤＮＡ鎖を制限酵素連立ユＩで切
断し、エキソヌクレアーゼＩＩＩで処理した０次にｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの存在下でＤ
ＮＡポリメラーゼＩおよびＴ ａ Ｄ Ｎ Ａリガーゼ
を働かせて目的の塩基対を欠失した二本Ｍｉ Ｄ Ｎ
Ａ ｐ Ｈ５Ｌ ＯＵ３を調製した（第３図中、工程５
）、このようにして５−リポキシゲナーゼの５′非翻訳
領域を欠失し、５−リポキシゲナーゼの翻訳領域の開始
コドンであるＡ Ｔ Ｇの直前にＬ立ｘＲＩす・イ゛ト
分付加した変異体を得た（第３図＞、ｐＨ５ＬＯＵＢ中
のヒト５−リポキシゲナーゼのＮ末端付近をコードする
ＤＮＡの配列は ５ ’−ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡ
ＡＴＴＣＡＴＧＣＣＣＴＣＣＴＡＣ−３’ＧＴＣＧＡＴ
ＡＣＴＧＧＴＡＣＴＡＡＴＧＣＴＴＡＡＧ’［ぷ房辺左
匹尤四ベクター ＥｃｏＲＩ ＭｅｔＰｒｏＳｅｒ
Ｔｙｒであることを配列う−ＡＴＧＴＡＧＴＣＧＴＣＡ
ＧＴＧＣＣ−３’の１７ｍａ ｒのオリゴヌクレオチド
を合成し、これを１ライマーとしてグイデオキシシーケ
ンス法で決定した。その結果ｐＨ５ＬＯＵ３はヒト５−
リポキシゲナーゼをコードするＤＮＡを含むことがわか
った。
ヒト５−リポキシゲナーゼのｃＤＮＡに含まれる３′側
非翻訳領域の大部分を削除することを目的として以下の
３つのステップでプラスミドｐＨ５ＬＯＵ４を構築した
（第４図）。
非翻訳領域の大部分を削除することを目的として以下の
３つのステップでプラスミドｐＨ５ＬＯＵ４を構築した
（第４図）。
（ａ）プラスミドｐＨ５ＬＯＵＢ内にあるヒト５−リポ
キシゲナーゼをコードするＤＮＡは、５′非翻訳領域を
欠失し、ヒト５−リポキシゲナーゼの翻訳領域の開始コ
ドンであるＡＴＧの直前に旦ｃｏＲ１サイトを付加した
変異体である。２０席のＰＨ５ＬＯＵ３は２０単位の１
上ＪＬ！；Ｌ Ｉ Ｉ Ｉ （日本ジーン社製）を加え
、５０縛の比重１１１ Ｉ工反応液［１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣ５１（ｐＨ７゜５）、７ｍＭＭｇＣＱ２．６０ｍ
ＭＮａＣＲ］中で３７℃、３時間反応させた。これをフ
ェノール処理し、エタノール沈澱後、ＴＥバッファー（
１ｒｎＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ’ｊ、
ｐＨ８，０＞に溶解した。溶解したＤＮＡ断片のうち１
０Ｊ！ｇは、０． ５単位のＢ−八」、３１ヌクレアー
ゼ（宝酒造社製）を加え１００バの１人上３１反応液［
２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＲ（ｐＨ８，０）、６００ｍＭ
ＮａＣ２、ｉ２ｍＭｃａｃＲｚ、１２ｍＭ Ｍ ｇ Ｃ
’ｊ ２．１ｍＭＥＤＴＡ］中で２５℃、３分間反応さ
せた。この反応は１０縛の０．２ＭＥＧＴＡを加えるこ
とにより停止し、フェノール処理、エタノール沈澱後、
ＤＮＡ断片をＴＥバッファーに溶解した。ここで溶解し
たＤＮＡ断片は、１０単位のｉ立旦Ｒ１（日本ジーン社
製）を加え、５０Ｊ１１のＬ１旦Ｒ１反応液［１００ｍ
ＭＴ ｒ ｉｓ’ −ＨＣ２（ｐＨ７，５）、７ ｍ
Ｍ Ｍ ｇ Ｃ９２，５０ｍＭＮａＣｇ、７ｍＭ２−メ
ルカプトエタノール、０．０１％ウシ血清アルブミン］
中で３７℃、３時間反応させた０反応後フェノール処理
し、エタノール沈澱ののちＴＥに溶解した。
キシゲナーゼをコードするＤＮＡは、５′非翻訳領域を
欠失し、ヒト５−リポキシゲナーゼの翻訳領域の開始コ
ドンであるＡＴＧの直前に旦ｃｏＲ１サイトを付加した
変異体である。２０席のＰＨ５ＬＯＵ３は２０単位の１
上ＪＬ！；Ｌ Ｉ Ｉ Ｉ （日本ジーン社製）を加え
、５０縛の比重１１１ Ｉ工反応液［１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣ５１（ｐＨ７゜５）、７ｍＭＭｇＣＱ２．６０ｍ
ＭＮａＣＲ］中で３７℃、３時間反応させた。これをフ
ェノール処理し、エタノール沈澱後、ＴＥバッファー（
１ｒｎＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ’ｊ、
ｐＨ８，０＞に溶解した。溶解したＤＮＡ断片のうち１
０Ｊ！ｇは、０． ５単位のＢ−八」、３１ヌクレアー
ゼ（宝酒造社製）を加え１００バの１人上３１反応液［
２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＲ（ｐＨ８，０）、６００ｍＭ
ＮａＣ２、ｉ２ｍＭｃａｃＲｚ、１２ｍＭ Ｍ ｇ Ｃ
’ｊ ２．１ｍＭＥＤＴＡ］中で２５℃、３分間反応さ
せた。この反応は１０縛の０．２ＭＥＧＴＡを加えるこ
とにより停止し、フェノール処理、エタノール沈澱後、
ＤＮＡ断片をＴＥバッファーに溶解した。ここで溶解し
たＤＮＡ断片は、１０単位のｉ立旦Ｒ１（日本ジーン社
製）を加え、５０Ｊ１１のＬ１旦Ｒ１反応液［１００ｍ
ＭＴ ｒ ｉｓ’ −ＨＣ２（ｐＨ７，５）、７ ｍ
Ｍ Ｍ ｇ Ｃ９２，５０ｍＭＮａＣｇ、７ｍＭ２−メ
ルカプトエタノール、０．０１％ウシ血清アルブミン］
中で３７℃、３時間反応させた０反応後フェノール処理
し、エタノール沈澱ののちＴＥに溶解した。
（ｂ）ＬｏｇのベクタープラスミドｐＨ３Ｇ３９９（宝
酒造社製）を６ｍＭＴｒ ｉ ｓ −ＨＣＱ （ｐＨ７
，９）、２０ｍＭＫＣＲ１６ｍ Ｍ Ｍｇ ＣＱ ２、
および６ ｍ Ｍ ２−メルカプトエタノールを含む５
０縛の溶液に溶解して１０単位のｉ工ａＩ（日本ジーン
社製）を加えて３０℃で３時間消化反応を行った。これ
をさらにエタノール沈澱後、ＴＥバッファーに溶解し、
つづいて１０単位のＬ立旦Ｒ１で消化反応を行った０反
応液はフェノール処理し、エタノール沈澱ｆＡＤＮＡＵ
Ｔ片をＴＥバッファーに溶解した。
酒造社製）を６ｍＭＴｒ ｉ ｓ −ＨＣＱ （ｐＨ７
，９）、２０ｍＭＫＣＲ１６ｍ Ｍ Ｍｇ ＣＱ ２、
および６ ｍ Ｍ ２−メルカプトエタノールを含む５
０縛の溶液に溶解して１０単位のｉ工ａＩ（日本ジーン
社製）を加えて３０℃で３時間消化反応を行った。これ
をさらにエタノール沈澱後、ＴＥバッファーに溶解し、
つづいて１０単位のＬ立旦Ｒ１で消化反応を行った０反
応液はフェノール処理し、エタノール沈澱ｆＡＤＮＡＵ
Ｔ片をＴＥバッファーに溶解した。
（Ｃ）上記実施例（ａ）で得られたＤＮＡ断片を含む５
バの溶液、実施例−（ｂ）で得られた約２゜２ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を含む２Ｊ！Ｑの溶液、ＩＡＩＱの１０倍濃
度のリガーゼバッファーおよび１縛の１０ｍＭＡＴＰを
含む１０ｄの溶液に６単位のＴ ４ ＤＮＡリガーゼ（
宝酒造社製）を加え、１４°Ｃで１６時間結合反応を行
った。該反応溶液を用いて常法により、大腸菌ＭＶ１１
８４株を形質転換し、クロラムフェニコールｍ性（Ｃｍ
”）のコロニーを得、このコロニーよりプラスミドＤ
Ｎ Ａを回収した。このプラスミド（ｐＨ５ＬＯＵ４＞
が目的とする約２．０ｋｂｐのＤＮＡを含むことをＬ立
旦Ｒ１およびＪＩＬ［Ｌ！；Ｌ Ｉ Ｉ Ｉで切断して
アガロースゲル電気泳動にて確認した。このようにして
ヒト５−リポキシゲナーゼの３°非目訳領域の大部分を
欠失した変異体を得た（第４図）、ｐＨうＬＯＵ４のヒ
ト５−リポキシゲナーゼをコードするＤＮＡの３°末端
付近の配列は、 ５ ’ −ＡＴＣＴＧＡＧＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＧＴＣ
ＴＣＡＣＴＧＴＧＧＧＡＡＧＧＣＣＧＧ−３’ＴＡＧＡ
ＣＴＣＧＴＧＴＧＡＣＧＧＴＣＡＧＡＧＴＧＡＣＡＣＣ
ＣＴＴＣＣＧＧ匹ｒｌｅネ本本
ベク ターであることを
グイデオキシシーケンス法で決定した。その結果ｐＨ５
ＬＯＵ４はヒト５−リポキシゲナーゼをコードするＤＮ
Ａを含むことがわがった。
バの溶液、実施例−（ｂ）で得られた約２゜２ｋｂｐの
ＤＮＡ断片を含む２Ｊ！Ｑの溶液、ＩＡＩＱの１０倍濃
度のリガーゼバッファーおよび１縛の１０ｍＭＡＴＰを
含む１０ｄの溶液に６単位のＴ ４ ＤＮＡリガーゼ（
宝酒造社製）を加え、１４°Ｃで１６時間結合反応を行
った。該反応溶液を用いて常法により、大腸菌ＭＶ１１
８４株を形質転換し、クロラムフェニコールｍ性（Ｃｍ
”）のコロニーを得、このコロニーよりプラスミドＤ
Ｎ Ａを回収した。このプラスミド（ｐＨ５ＬＯＵ４＞
が目的とする約２．０ｋｂｐのＤＮＡを含むことをＬ立
旦Ｒ１およびＪＩＬ［Ｌ！；Ｌ Ｉ Ｉ Ｉで切断して
アガロースゲル電気泳動にて確認した。このようにして
ヒト５−リポキシゲナーゼの３°非目訳領域の大部分を
欠失した変異体を得た（第４図）、ｐＨうＬＯＵ４のヒ
ト５−リポキシゲナーゼをコードするＤＮＡの３°末端
付近の配列は、 ５ ’ −ＡＴＣＴＧＡＧＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＧＴＣ
ＴＣＡＣＴＧＴＧＧＧＡＡＧＧＣＣＧＧ−３’ＴＡＧＡ
ＣＴＣＧＴＧＴＧＡＣＧＧＴＣＡＧＡＧＴＧＡＣＡＣＣ
ＣＴＴＣＣＧＧ匹ｒｌｅネ本本
ベク ターであることを
グイデオキシシーケンス法で決定した。その結果ｐＨ５
ＬＯＵ４はヒト５−リポキシゲナーゼをコードするＤＮ
Ａを含むことがわがった。
本発明で用いた発現ベクタープラスミドｐｓＴ５ＬＯの
構築は第５図に従って行った。以下３つのステップに分
けてｔｉＪ築の方法を述べる。
構築は第５図に従って行った。以下３つのステップに分
けてｔｉＪ築の方法を述べる。
（ａｎｉｏｐｇのｐＭＮ １９１を１０単位のΣユ１１
Ｔ消化反応し、エタノール沈澱後ＴＥバッファーに溶解
した。これに１０単位の左且工１ （日本ジーン社製）
を加え、５０４のＸｈｏＩ反応液［６ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃ２（ｐＨ７，９＞、１５０ｍ Ｍ Ｎ ａ Ｃ２，６
ｍＭＭｇＣＲ２，６ｍＭ２−メルカプトエタノール］中
で３７℃、３時間反応させた。該反応物をアガロースゲ
ル電気泳動にて分離し、約９．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を
ＤＥＡＥベーパー法で回収した０次に、この回収ＤＮＡ
に２単位の大腸菌ポリメラーゼ−■のクレノーフラグメ
ント（宝酒造社製）を加え１００バのクレノー反応液［
７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＲ（ｐＨ７，５＞、０゜１ｍＭＥ
ＤＴＡ、２０ｍＭＮ ａＣＱ、７ ｍＭＭ ｇＣＩ２２
．０．１ｍＭｄＡＴＰ、０． １ｍＭｄＧＴＰ、０．１
ｍＭｄＣＴＰおよび０．１ｍＭｄＴＴＰ］中で３７℃１
時間反応させることによりＸｈｏＩサイト側接着未接着
末端化した０反応液をフェノール処理後、エタノール沈
澱し、回収したＤＮＡはＴＥバッファーに溶解した。さ
らに溶解したＤＮＡに２単位の大腸菌アルカリホスファ
ターゼ（宝酒造社製）を加え、１００縛の反応液［ＩＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＯ２（ＰＨ８，０）、 １ ｍ Ｍ Ｍ
ｇ Ｓ ０４］中で６０℃、１時間反応し、両平滑末端
を脱リン酸化した０反応液をフェノール処理後、エタノ
ール沈澱し、沈澱したＤＮＡ断片はＴＥバッファーに溶
解した。
Ｔ消化反応し、エタノール沈澱後ＴＥバッファーに溶解
した。これに１０単位の左且工１ （日本ジーン社製）
を加え、５０４のＸｈｏＩ反応液［６ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃ２（ｐＨ７，９＞、１５０ｍ Ｍ Ｎ ａ Ｃ２，６
ｍＭＭｇＣＲ２，６ｍＭ２−メルカプトエタノール］中
で３７℃、３時間反応させた。該反応物をアガロースゲ
ル電気泳動にて分離し、約９．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を
ＤＥＡＥベーパー法で回収した０次に、この回収ＤＮＡ
に２単位の大腸菌ポリメラーゼ−■のクレノーフラグメ
ント（宝酒造社製）を加え１００バのクレノー反応液［
７ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＲ（ｐＨ７，５＞、０゜１ｍＭＥ
ＤＴＡ、２０ｍＭＮ ａＣＱ、７ ｍＭＭ ｇＣＩ２２
．０．１ｍＭｄＡＴＰ、０． １ｍＭｄＧＴＰ、０．１
ｍＭｄＣＴＰおよび０．１ｍＭｄＴＴＰ］中で３７℃１
時間反応させることによりＸｈｏＩサイト側接着未接着
末端化した０反応液をフェノール処理後、エタノール沈
澱し、回収したＤＮＡはＴＥバッファーに溶解した。さ
らに溶解したＤＮＡに２単位の大腸菌アルカリホスファ
ターゼ（宝酒造社製）を加え、１００縛の反応液［ＩＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＯ２（ＰＨ８，０）、 １ ｍ Ｍ Ｍ
ｇ Ｓ ０４］中で６０℃、１時間反応し、両平滑末端
を脱リン酸化した０反応液をフェノール処理後、エタノ
ール沈澱し、沈澱したＤＮＡ断片はＴＥバッファーに溶
解した。
（ｂ）１０ｐｇのｐＨ５ＬＯＵ４ （第４図）をｉ工、
ｑＲｌおよび出±ｄ Ｉ Ｉ Ｉそれぞれ１０単位で消
化反応し、この反応溶液からＤＥＡＥペーパー法でヒト
５−リポキシゲナーゼをコードするＤＮＡ約２．０ｋｂ
ｐを単離した６次にこのＤＮＡの再接着末端を大腸面ポ
リメラーゼＩのクレノーフラグメント２単位を用いて平
滑化した。そして反応液をフェノール処理後、エタノー
ル沈澱し回収したＤＮＡをＴＥバッファーに溶解した。
ｑＲｌおよび出±ｄ Ｉ Ｉ Ｉそれぞれ１０単位で消
化反応し、この反応溶液からＤＥＡＥペーパー法でヒト
５−リポキシゲナーゼをコードするＤＮＡ約２．０ｋｂ
ｐを単離した６次にこのＤＮＡの再接着末端を大腸面ポ
リメラーゼＩのクレノーフラグメント２単位を用いて平
滑化した。そして反応液をフェノール処理後、エタノー
ル沈澱し回収したＤＮＡをＴＥバッファーに溶解した。
（Ｃ）実施例（ａ）で得られたＤＮＡ断片（約９゜８
ｋ ｂ ｐ ）を含む２縛の溶液に、実施例（ｂ）で得
られたＤＮＡ断片（約２−Ｏｋｂｐ）を含む５バの溶液
を加え、さらに１バの１０＠濃度のリガーゼバッファー
および１縛の１０ｍＭＡＴＰを加えて１０４の溶液とし
、これに６単位のＴ ａ Ｄ Ｎ Ａリガーゼを加え、
１４℃で１６時間、結合反応を行った。該反応溶液を用
いて常法により、大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転換し、
ＡＰＲのコロニーを得、このコロニーより１ラスミドＤ
ＮＡを回収した８回収したプラスミドＤＮＡ （ｐｓＴ
５Ｌｏ）に目的とする約２．０ｋｂｐのＤＮＡがＳＴＡ
１プロモーターに対して順方向に挿入されていること
をＬＬｍＨ工（日本ジーン）で切断してアガロースゲル
電気泳動にて！認した。ＰＳＴＳＬＯ中のヒト５−リポ
キシゲナーゼをコードするＤＮＡの５′側末端付近の配
列は、 ５ ’−ＡＣＧＣＡＣＡＣＴＡＴＧＣＣＣＴＣＧＡＡＡ
ＴＴＣＡＴＧＣＣＣ−３’ＴＧＣＧＴＧＴＧＡＴＡＣＧ
ＧＧＡＧＣＴＴＴＡＡＧＴＡＣＧＧＧベクターＭｅｔＰ
ｒｏＳｅｒＬｙｓＰｈｅＭｅｔＰｒ。
ｋ ｂ ｐ ）を含む２縛の溶液に、実施例（ｂ）で得
られたＤＮＡ断片（約２−Ｏｋｂｐ）を含む５バの溶液
を加え、さらに１バの１０＠濃度のリガーゼバッファー
および１縛の１０ｍＭＡＴＰを加えて１０４の溶液とし
、これに６単位のＴ ａ Ｄ Ｎ Ａリガーゼを加え、
１４℃で１６時間、結合反応を行った。該反応溶液を用
いて常法により、大腸菌ＭＶ１１８４株を形質転換し、
ＡＰＲのコロニーを得、このコロニーより１ラスミドＤ
ＮＡを回収した８回収したプラスミドＤＮＡ （ｐｓＴ
５Ｌｏ）に目的とする約２．０ｋｂｐのＤＮＡがＳＴＡ
１プロモーターに対して順方向に挿入されていること
をＬＬｍＨ工（日本ジーン）で切断してアガロースゲル
電気泳動にて！認した。ＰＳＴＳＬＯ中のヒト５−リポ
キシゲナーゼをコードするＤＮＡの５′側末端付近の配
列は、 ５ ’−ＡＣＧＣＡＣＡＣＴＡＴＧＣＣＣＴＣＧＡＡＡ
ＴＴＣＡＴＧＣＣＣ−３’ＴＧＣＧＴＧＴＧＡＴＡＣＧ
ＧＧＡＧＣＴＴＴＡＡＧＴＡＣＧＧＧベクターＭｅｔＰ
ｒｏＳｅｒＬｙｓＰｈｅＭｅｔＰｒ。
であることを配列５ ’−ＡＴＧＴＡＧＴＣＧＴＣＡＧ
丁ＧＣＣ−３°の１７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合
成し、これを１ライマーとしてダイデオキシシーケンス
法で決定した。また同様に、３′側末端付近の配列は、
５ ’ −ＧＣＣＡＴＣＴＧＡＧＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡ
ＧＴＣＴＣＡＣＴＧＴＧＧＧＡＡＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴ
ＡＧＡＣＴＣＧＴＧＴＧＡＣＧＧＴＣＡＧＡＧＴＧＡＣ
ＡＣＣＣＴＴＣＣＧＧＣＣＡＩａｌｌｅ本＊本 ＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧ
ＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＧＧＧ−３’ＣＣＴＡＧＧＡＧＡ
ＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＧＴＣＣＧＴＡＣＧＴＴＣＧ
Ａ声エベクタ・− であることを配列５ ’−ＣＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＴＣ
ＡＧＣＧ−３°の１７ｍｅｒのオリゴヌクレオナトを合
成し、これを１ライマーとして決定した。その結果、ｐ
ＳＴ５ＬＯはヒト５−リポキシゲナーゼをコードするＤ
ＮＡを含むことがわかった。
丁ＧＣＣ−３°の１７ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合
成し、これを１ライマーとしてダイデオキシシーケンス
法で決定した。また同様に、３′側末端付近の配列は、
５ ’ −ＧＣＣＡＴＣＴＧＡＧＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡ
ＧＴＣＴＣＡＣＴＧＴＧＧＧＡＡＧＧＣＣＧＧＣＧＧＴ
ＡＧＡＣＴＣＧＴＧＴＧＡＣＧＧＴＣＡＧＡＧＴＧＡＣ
ＡＣＣＣＴＴＣＣＧＧＣＣＡＩａｌｌｅ本＊本 ＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧ
ＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＧＧＧ−３’ＣＣＴＡＧＧＡＧＡ
ＴＣＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＧＴＣＣＧＴＡＣＧＴＴＣＧ
Ａ声エベクタ・− であることを配列５ ’−ＣＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＴＣ
ＡＧＣＧ−３°の１７ｍｅｒのオリゴヌクレオナトを合
成し、これを１ライマーとして決定した。その結果、ｐ
ＳＴ５ＬＯはヒト５−リポキシゲナーゼをコードするＤ
ＮＡを含むことがわかった。
（５）へ
大腸菌ＭＶ１１８４株に導入し、クローン化されたｐｓ
Ｔ５Ｌｏを酵母Ｓ、 ｃ ｔ−ｅｖｉｓｉ、ＬＡ
ＹＩＹ３４５［址工二二、ＬＬユ２−３、Ｉｅｕ２−１
１２．１上１４．１工１３コに公知の方法［例えば、Ｈ
ｉｎｎｅｎ、Ａら、プ。シーディング、オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、米国、第７５
巻、１９２９頁（１９７８＞１で導入することにより、
ヒト５−リポキシゲナーゼをコードするＤＮＡを保有す
る形質転換体を得た。得られた上記形質転換体は、グル
コース、ガラクトースなどの炭素源、アミノ酸を含まな
い窒素源と菌株の要求性のアミノ酸（但しロイシンを除
く）、塩基を添加した培地で２８℃で培養することによ
り、プラスミドを安定保持させることができる０例えば
ＳＤ合成培地［２％デキストロース、 ０．６７％Ｂａ
ｃｔｏ−ｙｅａ ｓ ｔ ｎ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ
ｅ ｒｉ ｂ ａ ｓ ｅ Ｗ ／ Ｏａｍｉｎｏ
ａｃｉｄｓ （Ｄｉｆｃｏ社）］にヒスチジンおよ
びウラシルをそれぞれ２０ ）ｔ１７． ／ ＋ａ９の
割合で添加した培地を用いるとよいや プラスミドｐｓＴ５Ｌｏを含む酵母菌はムｃｈａｒｏｍ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＪＴＳ８７８−Ｌ
３（ＦＥＲＭ Ｐ−１０４４３）として昭和６３年１
２月９日付けで工業技術院微生物工業技術研究所（微工
研）に寄託されている。
Ｔ５Ｌｏを酵母Ｓ、 ｃ ｔ−ｅｖｉｓｉ、ＬＡ
ＹＩＹ３４５［址工二二、ＬＬユ２−３、Ｉｅｕ２−１
１２．１上１４．１工１３コに公知の方法［例えば、Ｈ
ｉｎｎｅｎ、Ａら、プ。シーディング、オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、米国、第７５
巻、１９２９頁（１９７８＞１で導入することにより、
ヒト５−リポキシゲナーゼをコードするＤＮＡを保有す
る形質転換体を得た。得られた上記形質転換体は、グル
コース、ガラクトースなどの炭素源、アミノ酸を含まな
い窒素源と菌株の要求性のアミノ酸（但しロイシンを除
く）、塩基を添加した培地で２８℃で培養することによ
り、プラスミドを安定保持させることができる０例えば
ＳＤ合成培地［２％デキストロース、 ０．６７％Ｂａ
ｃｔｏ−ｙｅａ ｓ ｔ ｎ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ
ｅ ｒｉ ｂ ａ ｓ ｅ Ｗ ／ Ｏａｍｉｎｏ
ａｃｉｄｓ （Ｄｉｆｃｏ社）］にヒスチジンおよ
びウラシルをそれぞれ２０ ）ｔ１７． ／ ＋ａ９の
割合で添加した培地を用いるとよいや プラスミドｐｓＴ５Ｌｏを含む酵母菌はムｃｈａｒｏｍ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＪＴＳ８７８−Ｌ
３（ＦＥＲＭ Ｐ−１０４４３）として昭和６３年１
２月９日付けで工業技術院微生物工業技術研究所（微工
研）に寄託されている。
実施例（５）で得な形質転換体酵母Ｓ、ｃｅ。
“ ° ＪＴＳ８７Ｂ−Ｌ３を２０ル／ａ９のヒス
チジンおよびウラシルを含むＳＤ培地１０−に接種し、
２８℃で２０時間培養した。この１０−の培養液をＹＰ
ＧＰＧＥ１％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社）、２％トリプ
トン（Ｄｉｆｃ。
チジンおよびウラシルを含むＳＤ培地１０−に接種し、
２８℃で２０時間培養した。この１０−の培養液をＹＰ
ＧＰＧＥ１％酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社）、２％トリプ
トン（Ｄｉｆｃ。
社）、３％グリセロール（和光純薬工業）コ５００ｍ１
に加え、２８℃で約３日量系どう培養した。
に加え、２８℃で約３日量系どう培養した。
培養液の濁度が０Ｄａｅ＠＝約４になったとき、培養液
を遠心分離して集菌した。培養液５００−がら得られた
約５ｇの菌体を０．１ＭＮａＣＲ１２ｍＭＥＤＴＡ、３
＋ｎｇ大豆大豆トリプシンインヒビタ−１フ ン酸バッファー（ｐＨ７．０＞２０艷に懸濁させた．こ
れに約２ ０ ｇのグラスビーズ（直径０．５ｒｎ ｍ
）を加え、ポルテックスミキサーで激しく撹拌するこ
とにより細胞を破砕した．この破砕液を４℃で１ ２０
００ｘｇで１０分間遠心分離して上清を得た．この上清
をｖＡ酸アンモニウムで塩析した．硫酸アンモニウム濃
度が３０％−６０％の範囲で塩析される蛋白質画分を２
０％グリセロール、２ｍＭＥＤＴＡ、２ ｍ Ｍジチオ
スレイトールを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ９ （ｐＨ
８．０＞中で透析した．この蛋白質画分をＬａｅｍｍ
１ ｉのサンプルバッファーに懸濁後、５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行い，クマシーブリリアン
トブルーで染色してヒト５−リポキシゲナーゼの分子量
に相当する約８０にダルトンの位置にポリベグナトバン
ドを検出した．このバンドはｐＳＴ５ＬＯからヒト５−
リポキシゲナーゼの遺伝子のみを除いたベクタープラス
ミドを含む酵母を用いた場合には存在しなかった．した
がって、ｐＳＴ５ＬＯを保有する酵母は、ヒト５−リポ
キシゲナーゼを大量に生産していることが明かとなった
。
を遠心分離して集菌した。培養液５００−がら得られた
約５ｇの菌体を０．１ＭＮａＣＲ１２ｍＭＥＤＴＡ、３
＋ｎｇ大豆大豆トリプシンインヒビタ−１フ ン酸バッファー（ｐＨ７．０＞２０艷に懸濁させた．こ
れに約２ ０ ｇのグラスビーズ（直径０．５ｒｎ ｍ
）を加え、ポルテックスミキサーで激しく撹拌するこ
とにより細胞を破砕した．この破砕液を４℃で１ ２０
００ｘｇで１０分間遠心分離して上清を得た．この上清
をｖＡ酸アンモニウムで塩析した．硫酸アンモニウム濃
度が３０％−６０％の範囲で塩析される蛋白質画分を２
０％グリセロール、２ｍＭＥＤＴＡ、２ ｍ Ｍジチオ
スレイトールを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ９ （ｐＨ
８．０＞中で透析した．この蛋白質画分をＬａｅｍｍ
１ ｉのサンプルバッファーに懸濁後、５ＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を行い，クマシーブリリアン
トブルーで染色してヒト５−リポキシゲナーゼの分子量
に相当する約８０にダルトンの位置にポリベグナトバン
ドを検出した．このバンドはｐＳＴ５ＬＯからヒト５−
リポキシゲナーゼの遺伝子のみを除いたベクタープラス
ミドを含む酵母を用いた場合には存在しなかった．した
がって、ｐＳＴ５ＬＯを保有する酵母は、ヒト５−リポ
キシゲナーゼを大量に生産していることが明かとなった
。
一す
あらかじめ卵黄のホスファチジルコリン（１００ＩＩＩ
ｇ／Ｌｎｇヘキサン、シグマ社製）５縛にｌ ｍ ＭＥ
ＤＴＡを含むＯ． １ＭＴｒ ｉ ５−ＨＣ Ｑ （
ｐＨ８、０）３５０縛および５ ｍＱのジエチルエーテ
ルを加え、窒素ガス気流下でジエチルエーテルを揮散さ
せながら超音波処理により均一なホスファチジルコリン
の懸濁液を調製した０次にアラキドン酸を塩化第２銅の
存在下で過酸化水素と反応させヒドロペルオキシエイコ
サテトラエン酸を調製した［詳細な実験条件は、プロシ
ーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス、米国、第８２巻、６０４０頁（１９８５
）を参照］．エッペンドルフチューブに１０ｍＭＣａＣ
Ｑ ２および１０ｍＭＡＴＰを含む０．５λｒＩＴｒ
ｉｓ−ＨＣ２ （ｐＨ８．０＞２０４を入れ、さらに上
記で得たホスファチジルコリン懸濁液１０縛および実施
例（・６）で得たヒト５−リポキシゲナーゼ画分７０縛
（蛋白質量として２ ３ ０ｇ）を加えて１００縛とし
、３０℃で５分間プレインキュベー ！−した。 これ
に１０ｍＭの合成ヒドロペルオキシエイコサテトラエン
酸を含む４ ｍ Ｍアラキドン酸２縛を加えて反応を開
始し、３０℃で１０分間インキュベートした。これに−
２０℃であらがしめ冷やしておいた３００１のメタノー
ル（内部標準物質として２μｇ、／ ｄの１３−ヒドロ
キシリルシン敢を含む）を加え、さらにＩＮ酢酸１縛を
加えて激しく撹拌したのちに８０００Ｘ ｇで１ｏ分間
遠心分社した。 上清４００ｄのうち１ｏｏｎをＨＰ
ＬＣで分析し、生成した５−ヒドロキシエイコサテトラ
エン酸を測定した。ＨＰＬＣの条件を以下に示す。
ｇ／Ｌｎｇヘキサン、シグマ社製）５縛にｌ ｍ ＭＥ
ＤＴＡを含むＯ． １ＭＴｒ ｉ ５−ＨＣ Ｑ （
ｐＨ８、０）３５０縛および５ ｍＱのジエチルエーテ
ルを加え、窒素ガス気流下でジエチルエーテルを揮散さ
せながら超音波処理により均一なホスファチジルコリン
の懸濁液を調製した０次にアラキドン酸を塩化第２銅の
存在下で過酸化水素と反応させヒドロペルオキシエイコ
サテトラエン酸を調製した［詳細な実験条件は、プロシ
ーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ
・サイエンス、米国、第８２巻、６０４０頁（１９８５
）を参照］．エッペンドルフチューブに１０ｍＭＣａＣ
Ｑ ２および１０ｍＭＡＴＰを含む０．５λｒＩＴｒ
ｉｓ−ＨＣ２ （ｐＨ８．０＞２０４を入れ、さらに上
記で得たホスファチジルコリン懸濁液１０縛および実施
例（・６）で得たヒト５−リポキシゲナーゼ画分７０縛
（蛋白質量として２ ３ ０ｇ）を加えて１００縛とし
、３０℃で５分間プレインキュベー ！−した。 これ
に１０ｍＭの合成ヒドロペルオキシエイコサテトラエン
酸を含む４ ｍ Ｍアラキドン酸２縛を加えて反応を開
始し、３０℃で１０分間インキュベートした。これに−
２０℃であらがしめ冷やしておいた３００１のメタノー
ル（内部標準物質として２μｇ、／ ｄの１３−ヒドロ
キシリルシン敢を含む）を加え、さらにＩＮ酢酸１縛を
加えて激しく撹拌したのちに８０００Ｘ ｇで１ｏ分間
遠心分社した。 上清４００ｄのうち１ｏｏｎをＨＰ
ＬＣで分析し、生成した５−ヒドロキシエイコサテトラ
エン酸を測定した。ＨＰＬＣの条件を以下に示す。
カラムニ ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ Ｃｌ８ＳＧ１２０
（資生堂社製） （４，６ｍｍｘ１５０ｍｍ） 溶媒 ：メタノール、／水／酢酸＝ ７５ ／ ２５７
０、 ＯＬ （ｖ／ｖ） 検出 ： ２３３ｎｍにおける吸光度流速 ： １
． ０ｔｄＺ薗 温度 ： ３８℃ 測定結果を第６図および第７図に示した。第７図に示し
たようにｐＨ５ＴうＬＯを含む酵母、すなわちヒト５−
リポキシゲナーゼ遺伝子が導入された酵母が生産する蛋
白質は５−リポキシゲナーゼ活性を示した。第６図に示
したようにベクター１ラスミドのみを含む酵母が生産す
る蛋白質はう一リポキシゲナーゼ活性を示さなかった。
（資生堂社製） （４，６ｍｍｘ１５０ｍｍ） 溶媒 ：メタノール、／水／酢酸＝ ７５ ／ ２５７
０、 ＯＬ （ｖ／ｖ） 検出 ： ２３３ｎｍにおける吸光度流速 ： １
． ０ｔｄＺ薗 温度 ： ３８℃ 測定結果を第６図および第７図に示した。第７図に示し
たようにｐＨ５ＴうＬＯを含む酵母、すなわちヒト５−
リポキシゲナーゼ遺伝子が導入された酵母が生産する蛋
白質は５−リポキシゲナーゼ活性を示した。第６図に示
したようにベクター１ラスミドのみを含む酵母が生産す
る蛋白質はう一リポキシゲナーゼ活性を示さなかった。
［発明の効果］
本発明によれば、酵素活性を有するヒト５−リポキシゲ
ナーゼを、微生物を用いて大量に生産することができる
。
ナーゼを、微生物を用いて大量に生産することができる
。
第１図は異種蛋白質遺伝子の発現用ベクターｐＭＮ１９
１の構築の過程を示す図である。 第２図は本発明で用いたヒト５−リポキシゲナーゼの塩
基配列およびアミノ酸配列を示す図である。 第３図はヒト５−リポキシゲナーゼの５°翻訳開始部位
ＡＴＧの直前にＬ立ｏＲＩを付加したヒト５−リポキシ
ゲナーゼをコードしているＤＮＡセグメントを得る方法
を示す工程図である。 第４図はヒト５−リポキシゲナーゼの３′非翻訳領域の
一部を削除したヒト５−リポキシゲナーゼをコードして
いるＤＮＡセグメントを得る方法を示す工程図である。 第５図は発現ベクターｐＳＴうＬＯの作成法を示す工程
図である。 第６図および第７図はｐｓＴ５Ｌｏを含む酵母が生産す
るヒト５−リポキシゲナーゼの活性のデータを示すもの
である。 第６図： コントロール（ベクタープラスミド）第７図
＋ ｐｓＴ５Ｌ。 易１回 特許出願人 日本たばこ産業株式会社ｍｑ１０ ５ａ
ｌ工 −３４−Ｉ ＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣ丁ＣＧＣτＧＣＴＣＣＣＧＣＧ
ＧＣＣＣＧＣＧＣＣ０６Ｇ ＡＴＧＣＣＣτＣＣＴＡＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧ
ＣＣＡＣＴ ＧＧＣＡＧＣＣＡＧ丁ＧＧＴ丁ＣＧＣＣ
ＧＧＣＡＣＴＧＡＣＧＡＣＰｒｏＳｅｒＴｙｒＴｈｒＶ
ａｌＴｈｒＶａｌＡｌａＴｈｒ ＧＩｙＳｃｒＧＩｎ
丁ｒｐＰｈｅＡｌａＧｌｙＴｈｒＡｓｐＡｓｐＴＡＣＡ
ＴＣ丁ＡＣＣ丁ＣＡＧＣＣＴＣＧ丁ＧＧＧＣ丁ＣＧＧＣ
Ｇ ＧＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＣτＧＣ
ＴＧＧＡＣ＾＾ＧＴｙｒｌｌｅＴｙｒＬｅｕＳｅｒＬｅ
ｕＶａｌＧｌｙＳｅｒＡＩａ ＧＩｙＣｙｓＳｅｒＧＩ
ｕＬｙｓＨｉｓＬｅｕＬｅｕＡｓｐＬｙｓＣＣＣＴＴＣ
丁ＡＣＡＡＣＧＡＣＴ丁ＣＧＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧ
ＧＴＧＧＡ丁ＴＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＧＡＣＴＧＴＧ
ＧＡＣＧＡＧＰｒｏＰｈｅ丁ｙｒＡｓｎＡｓｐＰｈｅＧ
ｌｕＡｒｇＧ１ｙＡｌａ ＶａｌＡｓｐＳｅｒＴｙｒ
ＡｓｐＶａｌτｈｒＶａｌＡｓｐＧｌｕＧＡＡＣＴＧＧ
ＧＣＧＡＧＡ丁ＣＣＡＧＣＴＧＧＴＣＡＧＡＡ丁ＣＧＡ
ＧＡＡＧＣＧＣＡＡＧ丁ＡＣＴＧＧＣ丁ＧＡＡ丁ＧＡＣ
ＧＡＣＧｌｕＬｅｕＧｌｙＧＩｕｌｌｅＧＩｎＬｅｕＶ
ａｌＡｒｇｌｌｅ ＧｌｕＬｙｓ八ｒｇＬｙへＴｙｒ
ＴｒｐＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｓｐ２７０
コ
ロ０ＴＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＧＴＡＣＡ丁ＣＡＣＧＣＴ
ＧＡＡＧＡＣＧ ＣＣＣＣＡＣＧＧＧＧＡＣ丁ＡＣＡ
丁ＣＧＡＧＴＴＣＣＣＣ丁ＧＣＴｒｐＴｙｒＬｅｕＬｙ
ｓ丁ｙｒｌｌｅＴｈｒＬｅｕＬｙｓＴｈｒ ＰｒｏＨ
４ｇＧｌｙＡｓｐ丁ｙｒｌｌｅＧＩｕＰｈｅＰｒｏＣｙ
ｓコ３０
コロ０ＴＡＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣ
ＡＣＣＧＧＣＧ＾丁ＧＴＣＧＡＧＧＴＴ Ｇ丁ＣＣＴ
ＧＡＧＧＧＡ丁ＧＧＡＣＧＣＧＣＡへへＧＴＴＧＧＣＣ
ＴｙｒＡｒｇＴｒｐＨｅ丁ｈｒＧｌｙＡｓｐＶａｌＧＩ
ｕＶａｌ ＶａｌＬｅｕＡｒｇＡｇｐＧｌｙＡｒｇＡ
ＩａＬｙｓＬｅｕ＾１ａＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＡＴ
ＴＣＡＣＡ丁丁ＣＴＣＡＡＧＣＡＡ ＣＡＣＣＧＡＣ
丁６＾ＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＡＣＡＣＧＧＣＡＡＡｒ
ｇＡｓｐ＾５ｐＧｌｎｌｌｅＨｉｓｌｌｅＬｅｕＬｙｓ
ＧＩｎ ＨｉｓＡｒｇ＾ｒｇＬｙｓＧｌｕＬｅｕＧ］ｕ
ＴｈｒＡｒｇＧｌｎ＾＾ＡＣＡＡＴＡＴＣＧＡＴＧＧＡ
ＴＧＧＡＧ丁ＧＧＡＡＣＣＣ丁 ＧＧＣＴＴＣＣＣＣ丁
ＴＧＡＧＣ＾丁（：ＧＡＴＧＣＣＡＡＡＴＧＣしｙｓＧ
ｌｎＴｙｒＡｒｇＴｒｐＭｅｔＧｌｕＴｒｐＡｓｎＰｒ
ｏ ＧｌｙＰｈｅＰｒｏＬｅｕＳｅｒｌｌｅＡｓｐ＾
ＩａＬｙｓＣｙｓＣＡＣＡＡＧＧＡＴＴ丁ΔＣＣＣＣＧ
ＴＧ＾丁ＡＴＣＣＡＧＴＴ丁 ＧＡＴＡＧＴＧＡＡＡ八
八ＧＧＡＧＴＧＧへへＴＴＴＧＴＴＣＴＧＨｉｓＬｙｓ
ＡｓｐＬｅｕＰｒｏ＾ｒｇＡｓｐＨｅＧＩｎＰｈｅ Ａ
ｓｐＳｅｒＧｌｕＬｙｓＧｌｙＶａｌＡｓｐＰｈｅＶａ
ｌＬｅｕＡＡＴＴＡＣ丁ＣＣＡＡＡＧＣＧＡＴＧＧＡＧ
ＡＡＣ（：ＴＧＴＴＣＡＴＣＡＡＣＣＧＣＴＴＣΔ丁Ｇ
ＣＡＣＡ丁ＧＴＴＣＣＡＧＴＣＴＡｓｎＴｙｒＳｅｒＬ
ｙｓＡＩａＭｅｔＧＩｕＡｓｎＬｅｕＰｈｅ ｌ１ｅＡ
ｓｎ＾ｒｇＰｈｅＭｃｔＨｉｓＭｅｔＰｈｅＧＩｎＳｅ
ｒＴＣＴＴＧＧＡＡＴＧＡＣＴ丁ＣＧＣｆ：ＧＡＣＴＴ
ＴＧＡＧＡＡＡ ＡＴＣ丁ＴＴ（、ＴＣ＾八ＧへＴＣ
ＡＧＣＡＡＣＡＣＴＡＴＴＴＣＴＳｅｒ丁ｒｐＡｓｎＡ
ｓｐＰｈｅＡＩａＡｓｐＰｈｅＧ１ｕＬｙｓ ＩＩｅ
ＰｈｅＶａｌＬｙｓｌｌｅＳｅｒＡｇｎＴｈｒｌｌｅＳ
ｅｒＧＡＧＣＧＧＧＴＣ＾丁ＧＡＡＴＣＡＣ丁ＧＧＣ八
ＧＧＡＡＧＡＣＣ丁ＧＡＴＧＴＴＴＧＧＣＴＡｆ：ＣＡ
Ｇ丁丁ＣＣＴＧＡＡ丁ＧＣＣＧ１ｕＡｒｇＶａｌｌ＋１
ａｔＡｓｎＨ４ｓＴｒｐＧ１ｎＧｌｕＡｓｐ ＬｅｕＭ
ｅｔＰｈｅＧＩｙＴｙｒＧＩｎＰｈｅＬｅｕＡｓｎＧｌ
ｙＴＧＣＡＡＣ（：ＣＴＧＴＧＴＴＧＡ丁ＣＣＧＧＣＧ
Ｃ：ＴＧＣＡＣＡ ＧΔＧＣＴＧＣＣＣＧＡＧＡＡＧ
Ｃ丁ＣＣＣＧＧＴＧＡＣＣＡＣＧＣｙｓＡｓｎＰｒｏＶ
ａｌＬｅｕｌｌｅＡｒｇＡｒｇＣｙＳ丁ｈｒ Ｇｌｕ
ＬｅｕＰｒｏＧｌｕＬｙｓＬｅｕＰｒｏＶａｌＴｈｒＴ
ｈｒＧＡＧＡ丁ＧＧＴＡＧＡＧ丁ＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡ
ＧＣＧＧＣＡＧ Ｃ丁ＣＡＧＣ丁丁ＧＧＡＧＣＡＧＧ
ＡＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧｌｕＭｅｔＶａｌＧｌ
ｕＣｙｓＳｅｒＬｅｕＧＩｕＡｒｇＧｌｎ ＬｅｕＳｅ
ｒＬｅｕＧｌｕＧｌｎＧＩｕＶａｌＧｌｎＧｌｎＧｌｙ
＾ＡＣＡτ丁τＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣ丁丁ＴＧＡＧＣ
ＴＧＣ丁Ｇ ＧＡＴＧＧＣＡＴＣＧＡ丁ＧＣＣＡＡＣ
ＡＡＡＡＣＡＧＡＣＣＣＣＡｓｎｌｌａＰｈｅｌｌｅＶ
ａｌＡｓｐＰｈｅＧｌｕＬｅｕＬｅｕ ＡｓｐＧｌｙ
ｌｌｅＡｓｐＡＩａＡｓｎＬｙｓ丁ｈｒＡｓｐＰｒ。 ＴＧＣＡＣＡＣＴＣ（：ＡＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＧＣＴ
ＣＣＣＡＴＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＴ八丁ＡＡＧＡＡＣＣ
へＧＧＣＣＡＡＣＡＡＧＣｙｓＴｈｒＬｅｕＧＩｎＰｈ
ｅＬｃｕＡｌａＡｌａＰｒｏｌｌｅＣｙｓＬｅｕＬｅｕ
ＴｙｒＬｙｓＡｓｎＬｅｕＡｌａＡｓｎＬｙｓ９９０
＋０２０Ａ丁
丁Ｇ丁ＣＣＣＣＡＴＴＧ＋：Ｃ＾丁ＣＣＡＧＣ丁ＣＡＡ
ＣＣＡＡ ＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＧＡＧ八ＡＣＣ
ＣＴ八丁ＴＴＴＣＣＴへ＋１ｅＶｉへＰｒｏｌｌｅＡｌ
ａｌｌｅＧｌｎＬｅｕＡｓｎＧｌｎ Ｉ］ｅＰｒｏＧＩ
ｙＡｓｐＧｌｕＡｓｎＰｒｏｌｌｅＰｈｅＬｅｕＣＣＴ
ＴＣＧＧＡ丁ＧＣＡＡＡＡＴＡｆ：ＧＡＣＴＧＧＣＴＴ
ＴＴＧ ＧＣＣＡＡＡＡＴＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＴＣ
ＣＡＧＴＧＡＣＴＴＣＰｒｏＳｅｒＡｓｐ＾ＩａＬｙｓ
ＴｙｒＡｓｐＴｒｐＬｅｕＬｃｕ ＡｌａＬｙｓｌｌｅ
ＴｒｐＶａｌＡｒｇＳｅｒＳｅｒＡｓｐＰｈｅｌｌｌｏ
１１４０
ＣＡＣＧＴＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡ丁ＧＡＣＣＣＡＣＣ
丁ＴＣＴＧ ＣＧＡＡＣＡＣＡ丁Ｃ丁ＧＧＴＧＴＣＴ
ＧＡＧＧ丁Ｔ丁ＴＴＧＧＣＨｉｓＶａｌＨｉｉＧＩｎＴ
ｈｒｌｌｅτｈｒ）ｌｉｓＬｅｕＬｃｕ ＡｒｇＴｈｒ
ＨｉｓＬｅｕＶａｌＳｅｒＧｌｕＶａｌＰｈｅＧｉｙＡ
ＴＴＧＣＡＡＴＧ丁ＡＣＣＧＣＣＡＧＣＴＧＣにＴＧＣ
ＴＧＴＧ ＣＡＣＣＣＣＡＴ丁丁ＴＣＡＡＧＣ丁Ｌ；
ＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＣ１１ｃＡ１ａＭｅｔＴｙｒＡ
ｒ７ＧＩｎＬｅｕＰｒｏＡＩａＶａｌ ＨｉｓＰｒｏＴ
ＩｅＰｈｃＬｙｓＬｅｕＬｅｕＶａｌＡｌａＨｉｓＧＴ
ＧＡＧＡＴ丁ＣＡＣＣＡＴＴＧＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＣ
ＡＡＧ ＧＣＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ丁ＣＡＴＣＴＧ
ＣＧＡＧＴＧＴＧＧＣＶａｌＡｒｇＰｈｅＴｈｒ１１ｅ
ＡＩａｌＩｅＡｓｎ丁ｈｒＬｙｓ ＾ｌａＡｒｇＧＩ
ｕＧＩｎＬｅｕｌｌｅＣｙｓＧＩｕＣｙｓＧｌｙ１２９
０
１コ２０ＣＴＣτＴＴＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡ
ＣＧＣＣＡＣＡＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＣＡＣＧ丁Ｇ
ＣＡＧ＾丁ＧＧＴＧＣＡＧ＾ＧＧＧＣＣＬｅｕＰｈｅＡ
ｓｐＬｙｓＡｌａＡｓｎＡｌａＴｈｒＧｌｙＧｉｙ Ｇ
ｌｙＧｌｙｌ且ｓＶａｌＧｌｎＭｅｔＶａｌＧｌｒ＋Ａ
ｒｇＡｌａ１３５０
１コ８０Ａ丁ＧＡＡＧＧＡＣ
ＣＴＧＡＣＣＴＡＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＴＧＣＴ丁ＴＣ
ＣＣＧＡＧＧＣＣＡ丁ＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＧＧＣ＾丁
ＣＭｅｔＬｙｓＡｓｐＬｅｕＴｈｒＴｙｒＡＩａＳｅｒ
ＬｅｕＣｙｓ ＰｈｅＰｒｏＧＩｕＡｌａｌｌｅＬｙ
ｓＡＩａＡｒｇＧＩｙＭｅｔＧＡＧＡＧＣＡＡＡＧ＾八
ＧＡＣＡＴＣＣＣＣ丁ＡＣ丁ＡＣＴＴＣＴＡＣＣＧＧＧ
ＡＣＧＡＣＩＩ；ＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＡ
ＧｌｕＳｅｒＬｙｓＧ！ｕＡｓｐＨｅＰｒｏＴｙｒ丁ｙ
ｒＰｈｅ ＴｙｒＡｒｇＡｓｐＡｓｐＧｌｙＬｅｕＬ
ｅｕＶａ１丁ｒｐＧｌｕＧＣＣＡＴＣＡＧＧＡＣＧＴＴ
ＣＡＣＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＧＴＡ ＧＡＣＡ丁ＣＴ
ＡＣＴＡＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＣＡＧＧ丁ＧＧＴＧＡｌ
ａｌｋｅＡｒｇ丁ｈｒＰｈｅＴｈｒＡｌａＧｌｕＶａｌ
Ｖａｌ ＡｓｐＨｅＴｙｒＴｙｒＧｌｕＧｌｙＡｓｐ
ＧｌｎＶａｌＶａ１ＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＧＧＡＧＣ
ＴＧＣＡＧＧＡＣＴＴＣＧＴＧ ＡＡＣＧＡＴＧＴＣ
ＴＡＣＧ丁ＧＴＡＣＧＧＣＡＴＧＣＧＧＧＧＣＧＩｕＧ
ｌｕＡｓｐＰｒｏＧＩｕＬｅｕＧｌｎＡｓｐＰｈｅＶａ
ｌ ＡｓｎＡｓｐＶａｌＴｙｒＶａｌＴｙｒＧｌｙＭｅ
ｔＡｒｇＧｌｙＣＧＩ：ＡＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＴ
ＣＣＣＣＡＡＧＴＣＧＧＴＣＡＡＧＡＧＣＣＧＧＧＡＧ
ＣＡＧ（：ＴＧＴＣＧＧＡＧＴＡＣＣＴＧＡｒｇＬｙｓ
ＳｅｒＳｅｒＧｌｙＰｈｅＰｒｏＬｙｓＳｅｒＶａｌ
ＬｙｓＳｅｒ＾ｒｇＧＩｕＧｌｎＬｅｕＳｅｒＧｌｕＴ
ｙｒＬｅｕＡＣＣＧ丁ＧＧＴＧＡＴＣ丁丁ＣＡＣＣＧＣ
Ｃ丁ＣＣＧＣＣＣＡＧ ＣＡＣＧＣＣＧＣＧＧＴＣＡ
Ａ、ＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＴＡＣＧＡＣＴｈｒＶａｌＶ
ａｌｌｌｅＰｈｅ丁ｈｒＡｌｉＳｅｒ＾１ａＧｌｎ
）ＩｉｓＡｌａＡｌａＶａｌＡｓｎＰｈｅＧＩｙＧＩｎ
ＴｙｒＡｓｐτＧＧＴＧＣ丁ＣＣＴＧＧＡＴＣＣＣＣＡ
ＡＴＧＣＧＣＣＣＣＣＡ ＡＣＣＡＴＧＣＧＡＧＣＣ
ＣＣＧＣＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣＣＡ八Ｃ丁ｒｐ（ｙｓｓ
ｅｒ丁ｒｐＩＩｅＰｒｏＡｓｎ＾ＩａＰへｏＰｒｏ
丁ｈｒＭｅｔ＾ｒｇＡＩａＰｒｏＰｒｏＰｒｏＴｈｒＡ
ｌａＬｙｓＧＧＣＧＴＧＧ丁ＧＡＣＣＡＴ丁ＧＡＧＣＡ
ＧΔτＣＣ丁ＧＧＡＣ、〜ＣＧＣ丁ＧＣＣ（：ＧＡＣＣ
ＧＣＧＧＣＣＧＣ丁ＣＣ丁ＧＣＴＧＧＧｌｙＶａ＋、Ｖ
ａｌＴｂｒｌｌｅＧｌｕＧｉｎｌｌｅＶａｌＡｓｐ
ＴｈｒＬｅｕＰｒｏ八ｓｐｈｒｇＧＩへＡｒｇＳｅｒＣ
ｙｓ丁ｒｐ１１！３０
１８６０ＣΔ丁ＣＴＧＧＧ丁ＧＣＡＧＴＧ丁ＧむＧ
ＣＧＣ丁ＧＡＧＣＣＡＧ ＴＴＣＣＡＧＧＡＡΔ八Ｃ
ＧＡＧＣＴＧＴへＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＨ４ｓＬｅｕＧ
ｌｙＡｌａＶａ１丁ｒｐＡｌａＬｅｕｓｅｒＧＩｎ
ＰｈｅＧＩｎＧｌｕＡｓｎＧｌｕＬａｕＰｈｅＬｅｕＧ
ｌｙｋｌｅｔＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣ八丁ＴττＡ
ＴＣＧＡＧＡＡＧＣＣＴ ＧＴＧＡＡＧＧΔＡＧＣＣ
ＡＴＧＧＣＣＣＧＡＴＴＣＣＧＣＡＡＧ丁ｙｒＰｒｏＧ
ｌｕＧＩｕＨｉｓＰｈｅｌｌｅＧｌｕＬｙｓＰｒｏ
ＶａｌＬｙｓＧｌｕΔｌａＭｅｔＡｌａＡｒｇＰｈｅＡ
ｒｇＬｙｓ１９５０
１９８ＣＩＡ〕１ＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＴＣ
ＡＧＣＧＴＧＡ丁ＴＧＣＴ ＧＡＧＣＧＩ：ＡＡＣ八
八へへＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣＡＴＡＴＡｓｎＬｅ
ｕＧｌｕ＾１ａｌｌｅＶａｌＳｅｒＶａｌＩｌｅＡｌａ
ＧＩｕＡｒｇＡｓｎＬｙｓＬｙｓＬｙｓＧＩｎＬｅ
ｕＰｒｏＴｙｒＴＡＣＴＡＣττＧＴＣＣＣＣＡＧＡＣ
ＣＧＧＡ丁ＴＣＣＧＡＡＣＡＧＴＧＴＧＧＣＣＡＴＣ丁
ＧＡＧＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＧＴＣＴＴｙｒＴｙｒＬｅ
ｕＳｅｒＰｒｏ八ｓｐＡｒｇｌｌｅＰｒへ八ｓｎ ５
ｃｒＶａｌへｌａｌｌｅ−−−ＣＡＣＴＧ丁ＧＧＧＡＡ
ＧＧＣＣＡＧｆ；丁ＧＣＣｆ：ＣＡＧＣＣＡＧ ＡＴ
ＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＧＧＴＧＴ
ＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣＡＣＡ
ＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＧ八ＧＧへＣＡＧＴＡＣＣＴＴ
ＴＣＣＡＴＴＴＡＴＴＣＴＴＪ１９０
２２２０ＴＧＡ丁ＣＴ丁ＣＡＧＧＧＡＡ
ＣＴＧＣＡＴＡＧ＾丁丁ＧＡ丁ＣＡ ＡＡＧＴＧＴＡ
ＡＡＣＡＣＣＡＴ八ＧＧＧＡＣＣＣＡＴＴＣ丁ＡへＡＣ
ＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＴ（：ＣＴＣ
ＴＣＣＡ ＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＴＴＴＣ（
：ＡＣＡＣＩ：ＡＡＧＣＡＧ２コ１０
２コ４０
ＣＡＡＣＡＧＣＡＡＡ丁ＣＡＣＧＡＣＣＡＣＴＧＡ丁Ａ
ＧＡＴＧＴ Ｃ丁へＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＡＣＡ
ＴＧＧＧＡＴＧＡＴＴＡ丁２コア０
２４００ＴＴ
ＴＣ丁ＧＴＴＣＴＡＴＴＴＧＴＣＧＴＴＡＧ丁ＣＣＡＡ
Ｔ丁ＣＣＴＴＧＣＡＣＡＴＡＧＴＡＧＧＴＡＣＣＣＡＡ
丁ＴＣＡＡＴ丁Ａ２４コ０
２４５０ＣＴＡＴ
丁ＧＡＡＴＧＡＡ丁ＴＡＡＧＡＡＴＴＧＧ丁丁ＧＣＣＡ
Ｔ Ａ＾八へＡＴＡ八へ丁ＣＡＧ丁ＴＣＡ丁ＴＴ八へ
へへへＡＡＡΔ八へＡＡＡＡＡ 筈、Ｌｌ記（＼ａ３’） 膝上１つ （ての）） 謂：３０ 茅４回 ＨＬｎａ工ＺＸ Ｐ！、６回 ヱ７＋Ｒ
１の構築の過程を示す図である。 第２図は本発明で用いたヒト５−リポキシゲナーゼの塩
基配列およびアミノ酸配列を示す図である。 第３図はヒト５−リポキシゲナーゼの５°翻訳開始部位
ＡＴＧの直前にＬ立ｏＲＩを付加したヒト５−リポキシ
ゲナーゼをコードしているＤＮＡセグメントを得る方法
を示す工程図である。 第４図はヒト５−リポキシゲナーゼの３′非翻訳領域の
一部を削除したヒト５−リポキシゲナーゼをコードして
いるＤＮＡセグメントを得る方法を示す工程図である。 第５図は発現ベクターｐＳＴうＬＯの作成法を示す工程
図である。 第６図および第７図はｐｓＴ５Ｌｏを含む酵母が生産す
るヒト５−リポキシゲナーゼの活性のデータを示すもの
である。 第６図： コントロール（ベクタープラスミド）第７図
＋ ｐｓＴ５Ｌ。 易１回 特許出願人 日本たばこ産業株式会社ｍｑ１０ ５ａ
ｌ工 −３４−Ｉ ＧＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣ丁ＣＧＣτＧＣＴＣＣＣＧＣＧ
ＧＣＣＣＧＣＧＣＣ０６Ｇ ＡＴＧＣＣＣτＣＣＴＡＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧ
ＣＣＡＣＴ ＧＧＣＡＧＣＣＡＧ丁ＧＧＴ丁ＣＧＣＣ
ＧＧＣＡＣＴＧＡＣＧＡＣＰｒｏＳｅｒＴｙｒＴｈｒＶ
ａｌＴｈｒＶａｌＡｌａＴｈｒ ＧＩｙＳｃｒＧＩｎ
丁ｒｐＰｈｅＡｌａＧｌｙＴｈｒＡｓｐＡｓｐＴＡＣＡ
ＴＣ丁ＡＣＣ丁ＣＡＧＣＣＴＣＧ丁ＧＧＧＣ丁ＣＧＧＣ
Ｇ ＧＧＣＴＧＣＡＧＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＣτＧＣ
ＴＧＧＡＣ＾＾ＧＴｙｒｌｌｅＴｙｒＬｅｕＳｅｒＬｅ
ｕＶａｌＧｌｙＳｅｒＡＩａ ＧＩｙＣｙｓＳｅｒＧＩ
ｕＬｙｓＨｉｓＬｅｕＬｅｕＡｓｐＬｙｓＣＣＣＴＴＣ
丁ＡＣＡＡＣＧＡＣＴ丁ＣＧＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧ
ＧＴＧＧＡ丁ＴＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＧＡＣＴＧＴＧ
ＧＡＣＧＡＧＰｒｏＰｈｅ丁ｙｒＡｓｎＡｓｐＰｈｅＧ
ｌｕＡｒｇＧ１ｙＡｌａ ＶａｌＡｓｐＳｅｒＴｙｒ
ＡｓｐＶａｌτｈｒＶａｌＡｓｐＧｌｕＧＡＡＣＴＧＧ
ＧＣＧＡＧＡ丁ＣＣＡＧＣＴＧＧＴＣＡＧＡＡ丁ＣＧＡ
ＧＡＡＧＣＧＣＡＡＧ丁ＡＣＴＧＧＣ丁ＧＡＡ丁ＧＡＣ
ＧＡＣＧｌｕＬｅｕＧｌｙＧＩｕｌｌｅＧＩｎＬｅｕＶ
ａｌＡｒｇｌｌｅ ＧｌｕＬｙｓ八ｒｇＬｙへＴｙｒ
ＴｒｐＬｅｕＡｓｎＡｓｐＡｓｐ２７０
コ
ロ０ＴＧＧＴＡＣＣＴＧＡＡＧＴＡＣＡ丁ＣＡＣＧＣＴ
ＧＡＡＧＡＣＧ ＣＣＣＣＡＣＧＧＧＧＡＣ丁ＡＣＡ
丁ＣＧＡＧＴＴＣＣＣＣ丁ＧＣＴｒｐＴｙｒＬｅｕＬｙ
ｓ丁ｙｒｌｌｅＴｈｒＬｅｕＬｙｓＴｈｒ ＰｒｏＨ
４ｇＧｌｙＡｓｐ丁ｙｒｌｌｅＧＩｕＰｈｅＰｒｏＣｙ
ｓコ３０
コロ０ＴＡＣＣＧＣＴＧＧＡＴＣ
ＡＣＣＧＧＣＧ＾丁ＧＴＣＧＡＧＧＴＴ Ｇ丁ＣＣＴ
ＧＡＧＧＧＡ丁ＧＧＡＣＧＣＧＣＡへへＧＴＴＧＧＣＣ
ＴｙｒＡｒｇＴｒｐＨｅ丁ｈｒＧｌｙＡｓｐＶａｌＧＩ
ｕＶａｌ ＶａｌＬｅｕＡｒｇＡｇｐＧｌｙＡｒｇＡ
ＩａＬｙｓＬｅｕ＾１ａＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＡＴ
ＴＣＡＣＡ丁丁ＣＴＣＡＡＧＣＡＡ ＣＡＣＣＧＡＣ
丁６＾ＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＡＣＡＣＧＧＣＡＡＡｒ
ｇＡｓｐ＾５ｐＧｌｎｌｌｅＨｉｓｌｌｅＬｅｕＬｙｓ
ＧＩｎ ＨｉｓＡｒｇ＾ｒｇＬｙｓＧｌｕＬｅｕＧ］ｕ
ＴｈｒＡｒｇＧｌｎ＾＾ＡＣＡＡＴＡＴＣＧＡＴＧＧＡ
ＴＧＧＡＧ丁ＧＧＡＡＣＣＣ丁 ＧＧＣＴＴＣＣＣＣ丁
ＴＧＡＧＣ＾丁（：ＧＡＴＧＣＣＡＡＡＴＧＣしｙｓＧ
ｌｎＴｙｒＡｒｇＴｒｐＭｅｔＧｌｕＴｒｐＡｓｎＰｒ
ｏ ＧｌｙＰｈｅＰｒｏＬｅｕＳｅｒｌｌｅＡｓｐ＾
ＩａＬｙｓＣｙｓＣＡＣＡＡＧＧＡＴＴ丁ΔＣＣＣＣＧ
ＴＧ＾丁ＡＴＣＣＡＧＴＴ丁 ＧＡＴＡＧＴＧＡＡＡ八
八ＧＧＡＧＴＧＧへへＴＴＴＧＴＴＣＴＧＨｉｓＬｙｓ
ＡｓｐＬｅｕＰｒｏ＾ｒｇＡｓｐＨｅＧＩｎＰｈｅ Ａ
ｓｐＳｅｒＧｌｕＬｙｓＧｌｙＶａｌＡｓｐＰｈｅＶａ
ｌＬｅｕＡＡＴＴＡＣ丁ＣＣＡＡＡＧＣＧＡＴＧＧＡＧ
ＡＡＣ（：ＴＧＴＴＣＡＴＣＡＡＣＣＧＣＴＴＣΔ丁Ｇ
ＣＡＣＡ丁ＧＴＴＣＣＡＧＴＣＴＡｓｎＴｙｒＳｅｒＬ
ｙｓＡＩａＭｅｔＧＩｕＡｓｎＬｅｕＰｈｅ ｌ１ｅＡ
ｓｎ＾ｒｇＰｈｅＭｃｔＨｉｓＭｅｔＰｈｅＧＩｎＳｅ
ｒＴＣＴＴＧＧＡＡＴＧＡＣＴ丁ＣＧＣｆ：ＧＡＣＴＴ
ＴＧＡＧＡＡＡ ＡＴＣ丁ＴＴ（、ＴＣ＾八ＧへＴＣ
ＡＧＣＡＡＣＡＣＴＡＴＴＴＣＴＳｅｒ丁ｒｐＡｓｎＡ
ｓｐＰｈｅＡＩａＡｓｐＰｈｅＧ１ｕＬｙｓ ＩＩｅ
ＰｈｅＶａｌＬｙｓｌｌｅＳｅｒＡｇｎＴｈｒｌｌｅＳ
ｅｒＧＡＧＣＧＧＧＴＣ＾丁ＧＡＡＴＣＡＣ丁ＧＧＣ八
ＧＧＡＡＧＡＣＣ丁ＧＡＴＧＴＴＴＧＧＣＴＡｆ：ＣＡ
Ｇ丁丁ＣＣＴＧＡＡ丁ＧＣＣＧ１ｕＡｒｇＶａｌｌ＋１
ａｔＡｓｎＨ４ｓＴｒｐＧ１ｎＧｌｕＡｓｐ ＬｅｕＭ
ｅｔＰｈｅＧＩｙＴｙｒＧＩｎＰｈｅＬｅｕＡｓｎＧｌ
ｙＴＧＣＡＡＣ（：ＣＴＧＴＧＴＴＧＡ丁ＣＣＧＧＣＧ
Ｃ：ＴＧＣＡＣＡ ＧΔＧＣＴＧＣＣＣＧＡＧＡＡＧ
Ｃ丁ＣＣＣＧＧＴＧＡＣＣＡＣＧＣｙｓＡｓｎＰｒｏＶ
ａｌＬｅｕｌｌｅＡｒｇＡｒｇＣｙＳ丁ｈｒ Ｇｌｕ
ＬｅｕＰｒｏＧｌｕＬｙｓＬｅｕＰｒｏＶａｌＴｈｒＴ
ｈｒＧＡＧＡ丁ＧＧＴＡＧＡＧ丁ＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡ
ＧＣＧＧＣＡＧ Ｃ丁ＣＡＧＣ丁丁ＧＧＡＧＣＡＧＧ
ＡＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧｌｕＭｅｔＶａｌＧｌ
ｕＣｙｓＳｅｒＬｅｕＧＩｕＡｒｇＧｌｎ ＬｅｕＳｅ
ｒＬｅｕＧｌｕＧｌｎＧＩｕＶａｌＧｌｎＧｌｎＧｌｙ
＾ＡＣＡτ丁τＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣ丁丁ＴＧＡＧＣ
ＴＧＣ丁Ｇ ＧＡＴＧＧＣＡＴＣＧＡ丁ＧＣＣＡＡＣ
ＡＡＡＡＣＡＧＡＣＣＣＣＡｓｎｌｌａＰｈｅｌｌｅＶ
ａｌＡｓｐＰｈｅＧｌｕＬｅｕＬｅｕ ＡｓｐＧｌｙ
ｌｌｅＡｓｐＡＩａＡｓｎＬｙｓ丁ｈｒＡｓｐＰｒ。 ＴＧＣＡＣＡＣＴＣ（：ＡＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＧＣＴ
ＣＣＣＡＴＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＴ八丁ＡＡＧＡＡＣＣ
へＧＧＣＣＡＡＣＡＡＧＣｙｓＴｈｒＬｅｕＧＩｎＰｈ
ｅＬｃｕＡｌａＡｌａＰｒｏｌｌｅＣｙｓＬｅｕＬｅｕ
ＴｙｒＬｙｓＡｓｎＬｅｕＡｌａＡｓｎＬｙｓ９９０
＋０２０Ａ丁
丁Ｇ丁ＣＣＣＣＡＴＴＧ＋：Ｃ＾丁ＣＣＡＧＣ丁ＣＡＡ
ＣＣＡＡ ＡＴＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＧＡＧ八ＡＣＣ
ＣＴ八丁ＴＴＴＣＣＴへ＋１ｅＶｉへＰｒｏｌｌｅＡｌ
ａｌｌｅＧｌｎＬｅｕＡｓｎＧｌｎ Ｉ］ｅＰｒｏＧＩ
ｙＡｓｐＧｌｕＡｓｎＰｒｏｌｌｅＰｈｅＬｅｕＣＣＴ
ＴＣＧＧＡ丁ＧＣＡＡＡＡＴＡｆ：ＧＡＣＴＧＧＣＴＴ
ＴＴＧ ＧＣＣＡＡＡＡＴＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＴＣ
ＣＡＧＴＧＡＣＴＴＣＰｒｏＳｅｒＡｓｐ＾ＩａＬｙｓ
ＴｙｒＡｓｐＴｒｐＬｅｕＬｃｕ ＡｌａＬｙｓｌｌｅ
ＴｒｐＶａｌＡｒｇＳｅｒＳｅｒＡｓｐＰｈｅｌｌｌｏ
１１４０
ＣＡＣＧＴＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡ丁ＧＡＣＣＣＡＣＣ
丁ＴＣＴＧ ＣＧＡＡＣＡＣＡ丁Ｃ丁ＧＧＴＧＴＣＴ
ＧＡＧＧ丁Ｔ丁ＴＴＧＧＣＨｉｓＶａｌＨｉｉＧＩｎＴ
ｈｒｌｌｅτｈｒ）ｌｉｓＬｅｕＬｃｕ ＡｒｇＴｈｒ
ＨｉｓＬｅｕＶａｌＳｅｒＧｌｕＶａｌＰｈｅＧｉｙＡ
ＴＴＧＣＡＡＴＧ丁ＡＣＣＧＣＣＡＧＣＴＧＣにＴＧＣ
ＴＧＴＧ ＣＡＣＣＣＣＡＴ丁丁ＴＣＡＡＧＣ丁Ｌ；
ＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＣ１１ｃＡ１ａＭｅｔＴｙｒＡ
ｒ７ＧＩｎＬｅｕＰｒｏＡＩａＶａｌ ＨｉｓＰｒｏＴ
ＩｅＰｈｃＬｙｓＬｅｕＬｅｕＶａｌＡｌａＨｉｓＧＴ
ＧＡＧＡＴ丁ＣＡＣＣＡＴＴＧＣＡＡＴＣＡＡＣＡＣＣ
ＡＡＧ ＧＣＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣ丁ＣＡＴＣＴＧ
ＣＧＡＧＴＧＴＧＧＣＶａｌＡｒｇＰｈｅＴｈｒ１１ｅ
ＡＩａｌＩｅＡｓｎ丁ｈｒＬｙｓ ＾ｌａＡｒｇＧＩ
ｕＧＩｎＬｅｕｌｌｅＣｙｓＧＩｕＣｙｓＧｌｙ１２９
０
１コ２０ＣＴＣτＴＴＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡ
ＣＧＣＣＡＣＡＧＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＧＣＡＣＧ丁Ｇ
ＣＡＧ＾丁ＧＧＴＧＣＡＧ＾ＧＧＧＣＣＬｅｕＰｈｅＡ
ｓｐＬｙｓＡｌａＡｓｎＡｌａＴｈｒＧｌｙＧｉｙ Ｇ
ｌｙＧｌｙｌ且ｓＶａｌＧｌｎＭｅｔＶａｌＧｌｒ＋Ａ
ｒｇＡｌａ１３５０
１コ８０Ａ丁ＧＡＡＧＧＡＣ
ＣＴＧＡＣＣＴＡＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＴＧＣＴ丁ＴＣ
ＣＣＧＡＧＧＣＣＡ丁ＣＡＡＧＧＣＣＣＧＧＧＧＣ＾丁
ＣＭｅｔＬｙｓＡｓｐＬｅｕＴｈｒＴｙｒＡＩａＳｅｒ
ＬｅｕＣｙｓ ＰｈｅＰｒｏＧＩｕＡｌａｌｌｅＬｙ
ｓＡＩａＡｒｇＧＩｙＭｅｔＧＡＧＡＧＣＡＡＡＧ＾八
ＧＡＣＡＴＣＣＣＣ丁ＡＣ丁ＡＣＴＴＣＴＡＣＣＧＧＧ
ＡＣＧＡＣＩＩ；ＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＡＡ
ＧｌｕＳｅｒＬｙｓＧ！ｕＡｓｐＨｅＰｒｏＴｙｒ丁ｙ
ｒＰｈｅ ＴｙｒＡｒｇＡｓｐＡｓｐＧｌｙＬｅｕＬ
ｅｕＶａ１丁ｒｐＧｌｕＧＣＣＡＴＣＡＧＧＡＣＧＴＴ
ＣＡＣＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＧＴＡ ＧＡＣＡ丁ＣＴ
ＡＣＴＡＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＣＡＧＧ丁ＧＧＴＧＡｌ
ａｌｋｅＡｒｇ丁ｈｒＰｈｅＴｈｒＡｌａＧｌｕＶａｌ
Ｖａｌ ＡｓｐＨｅＴｙｒＴｙｒＧｌｕＧｌｙＡｓｐ
ＧｌｎＶａｌＶａ１ＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＣＧＧＡＧＣ
ＴＧＣＡＧＧＡＣＴＴＣＧＴＧ ＡＡＣＧＡＴＧＴＣ
ＴＡＣＧ丁ＧＴＡＣＧＧＣＡＴＧＣＧＧＧＧＣＧＩｕＧ
ｌｕＡｓｐＰｒｏＧＩｕＬｅｕＧｌｎＡｓｐＰｈｅＶａ
ｌ ＡｓｎＡｓｐＶａｌＴｙｒＶａｌＴｙｒＧｌｙＭｅ
ｔＡｒｇＧｌｙＣＧＩ：ＡＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＴ
ＣＣＣＣＡＡＧＴＣＧＧＴＣＡＡＧＡＧＣＣＧＧＧＡＧ
ＣＡＧ（：ＴＧＴＣＧＧＡＧＴＡＣＣＴＧＡｒｇＬｙｓ
ＳｅｒＳｅｒＧｌｙＰｈｅＰｒｏＬｙｓＳｅｒＶａｌ
ＬｙｓＳｅｒ＾ｒｇＧＩｕＧｌｎＬｅｕＳｅｒＧｌｕＴ
ｙｒＬｅｕＡＣＣＧ丁ＧＧＴＧＡＴＣ丁丁ＣＡＣＣＧＣ
Ｃ丁ＣＣＧＣＣＣＡＧ ＣＡＣＧＣＣＧＣＧＧＴＣＡ
Ａ、ＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＴＡＣＧＡＣＴｈｒＶａｌＶ
ａｌｌｌｅＰｈｅ丁ｈｒＡｌｉＳｅｒ＾１ａＧｌｎ
）ＩｉｓＡｌａＡｌａＶａｌＡｓｎＰｈｅＧＩｙＧＩｎ
ＴｙｒＡｓｐτＧＧＴＧＣ丁ＣＣＴＧＧＡＴＣＣＣＣＡ
ＡＴＧＣＧＣＣＣＣＣＡ ＡＣＣＡＴＧＣＧＡＧＣＣ
ＣＣＧＣＣＡＣＣＧＡＣＴＧＣＣＡ八Ｃ丁ｒｐ（ｙｓｓ
ｅｒ丁ｒｐＩＩｅＰｒｏＡｓｎ＾ＩａＰへｏＰｒｏ
丁ｈｒＭｅｔ＾ｒｇＡＩａＰｒｏＰｒｏＰｒｏＴｈｒＡ
ｌａＬｙｓＧＧＣＧＴＧＧ丁ＧＡＣＣＡＴ丁ＧＡＧＣＡ
ＧΔτＣＣ丁ＧＧＡＣ、〜ＣＧＣ丁ＧＣＣ（：ＧＡＣＣ
ＧＣＧＧＣＣＧＣ丁ＣＣ丁ＧＣＴＧＧＧｌｙＶａ＋、Ｖ
ａｌＴｂｒｌｌｅＧｌｕＧｉｎｌｌｅＶａｌＡｓｐ
ＴｈｒＬｅｕＰｒｏ八ｓｐｈｒｇＧＩへＡｒｇＳｅｒＣ
ｙｓ丁ｒｐ１１！３０
１８６０ＣΔ丁ＣＴＧＧＧ丁ＧＣＡＧＴＧ丁ＧむＧ
ＣＧＣ丁ＧＡＧＣＣＡＧ ＴＴＣＣＡＧＧＡＡΔ八Ｃ
ＧＡＧＣＴＧＴへＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＨ４ｓＬｅｕＧ
ｌｙＡｌａＶａ１丁ｒｐＡｌａＬｅｕｓｅｒＧＩｎ
ＰｈｅＧＩｎＧｌｕＡｓｎＧｌｕＬａｕＰｈｅＬｅｕＧ
ｌｙｋｌｅｔＴＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣ八丁ＴττＡ
ＴＣＧＡＧＡＡＧＣＣＴ ＧＴＧＡＡＧＧΔＡＧＣＣ
ＡＴＧＧＣＣＣＧＡＴＴＣＣＧＣＡＡＧ丁ｙｒＰｒｏＧ
ｌｕＧＩｕＨｉｓＰｈｅｌｌｅＧｌｕＬｙｓＰｒｏ
ＶａｌＬｙｓＧｌｕΔｌａＭｅｔＡｌａＡｒｇＰｈｅＡ
ｒｇＬｙｓ１９５０
１９８ＣＩＡ〕１ＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＡＴＴＧＴＣ
ＡＧＣＧＴＧＡ丁ＴＧＣＴ ＧＡＧＣＧＩ：ＡＡＣ八
八へへＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣＡＴＡＴＡｓｎＬｅ
ｕＧｌｕ＾１ａｌｌｅＶａｌＳｅｒＶａｌＩｌｅＡｌａ
ＧＩｕＡｒｇＡｓｎＬｙｓＬｙｓＬｙｓＧＩｎＬｅ
ｕＰｒｏＴｙｒＴＡＣＴＡＣττＧＴＣＣＣＣＡＧＡＣ
ＣＧＧＡ丁ＴＣＣＧＡＡＣＡＧＴＧＴＧＧＣＣＡＴＣ丁
ＧＡＧＣＡＣＡＣＴＧＣＣＡＧＴＣＴＴｙｒＴｙｒＬｅ
ｕＳｅｒＰｒｏ八ｓｐＡｒｇｌｌｅＰｒへ八ｓｎ ５
ｃｒＶａｌへｌａｌｌｅ−−−ＣＡＣＴＧ丁ＧＧＧＡＡ
ＧＧＣＣＡＧｆ；丁ＧＣＣｆ：ＣＡＧＣＣＡＧ ＡＴ
ＧＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＧＧＴＧＴ
ＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＴＣＴＴＧＧＣＡＧＴＣＡＣＡ
ＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＧ八ＧＧへＣＡＧＴＡＣＣＴＴ
ＴＣＣＡＴＴＴＡＴＴＣＴＴＪ１９０
２２２０ＴＧＡ丁ＣＴ丁ＣＡＧＧＧＡＡ
ＣＴＧＣＡＴＡＧ＾丁丁ＧＡ丁ＣＡ ＡＡＧＴＧＴＡ
ＡＡＣＡＣＣＡＴ八ＧＧＧＡＣＣＣＡＴＴＣ丁ＡへＡＣ
ＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＴ（：ＣＴＣ
ＴＣＣＡ ＣＡＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＴＴＴＣ（
：ＡＣＡＣＩ：ＡＡＧＣＡＧ２コ１０
２コ４０
ＣＡＡＣＡＧＣＡＡＡ丁ＣＡＣＧＡＣＣＡＣＴＧＡ丁Ａ
ＧＡＴＧＴ Ｃ丁へＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＡＣＡ
ＴＧＧＧＡＴＧＡＴＴＡ丁２コア０
２４００ＴＴ
ＴＣ丁ＧＴＴＣＴＡＴＴＴＧＴＣＧＴＴＡＧ丁ＣＣＡＡ
Ｔ丁ＣＣＴＴＧＣＡＣＡＴＡＧＴＡＧＧＴＡＣＣＣＡＡ
丁ＴＣＡＡＴ丁Ａ２４コ０
２４５０ＣＴＡＴ
丁ＧＡＡＴＧＡＡ丁ＴＡＡＧＡＡＴＴＧＧ丁丁ＧＣＣＡ
Ｔ Ａ＾八へＡＴＡ八へ丁ＣＡＧ丁ＴＣＡ丁ＴＴ八へ
へへへＡＡＡΔ八へＡＡＡＡＡ 筈、Ｌｌ記（＼ａ３’） 膝上１つ （ての）） 謂：３０ 茅４回 ＨＬｎａ工ＺＸ Ｐ！、６回 ヱ７＋Ｒ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）酵母グルコアミラーゼを支配している遺伝子のプロ
モーターを含み異種蛋白質遺伝子を酵母中で発現させる
プラスミド。 ２）酵母グルコアミラーゼを支配している遺伝子のプロ
モーターの直後にヒト５−リポキシゲナーゼをコードす
る遺伝子を結合した組換え体ＤＮＡ。 ３）酵母グルコアミラーゼを支配している遺伝子のプロ
モーターの直後にヒト５−リポキシゲナーゼをコードす
る遺伝子を結合した組換え体ＤＮＡを含有する酵母。 ４）酵母グルコアミラーゼを支配している遺伝子のプロ
モーターの直後にヒト５−リポキシゲナーゼをコードす
る遺伝子を結合した組換え体ＤＮＡを含有する酵母を培
養し、該培養物中にヒト５−リポキシゲナーゼを生成蓄
積させ、該培養物からヒト５−リポキシゲナーゼを採取
することを特徴とするヒト５−リポキシゲナーゼの製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4171689A JPH02222690A (ja) | 1989-02-23 | 1989-02-23 | ヒト５―リポキシゲナーゼの酵母による製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4171689A JPH02222690A (ja) | 1989-02-23 | 1989-02-23 | ヒト５―リポキシゲナーゼの酵母による製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02222690A true JPH02222690A (ja) | 1990-09-05 |
Family
ID=12616147
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4171689A Pending JPH02222690A (ja) | 1989-02-23 | 1989-02-23 | ヒト５―リポキシゲナーゼの酵母による製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02222690A (ja) |
-
1989
- 1989-02-23 JP JP4171689A patent/JPH02222690A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3950196B2 (ja) | アルコールデヒドロゲナーゼ及びキラルヒドロキシ化合物の酵素的生産へのその使用 | |
| DE69333718T2 (de) | Gen, das für eine Fisch-Transglutaminase kodiert | |
| JP2006068019A (ja) | ｏｓｍＢプロモータで制御される発現プラスミド | |
| NO301480B1 (no) | Fremgangsmåte for enzymatisk fremstilling av basisk fibroblastfaktor | |
| JPH01501840A (ja) | 繊維芽細胞成長因子の産生 | |
| JPH11514530A (ja) | （２．５―ｄｋｇ）リダクターゼの各種改良型変異体 | |
| CN105713883B (zh) | 一种l-脯氨酸-4-羟基化酶及其应用 | |
| JP2842693B2 (ja) | 宿主細胞中でのタンパク質の過剰発現のための方法およびｄｎａ発現システム | |
| US5037744A (en) | Process for the microbiological preparation of human serum albumin | |
| JPH1175876A (ja) | 新規な微生物トランスグルタミナーゼの製造法 | |
| JPH02222690A (ja) | ヒト５―リポキシゲナーゼの酵母による製造法 | |
| JP3364972B2 (ja) | 魚由来トランスグルタミナーゼ遺伝子 | |
| JPH06311884A (ja) | プラスミド及びそれで形質転換されたエ シェリチア・コリ | |
| EP0779298A2 (en) | Thermostable geranylgeranyl diphosphate synthase | |
| JPH08103278A (ja) | 活性型ヒトａｌｔの製造方法 | |
| EP1231266A1 (en) | Arabidopsis-origin gdp-4-keto-6-deoxy-d-mannose-3,5-epimerase-4-reductase gene | |
| JP3477746B2 (ja) | 魚由来トランスグルタミナーゼ遺伝子 | |
| JP4252299B2 (ja) | 新規ジスルフィド酸化還元酵素、および、該酵素を用いたタンパク質の活性化方法 | |
| JP2525413B2 (ja) | Ｌ−フェニルアラニン・アンモニアリア−ゼ発現用組換え体プラスミド及び該プラスミドを有する形質転換株 | |
| JP2664802B2 (ja) | イオンチャンネル直結型受容体ｎ末端細胞外部位蛋白質の生産方法 | |
| CN115011578A (zh) | 一种强化型m-mlv逆转录酶突变体及其应用 | |
| JPH02219570A (ja) | ヒト５―リポキシゲナーゼの製造方法 | |
| JP3081917B1 (ja) | ホスファチジルエタノールアミンｎ−メチル転移酵素活性を有する耐熱性酵素 | |
| CN115838745A (zh) | 一种适用于无细胞合成限制性内切酶BsaI的线性DNA模板、体系及其用途 | |
| CA1200775A (en) | Expression linkers |