KR100779055B1 - 인간 텔로머라제 역전사효소를 암호화하는폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 대장균에서의 인간텔로머라제 역전사효소의 제조방법 - Google Patents

인간 텔로머라제 역전사효소를 암호화하는폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 대장균에서의 인간텔로머라제 역전사효소의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 텔로머라제 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로 보다 상세하게는 대장균에서 효율적으로 발현되도록 코돈을 최적화시킨 인간 텔로머라제 역전사효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 대장균에서의 인간 텔로머라제 역전사효소의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 이용하면 대장균에서 효율적으로 인간 텔로머라제 역전사효소를 제조할 수 있으며, 아울러 인산화효소로 인산화하고, 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트로 재구성하여 활성화된 인간 텔로머라제 역전사효소를 제조할 수 있다.
텔로미어, 인간 텔로머라제 역전사효소

Description

인간 텔로머라제 역전사효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 대장균에서의 인간 텔로머라제 역전사효소의 제조방법{Polynucleotide encoding Human Telomerase reverse transcriptase and method for preparing Human Telomerase reverse transcriptase in E. coli using the same}
도 1a 내지 도 1c는 본 발명에 따른 재조합 발현벡터 pET28a(+)-hTERT의 제작과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 pET28a(+)-hTERT1 -398, pET28a(+)-hTERT398 -716, pET28a(+) - hTERT716-1132로부터 적절한 제한 효소를 사용하여 내부에 삽입된 각각의 인간 텔로머라제 역전사효소 유전자를 확인한 결과를 나타내는 겔 사진이다.
레인 1: λDNA-Hind Ⅲ 분자량 마커
레인 2: φχ174-Hinc II 분자량 마커
레인 3: pET28a(+)-hTERT1 - 398를 제한 효소 EcoR I 과 Sac I으로 처리한 결과
레인 4: pET28a(+)-hTERT398 -716를 제한 효소 Sac I 과 Sal I으로 처리한 결과
레인 5: pET28a(+)-hTERT716 -1132를 제한 효소 Sal I and Hind III로 처리한 결과
도 3은 대장균 BL21 (DE3) star 내의 ColE1-compatible pACYC-based plasmid 및 colE1-과 pACYC-compatible pSC101-based plasmid의 안정성의 결과를 나타낸 사진이다.
레인 1: λDNA-Hind Ⅲ 분자량 마커
레인 2: 대장균 BL21 Codon Plus(DE3)-RIPL 내의 플라스미드
레인 3: 1대 계대 배양 후 레인 2의 플라스미드를 포함하고 있는 대장균 BL21 Star (DE3)의 플라스미드
레인 4: 2대 계대 배양 후 레인 2의 플라스미드를 포함하고 있는 대장균 BL21 Star (DE3)의 플라스미드
레인 5: 3대 계대 배양 후 레인 2의 플라스미드를 포함하고 있는 대장균 BL21 Star (DE3)의 플라스미드
레인 6: 4대 계대 배양 후 레인 2의 플라스미드를 포함하고 있는 대장균 BL21 Star (DE3)의 플라스미드
레인 7: 5대 계대 배양 후 레인 2의 플라스미드를 포함하고 있는 대장균 BL21 Star (DE3)의 플라스미드
레인 8: 6대 계대 배양 후 레인 2의 플라스미드를 포함하고 있는 대장균 BL21 Star (DE3)의 플라스미드
도 4는 인간 텔로머라제 역전사효소의 발현을 조건별로 확인한 결과(A, C) 및 분리된 인간 텔로머라제 역전사효소(B)를 나타낸 것이다.
레인 1: 분자량 마커
레인 2: 음성대조군(pET28a(+)-hTERT 미포함)
레인 3: 음성대조군(pET28a(+)-hTERT포함, IPTG 미첨가)
레인 4: OD600 = 0.6∼0.7일 때, 0.1mM의 IPTG를 첨가한 경우
레인 5: OD600 = 0.6∼0.7일 때, 1.0mM의 IPTG를 첨가한 경우
레인 6: OD600 = 0.9∼1.0일 때, 0.1mM의 IPTG를 첨가한 경우
레인 7: OD600 = 0.9∼1.0일 때, 1.0mM의 IPTG를 첨가한 경우
도 5는 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트를 합성하여 분리한 것을 나타낸 것이다.
도 6은 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소를 이용하여 인산화한 인간 텔로머라제 역전사효소의 텔로머라제 활성을 정성적(A) 및 정량적(B, C)으로 측정한 결과이다.
레인 1: 음성대조군
레인 2: 인산화를 수행하지 않은 100ng의 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소와 100ng 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트로 재구성한 경우
레인 3-6: 인산화된 100ng의 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소와 각각 0, 30, 60, 100ng의 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트로 재구성한 경우
레인 7-10: 50ng의 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트와 각각 0, 15, 30, 50ng의 인산화된 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소로 재구성한 경우
도 7은 Akt 단백질 인산화효소를 이용하여 인산화한 인간 텔로머라제 역전사효소의 텔로머라제 활성을 정성적(A) 및 정량적(B, C)으로 측정한 결과이다.
레인 1: 음성대조군
레인 2: 인산화를 수행하지 않은 100ng의 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소와 100ng 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트로 재구성한 경우
레인 3-6: 인산화된 100ng의 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소와 각각 0, 30, 60, 100ng의 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트로 재구성한 경우
레인 7-10: 50ng의 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트와 각각 0, 15, 30, 50ng의 인산화된 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소로 재구성한 경우
도 8은 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소 또는 Akt 단백질 인산화효소로 인산화된 인간 텔로머라제 역전사효소를 Abl 티로신 인산화효소로 다시 인산화한 경우 텔로머라제 활성을 정성적(A) 또는 정량적(B)으로 측정한 결과이다.
레인 1: 음성대조군
레인 2: 100ng의 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소에 의하여 인산화된 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소와 100ng 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트로 재구성한 경우
레인 3: 100ng의 Akt 단백질 인산화효소에 의하여 인산화된 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소와 100ng 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트로 재구성한 경우
레인 4: 레인 2의 조건에서 Abl 티로신 인산화효소로 인산화시킨 경우
레인 5: 레인 3의 조건에서 Abl 티로신 인산화효소로 인산화시킨 경우
본 발명은 인간 텔로머라제 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로 보다 상세하게는 대장균에서 효율적으로 발현되도록 코돈을 최적화시킨 인간 텔로머라제 역전사효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 이용한 대장균에서의 인간 텔로머라제 역전사효소의 제조방법에 관한 것이다.
염색체(chromosome) 말단의 길이를 유지시켜 주는 리보뉴클레오단백질(ribonucleoprotein)인 텔로머라제(telomerase)는 세포의 노화, 암, 및 불멸화(immortalization)와 관련된 잠재적 가능성에 때문에 최근 몇 년 동안의 주된 연구과제였다(Harley et al., Nature, 345: 458-460, 1990; Counter et al., EMBO J. 11: 1921-1929, 1992; Kim et al., Science 266: 2011-2014, 1994). 성인의 체세포(somatic cell)에 직렬로 나열(tandem repeat)되어 있는 염색체 말단의 반복 서열(tandem telomeric repeats; 5'-TTAGGG-3' in human)을 포함하고 있는 염색체 말단 부분은 염색체 분해 (degradation), 염색체 말단 사이의 융합 (end-to-end fusions), 염색체의 재배열 (rearrangements)과 염색체의 손상 (chromosome attrition)과 같은 총체적인 염색체적 손상을 방지하는 역할을 담당한다(Greider, Mol. Cell. Biol. 11: 4572-4580, 1991). 일반적으로 일반 체세포에서는 세포 분열시마다 염색체 말단의 30-150bp 정도를 손실한다(Harley et al., Nature 345: 458-460,1990; Allsopp et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 10114-10118, 1992; Vaziri et al., Am. J. Hum. Genet. 52: 661-667, 1993). 이러한 염색체 말단의 단백질을 코드하고 있지 않는 DNA(non-coding DNA)의 손실에 의한 전체적인 염색체 길이의 감소는 세포의 성장 지연(growth arrest), 세포의 노화(cellular senescence)와 같은 세포의 총체적 위기를 초래한다(Chiu and Harley, 1997; Autexier and Greider 1996). 그러나 RNA 의존적 DNA 폴리머라제(RNA-dependent DNA polymerase)인 텔로머라제의 존재 하에서는 염색체 말단 부위의 길이가 확장되거나 유지되어 세포의 노화를 억제하여 세포의 총체적 위기를 극복할 수 있다. 이러한 기능을 하는 텔로머라제는 대부분 성인 정상 체세포에서는 발견되지 않지만 생식계열의 세포(germline cells), 영양포(trophoplast), 조혈세포(hematopoietic cells)와 같은 급격히 분열을 하는 세포나 전체 암세포의 95%이상에서 발견되어지고 있다.
텔로머라제 기능 복합체의 연구에 의하면 이 효소가 활성을 나타내기 위해서는 텔로머라제의 폴리머라제의 활성을 위해 필요한 주형(template) 역할을 담당하는 텔로머라제 RNA 컴포넌트(telomerase RNA components; hTR)와 염색체 말단을 연장시키는 역할의 역전사효소 활성을 나타내는 효소적 기능 단위인 텔로머라제 역전 사효소(human telomerase reverse transcriptase; hTERT) 적어도 이 두 가지 요소를 필요로 함이 이전 연구에서 밝혀졌다(Feng et al., Science 269: 1236-1241, 1995; Harrington et al., Genes Dev. 11: 3109-3115, 1997; Nakayama et al., Nat. Genet. 18: 65-68, 1998). 특히, 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트와 인간 텔로머라제 역전사효소는 in vitro 텔로머라제 활성을 위해서 반드시 필요로 하며 또한 재구성 되어져야만 한다(Weinrich et al., Nat. Genet. 17: 498-502, 1997; Beattie et al., Curr. Biol. 8: 177-180, 1998). 하지만 in vitro 상에서 텔로머라아제 활성을 위해서 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트와 인간 텔로머라제 역전사효소의 두 요소만 재구성되어야하는지 그 이유는 아직까지 불분명하다.
텔로머라제 역전사효소는 다양한 역전사효소에서 발견되는 motif를 포함하고 있으며, 이러한 motif들은 효모에서부터 인간까지 다양한 종에서 보존되어 있음이 밝혀졌다(Meyerson et al., Cell 90: 785-795, 1997; Nakamura et al., Science 277: 955-959, 1997; Nugent and Lundblad, Genes & Dev. 12: 1073-1085, 1998). 텔로머라제 역전사효소의 아미노 말단 부위(N terminus)는 텔로머라제 RNA 컴포넌트가 결합하거나 텔로머라제 역전사효소의 4차구조 형성에 있어서 반드시 필요한 부분이다(Friedman et al., Genes & Dev. 13: 2863-2874, 1999; Bryan et al., Mol. Cell. Biol. 6: 493-499, 2000; Xia et al., Mol. Cell. Biol. 20: 5196-5207, 2000; Armbruster et al., Mol. Cell. Biol. 21: 7775-7786, 2001; Bachand et al., Mol. Cell. Biol. 21: 1888-1897, 2001; Lai et al., Mol. Cell. Biol. 21, 990-1000, 2001). 또한, 텔로머라제 역전사효소의 카르복실 말단 부위(C terminus)는 인간의 경우 CRM1과 14-3-3이 결합하는 자리를 포함하고 있으며 4차구조 형성에 있어 필요한 부분으로 밝혀졌다(Seimiya et al., EMBO J. 19, 2652-2661, 2000).
인간 텔로머라제 역전사효소의 발현은 약 85-95%의 종양 조직에서 발견되어지며, 이는 암을 진단하는데 있어 유용한 도구로 사용되어진다. 게다가, 일반적인 암과 갑상선 암(thyroid cancer), 유방 암(breast cancer), 경부 암(cervical cancer), 전립선 암(prostate cancer)과 같은 치명적인 암에서 hTERT의 발현은 발암 초기 단계에서 발견되어 진다. 따라서 인간 텔로머라제 역전사효소의 조절 및 발현에 대한 메카니즘의 이해와 텔로머라제 활성의 조절은 노화 방지와 노화 관련 질병연구 및 항암치료에 있어 반드시 필요한 연구이며, 이를 위하여 인간 텔로머라제 역전사효소를 다량으로 수득하고, 이의 활성을 조절할 수 있는 방법이 요구되어 왔다.
하지만, 현재까지 대장균을 이용한 인간 텔로머라제 역전사효소의 발현은 일부 서열을 대장균을 이용하여 발현시켜 항체(antibody)를 생산하는 데 이용되는 데에 한정되어 있으며, 곤충세포 (insect cell)을 이용한 인간 텔로머라제 역전사효소의 발현을 불용성 응집체(inclusion body)의 형성과 같은 문제를 야기하여 인간 텔로머라제를 다량으로 수득하기 위한 방법은 개발되어 있지 않았다.
이에 본 발명자들은 인간 텔로머라제 역전사효소를 다량으로 수득하고, 이들의 활성을 조절할 수 있는 방법을 연구하던 중, 기존에 원핵생물에서는 발현되지 않는다고 알려진 인간 텔로머라제 역전사효소를 대장균 발현 시스템을 이용하여 발현시켰으며, His-바인드 레진 크로마토그래피로 1차 정제만을 실시하여 재조합 텔로머라제 역전사효소를 대장균 유래의 단백질로부터 분리, 정제 하였다. 또한, 다양한 인산화효소를 이용하여 재조합 텔로머라제 역전사효소의 특정 위치의 인산화를 통해 활성화된 텔로머라제 역전사효소를 제조하여 텔로머라제 활성을 복원함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 대장균을 이용한 인간 텔로머라제 역전사효소의 발현을 위하여 코돈 최적화된 텔로머라제 역전사효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 대장균에 형질전환하고, 형질전환된 대장균을 배양하여 인간 텔로머라제 역전사효소를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 활성화된 인간 텔로머라제 역전사효소를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 텔로머라제 역전사효소를 암호화하는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 형질전환세포를 배양하는 것을 포함하는 인간 텔로머라제 역전사효소의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 활성화된 인간 텔로머라제 역전사효소를 제조하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 대장균에서 발현될 수 있도록 유전자 조작이 되어진 인간 텔로머라제 역전사효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 특징으로 한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 가지는 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 대장균에서의 발현이 용이하도록 코돈-최적화시킨 것이다.
본 발명에서 용어 "코돈-최적화"는 각종 숙주의 형질전환을 위한 핵산 분자의 암호화 영역 또는 유전자를 지칭함에 따라, DNA에 의해 암호화된 폴리펩티드를 변화시키지 않고서 숙주 유기체의 전형적인 코돈 활용을 반영하도록 상기 핵산 분자의 암호화 영역 또는 유전자 내의 코돈을 변화시키는 것을 지칭한다.
코돈-최적화는 DNA 전부 (또는 일정 부분)을 합성하여, 전사된 mRNA에 존재할 수도 있는 이차 구조의 모든 탈안정화 서열 또는 영역을 제거할 수도 있고, DNA 전부 (또는 일정 부분)을 합성하여, 염기 조성을 목적하는 숙주 세포에서 보다 선호될 수 있는 것으로 변화시킬 수도 있다.
본 발명에서는 대장균 내부에 많이 존재하는 서열(E. coli usage codon)을 바탕으로 하여 인간 텔로머라제 역전사효소를 암호화하는 뉴클레오티드서열을 정하였으며, 이를 PCR을 통해 서열을 수득할 수 있었다(실시예 1 참조).
본 발명의 일 실시예에서는 공지된 서열(Genbank Accession No. AF128893)을 바탕으로 대장균 내부에 많이 존재하는 서열(E. coli usage codon)을 이용하여 인간 텔로머라제 역전사효소가 합성되도록 서열을 정하고, 이를 HeLa cDNA library (CLontech, Palo Alto, CA, USA)를 주형으로 하여 PCR법을 이용하여 증폭하였다. PCR에 의해 증폭된 단편을 연결하여 대장균에서 발현될 수 있도록 조작된 전체 길 이의 인간 텔로머라제 역전사효소를 암호화하는 유전자를 얻었다.
본 발명은 또한, 인간 텔로머라제 역전사효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명에서 “재조합 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성 적(constitutive) 또는 유도성(inducible) 일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 pET28a(+)-hTERT일 수 있다. 상기 pET28a(+)-hTERT는 pET28a(+)벡터(Novagen, USA)의 MCS(multi cloning site) 중 EcoRI 및 HindIII 제한효소 부위에 본 발명의 뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 단백질의 정제를 용이하게 할 목적으로 인간 텔로머라제 역전사효소의 N 말단 부위에 인위적으로 6개의 히스티딘(Histidine)을 포함시켜 발현시키기 위하여, His-Tag 서열을 가지고 있는 pET28a(+)벡터(Novagen, USA)에 본 발명의 뉴클레오티드를 클로닝하였다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환세포를 제공한다. 본 발명의 형질전환세포는 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 대장균을 본 발명의 재조합 벡터, 바람직하게는 본 발명의 뉴클레오티드를 포함하는 pET28a(+)-hTERT를 이용함으로써 많은 양의 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소를 발현시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 형질전환은 핵산을 숙주세포에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격유전자전달법(electroporation), 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection) 및 리포좀 매개법(liposome-mediated method) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
아울러, 본 발명의 형질전환 대장균은 본 발명의 인간 텔로머라제 역전사효소를 발현을 증진하기 위하여 ColE1- compatible pACYC-based plasmid 및 colE1- 과 pACYC -compatible pSC101-based plasmid을 추가로 포함할 수 있다. 상기 ColE1- compatible pACYC-based plasmid 및 colE1- 과 pACYC -compatible pSC101-based plasmid는 상용의 균주인 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL(Stratagene, USA)에 도입되어 있는 벡터로 상기 균주로부터 통상적인 플라스미드 분리 방법을 통하여 쉽게 수득할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 mRNA의 안정성을 높여주는 대장균 BL21 (DE3) star(Novagen, USA)에 대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL(Stratagene, USA)으로부터 argU , proL tRNA를 코드하고 있는 유전자를 포함하는 ColE1-compatible pACYC- based plasmid 및 argU, ileY, leuW tRNA를 코드하고 있는 유전자를 포함하는 colE1-과 pACYC-compatible pSC101-based plasmid를 도입하여 형질전환된 대장균을 사용하였다.
본 발명은 또한, 본 발명의 형질전환세포를 배양하는 것을 포함하는 인간 텔로머라제 역전사효소의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은 본 발명의 형질전환세포에 도입된 재조합 벡터에서 본 발명의 인간 텔로머라제 역전사효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하는 것에 의해 수행된다. 상기 형질전환세포를 배양하여 재조합 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들면, 형질전환된 세포가 성장할 수 있는 적합한 배지에 접종하여 종배양한 다음, 이를 본 배양용 배지에 접종하고 적합한 조건에서 배양함으로써 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 이후, 상기 형질전환된 세포에서 발현이 유도된 본 발명의 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소의 분리 및 정제는 당업계에 공지된 다양한 분리 및 정제방법을 통해 수행할 수 있으며, 예를 들어, 상기 세포를 용해 후, 용해물을 원심분리하여, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소를 제조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).
본 발명의 일 실시예에서는 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소를 제조하기 위하여, 발현 벡터를 도입한 대장균을 배양하여 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소의 발현을 유도하고, 상기 균을 파쇄한 다음 원심분리하여 상층액을 수득하고 이를 His-바인드 레진 크로마토그래피 (His-Bind Resin chromatography, Novagen, USA)를 이용하여 정제하였다.
본 발명은 또한, 본 발명의 인간 텔로머라제 역전사효소를 다양한 인산화효소를 이용하여 인산화하여 활성화된 인간 텔로머라제 역전사효소의 텔로머라제를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 활성화된 인간 텔로머라제 역전사효소는
(a) 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 인간 텔로머라제 역전사효소를 분리, 정제하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 분리, 정제된 효소를 Akt 단백질 인산화효소(Akt protein kinase) 또는 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소(protein kinase Cα kinase)로 인산화하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 인산화된 효소와 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트의 RNA를 혼합하여 재구성하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 제조할 수 있다.
상기 (a) 단계의 인간 텔로머라제 역전사효소를 제조, 분리 및 정제는 상기에서 기술한 바와 같으며, 이를 Akt 단백질 인산화효소(Akt protein kinase) 또는 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소(protein kinase Cα kinase)로 인산화한다.
인산화는 Akt 단백질 인산화효소(Akt protein kinase) 또는 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소(protein kinase Cα kinase)에 의해 수행될 수 있으며, 인산화 반응은 당업계에 공지된 효소 반응 방법에 따라 적절한 완충용액 및 ATP를 포함하는 반응액에 의해 수행될 수 있다. 상기 Akt 단백질 인산화효소 또는 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소는 상기 효소를 발현하는 공지의 균주에서 분리되거나 상용의 효소를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 상용의 효소를 사용할 수 있다.
인산화된 효소와 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트의 RNA의 재구성은 당업계에 공지된 재구성 방법에 의해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 상기 효소와 RNA를 혼합하고 33℃에서 30분간 놓아 두어 수행될 수 있다. 상기 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트는 이에 한정되지는 않으나, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 Akt 단백질 인산화효소 또는 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소를 이용하여 본 발명의 인간 텔로머라제 역전사효소를 인산화시킨 뒤, 이를 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트와 혼합하여 재구성함으로써 활성화된 인간 텔로머라제 역전사효소를 제조하였다.
본 발명에서의 인간 텔로머라제 역전사효소는 Akt 단백질 인산화효소에 의해 인산화되었을 경우가 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소에 의해 인산화되었을 경우보다 인간 텔로머라제 역전사효소의 활성 복원이 더 잘되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 인간 텔로머라제 역전사효소의 인산화 부위에 따라 텔로머라제 활성 정도가 다르게 나타남을 의미한다.
한편, 본 발명은 Abl 티로신 인산화효소로 인산화시키는 단계를 추가로 포함하는 활성화된 텔로머라제 역전사효소를 제조하는 방법을 제공한다.
Abl 티로신 인산화효소에 의한 인산화 반응은 바람직하게는 상기 (b) 단계의 Akt 단백질 인산화효소 또는 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소에 의한 인산화 이후에 수행될 수 있으며, 당업계에 공지된 효소 반응 방법에 따라 적절한 완충용액 및 ATP를 포함하는 반응액에 의해 수행될 수 있다. 상기 Abl 단백질 인산화효소는 상기 효소를 발현하는 공지의 균주에서 분리되거나 상용의 효소를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 상용의 효소를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 Akt 단백질 인산화효소 또는 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소에 의한 인산화된 인간 텔로머라제 역전사효소를 다시 Abl 티로신 인산화효소에 의해 인산화하여 인간 텔로머라제 역전사효소의 텔로머라제 활성의 변화를 확인하였다.
그 결과, Abl 티로신 인산화효소에 의해 다시 인산화시키는 경우 인간 텔로머라제 역전사효소의 텔로머라제 활성이 감소하는 것을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
< 실시예 1>
인간 텔로머라제 역전사효소 유전자의 클로닝
<1-1> 프라이머 제작
진뱅크에 공지된 인간 텔로머라제 역전사효소를 암호화하고 있는 유전자 서 열(Genbank Accession No. AF128893)을 바탕으로 5′과 3′말단 영역의 염기들과 서로 상보적으로 쌍을 이루며 pET-28a(+)(Novagen, USA)의 다중 클로닝 지역(mutiple cloning site; MCS)에 적합한 제한 효소를 가지도록 찾아 중합효소 연쇄반응(PCR)을 위해 세 쌍의 프라이머를 각각 설계하였다. 각각의 프라이머는 말단에 각각 EcoRⅠ과 SacⅠ, SacⅠ과 Sal I, 그리고 Sal I과 Hind III의 제한효소 자리를 포함하도록 설계되었다. 또한, 발현양을 높이기 위해 각각의 프라이머의 5‘ 말단 부위와 3’ 말단 부위의 코돈은 E. coli 코돈 사용빈도(E. coli codon usage)를 바탕으로 치환하였다. 각각의 프라이머는 하기 표 1과 같으며, 치환 전 원래의 염기는 각각의 프라이머의 밑줄친 볼드 아래에 표시하였고, 각각의 프라이머에 포함되어 있는 제한효소 사이트를 각각 표시하였다.
hTERT1-398 1 5'-GAATTCATGCCGCG T GCTCC G CGCTGCCGAGCC-3' EcoRⅠ C C 정방향 (서열번호3)
5'-CAAGGAGCTCCAGAAACAG C GGACGCAT C TGCC-3' SacⅠ G T 역방향 (서열번호4)
hTERT398 -716 2 5'-CTGGAGCTCCT G GG T AACCACGCGCAGTGCCC-3' SacⅠ T G 정방향 (서열번호5)
5'-CACGTCGACCTTGACAAAGTACAG T TC C GGCGG-3' Sal I C A 역방향 (서열번호6)
hTERT716-1132 3 5'-AAGGTCGACGT T ACGG G TGCGTACGACACCATCC-3' Sal I G C 정방향 (서열번호7)
5'-AAGCTTATCAGTCCAGGATGGTCTTGAAGTC-3' Hind III 역방향 (서열번호8)
(1: 인간 텔로머라제 역전사효소의 1번 아미노산부터 398번 아미노산까지 암호화 하고 있는 인간 텔로머라제 역전사효소 유전자, 2: 인간 텔로머라제 역전사효소의 398번 아미노산부터 716번 아미노산까지 암호화 하고 있는 인간 텔로머라제 역전사효소 유전자, 3: 인간 텔로머라제 역전사효소의 716번 아미노산부터 1132번 아미노산까지 암호화 하고 있는 인간 텔로머라제 역전사효소 유전자)
<1-2> 인간 텔로머라제 역전사효소 유전자의 증폭
상기 실시예 1-1에서 합성한 프라이머를 이용하여 HeLa cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, PCR에 의해 인간 텔로머라제 역전사효소 유전자를 증폭하였다. PCR 반응은 주형 유전자 (HeLa cDNA library) 100ng, 각 최종 농도 0.2mM의 dNTP 혼합물, 0.6μM의 프라이머, 10× Z-Taq 완충용액 5㎕, Z-Taq 중합효소(Takara, Japan) 1㎕를 포함하는 용액을 최종 부피 50㎕ 반응액으로 하여 수행하였다. PCR 반응 조건은 먼저 94℃에서 30초 동안 열 변성(denaturing) 시킨 후 의 hTERT1 - 398를 암호화하고 있는 유전자의 경우 67℃에서 1분 동안, hTERT398 -716를 암호화하고 있는 유전자의 경우 64℃에서 1분 동안, hTERT716 -1132를 암호화하고 있는 유전자의 경우 60℃에서 1분 동안 어닐링(annealing)시킨 후 중합효소에 의한 유전자 합성은 72℃에서 30초 동안 실시하였다. 이 조건을 1 cycle로 하고, 이것을 반복하여 35 cycle 반응시켰다. 반응이 끝난 후 1.0% 아가로즈 겔 전기영동 (electrophoresis)에 의해 증폭된 생성물을 확인한 뒤, 아가로즈 겔에서 증폭된 단편을 회수하여 상용의 키트(QIAquick Gel extraction kit; Qiagen, USA)를 이용하여 추출, 정제하였다. 추출한 단편은 pGEM-T Easy 벡터 (Promega, USA)에 삽입한 후(이를 각각 pGEM-T Easy-hTERT1 -398, pGEM-T Easy-hTERT398-716, pGEM-T Easy-hTERT716 -1132라고 함), 상기 인간 텔로머라제 역전사효소 유전자 단편이 삽입된 pGEM-T Easy 벡터를 대장균 JM109 감응세포(supercompetent cell)에 형질전환시켰다. 이를 50㎍/㎖ 암피실린(Ampicillin)이 포함된 평판 L-브로쓰(Broth) 배지 상에서 배양하여 형질전환된 대장균을 선별하고, 이를 다시 액체 L-브로쓰 배지에서 배양한 후, 이로부터 각각의 인간 텔로머라제 역전사효소 유전자가 삽입된 pGEM-T Easy 벡터(pGEM-T Easy-hTERT1 -398, pGEM-T Easy-hTERT398 -716, pGEM-T Easy-hTERT716-1132)를 다량으로 수득하였다.
<1-3> 재조합 발현벡터 pET28a (+)- hTERT 의 제작
상기 실시예 1-2에서 클로닝한 pGEM-T Easy-hTERT1 -398 벡터를 제한효소 EcoRⅠ과 SacⅠ를 사용해 37℃에서 6시간동안 절단(digestion)하여 단편(hTERT1 -398)을 얻었다. T7 promoter를 가진 발현 벡터 pET26B(+)벡터도 상기 조건과 동일한 조건으로 각각 절단하였다. 상기 단편(hTERT1 -398)과 절단된 pET28a(+) 벡터를 전기영동으로 분리하여 상용의 키트(QIAquick Gel extraction kit; Qiagen, USA)을 사용하여 정제하였다. 이를 혼합하여 T4 DNA 연결효소(ligase; Takara, 일본)를 사용하여 16℃에서 12시간 반응시킨 후, JM109 감응세포(supercompetent cell)에 형질전환 하였다. 라이게이션 결과 생성된 재조합 발현 벡터를 pET28a(+)-hTERT1 -398이라고 명명하였다.
pGEM-T Easy-hTERT398 -716 벡터에 대해서는 상기 벡터 및 pET28a(+) 벡터를 SacⅠ과 Sal I으로 절단한 것을 제외하고 상기 방법과 동일하게 하여 재조합 발현 벡터 pET28a(+)-hTERT398 -716를 제조하였다.
pGEM-T Easy-hTERT716 -1132 벡터에 대해서는 상기 벡터 및 pET28a(+) 벡터를 Sal I과 Hind III로 절단한 것을 제외하고 상기 방법과 동일하게 하여 재조합 발현 벡터 pET28a(+)-hTERT716 -1132를 제조하였다.
각각의 재조합 발현 벡터에 형질 전환된 유전자는 EcoRⅠ과 SacⅠ, SacⅠ과 Sal I, 그리고 Sal I과 Hind III의 제한효소로 각각 절단한 후 아가로즈 겔 전기영동과 DNA 서열분석을 통하여 상기 형질 전환된 유전자가 인간 텔로머라제 역전사효소의 유전자를 확인 하였다. 제한효소를 이용한 실험 결과는 도 2에 나타내었다.
이후 pET28a(+)-hTERT1 -398 벡터를 SacⅠ과 Sal I으로 37℃에서 6시간 반응시켜 절단한 다음 SacⅠ과 Sal I으로 절단되어진 hTERT398 -716 유전자 단편을 T4 DNA 연결효소를 이용하여 16℃에서 12시간 반응시켰다. 라이게이션 결과 생성된 pET28a(+)-hTERT1 -398+hTERT398 -716를 JM109 감응세포로 형질 전환하였다. 형질 전환된 대장균을 50㎍/㎖의 카나마이신(kanamycin)이 포함된 평판 L-브로쓰(Broth)에서 12시간 배양한 후 EcoRⅠ과 Sal I으로 hTERT1 -398+hTERT398 -716 단편을 모두 포함하고 있는 형질전환체를 선별하였다.
pET28a(+)-hTERT716 -1132에 삽입되어 있는 hTERT716 -1132 유전자는 내부에 Sac I 제한효소자리를 포함하고 있기 때문에 이를 제거하기 위해 서열번호 9 (5'-GTCGTCATCGAGCAGTCCTCCTCCCTGAATG-3') 및 서열번호 10 (5'-CATTCAGGGAGGAGGACTGCTCGATGACG-3')의 프라이머를 합성하여 부위 특이적 변이법 (site-directed mutagenesis)을 이용하여 내부의 Sac I 제한효소자리를 제거하였으며, 서열분석을 통하여 내부의 Sac I 제한 효소 자리가 제거가 되었는지 확인하였다(결과미도시).
이후, pET28a(+)-hTERT1 -398+hTERT398 -716 벡터를 Sal I과 Hind III로 37℃에서 6시간 반응시켜 절단한 다음 상기의 Sac I의 제한효소자리가 제거된 pET28a(+)-hTERT716 -1132에서 Sal I과 Hind III로 절단되어진 hTERT716-1132유전자 단편을 T4 DNA 연결효소를 이용하여 16℃에서 12시간 반응시켰다. 라이게이션 결과 생성된 pET28a(+)-hTERT1 -398 +hTERT398 -716+hTERT716 -1132를 JM109 감응세포로 형질전환하였다. 형질전환된 대장균을 50㎍/㎖의 카나마이신(kanamycin)이 포함된 평판 L-브로쓰에서 12시간 배양한 후 EcoRⅠ과 Hind III로 hTERT1 -398+hTERT398 -716+hTERT716 -1132 단편을 모두 포함하고 있는 형질전환체를 선별하였으며, 상기 형질전환체에 삽입된 벡터를 최종적으로 pET28a(+) -hTERT 라고 명명하였다.
이와 같은 일련의 클로닝 과정은 도 1에 나타내었다.
< 실시예 2>
pET28a (+)- hTERT 를 이용한 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소의 발현 및 정제
<2-1> 인간 텔로머라제 역전사효소의 발현을 위한 균주 제작
대장균 BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL(Stratagene, USA) 균주는 argU , proL tRNA를 코드하고 있는 유전자를 포함하는 ColE1-compatible pACYC-based plasmid와 argU, ileY, leuW tRNA를 코드하고 있는 유전자를 포함하는 colE1-과 pACYC-compatible pSC101-based plasmid를 포함하고 있다. 상기 균주에서 상기 플라스미드 벡터들을 분리하기 위하여, 상기 대장균 균주를 34 μg/ml 클로람페니콜(chloramphenicol)과 75 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 LB 배지에 37℃에서 12시간동안 배양한 후 상기 균주에 포함되어 있는 두 종류의 플라스미드 벡터를 분리하였다. 이를 mRNA를 분해하는 RNase 활성이 결여되어 있어 mRNA의 안정성을 높여주는 균주인 대장균 BL21(DE3) star(Novagen, USA)에 동시에 형질 전환(co-transformation)시켰다. 형질 전환된 대장균(이를 대장균 BL21(DE3) star-codon plus라고 명명)를 34 μg/ml 클로람페니콜, 75 μg/ml 스트렙토마이신이 포함된 평판 LB배지에서 12시간 배양한 뒤 상기의 두 종류 플라스미드를 분리하고 확인하였다. 대장균 BL21(DE3) star에 형질 전환되어진 두 종류의 플라스미드의 안정성을 확인하기 위하여 총 6번에 걸친 계대배양을 실시하여 플라스미드의 유실여부를 확인한 결과 두 종류의 플라스미드 모두 유실되지 않고 안정적으로 유지되고 있음을 확인하였다(도 3).
<2-2> 인간 텔로머라제 역전사효소의 발현 및 정제
실시예 1에서 제조한 재조합 발현 벡터 pET28a(+)-hTERT를 실시예 <2-1>에서 제조한 BL21(DE3) star-codon plus에 도입하고, 형질전환된 대장균을 50μl/ml의 카나마이신, 34 μg/ml 클로람페니콜 및 75 μg/ml 스트렙토마이신이 포함된 LB 배지 1L에서 37℃에서 2시간 배양하여 선별 및 배양하였다.
발현을 위한 최적의 조건을 확립하기 위하여, 배양단계별(OD600 = 0.6∼0.7 또는 OD600 = 0.9∼1.0) 또는 IPTG(isopropyl β-D-thoigalactopyranoside) 첨가량(0.1mM 또는 1.0mM)을 달리하여 인간 텔로머라제 역전사효소의 발현 정도를 SDS-PAGE와 텔로머라제 역전사효소 항체(Abcam, USA)를 이용한 웨스턴 블럿(Western Blot)을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 600nm에서의 흡광도가 0.6-0.7 되었을 때 IPTG를 최종농도가 0.1 mM이 되도록 투입하였을 때 가장 많은 텔로머라제 역전사효소를 합성하는 것으로 나타났다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 텔로머라제 역전사효소의 분자량은 약 130kDa인 것으로 나타났다.
본 발명의 재조합 텔로머라제 역전사효소는 다음과 같은 방법에 의해 정제하였다: 효소의 합성을 유도하고, 8시간동안 배양한 후, 8,000g에서 10분간 원심분리하여 균을 집균하였다. 완충용액(500mM NaCl, 20mM 트리스-염산(Tris-HCl), pH7.9)을 가하여 균을 균질화하고, 초음파 파쇄기(Sonics amp; Materials INC.)를 이용하여 4℃에서 30~40 와트, 앰플리튜드(amplitude) 8% 의 조건으로 9초 동안 펄스(pulse)를 가하고 1초 동안 멈추기를 반복하여 15분간 균을 파괴하였다. 이후, 10,000g에서 30분간 원심분리하여 다른 단백질 찌꺼기를 제거한 조추출물을 수득하였다. 상기 조추출물을 His 바인드 레진 크로마토그래피(His bind resin chromatography, Novagen, USA)에 도입하여 흡착시킨 다음 불필요한 단백질을 제거하기 위해 완충용액(50mM imidazol, 500mM NaCl, 20mM 트리스-염산(Tris-HCl), pH7.9)으로 충분히 세척하였다. 이때 세척은 세척된 액의 OD280 값을 측정하여 OD280=0이 될 때까지 세척하였다. 이후, 완충용액(50mM imidazol, 500mM NaCl, 20mM 트리스-염산(Tris-HCl), pH7.9)로 1㎖/min의 속도로 용출시켰다. 용출액에 포함된 이미다졸의 제거 및 텔로머라제 활성 완충 용액으로 교환하기 위하여 다른 완충용액(3mM MgCl2, 6mM KCl, 1mM EGTA, 1mM DTT, 20mM 트리스-염산(Tris-HCl), pH7.5)을 사용하여 8시간씩 3회 투석하였다. 정제된 티로시나제의 순도를 SDS-PAGE로 확인하였다(도 4B 참조).
< 실시예 3>
인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트의 분리
<3-1> 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트의 클로닝
인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트를 제조하기 위하여 진뱅크에 등재된 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트의 유전자(Genbank Accession No. U86046)서열을 이용하여 각각 서열번호 11 (정방향 프라이머, 5'-GGGCCCGGGTTGCGGAGGGTGGGCCTGGGAG-3' ) 및 서열번호 12 (역방향 프라이머, 5'-GAGCTCGCATGTGTGAGCCGAGTCCTG GGTGC-3')의 프라이머를 합성하였다. 상기 프라이머는 상기 유전자의 전사 시작 부위(transcription start site)인 95번 염기부터 450번 염기까지의 유전자 서열을 증폭할 수 있도록 디자인된 것이며, Apa I과 Sac I 제한효소 부위를 추가하였다.
헬라셀의 게놈(HeLa cell genomic DNA)을 주형으로 하고, 상기의 방법으로 합성한 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머를 사용해 PCR법을 이용하여 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트 유전자를 증폭하였다. PCR 반응은 상기의 주형 유전자 100ng, 0.2mM dNTP 혼합물, 0.6μM 프라이머, 10× Z-Taq 완충용액 5㎕, Z-Taq 폴리머라제 1㎕를 포함하는 반응액을 최종 부피 50㎕ 반응액으로 하여 수행하였다. PCR 반응 조건은 먼저 94℃에서 30초 동안 열 변성(denaturing), 64℃에서 1분 동안 어닐링(annealing), 폴리머라제에 의한 유전자 합성은 72℃에서 30초 동안 실시하였다. 이 조건을 1 cycle로 하고, 이것을 반복하여 35 cycle 반응시켰다. 반응이 끝난 후 2.0% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 증폭된 생성물을 확인한 뒤, 생성물을 yT&A Cloning 벡터(RBC, Taiwan)와 실온에서 5분간 반응시킨 후, 42℃에서 1분간 열 충격을 가해 균주(TOP10 one shot supercompetent cell; Invitrogen, USA)에 형질전환 시키고 이를 yT&A-hTR이라고 명명하였다.
yT&A-hTR 유전자와 pGEM-T Easy 벡터를 제한효소 ApaⅠ과 SacⅠ을 이용하여 37℃에서 6시간 반응시켜 절단하였다. 이를 2.0% 아가로즈 겔 전기영동으로 단편을 분리하고, 상용의 키트(QIAquick Gel Extraction Kit)을 이용하여 각각 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트 유전자 및 pGEM-T easy 벡터를 분리하였다. 분리된 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트 유전자와 pGEM-T easy 벡터를 T4 DNA 연결효소를 이용하여 16℃에서 12시간 반응시켰다. 라이게이션 결과 생성된 유전자를 pGEM-hTR이라고 명명하고 감응세포인 대장균 XL1-Blue로 42℃에서 2분간 열충격을 가하여 형질 전환하였다. 형질 전환된 대장균 XL1-Blue를 50㎍/㎖의 암피실린이 포함된 평판 LB 배지에서 12시간 배양하여 선별한 뒤, 선별된 대장균에서 다시 벡터를 분리하고 이의 DNA 서열을 분석하여 pGEM-T easy 벡터 내부로 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트 유전자가 클로닝되었음을 확인하였다.
<3-2> 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트의 합성 및 분리
상기의 형질전환된 대장균으로부터 분리된 pGEM-hTR을 제한효소 Sac I 자리의 3’ overhang을 방지하기 위해 Sac I의 네오스키조머(neoschizomer)인 Ecl136II (Fermentas, Canada)를 이용하여 37℃에서 6시간 반응시켰다. 선형화 되어진 pGEM-hTR를 상용의 키트(QIAquick Gel Extraction Kit)를 이용하여 선형화에 이용한 제한 효소 제거 및 인비트로(in vitro) 전사를 위한 완충용액 교환을 실시하였다. 선형화 되어진 pGEM-hTR을 주형으로 ATP, CTP, GTP, UTP 각각 2㎕와 T7 RNA 폴리머라제 2㎕, 10× 반응 완충 용액 2㎕를 반응 튜브에 넣고 총 반응용액 부피를 20㎕로 하여 37℃에서 2시간동안 반응시켰다. 반응 후 1㎕의 디엔네이즈(DNase)를 반응튜브에 넣고 37℃에서 15분 동안 반응시켜 주형으로 사용된 DNA를 제거하였다. 생성된 RNA는 상용의 키트(MEGAclear kit; mbion, USA)를 이용하여 RNA를 제외한 다른 불순물을 제거 및 정제를 실시하였다.
정제된 RNA는 도 5에 나타난 바와 같이, 8% Urea-PAGE를 이용하여 전기영동을 수행한 결과 452뉴클레오티드(nt)를 가지는 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트임을 확인할 수 있었다.
< 실시예 4>
활성화된 인간 텔로머라제 역전사효소의 제조
<4-1> 인간 텔로머라제 역전사효소의 인산화
인간 텔로머라제 역전사효소의 인산화를 위해 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소(protein kinase Cα kinase; Upstate, USA)를 사용하였다. 인산화효소는 제조사에서 제공하는 activator에 의해 활성화시켰다.
인간 텔로머라제 역전사효소의 최적의 인산화를 위해 Microcon YM-50 (Amicon, USA)를 이용하여 인산화효소에 적합한 인산화 효소 완충용액(kinase reaction buffer, 제조사 제공)으로 완충 용액 교환을 실시하였다. 이 후, 인간 텔로머라제 역전사효소가 들어있는 반응튜브에 활성화시킨 10ng의 인산화효소(2.5μl)와 ATP를 최종농도가 200μM이 되도록 첨가한 후 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 인산화를 시킨 인간 텔로머라제 역전사효소는 텔로머라아제의 활성을 측정을 위해 Microcon YM-50을 이용하여 완충용액(20mM Tris-Hcl (pH 7.5)에 3mM MgCl2, 6mM KCl, 1mM EGTA, 1mM DTT)으로 버퍼교환을 실시하였다.
<4-2> 인간 텔로머라제 역전사효소와 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트의 재구성
상기 실시예 4-1에서 인산화되어진 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT)와 상기 실시예 3-2에서 합성 및 분리된 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트(hTR)를 혼합하여 33℃에서 30분간 재구성하였다.
이 때, 재구성시 최적의 텔로머라제 활성을 위한 인간 텔로머라제 역전사효소와 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트의 혼합 비율을 결정하기 위해서 다음과 같이 다양한 농도의 인간 텔로머라제 역전사효소와 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트 혼합하였다: hTERT 100ng에 대해서 hTR 각각 0ng, 10ng, 20ng, 30ng, 40ng, 50ng, 60ng, 70ng, 80ng, 90ng, 100ng, 110ng, 120ng 및 hTR 50ng에 대해서 hTERT 각각 0ng, 5ng, 10ng, 15ng, 20ng, 30ng, 35ng, 40ng, 45ng, 50ng, 55ng, 60ng, 65ng. 이들의 각각의 텔로머라아제 활성을 아래와 같이 측정을 하였다.
<4-3> 텔로머라아제 활성 측정
텔로머라제 정성적 활성 측정을 위하여 상용의 키트(Trapeze telomerae detection kit; Chemicon, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라서 수행하였다. 50× dNTP 혼합물 1㎕, 10× 반응완충용액(200 mM 트리스-염산 (pH 8.3), 15 mM MgCl2, 230 mM KCl, 0.5% Tween 20, 10 mM EGTA)과 TS 프라이머 1.0 ㎕, TRAP 프라이머 혼합물 1.0 ㎕, Taq 폴리머라제 (5 units/) 0.4 ㎕를 반응튜브에 넣은 뒤 상기 실시예 4-2에서 재구성시킨 혼합물 넣고 교반하였다. 텔로머라아제 활성을 측정하기 위해 30℃에서 30분간 반응시킨 뒤, 합성된 텔로미어 말단 부분의 증폭을 위해 94℃에서 30초, 59℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분 동안을 1 cycle로 총 33 cycle을 반응시킨 후, 10% 폴리아크릴아마이드겔(PAGE)를 이용하여 텔로머라아제 활성을 확인하였다.
또한, 텔로머라제의 정량적 활성 측정을 위해서는 상용의 키트(Trapeze XL telomerae detection kit; Chemicon, USA)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. TS 프라이머, RP Amplifluor 프라이머, K2 Amplifluor 프라이머, TSK2 주형, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 완충 용액(7.5 mM MgCl2, 315 mM KCl, 0.25% Tween 20, 5 mM EGTA, 0.5 mg/mL BSA, 100 mM 트리스-염산 (pH 8.3)) 10㎕, Taq 폴리머라제 (5 units/) 0.4㎕를 반응튜브에 넣어 잘 교반한 후에 상기 실시예 4-2에서 재구성시킨 혼합물 넣고 텔로머라아제 활성을 측정하기 위해 30℃에서 30분간 반응시켰다. 합성된 텔로미어 말단 부분의 증폭을 위해 94℃에서 30초, 59℃에서 30초, 그리고 72℃에서 1분동안을 1 cycle로 총 33 cycle을 반응시켰고 이 후 55℃에서 25분간 반응시키고 즉시 4℃로 냉각시켰다. 각각의 반응액 20㎕에 0.15 M NaCl와 2 mM MgCl2가 포함된 10 mM 트리스-염산 (pH 7.4)을 넣고 잘 교반한 후 495 nm에서 여기(勵起; exitation) 시키고, 516 nm에서 방출(emition)시켜 정성 분석을 실시하였다. 각각의 측정 샘플당 3회 이상 측정하고 그 평균값을 계산하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에서의 대장균을 이용하여 발현시킨 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소가 in vitro 텔로머라아제 활성을 보이게 하기 위해서는 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트가 반드시 필요한 것으로 나타났다. 또한, in vitro상에서 최적의 텔로머라제 활성은 인간 텔로머라제 역전사효소와 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트를 동량을 넣었을 경우에 나타났다.
또한, 본 발명에서의 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소의 경우, 번역후 수식과정(post-translational modification) 중의 하나인 인산화가 진행되지 않기 때문에 인산화효소를 사용하여 인위적으로 인산화를 시켜주어야만 텔로머라제 활성을 복원할 수 있었다.
< 실시예 5>
활성화된 인간 텔로머라제 역전사효소의 제조
<5-1> 인간 텔로머라제 역전사효소의 인산화
인간 텔로머라제 역전사효소의 인산화를 위해 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소대신 Akt 단백질 인산화효소(Akt protein kinase; Upstate, USA)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 <4-1>과 동일하게 하여 본원발명의 인간 텔로머라제 역전사효소를 인산화하였다.
<5-2> 인간 텔로머라제 역전사효소와 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트의 재구성
상기 실시예 5-1에서 인산화되어진 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT)와 상기 실시예 3-2에서 합성 및 분리된 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트(hTR)를 혼합하여 33℃에서 30분간 재구성하였다. 이 때 재구성은 상기 실시예 <4-2>에서와 동일한 방법으로 수행하였다.
<5-3> 텔로머라아제 활성 측정
상기 실시예 <5-2>에서 재구성한 혼합물을 이용한 것을 제외하고는 상기 실시예 <4-3>과 동일하게 하여 텔로머라아제 활성을 각각 정성적 및 정량적으로 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명에서의 대장균을 이용하여 발현시킨 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소가 in vitro 텔로머라아제 활성을 보이게 하기 위해서는 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트가 반드시 필요한 것으로 나타났다. 또한, in vitro상에서 최적의 텔로머라제 활성은 인간 텔로머라제 역전사효소와 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트를 동량을 넣었을 경우에 나타났다.
또한, 본 발명에서의 재조합 인간 텔로머라제 역전사효소의 경우, 번역후 수식과정(post-translational modification) 중의 하나인 인산화가 진행되지 않기 때문에 인산화효소를 사용하여 인위적으로 인산화를 시켜주어야만 텔로머라제 활성을 복원할 수 있었다.
이 때, 텔로머라제 활성에 대해서 Akt 단백질 인산화효소에 의한 인간 텔로머라제 역전사효소의 인산화의 결과(도 7 참조)와 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소에 의한 인간 텔로머라제 역전사효소의 인산화의 결과(도 6 참조)를 비교한 결과 Akt 단백질 인산화효소에 의한 인산화에 의한 활성이 더 크게 나타난 것으로 나타났다. 이러한 실험 결과는 인간 텔로머라제 역전사효소의 특정 부위의 인산화가 텔로머라제 활성을 나타내기 위한 인간 텔로머라제 역전사효소의 활성 상태를 다르게 유도함을 의미한다.
< 실시예 6>
Abl 티로신 인산화효소에 의한 텔로머라제 활성 변화 측정
실시예 <4-1>에서 인산화시킨 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소 및 실시예 <5-1>에서 인산화시킨 Akt 단백질 인산화효소를 사용하여 각각 인산화시킨 인간 텔로머라제 역전사효소를 Abl 티로신 인산화효소(Abl tyrosine kinase; New England Bio Lab, England)를 이용하여 이를 다시 인산화하여 텔로머라제 활성의 변화를 측정하였다.
실시예 <4-1> 또는 실시예 <5-1>에서의 인간 텔로머라제 역전사효소의 인산화 후 완충용액(20mM Tris-Hcl (pH 7.5)에 3mM MgCl2, 6mM KCl, 1mM EGTA, 1mM DTT)으로 버퍼교환을 실시하기 전, Microcon YM-50을 사용하여 제조사에서 제공하는 Abl 티로신 인산화효소용 완충용액(kinase reaction buffer)으로 완충 용액 교환을 실시하였다. 이 후, 인간 텔로머라제 역전사효소가 들어있는 반응튜브에 10ng의 Abl 티로신 인산화효소와 ATP를 최종농도가 200 μM이 되도록 첨가한 후 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
이후, 실시예 <4-2> 및 <4-3>에서와 동일한 방법으로 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트와 재구성하고, 텔로머라제 활성을 정성적 및 정량적으로 측정하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, Abl 티로신 인산화효소를 처리한 결과 Akt 단백질 인산화효소와 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소에 의해 활성화되어 복원된 인간 텔로머라제 역전사효소 활성이 억제되었으며, Akt 단백질 인산화효소에 의해 활성화된 인간텔로머라제 역전사효소의 텔로머라제 활성이 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소에 의한 경우보다 크게 텔로머라제 활성이 저해되었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 이용하면 대장균에서 효율적으로 인간 텔로머라제 역전사효소를 제조할 수 있으며, 아울러 인산화효소로 인산화하고, 인간 텔로머라제 RNA 컴포넌트로 재구성하여 활성화된 인간 텔로머라제 역전사효소를 제조할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 pET28a(+)-hTERT인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  4. 제2항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환세포.
  5. 제4항에 있어서, 상기 형질전환세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 형질전환세포.
  6. 제5항에 있어서 상기 대장균은 ColE1-compatible pACYC-based plasmid및 colE1-과 pACYC-compatible pSC101-based plasmid를 추가로 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 형질전환세포.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 형질전환세포를 배양하는 것을 포함하는 인간 텔로머라제 역전사효소의 제조방법.
  8. (a) 제7항의 제조방법에 의해 제조된 인간 텔로머라제 역전사효소를 분리, 정제하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 분리, 정제된 효소를 단백질 인산화효소 Cα 인산화효소(protein kinase Cα kinase) 또는 Akt 단백질 인산화효소(Akt protein kinase)로 인산화하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 인산화된 효소와 서열번호 2의 RNA를 혼합하여 재구성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 활성화된 인간 텔로머라제 역전사효소의 제조방법.
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Cell, Vol.90: 785-795(1997) *
EMBO J., Vol.19:2652-2661(2000) *

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