JP2001502547A

JP2001502547A - 新規代謝経路の生成およびスクリーニングのための方法

Info

Publication number: JP2001502547A
Application number: JP10519751A
Authority: JP
Inventors: ピーターソン，トッド，シー．; フォスター，リンドン，エム．; ブライアン，ポール
Original assignee: クロマクスオムコーポレーション
Priority date: 1996-10-24
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2001-02-27
Also published as: ZA979557B; KR20000052795A; AU5163298A; WO1998017811A1; US5783431A; EP0951557A1; EP0951557A4; AU744960B2; IL129577A0; CA2269123A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、分子多様性(molecular diversity)を生成しかつスクリーニングするための新規な薬物探索システムに関する。このシステムは、コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリー中の複数の生物種由来の遺伝物質を混合しクローニングして、新規な代謝経路および新規なクラスの化合物を生成させるための方法を提供する。このシステムはまた、発現させるために宿主生物の１つの種から別の種へ導入することができる移動可能なコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーを提供する。また、移動可能な遺伝子発現ライブラリーを作製するための特殊なクローニングベクターも提供する。このシステムはまた、このような新規な経路および化合物を生成することができるライブラリー含有宿主生物を前もってスクリーニングしまたは同定するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】新規代謝経路の生成およびスクリーニングのための方法本出願は、1996年４月24日に提出された出願番号08/639,255の一部継続出願であり、その全内容は引用により本明細書に含まれるものとする。１．発明の分野本発明は、薬物を探索するための新規アプローチに関する。より詳細には、本発明は、良好または有望な薬物供給源である生物のゲノムを保存するためのシステム、１以上の生物種からの遺伝物質をランダムに組み合わせて新規代謝経路を生成するためのシステム、およびそのような遺伝的に操作された細胞を予備スクリーニングまたはスクリーニングして新規生化学的経路を生成させ新規化合物クラスを生成させるためのシステムに関する。そのような新規のまたは再構成された代謝経路は、そのような化合物の商業的生産に有用でありうる。２．発明の背景２．１．薬物リードの供給源薬物の探索における基本的な挑戦は、所望の活性を有するリード化合物を同定し、薬物のさらなる開発を続行するのに要求される基準を満たすようそのリード化合物を最適化することである。薬物の探索のための一般的な１つのアプローチには、疾患を引き起こすのに関与している巨大分子（疾患標的）を、潜在的薬物候補の治療活性を試験するバイオアッセイにおいて提示することが含まれる。そのような分子としては、受容体、酵素または転写因子が考えられる。もう１つのアプローチは、その疾患の原因因子を表す全細胞または生物を提示することが含まれる。そのような因子としては、細菌、腫瘍細胞系が挙げられる。伝統的には、潜在的薬物候補には２つの供給源（集積されている天然産物および合成化学物質）がある。リード化合物の同定は、可能な限り広範な構造型を含むそのような集積体のランダムスクリーニングにより達成されている。合成コンビナトリアル化学ライブラリーが最近開発されたことにより、スクリーニングに利用しうる化合物の数および多様性はさらに増加するであろう。しかしながら、あらゆる合成化学ライブラリーの多様性は、人間の想像および合成技術に限定される。土壌細菌、真菌、無脊椎動物、植物などの供給源からの天然産物のランダムスクリーニングの結果、多数の重要な薬物が探索された(Francoら，1991，Critica l Rev Biotechnol 11:193-276;Goodfellowら，1989，“Microbial Products:New Approaches”，Cambridge University Press，pp．343-383;Berdy 1974，Adv A ppl Microbiol 18:309-406;Suffnessら，1988，Biomedical Importance of Mari ne Organisms，D.G．Fautin，California Academy of Sciences，151-157頁)。これらの天然産物の10,000以上は生物学的に活性であり、これらの少なくとも10 0が、抗生物質、農薬および抗癌剤として現在使用されている。薬物を探索するためのこのアプローチが成功するか否かは、スクリーニングプログラムに加える化合物の数に大きく左右される。典型的には、製薬会社は、無数の天然および合成化合物を含有する化合物集積体をスクリーニングしている。しかしながら、既に探索されている化合物に対する新規化合物の比率は、時と共に減少している。例えば、抗癌剤のスクリーニングでは、生物学的に活性な微生物種のほとんどが、既に特徴づけされている化合物を与えることがある。これは１つには、新規天然産物サンプルを一貫して適切に見い出し、再生産し、供給するのが難しいことによる。生物学的多様性はその根底にある分子多様性により大きく左右されるため、ランダムスクリーニング用に現在選択されている生物の生物学的多様性が不十分であれば、新規化合物が単離される可能性は減少してしまう。新規の生物活性が種々の天然供給源から一貫して見出されている。例えば、Cr aggら，1994(“Enthnobotany and the search for new drugsi”，Wiley，Chich ester，p.178-196)を参照のこと。これらの供給源のうち、新規薬物リードが系統的かつ徹底的に探索されているものは少ない。例えば、可能な医学用途について徹底的に研究されているのは、わずか5000種の植物しかないと推定されている。これは、ほとんどが熱帯地方で成長する推定総数250,000〜3,000,000種のほんの一部である(Abelson 1990，Science 247:513)。さらに、何百万種と推定される海洋微生物のうち、特徴づけされているのば少数しかない。それどころか、莫大な生物多様性が、リード化合物の供給源として依然利用されていないのである。歴史的には、土壌微生物、真菌、無脊椎動物および植物が天然産物の供給源として利用されてきた。しかしながら、薬物スクリーニングおよび商業的生産のために開発されている放線菌などのいくつかのよく研究されている生物群を除き、再現性および生産上の問題が依然として存在している。例えば、抗腫瘍薬であるタキソールは、成熟した北米原産イチイの樹皮の構成成分であり、その臨床薬としての供給により地域生態系が損なわれるとの懸念が生じている。タキソールは、11個のキラル中心を含有し、2048個のジアステレオマーが考えられるため、そのde novo合成は商業的規模では実現しそうにない(Phillipson，1994，Trans Ro yal Soc Trop Med Hyg 88 Supp 1:17-19)。海洋無脊椎動物は新規化合物の有望な供給源であるが、薬物スクリーニングおよび大規模再供給を行う技術に大きな欠点がある。例えば、海洋無脊椎動物は再採集が難しく、天然産物含量が季節的に変動するものが多い。海洋微生物は新規化合物の有望な供給源であるが、海洋微生物を用いて薬物スクリーニングおよび産業的発酵を行う技術に大きな欠点がある。例えば、海洋微生物は、採集、樹立、および培養中の維持が難しく、特定の栄養要件を有するものが多い。一般には、信頼しうる未汚染海水源が発酵に必須である。海洋細菌種の少なくとも99％は、実験用培地上では生存できない。さらに、入手可能な市販の発酵装置は、食塩水条件中または高圧下での使用に最適とはいえない。さらに、特定の微生物相互間でおよび環境と相互作用した場合にのみ天然に生じる化合物もあるらしい。病原体は、植物遺伝子発現を改変し、植物が攻撃に抵抗するのを可能にするフィトアレキシンなどの化合物の合成を誘発させうる。例えば、野生タバコ植物であるニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestr is）は、マンダカ・セクスタ（Manduca sexta）の幼虫から攻撃されている際、そのアルカロイド合成を増強する。同様に、真菌がフィトアレキシンに反応しうるが、これは、解毒したりその蓄積を防ぐことによるものである。真菌をその植物宿主と共に評価しない伝統的な高処理量スクリーニングでは、そのような代謝産物は見逃されるであろう。生物に対する自然環境の影響の劇的な例は、ヤドクガエルで認められる。野外標本では、その腺背部を横切るように吹矢の先端をこすることにより、ナトリウムチャンネルアゴニストアルカロイドであるバトラコトキシンの致死量が採集できるが、陸生動物飼育器で飼育された第２世代のカエルからはバトラコトキシンを検出することができなかった(Daly，1995，Proc．N atl．Acad．Sci．92:9-13)。もし伝統的な薬物スクリーニング技術のみを利用するのであれば、これらの潜在的に貴重な分子は決して探索されないかもしれない。さらに、ランダムスクリーニングにより探索されたリード化合物の効力、選択性、生物学的利用能または安定性が適当でないことがあるため、その化合物が薬になることは稀である。リード化合物を構造的に修飾してその最初の活性を改良するには、典型的には、一定量のリード化合物が必要となる。しかしながら、天然供給源（特に、植物）からのリード化合物の合成および開発のための現在の方法は、比較的非効率的である。薬物開発の種々の段階に伴う重大な障害があり、例えば、再採集、薬物産生生物の成長、複製解除(dereplication)、株改良、培地改良、大規模生産などである。これらの問題は、新規化合物の臨床試験を遅らせ、薬物リードのこれらの新規供給源を用いる経済性に影響を与える。現在、天然産物の前記の海洋、植物および動物供給源は、十分に利用されていない。リード化合物の生成・スクリーニングに現在利用しうる方法が、これらの未探索供給源に有効に適用されることはありえない。いくつかの土壌細菌および真菌と異なり、これらの薬物産生生物は、産業的発酵技術に容易になじまない。同時に、薬物の新規供給源を見出さねばという重圧が、新たな高効率かつ高処理量のスクリーニング技術により増大する。したがって、これらの未利用の化合物供給源の遺伝資源および化学的多様性を利用する方法が、薬物探索のために一般に必要とされている。２．２．発現ライブラリーつい最近になって、薬物探索プログラムは、作用機序に基づく探索スクリーニングに移行した。分子標的が同定されたら（例えば、その疾忠の調節に関与するホルモン受容体）、その標的と分子レベルで相互作用する治療薬を同定および／または合成するためのアッセイを設計する。その標的分子を同定し、研究し、生成させるためには、遺伝子発現ライブラリーを用いる。発現クローニングは、タンパク質の物理的特性を知ることなく、単一のタンパク質をコードする標的遺伝子を得るための通常の方法となっている。ヒトおよび哺乳動物の組織から作製された遺伝子発現ライブラリーをスクリーニングして同定された多くのタンパク質は、潜在的な疾患標的、例えば受容体(S imonsenら，1994，Trends Pharmacol Sci 15:437-441;Nakayamaら，1992，Curr Opin Biotechnol 3:497-505;Aruffo，1991，Curr Opin Biotechnol，2:735-741) 、およびシグナル伝達タンパク質（Margoliaら，US5,434,064）である。哺乳動物細胞中での機能的発現クローニングにより同定されたタンパク質の具体例に関しては、Seedら，1987，Proc Natl Acad Sci 84:3365-3369;Yamasakiら，1988， Science 241:825-828;およびLinら，1992，Cell 68:775-785（III型TGF-β受容体）を参照のこと。疾患標的が同定されている場合は、そのタンパク質標的またはそのタンパク質標的を発現するよう操作された宿主細胞が、リード化合物をスクリーニングするための生物学的アッセイにおいて使用されている(Luytenら，1993，Trends Biot echnol 11:247-54)。したがって、薬物探索の計画においては、遺伝子発現ライブラリーの使用は、主として、潜在的なタンパク質疾患標的の同定および生成に限定されている。その薬物がタンパク質または小さなペプチド（例えば、抗体）である場合に限り、所望の生物活性を有する分子を生成させスクリーニングするために発現ライブラリーが作製されている(Huseら，1991，Ciba Foundation Sym p 159:91-102)。しかしながら、薬物探索に関連した遺伝子発現ライブラリーには、他の用途もある。医薬的に活性な代謝産物および特殊な化学物質を与える生合成経路に関与する遺伝子を同定するために、微生物の遺伝子ライブラリーが作製されている。これらの経路には、複数のタンパク質（特に、酵素）が必要であり、単一のタンパク質を薬物標的として用いる場合よりも大きな複雑さを伴う。例えば、細菌ポリケチドシンターゼ（PKS）の経路をコードする遺伝子が、その生物の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることにより同定された(Malpartidaら，1984，N ature 309:462;Donadioら，1991，Science 252:675-679)。PKSは、重要な治療化合物クラスであるポリケチドの生合成の複数工程を触媒し、生成したポリケチドの構造的多様性を制御する。クローン化PKS遺伝子の指令された突然変異および発現を可能にするストレプトミセスにおける宿主−ベクター系が開発されている (McDanielら，1993，Science 262:1546-1550;Kaoら，1994，Science 265:509-51 2)。この特異的宿主−ベクター系は、より効率的なポリケチドの製造法を開発し、新規ポリケチドを合理的に開発するのに使用されている(Khoslaら，WO95/0854 8)。もう１つの例は、大腸菌宿主中での発酵による、繊維染料であるインジゴの製造である。外来性大腸菌宿主によるインジゴの製造を改良するために、多酵素生合成経路をコードする遺伝子を含有する２つのオペロンが遺伝的に操作されている(Ensleyら，1983，Science 222:167-169;Murdockら，1993，Bio/Technology 1 1:381-386)。全般的には、代謝経路をコードする遺伝子の異種発現の通常の研究には、指令されたクローニング、配列分析、設計された突然変異、および既に特徴づけされている代謝経路に関与していることが知られているタンパク質をコードする特定の遺伝子の再配列が含まれる。疾患メカニズムの理解および薬物標的の同定における著しい進歩を考慮すると、リード化合物を迅速に同定し、それを臨床試験につなぐための革新的な戦略および方法の必要性がますます増大している。３．発明の概要本発明は、薬物探索の目的で分子多様性を生成させてスクリーニングするための薬物探索システムを提供する。本発明の方法は、薬物リード化合物の既知のまたは有望な供給源である生物の遺伝物質をコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリー中に捕捉し保存する。一つの態様において、本発明は、微生物、植物、動物を含めたドナー生物（特に、自然界で実質的な量を回収できないもの、または実験室で培養できないもの）の１以上の種からのコンビナトリアル天然経路遺伝子発現ライブラリーの構築を包含する。プール中のドナー生物は、それらの既知の生物学的性質に基づいて選択することができ、また、それらは自然界から採集された既知のおよび／または未確認の生物種の混合物であってもよい。ドナー生物のゲノムのランダム断片( そのうちの幾つかは生化学的経路の全体またはその一部を含む)がクローニングされ、宿主生物において発現される。本発明によると、クローニングされたＤＮＡの遺伝子産物のサブセットは、宿主生物内で機能する能力がある。かくして、ドナー生物の自然界に存在する経路を宿主生物内で再構築することができる。あるいは、異種宿主の異なる生理学的および調節的環境でのドナー遺伝子の発現は、隠れていた代謝経路を暴き出すことができる。また、ドナー生物の代謝経路が宿主生物に内在する代謝経路と相互に作用して、新規な化合物または通常では宿主生物によって産生されない化合物を生成させることもできる。さらに、限定されたサブセットのドナー生物遺伝子のみが同時に発現されるので、このシステムにより、すでに特性付けられた宿主生物の生化学的／細胞的バックグラウンドから代謝経路および化合物を比較的容易に検出することが可能である。本質的に、これらドナー生物の遺伝子供給源は、別の薬物探索計画において反復して繰り返し使用することのできる遺伝子発現ライブラリー中に捕捉されかつ保存される。もう一つの態様において、本発明は、１以上のドナー生物種由来の遺伝物質がランダムに組み合わされ、クローニングされ、宿主生物において発現されるコンビナトリアル・キメラ経路発現ライブラリーの構築を包含する。このようなライブラリーは複数の経路および生物からの遺伝子のランダムな組合せを生じさせ、以前には自然界に存在しない代謝経路および離散遺伝子セットを生み出す。「離散遺伝子セット」(discrete gene set)なる用語は、コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリー中の１以上の経路または生物に由来する遺伝子のコンカテマー形成により得られる２以上の遺伝子の任意の集合を意味する。複数の遺伝子産物が宿主生物内で機能することができ、そこで、それらは相互に作用し合って新規なクラスの化合物を産生する新規なキメラ代謝経路を形成する。こうして、薬物スクリーニングに利用しうる分子構造の多様性は、コンビナトリアル・キメラ遺伝子発現ライブラリー中の現存の経路および生物由来の遺伝物質を混合することにより増大される。さらに別の態様において、本発明は、勾配をつけた(biased)コンビナトリアル発現ライブラリーであって、該ライブラリー中のドナー遺伝物質が前もって選択され、ドナー生物の全体のゲノムを含まなくてもよいものである。本発明はまた、移動可能なコンビナトリアル発現ライブラリーを提供し、これはクローン化されたドナーの遺伝物質を、宿主生物の１以上の種から宿主生物の少なくとも１つの他の種に送達することができる。遺伝子発現ライブラリーをスクリーニングする標準的な方法を使用することができるが、望ましい経路および代謝産物を発現しているクローンを同定するように適応させたリポーターレジメ(reporter regimen)を組み込むように、そのライブラリーをさらに修飾することができる。特定の実施態様では、宿主生物を遺伝子工学的に操作して、発現ライブラリーにおいて検出される希望のクラスの代謝産物に応答する化学応答性プロモーターと機能的に結合させたリポータータンパク質をコードする遺伝子を導入する。別の実施態様では、探索される経路において産生された化合物によりリポーター分子に直接的または間接的に変換されるリポーター分子の前駆体である生理的プローブに宿主生物をさらしてもよい。リポーター発現の活性化、つまりリポーター前駆体の変換は、希望のクローンの同定および単離を可能にするシグナルを発生させる。本発明のさらに別の実施態様では、アッセイを含むかまたはそれ自体が希望の化合物の標的となるリポーターレジメまたは別の指示細胞型（例えば、抗感染薬に対する病原体または抗腫瘍薬に対する癌細胞）を含有する半固形マトリックス中に、ライブラリーの宿主生物を埋め込むことができる。コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリー中の希望の生物を同定し単離するためには、高処理量のスクリーニング法、例えば、巨大液滴(macrodroplet)ソーティング、蛍光活性化セルソーティングまたば磁気活性化セルソーティングを用いることができる。陽性クローンはさらに、新規な化合物の産生に関して分析される。新規化合物の産生へと至らしめる代謝経路の遺伝学および生化学は、単離したクローンに導入された遺伝物質を特徴付けることにより概ね解明することができる。本発明はまた、コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーを構築するのに有用な組換えＤＮＡベクター、特定のコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリー、特定の型のリポーターシステムを含有する宿主生物、別の状況下では毒性を示す化合物の産生をうながすように改変された宿主生物、並びに宿主生物、指示細胞および／またはリポーターレジメを含有する組成物に関する。３．１．定義本発明において用いる以下の用語は、示されている意昧を有する。「コンビナトリアル天然経路発現ライブラリー」は、ドナー生物の複数の種に由来する遺伝物質から調製された発現構築物のライブラリーであり、該遺伝物質中に存在する遺伝子は、適当な宿主生物中での該遺伝子の発現を駆動する調節領域と機能的に結合している。このコンビナトリアル発現ライブラリーは、ドナー生物の機能性遺伝子産物を産生しうる宿主生物を利用する。各宿主生物の遺伝物質は、ドナー生物の１つからの、天然に存在する生化学的経路またはその一部をコードする。「コンビナトリアル・キメラ経路発現ライブラリー」は、ドナー生物の１以上の種に由来するランダムにコンカテマー形成した遺伝物質から作製された発現構築物のライブラリーであり、該遺伝物質中に存在する遺伝子は、適当な宿主生物中で該遺伝子の発現を駆動する調節領域に機能的に結合している。用いる宿主生物は、ドナー生物の機能性遺伝子産物を産生しうる。「勾配をつけた(biased)コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリー」は、特定の性質に関して前もって選択されているドナー生物の１以上の種に由来する遺伝物質から作製された発現構築物のライブラリーである。その前選択されている遺伝物質を用いて、コンビナトリアル天然経路またはキメラライブラリーを作製することができる。「移動可能なコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリー」は、ドナー生物の１以上の種に由来する遺伝物質から調製され、かつ、ドナー生物の１以上の種又は株から宿主生物の少なくとも１の他の種又は株に送達することを可能にするシャトルベクター中にクローン化された、発現構築物のライブラリーである。シャトルベクターは、コンビナトリアル天然経路又はキメラライブラリーを調製するために使用することができる。本発明で用いる「ライブラリー」なる語は、発現構築物または該発現構築物を含有する宿主生物を意味する。「生化学的経路」、「天然経路」および「代謝経路」なる語は、生物が行ういずれかの一連の関連した生化学的反応を包含する。そのような経路には、生合成または生分解経路、またはエネルギー生成または変換経路が含まれるが、これらに限定されるものではない。「化合物」は、生化学的経路の産物または副産物である任意の分子であり、通常、複数の遺伝子産物の相互作用の産物である。「活性」は、関心のある化合物の産生につながるある生化学的反応または一連の生化学的反応を行う宿主生物の能力である。本発明で用いる以下の略語の使用を以下に示す。eq(当量)；Ｍ(モル濃度)；ｍＭ(ミリモル濃度)；μＭ(マイクロモル濃度)；Ｎ(規定)；mol(モル)；mmol(ミリモル)；μｍｏｌ(マイクロモル)；nmol(ナノモル)；kg(キログラム)；gm(グラム )；mg(ミリグラム)；μｇ(マイクログラム)；ng(ナノグラム)；Ｌ(リットル)；m L(ミリリットル)；μｌ(マイクロリットル)；vol(容量)；s(秒)；および℃(摂氏度)。さらに、以下の略語を用いる。Cfu：コロニー形成単位；LB：ルリアブロス；d dH₂O：二回蒸留逆浸透精製水；海H₂O：濾過された太平洋の海水；SSW：合成海水；FACS：蛍光活性化セルソーティング；GFP：クラゲ（Aequorea victoria）緑色蛍光タンパク質；kbp：キロ塩基対；g：重力；rpm：毎分回転数；CIAP：ウシ腸アルカリホスファターゼ；EDTA:エチレンジアミンテトラ酢酸；TE：10mMトリス／1.5mM EDTA(pH7.4)；PEG：ポリエチレングリコール；イー・コリ(E．coli.)： (大腸菌(Escherichia coli))；CHO：チャイニーズハムスター卵巣；エス・セレビシエ(S．cerevisiae)：サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisi ae)；エイ・ニデュランス(A．nidulans)：アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)；エス・ポンベ(S．pombe)：シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)；エス・リビダンス(S．l ividans)：ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)；エス・アウレウス(S．aureus)：スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureu s)；エス・ケリコロール(S．coelicolor)：ストレプトミセス・ケリコロール(St reptomyces coelicolor)；ビー・サブチリス(B．subtilis)：枯草菌(Bacillus s ubtilis)；BAC：細菌人工染色体；YAC：酵母人工染色体；PCR：ポリメラーゼ連鎖反応；CaMV：カリフラワーモザイクウイルス；AcNPV：オートグラファ・カリフオルニカ（autographa californica）核多角体病ウイルス；EBV：エプスタイン・バーウイルス；SDS：ドデシル硫酸ナトリウム；CsCl：塩化セシウム。４．図面の説明図１：コンビナトリアル天然経路発現ライブラリー用の発現構築物。この発現構築物は、ベクターＤＮＡと、代謝経路をコードする遺伝子および自然界で結合している調節領域を含むドナーＤＮＡとを含有する。図２：コンビナトリアル・キメラ発現ライブラリー用の発現構築物。この発現構築物は、ベクターＤＮＡと、ドナーＤＮＡおよび調節領域をそれぞれ含む５つのコンカテマー形成した遺伝子カセットとを含有する。図３：コンビナトリアル天然経路発現ライブラリーのクローニング戦略。クローニングしうるＤＮＡ（Ｂ）をドナー生物（Ａ）から抽出し、制限酵素で部分消化して、天然に存在する生化学的経路またはその一部をコードするゲノムＤＮＡ（Ｃ）の断片を得る。ＤＮＡベクター（Ｄ）を制限酵素で消化して、適合しうる末端を有するベクター（Ｅ）を得、これをゲノムＤＮＡの断片にライゲートして発現構築物（Ｆ）を得る。図4A〜4C：遺伝子カセットの組み立て。図4Aは、粘着BamHI部位と、SmaI部位の一部に相当する平滑末端とを含有するアニーリングしたリン酸化lacプロモーター断片を示す。図4Bは、各末端上でlacプロモーターと隣接したBamHI部位を含有するプロモーター二量体を示す。図4Cは、コンカテマー形成したプロモーター断片を示す。図5A〜5F：コンビナトリアル・キメラ経路発現ライブラリーのクローニング戦略。図5Aは、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡ挿入断片の指向性クローニング(direc tional clonlng)のためのプロモーターおよびターミネーター断片を作製する工程を示す。図5Bは、ゲノムＤＮＡ挿入断片に連結するためのプロモーターおよびターミネーター断片を調製する工程を示す。図5Cは、指向性クローニングのためのｃＤＮＡ挿入断片の作製、遺伝子カセットの組み立ておよび固相支持体への結合の工程を示す。図5Dは、クローニングのためのゲノムＤＮＡ挿入断片の作製、遺伝子カセットの組み立ておよび固相支持体への結合の工程を示す。図5Eおよび 5Fは、遺伝子カセットの連続的な連結および脱保護によるコンカテマー形成、S ．pombe／大腸菌シャトルベクター（pDblet）への該コンカテマーの連結、固相支持体からの該発現構築物の遊離、および該発現構築物の環化を示す。図6A〜6B：コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの作製に有用なベクター。図6Aは、ストレプトコス(Streptocos)の地図を示す。コスミドベクターであるストレプトコスは、複数クローニング部位中のT3およびT7プロモーターに隣接したユニークBamHI部位、pIJ699からの複製起点およびチオストレプトン耐性遺伝子、ColE1起点(ori)、アンピシリン遺伝子（Amp）および２つのcos部位を含有する。図6Bは、修飾されたpDbletの地図を示す。プラスミドpDletは、複数クローニング部位（MCS）において修飾されており、ColE1複製起点、アンピシリン遺伝子(Ap^R)、２コピーの自律複製配列(ARS)、ura4マーカーおよびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（LacZ）を含有する(A:AatII;B:BamHI;N:Ndel)。図6Cは、改変された BstXI配列およびNcoI部位を含有するオリゴマーを示す。これを、SacI／NotIで切断したpDbletに過度に連結し、修飾pDbletを得た。図７は、緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするリポーター遺伝子、化学反応性プロモーター（Pm）およびその関連調節遺伝子（Xyls）を含む化学反応性構築物pERD-20-GFPを示す。図８は、コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーからのクローンが封入されている浸透性マトリックスと、リポーターレジメを含有する指示細胞とを含む巨大液滴を示す。図9Aおよび9Bは、海洋細菌遺伝子を含む発現構築物の存在下または不存在下での大腸菌細胞のプールのFACSソーティングの一例を示す。化学応答性構築物pERD -20-GFPを含有する大腸菌XLI-MR株（XLI-GFPと称する）に、海洋細菌遺伝子のコスミドライブラリーを感染させた。該海洋細菌遺伝子の存在下または不存在下で、XLI-GFP細胞を30℃で12時間培養し、２サイクルのFACSソーティングに付した。図9A：海洋細菌遺伝子の存在下でのXLI-GFP；図9B：対照XLI-GFP細胞。図10は、ストレプトミセス・ケリコロールのアクチノロジンデヒドラーゼ（ac tinorhodin dehydrase）のアミノ酸配列と、CXC-AMN20に由来する推定上の部分アミノ酸配列とのアライメントを示す。細線のボックスは配列同一性を示し、太線のボックスは保存配列の相同性を示す。図11：海洋細菌のゲノムＤＮＡプール中のクローンCXC-AMN20配列のPCR検出。この図は、海洋細菌ゲノムＤＮＡに由来するPCRアンプリコンを含有する染色されたアガロースゲルを示す。Ｍ：分子量マーカー(サイズはbp単位)。−：陰性対照。＋：該アンプリコンおよびリボソームＲＮＡに関する陽性対照。レーンは、Ｔ：海洋細菌の全37種からのゲノムＤＮＡ；１、２、３、４：海洋細菌のゲノムＤＮＡのプール、に由来するアンプリコンを含有する。図12A〜Ｃ：海洋細菌種のゲノムＤＮＡ中のクローンCXC-AMN20配列のPCR検出。この図は、海洋細菌の個々の種のゲノムＤＮＡに由来するPCRアンプリコンを含有する染色されたアガロースゲルを示す。Ｍ：分子量マーカー(サイズはbp単位)。−：陰性対照。＋：該アンプリコンおよびリボソームＲＮＡに関する陽性対照。レーンは、種番号1〜10、12〜20および21〜35（それぞれプール１、２および３）の海洋細菌のゲノムＤＮＡに由来するアンプリコンを含有する。図13：pPCos+ura．図は、9.6kbのS．pombe/大腸菌コスミドベクターpPCos+ura のキー要素を示す：マルチクローニング部位(MCS)、酵母選択マーカー(ura4)、 λファージ中にパッケージングするためのcos部位(cos)、SV40複製起点(SV40 ori)、ネオマイシン耐性遺伝子(Neo^R)、ColE1複製起点(ColE1 ori) 、アンピシリン耐性遺伝子(Amp^R)及びS.pombe自律複製配列(ARS)。図14:pPCos1．図は、9.8kbのS．pombe/大腸菌コスミドベクターpPCos1のキー要素を示す：マルチクローニング部位(MCS)、酵母選択マーカー(ura4)、λファージ中にパッケージングするためのcos部位(cos)、SV40複製起点(SV40 ori)、Co lE1複製起点(ColE1 ori)、アンピシリン耐性遺伝子(Amp^R)及びS.pombe自律複製配列(ARS)。５．発明の詳細な説明本発明は、天然の遺伝資源の多様性を捕捉し保存するため、および該捕捉遺伝資源を化学構造の多様性に翻訳・拡張するための方法および組成物を提供する薬物探索システムに関する。本発明はまた、所望の活性および化合物に関するスクリーニングを容易にする。さらに詳細には、本発明は、コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーを構築しスクリーニングするための方法を提供する。これらのライブラリーは、場合によっては発現宿主中で互いに相互作用することを可能にし、場合によっては新規生化学的経路の形成および／または新規化合物クラスの産生につながる複数の種の遺伝子産物のランダムな組合せを含む。さらに、本発明のライブラリーによれば、これがなければ入手不可能な分子多様性の供給源を、有効に得ることができる。本発明のいくつかのライブラリーは、宿主生物の１の種から宿主生物の別の種又は株に送達することができる。この新規生化学的経路は、物質の構造的修飾、この物質への化学基の付加、またはこの物質の分解など（これらに限定されるものではない）の過程を行いうる。この新規化合物クラスとしてば、代謝産物、二次代謝産物、酵素、生物の構造成分などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。関心のある化合物は、抗生物、抗ウイルス、抗腫瘍、薬理学的または免疫調節特性などの１以上の潜在的な治療特性を有するものであり、染料などの他の商業的に価値のある化学物質であることもある。化合物は、受容体のクラスまたは特定の受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうる。本発明で用いる「コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリー」なる語は、コンビナトリアル天然経路発現ライブラリー、コンビナトリアル・キメラ経路発現ライブラリー、および発現構築物のライブラリーを含有する宿主生物を包含する。「コンビナトリアル天然経路発現ライブラリー」は、ドナー生物の１以上の種に由来する遺伝物質から作製された発現構築物のライブラリーであり、その遺伝物質中に存在する遺伝子は、適当な宿主生物中での該遺伝子の発現を駆動する調節領域と機能的に結合している。該コンビナトリアル発現ライブラリーは、ドナー生物の機能性遺伝子産物を産生しうる宿主生物を利用する。各宿主生物の遺伝物質は、ドナー生物の１つからの、天然に存在する生化学的経路またはその一部をコードする。「コンビナトリアル・キメラ経路発現ライブラリー」は、ドナー生物の複数の種に由来するランダムにコンカテマー形成した遺伝物質から作製された発現構築物のライブラリーであり、該遺伝物質中に存在する遺伝子は、適当な宿主生物中での該遺伝子の発現を駆動する調節領域に機能的に結合している。用いる宿主生物は、ドナー生物の機能性遺伝子産物を産生しうる。宿主生物中での発現に際して、ドナー生物の遺伝子産物（単数または複数）が相互作用して新規キメラ生化学的経路を形成することもある。一般には、本発明の方法は、１以上のドナー生物に由来する遺伝物質を準備し、該遺伝物質を操作し、そしてクローニングまたは発現ベクターにより該遺伝物質を宿主生物中に導入して、該ドナー生物の１以上の遺伝子を該宿主生物中でクローニング及び発現させることを含む。ライブラリーを形成するために、ドナー遺伝物質を含有するそのような宿主生物をプールする。いくつかのライブラリーについて、遺伝物質を宿主生物の１の種から宿主生物の別の種又は株に輸送することができ、ここで遺伝物質は安定に維持され、かつ発現することができる。開始物質、宿主生物及びベクターの選択に応じて、当該分野で知られている任意の組換えＤＮＡ技術を、第5.3節、5.4節、5.5節に記載の技術及びプロトコール、並びに実施例６及び７において使用された技術及びプロトコールを組み合わせて、そして任意の順序で使用することができる。クローニングされた遺伝物質は、典型的には、発現が１以上の機能的調節領域により駆動され制御される遺伝子のランダムな組合せを含む。その発現構築物またはベクターが、これらの調節領域のいくつかを与えることもある。ドナー生物の遺伝子が宿主生物中で、転写、翻訳およびプロセシングされて、機能性タンパク質が産生され、今度はこれが、関心のある代謝産物を産生する。本発明によれば、天然に存在する完全な生化学的経路またはその実質的な部分を含む遺伝子発現ライブラリーが、関心のある化合物または活性を与えるドナー多酵素系の探索を著しく促進しうる。特定の生化学的経路に関与する遺伝子は、簡単に単離でき、単一の発現構築物またはクローン中で特徴づけすることができる。そのような発現構築物の典型的な配置を図１に示す。所望の活性または化合物が同定されたら、この簡便な特性のおかげで、株改良、プロセス開発などの、後続の薬物開発の作業が著しく容易になりうる。陽性クローンを標準的な条件下で培養して、さらなる研究または用途のための十分な量の所望の化合物を得ることができる。生化学的経路の遺伝子は、配列決定、突然変異、発現、およびスクリーニングのさらなるラウンドのために、即座に入手できる。このクローニングされた生化学的経路は、所望の化合物の過剰生産のための伝統的な操作および／または遺伝子操作に容易になじむ。さらに、本発明を用いなければ不活性であるかまたは検出できないドナー生物中の生化学的経路を、宿主生物中での機能的再構築により、より容易に見い出しうる。宿主生物の生化学的特徴はよく知られているため、ドナー遺伝物質の発現から生じる多くの差異を容易に認めることができる。ドナー遺伝物質を含有する宿主生物の抽出物を、一定の環境条件下で、対照宿主生物により産生されることが知られている化合物のプロフィールと比較することにより、新規化合物を検出してもよい。宿主の生化学的な細胞バックグラウンドが十分に特徴づけされている場合には、非常に低レベルの所望の活性または化合物でさえも検出しうる。後の節で説明するとおり、本発明は、所望の活性または化合物クラスを与えるクローンを検出し単離するための方法を提供する。好ましい態様においては、該方法は、天然で十分な量を回収できず実験室で培養もできないドナー生物に適用できる。そのような生物からの遺伝物質を宿主生物中にクローニングすることにより、その生物の代謝経路を再現でき、その産物のいずれかの所望の特性を効率的に試験することができる。このようにして、これらの生物の遺伝的多様性が、捕捉され保存される。本発明のもう１つの実施態様では、１つまたは複数のドナー生物からの遺伝物質を、宿主生物中に導入する前に、ランダムにコンカテマー形成させるコンビナトリアル・キメラ経路遺伝子発現ライブラリーを構築することができる。したがって、該ライブラリー中の各宿主生物が個々に、種々のドナー経路または生物に由来する遺伝子の独特でランダムな組合せを含有する。図２は、コンビナトリアル・キメラ経路遺伝子発現ライブラリーの発現構築物における、遺伝子および調節領域の整列を示す。ほとんどの場合、該ライブラリー中の遺伝子のそのような組合せは、天然では生じない。発現に際して、種々のドナー経路または生物の機能性遺伝子産物が個々の宿主生物中で互いに相互作用して、生化学的反応の組み合わせが生じ、これは、新規キメラ代謝経路および／または新規化合物の産生につながる。一言で言うと、該ライブラリー中のドナー生物の遺伝資源は、個々のドナー生物中では見い出されない多様な化学物質に翻訳されるのである。本発明のもう１つの態様では、ドナー生物種は、その生化学的特徴、または宿主生物を補足する望ましいが特徴づけされていない生化学的反応を行う能力に基づいて、選択してもよい。そのような望ましい特徴としては、ある栄養素を利用する能力、極端な条件下で生存する能力、化学構造を誘導する能力、ある型の化学結合を分解する能力またはその形成を触媒する能力などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。宿主生物の遺伝子を該宿主生物中で発現させる場合、ドナー遺伝子産物が、宿主代謝経路を構成する宿主遺伝子産物の機能を修飾および／または置換することがあり、それにより、新規のハイブリッド経路を得ることができる。新規の活性および／または化合物は、ドナーおよび宿主に由来する成分を含むハイブリッド経路により得てもよい。ドナー遺伝子産物により修飾された標的代謝経路は、宿主生物に固有のものであってもよい。あるいは、内因性であるか、または該遺伝子発現ライブラリーの構築の前またはそれと同時に各宿主生物中へ遺伝的に操作された異種遺伝子の産物により、標的代謝経路を得てもよい。したがって、本発明はまた、ドナー生物の代謝経路をコードするＤＮＡ断片をクローニングし、そして標的代謝経路を含有する宿主生物中で同時発現させる、遺伝子発現ライブラリーの構築およびスクリーニングを包含する。本発明のもう１つの実施態様では、、関心のある化合物を培地中に分泌する活性薬物エフラックス系の補足体（complement）が宿主生物において増強されており、それにより該宿主生物に対する該化合物の毒性が減少していてもよい。宿主生物の培養中に中性樹脂などの吸収性物質を使用することにより、該宿主生物により産生および分泌された代謝産物を隔離して、該代謝産物の回収を容易にしてもよい。コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーのスクリーニング方法をより効率的にするために、本発明はさらに、関心のある活性または化合物を有する該ライブラリー中の宿主生物を検出する方法を提供する。本発明の１つの実施態様では、宿主生物は、リポーター分子のde novo合成を活性化することにより、所望の化合物または活性の存在などの導入変化の存在に反応するリポーター系を含有する。もう１つの実施態様では、宿主生物は、所望の化合物または活性の存在によりリポーターに変換されるリポーター分子前駆体または生理学的プローブを含有する。陽性クローン中のリポーター分子は、発現ライブラリー中の陽性クローンを検出し、それを残りの非生産的クローンから単離するのを可能にするシグナルを発生する。多くの点で、この薬物探索システムは、臨床試験に至る薬物開発の種々の段階に、有意な簡便さおよび時間的利点を与える。本発明のライブラリーは、高処理量スクリーニングのための、確立されているマルチウェルフットプリントフォーマットおよびロボティックス(robotics)に適合しうる。本発明の宿主生物は、遺伝子操作および／またはプロセスの開発に一般に用いられる生物である。本発明は、宿主生物または生産宿主が、それらの生物的特性および維持要件の点でよく特徴づけされているという事実を利用している。ドナー生物からの遺伝物質を他のより一般的な発現系にクローニングすることにより、該ドナー生物の困難な培養条件に対する要件が緩和される。したがって、本発明の系で探索されたいずれかのリード化合物の生物活性、薬物動態学的特性および毒性特性をより効率的に研究し、最適化しうる。陽性クローンにおいて生じた新規代謝経路は、分子生物学の標準的な技術により説明することができる。標準的または経験的に決定される培養条件下で薬物産生宿主生物のクローンを培養することにより、リード化合物を合成して、さらに分析し開発するために十分な量のリード化合物を単離してもよい。これらの標準的な産業用宿主生物のいくつかについて制定されている「医薬品の製造管理および品質に関する基準」(GMP)などの高純度の製造プロトコールが既に存在する。天然産物源をスクリーニングする通常の方法と異なり、スクリーニングおよび生産技術を各潜在的薬物産生生物の特定の要件に適応させるのに、それほどの労力は要求されない。さらに、スクリーニングアッセイにおいて一旦陽性クローンが同定されると、代謝経路をコードするクローン中の配列又はそれらの部分を単離することができ、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。同じドナー生物の他の遺伝子ライブラリー若しくはコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリー、又は関連する生物をそのようなプローブでスクリーニングして、天然経路中の関連遺伝子、又は同一のオペロン若しくはコンビナトリアル遺伝子発現構築物中の他の遺伝子を単離することができる。そのような配列はまた、遺伝子発現ライブラリーを作るために、宿主生物中に再度導入し、共発現することができる。スクリーニング及び発現のプロセスを繰り返して、コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーにおける遺伝的及び化学的多様性をさらに増加することができる。本発明はまた、特定の組のドナー生物および／または細胞型の遺伝物質から本発明の方法により作製された特異的コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーを提供する。該コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの製造が可能となるためには、ある組（特に混合サンプル）のすべての生物または細胞型が、個々に同定または特徴づけされている必要はない。本発明はさらに、アーキバル(archival)又は移動可能なコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーを提供する。ここで、ドナー生物の遺伝物質は、宿主生物の１の種から宿主生物の別の種又は株に送達することができる。これらのライブラリーは、ドナー生物の遺伝物質が特有であり、まれであり、若しくは調製することが困難であるときに、又は宿主生物の多くの異なる種又は株においてドナーの遺伝物質の発現を得ることが望まれているときに、特に有用である。クローニングベクターが適当な複製起点及び選択機構、及び／又は送達起点を含むところでは、ライブラリー中の遺伝物質を送達でき、そして宿主生物の他の種又は株において安定に維持され発現することができる。送達は、例えば発現構築物の単離、及びトランスフォーメーション、トランスフェクション、感染又はエレクトロポレーションなどの任意の手段（これらに限定されるものではない）による該構築物の別の宿主生物への導入により、果たすことができる。あるいは、送達は適当な宿主生物間の細菌接合により果たすことができる。本発明のコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーはいずれも、増幅し、複製し、保存することができる。増幅は、ドナーＤＮＡを含有する最初の宿主生物を培養して、該宿主生物の複数のクローンを得ることを意味する。複製は、該ライブラリー中の個々のクローンを拾い、増殖させることを意味する。本発明のコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーは、該宿主生物に適した当該分野で公知のいずれかの技術により、保存し、回収しうる。したがって、本発明のライブラリーは、薬物探索プログラムにおいて反復して入手しうるドナー生物の遺伝資源を捕捉し、保存するための効果的な手段である。５．１．コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの作製５．１．１．ドナー生物本発明のコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーを作製するためには、どのような生物がドナー生物であってもよい。ドナー生物は、私的または公的な実験室培養、American Type Culture Collection、Mycological Instituteなどの培養寄託機関から、あるいは培養可能または不可能な環境サンプルから入手してもよい。ドナー生物は、土壌細菌、真菌、植物などの薬物リード化合物の伝統的な供給源であってもよい。ドナー生物は、薬物の生成および／または産生に有用であるトランスジェニックな、遺伝的に操作されたまたは遺伝的に選択された株であってもよい。ドナー生物は、現在の最新の微生物学的技術により培養可能であってもよいし、そうでなくてもよい。例えば、該ライブラリーの作製に用いる遺伝物質は、環境サンプルから直接入手することができる。天然で見い出される微生物のごくわずか（１％）しか実験室で培養できないため、本発明の大きな利点は、本発明で用いるドナー生物が培養可能でなくてもよいことである(Torsvikら，1990，Ap pl Env Micro，56:782-787)。本発明は、ドナーとしての微生物の用途に限定されない。植物は非常に広範な化合物を産生し、そのいくつかは(例えばフィトアレキシン)、動物および微生物の両方に対する劇的な活性を有する(Abelson 1990，Science 247:513)。これらの化合物のいくつかは、傷害により、あるいは植物病原体の細胞壁に由来する誘導因子により誘導されうる(Cramerら，1985，EMBO J．4:285-289;Cramerら，198 5，Science 227:1240-1243;Dronら，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:673 8-6742)。タキソール、カンプトテシンおよびアルテミシニンのような生物学的に活性な化合物は、それぞれ抗腫瘍薬および抗マラリア薬として臨床開発中である植物由来天然産物の具体例である。どのような植物（特に、潜在的な医薬特性を有する植物）も、望ましいドナー生物でありうる(Phillipson，1994，Trans R Soc Trop Med Hyg，88 Suppl 1:S17-9;Chadwickら編，1994，“Ethnobotany an d the search for new drugs”，Wiley，Chichester，Ciba Foundation Symp 18 5)。潜在的に有用な抗微生物的または薬理学的特性を有する天然産物のもう１つの供給源は、無脊椎動物および脊椎動物である。これらの化合物のいくつかは、競争者、病原体および捕食者に対する化学防御剤として作用する。そのような化合物は、被食者を殺すのに用いられることもあるし、あるいは、コミュニケーションの一形態として用いられることもある(Caporale 1995，Proc Natl Acad Sci 9 2:75-82)。多くのクラスでは、共生しうる関連微生物により二次代謝産物が産生されると考えられている(Faulknerら，1993，Gazzetta Chimica Italiana，123: 301-307;Bewleyら，1995，“An Overview of Symbiosis in Marine Natural Pro ducts Chemistry Symposium”(in hornr of Professor Antonio Gonzalez，La L aguna University，Canary Islands)1995年９月16日，p26(抄録))。天然において他の生物の生化学的経路を操作することが知られている生物は、特に関心のある供給源である。例えば、ソテツ（Cycas）などの植物は、ある昆虫の成長を妨げるエクジソン擬似体を産生しうる。そのような生物は、それらが競争者、共生生物、捕食者および被食者あるいは宿主および寄生体として存在する同じ生態的地位で生存しうる。したがって、天然において他者と化学的に相互作用する生物に由来する遺伝物質を使用するのが有利かもしれない。天然産物のさらにもう１つの豊富な供給源は、海洋生物である。例えば、海洋微生物は新規分子構造を提供し、そのうちの多くが生物学的に活性である。例えば、これまで土壌細菌では見い出されていない分子構造を有する潜在的な抗癌剤であるオクタラクチンＡ(Tapiolasら，1991，J Amer Chem Soc，113:4682-83)、強力な抗炎症特性を有するサリナミド（Trischmanら，1994，J AmerChem Soc，1 16:757-758）が挙げられる。海洋微生物由来のある化合物は、海水からの臭素を含有し、この導入ハロゲンの化学反応性のため、該化合物は該臭素により非常に活性になる。例えば、グラム陽性細菌に対して選択的な抗生物質活性を有する混合ポリケチドおよびメバロン酸生合成経路の産物であるマリノン（Pathiranaら，1992，Tetrahedron Lett 33:7663-7666）が挙げられる。極地から熱帯地方までの一定範囲の生息場所で、種々の塩分、温度および圧力により生存している海洋種には、莫大な多様性がある。これらの生息場所の独特の性質は、これらの生物の異なる遺伝的および生化学的特徴に反映されており、多数の有用な薬物リード化合物を与えうる。例えば、Fenicalら，1992，“Marine Microorganisms;a n ew biological resource”，Adv in Marine Biotechol，Vol．IＩ，Plenum Pres s，New Yorkを参照されたし。環境サンプルは、天然のまたは人工的な環境から入手してもよく、原核および真核生物およびウイルスの混合物を含有していてもよく、これらのいくつかは未同定であってもよい。サンプルは、ランダムに採集してもよいし、あるいは、生態学的に重要視されている場所（例えば、産業廃液の近く）から採集してもよい。ドナー生物の供給源として、土壌、淡水または海水濾液、温泉周辺の堆積物、熱口、および海洋または河口沈殿物を用いてもよい。サンプルは、水底、遠洋および潮間海洋供給源から採集してもよい。サンプルは、熱帯、亜熱帯、温帯、その他の地域から採集してもよい。ドナー生物は、高温性、好塩性、好酸性、好圧性またはメタン産生性であってもよい。熱帯雨林に棲息する植物および微生物等の、絶滅の可能性に直面している生物を用いることも好ましい。そのような生物が滅ぼされつつあるかぎり、有用な医薬品を産生するかもしれない種が無くなっていくのである。藻類、地衣類、真菌類、植物および動物を含めて、病気を直す特性を可能性として有する生物を、伝統的な又は民族的な医療実践におけるそれら生物の使用に基づいて集めることも可能である。多くの側面において、伝統的な薬物発見または開発技術に一般的に受け入れられないドナー生物由来の遺伝子物質を用いて、ライブラリーを構築することが望ましい。このようなドナー生物は、下記の特徴を１つ以上有していてよい。すなわち、(i)実験室で増殖または培養することができない;(ii)さらなる実験に十分な量を自然から回収することができない;および／または(iii)所望の化合物を産生するために、未知の又は商業的に妥当でない特別な条件を必要とする、である。最後の特徴は、不適切な培養条件のため従来のスクリーニング法では薬物の手掛かり(drug lead)が全く検出されなかったような、現存の培養コレクション中の生物をも指している。発現ライブラリーの構築のためには、ドナー生物を分類学的に定義する必要も、または生化学的に特徴づける必要もない。サンプルの複雑性および薬物発見プログラム上の必要（例えば、ドナー生物の脱複製(dereplication)の必要等）に応じて、環境サンプル由来の培養可能な種または種の代表的なグループの同定または遺伝子フットプリンティング(footprinting)を実施してもよい。核酸の抽出に先立って、ドナー生物を実験室または現場(field)で濃縮または培養することができる。ｃＤＮＡを調製するためには、ドナー生物中の関心のある活性をコードする遺伝子産物の転写を誘導または増強するため、特定の増殖条件または培養物中の特定の化学薬品の存在が必要とされる場合がある。ゲノムＤＮＡのみが必要な場合は、ドナー生物を培養するのに標準的増殖条件を用いることができる。ある環境サンプル中の全ドナー生物が同じ速度で増殖することはありそうもないことなので(実験室の条件下ではありうるとしても)、ドナー生物のいくつかは過増殖し、ゆっくり増殖する生物の喪失または希釈をもたらしうる。したがって、実験室で前もって培養することなく、環境サンプル中のドナー生物から直接核酸を調製することが好ましいであろう。これは、海綿動物等の無脊椎動物の二次代謝物の評価を試みる場合、特に有用である。この場合、その代謝物は関連する共生性でかつ培養不可能な微生物によって産生されるとしばしば考えられている。環境サンプル中のドナー生物から高品質の核酸を調製する方法を以下の第5.1. 2節に記述する。本発明によって意図されるドナー生物としては、細菌、単細胞真核生物(酵母、原生生物、等)、藻類、真菌、植物、尾索類、苔虫類、蠕形動物、棘皮動物、昆虫、軟体動物、魚類、両性類、爬虫類、鳥類、および哺乳動物が挙げられるが、これらだけに限定されない。ドナー生物の非限定的例を表ＩおよびIIに示す。 5.1.2. ドナー生物からの高品質の核酸の調製核酸は、ドナー生物から、該ドナー生物の種類およびサンプルの供給源に応じて種々の方法によって単離することができる。ドナー生物の遺伝子情報を完全に表す遺伝子発現ライブラリーを構築するためには、ニック、一本鎖ギャップ、および部分変性のない、そして（特にゲノムＤＮＡクローニングの場合は）高分子量である、高品質の核酸を得ることが重要である。高品質の核酸を調製するため、本発明の方法はサンプル中のドナー生物の穏やかな、迅速な、そして完全な溶解、ならびに該生物由来のヌクレアーゼおよび他の分解性タンパク質の迅速かつ完全な不活性化を提供する。最初の抽出を現場で実施して、さらなる単離工程を実験室で行なえるようになるまで、サンプル中の核酸を安定化させることができる。いずれの核酸単離法もドナー生物の効率的破壊を必要とする。液体窒素中での凍結、ガラスまたは他の破壊的作用物質の存在下での粉砕、および単純な機械的剪断または酵素的消化等の多数の標準的技法が使用できる。土壌等の混合物質、またはセルロースあるいはキチン等の堅い物質を多量に含むサンプル（例えば糸状菌および植物）に対しては、サンプルを脆くして破壊されやすくするために凍結乾燥を採用することができる。このような凍結乾燥させた物質は、酵素性物質および高分子量物質（核酸等）の両方を長期間保存する(G urney 1984，Methods in Molecular Biology，第２巻，p.35-42，John M.Walker 編)。液体窒素中でサンプルをフラッシュ凍結させることができる。土壌のようにゆるい(loose)サンプルは、細かいゲージまたはナイロンメッシュを用いて凍結させることができる。凍結乾燥は、凍結サンプルを用いて真空下で24〜72時間にわたって行なうことができる。凍結乾燥したサンプルは、粉末状態で真空下で -70℃で保存することができる。環境サンプルの調製のため、微生物集団の濃縮等の付加的工程が必要とされる場合がある(Jacobsonら，1982，Appl Env Microbiol，58:2458-2462;Zhouら，1996，Appl Env Microbiol，62:316-322 ;Somervilleら，1989，Appl Env Microbiol，55:548-554)。本発明の１つの主要な方法は(使用される唯一の方法ではないが)、Chirgwinら (1979，Biochem 24:5294)、Sadlerら(1992，Curr Genet，21:409-416)およびFos ter(1991，博士論文，University of California，Santa Barbara)を改変したものである。この方法は、強いカオトロピック(caotropic)作用物質であるグアニジニウムイソチオシアネートを2-メルカプトエタノールと共に使用してタンパク質を変性し、ヌクレアーゼを不活性化し、次いで塩化セシウム勾配遠心により核酸物質の精製を行なう。本明細書において提供する方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を抽出するという点でChirgwinの方法と異なっている。本発明の方法には、高速遠心工程、および場合によりビスベンズイミド染料の添加もまた包含される。用いるドナー生物に応じて、付加的工程は多糖類を選択的に除去するためのヘキサデシルピリジニウムクロリドまたはセチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)を用いた処理、フェノール性物質を除去するためのポリビニルピロリドンを用いた処理、ならびにデンプンおよび他の炭水化物を除去するためのセルロースクロマトグラフィーを含みうるが、これらだけに限定されない(MurrayおよびThompson，1980，Nuc Acid Res 8:4321-25)。ドナー生物から単離したＲＮＡを、逆転写酵素を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換することができる。損傷した核酸はクローン化が困難で、ドナー生物ＤＮＡの損失をもたらし、ライブラリーにおけるクローンの数は少なくなる。これらの問題は、もし宿主生物が組換えを許容し、かつ有効な内因性ＤＮＡ修復機構を欠く場合には、さらに悪化しうる。本発明は、相補的ＤＮＡの第２鎖合成の際に一般的に採用されている酵素反応を用いて、損傷したＤＮＡがクローン化に先立ってin vitroで修復され得ることをも提供する(Sambrookら，1989，"Molecular Cloning"第２版，第８節 )。例えば、ＤＮＡギャップおよびニックは、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片および大腸菌ＤＮＡリガーゼによって修復され得る。このような酵素反応は当業者には周知である。環境サンプルから抽出したＤＮＡからコンビナトリアル発現ライブラリーを作製する場合には、利用可能なＤＮＡの量ばしばしば制限され、またライゲーション戦略の選択において考慮すべき事柄である。抽出または濃縮後にＤＮＡの量が少ない(<100μｇ)場合は、第5.1.3節に記述するように、ＤＮＡを高効率クローニング系（例えば、SuperCos）にライゲートしてもよい。クローン中の挿入断片を増幅し、制限酵素消化によってベクターから放出させる。原核および真核ドナー生物の両方を含みうる環境ＤＮＡサンプルの性質により、複数の宿主生物を使用するのが望ましいかもしれない。もとの環境ＤＮＡサンプルが十分な量だけ入手できない場合、またはＤＮＡが増幅されている場合は、所望の一群の発現宿主細胞にとって適切な一群のベクターのそれぞれとＤＮＡとをライゲートすることができる。好ましくは、ベクターは２個以上の発現宿主の間をシャトルする能力を有する。 5.1.3．発現宿主およびベクター本明細書に用いる「宿主生物」という用語は、細菌等の単細胞生物ならびに植物および動物等の多細胞動物を広く包含する。in vitroで培養された、または遺伝子工学的に作製された細胞を含むいずれの細胞型も使用できる。本発明においては当分野で公知のあらゆる宿主−ベクター系が使用できる。２個以上の宿主生物中で複製され、維持されうるシャトルベクターの使用が有利である。宿主生物または宿主細胞は、私的な実験室の寄託物、American Type Culture Collection等の公的な培養物コレクション、または商業的供給者から得ることができる。そのような宿主生物または細胞を、特定の用途のために、当分野で公知の技法によりさらに改変することができる。本発明によれば、宿主生物または宿主細胞は、異種遺伝子の発現にすでに使用されており、かつ生化学的、生理学的および／または遺伝子的にかなり十分に特徴づけられていることが好ましい。そのような宿主生物は伝統的遺伝的な細胞株の改善法、育種法、発酵法、および／または組換えＤＮＡ技法と共に使用されてきたかもしれない。大量産生法のために開発された宿主生物であって、増殖条件および二次代謝物産生条件が分かっているものを使用することが望ましい。宿主生物は、温度、インキュベーション時間、光学密度、および発現宿主の栄養的および生理的要求に対応した培地組成の標準的条件下で培養することができる。しかし、ライブラリーを維持および作製するための条件は、ライブラリーの発現およびスクリーニングのための条件とは異なる場合がある。改変した培養条件および培地を用いてドナー生物のいくつかの栄養的および生理的特徴をエミュートし、そして関心のある代謝物の産生を促進することが可能である。例えば、関心のある化合物の化学的前駆体を栄養培地に付与して、これら前駆体の修飾を促進することが可能である。当分野で公知の任意の技法を適用して最適条件を確立することができる。好ましくは、宿主生物は、相同組換えを受ける能力および外来ＤＮＡを切断する能力を欠いているべきである。好ましくは、宿主生物はドナー生物のコドン使用法と類似のコドン使用法を有しているべきである。真核ドナー生物を用いる場合は、宿主生物はドナーのｍＲＮＡを適切にプロセシングする（例えばイントロンをスプライシングする）能力を有することが好ましい。好ましい原核宿主生物としては、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillu s subtilis)、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、ストレプトミセス・ケリコロール(Streptomyces coelicolor)、シュードモナス・アエルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、ミクソコッカス・キサンタス(Myxococcu s xanthus)が挙げられるが、これらだけに限定されない。サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)(パン酵母)、シゾサッカロミセス・ポンベ(S chizosaccharomyces pombe)(分裂酵母)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris) 、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)（メチロトローフ性酵母）等の酵母種も使用できる。ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)およびアスペルギルス・ニードランス(Aspergillus nidulans)等の糸状子嚢菌類もまた使用できる。タバコ(Nicotiana)およびシロイヌナズナ(Arabidopsis)由来の細胞等の植物細胞が好ましい。好ましい哺乳動物宿主細胞としては、ヒト、サル、および齧歯類由来の細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３、ＣＯＳ、２９３、ＶＥＲＯ、等が挙げられるが、これらだけに限定されない(Kriegler M.，"Gene Transfer and Expression:A Lab oratory Manual"，New York，Freeman & Co．1990参照)。発現された遺伝子産物を所望の特定の様式で修飾し、プロセシングする宿主生物を選択することができる。タンパク質産物のこのような修飾（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば開裂）は、生化学的経路におけるタンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的な作用機構を有する。適切な細胞系または宿主系を選択して、発現された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にすることができる。この目的のため、もしドナー生物が真核生物であるならば、一次転写物の適切で正確なプロセシング、伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞が好ましい。例えば、真核生物真菌類は同一のコア分子生物学の多くの部分を共有していること、そして最も一般的な真菌種の多数の間では遺伝子交換が可能であることが示されている(Gurrら，1987，Gene Structure in Eukaryotic Microbes，Kingho rn編、p．93;BennetおよびLasure，1992，Gene Manipulations in Fungi，Acade mic Press，NY)。真核宿主生物の好ましい例は、分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)である。第１に、S．pombeの分子生物学は高度に発達しており、そして多くの主要な培養および精製プロセスならびに操作は決まりきった形で実施されている。第２に、S．pombeは単細胞性であり、したがって実験室の環境の中で容易に培養し、保存し、そして操作することができる。第３に、そして混合された真核細胞ＤＮＡを発現するのに使用する場合に特に重要なのだが、S．pombeは、真菌の他の種、植物、および哺乳動物の遺伝子を適切にスプライシングし、発現することが可能である。異種核のＲＮＡ（イントロンを含むＲＮＡ）のスプライシングおよびプロセシングの研究は、スプライシングに必要な小さい核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）成分のパターンおよび構造において、 S．pombeが他の真菌およびより高等な後生動物と顕著な類似性を共有することを示した。最後に、多くの非Ｓ．pombeプロモーターが、（それらのうちのいくつかは哺乳動物および植物ウイルス由来であるが、）中等度から高レベルの遺伝子発現を引き出すことができる(Forsburg，1993，Nuc Acids Res，21:2955)。この特徴は、真菌ＤＮＡ／ｃＤＮＡライブラリーの、哺乳動物細胞発現宿主［例えば、ＮＩＨ３Ｔ３(繊維芽細胞)、ＧＴ１−７（ニューロン）または他の細胞型、等］へのシャトリング(shuttling)を可能とする。発現のためにドナーＤＮＡを宿主生物に導入するのにクローニングベクターまたは発現ベクターを用いることができる。発現構築物とは、１以上の調節領域に機能しうる形で結合されているドナーＤＮＡを含む発現ベクターである。調節領域はドナーＤＮＡまたはベクターによって提供されうる。以下の種々のベクターを用いることができるが、それらに限定されない。すなわち、プラスミド；コスミド；ファージミド；酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）および細菌人工染色体（ＢＡＣｓ，Shizuyaら，1992，Pro Natl Acad Sci 89:8794-8797）等の人工染色体、または改変ウイルスである。ただし、上記ベクターは宿主生物と適合性でなければならない。有用なベクターの非限定的例は、λgt11、pWE15、SuperCosl(Strat agene)、pDblet(Brunら，1995，Gene，164:173-177)、pBluescript(Stratagene) 、CDM8、pJB8、pYAC3、pYAC4(Current Protocols in Molecular Biology，1988 ，Ausubelら，Greene Publish．Assoc.およびWiley InterscienceのAppendix 5 参照、引用することにより本明細書の一部を構成するものとする)。シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)におけるクローニング及び発現のための適例のコスミドベクター、pPCos+uraは図13に示されており、1996年10 月24日に、アグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション（Agricultural Research Service Culture Collection）(NRRL)(Agricultura l Research Center，Ｕ．Ｓ．Department of Agriculture，1815 North Univers ity Street，Peoria，Illinois 61604，米国)に寄託されており、受託番号はB-2 1637Nである。宿主およびドナー生物の調節領域および転写因子が適合性である場合、ドナーの転写領域はＲＮＡポリメラーゼ等の宿主の因子と結合し、宿主生物中で転写を達成することができる。もしドナーおよび宿主生物が適合性でない場合は、導入遺伝子の発現を確実にするため、宿主生物に適合性の調節領域をドナーＤＮＡ断片に連結することができる。それ自体の翻訳開始コドン、リボソーム結合領域、及び隣接配列を含むオペロン全体が適当なクローニングベクター又は発現ベクターに挿入される場合、追加的な調節シグナルは必要とされ得ない。しかしながら、遺伝子のコーディング配列の一部のみが挿人された場合、翻訳開始コドン（ATGである場合が多い）及び隣接配列を含む外因性調節シグナルが提供される必要がある。これらの外因性調節領域及び開始コドンは、種々の天然及び合成起源のものであり得る。ドナーＤＮＡの発現には構成及び誘導調節領域の両方が使用され得る。発現ライブラリーの産物が毒性である場合、誘導プロモーターを使用するのが望ましい。発現の効率は適当な転写エンハンサーエレメントの含有によって増強され得る(Bittnerら，1987，Methods in Enzymol．153:516-544参照)。「機能的に結合された(operably-associated)」とは、発現される調節領域及びＤＮＡ配列が、転写及び最終的には翻訳を可能にするような様式で結合され、配置される結合をいう。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は生物と生物の間で変動する。一般的に、ＲＮＡポリメラーゼを結合し、機能的に結合された核酸配列の転写を促進することが可能なプロモーターが必要とされる。そのような調節領域は、TATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列等の、転写及び翻訳の開始と関係した5'-非コーディング配列を含み得る。また、コーディング配列に結合した非コーディング領域3'にも、ターミネーター及びポリアデニル化部位等の転写終結調節配列が保持又は複製され得る。核酸分子の２つの配列が、いずれかがその両方の配列が同一のＲＮＡ転写物上に転写されるのを可能にするか、或いは一つの配列において生じたＲＮＡ転写物が第二の配列に伸びるのを可能にする様式において互いに結合している場合は、「機能的に結合された」と言う。このようにして、ポリシストロン性転写物が産生され得る。プロモーター及び他の任意の核酸配列等の２以上の配列は、プロモーターで開始されている転写が機能的に結合された配列のＲＮＡ転写物を産生する場合、機能的に結合している。「機能的に結合」させるために、２つの配列を互いにじかに隣接させる必要はない。さらに、発現ベクターは、ドナーＤＮＡを含む宿主生物を最初に単離し、同定し又は追跡するための選択可能な又はスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含み得る。任意の抗生物質耐性遺伝子、例えば、限定されるものではないがアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、アプラマイシン又はゲンタマイシン(Brauら、1984，Mol Gen Genet 193:179-187)及びハイグロマイシン(Hopw oodら、1985，Genetic Manipulation of Streptomyces，A Laboratory Manual， The John Innes Foundation，UK)を使用することができる。細菌宿主におけるプラスミド安定性に基づく普遍的前方選択、例えばparD/E系(Johnsonら、1996，J Bacteriol，178:1420-1429)もまた、抗生物質選択の不在下で使用することができる。また、発現ベクターは発現構築物中でのＤＮＡ挿入断片の一部の切断及び／又は再配列を可能にするための固有の又は都合よく配置された制限部位をも提供し得る。発現ベクターは１以上の宿主生物中のベクターの維持及び／又は複製、或いは宿主染色体中へのそのベクターの組み込みを可能にする配列を含み得る。そのような配列には、限定するものではないが、複製開始点、自己複製配列(ＡＲＳ)、セントロメアＤＮＡ、及びテロメアＤＮＡが含まれ得る。発現ベクターに、宿主生物配列又は相同配列、特に宿主において活発に転写される配列を含めることもまた有利であり得る。特に、そのような配列がクローニングベクター内のクローニング部位に隣接する位置に見出される場合に、該配列は、発現構築物を宿主染色体に組み込むことを可能とする。発現構築物は、宿主のゲノムに組み込まれてもよく、宿主生物内でエピソームのままでもよい。結果として、発現構築物の１以上のコピーが産生され、宿主生物中に維持され得る。発現構築物は宿主ゲノム中に組み込まれるか、又は宿主生物中にエピソームの状態でとどまる。一般的に、例えば、細菌細胞と哺乳動物細胞、細菌と酵母、細菌細胞と植物細胞、又はグラム陽性菌とグラム陰性菌などの少なくとも２つの宿主生物中で複製され維持され得るシャトルベクターを用いるのが有利であり得る。本発明のシャトルベクターは、宿主生物の異なる種又は株において複製することができ、そして、宿主生物の範囲を決定する１又はそれ以上の複製起点を含み得る。そこでは、ベクターがそれ自身安定に維持し、かつ細胞増殖と提携して複製を受ける。例えば、原核生物において広い宿主の範囲のプラスミド複製起点が存在するならば、シャトルベクターは非常に広い範囲の細菌内で安定に遺伝することができるであろう。例えば、RK2複製起点(Pansegrauら、1994，J．Mol Biol 239:623 -663)又はpBBR(Kovachら、1994，BioTechniques 16:800-801)は、Pseudomonas、 Agrobacterium、Escherlchia及びRhizobiumなどの多くのグラム陰性細菌において機能的である。広い宿主の範囲の複製起点を含むＤＮＡを保有する多くの細菌は、興味の対象である代謝産物を生成することが知られている。比較的制限された範囲の同類の宿主において機能的である複製起点、例えば、４つのアクチノミセス属において機能するpAkijlの複製起点(J Gen Microbiol 131:2431-2441)もまた使用することができる。あるいは、本発明のシャトルベクターは、ベクターを例えば大腸菌及びバチルスなどの各々の宿主において複製及び維持することを可能にする、それぞれ狭く定義された範囲の２又はそれ以上の複製起点を含むことができる。IncP、IncQ又はIncWプラスミド由来の任意の複製起点は、本発明のベクターにおいて使用することができる。バクテリオファージ複製起点、例えば M13ファージのf1起点もまたベクター中に存在することもできる。コリファージ複製起点は、例えば限定されるものではないが形質転換、ハイブリダイゼーションなどの種々の目的のために有用な発現構築物の単一の標準的形態の生成を容易にすることができる。本発明のシャトルベクターは、天然に生ずる自己伝達性プラスミド由来のシス -作用配列（それらは、プラスミドが、異種間の接合性プロセスによって細菌の１つの種又は株から他のものに自身を伝達することを可能にする）を含むこともできる(Haymanら、1993，Plasmid 30:251-257)。伝達起点として知られるそのような配列は比較的小さく(例えば200-800bp)、そして本発明のシャトルベクターに挿入して宿主生物の異なる種又は株間でのシャトルベクターの伝達を可能にすることができる。接合は天然のプロセスであり、それにより、大プラスミドは、明らかに高頻度で接合チューブを介して生物の異なる種又は株間に伝達される。伝達起点を含有するシャトルベクターの動員は、伝達タンパク質の特別なセット（宿主染色体自体に、又はTraヘルパープラスミドによりトランスに組み込まれた機能の発現によって提供され得る）によって媒介される(Dittaら、1980，Proc ．Natl．Acad．Sci.77:7347-7351;Knaufら、1982，Plasmid 8:45-54)。組み込まれたTra機能を保有する大腸菌株、例えばS17-1は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できる。適当な複製起点、伝達起点及び選択機構を有するシャトルベクターを用いてライブラリーを構築することにより、ライブラリー内のドナー生物のＤＮＡ配列は、宿主生物の１つの最初の種から宿主生物の種々の他の種にたやすく動員することができ、そこでは、ドナーＤＮＡ配列は安定に維持され、複製され及び発現される。こうして、シャトルベクターで構築された、及び接合により多宿主生物に動員することができる移動可能な発現ライブラリーは、本発明の範囲に含まれる。例えば、好ましい典型的な発現ベクター−宿主生物の組み合わせは、コスミド SuperCos 1とEsherichia coli株XL1-Blue MR（いずれもStratagene（La Jolla、 CA）から市販されている。）である。このベクターは、BamHIクローニング部位に30〜42kbpの範囲のサイズのＤＮＡ挿入断片を受け取り、ネオマイシン耐性マーカー(neoR)及び哺乳動物細胞中での発現に用いられるSV40プロモーターを有する。また、このベクターは原核細胞における選択用のアンピシリン耐性遺伝子をも含む。E.coli宿主生物は、一定の制限系(hsdR、mcrA、mcrCB及びmrr)が欠損しており、エンドヌクレアーゼ欠損(endA1)及び組換え欠損(recA)である。宿主生物はシトシン及び／又はアデニンメチル化をもたらす挿入されたＤＮＡ（これは、しばしば真核性ＤＮＡ及びメチル-dNTP類似体を用いて合成されたｃＤＮＡ中に存在する。）を切断することができない。この系の利点には、制限マイナス、recAマイナス、E.coli宿主におけるライブラリーを最初に作成するための高効率のラムダin vitroパッケージング系の利用が含まれる。起源ゲノムＤＮＡの質は裸のＤＮＡ形質転換に要求される質よりも低くてもよいので、パッケージされたゲノムＤＮＡ挿入断片は分解に対して保護され得る。いったんE.coli宿主細胞中に入ると、ダメージを受けた挿入断片は宿主の細胞ＤＮＡ修復メカニズムによって修復され得る。この系は、ほんのわずかの量の出発ゲノムＤＮＡ（５〜１０μｇ）しか必要とせず、そしてそのパッケージング系が一定のサイズ範囲にある挿入断片のみを受け入れるのでサイズ選択は要求され得ない。E.coliの最初のライブラリーは増幅されて他の発現宿主生物への導入のための高効率の形質転換方法で用いられ得るスーパーコイルコスミドＤＮＡを産生し得る。 SuperCos 1ベクターは、複製のSV40開始点及び複製のストレプトミセス属開始点を有するneoR遺伝子（例えば、プラスミドpIJ101又はpIJ922由来）、並びにチオストレプトン耐性遺伝子を置換することによるストレプトミセス属宿主中でのクローニングのためにさらに改変され得る。シャトルベクター（これはストレプトコス(Streptcos)と称する。(図６Ａ参照)）は、pIJ101開始点並びにKpnI及びH indIIIでの消化によるチオストレプトン耐性遺伝子を含むpIJ699(Hopwoodら，19 85，ストレプトミセス属の遺伝的操作(Genetic Manipulation of Streptomyces) ，研究室マニュアル(A Laboratory Manual)，The John Innes Foundation）由来の4.0kbの断片の単離によって構築される。この断片はKpnI部位で平滑にされて( blunted)、SuperCosのSmaI-HindIII制限部位にクローニングされる(関連した例としてBierman 1992、Denis 1992を参照)。さらに、接合性移入によってシャトルコスミドベクター動態化のために配列エレメントが導入され得る（Biermanら，1992，Gene 416:43-49）。ストレプトミセス属特異性プロモーターを含む種々のストレプトコスバージョン(version)がBamHIクローニング部位に隣接するベクターに導入され得る。ＰＣＲを用いることによって、SuperCos １のNotI/EcoRI 部位に直接クローニングすることができるストレプトミセス属プロモーター断片が産生され得る。ermE、Pptr(1995，Mol Microbiol，17:989)及びhrdB(Buttner ，M.J．1989，Mol Microbiol，３巻，pp．1653-1659)を含む種々の公知のストレプトミセス属プロモーターが使用され得る。さらに、１又はそれ以上の複製起点をストレプトコス(Streptocos)内に操作して種々のStreptomyces/Actinomycete 種の間でベクターの複製及び維持を容易にすることができる。例えば、ストレプトミセス・ガナエンシス(Streptomyces ghanaensis)からのpSG5由来の複製起点を使用することができ、pSG5を基本とするベクターは和合的であることが示されており、従って、例えばSCP2^*、SLP1.2、pIJ101及びpSVH1等の他のストレプトミセスプラスミドからの複製起点と共存することができる(Muthら、1989，Mol Gen Genet 219:341-348)。このアプローチは一般的に広範な宿主−ベクター系に有用であり得る。したがって、SuperCos １は宿主複製開始点、選択可能なマーカー遺伝子、及び所望であれば相同プロモーターの導入によって改変され得る。本発明のライブラリーを構築するのに使用し得る他の適例のベクターはpBeloB AC11であり、これはプラスミドＦ因子に基づく改変細菌人工染色体（BAC）である(Shizuyaら、1992，Proc Natl Acad Sci 89:8794-8797)。低コピー数のプラスミドベクターは>300kbのドナーＤＮＡを扱うことができ、大腸菌内において安定に維持することができる。本発明に従って、プラスミドpBACは、広い宿主範囲のプラスミドRK2、ストレプトミセス・コエリカラー(Streptomyces coelicolor)(L ydiateら、1985，Gene 35:223-235)からの複製起点SCP2^*、及びアプラマイシン耐性遺伝子由来の送達起点の導入により改変することができる。宿主として植物細胞を用いるコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーのために、ドナーコーディング配列の発現は、多くの全てのプロモーターによって誘導され得る。例えば、好ましい株は、遺伝子操作の原理(Principles of Gene Nani pulation)1985，R.W.OLD及びS.B.Primorose第３版，Black well Scientific Pub .;Vectors:分子クローニングベクター及びその使用の概論(Asurvey of molecula r cloning vectors and their uses)1988，R.L.Rodriquez，D.T.Denhardt，Butt erworths Pub.;分子クローニングへの実際的なガイド(A Practical guide to mo lecular Cloning)1988，B.Perbal，John Wiley及びSonsに記載されており、CaMV の35S ＲＮＡ及び19S ＲＮＡプロモーター(Brissonら，1984，Nature 310:511 -514)等のウイルスプロモーター、又はTMVのコートタンパク質プロモーター(Tak amatsuら，1987，EMBO J．6:307-311)を使用することができ、また、RuBISCo(Co ruzziら，1984，EMBO J．3:1671-1680;Broglieら，1984，Science 224:838-843) の小サブユニット等の植物プロモーター；又は、例えば大豆hsp17.5-E又はhsp17 .3-B等の熱ショックプロモーター(Gurleyら，1986，Mol．Cell．Biol．6:559-56 5)が使用され得る。植物細胞及び原形質体のいずれもが宿主細胞として使用され得る。植物宿主には、限定するものではないが、トウモロコシ、小麦、米、大豆、トマト、タバコ、ニンジン、落花生、ジャガイモ、テンサイ、ヒマワリ、ヤマノイモ、ナズナ（ Arabidopsis）、ナタネ及びペチュニアのものが含まれ得る。細胞壁がなく、細胞培養物として増殖し、そして植物中に再生するという能力を有するという理由から、植物原形質体が好ましい。さらに、組換え構築物は、限定するものではないが抗生物質抵抗性（例えば、カナマイシン又はヒグロマイシン耐性）又は除草剤耐性（例えば、スルホニル尿素、ホスフィノスリシン(phosphinothricin)、又はグリホセート(glyphosate)耐性）を与える遺伝子を含む植物発現性の選択可能な又はスクリーニング可能なマ一カ一遺伝子を含み得る。スクリーニング可能なマーカーにば、限定するものではないが、β−グルクロニダーゼ(Jefferson，1987，Plant Molec Biol．Rep 5: 387-405)、ルシフェラーゼ(Owら，1986，Science 234:856-859)、及びアントシアニン色素産生を調節するＢタンパク質(Goffら，1990，EMBO J 9:2517-2522)をコードする遺伝子が含まれる。ドナー生物ＤＮＡを植物細胞に導入するために、植物の形質転換用のアグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)系が用いられ得る。そのようなＴ−ＤＮＡを基本とした形質転換ベクターの適切な設計及び構築は当業者にはよく知られている。かかる形質転換には、好ましくは、二元性(binar y)アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡベクター(Bevan，1984，Nuc．Acid Res.12:871 1-8721)及び共同培養法(Horschら，1985，Science 227:1229-1231)を使用する。一般的に、アグロバクテリウム形質転換系は双子葉植物の遺伝子操作に用いられている（Bevanら，1982，Ann．Rev．Genet 16:357-384;Rogersら，1986，Method s Enzymol．118:627-641）が、ＤＮＡを単子葉植物及び植物細胞に形質転換及び移入するのにも用いられ得る(Hernalsteenら，1984，EMBO J 3:3039-3041;Hooyk ass Van Slogterenら，1984，Nature 311:763-764:Grimsleyら，1987，Nature 3 25:1677-1679;Boultonら，1989，Plant Mol．Biol．12:31-40;Gouldら，1991，P lant Physiol．95:426-434参照)。他の態様においては、組換え核酸構築物を植物細胞に導入するための種々の代替方法も利用し得る。これらの他の方法は、特に、ターゲットが単子葉植物細胞である場合に有用である。代わりとなる遺伝子移入及び形質転換方法には、限定するものではないが、裸ＤＮＡのカルシウム−、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−、又はエレクトロポレーション−仲介取り込みによる原形質体形質転換（ Paszkowskiら，1984，EMBO J 3:2717-2722;Potrykusら，1985，Molec. Gen．Genet．199:169-177;Frommら，1985，Proc．Nat．Acad．Sci．USA 82:5824 -5828;Shimamoto，1989，Nature 338:274-276参照）及び植物組織のエレクトロポレーション（D'Halluinら，1992，Plant Cell 4:1495-1505）が含まれる。さらなる植物細胞形質転換方法には、微量注入法、炭化ケイ素仲介ＤＮＡ取り込み (Kaepplerら，1990，Plant Cell Reporter 9:415-418)、及び微量噴射性衝撃法( microprojectile bombardment)(Kleinら，1988，Proc．Nat.Acad．Sci．USA 85: 4305-4309;Gordon-Kammら，1990，Plant Cell 2:603-618参照)が含まれる。植物分子生物学的技術の総説については、例えば、Weissbach & Weissbach,19 88,植物分子生物学のための方法(Methods for Plant Molecular Biology)，Acad emic Press，NY，VIII節，pp．421-463;及びGrlerson & Corey，1988，植物分子生物学(Plant Molecular Biology),第２版，Blackie，London,7〜９章を参照。昆虫系においては、オートグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルス(Autog rapha californica nuclear polyhydrosis virus)(AcNPV)、バキュロウイルス(b aculovirus)が、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞中でドナー遺伝子を発現させるためのベクターとして用いられる。そのドナーＤＮＡ配列は、ウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）にクローニングされて、AcNPVプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下で配置される。次いで、これらの組換えウイルスを用いて宿主細胞に感染させ、その挿入遺伝子を発現させる(例えば、Smithら，1983，J Virol 46:584;Smith,米国特許第4,215,051号参照)。酵母においては、構成プロモーター又は誘導プロモーターを含む多くのベクターが、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)(パン酵母)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)(分裂酵母)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、及びハンセニュラ・ポリモルファ(Hansenula po lymorpha)（メチロトロピック(methylotropic)酵母）とともに用いられ得る。再考のために、分子生物学の最新のプロトコール(Current Protocols in Molecula r Biology)，２巻，1988，編集Ausubelら，Greene Publish．Asso c．& Wiley Interscience，13章;Grantら，1987，酵母用発現及び分泌ベクター( Expression and Secretion Vectors for Yeast)，in Methods in Enzymology，編集Wu & Grossman，1987，Acad．Press，N.Y.,153巻，pp.516-544;Glover，198 6，ＤＮＡクローニング(DNA Cloning)，II巻，IRL Press，Wash.，D.C.，３章；及びBitter，1987，酵母における異種遺伝子発現(Heterologous Gene Expressio n in Yeast)，Methods in Enzymology，編集Berger & Kimmel，Acad．Press，N. Y.,152巻，pp.673-684；及び酵母サッカロミセス属の分子生物学(The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces)，1982，編集Strathernら，Cold Spring Harbor Press，Ｉ及びII巻を参照のこと。大腸菌とS.pombeとの間を往復することができる適例のベクター、pDblet(Brunら、1995，Gene，164:173-177)、及び該ベクターの改変は、第5.5.7.節に記載されている。本発明はまた、一連のS.pombe/E.coliコスミドベクター、例えばpPCos+ura(図 13)、pPCos1(図14)を提供する。これらは、マルチクローニング部位、大腸菌内における複製及び選択のためのそれぞれColE1起点及びアンピシリン耐性遺伝子、S.pombeにおける維持及び選択のための自己複製配列(ARS)及びura4遺伝子、SV 40起点、並びにλファージにおけるin vitroパッケージングのための二つのcos 部位を含む。pPCos+ura及びpPCos1の構築は、第5.5.7.節に記載されている。哺乳動物宿主細胞においては、種々の哺乳動物発現ベクターが市販されている。さらに、多くのウイルスを基礎とした発現系を利用し得る。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、ドナーＤＮＡ配列はアデノウイルス転写／翻訳調節複合体、例えば後期プロモーター(late promoter)及び三部分リーダー配列、に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、in vitro又はin vivo組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅｌ又はＥ３）中の挿入によって、感染宿主中で生育可能で異種の産物を発現する能力のある組換えウイルスが得られる(例えば、Logan & Shenk， 1984，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）81:3655-3659参照)。トランス作用複製因子としてエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）開始点（OriP）及びEBNA-1を用いて、シャトルエピソームクローニングベクター、例えばEBO-pCD が創出されている(Spickofskyら，1990，DNA Prot Eng Tech 2:14-18)。また、レトロウイルスを基礎としたウイルスベクターも使用され得る(Morgensternら， 1989，Ann Rev Neurosci，12:47-65)。また、ワクシニア7.5Kプロモーターが使用され得る(例えばMackttら，1982，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）79:7415-7 419;Mackettら，1984，J．Virol．49:857-864;Panicaliら，1982，Proc．Natl． Acad．Sci．79:4927-4931参照)。限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler ら，1977，Cell 11:223)、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski，1962，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 48:20 26)、及びアデニンホスホリボシルトランスフエラーゼ(Lowyら，1980，Cell 22: 817)遺伝子が、それぞれtk^-、hgprt^-又はaprt^-細胞中で用いられ得ることを含む多くの選択系が哺乳動物細胞に使用され得る。また、抗代謝剤耐性は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(dhfr)(これはメトトレキセートに対する耐性を与える（Wigle rら，1980，Natl．Acad．Sci．USA 77:3567；O'Hareら，1981，Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 78:1527）)；gpt（これはミコフェノール酸(mycophenolic acid）に対する耐性を与える（Mulligan & Berg，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:2072）)；ネオマイシンホスホトランスフエラーゼ(neo)（これはアミノグリコシドＧ−418に対する耐性を与える(Colberre-Garapinら，1981，J．Mol．Biol ．150:1)）；及びヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hyg)（これはヒグロマイシンに対する耐性を与える(Santerreら，1984，Gene 30:147)）の選択の基礎として用いることができる。また、本発明は、コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの能力を改良する宿主生物の特異的な改変を提供する。ライブラリーを第二の代謝産物を産生する目的に用いる場合、その化合物の毒性はそのライブラリーにおけるこれらの増殖性宿主生物の発現量の低下(underrepresentation)に導くことができる。本発明の一つの態様においては、宿主生物は、その宿主生物の成長及び生存が目的とする化合物の産生によってよりいっそう不利な影響を受けるように改変され得る。耐性を増大させることによって、スクリーニング段階及び産生段階で強力な薬物を産生している宿主生物の消失を低減することができる。宿主生物の好ましい改変は、宿主生物における活性薬物エフラックス系への導入及び／又は該エフラックス系の過剰産生である。エフラックスを引き起こした膜結合エネルギーは、細菌、酵母及び哺乳動物細胞を含む大部分の生物における薬物耐性において大きな役割を演じている（Nikaido 1994，Science 264:382-38 8;Balziら，1994，Biochim Biophys Acta 1187:152-162;Gottesmanら，1993，An n Rev Biochem 62:385）。増大したエフラックス系の相補体を有する改変された宿主生物は、より広範な潜在的毒性化合物を活発に分泌することができ、したがって、宿主生物内部のそれらの蓄積を低減することができる。化合物を産生する代謝経路の最終産物阻害などの負のフィードバックメカニズムが回避され得る。さらに、目的とするその化合物は宿主生物内部に蓄積されないので、その化合物の単離はより効率的に行われ得る。細菌においては、広範な種類の構造的に無関係の分子、例えば、ポリケチド抗生物質(E.coliのacrAE遺伝子，Maら，1993，J Bacteriol 175:6299-6313)、フルオロキノリン及び臭化エチジウム（枯草菌(Bacillus subtilis)のbmr及びスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)のnor A，Neyfakhら，1993 ，Antimicrob Agents Chemother 37:128-129)、ドキソルビシン(doxorubicin)( ストレプトミセス・ピューセテイウス(Streptmyces peucetius)のｄrr)、及び第４級アミン類（クレブシエラ・アエロゲネス(Klebsiella aerogenes)のqacE及び E.coliのmvrC）を送り出すことができる非常に多くのエフラックス系が研究されている。エフラックス系の非限定的な例を一覧にした表IIIを参照のこと。そのような全てのエフラックス系が原核性宿主生物中で使用され得る。酵母においては、多面発現性薬物耐性をもたらす多くの遺伝子がエフラックス系をコードしており、本発明において有用であり得る。例えば、bfrl+遺伝子は、シゾサッカロミセス・ポンベにブレフェルディン(brefeldin)Ａ耐性を与え、カンジダ・アルビカンス(Candidaalbicans)のCDR1遺伝子はシクロヘキサミド及びクロラムフェニコールに対する耐性を与える(Prasadら，1995，Curr Genet 27 :320-329)。哺乳動物細胞のために、ＡＴＰ−結合性ポンプタンパク質のクラスに属する多剤耐性タンパク質が使用され得る(Jurankaら，1989，FASEB J．3:2583-2592;Pau lusmaら，1996，Science 271:1126-1128;Zamanら，1994，Proc．Natl Acad Sci ，91:8822-8826;Breuningerら，1995，Cancer Res 55:5342-5347;Koepsell EP 0 699753)。ヒトmdrl多剤耐性遺伝子はサッカロミセス・セレビシエ中で機能的に発現された（Kuchlerら，1992，Proc Natl Acad Sci 89:2302-2306）。また、他の任意のエフラックス系は真核細胞にも使用され得る。１以上のエフラックス系が宿主生物に導入され、誘導され又は過剰産生され得る。エフラックス系の成分をコードする遺伝子を宿主生物に導入し、上記の発現ベクター及び技術を用いて発現させ得る。いくつかの場合には、エフラックス系遺伝子の発現に誘導プロモーターを用いるのが都合がよい。 5.1.4．コンビナトリアル天然経路発現ライブラリー本発明は、コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの構築及び使用に関する。このライブラリーにおいて、宿主生物は、多数のドナー生物種から誘導され、ドナー生物の機能的な遺伝子産物を産生する能力のある天然の生化学的経路又はその一部をコードする遺伝物質を含む。したがって、ドナー生物の生化学的経路又はその一部は、ライブラリーの個々の宿主生物中で機能的に再構成される。そのような生化学的経路の新規の活性及び化合物は、従来の薬物発見技術又は本明細書で提供された方法によりスクリーニングしやすくなる。ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかが、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリー及び混合ｃＤＮＡ／ゲノムＤＮＡライブラリーを含み得るライブラリーを作製する出発遺伝物質として用いられ得る。多数のドナー生物、例えば5.1.1．節に記載した生物から誘導されたＤＮＡ断片を宿主生物のプールに導入してそのプール内の各宿主生物がそのドナー生物の一つから誘導されたＤＮＡ断片を含むようにする。宿主生物及びドナー生物が、ＤＮＡの同様のＧＣ含量及び共通のＲＮＡスプライシングメカニズム等の一定の遺伝的特徴、又は最適増殖温度等の生理学的特徴を共有する場合、都合がよい。したがって、ドナー生物に系統発生的に密接に関連している宿主生物を用いるのが望ましい。例えば、原核性宿主生物が他の原核細胞のオペロンのクローニング及び発現により望ましい。従来の薬物発見又は薬物開発技術に従わないドナー生物が好ましい。例えば、大部分の海洋細菌の特性付けは不十分であり、通常の陸生微生物学的プロトコールには従わない。本発明は、産生及び精製プロセスの開発を簡単にすることができる。移入されたドナーＤＮＡの断片は、完全な生化学的経路又はその一部の機能タンパク質をコードするコーディング領域、並びにプロモーター及びターミネーター等の固有的に結合した調節領域を含み得る。生化学的経路全体をコードするより高い確率を有する大きな原核性ゲノムＤＮＡ断片を用いることによって最適の結果が得られ得る。移入されたＤＮＡ断片の固有の機能及び機構が宿主生物に維持される場合、ドナー生物の遺伝子は協調的に発現され得る。また、宿主生物中の移入遺伝子の転写を確実にするように、ＤＮＡ断片に結合し得る外因性調節領域も提供され、それによって固有のプロモーターから開始された転写を置換し、又は補足する。興味深いことに、海洋細菌から誘導された多くの遺伝子はE.coli中の機能タンパク質を発現するために固有のプロモーターを利用することが発見されている。したがって、海洋微生物の遺伝子は外因性調節領域を用いる必要なく発現され得る。E.coli中でその固有のプロモーターを使用する海洋細菌遺伝子の例の一覧を表IVに示す。好ましい実施態様において、本発明の方法は、原核動物、たとえば細菌の遺伝子を、ゲノム中の、オペロンと称される離散した機能的関連性を有する遺伝子クラスターへと組織化する点で有利な利点を有する。こうしたクラスターでは、生化学的経路の各種要素をコードする遺伝子が、共通の調節配列に結合されている。糸状菌（放線菌類）の機能関連遺伝子も、クラスター状であることが知られている。多くの細菌、放線菌、及び少数の真核生物の菌類の生合成経路についての遺伝子クラスターが単離され、性状決定されている。たとえば、エルウィニア・ヘルビコーラ（Erwinia hervicola）でカロテノイドゼアキサンチンならびにβ− クリプトキサンチンをde novoに産生する際に使用される１２のタンパク質は、細菌である大腸菌中で活性化させ、同時に産生させることが可能である(Perryら ,1986，J．Bacteriol，168:607-612;Hundleら，1991，Photochem and Photobiol ，54:１:89-93)。原核生物のアミノ酸生合成経路、たとえばロイシン及びイソロイシン生合成、ならびにグルコーストランスファー系も、離散クラスターに含まれている。したがって、原核生物をドナー生物として使用する場合には、生合成経路で機能的に関連している遺伝子は、１個のクローン中に単離される可能性が高い。比較的少数の非コード領域を含むコンパクトなゲノムを有するドナー生物が好適である。多くの場面で、ドナー生物は、比較的小型のゲノム、たとえば、大腸菌では長さが４４００kbp、古細菌であれば２５００−３５００kbpのゲノムを有する細菌である。ドナーゲノムの配列を全てを含んでいる確率を９９％とするために、ライブラリー中に必要な独立クローンの数は、以下の式（Clarkeら、1976 ，Cell 9:91-99）によって計算される。式中、Ｎは、ライブラリー中で必要とされる組換えクローンの数であり、Ｐは、配列が表されている確率であり、ｆは、単一の組換えクローン中でのゲノムの部分の割合である。たとえば、大腸菌は、約４４００kbpのＤＮＡを有しており、コスミドベクターは、約４０kbpのＤＮＡをパッケージすることができる。こうした計算からすると、大腸菌のゲノム全体が、コスミドライブラリー中で５０４個という数少ないクローンで十分に表されうると考えられる。通常のＤＮＡライブラリーは、５００，０００個の独立組換えクローンを含んでいることもあるので、こうしたライブラリーは、大腸菌に似たサイズのゲノムを有する１０００種までの異なった細菌の種を有効に表しうるということになる。したがって、１０００種あるいはそれ以上の種の細菌の多様な遺伝物質を含む遺伝子発現ライブラリーをスクリーニングすることによって、相当の化学的多様性を創出し、検定することが可能である。標準的参考論文、たとえば、Maniatisら、1989，Molecular Cloning，第２版，Cold Spring Harbor Press，New York;ならびにAusubelら，Current Protocol s in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscie nce，New Yorkに記載された方法にしたがって、コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーを構築する際に使用される通常の分子生物学的反応を実施することができる。コンビナトリアル天然経路遺伝子発現ライブラリーのクローニング戦略を図３に示す。ドナー生物由来のいかなる細胞も、遺伝子発現ライブラリーを構築するにあたっての核酸源となりうる可能性を有しており、染色体ＤＮＡならびに染色体外遺伝因子、たとえば天然に生じているプラスミドを含むゲノムＤＮＡを使用することが可能である。また、ドナー生物のＲＮＡも使用が可能である。当業界で公知の任意の技術によって、ＲＮＡ、好ましくはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を抽出、精製し、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換することができる。ｃＤＮＡの第１ストランドの合成のプライミングには、オリゴー（ｄＴ）プライマーあるいはランダム配列プライマーを使用することができる。ＤＮＡ挿入断片は、必要に応じて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することができる。ゲノムＤＮＡならびにＲＮＡは、第５．１．２節に記載の方法、あるいは当業界で公知の方法で、抽出、精製を行うことができる。糸状菌ならびに細菌については、そうした方法は、ａ）液体培地中で生育させた若い菌糸体から調製した原形質体を高速ＳＤＳ／高塩溶解に供し、その直後に平衡化したフェノールで抽出する方法、ｂ）グアニジニウムイソチオシアネート中で原形質体を高速溶解してから、ＣｓＣｌ勾配中で超遠心する方法、あるいはｃ）アガロースプラグ中で調製した原形質体由来の高分子量ＤＮＡを単離してから、パルスフィールド電気泳動を行う方法をはじめとするいくつかの手法のいずれかとすることができる。細菌については、リゾチーム／洗浄剤で溶菌し、非特異的プロテアーゼを加えてインキュベーションを行ってから、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールによる一連の抽出を行うというさらに別の方法も有用である。最適の結果を得るうえでは、完全なオペロンあるいはその実質的な部分を含む可能性が高い、大型でランダムな原核生物のゲノムＤＮＡ断片が好適である。ゲノムＤＮＡは、各種の制限酵素を使用して、特定の部位で切断することができる。ランダムで大型のＤＮＡ断片（２０kbp以上）は、ゲノムＤＮＡを、頻回切断( frequent-cutting)制限酵素で部分的に消化することによって生成することができる。ゲノムＤＮＡの必要量は、使用するゲノムの複雑度に応じて変化する。細孔の針を通過させたり、超音波処理を行うことによって、ＤＮＡを物理的に切断することも可能である。こうしたＤＮＡ挿入断片は、空の発現ベクターに挿入する前に、標準的な方法、たとえばアガロースゲル電気泳動、動的密度勾配遠心、カラムクロマトグラフィーといった方法（但し、これらには限定されない）で、サイズによって分けることができる。線形の１０−４０％のしよ糖勾配が好ましい。挿入は、ＤＮＡ断片を、相補的付着末端を有する発現ベクターにライゲーションすることによって行う。ライゲーション反応で使用するベクタ−ＤＮＡならびにＤＮＡ挿入断片の量は、それらのＤＮＡの相対的なサイズに応じて決まり、当業界で公知の方法によって経験的に決定することが可能である。しかし、ＤＮＡの断片化に使用する相補的制限部位が発現ベクター中に存在しない場合には、ＤＮＡ分子の両端を酵素で改変して、平滑末端を生成するなどの処理を行う。あるいは、所望される任意の部位を、ヌクレオチド配列、すなわちリンカーあるいはアダプターをＤＮＡ末端にライゲーションすることによって生成することもでき、この場合、こうしたライゲーションされるリンカーあるいはアダプターは、制限エンドヌクレアーゼの認識配列をコードする特定の化学合成オリゴヌクレオチドとすることができる。さらに別の方法では、切断した発現ベクターならびにＤＮＡ挿入断片を、ホモポリマーを用いたテーリングで改変することもできる。ベクターＤＮＡをＤＮＡ挿入断片とライゲーションした後、発現用構築物を宿主生物に導入する。その際には、形質転換、トランスフェクション、インフェクション、接合、原形質体融合、リポソームを媒介とする導入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ならびにマイクロ弾打ち込み(microprojec tile bombardment)をはじめとする各種の方法を用いることができるが、これらに限定されるものではない。特定の実施態様では、バクテリオファージあるいはコスミドＤＮＡの宿主大腸菌への導入を、バクテリオファージ粒子にＤＮＡを in vitroでパッケージングし、大腸菌をこれらの粒子で感染させることによって行う。天然状態で生じている他のＤＮＡ導入メカニズム、たとえば細菌の接合を利用することも可能である。発現用構築物を含む宿主細胞をプールしてライブラリーを形成した後、当業界で公知の方法で、それらの細胞を増幅および／または複製することができる。増幅を行うのは、多数回にわたって使用しうるライブラリーを得ることが目的である。増幅は、ライブラリーを培養し、細菌を生育させ、ファージまたは細菌を集めて保存することによって行う。ライブラリーは、また、順序よく配列させて保存することもできる。ライブラリーを低密度で培養し、単一の離散したプラークあるいはコロニーを形成させ、個々のプラークあるいはコロニーをコードされたマルチウェルプレートのウェル、たとえば９６ウェルプレートあるいは３８４ウェルプレートに移す。個々のクローンを、ウェル中で、適当な条件下で生育させる。コードしたマスタープレートは、１枚以上の作業プレートに各クローンを別々に複製させる際のアーカイブ的(archival)ソースとして使用することができる。このように、ライブラリーの各クローンは、個別に操作、検定することができる。コードされたアーカイブプレートは、将来の使用に備えて、密封、保存することができる。クローンの複製ならびに移動は、マルチピン複製装置、あるいは流体操作用マルチチャネル装置を用いて行うことができる。移動ならびに操作は、すべて、あるいは大半を、実験室ロボットによって行うのが好ましい(Bentleyら,1992，Genomics 12:534-541 )。本発明のライブラリーは、凍結乾燥、あるいはフリーザーでの低温保存(−２０℃から−１００℃、あるいは液体窒素中（−１７６℃から−１９６℃)で保存することができる。ライブラリー中のドナーＤＮＡを含む宿主細胞は、使用した宿主−ベクター系に応じて、各種の方法によって識別、選択することができる。一つのアプローチでは、こうした宿主生物は、マーカー遺伝子の機能、たとえば、チミジンキナーゼ活性、カナマイシン、アンピシリン、ブレオマイシンあるいはチオストレプトンのような抗生物質への抵抗性、メラニンのような色素の生成、メトトレキセートに対する抵抗性の存否で識別、選択することができる。あるいは、代謝試験、組織培養でのフォーカス形成、又はバキュロウイルスでの封入体の形成によって示唆されるような宿主細胞の表現型又は代謝の変化を使用することもできる。ドナーＤＮＡの存在について選択を行ったら、そのクローンについて一連の酵素検定あるいは代謝試験を実施して、さらなる特性分析を実施してもよい。ドナーＤＮＡあるいはその一部を含むクローンのライブラリー中のドナーＤＮＡ挿入断片の特性を調べるためには、代表的な１組のクローンを用いて、ＤＮＡのミニ調製ならびに制限分析を行うことができる。結果からは、ドナーＤＮＡのサイズ制限とパターンのフィンガープリントが得られ、これは、ライブラリーについて想定される挿入断片の範囲に匹敵する。 5.1.5．コンビナトリアル・キメラ経路発現ライブラリー本発明はまた、コンビナトリアル・キメラ経路発現ライブラリーの構築および使用に関し、ここで、宿主有機体が複数のドナー生物種に由来するランダムに鎖状体を形成した遺伝物質を含有し、そしてドナー生物の機能性ある遺伝子産物を生産しうるものである。ライブラリー中の宿主生物の相当数が１種またはそれ以上の種のドナー生物に由来する遺伝子のランダムでユニークな組み合わせを含有してもよい。クローン化された遺伝子の同時発現は、それらの各々の本来の調節領域によって、または外因性として供給された調節領域によって行うことができる。異なるドナー生物に由来する複数の遺伝子産物が宿主生物中で相互作用し、新規なキメラ代謝経路および新規化合物を生成する。かかるキメラ経路の新規な活性および化合物により、従来の薬物探索技術によっるスクリーニング、または本明細書で提供される方法によるスクリーニングがより容易になるであろう。コンビナトリアル・キメラ経路遺伝子発現ライブラリーにおいて、どのように新規経路または化合物が生成されるかといういずれかの理論に限定されるものではないが、複数種のドナー生物に由来する機能性を有する異種遺伝子の同時発現により、複数の遺伝子産物がin vivoで相互作用することが可能となり、宿主生物の要素との相互作用も可能となる。このような相互作用によって新たな生化学的反応のセットが生じるであろうし、それらの幾つかは協同して作用してキメラの生化学的経路を形成しうる。異種遺伝子産物はそれらの各々のドナー生物中には存在しない基質、コファクターおよびシグナル形成分子に遭遇する可能性がある。このような基質、コファクターおよびシグナル形成分子は宿主生物、同じ宿主生物中に同時発現する他の異種遺伝子産物、または培地から供給されうる。さらに、異種遺伝子産物の幾つかは構造的に修飾することができ、宿主生物における生合成の間に、異なって画分化されるかまたは局在化されうる。異種遺伝子産物の幾つかは、それら各々のドナーの宿主細胞環境とは異なる宿主細胞環境に暴露されてもよい。幾つかの異種遺伝子産物はまた宿主生物に対しても作用し、宿主細胞環境を変化させうることが考えられる。異種遺伝子産物の機能に影響するかまたはそれによって影響を受ける可能性のある宿主細胞環境の要素には、塩濃度、微量元素、栄養素、酸素、代謝産物、エネルギー源、酸化還元状態、およびpHが包含されるが、これらに限定されるものではない。異種遺伝子産物の幾つかはまた宿主遺伝子産物とも相互作用して、宿主の代謝経路の修飾を生じさせる可能性がある。異種遺伝子の組み合わせに依存して、新規なキメラ生化学的経路および天然には存在しない新規なクラスの化合物がライブラリーの宿主生物中で形成されうる。コンビナトリアル・キメラ経路発現ライブラリーにおいては、ドナー生物の遺伝子供給源が増加され、拡張されて、個々の生物では見出されない可能性のある科学的構造物の多様性を提供する。そのようにして作製したライブラリーは、本発明によって提供される方法または従来の方法を用いてスクリーニングすることができる。このようにして、新規経路および化合物を、一層薬物スクリーニングにかけやすいものとすることができる。 5.1.1.節に記載された任意のドナー生物をコンビナトリアル・キメラ経路発現ライブラリーの作製に使用することができる。ドナー生物はそれらの公知の生物学的性質に基づいて選択することができ、またはそれらは公知および／または未同定の生物の混合物であってもよい。本発明のコンビナトリアル・キメラ経路発現ライブラリーは5.1.3.節に記載された原理に従って組み立てることができる。多数のドナー生物種からのＤＮＡ断片のランダムなコンカテマー形成を可能とするためには、ライブラリーの組み立てのための操作は以下の工程、すなわちより小さいゲノムＤＮＡ断片の生成、プロモーターおよびターミネーターなどの調節配列とのライゲートによる遺伝子カセットの形成、および遺伝子カセットのコンカテマー形成、を包含させることにより修飾してもよい。挿入ＤＮＡはｍＲＮＡに由来する相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、および／またはゲノムＤＮＡの断片、またばアーキバルな若しくは移動性をもたせるコンビナトリアル発現ライブラリー由来のＤＮＡであってもよい。異なる種のドナー生物のＤＮＡまたはＲＮＡは同時精製してもよく、または別々に単離し、次に特定の比率で組み合わせてもよい。挿入ＤＮＡのランダムな混合はクローニングベクターまたは発現ベクター中への挿入の前に、任意の段階で行なうことができる。例えば、アーキバルライブラリー由来のＤＮＡの大型の断片を単離・消化して小型断片とし、次いでこれらをランダムに再度ライゲートして、第２のコンビナトリアル発現ライブラリーのための挿入ＤＮＡを形成させることができる。ＤＮＡのランダムな断片の生成および混合のための他の方法も用いることができ、例えば、ＤＮＡ断片が幾らかの配列相同性を共有する場合には、in vitro組換え法を用いることができる。メチル化されたヌクレオチド、例えば、５−メチル−ｄＣＴＰ、をｃＤＮＡ合成において使用して酵素的開裂に対する保護を付与することができ、プロモーターおよびターミネーター断片に関してセンス方向にｃＤＮＡ挿入物を方向を一定にしたクローニング（指向性クローニング、directional cloning）を可能にする。２〜７kbpの範囲のゲノムＤＮＡのランダムな断片は、比較的高頻度の切断部位を有する制限酵素、例えば、Sau3AIを用いる部分消化により生成させることができる。部分消化はサンプルのアリコートをアガロースゲル電気泳動にかけることによりモニターし、確認する。構成プロモーターまたは誘導プロモーターおよびターミネーターなどの外因性調節領域を、クローン化された遺伝子を発現させるために提供してもよい。宿主およびドナー発現系が適合性でない場合には、かかる調節配列を提供することが必須である。特別な発現宿主に特異的であり、それらの末端に定義された制限部位を有する種々のプロモーター断片およびターミネーター断片を生成させるためにＰＣＲを使用することができる。ＤＮＡ挿入物に調節領域を付着させるために、任意の方法を使用することができる。クレノウ断片および部分的ヌクレオチドセットでの処理、すなわち部分的フィルイン反応により、適合性の末端を有するプロモーター断片およびターミネーター断片にのみ特異的にライゲートするであろう挿入ＤＮＡ断片を作ることができる。本発明は、ユニークな制限部位のいずれか一方の側に逆に位置するプロモーターの２コピーを含有する遺伝子カセットの使用を包含する方法を提供する。この制限部位に挿入された任意のＤＮＡは、この２つのプロモーターの各々によって、両側から両方の鎖上に転写されよう。本発明はまた、ＤＮＡ挿入物のいずれか一方の側に位置するプロモーターおよびターミネーターを含有する遺伝子カセットの使用を包含する別の方法をも提供する。もしｃＤＮＡの指向性クローニングのための操作をその後に行なう場合には、ｃＤＮＡ挿入物の5'末端と3'末端とは、プロモーター断片の3'末端およびターミネーター断片の5'末端それぞれと、ユニークにマッチする制限部位を有するはずである。両末端に適合性の制限部位を有するゲノムＤＮＡ断片またはｃＤＮＡを、プロモーターにライゲートし、ある場合にはターミネーター断片にライゲートして、約１〜10kbpの平均サイズを有する遺伝子カセットを形成する。多数の転写ユニットをからなるコンカテマーを、ペプチド合成で使用すると同様の方法により組み立てる。遺伝子カセットのプールのサブセットを、一方の末端で固相、例えば、磁気ビーズに結合させる。他の遊離末端は、「脱保護」および転写ユニットの残りのプールの連続ライゲーションという幾つかの逐次的サイクルに供する。この固相により、各付加サイクル後に、ライゲーションしていないＤＮＡ断片からのコンカテマーの分離が可能となる。コンカテマー形成が完了すると、イントロンヌクレアーゼなどの制限酵素とともにインキュベートして、コンカテマーを遊離させる。このヌクレアーゼは、固相に隣接したユニークで非常に数の少ない部位を開裂させて、コンカテマーを形成したＤＮＡの開裂の確率を低下させる。次に、コンカテマー形成したＤＮＡをクローニングベクターに挿入して発現構築物を形成させ、これを適当な宿主生物中に導入する。あるいは、この構築物を、宿主生物中へ導入する前に増幅させるために、E．coli recA^-株を形質転換してもよい。プロモーター断片およびターミネーター断片の合成、遺伝子カセットの作製、ＤＮＡ挿入物の組み立て、および挿入物とベクターとのライゲーションの詳細は 5.4.節および5.5.節に示す。ひとたびコンビナトリアル・キメラ経路発現ライブラリーを組み立てれば、5 ．1.3.節に記載したと実質的に同じ方法で、保存し、増幅させ、複製させ、予備スクリーニングおよびスクリーニングを行なうことができる。上記ベクターが、適切な複製起点、適切な導入起点、および／または適切な選択機構を含有する場合には、ライブラリー中の遺伝物質を、ある種の宿主生物から発現用の他の種または株に移入することができる。 5.1.6．勾配をつけたコンビナトリアル発現ライブラリー本発明の別の態様においては、勾配をつけたコンビナトリアル天然経路発現ライブラリーまたはキメラ経路発現ライブラリーを、１以上のドナー生物種から一緒にプールし、予め選択したＤＮＡの断片から作製することができる。ドナー生物の全てのプールされたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのみを用いる代わりに、この方法では、スクリーニングを必要とするクローン数を減少させ、目的の化合物を生産するクローンのパーセンテージを増大させるであろう。予め選択されたＤＮＡ断片は、部分的または完全な生合成経路をコードする遺伝子を含み、目的の化合物の産生に関連するか、またはそれに関与する公知の遺伝子から作製された複数のプローブを当初のＤＮＡライブラリーにハイブリダイズさせることにより予備選択することができる。好ましくはコスミドライブラリーまたは細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーであり、必ずしも発現ＤＮＡライブラリーではない当初のＤＮＡライブラリーは、１以上のドナー生物種からのＤＮＡを含有しうる。さらに予備スクリーニングを行なうために、当初のライブラリーが発現ライブラリーである場合には、陽性クローン中のＤＮＡを産生のためにE．coliまたはStreptomyces lividansなどの宿主中に移し、その中で発現させることができる。１以上の当初ライブラリーは予備スクリーニングすることができ、すべての陽性クローンからのＤＮＡをプールして勾配をつけたコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーを作るために使用することができる。当初ライブラリーまたはアーキバルライブラリーを増幅させて、ドナー生物のＤＮＡを種々の宿主生物中で予備スクリーニングするとができる。本発明の１つの態様では、クローニングベクターまたは発現ベクターは、5.1.3節に記載の適切な複製起点および／または適切な導入起点を含むことができ、これにより、当初ライブラリーまたはアーキバルライブラリーの全体を様々な適合性宿主生物中に、コンジュゲーションにより移入または移動させることができる。該移入はまた、ドナー遺伝物質をアーキバルライブラリーから単離し、該遺伝物質を他の生物種または株中に何らかの方法、限定するわけではないが、形質転換、トランスフェクションおよびエレクトロポレーションなどの方法により導入することにより行うことができる。例えば、ひとたびStreptomyces lividansで遺伝子発現ライブラリーを作製すると、オキシテトラサイクリンを生産するS．rimosisまたはアクチノマイシンＤを生産するS．parlusなどの、発現とスクリーニングのために限定された宿主生物中に導入することができる。他の例としては、アーキバルライブラリーを大腸菌（E．coli）中に構築し、核酸プローブを用いるハイブリダイゼーションにより予備選択して目的の遺伝物質を同定することができる。予備選択されたＤＮＡ断片をアーキバルライブラリーから単離し、次いでランダムに混合し、そして移動性をもたせる発現ベクター中にクローン化して勾配のついたコンビナトリアル発現ライブラリーを形成することができる。このようなライブラリーは代謝経路の特定のクラスに富んでおり、異なる宿主生物中に移入して、異なる生化学的および／または遺伝的環境下で発現させることができる。予備スクリーニングのために使用したプローブは、ポリケチド(polyketide)生合成遺伝子座などの任意のクローン化された生合成経路に由来するものであってもよい。なぜなら、そこには最もよく特徴付けされた生合成遺伝子座が存在し、公知のクラスター間にはかなりの保存配列があるためである。例えば、actI(アクチノロジン生合成−Malpartidaら、1987 Nature 325:818-820)、whiE（胞子色素生合成−Blancoら、1993 Gene 130:107-16）およびeryA1(Donadioら、1991 Science 252，675-679)。同様の原理を、他の抗生物質生合成遺伝子座または二次代謝産物生合成遺伝子座に適用することができる。例えば、Bacillus（Stache lhausら、1995 Science 269:69-72）などの低GCグラム陽性細菌および、チオストレプトン、バージニアマイシン、バリノマイシンおよびアクチノマイシンを生産するActinomycetes種などの高GCグラム陽性細菌においてクローン化されたペプチドシンセターゼ遺伝子は、プローブとして使用するために充分な配列の相同性を有し、両方の細菌群における新規な生合成遺伝子座を同定することができる。ペプチドシンターゼおよびアミノグリコシドシンターゼなどの他のクローン化された生合成経路もまた、当初のライブラリーを予備スクリーニングするためのプローブを提供しうる。あるいは、当初のＤＮＡライブラリーは二次代謝に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ由来のプローブによってスクリーニングすることもできる。このようなプローブは、総ＤＮＡから非コードＤＮＡおよび一次代謝生合成経路に関連するタンパク質をコードするＤＮＡを差し引くことにより作製することができる。このようにして、残りのＤＮＡに、二次代謝に関与するタンパク質をコードするコード領域に向けて勾配をかける。サブトラクション手順の詳細は5.3.5.節に示す。 5.2．コンビナトリアル発現ライブラリーのスクリーニング本発明の薬物探索システムは、さらに、コンビナトリアル発現ライブラリーのスクリーニングのための新規な方法をも包含する。抗体結合およびリガンド結合などの発現ライブラリーをスクリーニングするための標準的な方法もまた本発明の発現ライブラリーとともに使用できる一方、このライブラリーは所望の経路および代謝産物を発現している宿主生物を同定するように作ったリポーター様式(r eporter regimen)に適合させることもできる。本明細書でクレームした方法により、最小の手間で多数のサンプルを管理し、ライブラリー中の生産クローンの効率的かつ高処理量検出および単離を可能にすることが可能となる。ライブラリーは、あるクラスの化合物の生産、または適切なＤＮＡ配列の存在のための、広範囲の活性に関して予備スクリーニングすることができる。これらのライブラリーはまた、in vivoおよびin vitroアッセイの両方において、直接、標的と共に使用することができる。同定または単離された細胞集団は容易に培養でき、数を増やし、そして新規化合物の生産のためのさらなる分析にかけることができる。新規活性または化合物の生産を生じさせる代謝経路をコードする遺伝子は、単離されたクローン中に導入された遺伝物質を特徴付けることにより描写することができる。遺伝子および経路、そしてクローンに関する情報は薬物の最適化および生産を大きく促進しよう。ここに使用される、「ライブラリークローン」または「ライブラリー細胞」という用語は、ドナーの代謝経路またはその構成成分をコードしうるドナーＤＮＡの少なくとも１つの断片を含有するコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリー中の宿主細胞または生物を指す。「陽性クローン」または「陽性細胞」という用語は、リポーター様式によってシグナルを生産するライブラリークローンまたは細胞を指す。「生産細胞」または「生産クローン」なる用語は、ライブラリー中の残りの「非生産細胞」から区別して、目的の活性または化合物を生産するライブラリー中の宿主細胞または生物を指す。「予備スクリーニング」なる用語は、目的の活性、化合物または遺伝子の存在を指示する一般的な生物学的または生化学的アッセイを指す。「スクリーニング」という用語は、特異的な疾患または臨床的状態に関し、そして標的を使用する特異的な治療優先の生物学的または生化学的アッセイを指す。「標的」という用語は、スクリーニングにおいて試験化合物が接触する細胞全体ならびに巨大分子、例えば、酵素を一般的に指す。予備スクリーニングおよびスクリーニングの使用は、一般的に発色性指示薬の目視による検出または自動化された画像分析、蛍光活性化された細胞の選別(fluorescence-activated cells sorting，FACS)による蛍光選別またはリポーター様式の存在下におけるライブラリー細胞の集団に対して行われる磁気細胞選別システム（magnetic cells sorting，MACS）の使用を具体化するものである。本発明の方法は、目的の生産細胞を検出および単離する目的のために、これらの細胞と関連する検出可能なシグナルを生成させるための代替的ではあるが、相互に排他的ではない方法を提供する。リポーターは検出可能なシグナルの生成を直接的または間接的に可能にする分子であってもよい。例えば、リポーターは発光分子、またはこの様式の他の構成分によって特異的に認識されうる細胞表面分子であってもよい。リポーター様式（reporter regimen）には、リポーターおよびそのリポーターによるシグナル生成を可能にしかつ支持する組成物が包含される。このリポーター様式には、生きている指示細胞またはその一部分が包含されうる。リポーター様式の構成成分は、ライブラリーの宿主生物中に取り込まれてもよく、または透過性の半固形媒体中で個々のライブラリー細胞とともに、またはプールされたこれらの細胞とともに、同時カプセル封入し、スクリーニングのためのばらばらのユニットを形成させることもできる。下記の文章で記載するように、目的の化合物の検出を容易にするために、中性の樹脂、例えば、Diaion HP20またはAmberlite XAD-S樹脂などの吸収性物質をライブラリー細胞の培養物中に添加することができる(Lamら、1995，J．Industria l Microbiol 15:453-456)。多くの二次代謝産物は疎水性分子であるので、かかる代謝産物が放出または分泌されると細胞外で沈殿する可能性がある。培養物中にかかる樹脂が含まれると、溶出およびスクリーニングのために培養物から取り出されうる金属イオンの封鎖を樹脂上で引き起こすこととなる。本発明の一態様においては、化学応答性構築物を含有するように宿主生物を遺伝子操作する。この構築物は、発現ライブラリー中でスクリーニングされる所望のクラスの化合物または代謝産物に応答する化学応答プロモーターと機能的に結合したリポーター分子をコードする遺伝子を包含する。望ましい活性または化合物の存在下に、陽性クローン中の化学応答性プロモーターを、機能的に結合したリポーター遺伝子の転写を開始させるように誘導する。陽性細胞はリポーター遺伝子の発現によって生成される検出可能なシグナルによって同定される。別の態様においては、望ましい活性または化合物が存在する結果として、個々の細胞中における生理学的変化に応答してシグナルを生成する生理学的プローブを使用することができる。このようなプローブは、探索された生化学的経路における活性または化合物によって、直接的または間接的にリポーター分子に変換されるリポーター分子の前駆体であってもよい。生産細胞と接触すると、生理学的プローブまたはリポーター前駆体が検出可能なシグナルを生成し、このシグナルにより生産細胞の同定および／または単離が可能となる。ライブラリー細胞へのプローブまたは前駆体の直接添加によって接触を行なってもよい。あるいはまた、スクリーニング中のライブラリー細胞へのプローブまたは前駆体のカプセル封入、および拡散によっても接触させることができる。本発明のさらに別の態様においては、望ましい活性または化合物の生産をシグナルで示すために指示細胞を使用することができ、それによりライブラリーにおける生産細胞の同定および／または単離が可能となる。生きている全細胞または固定された指示細胞、またはその細胞画分は個々のライブラリー細胞またはプールされたこれらの細胞と混合または同時カプセル封入することができる。望ましい活性または化合物の存在に応答するそれらの生物学的特性について、指示細胞を選択する。指示細胞は、望ましい化合物の標的細胞であってもよい。あるいはまた、指示細胞はリポーターと一緒に使用して検出可能なシグナルを生成させることもできる。各ライブラリーのための予備スクリーニングおよびスクリーニングは、宿主生物、そして可能な場合は、ドナー生物の包括的な特徴付けの後に選択する。宿主生物が陽性であるアッセイは失格とし、一方ドナー生物が陽性であるアッセイを受容できるライブラリー予備スクリーニングまたはスクリーニングとする。基質は望ましい生合成能に適切な酵素の標的であるのが好ましく、または、特異的なクローンのＤＮＡのための転写および翻訳活性の存在を示す不適切な標的（例えばアミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ）に使用していもよい。本発明のさらに別の態様においては、目的の二次代謝産物の生産または潜在的な生産のインジケーターとして抗生物質抵抗性を使用することができる。ライブラリークローンを一団の抗生物質と接触させた場合、抗生物質に対する耐性は、自己中毒に対する防御としての二次代謝産物生合成経路に隣接してしばしば見出されるエフラックスポンプなどの自己防御メカニズムの存在を示しうる。このようなクローンは検出の時点では二次代謝産物の生産を示さないかも知れないが、所望に応じてさらに操作または試験することができる隣接生合成経路を有する蓋然性が大きくなっている。本発明はまた、ペトリ皿中における細菌の増殖の古典的な方法にとって代わる、限定された空間における効率的な細胞増殖の高処理方法としてのカプセル封入をも提供する。プレートフォーマット中での細胞増殖は労働および物質集約的であり、一方カプセル封入された細胞は分裂中の細胞が一緒に保持されるという利点を有しつつ液体培地中で容易に増殖でき、こうして目的の二次代謝産物の検出を容易にする。カプセル封入のもう一つの利点は、リポーター様式の構成成分および／または他の指示細胞をライブラリー細胞と同時カプセル化でき、こうして予備スクリーニングまたはスクリーニングを別個のユニットで実施できることにある。細胞のカプセル封入は、アガロース、アルギン酸またはカラギーナンなどの物質を用いる熱によるゲル化またはイオンによるゲル化によって容易に実施できる。 FACSは粒子の蛍光特性に基づく周知の粒子分離方法である（サイズ1-130μｍ）(Kamarch，1987，Methods Enzymol.，151:150-165)。FACSは、それぞれの粒子の蛍光部分のレーザー励起に基づいて作動する。粒子に少量の電荷を加えると陽性の蛍光が生ずる。この変化により、混合物からの陽性粒子および陰性粒子の電磁気的分離を行うことができる。分離された粒子は、96ウエルまたは384ウエルプレートの個々のウエル中に直接沈着させることができる。 MACSは磁性のマイクロスフェア（直径0.5-100μｍ）に結合するそれらの能力に基づく、周知の粒子分離方法である(Dynal，1995)。細胞表面抗原またはハプテンを特異的に認識する抗体を共有結合するように添加することを含めて、種々の有用な修飾を磁性マイクロスフェアに対して行うことができる。あるいはまた、カプセル封入された細胞を磁化するには、リポーター様式をフェリチンのような磁性（magnetogenic）のリポータータンパク質を生成する宿主細胞中に取り込むこともできる。この場合、陽性シグナルを生成するカプセル封入された細胞が磁性マイクロスフェアとして作用する。選択されたマイクロスフェアを磁場と接触させることにより、物理的に操作することができる。例えば、選択したマイクロスフェアを、反応容器の外側に磁石を適用することにより封鎖することができる。５．２．１リポーター構築物本発明にしたがって、ライブラリー中の宿主生物を遺伝子操作して、あるリポーター遺伝子と機能的に結合している化学応答性プロモーターを含有する化学応答性リポーター構築物を含ませるようにすることもできる。この宿主生物および／または構築物は化学応答性プロモーターからの転写調節またはシグナルの生成に関与する付属タンパク質をコードするその他の遺伝子を含んでいてもよい。化学応答性プロモーターとは、ある一定の種類の活性または一定のクラスの化合物の存在下においてのみ、ＲＮＡポリメラーゼと結合し、機能的に結合されるリポーター遺伝子の転写を開始またはモジュレートすることが可能な、任意の二重鎖ＤＮＡ配列である。好ましくは、化学応答性プロモーターは、誘導活性または化合物が存在しないときには、宿主生物中での構成的転写活性のバックグラウンドがないかまたは無視し得るほどの値である。ある活性または化合物の存在に対して、転写活性を減少させるかまたは停止させることによって、負の応答をする、化学応答性プロモーターもまた使用することができる。本発明に有用なプロモーターとして、限定するわけではないが、熱ショックタンパク質などの、代謝経路、生物分解経路、シトクロムおよびストレス応答に関するプロモーター（Orserら、1995,In vitro Toxicol 8:71-85）が含まれる。例えば、Pseudomonas TOLプラスミドメタ開裂経路のPmプロモーターならびに一群の安息香酸塩およびハロまたはアルキル芳香族化合物によって誘導およびモジュレートされるその陽性調節XylSタンパク質が使用される(Ramosら、1988,FEBS Le tters 226:241-246;de Lorenzoら、1993,Gene 130:41-46;Ramosら、1986,Proc N atl Acad Sci 83:8467-8471;Mermodら、1986，J.Bacteriol 167:447-454)。その他の限定するわけではない化学応答性プロモーターの例として以下のものがある；ホスホン酸塩の利用に関するプロモーター(Metcalfら、1993,J．Bacteriol 17 5:3430-3442)、シス−シスムコン酸塩に感受性のプロモーター(Rothmel,1990)；抗生物質およびサリチル酸塩に感受性のプロモーター(Cohenら、1993,J.Bacteri ol,175:7856-7862；Cohenら、1993,J. Bacteriol,175:1484-1492)、Staphylococcus aureusからの砒素およびカドミウムオペロンからのプロモーター(Corbisierら、1993,FEMS Letters 110:231-238) ；sfiA(Quillardetら、1982,Proc Natl Acad Sci 79:5971-5975)、zwf(Orserら、1995，上記)。リポーター遺伝子は検出し得るシグナルを直接または間接的に産生することができるリポーター分子をコードする。この中に、発色性または磁気性リポーターが含まれ、また生物発光性、化学発光性または蛍光タンパク質などの何らかの光放出性リポーターを使用することができる。限定するわけではないが、この中に、Victoria aequoriaの緑色蛍光タンパク質（GFP）(Chalfieら、1994,Science 2 63:802-805)、蛍光が強化された修飾GFP(Heimら、1995,Nature 373:663-4)、Vib rio harveyiのルシフェラーゼ（luxAB遺伝子産物）(Karp,1989,Biochim Biophys Acta 1007;84-90：Stewartら、1992,J Gen Microbiol,138:1289-1300)、および蛍、Photinus pyralisからのルシフェラーゼ（De Wetら、1987,Mol Cell Biol 7 :725-737）が含まれる。任意の蛍光原性または発色性酵素を使用することもでき、限定するわけではないが、ベータガラクトシダーゼ(LacZ,Nolanら、1988,Proc Natl Acad Sci USA85:2603-2607)、およびアルカリホスファターゼが含まれる。任意の細胞表面抗原、例えばE.coliチオレドキシン−フラジエリン融合タンパク質、すなわち、E.coli flagellaeの表面においてフラジェリン（fliC遺伝子）との融合タンパク質として発現されるE.coliチオレドキシン（trxA遺伝子）(Lu ら、1995,Bio/Technology 13:366-372)を使用することもできる。ここで提供する典型的な化学応答性リポーター構築物は、ある種のクラスの安息香酸塩に応答してリポーター、GFPの転写および翻訳（発現）をする、Pseudom onasのPmプロモーターおよびXylS遺伝子を含む、pERD-20-GFPである(図６参照) 。ＰＣＲによって異なるプロモーター配列が産生されてGFPまたはフラジェリン −チオレドキシンリポーターのコード領域に接着することもある。標準的なＤＮＡ精製方法を使用して、適切な種から、対象とするプロモーターを含有するゲノムおよびプラスミドＤＮＡを精製して、TE中に再懸濁することができる。プロモーター領域の5'および3'境界に対応し、サブクローン化を可能にする制限部位の配列をさらに含むプライマーを合成することができる。選択した鋳型およびプライマーに適するように決定した条件下でサーモサイクラー中で増幅反応を行なう。反応生成物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、TA Cloning Kit（ Invitrogen,La Jolla）を使用してサブクローン化する。増幅したプロモーター配列をGFPまたはフラジェリン−チオレドキシンｃＤＮＡの5'contextにおいて一般目的用のクローン化ベクター中に再クローン化してもよい。５．２．２．生理的プローブおよびリポーター前駆体ここで使用する生理的プローブは、接触または侵入したとき、ライブラリー細胞または指示性細胞の生理的および／または代謝的パラメーターの変化に応答してシグナルを産生する、蛍光または発色剤である。このプローブは、蛍光源剤に連結した酵素基質でもよい。例えば、蛍光源性アルキルエーテルを細胞とともにインキュベートすることができる。細胞が多芳香環炭化水素を産生しているとき、この炭化水素がミクロソームデアルキラーゼを誘導して、次に蛍光源性アルキルエーテルを切断して蛍光生成物を生成することができる。蛍光プローブは、限定するわけではないが、Shechterら（1982,FEBS Letters 139:121-124）およびBronsteinら（Anal Biochem 219:169-81）に記載されているような、以下の生理的および代謝的パラメーターにおける変化を検出するように選択される。原因染色剤／基質代謝活性（特定の例）（化学物質の種類）膜電位の減少ストレス、損傷 BacLight染色剤（イソプロパノール）半透過性核酸染色剤）細胞内ｐＨ生理的変化 BCECF-AM(フェノール性蛍光剤の親油性アセトキシメチルエステル）シトクロム仲介多芳香環炭化水素７−エトキシ−ヘプタデシ酸化の増加（ナフタレン）によるル−クマリン（蛍光源性アミクロソームデアルキルキルエーテル）ラーゼの誘導５．２．３．ライブラリーの予備スクリーニングおよびスクリーニング本発明の組合せ遺伝子発現ライブラリーは各種の方法によって予備スクリーニングまたはスクリーニングすることができる。これには限定するわけではないが、可視検査、自動画像分析、分子標識ＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーション(Tyagiら、1996,Nature Biotechnol,14:303-308)、蛍光活性化細胞選別（FACS ）および磁性細胞選別（MACS）が含まれる。スクリーニングは非増幅または増幅ライブラリーの大量培養物について実施することができる。本発明の特定の態様において、予備スクリーニングまたはスクリーニング中に、個々のまたは集積したライブラリー細胞を液滴形態の不活性で安定な多孔性の半固体マトリックス中にカプセル化する。この半固体マトリックスは巨大分子と同様に気体および液体を透過させ、カプセル内の細胞を成長および分割させる。好適なマトリックスの例として限定するわけではないが、アガロース、アルギン酸塩、およびカラギーナンが含まれる。カプセル化されたライブラリー細胞は液滴中で培養および試験することができ、生存し続けるので、次の操作のために細胞を液滴から回収することができる。場合によってはマトリックスを抗生物質などの物質に暴露し、選別し得るマーカーを有するライブラリー細胞を選別することができる。ライブラリー細胞の成長を維持するために、液滴を栄養素に暴露することもできる。以下の実施例は説明のために提供するものであって、いかなる意昧でも本発明を限定するつもりはない。カプセル化は、以後の予備スクリーニングまたはスクリーニング中に使用する検出方法によって、巨大液滴（0.5−2.5mmの液滴）または微小液滴（10−25 ０μｍの液滴）のいずれかを産生する多くの方法の１つによって実施される。液滴のサイズおよび組成は液滴の形成中に調節することができる。好ましくは、各巨大液滴または微小液滴が1−5個のライブラリー細胞を含むようにする。例えば、アルギン酸ナトリウムを使用して以下のようにして巨大液滴を調製することができる：オーバーヘッドミキサーを2000rpmで使用して、アルギン酸ナトリウムを100ml無菌水に溶解して濃度1％とする。E.coliまたはSchizosaccharo myces pombeおよびSaccharomyces種などの酵母；またはStreptomyces種の胞子； Bacillus subtilis；ならびにAspergillusおよびNeurospora種などの糸状菌のライブラリー細胞の１容積を、液滴あたり1−5細胞がカプセル化されるように、このアルギン酸ナトリウム溶液に添加する。混合物を脱気するため少なくとも30分静置し、分離した液滴を形成させる任意の器具によって押し出す。こうした器具の１つは25ゲージの針を有する注射器である。緩やかに撹拌している135mMの塩化カルシウム溶液のビーカーにこのアルギン酸ナトリウム溶液を一滴ずつ添加することによって、液滴が形成される。液滴を10分間固化させ、その後無菌フラスコに移し、塩化カルシウム溶液を除去し、好適な生育培地と置換する。カプセル化されたライブラリー細胞は標準条件下で生育することができる。微小液滴は限定するわけではないが、２液境界噴霧器、静電液滴生成器、振動オリフィス系、および乳化などの、小さな液滴を製造する任意の方法または器具によって製造することができる。半固体液滴を調製するためのその他の方法は当業界で周知である。例えばWeaver,米国特許第4,399,219号を参照されたい。以下の例は乳化手法を使用する微小液滴を製造するためのプロトコルである(M onshipouriら、1995,J.Microencapsulation,12:255-262)。オーバーヘッドミキサーを2000rpmで使用して、0.6gポリリン酸ナトリウムおよび2％アルギン酸ナトリウムを100ml無菌水に溶解し、このアルギン酸塩溶液を60分脱気させる。キャノーラまたはオリーブ油などの油300mlおよび精製大豆レシチン1.0gを少なくとも30分混合することによって、油層を調製する。５０％グリセロール10ml中に硫酸カルシウム1.9gを含有するスラリーを少なくとも15分の音波処理によって調製する。このスラリーおよび1液滴あたり1 −5細胞を含むような量のライブラリー細胞を油層に導入する直前にアルギン酸溶液中に混合する。アルギン酸塩混合物をゆっくり油層中に移すことによって、乳化過程を開始させ、580rpmで10分混合する。その後無菌水500mlを添加し、５分間混合を続ける。その後、遠心分離によって油層から微小液滴を取り出すことができる。この微小液滴を洗浄し、必要ならば標準条件下で培養することができるように、好適な生育培地中に再懸濁する。微小液滴のサイズを位相顕微鏡によって調べる。FACSまたはMACSによる選別の目的において、液滴が選別に必要な範囲の所望のサイズ外である場合には、必要なサイズ限界のフイルター膜を使用して、液滴のサイズを選別することができる。本発明にしたがって、リポーターレジメまたは薬剤スクリーンの標的もまた、ライブラリー細胞（単数または複数）とともに液滴中にカプセル化することができる。前述のような巨大または微小液滴の形成の前に、媒体中に懸濁させたライブラリー細胞に全指示細胞またはバイオアッセイ、酵素、若しくはリポーター分子を含む細胞画分を混合することができる。ライブラリー細胞によって産生された対象化合物が液滴内に集積して拡散し、指示細胞またはリポーターが共カプセル化されてシグナルを産生する。この共カプセル化指示細胞は所望の化合物の生体標的、例えば抗感染薬に対する病原体、または抗ガン剤に対する腫瘍細胞でもよい。指示細胞の死、または成長阻害などの代謝段階の何らかの変化があるシグナルを形成し、当業界で既知の各種の方法によって液滴内で検出することができる。こうした方法として限定するわけではないが、生体染色剤などの生理的プローブの使用、または液滴の光学的性質の測定が含まれる。液滴がリポーターレジメにさらされたとき、カプセル化されたライブラリー細胞およびリポーター成分によって生成される代謝物および化合物は、半固体の媒体を介して拡散してシグナルを産生する。例えば、ある生理的プローブを液滴のバッチに添加し、その後これを適当な選別フォーマットにかける。ライブラリー細胞（群）が液滴内で分割することができる場合は、当初の陽性細胞（群）の子孫が微小コロニー内に共に存在することになり、これによってより強いシグナルが産生される。シグナルが有効に検出されるためには、半固体媒体が例えばある範囲の波長の光を透過するなどの、リポーターによって産生されるシグナルに光学的に適合するものが好ましい。巨大液滴は発色性リポーターを使用して、肉眼で、または液滴をあるスクリーニングポイントを通過させて陽性物を分離することができる器具を使用してスクリーニングすることによって、選別することができる。巨大液滴はFACSまたはMA CSのいずれかを使用して選別することができる。FACSサービスはいずれかの好適な機械（例えばBecton-Dickinson FACStar Plus）上で適格なオペレーターによって実施される。粒子の懸濁密度（細胞または液滴）を1×10⁶粒子／mlに調整する。すべての場合に、陽性物をマルチウェルプレート内に１ウェル当たり１クローンずつ直接分別することができる。MACSはMPC-M磁性管台を使用して、製造会社の指示にしたがって実施する(Dynal,5 Delaware Drive,Lake Success,New Yor k 11042)。予備スクリーニングまたはスクリーニングにおいて陽性であることがわかったカプセル化細胞は好適な寒天または液体生育培地のいずれかに入れて培養することによって、または液滴をクエン酸ナトリウム中に溶解することによって回収することができる。一定期間の培養後、陽性細胞が液滴の外まで成長することがある。液滴の操作および保存の便宜のためには、その後の培養をマルチウェルプレート中で実施するのがよい。より小さな集団に減量した予備スクリーニング陽性物をその後グリセロールの存在下で凍結して保存するか、またはマルチウェルプレート中で培養することができる。マルチピンレプリケーターを使用して、クローン群を各種の型のアッセイプレート（例えば、分別用媒体、選別用媒体、抗微生物または遺伝子操作アッセイローン(lawn)）に移すのに、これらを使用することができる。これらのマイクロタイタープレート中で特定のアッセイを実施し、標準プレートリーダーまたは現在高度に利用されているスクリーニング技術に使用する任意のその他のフォーマットによって読み取ることもできる。論点を明確にするために、以下の分節において、原核および真核のドナーおよび宿主生物を含む、本発明の各種の態様をより詳細に記載する。以下の態様は好例であって、限定するつもりのものではない。５．３．ドナー生物からの高品質核酸の調製のためのプロトコル出発物質として高品質のＤＮＡまたはＲＮＡの利用可能性は、ドナー生物の遺伝情報の典型であるＤＮＡライブラリーの構築において重要である。ドナー生物の培養物または外界のサンプルから高品質の核酸を抽出、選別および調製する方法をこの節において提供する。第２次代謝に関連するＤＮＡを富化する目的でＤＮＡライブラリーを予備スクリーニングするのに使用するサブトラクトされた(s ubtracted)ＤＮＡの調製方法もまた記載する。５．３．１．イソチオシアン酸グアニジン核酸の単離凍結乾燥または非凍結乾燥材料を機械的粉砕機を通過させることによって、あるいはまた微細ガラスまたは軽石を存在させた乳鉢と乳棒で手動で粉砕することができる。粉砕直後に、粉砕した凍結乾燥材料を材料1−2g当たり10mlの溶解緩衝液と混合する。溶解緩衝液は5Ｍイソチオシアン酸グアニジン、50mM Hepes ｐＨ7.6、10mM EDTA、および5％β−メルカプトエタノール（または250mM DTT）からなっている。混合して50℃で5分間インキュベートした後、溶液に4％サルコシルとなるように混合し、50℃でさらに5分間インキュベートした後、8000gで遠心分離する。上清が肉眼で濁っている場合は、不必要な炭水化物を沈降させるために、27,000gで90分間の遠心分離ステップを使用してもよい。あるいは、不必要な混濁物がある溶解液を清澄化するために、15,000回転を使用してもよい。遠心分離後、上清を1.42ＭＣｓＣｌ（0.15gＣｓＣｌ／ml）とし、あらかじめ調製しておいた超遠心管中の5.7ＭＣｓＣｌ/TE（10mM Tris-ＨＣｌ／１mM EDTA）溶液上に層状に置く。超遠心分離を160,000ｇ、20℃で18時間実施することができる。超遠心分離後、1.42Ｍ／5.7ＭＣｓＣｌ界面の透明なゼリー状の層がＤＮＡであり、一方全細胞ＲＮＡは管の底部に透明なペレットとして存在する。超遠心分離ステップからのＤＮＡをTE緩衝液に対して透析し、0.1ＭＮａＣｌとし、2.5倍容積のエタノールで沈殿させ、乾燥し、そして適当な量のTEに再溶解する。ＤＮＡ層が白色の場合は、これを取り出して、ＣｓＣｌ／ビスベンジドイミド勾配中で８時間再遠心分離し、残存する炭水化物を除去する。染料は85％イソプロパノールで2−5回の洗浄で除去することができ、ＤＮＡを上記のように透析して処理する。ＲＮＡは再懸濁用緩衝液（5Ｍイソチオシアン酸グアニジン、50mM Hepes ｐＨ 7.6、10mM EDTA）に再溶解し、50mM Hepes ｐＨ7.6、10mM EDTA溶液で1.33Ｍイソチオシアン酸グアニジンになるように希釈する。全ＲＮＡが必要な場合は、この希釈したＲＮＡサンプルを２倍容積のエタノールまたは１倍容積のイソプロパノールを添加して沈殿させる。沈殿したＲＮＡを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、水またはホルムアミド中に再懸濁させ、使用まで-70℃で保存する。５．３．２．ポリ（Ａ）−含有ＲＮＡの単離真核ｍＲＮＡ分子の大多数が3'末端に長さ250塩基までのポリ（アデニル）酸束を含有しているので、オリゴ−dTセルロースマトリックスを使用したアフィニティークロマトグラフィーによって、これを精製することができる。非常に多種の市販のオリゴ−dTセルロースマトリックスを使用することができ、限定するわけではないが、これには単純重力カラム、常磁性粒子、スピンおよびプッシュカラムが含まれる。単離したｍＲＮＡを水またはホルムアルデヒドに溶解するか、あるいは-70℃で乾燥して保存する。５．３．３．全ＲＮＡからの非リボソーム配列の富化培養が困難なまたは培養できないドナー生物から有用なＲＮＡ集団を得る際には、非リボソーム配列の富化が主要なステップとなる。中性ショ糖勾配上でのＲＮＡの分画はその他のＲＮＡ種から主要なリボソームＲＮＡを精製するのに有用となり得る(R.McGookin 1984,In Methods in Molecular Biology Vol.2 Nucleic Acids.Humana Press,pp.109-112)。遠心分離の後、最も大量のリボソームＲＮＡを捨てて、残りの画分を透析して沈殿させる。出発材料中の少量のＲＮＡを増幅するため、ランダム尾部オリゴ−dTプライマーとともにまたはこれを含まないランダムプライマーを利用する他の方法およびＰＣＲを使用することもできる。５．３．４．クレノウ断片を使用するフィルイン(fill-in)反応 5'付着末端にヌクレオシドを付け加えるためのE.coli ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片または3'→5'エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているその他のＤＮＡポリメラーゼの使用は、消化後にＤＮＡ分子に平滑末端を形成させるためによく使用される、標準的な技術である。完全ヌクレオチドセットを用いないで使用する場合は、こうした活性はそれ自体内では不適合であるが他のものとは適合する連結末端の形成に利用することができる。こうした技術は高力価の遺伝子ライブラリーおよび構築物を製造するのに使用されてきた(Hungら、1984,Nuc Acids Res 12:1863-1874；Zaborovskyら、1986,G ene 42:119；Foster,1991,Ph.D．論文、University of Californla,Santa Barba ra；Loftusら、1992,Biotechniques 12:172-175.)。フィルイン反応はクレノウ緩衝液(50mM Tris−ＨＣｌｐＨ7.5，10mMＭｇＣｌ₂ ，50mg/ml BSA，1mM dNTP)、酵素（10 U/50μｌ反応）とともに37℃で3−4時間インキュベートして実施される。反応後、限定するわけではないが、アフィニティークロマトグラフィー、エタノール沈殿およびスピンカラム遠心分離を含む各種の方法によって、ＤＮＡを精製することができる。５．３．５予備スクリーニング用のサブトラクトされたＤＮＡプローブの調製プロトコールＲＮＡを若い、対数増殖中期にある、まだ分化していない複雑な生活環にある生物培養より単離してもよい。このＲＮＡプールは未分化の成長及び一次代謝に関与する遺伝子に対して相補的である。このＲＮＡを試験管内でビオチン化し、同族種あるいは極めて関連性のある異なる種から無作為に切断した遺伝子サイズのゲノムＤＮＡの断片と過剰にハイブリダイズする。この混合物をフェノール抽出することで、界面における一次代謝ＲＮＡに相補的なゲノム配列が除去される。この操作をもう一度繰り返してもよい。得られた１本鎖ＤＮＡ断片は一次代謝遺伝子の（＋）鎖と、二次代謝関連遺伝子を含むその他の遺伝子の（＋）および（−）鎖から構成される。このＤＮＡ混合物を変性し、関連する配列だけが再ハイブイリダイズし２本鎖のＤＮＡを形成するような極めてストリンジェントな条件下で５−１０ハーフCotsで再びハイブリダイズする。残った１本鎖ＤＮＡは、ハイドロキシアパタイトと結合させるか、ヤエナリヌクレアーゼで消化することによって取り除くことができる。それから、非一次代謝関連遺伝子に代表される単離２本鎖ＤＮＡはランダムプライミングを利用して標識することができ、ライブラリーの予備スクリーニング用のプローブとして利用することができる。５．３．６土壌あるいはその他の混合した環境サンプルからの核酸の精製土壌サンプルは液体窒素で瞬時に凍結し、処置するまで−７０℃で保存する。あるいは土壌サンプルは−２０℃で凍結保存する。サンプルは使用直前に氷上で融解するか、処置前に凍結乾燥する。全核酸を材料の物理的状態および採取元に依存してマイナーな変更を加えた多数の方法を用いて抽出する。乾燥から半乾燥状態のサンプルを凍結し、直接処置する；非常に湿った状態のサンプルは瞬間凍結してから凍結乾燥する；油状のサンプルは処置前にリン酸バッファー生理食塩水で希釈する。以下の手順のいずれかを利用してもよい。Ogramら，1987，J.Microbiol.Meth．7:57-66;Steffanら， 1988，Appl.Environ.Microbiology，54;137-161；Wernerら，1992,J．of Bact． 174(15):5072-5078;Zhouら，1996，Appl.Environmental Microbiol．62(2):316- 322．簡単に説明すると、５ｇのサンプルを暖めたグアニジンイソチオシアネート酸溶解緩衝液に滴下して直接溶解し(５．３．１節参照)、塩化セシウムで精製した。あるいは、サンプルを５０ｍｌの遠心管の中に入った１３．５ｍｌのＤＮＡ抽出バッファー(100mM Tris-HCIpH8.0、100mM EDTA、100mMリン酸カリウム、1.5mM NaCl、1％CTAB（ヘキサデシルメチルアンモニウムブロマイド）と１００μｌの２０ｍｇ／ｍｌプレテイナーゼＫと混合し、水平攪拌器で２２５ｒｐｍの速度で３０分間、３７℃で振盪した。振盪後、２０％のＳＤＳを１．５ｍｌ加え、サンプルを１５−２０分間隔で回転させながら振盪して６５℃で２時間インキュベートした。６０００×ｇ、1０分間、２０℃の遠心分離により上清を集めた。ペレットを４．５ｍｌの抽出緩衝液と０．５ｍｌの２０％ＳＤＳを加えて１分間ボルテックスし、さらに１０分間６５℃でインキュベーションして再度遠心分離する操作により３回再抽出した。上記３回の抽出で集めた上清を２回、クロロフォルム−イソアミルアルコール（４８：１）で抽出する。得られた核酸を０．６容量のイソプロパノールを加え、１時間インキュベーションした後に１６，０００×ｇで２０分間室温で遠心分離することにより、沈殿させた。その後、この粗核酸ペレットを１０mMのTris-HCLpH8.0、2mM EDTAで再懸濁した。必要に応じてこのＤＮＡをＤＥＡＥクロマトグラフィーでさらに精製した。全ＲＮＡを４Ｍの酢酸リチウムあるいは酸性フェノール抽出による選択的な沈殿により粗ペレットから得た(Ausubelら，1990，Greene publishing Associates and Wil ey Interscience，New York;Hobenら，1988，Appl.，Environ,Microbiology，54 :703-71)。５．３．７ＤＮＡの修復切れ目の入った、あるいは分解したＤＮＡサンプルを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs)を用いて断片化した末端を最初に平滑化して修復した。このＤＮＡを平滑化緩衝液(50mM Tris-HCl pH7.8、10mM MgCl₂、40μＭ dNT Ps、5U/10μｇ T4 ＤＮＡポリメラーゼ)内で１−２時間、３７℃で処置した。ＤＮＡに１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容量の１００％エタノールを加えてエタノール沈殿した。遠心分離し水中に再懸濁した後に、ＤＮＡサンプルをＥ．ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ緩衝液中で(50mM Tris-HCl pH7.8、10mM MgCl₂、10mM DTT、26μＭ NAD+ 、ならびに25μＭ BSA、10ＵのE.coli)E.coli ＤＮＡリガーゼで１−２時間、１ 6℃で処理した。処理後、ＤＮＡサンプルを２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、０．３Ｍの酢酸ナトリウム液で５倍に希釈し、一度フェノールで抽出し、さらに一度クロロフォルムで抽出した。水相に２．５容量のエタノールを加え、ＤＮＡを沈殿させた。このサンプルを７０％エタノールで２回すすぎ、滅菌水あるいは10mM Tris-HCl pH8.0、１mM EDTAで再懸濁し、使用するまで−７０℃で凍結した。５．４．原核生物発現ライブラリー用プロトコール本節では原核生物宿主とドナー生物を用いた自然経路発現ライブラリーならびにキメラ経路発現ライブラリーを調製する方法を示す。以下の手順では５．３．１−５．３．４節に記載した技術により得られた精製高品質ＤＮＡを使用してもよい。５．４．１．細菌種、株、ならびに培養条件特に発現が良好な宿主生物は、制限マイナス、エンドヌクレアーゼ欠損、組み換え欠損のものである。例えば大腸菌では、好ましい株は、XL1-MR(遺伝子型:Mc rA-、McrCB-、McrF-、Mrr-、hsdr-、endal-、recA-)である。Streptomycesで好適な株はS.livldans TK64である。Bacillus subtilisでは好適な株はB.subtilis PB168 trp C2:B.subtrisPB5002 sacA、degUhy;B.subtilis PB168delta trpC2,p ksdelta 75.8;B.subtilis ATCC 39320ならびに39374である。ドナー生物は細菌種である。幾つかのものは、現行のアッセイにより検出可能な特異的化合物を産生できるかどうかで選別する。その他は、潜在的な興昧深い環境サンプル中に存在しているか否かで選別した。幾つかの例では、海洋細菌は Harbor Branch Oceanographic InstituteならびにScripps Institute of Oceano graphyから得た。これらは通常は海岸より２００マイル以上はなれた公海より採取した。代謝試験ならびにグラム試験、そしてコロニーの形態観察を、サンプルが分類学上、異なることが保証するのに必要な程度まで実施した。ライブラリーストックを調製する場合には大腸菌は３７℃で増殖させ、発現のためには３０℃で増殖させた。海洋性のActinomycesとStreptomyces種は３０℃ だけで増殖させた。５．４．２．ドナーのゲノムＤＮＡの調製各種の細菌種より１０ｍＬの培養物を増殖させた。細菌を遠心分離によりペレット化させてから、10mM Tris、5mM EDTA(TE)で再懸濁する。ＤＮＡは５．１．２．節，記載の方法で精製するか、細菌のペレットをＳＤＳ／プロテイナーゼＫで可溶化してから、フェノール：クロロフォルムで抽出し、イソプロパノールで沈殿させてもよい。得られた精製ＤＮＡをＴＥ中で一晩再懸濁する。各精製ＤＮＡの一部を取り、アガロースゲル電気泳動にかけて組み込みを確認し、ＤＮＡ濃度を求めた。自然経路発現ライブラリー用のランダムな大ＤＮＡ断片を調製するために、各種について２０μｇのＤＮＡを部分的にＳａｕ３Ａの様な頻回切断酵素(frequen t-cutting enzyme)で、１×酵素緩衝液ならびにμｇＤＮＡ当たり０．０１−０．５単位の酵素中で１時間、３７℃でインキュベートすることで消化した。使用する酵素の量を経験的に決定し、希望する大きさの範囲のものを得ることができる。消化されたＤＮＡを集め、フェノール：クロロフォルムで抽出し、エタノールで沈殿させる。ゲノムＤＮＡの大きな未変性断片が必要な各ライブラリーについてこの混合物１００μｇを用いる。この混合物は任意にショ糖勾配を利用して分子量分画が可能である。キメラ経路発現ライブラリー用の小さなＤＮＡ断片も同時に分子量分画法で選別することができる。消化および分子量分画の成否についてはサンプルの一部をアガロースゲル電気泳動にかけて確認する。５．４．３．原核生物プロモーター断片の生成一つの実施例では、合成オリゴヌクレオチドを用いて、ベータガラクトシダーゼプロモーター（ｌａｃ）を２コピーを含有し、１つはユニークなＢａｍＨ１サイトのいずれかの端に位置し、これに挟まれて中央に位置するＢａｍＨ１サイトに向かって転写方向があるように各ｌａｃのコピーが配置された断片を構築する (図４Ａ）。合成オリゴヌクレオチドは合成機を用いてリン酸化される。各オリゴヌクレオチド４００ｎｇを５分間煮沸することによりアニールしてから、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて室温で３０分間ライゲートする前に３０分以上かけてゆっくりと２５℃まで冷却する。ライゲーション混合物をアガロースゲル電気泳動にかけて、それから２−７ｋｂｐ断片を切り出しGene Cleanで精製する。連結された対をなす適切に配向されたカセットを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを１×リガーゼ／ＰＥＧ緩衝液中で、１５℃で１６時間インキュベーションすることによりｐＢＳＫプラスミドベクターのＳｍａｌサイトに挿入する。ライゲーション混合物をＸＬ１−ＭＲ細胞中に導入する。個々のクローンを制限酵素分析により解析し、任意に配列を決定し配向と正確性を確認してもよい。 pBSK-(lac/lac)_nクローン（ｎは２から１０の間の整数）を０．３リッター量で培養し、プラスミド調製キット(Qiagen)を用いてプラスミドを精製する。選別し、精製したpBSK-(lac-lac)_n40μｇを１×緩衝液中でＳｍａ１で完全に消化する。消化したＤＮＡはアガロースゲル電気泳動にかけてlac/lacプロモーターダイマーを切り出し、Gene Cleanで精製し、それから１×緩衝液中でBamH1で完全に消化する。図の４Ｂと４Ｃを参照のこと。消化されたプロモーターモノマーをフェノール：クロロフォルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、さらに１×ＣＩＡＰ緩衝液中でＣＩＡＰで処置して脱リン酸化した。脱リン酸化され、消化されたプロモーターは前記同様に抽出し、沈殿して−２０℃で保管するか、さらに使用するまで２０ｎｇ／μｌの濃度でＴＥ中に再懸濁する。その他の実施例では、調製したプロモーター断片を同様に調製したリンカー( プロモーター配列を含まない)と混合してからドナーのゲノムＤＮＡとのライゲーションに使用する。アンチセンスの転写を考えると、この処置によって１つのプロモータだけを有するカセットが生成する。５．４．４．コンビナトリアルキメラ経路発現ライブラリー用遺伝子カセットの調製１つの実施例では、ゲノムＤＮＡのBamHI-BamHI断片（平均サイズ３．５ｋｂｐ）を過剰量の脱リン酸化したプロモーター断片と混合し、連結する。ゲノムＤＮＡ断片に対するプロモーターのモル比は２０：１である。得られた単位（ｌａｃ／ゲノムＤＮＡ断片／ｌａｃ）の平均サイズは約４ｋｂｐである。その他の使用できる原核生物プロモーターとしては、他の大腸菌プロモーター(Harleyら.,1 987、Nuc Acid Res15:2343-2361)、ならびにStreptomyces種の発現宿主での使用のためのStreptomycesプロモーター(Strohl 1992、Nuc Acid ResV20:961-974)が挙げられる。組み換え能力が未定あるいは有意である宿主の場合、いくつかのカセットを含むどのクローンもいくつかの異なるプロモーターを含む様に、一連の異なるプロモーターを使用することが望ましい。５．４．５．固相支持体の調製ウルトラリンク固相化ストレプトアビジンビーズがPierce(Cat.No.53113)より市販されている。3M Emphaze Biosupport Medium AB1”ブランクビーズ”がPier ce(Cat.No.53112)より市販されている。他社からの同様の固相支持体は、いずれも本手順に使用してもよい。オリゴヌクレオチドはLife Technologies(Gibco-BRL)社より得た。オリゴヌクレオチド“ビーズ−リンク−５”は５’ビオチン-GCC GAC CAT TTA AAT CGG TTA AT 3'である。“ビーズ−リンク−３”は５’リン酸−TAA CCG ATT TAA ATG GT C GGC 3'である。アニールすると、これらオリゴヌクレオチドはSwaI制限エンドヌクレアーゼサイトを含む(以下に下線で示す)。アニールしたビーズ−リンクオリゴヌクレオチドはまた３’端のＡＴの突き出し配列を残す。この突き出し配列はオリゴヌクレオチドビーズ−リンク−５では太字で示される。ビオチン−GCC GAC CAT TTA AAT CGG TTA AT CGG CTG GTA AAT TTA GCC AAT 各ビーズ−リンクオリゴヌクレオチドをエッペンドルフチューブ内で等モル量づつ混合する。5M NaClをチューブに加え、最終濃度を３００ｍＭとする。６０ ℃、１．５時間反応させた。アニーリングは非アニーリングオリゴヌクレオチドを対照として用いるアガロースゲル電気泳動にて確認した。ブランクビーズを調製するために、１００ｍｇの乾燥ビーズをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１ｍｌ内に再懸濁した。ウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）を最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになる様に加えた。このビーズを室温で４時間旋回攪拌した。ビーズを遠心分離でペレット化し、1M Tris-HCl pH8.0で室温で２時間洗浄することを３回繰り返し、未反応のアザラクトンサイトをブロックした。ビーズを短時間遠心分離してペレット化し、ＰＢＳで徹底的に洗浄した。ブランクビーズは使用時までＰＢＳ中に４℃で保存した。ビーズ−リンクオリゴヌクレオチドをストレプトアビジンビーズに結合させるために、前もってアニールしたオリゴヌクレオチド１０μｇを１×結合緩衝液(P BS、500mM NaCl)中で20μｌのUltralink固定化ストレプトアビジンビーズと混合した。ビーズを室温で３時間転倒インキュベーションし常に懸濁する様にした。ビーズをペレット化し、１ｍｌの結合緩衝液で３回洗浄した。それからビーズを洗浄し、１×ライゲーション緩衝液(50mM Tris-HCl pH7.8、10mM MgCl₂、10mMジチオスレイトール、1mM ATP、25μｇ/ml BSA)で平衡化した。ビーズは使用時まで４℃に保管した。５．４．６．コンビナトリアルキメラ経路発現ライブラリーの組立てマグネチックビーズへの遺伝子カセットの結合：遺伝子カセットはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて１×キナーゼ緩衝液中でリン酸化する。リン酸化した断片をエタノールで沈殿させてからＴＥ中に再懸濁する。この1/10を２種類の短い非リン酸化合成リンカーの混合物に結合する。残りの9/10はその後の手順に使用する。各リンカーは２種類の稀な切断酵素の１つ、Not1あるいはSrf1いずれかを有する。さらに、Not1-含有リンカーはオリゴヌクレオチド合成時にビオチン化する。Not1およびSrf1リンカーをそれぞれ100:100:1の割合でリン酸化転写単位と混合し、T4 ＤＮＡリガーゼを用いて１×リガーゼ／ＰＥＧ緩衝液中で１６時間、１５℃でライゲートさせる。この混合液をアビジン結合ＭＰＧ磁気ビーズに結合させ、それからメーカーのプロトコールに従ってライゲーション混合物からビーズ結合転写単位を除去する。ライゲーションしたＤＮＡの混合物のおよそ1/2は一端にビオンチン化したNot 1リンカーを、もう一端にはSrf1リンカーを有することになる。Not1端はアビジンービオチン結合でビーズに結合することになる。Not1リンカーを両端に有する断片は次の付加ステップには関与しない。Srf1リンカーを両端に持つ断片は磁気分離のステップでは保持されない。ビーズ結合ＤＮＡへの付加用ＤＮＡのプールの調製：リン酸化した転写単位の残りの9/10を上記の如く結合させたが、Srf1リンカーに対するものだけをＳrf1 で完全に消化し、脱リン酸化し、精製後、エタノールで沈殿させる。ビーズ結合ＤＮＡの脱保護：ビーズに結合した転写単位を１×のSrf1緩衝液内でSrf1酵素で完全に消化する。反応は熱で不活性化し、ビーズは磁気分離で除去する。濃縮：それからビーズを１×ライゲーション緩衝液中の脱リン酸化したSrf1− Srf1消化転写単位を含むライゲーション混合物に加える。ライゲーションはT4 ＤＮＡリガーゼを添加して開始し、リガーゼを熱で不活性化させビーズを磁気分離する前に６０分間、２５℃で進行させた。ライゲーションは主にリン酸化したビーズに結合したＤＮＡと非リン酸化転写単位の間で生じることになる。ビーズ上の転写単位はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化され、熱で不活性化されてから磁気で分離され、そしてさらにT4 ＤＮＡリガーゼが加えられたライゲーション混合物に戻される。このサイクルをNot1による消化によりビーズからポリマーを切断する前に１０回繰り返す。切断されたＤＮＡはエタノールで沈殿してから、ＴＥ中に再懸濁され、発現宿主に合わせて使用する、SuperCoslやその他のベクターに挿入する前に大きさの範囲と質をアガロースゲル上で調べる。このコンカテマーを用いて５．４．５．節に記載の様にして適当な発現宿主において原核生物ライブラリーを作成する。５．４．７．コンビナトリアル天然経路発現ライブラリーの組立て大腸菌ライブラリーの発現ベクターは、望ましくは30〜42kbpの大きさの挿入体を維持できるコスミドSuperCos1である。SuperCos1内へのＤＮＡ断片の挿入と Gigapack抽出物によるパッケージングをメーカーの指示に従い行う(Stratagene) 。簡単に説明すると、XL1-MR宿主細胞をＤＮＡライブラリーを含むSuperCos1ファージに感染させる。この作業は以下の様にして行う：XL1-MR細胞を一晩5mLの１％のマルトースと10mm MgSO₄を含むＬＢ培地5mL中で、300rpm、37℃で増殖させる。一晩培養したものをｌ：10に希釈し、LB/10mM MgSO₄内、300rpm、37℃で３時間培養する。この培養液を800×ｇの遠心分離でペレット化してから5mLのＬＢ内に再懸濁する。この懸濁液600μｌをファージ粒子内にパッケージされたライブラリー500cfuと共に周囲温度で３０分間インキュベートし、さらに300rpm、 37℃で８倍量のＬＢで60分間インキュベーションした。発現ライブラリーを増幅するために、感染した宿主細胞を50μg/mLアンピシリン含有の50mL LBを有する150mmのペトリ皿上に広げる。このプレートは前もって 48時間周囲温度で乾燥させておく。細胞を広げた後に、プレートを37℃で一晩インキュベートする。プレート面のコロニーをかき集め、プレート当たり3mLの15 ％グリセロール、85％LBで再懸濁する。この細菌の懸濁液は使用するまで−70℃ で保存した。個々のクローンをスクリーニングするためのライブラリーを調製するために、感染した宿主細胞を50μg/mLアンピシリン含有の50mLのLBを有する150mmのペトリ皿上に広げる。このプレートは前もって４８時間周囲温度で乾燥させておく。細胞を広げた後に、プレートを３７℃で一晩インキュベートする。得られたコロニーを滅菌した爪楊枝で拾い上げ、マルチウエル型プレートに、ウエル当たり一つの割合で移す。384ウエル型プレートの各ウエルには75/μｌLB、 50μｇ/mLのアンピシリン、７％のグリセロールが含まれている。外側の列（合計８０ウエル）には接種しないが、同様に培地を加えその後のインキュベーションと凍結の間の乾燥を防いだ。この接種したマスタープレートを振盪しないで３７℃に１６時間放置する。一晩おいたマスター384ウエル型プレートを元プレートとして利用して１枚以上の384ウエル実験プレートあるいはオムニトレー(Omni -Trays)を複製する。マスターの384ウエル型プレートはそれから個別にシールして−８０℃で凍結する。複製は384ピンレプリケーターを利用して行う。各使用の前後に384ピンレプリケーターを漂白剤に２０秒間順次漬けて、さらに水に３０秒漬け、それからエタノールに５秒漬けてからフレイミング(flaming)する。ライブラリーの組み立て方法は選択したベクターと発現宿主によって異なる。５．４．８．発現ライブラリーの予備スクリーニング予備スクリーニングの方法には３つのカテゴリーがある：細胞内予備スクリーニング、差別化(differential)予備スクリーニング、ならびに選択予備スクリーニングである。簡単に説明すると、最初のカテゴリーである細胞内予備スクリーニングはライブラリーを化学反応性レポーター構築物を含むよう設計された宿主内に導入する方法である。レポーターはGFP（緑色蛍光タンパク質）あるいはβ−ガラクトシダーゼであり、選別は蛍光活性化セルソーティング(FACS)または巨大液滴選別で行う。第二のカテゴリーである、差別化予備スクリーニングは、宿主中のライブラリーを蛍光性あるいは発色性の生理学的トレーサーと一緒にインキュベーションした後にFACSあるいは巨大液滴選別法で分ける方法である。第三のカテゴリーである選別予備スクリーニングは、宿主中のライブラリーを抗生物質の様な選択薬剤と一緒にインキュベーションし、それからFACSあるいは巨大液滴選別法で生存あるいは増殖している細胞を同定する方法である。いずれの方法でも、細胞の選別は個別の培養物を調べる前に増幅したライブラリーのバルク培養物で行う。ライブラリーはFACSあるいは巨大液滴選別法で予備スクリーニングされてもよい。ＤＮＡライブラリーを含む宿主細胞のプールを高密度あるいは低密度の微小環境のいずれかを促進する次の２種類の方法の一つで培養する。最初の方法は、増幅ライブラリーの細胞を個別の細胞として試験する方法である。大腸菌のライブラリーの一部を４時間、３０℃で２０容量の培地中で300rpm の条件下で増殖してから、ペレット化し、さらに１容量の滅菌ddH₂O内に再懸濁してから、蛍光プローブと共にインキュベーションし(必要な場合)、それから氷上に置いてFACS設備に運ぶ。第二の方法では、FACSあるいは巨大液滴選別法の設備に運ぶ前に、増幅したライブラリーの一部をカプセル化して５．２．３節に記載のような基質あるいは選別剤の存在下に培養する。培養物を蛍光トレーサーあるいは基質を用いて試験する場合には、培養物をdd H₂Oに再懸濁し、さらに製造元のプロトコールに従うFACSの前に以下の典型例の様にして染色する：インキュベーションは暗所、室温で１５分間行い、それから 1.5mLの微小遠心管内で５分間ペレット化してから１容量の冷ddH₂Oに再懸濁する。選別後、発現ライブラリーより選別された1〜1000クローンあるいは巨大液滴のプールを0.5Lの栄養培地内で培養する。培養菌と培地を0.5Lの酢酸エチルで抽出して化学分析に廻した。ロータリーエバポレーションで、１リッターの培養液当たり約20mgから１ｇの粗有機抽出物が得られる。同起源のクローン化ＤＮＡを精製して、宿主細胞を再度形質転換して関連する配列がコスミドに局在化していることを確かめる。ライブラリークローンを発現させて得た化学サンプルを一連のカラム（陽イオン性、陰イオン性、逆相）を用いたＨＰＬＣで試験し、次いでＮＭＲを用いた定性的化学分析を行ってもよい。５．４．９．プレート複製による海洋性グラム（−）菌／大腸菌(E．coli)ライブラリーの代謝試験それぞれの野生型の海洋性種について、ＤＮＡライブラリーを作製する前に、無駄を防ぎ、完全なライブラリーについてなすべき一連の代謝試験を決めるうえで役立てるために試験を行った。個々のクローンのスクリーニングのためのライブラリーを作製する目的で、大腸菌(E．coli)XL1-MR株などの感染宿主細胞を、50mg/mlのアンピシリン濃度の50 ml LBの入った150mmペトリ皿上に広げた。このプレートは前もって４８時間室温で乾燥させておく。細胞を広げた後に、プレートを３７℃で一晩インキュベートする。得られたコロニーを滅菌した爪楊枝で拾い上げ、384ウエルプレートに、ウエル当たり一つの割合で移す。各ウエルには75/μｌ LB、５０μｇ/mLのアンピシリン、７％のグリセロールが含まれている。外側の列（合計８０ウエル）には接種しないが、同様の培地を加えてその後の培養時および凍結時の乾燥を防いだ。この接種したマスタープレートを振盪しない状態で３７℃に１６時間放置した。一晩おいたマスター384ウエルプレートを起源プレートとして用いて、１枚以上の実験用マルチプレート又はオムニトレー中に複製した。マスター384ウエルプレートはそれから個別に密封して−８０℃で凍結した。複製は384ピンレプリケーターを利用して行った。使用の前後に384ピンレプリケーターを漂白剤に２０秒間、水に３０秒間、エタノールに５秒間順番に漬けてから燃やした。実験用のマルチウエルプレートあるいはオムニトレイを起源プレートとして用いてＤＮＡライブラリーを一連の分化培地および／又は選択培地（例えば、シデロホア検出培地又は殺菌剤叢）上に複製する。得られるものを集めて、ＤＮＡライブラリーを構築するのに使用した野生型の海洋細菌のプロフィールと比較する。５．４．10．巨大液滴カプセル封入法(macrodroplet encapsulation)による海洋性グラム（−）菌／大腸菌(E．coli)ライブラリーの代謝試験クローンをアルギン酸ナトリウムを用い、100mLの滅菌水中に１％の濃度になるようオーバーヘッドミキサーで2000rpmで溶解することにより、カプセル封入する。ライブラリー懸濁液を１滴内に１〜５クローン入るように加えた。混合物は脱気するために少なくとも３０分放置した。それから混合物を個別の水滴にする装置を用いて射出した。このような装置の例としては、２５ゲージ針のついた注射器がある。これらを、緩やかに攪拌している135mM塩化カルシウムの入ったビーカー内に滴下する。滴は１０分間硬化させてから無菌フラスコに移し、塩化カルシウムを除いてからLB/Amp培地及び基質（例えば、ｘ−グルコシダミン）に交換する。滴が入ったフラスコを３０℃で一晩振とうしてから次の朝に青色コロニーの存在により示される陽性クローンを確認した。滴を大きな透明のトレーの中に単層に配して肉眼で調べた。陽性コロニーを取り出して、LB/Ampと50mMクエン酸ナトリウムpH7.4の入っている９６ウエルのマスタープレートに移して滴を溶解し、３７℃で一晩増殖した。これらの一晩増殖した９６ウエルプレートを起源プレートとして用いて１枚以上の実験用のマルチウエルプレートあるいはオムニトレー中に複製を作製した。それからマスター９６ウエルプレートを個々に密封して−８０℃で冷凍した。陽性クローンについて産物の特異的な試験を行うか、さらに予備スクリーニング又はスクリーニングを行う。更なるスクリーニングはマルチピンレプリケーターを用いる複製により行うことができる。使用前後にマルチピンレプリケーターを漂白剤に２０秒間、さらに水に３０秒間、それからエタノールに５秒間順番に漬けてから燃やした。５．４．11．巨大液滴カプセル封入法による海洋性グラム（−）／大腸菌(E.col i ）ライブラリーの代謝試験巨大液滴は次の方法で作製することが出来る。2000rpmでオーバヘッドミキサーを使用し、0.6gのポリリン酸ナトリウム及び２％のアルギン酸ナトリウムを10 0mlの滅菌水に溶かした。この混合液を６０分間脱気した。それから1.9gの硫酸カルシウムを10mlの50％グリセロール中で最低１５分間超音波処理した。得られたスラリーと１滴あたりの細胞数が１〜５となるライブラリー懸濁液を、1.0gの精製したダイズレシチンを前もって３０分以上前に混合しておいた油相（オリーブオイル）に導入する直前にアルギン酸塩溶液に加え混合した。ゆっくりとこのアルギン酸塩混合液を油相に移し580rpmで10分間混合して乳化反応を開始した。それから500mlの滅菌水を加え５分間混合し続けた。次いで巨大液滴を遠心分離で油相から除き、洗浄してからLB/Amp中に再懸濁した。滴が選別に必要な希望の大きさの範囲から外れた場合に、FACSを用いて選別するためには、求められる限界の大きさを持つフィルターメンブレンを用いて滴をサイズ選別することができる。その後にクローンを３０℃で２時間、蛍光基質を含むLB/Amp培地内で振とうしながら増殖させることができる。インキュベーションに続いて、遠心分離、洗浄、そして滅菌水中に1×10⁶滴／ mlの密度で再懸濁することによりFACSによる選別用に試料を調製した。滴の大きさは位相差顕微鏡で調べることができる。FACS検査は熟練者によりBecton-Dicki nsonのFACStar Plusを用いて行い、陽性のものをLB/Ampを含むマルチウエルプレート中に直接ウエル当たり１クローンになるように単離して選別した。これらのプレートをコロニーがビーズの外にはみ出すまで（１〜２日）３７℃で増殖させた。これらの一晩おいたプレートを起源プレートとして用いて、１枚以上の実験用のマルチウエルプレート又はオムニトレー中に複製を作成した。それからマスターマルチウエルプレートを個々に密封して−８０℃で冷凍した。陽性クローンについて産物の特異的な試験を行うか、さらに予備スクリーニング又はスクリーニングを行う。さらなるスクリーニングは９６又は384ピンレプリケーターを用いた複製により行うことができる。使用前後にマルチピンレプリケーターを漂白剤に２０秒間、水に３０秒間、エタノールに５秒間順番に浸してから燃やした。５．４．12．プレート複製法によるactinomycetes／Streptpmyces lividansライブラリーの代謝試験培養可能な野生型のactinomyCete種それぞれについて、ＤＮＡライブラリーの作製前に分類上の混乱を避けるために試験を行い、ライブラリーを完成させる上で必要な代謝試験の種類を決める手助けとした。個々のクローンをスクリーニングするためのライブラリーを作製するために、形質転換宿主細胞であるStreptom yces lividans TK66株を、F10Aを含む150mmペトリ皿上に広げた。このプレートは前もって４８時間室温で乾燥させておく。細胞を広げた後に、プレートを３０ ℃で一晩インキュベートした。選別はチオストレプトンを重層することにより開始した。得られたコロニーを滅菌した爪楊枝で拾い上げ、９６ウエルプレートに、ウエル当たり１つの割合で移す。各々のウエルはF10A培地を含む。これらの接種されたマスタープレートを１〜４日間３０℃で放置いた。一晩おいたマスター９６ウエルプレートを起源プレートとして使用し、１以上のマルチウエルプレートあるいはオムニトレー中に複製を作製した。マスター９６ウエルプレートはそれから個別に密封して−８０℃で凍結した。複製はマルチピンレプリケーターを用いて行った。使用前後にマルチピンレプリケーターを漂白剤に２０秒間、水に３０秒間、エタノールに５秒間順番に漬けてから燃やした。実験用のマルチウエルプレートあるいはオムニトレイを起源プレートとして使用して、ＤＮＡライブラリーを一連の分化培地および／又は選択培地（例えば、抗生物質プレート又は殺菌剤叢）上に複製する。得られたものを集めて、ＤＮＡライブラリーを構築するのに使用した野生型の細菌のプロフィールと比較した。５．４．13．巨大液滴カプセル封入法によるactinomycetes/Streptomyces livi dans ライブラリーの代謝試験クローンを大腸菌(E．coli)ライブラリーについて記載した第５．４．10節に記載の方法でカプセル封入した。滴は１０分間硬化させてから滅菌フラスコに移し、塩化カルシウムを除いてからF10A培地及び基質（例えば、x-gal）に交換する。滴が入ったフラスコを３０℃で１〜５日間振とうし、青色コロニーの存在で示される陽性クローンについて調べた。滴を大きな透明のトレーの中に単層に配して肉眼で調べた。陽性コロニーを取り出して、F10A及び50mMクエン酸ナトリウムpH7.4の入っている９６ウエルのマスタープレートに移して滴を溶解し、３０℃で２日間増殖させた。この一晩増殖させたマスター９６ウエルプレートを起源プレートとして用いて、１枚以上の実験用のマルチウエルプレート又はオムニトレーに複製を作成した。それからマスター９６ウエルプレートを個々に密封して−８０℃で冷凍した。陽性クローンについては産物の特異的な試験を行うか、さらに予備スクリーニング又はスクリーニングを行った。更なるスクリーニングは第５．４．９節の記載と同様の複製により実施した。５．４．14．指示細胞と共に同時カプセル封入することによるクローンの予備スクリーニングライブラリークローンのプールは適当な希釈を加えた試料をプレーティングしコロニー数を計測することで力価測定した。適当なライブラリー細胞を１％のアルギン酸塩と混合して１巨大液滴当たり約１細胞が入るようにした。更に、適当な指示細胞を加え、滴当たりの標的細胞数を約５０とした。巨大液滴は第５．４．10節記載の方法で作製し、ライブラリーと指示細胞に合った条件下で培養した。一般的に、S.lividansライブラリーの巨大液滴はR5又はF10A中で、３０℃で培養し、大腸菌(E．coli)ライブラリーの巨大液滴はＬＢ又はＢ３中で３０〜３７ ℃で培養する。培地と温度は指示細胞の生理的欲求に合わせて調製した。ライブラリー細胞の効果を視覚化するために、次の様なリポーターレジメを使用した：細胞死の検出は、ニュートラルレッドあるいはコンゴレッドの取り込みで；生存細胞の検出は指示細胞に関連した基質（例えば、E.faecalisの場合ではＸ−グルコピラノシド）の取り込みで；プロモーターの活性化に応答するβ− ガラクトシダーゼリポーター活性の検出には、培養培地中の80mg/mlのX-galの取り込みで行った。第５．４．10記載の方法で陽性の巨大液滴を単離した後に、ライブラリー細胞は選別するが指示細胞は選別しない抗生物質を加えて指示細胞を除去した。それからライブラリー細胞を保存しおよび／または必要に応じて別の試験を行った。５．５．真核生物発現ライブラリーについてのプロトコール本節では真核ドナー生物のコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの作製に通常応用できる手順を記す。真核生物におけるコンビナトリアルキメラ経路遺伝子発現ライブラリーの作製方法に含まれる工程を図５Ａ〜５Ｆに示した。特に優れた発現用真核宿主生物は、安定で、非繊維性の、遺伝子発現を目的とした遺伝子操作が出来るように特性が十分に解明されているものである。酵母や真菌類では、好ましい種は３０℃で増殖するS.pombe(C.GuthrieとG.R.Funk、Gui de to Yeast Genetics and Molecular Biology、Methods in Enzymology、Vol.1 94,Academic Press)である。A.thalianaおよびN.tabacum細胞は宿主として好ましい(C.P.Lichtenstein ＆ J.Draper,Genetic Engineering of Plants,DNA Clon ing Vol.II、pp,67-119)。５．５．１．密度勾配遠心法によるサテライトゲノムＤＮＡの除去真核生物ゲノムはしばしば、主にリボソームをコードしていた領域又は機能が不明な配列からなる繰り返しＤＮＡを大量に持っている。従って、真核生物のドナー生物からゲノムＤＮＡを調製する場合には、この様な非コードＤＮＡ配列をライブラリーから除去することが望ましい。ＤＮＡ結合性色素、ヘキスト33258( Cooney＆Matthews、1984)の存在下で標準的なCsClゲノムＤＮＡ精製法を用いて様々なクラスのゲノムＤＮＡをクローニング前に分離することができる。５．５．２．真核生物プロモーターおよびターミネーター断片の作製プロモーターおよびターミネーター遺伝子断片は共に、既知のプロモーターとターミネーターの配列に合わせて作製した配列特異的プライマーを用いたＰＣＲで作製することができる。プロモーターおよびターミネーターの配列の選択は使用する宿主生物によって決める。例えば、S.pombeを発現宿主として使用する場合には、nmt1又はura4などの未変性プロモーター、並びにＣＭＶ、ＳＶ４0(Fors burg,1993 Nuc Acid Res、8:4321-4325)などのウイルス由来、又はヒト由来の例えば柔毛膜性生殖線刺激ホルモン若しくはソマトスタチン(R.Toyama、H.Koyama 1990、FEBS Letters 268(1)pp.217-221)由来の非未変性プロモーターの両方が使用できる。誘導可能なテトラサイクリン系に見られるような遺伝子操作によりつくられたプロモーター(Faryarら1992、Curr Genet21;345-349)もまた使用できる。ＰＣＲ反応も標準的なＰＣＲ反応条件と、限定するわけではないが、Pfuポリメラーゼ(Stratagene)又はVentポリメラーゼ(New England Biolabs)のような高適合性および高処理量のＤＮＡポリメラーゼを使用し、市販のＰＣＲ装置によって実施できる。全てのプライマーセットが同一条件で使用できる訳ではないが、正確な条件は当業者により実験的に決定することができる。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーはおそらく市販のものを入手可能であるか、または当分野で公知の方法により合成することができる。ＰＣＲにより生成したプロモーターおよびターミネーター断片には５’端に制限酵素部位が含まれていてもよい。ここではBglII、XhoIおよびBamHＩを用いて、本発明の原理を説明している。制限酵素部位がプロモーターあるいはターミネーター遺伝子配列内に存在しないものであればいずれのものでもかまわない。ｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡ挿入断片に適合するクローニング部位の作製するためには、プロモーター遺伝子断片をBglIIとXhoＩで切断して、5’端にBglII 部位を、3’端にXhoＩ部位を有するプロモーター遺伝子断片を得る。ターミネーターはXhoＩだけで切断し、その結果5’端だけにXhoＩ部位を有することになる。５’および３’の配向はプロモーターあるいはターミネーター遺伝子断片の予測される転写方向に基づく。図５Ｂ参照。大脂菌(E．coli)ＤＮＡポリメラーゼＩの大型サブユニット（クレノウ断片）とデオキシヌクレオチドのサブセット（この場合にはdCTPとdTTP）を用いた、部分的フィルイン反応によって、XhoI端による自己ライゲーションができないプロモーターならびにターミネーター断片を作製することができる。プロモーター断片のBglＩＩ端は塩基相補性を欠いていることにより影響されず、ターミネーター断片のBamHI端にはクレノウ断片により利用される露出された５’端が無い。仔ウシ腸アルカリホスファターゼなどのホスファターゼで処理すると、BglII の自己ライゲーションを防ぐことができ、プロモーターとターミネーター断片の両方のライゲーションに利用できる似たような末端を提供することができる。ｃＤＮＡ断片は、最初の鎖合成の間に５’メチルdCTPの取り込みがおこることにより、NotＩによる消化を受けない(Short,J.M.1988、Nuc Aclds Res 16:7583-7600 )。本発明の他の実施態様では、ＤＮＡ挿入断片がｍＲＮＡに由来する場合、クローニング効率を上げるために指向性クローニングが使用される。ｃＤＮＡ挿入断片を、プロモーターおよびターミネーター断片に関してセンス方向になるように一方向にライゲーションした。この操作は異なる、非ライゲーション型端をプロモーターとターミネーター断片の両方に作製することにより達成される。BglＩ、XhoI、XmaＩ、ならびにBamHIを使用して本発明を記載する。適合する端を作りだし、メチル化により保護することができるものであればいずれの酵素の組み合わせでも使用することが出来る。ターミネーター断片の５’端においてXmaＩ部位とXhoI部位を置換するが、プロモーター断片の調製は変わらない。XmaＩがクレノウ断片とｄＣＴＰでフィルインすることによりNotＩと適合することから、これを使用した。本結果は２塩基のdCTP-dCTP5’の突出部を有するターミネーター断片でのもので、好適に調製されたNotＩ消化ｃＤＮＡ遺伝子断片にも当てはめることができるものである。図５Ａを参照のこと。５．５．３．ＤＮＡ挿入断片の調製真核生物ライブラリー用のコーディング遺伝子断片は２種類の基本的なＤＮＡ材料、即ちゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）あるいはメッセンジャーＲＮＡより酵素的に得た相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から得た。ｇＤＮＡあるいはｃＤＮＡの調製の基本方針は極めて類似しているが、同一ではない。相補的ＤＮＡはメッセンジャーＲＮＡおよび／又は全ＲＮＡより、文献などに紹介されている標準的なプロトコール、又は特にメーカーの操作説明書に従って作製した。全ＲＮＡの単離は第５．３．１節に記載したグアニジン−イソチオシアンネート法によりゲノムＤＮＡと同時に単離することができ、ｍＲＮＡは引き続いてオリゴ−ｄＴセルロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーで単離することができる。第一鎖ｃＤＮＡ合成はクローニング部位、例えばNotＩ部位を５’端に含むオリゴ−ｄＴＤＮＡプライマーを利用して行うことができる。内部にNotI部位を５’端付近にもつランダム配列のオリゴヌクレオチドも、ランダムにプライムする第一鎖合成に利用することができる。この代替のプライマーを利用することで大型ｍＲＮＡについて３’バイアスを避けることができる。５−メチル−dCTPなどのメチル化デオキシヌクレオチドをPfuなどのポリメラーゼと一緒に用いることにより制限酵素の消化から防御される(Shortら.，前出；G.L.Costa、1994,Str ategies 7:8)。最初のプライマー内だけにメチル化されていない部位があって、これだけが制限酵素によって切断されるので、ｃＤＮＡの３’端を決定することが可能になる。メチル化されたｃＤＮＡはまたメチレーション処理することでも得られるが、全ての修飾可能部位がメチル化されてしまい、その結果酵素切断に対して抵抗性となってしまうので、クローニングの指向性は無くなる。５’端にリン酸を持つ改良BamHIアダプターなどの配列特異的アダプターをライゲーションすることで、特定５’端をもつｃＤＮＡを調製することができる。その相手となるオリゴヌクレオチドにアニールすると、アダプターには５’側に２塩基のdGTP-dATPの突出部および平滑な５’リン酸端のみを有するようになる。この改良したアダプターは、通常の方法に従ってPfuあるいはT4ＤＮＡポリメラーゼで処理したｃＤＮＡにライゲーションすることができる。改良型BamHIアダプターのライゲーションおよびｃＤＮＡのNotIによる消化の後で、アダプターの付いたｃＤＮＡをクレノウ断片およびdGTPで処理することで、適切に調製されたプロモーターならびにターミネーター断片にライゲーションできる特定された、方向性を持ったｃＤＮＡ遺伝子挿入断片を作製することができる。断片の方向性はｃＤＮＡの５’端がプロモーターの３’端に向かって位置し、ｃＤＮＡの３’端がターミネーター断片の５’端に向かって配置されるようになる。図５Ｃを参照されたい。ゲノムＤＮＡ断片は全ゲノムＤＮＡをSau3AIなどの切断頻度の高い制限酵素による部分消化により得る。この酵素はこの目的に広く使用されており、部分消化の後にスクロース密度勾配により大きさによって分画する方法はごく標準的な技術である。最初の酵素の濃度が異なる３種類の消化により得た断片のプールを使用して、該ゲノム内の酵素に対する感受性に違いを持たせることができる。大きさによる分画と精製に続き、断片をBamHIメチラーゼで処理して内部のBam HI部位を保護し、続いてクレノウ断片およびdATPとdGTPにより処理する。その結果、内部のBamHI部位がメチル化されてdATP-dGTP突出部だけを有する遺伝子断片が得られる。図５Ｄを参照されたい。これらの断片は自己ライゲーションできず、好適に調製されたプロモーターとターミネーター遺伝子断片だけにライゲーションすることができるものである。５．５．４．挿入ＤＮＡのプロモーターとターミネーターへのライゲーション好適に調製したｃＤＮＡ、プロモーター、およびターミネーター断片を16℃で一晩反応させてライゲートさせた。ライゲーション反応においては、プロモーター(P)：ｃＤＮＡ：ターミネーター(T)を10：１：10で行った。至適の比は当業者に公知の技術を用いて実験的に決めることができる。指向性クローニング法により、ただ１つのライゲーション産物、即ち、正確に方向付けがされたプロモーター−センス挿入物−ターミネーター遺伝子カセットが得られた。調製されたゲノムＤＮＡ、プロモーター、およびターミネーター遺伝子断片のライゲーションは、16℃にて様々な比率で行なうことができる。ライゲーション化合物はいずれも自己ライゲーションしないので、至適の比率を実験的に決定することができる。形成されたライゲーション産物の半分は直接的に利用可能であり、1/4はライゲーション反応に与っておらず、残りの1/4は鎖が成長する前に一度だけライゲーションされたものと概算することができる。次の組み合わせ（Ｐ＝プロモーター、frag＝5'→3'ゲノムＤＮＡ断片、Ｔ＝ターミネーター garf＝3'→5'ゲノムＤＮＡ断片）：１．Ｐ−frag−Ｔ５．Ｐ−graf−Ｔ２．Ｔ−frag−Ｐ６．Ｔ−graf−Ｐ３．Ｐ−frag−Ｐ７．Ｐ−graf−Ｐ４．Ｔ−frag−Ｔ８．Ｔ−graf−Ｔ１、６ならびに２、５の組み合わせが所望の構築物を表すが、挿入物の方向性はランダムであるため、これらの構築物の50％が与えられた遺伝子にとって正確な方向性を有するものと推測される(１および６)。ターミネーター／ターミネーター遺伝子カセットを形成することはできるが、それらの3'末端は、末端切断型の切断されていないBamHI端であるために突出した5'端を持たないことから、以後のクローニングの工程に関わることができなくなる。プロモーター／プロモーター構造物は、BglII端には5'リン酸がないため(最初の反応)、もう一方の突き出したBamHI端だけへの連続するライゲーションにおいてクローニングするだろう。次に、突き出したBglII端に加えられた遺伝子カセットがライゲーションすることも、5'リン酸がないために稀である。突き出した BamHI端は内在する鎖の形成には関与できるが、加えられた新しい遺伝子カセットの形成には関与できない。したがって、このようなプロモーター／プロモーター遺伝子カセットは、近傍の別の鎖のBamHI部位と環を形成し、そしてこのような環形成は回復できないために鎖を終止させてしまうだろう。この様なプロモーター／プロモーター断片がライゲーション効率にとっての重大な問題となる場合には、新しい遺伝子カセットを加える前に固定してしまった成長鎖に中間のキナーゼ処理を行い、BglII/BglIIライゲーション産物を形成させることによって、プロモーター／プロモーター断片を成長鎖にすべきである。このキナーゼ処理により、固相へのBglII/BglIIおよびBglII/BamHIの結合を促進し、包含される成長鎖を環化させるだろう。５．５．５．遺伝子カセットの連続ライゲーションによるコンカテマーの形成プロモーター／ターミネーターの組み合わせがフランキングするゲノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡ挿入体のいずれかからなる各遺伝子カセットのライゲーションは、先に原核生物のＤＮＡについて概略を説明した方法と同様にして行なうことができる。ここにおける主要な相違は、この戦略では次のクローニングのためにエンドヌクレアーゼBamHIを用いて突き出した3'制限酵素部位を作製したことにある。BamHIメチラーゼあるいは５−メチル−dCTPのいずれかを用いることは、挿入するＤＮＡ内にあるBamHI部位の保護を保証する。図５Ｅを参照のこと。鎖のライゲーションを５〜10回繰り返した後に、成長しているコンカテマー鎖をBamHIを用いて脱保護し、クレノウ断片とdATPおよびdGTPで処理して発現ベクターに結合できるよう準備する。これによって、成長鎖の全ての端末が相互にライゲーションすることを不可能にし、こうしてコンカテマー鎖の環化および損失とを排除することを不可能にする。ベクターＤＮＡは５：１のモル比でコンカテマー鎖にライゲーションさせることができる。その他の比もまた使用することもできる。この反応は、16℃、8〜1 6時間あるいは22℃、４時間で行なうことができる。ライゲーションの後には、ビーズを洗浄することができ、イントロンヌクレアーゼ制限緩衝液中に再度懸濁する。消化は製造元の使用説明書に従って行なった。いかなるイントロンヌクレアーゼを使用してもよい。酵素Ceulは、非パリンドローム型の3'の突き出し部を生じさせるために、自己ライゲーションしないので好ましい。図５Ｆを参照のこと。５．５．６．コンカテマー構築物を含有するヘクターの環化および形質転換固相から放出されたコカカテマー／ベクター分子は、CeuＩ消化ミックスを１ ×リガーゼ緩衝液で100倍に希釈することにより、分子内ライゲーションを受けることが促進される。Ｔ４リガーゼを加え、２２℃で４〜６時間、あるいは１６℃で一晩反応させる。図５Ｆを参照。得られた構築物を微量濾過または凍結乾燥により濃縮し、Ｓ．ポンベ株または大腸菌もしくはＳ．リビダンス株に標準方法で導入する。エレクトロポレーションあるいは改良型のリン酸カルシウム形質転換法を含むがこれらに限らないどのような方法も利用できる。５．５．７．酵母発現用ベクターの作製とライゲーション本節では酵母を宿主生物として用いるコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの作製に一般的に適用しうる手順について記載する。Ｓ．ポンベでのライブラリーの作製に利用できるベクターの一つは、言うまでもなくこれに限定されるものではないが、大腸菌／Ｓ．ポンベシャトルベクター pDblet(Brunら．1995、Gene、164:173-177)である。このベクターは複数のクローニング部位およびf1ファージ起点を有し、比較的高いコピー数で発現され、大腸菌内でもＳ．ポンベ内でも非常に安定しているという利点がある。本発明では、既知配列のBstXI部位を収容するようにpDbletの複数のクローニング部位（ＭＣＳ）を修飾しうる。図６Ｂを参照。これは固相からのコンカテマー鎖の放出に用いられるイントロンヌクレアーゼ酵素が規定配列の３’ヌクレオチド突出部（3’GATT...）を生成するためである。CCACCTAACTGG配列を有する遺伝子操作されたBstXI部位は、開裂後に適当なCTAA-3’突出部を生成する。 pDbletを修飾するために、まずSacＩとNotＩで切断して正確な配列をもたない既存のBstXI部位を除去することができる。pDbletプラスミドは、スピンクロマトグラフィーまたは他の手段で精製した後、BstXI部位の正確な配列に加えて新たにNcoＩ配列およびSacＩ-およびNotＩ-適合性突出部を含む予め合成されたオリゴヌクレオチドと混合することができる。図６Ｃを参照。ライゲーションおよび形質転換の後、クローンのミニプレップをNcoＩでの消化により正確さについて調べた。正しいクローンはBstXI部位とNcoＩ部位の両方の存在により同定される。この修飾pDbletをBstXIで処理し、さらにXhoＩ部位で処理すると、5’XhoＩ部位と3’CTAA BstXI突出部を含むベクターが生成される。図５Ｅを参照。この開裂したベクターをクレノウ断片およびdCTPとdTTP で処理して、それ自体へのライゲーションを不可能にする。このようなベクターはコンカテマー鎖を受け入れるために使用することができる。一態様形態では、本発明は、Ｓ．ポンベの自律複製配列を含むコスミドベクターを包含し、Ｓ．ポンベのコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの作製に使用することができる。ドナーＤＮＡを挿入するための少なくとも１つのクローニング部位、λファージのin vitroパッケージングのためのcos部位、大腸菌でクローニングを行うための複製起点と選択マーカー、Ｓ．ポンベの自律複製配列(A RS)、および１種以上の異なる酵母選択マーカー（例えば、ピューロマイシン、u ra4、ハイグロマイシンまたはゼオシン(zeocin)が挙げられるが、これらに限定されない）を含む一連のコスミドベクターを構築することができる。コスミドベクターSuperCosl(Stratagene)を制限エンドヌクレアーゼBg/IIで直鎖状にした。ジーンクリーン(geneclean)法(Bio101)で精製したプラスミドをT4 ＤＮＡポリメラーゼで処理してＤＮＡ末端を「フィルイン(fill-in)」した。ＤＮＡを再びジーンクリーン法で精製した。ＤＮＡをT4 ＤＮＡリガーゼで処理し、大腸菌株DH5αへ形質転換した。制限酵素Bg/IIで切断される能力についてクローンを試験した。さらに研究を行うためにBglIIに耐性の１つのクローンを単離し、SCos-BglIIと命名した。 SCos-BglIIを制限エンドヌクレアーゼBamHIで消化／直鎖状化した。直鎖状にしたベクターを仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理して自己ライゲーションを防止し、ＤＮＡをジーンクリーン法で精製した。２つのDraI、１つのXhoIおよび１つのBg/II制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する人工ＤＮＡリンカーをT4 ＤＮＡリガーゼでBamHI部位へライゲートさせた。ライゲートさせたものを大腸菌株DH5αへ形質転換した。得られたプラスミド(pSuperCosB)は、もはやBamHI 制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含まない。 pSuperCosBを制限エンドヌクレアーゼAatIIで直鎖状にした。直鎖状にしたベクターを仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理して自己ライゲーションを防止し、ジーンクリーン法で精製した。同時に、プラスミドpDbletを制限エンドヌクレアーゼAatIIで切断した。消化したpDbletプラスミドをアガロースゲル電気泳動で分離した。酵母の自律複製配列(ARS)を含有する1198bpの断片をゲルから切り出し、ジーンクリーン法で精製した。次いで、ARS-含有ＤＮＡ断片を直鎖状にしたSuperCoslベクターヘライゲートさせた。ライゲートさせたものを大腸菌株SC110へ形質転換した。得られたクローンをpPCosと命名した。 pPCosを制限エンドヌクレアーゼBg/IIとXhoIで消化した。pDbletを制限エンドヌクレアーゼBamHIとXhoIで消化した。両方の消化物をアガロースゲル電気泳動で分離した。ura4遺伝子を含有するBamHI／XhoI断片とpPCosベクター断片をゲルから切り出し、ジーンクリーン法で精製した。２つのＤＮＡ断片をT4 ＤＮＡリガーゼを用いて互いにライゲートさせた。次いでライゲーション反応を大腸菌株 DH5αへ形質転換した。得られたプラスミドクローンをpPCos＋uraと命名した。ベクターpPCos+uraをAgricultural Research Service Culture Collection(NR RL)、Agricultural Resaerch Service，U.S．Department of Agriculture,1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604，U.S.A.へ1996年10月24日に寄託し、受託番号B-21637Nを得た。あるいは、pPCosは制限エンドヌクレアーゼSmaIおよびBclIIで消化することもできる。これにより、末端切断されたネオマイシン耐性遺伝子を含有するＤＮＡ断片が遊離する。ベクターは、アガロースゲル電気泳動とジーンクリーン法によってこの断片から精製する。SpeI、KpnIおよびNdeI制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する人工ＤＮＡリンカーをT4 ＤＮＡリガーゼを用いてベクターへライゲートさせる。ライゲートさせたものを大腸菌株DH5αへ形質転換する。得られたベクターをpPCos-Neoと命名する。さらに、制限エンドヌクレアーゼNdeIでpPCos-Neoを直鎖状にすることもできる。直鎖状にしたベクターを仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理して自己ライゲーションを防止し、ＤＮＡをジーンクリーン法で精製した。同時に、プラスミドpDbletを制限エンドヌクレアーゼNdeIで消化し、ura4遺伝子を含有する約18 00bp断片を遊離させる。この断片は、ベクターの残部からアガロースゲル電気泳動によって分離し、ジーンクリーン法で精製する。このura4遺伝子断片を、T4 ＤＮＡリガーゼを用いてpPCos-Neoベクターのバックボーンへライゲートさせる。ライゲートさせたものを大腸菌株DH5αへ形質転換する。得られるプラスミドはpPCoslである(図14参照)。５．５．８．植物発現ライブラリーこの節では植物細胞をドナーおよび／または宿主生物として用いるコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの作製に一般的に適用される手順について記載する。植物からのドナーＤＮＡの調製には以下の一般的な手順を用いる。すなわち、（１）植物組織を冷エーテルで前処理して細胞破壊を促進する；（２）組織を砂やガラスビーズまたは酸化アルミニウムと擦り合わせて機械的にホモジナイズする；（３）メッシュを通して濾過し細胞破片を取り除く；（４）第５．１．２節の手順によりＤＮＡを抽出する。得られた精製ＤＮＡを第５．５．３節に記載したように修飾する。CaMV35Sまたはノパリン合成酵素プロモーター、ならびにノパリン合成酵素ターミネーター断片を第５．５．３節に記載したようにＰＣＲで調製する。プロモーターならびにターミネーター断片をＤＮＡ断片に結合し、第５．５．５節と第５．５．６節に記載したように植物ＤＮＡベクターにライゲートする。好ましい植物ＤＮＡベクターはBin19またはその改変体で、これはT-DNAボーダーとAgrobacterium tumefaciensの共存するＴｉプラスミドのｖｉｒ領域のトランス作用性機能を使用して、植物宿主細胞の核内ゲノムにドナー遺伝物質を移入する(Bevan 1984、前出)。複数のクローニング部位を含有する改良型Bin19ベクターであるpBI121またはpBI221が市販されており(Clontech,Palo Alto)、これを使用することができる。カナマイシン耐性および／またはβ−グルクロニダーゼ活性は形質転換をモニターするための、および予備スクリーニングのためのマーカーとして使用される。植物プロトプラストをPotrykusらが1988年に”Methods for Plant Molecular Biology”Weissbach and Weissbach編、Academic Press、376-378頁に記載している方法で、Nicotlana tabacum植物体の葉から調製した。発現構築物は、Ｐ owerらが1988年に”Methods for Plant Molecular Biology”Weissbac h and Weissbach編、Academic Press、388-391頁に記載している方法により、ポリエチレングリコールを用いて形質転換してプロトプラスト細胞内に導入する。形質転換したプロトプラストをカナマイシン耐性などの抗生物質耐性により選別し、第５．４．10節に記載されるように予備スクリーニングのためにカプセル化する。６．実施例：コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの構築およびスクリーニング以下の節では、陸生微生物または海洋微生物の混合物をドナー生物として使用するコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの作製および予備スクリーニングについて記載する。このライブラリーでは宿主生物としてストレプトミセス・リビダンス、大腸菌およびＳ．ポンベを使用する。結果はライブラリー細胞の幾つかがドナー生物の代謝活性を示し、従って潜在的に関心のあるドナー代謝経路が宿主生物内でも機能していることを示す。更に、一つのライブラリークローンは、代謝経路内の既知酵素と配列相同性を共有する海洋細菌タンパク質をコードしているＤＮＡを含むことが示される。６．１．材料および方法本方法に有用な試薬は通常は市販されているものである。例えば以下がある： Gene Clean，Genomeキット(Biol01、Vista、CA)；制限酵素、ＰＣＲ試薬および緩衝液(Promega、Madison,WI;New England Biolabs;Stratagene、La Jolla,CA )；ＴＡクローニングキット(Invitrogen、LaJolla、CA)；細菌用培地(Difco、In c.);Mira Tip(Hawaiian Marine Imports,Inc.);pBSKプラスミド、XL1-MR細胞、S uperCoslコスミド、Gigapackパッケージング抽出物(Stratagene,La Jolla,CA);Q iagen QIAprepプラスミド精製キット(Qiagen,Inc.，Chatworth,CA)；アビジン結合磁気多孔性ガラス（ＭＰＧ）ビーズ(CPG,Inc.,New Jersey)；ペトリ皿、９６ −および384ウエルプレート、Omni-Trays(Nunc)、９６−および384ピンレプリケーターおよびフォーム(V＆PScientific、San Diego,CA) ；アンピシリン(IBI、Inc.,CA)；緑色蛍光タンパク質およびGFP cDNA(Clontech 、Inc.)；オリゴヌクレオチド(Genset,La Jolla,CA)；特記しない細菌種とＤＮＡ配列(American Type Cult ure Collection,Rockville,MD)；７−エトキシ−ヘプタデシルクマリン、BCECF-AM(Molecular Probes,Oregon)；３−メチルベンゾエート、３−クロロトルエン、ｍ−トルエート、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、アセタミノフェン、砒素、アンチモン、シス−シス−ムコネート、およびその他の（特記してない）化学薬品(Sigma)；およびDynabeads、MPC-M(Dy nal,Inc.,Lake Success,NY)。６．１．１．培地の調製培地および溶液に汎用の精製水(ddH₂O)を、軟化、逆浸透および脱イオン化により精製した。海洋水(海水H₂O)は、Scripps Institute of Oceanography(La Jolla ，Ca)より得て、使用前に濾過した。合成海水(SSW)は、ddH₂Oから、塩類(45.2mm のNaF、48.8mmのSrCl₂、0.324mMのH₃BO₃、0.563mMのKBr、6.25mMのKCl、4.99mM のCaCl₂、0.7mMのNa₂SO₄、16.4mMのMgCl₂、268mMのNaCl、45.8mMのNa₂SiO₃、1.1 0mMのEDTA、1.58mMのNaHCO₃)および海洋微量元素(0.01％のMira Tip)を添加することにより調製した。ＬＢ培地は、１％のトリプトン、0.5％酵母エキス、１％NaClを有するddH₂Oから調製した。W2-B1は、0.25％のペプトン、0.15％の酵母エキス、0.6％（容積／容積）のグリセロールを有する75％海水H₂OあるいはSSWから調製した。 F10Aは、2.5％の可溶性ポテトデンプン、0.2％グルコース、0.5％酵母エキス、0.5％ペプトン、0.5％Distillerの可溶化物(Nutrition Products Co.，Louisv ille,KY)、0.3％炭酸カルシウムを含むddH₂O（pHを7.0にした）より調製した。６．２．プレート複製および巨大液滴カプセル化によるActinomvcetes/Streptom vces lividans コンビナトリアル天然経路発現ライブラリーの予備スクリーニング種番号501〜534で同定される34種類のactionmycetes種をドナー生物として使用した。この生物は、個別にF10A培地で培養し、ゲノムＤＮＡを第５．３．１節に記載されているようにして抽出、精製した。各種当り約100μｇのゲノムＤＮＡを得て、第５．４．２節に記載したようにしてSau3Aで部分的に制限酵素消化するために混合した。ゲノムＤＮＡの断片を、ショ糖密度勾配遠心分離によりサイズ分画し、20〜40kbの断片を含む分画をプールして、Klenow断片で部分的にフルインして、以下において同様に調製したベクターと適合するようにした(Korch 1987,Nuc Acids Res 15;3199-322O;Loftus ら.1992 Biotehnlques 12:172-175)。0.5〜3.0μｇのプールした断片を、複数のバッチ内で、BamHIあるいはXhoIで調製したpIJ922およびpIJ903(Hopwood 1985，前出)ベクターの0.5〜3.0μｇにライゲートした。ライゲートした発現構築物を、宿主生物であるStreptomyces lividans細胞株64(すでに細胞壁をリゾソームで除去してコンピテントな状態にしてある)(Hopwood 1985，前出)に形質転換した。約11,000の特徴的なクローンが得られ、増幅して、菌糸として(20％のグリセロール中)、あるいは胞子として（50％のグリセロール中）−70℃で保存した。個々のクローンをスクリーニングするためのライブラリーを調製するために、形質転換したTK64宿主細胞を、F10A寒天で満たした150mmシャーレに広げた。細胞を広げた後に、シャーレを30℃で21時間インキュベートした。選別は、チオスレプトン５μｇ/mlを1ml／シャーレの割合で上層することにより行った。48〜72 時間後に、コロニーを滅菌した爪楊枝で拾い上げ、９６ウエルのプレートに、１ウエル当たり１個の割合で移した。各ウエルにはF10A培地が入っている。これらの接種したマスタープレートを１〜４日間にわたって３０℃で置いた。一晩おいたマスターの９６ウエルプレートは起源プレート(sourceplate)として使用して、１枚以上の実験用９６ウエルプレートあるいはオムニートレー(Omini-Trays) に複製した。マスターの９６ウエルプレートは、次に、個別に密封して−８０℃ で凍結した。複製は、各使用前に火炎吹き付けにより滅菌した９６ピンレプリケーターを用いて行った。実験用の９６ウエルプレートを起源プレートとして用いて、ライブラリーを一連の確認および／または選択培地および指示プレートに複製した。選別用抗生物質としては、エリスロマイシン、ノボビオシンおよびネオマイシンが挙げられる。確認培地としては、Ｘ−グルコピラノシドおよびＸ−グルコン酸を含む F10AおよびR5培地を用いられる。指示プレートは、F10A上で増殖したライブラリークローンを含み、次にEnterococus faecalis(E.faecalis)、Bacillussubtilis (B.subitilis)あるいはSOSクロモテスト(Chromotest)(X-galを有する)の指示菌叢を上層した。得られたものを集めてStreptomyces宿主TK64株のプロファイルと比較した。ライブラリーのクローンについても巨大液滴カプセル化によって予備スクリーニングした。予備スクリーニングの各々において、ライブラリーの50,000の増幅クローンを第５．４．13節に記載したようなにしてカプセル化した。６．３．巨大液滴カプセル化によるActinomvcetes／大腸菌コンビナトリアル・キメラ経路発現ライブラリーの予備スクリーニング第６．２節に記載したような３４種類のactionmycetes種（種番号501〜534として同定）から得たゲノムＤＮＡを、S.lividans宿主内のコンビナトリアル・キメラ経路遺伝子発現ライブラリーの作製に使用した。2〜7kbのSau3A消化ゲノムＤＮＡの断片を含む分画をプールした。ゲノムＤＮＡ断片のアリコートを、別のプロモーターに別々にライゲートして第５．５．３節に記載したような遺伝子カセットを作製した。コンカテマーは、各サイクルについて異なるプールの遺伝子を用いてライゲーションおよび脱保護を８回繰り返して作製して、得られたコンカテマーが各々、ゲノムＤＮＡの断片に結合した８種類の異なるプロモーターを含有する８種類の遺伝子カセットを有するようにした。 10μｌのコンカテマーを環化して、0.5μｇのSuperCoslベクターとBamHI部位でライゲートして発現構築物を形成した。製造業者の指示（ストレタジー）に従って、大腸菌宿主細胞XL1-MRの感染のためにインビトロでパッケージングした。およそ1,000,000の特有のクローンを得、増幅し、プールして増幅ライブラリーを作製した。このライブラリーを−７０℃で保存した。増幅細胞は第５．４．10 節のようにしてカプセル化し、第５．４．14節のようにして予備スクリーニングした。６．４．巨大液滴カプセル化法による真菌／シゾサッカロミセス・ポンベコンビナトリアルキメラ経路発現ライブラリーの予備スクリーニング以下の真菌ドナー生物をATCCより得て用い、２種類のコンビナトリアルキメラ経路発現ライブラリーを調製した：トリコデルマ・レエセイ(Trichodermareesei )，フザリウム・オキシスポラム(Fusarlumoxysporum)，ペニシリウム・ロッケフォルティ(Penicillium roquefortii)，リゾプス・オリゴスポラス(Rhizopus oli gosporus)，ノイロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)，フイコミセス・ブランケスレアヌス(Phycomyces blankesleeanus)，アスペルギルス・フミガーツス( Aspergillus fumi gatus)，アスペルギルス・フラーブス(Aspergillus flavus) 、エメリセラ・ヘテロタリカ(Emerlcella heterothallica)，ケトミウム・グラシレ(Chaetonium gracile)，ペニシリウム・ノタルーム(Penicillium notatum) ，ペニシリウム・クリソゲナム(Penicillium chrysogenum)。各々の種を別々にポテトデキストロース寒天(PDA;Difco)あるいは麦芽抽出寒天(MEA;Difco)中で中程度のrpmで48〜72時間培養した。胞子の接種は１×10⁴〜1 ×10⁶胞子/mlを、１リッターの培養フラスコに入った500mlのポテト抽出物あるいは麦芽抽出ブロスに加えて、22℃で、225rpm、48〜72時間培養して行った。培養物をMiracloth(Calbiochem)に真空下で濾過して集めた。集めた菌糸塊を２リッターのddH₂Oで洗浄し、10分間風乾して凍結乾燥した。真菌のゲノムＤＮＡとｍＲＮＡを５．３．１節および５．３．２．節に記載された方法で菌糸から抽出し精製した。集めた菌糸の一部を凍結乾燥し−７０℃で保存した。真菌のゲノムＤＮＡの断片を５．４．２節に記載された方法で調製した。真菌のｍＲＮＡは通常の方法でｃＤＮＡに変換した。(Sambrookら。1989、Watson CJ＆Jackson JF(1985)DNA cloning：A practical approach 79-88,IRL Press)。各々の種から得たＤＮＡ断片のうち同重量のものを集めてゲノムＤＮＡプールならびにｃＤＮＡプールとした。これらのプールにはＤＮＡがおよそ5〜10μｇ含まれていて、独立にコンビナトリアルキメラ経路発現ライブラリーの組立に利用した。以下のシゾサッカロミセス・ポンベ(S.pombe)−適合プロモーターとターミネーターを５．５．２節に記載された方法で作製した。即ち、ＣＭＶ早期／初期、SV40初期、RSV、HSVチミジンキナーゼ、CaMV、nmtＩ、adh1、およびuva4プロモーターである。これらのプロモーターとターミネーターの断片をｃＤＮＡとゲノムＤＮＡプールに５．５．４節に記載された方法で結合した。各遺伝子カセットは平均で５ｋｂの長さであり、５．５．５節に記載された方法で濃縮した。８つの遺伝子カセットを含む最終の結合体を環状化して、５．５．７節に記載された方法でpDbletを改変したベクター(Burnら、1995、Gene、Vol.164 pp.173-177)に挿入した。発現構築物をS.pombeにGietzとWoody(FD Gietz ＆ RA Woody、Molecular genetics of yeas t:A practical approach,chapter8、pp121-134)の酢酸リチウム法で導入して形質転換した。ura4マーカーの存在について選別して、110,000のＳ．ポンベクローンを得て、増幅させた。このクローンをプールして予備スクリーニング用の増幅ライブラリーを作った。以下の様な予備スクリーニングを行った。即ち、酵素基質試験、抗生物質活性、抗生物質耐性である。６．５．プレート複製による海洋グラム（−）菌／大腸菌ライブラリーの予備スクリーニングバハマ諸島近海の海水より採取された海洋細菌がHarbor Branch Oceanographi c Instituteより提供された。各野生型のグラム陰性着色海洋細菌種はＤＮＡライブラリーを調製する前に、余分な部分を決定するとともに、完全なライブラリーになされるべき一連の予備スクリーニングのアレイを決めるうえで役立てるための試験を行った。次のようなアッセイを海洋グラム陰性／大腸菌ライブラリーの親種について行った。その結果は以下のとおりである：これらのアッセイにおいて、以下のものを選んで大腸菌のコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの細胞に実施した：CAS;S.aureus;S.aurantiaca；デンプン消化。簡単に説明すると、40の親種を各々、B3培地5mlに接種して一晩３０℃で、300 rpmでFalcon2059チューブを用いて培養した。一晩培養したものを沈殿させてから全ゲノムＤＮＡを通常の方法で抽出した。ゲノムＤＮＡはアガロースゲル上で可視化して定量し、40種の各々から５μｇのＤＮＡを集めて合計200μｇとした。コンビナトリアル自然経路発現ライブラリーを大腸菌を利用して５．１．４節に記載された方法で作った。このＤＮＡを部分的に消化して、SuperCoslにライゲートして、SuperCoslの製造業者の説明書に従いλファージにパッケージして大腸菌に導人できるようにした(Stratagene)。こうして５×10⁶の特徴的なクローンが得られ、これを通常の方法で７×10⁸/ml cfuに増幅した。増幅したストックを使用するまで15％のグリセロール中に−７０℃で保管した。個々のクローンをスクリーニングする為のライブラリーを調製するために、増幅したライブラリー細胞を、50mlのLB、100mg/mlのアンピシリン及び50mg/mlのカナマシンで150mmペトリ皿上に広げた。このプレートは前もって２４時間室温で暗所下で乾燥させておく。７×10⁸/mlcfuのストックをＬＢで希釈して500cfu/ mlにした。1mlを各150mmのプレートに広げた。広げた後に、プレートを３７℃で一晩インキュベートする。得られたコロニーを滅菌した爪楊枝で拾い上げ、384 ウエル型プレートに、ウエル当たり一つの割合で移す。合計6400のクローンを拾い上げ記録した。各ウエルには75/μｌLB、50μｇ/mLのアンピシリン、７％のグリセロールが含まれている。外側の列（合計８０ウエル）には接種しないが、同様に培地を加えその後のインキユベーションと凍結の間の乾燥を防いだ。この接種したマスタープレートを振盪しない状態で３７℃で１６時間放置した。一晩おいたマスター384ウエルプレートを起源プレートとして利用して１枚以上の実験用マルチプレートあるいはオムニトレーを複製した。マスターの384ウエルプレートはそれから個別にシールして−８０℃ で凍結した。複製は複数のピンを持つレプリケーターを利用して行った。使用前後に384ピンレプリケーターを漂白剤に２０秒間浸して、さらに水に３０秒浸し、それからエタノールに５秒浸してから燃やした。実験用のマルチウエルプレートあるいはオムニトレイを起源プレートとして利用して、ＤＮＡライブラリーを一連の識別および／あるいは選択培地（例えば、シデロフォア検出培地(CAS)あるいは抗菌叢）上に複製する。生育したものを集めて、ＤＮＡライブラリーを構築するのに使用した野生型の海洋細菌のプロファイルと比較した。デンプン消化能力が陽性のクローンが６つ単離された。これらのクローンについてS.aureusあるいはS.aurantiacaの成長阻害能力について調べたところ、１種のクローンがS.aurantiacaの成長を阻害することが判明した。このクローンについて更に解析を進め、ＤＮＡ配列を解析した結果、ポリケチド合成経路に相同なタンパク質をコードするＤＮＡ配列が含まれるていることが判明した。図１０にはStreptomycesc oelicolorのアクチノロジンデヒドラーゼ遺伝子とクローンCXC -AMN20から得られたＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列とのアライメントを示している。このクローンの活性部分を有機溶媒を用いて抽出することによりさらに解析し、抗菌試験による精製を行った。このクローンに含まれるＤＮＡ配列を多重ＰＣＲを用いて更に解析し、同起源の親種を決定した。ＰＣＲプライマーを選択し、クローンの配列を基に合成した。極めて保存性の高いリボソーマルＲＮＡプライマー配列を陽性コントロールとしてＰＣＲに利用した。陽性コントロールより、およそ2kbの断片が得られた。クローンあるいはその同起源の親種から得られた増幅産物は600bp未満であった。まず、多重ＰＣＲ反応を４種類の親種由来のゲノムＤＮＡプールを用いて通常の方法に従い実施した。プール１−３のゲノムＤＮＡからは増幅により増幅産物が得られた（図１１参照）。多重ＰＣＲ反応を個々の親種のゲノムＤＮＡを用いて繰り返した。図１２より、プール１の種＃６から得たゲノムＤＮＡ、プール２の種＃１８から得たゲノムＤＮＡ、プール３の種＃３１から得たゲノムＤＮＡがＰＣＲ反応で陽性であることが判明した。このことより、同定したＤＮＡ配列がこれら３種の海洋性細菌のいずれかに由来しているらしいことが示唆された。従って、この結果より、コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーには目的とする代謝経路をコードする海洋性細菌由来の遺伝物質を含むクローンが含まれていることが判る。更に、この様なライブラリー中のクローンを同定することが可能であり、予備スクリーニングにより単離できることが示された。６．６．巨大液滴カプセル化法による海洋性グラム（−）菌／大腸菌ライブラリーの予備スクリーニング 30,000クローンをアルギン酸ナトリウム(Protanol LF 20/60，Pronova Biopol ymer，Drammer，Norway)を用いてカプセル化し、100mLの滅菌水中に１％の濃度になるようオーバーヘッドミキサーで2000rpmで溶解した。30,000細胞を含むライブラリー懸濁液１ｍｌを滴内に1〜5クローン入るように添加した。混合物を脱気のため３０分放置した。次いで混合物を２５ゲージ針より押し出した。135mM 塩化カルシウムの入った0.5Lのビーカーをゆっくりと攪拌し、そこへ混合物を滴下した。滴を１０分間硬化させてから無菌フラスコに移し、塩化カルシウムを除いてからLB/Amp培地と基質であるＸ−グルコサミニドと80μ/mlで交換した。その他の基質としてはＸ−酢酸塩、Ｘ−グルコピラノシド、X-galやポリケチド経路に関係する特定の基質がある。滴の入ったフラスコを３０℃で一晩振とうし、青色となることで特定される陽性クローンを翌朝確認した。クローンは５．４． 14に記載するとおり、Ｓ．アウレウス(aureus)，Ｓ．アウランティカ(aurantiac a)を含む指示細胞と一緒にカプセル化することもできる。滴は大きな透明のトレーの中に単層に配し、目視で観察した。Ｘ−グルコサミニド陽性のものは取り出して１５％のグリセロールに再懸濁し、−７０℃で保存した。その他の陽性コロニーは取り出してLB/Ampと50mMのクエン酸ナトリウムpH 7.4が入った９６ウエルのマスタープレートに移し、溶解させ、３７℃で一晩増殖させた。この一晩増殖させた９６ウエルマスタープレートを起源プレートとし、１枚以上の実験用のマルチウエルプレートあるいはオムニトレーに複製する。次いで９６ウエルマスタープレートを個々にシールして−８０℃で冷凍した。陽性クローンに対しては、産物の特異試験を行うか、別の予備スクリーニングあるいはスクリーニングを行う。更なるスクリーニングはマルチピンレプリケーターを用いて複製することにより行うことができる。７．実施例：Actinomvcetes ／Streptomvces lividansコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの構築およびスクリーニング以下の小節には、コンビナトリアル天然経路発現ライブラリーと、陸生微生物の混合物をドナー生物として用いる勾配をつけたコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの作製を記載する。両方のライブラリーとも、大腸菌をアーキバル（ archival）宿主とし、Streptomyces lividansを発現宿主として使用した。簡単に説明すると、コンビナトリアル天然経路発現ライブラリーを作製するのに、ドナー生物のＤＮＡを用いてアーキバル・コスミドライブラリーを作製した。次いでライブラリーの挿入断片を単離し、宿主であるStreptomyces lividans へ導入するためにStreptomycesベクターへ再度クローニングした。勾配をつけたコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーを作製するには、II型ポリケチド生合成経路をコードする遺伝子とのハイブリダイゼーションによってアーキバル・ライブラリーを予め選択した。actinomyceteドナー生物由来のII型ポリケチド経路をコードする可能性のある遺伝物質を単離し、ランダムに混合し、S．lividans へ再度クローニングしてコンビナトリアル発現ライブラリーを形成した。宿主生物内で機能し得る、新規な代謝経路またはハイブリッド代謝経路の産物である可能性のある両ライブラリー由来のクローンを、抗菌活性について分析した。７．１．材料および方法本発明従って、34種のドナーactinomycete株より単離した染色体ＤＮＡを用いてコスミドpWE15および大腸菌でアーキバル・ライブラリーを構築した。コンビナトリアル天然経路遺伝子発現ライブラリーを作製するため、コスミドＤＮＡをアーキバル・コスミドライブラリーのクローンより作製し、プールした。actinomyceteドナーＤＮＡのGC含量が高いため、酵素Dral（その認識部位にＧまたはＣを含まない）を使用してactinomyceteドナーＤＮＡを、プールしたコスミドＤＮＡから単離した。サイズが25kbよりも大きいＤＮＡ断片をスクロース勾配遠心分離によって濃縮し、発現ベクターのクローニング部位と適合するリンカーへライゲートさせた。以下のStreptomycete発現ベクターを使用してライブラリーを作製した：pIJ941、pIJ702、pIJ699、pIJ922およびpIJ903(Hopwoodら、19 85 Genetic Manipulation of Streptomyces,ALaboratory Manual，The John Inn es Foundation)。次いでコンビナトリアル天然経路発現ライブラリーを発現宿主であるS．lividans TK64へ導入した。8,200個のクローンを拾って別々に培養し、Micrococcus lutens、Staphylococcus aureus、Bacillus subtilis、大腸菌、 Saccharomyces cerevisiae、Candidaalbicans、およびPenicillium chrysogenum の増殖を抑制する能力について分析した。クローンはSOS試験によってＤＮＡ反応性についても試験した。勾配をつけたコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーを作製するため、アーキバル・コスミドライブラリーを150mmペトリ皿の上にプレート当たり約2,000コロニーの密度となるように広げた。全部で60,000コロニーをスクリーニングした。直径約0.5mmのコロニーを産生させるためにプレートを18時間30℃でインキュベートした。次いでこれらのコロニーを137mm、0.45μｍのNytranディスクに写し取った。次いでディスクを、コロニーが付着した面を上にして、10％SDSに予め浸漬しておいた3MM紙のシートの上に置き、３分間浸漬した。これらのディスクを、0.5M NaOH、1M NaClに５分間浸漬しておいた3MM紙のシートへ移し、次いで0.5M Tris-HCl、1.5M NaClにさらに５分間浸漬しておいた3MM紙へ移し、最終的に２×SSCに５分間浸漬しておいた3MM紙へ移した。次いでディスクを空気中で少なくとも６時間乾燥させた。次いでＤＮＡをＵＶ架橋剤でフィルターへ固定した。actIポリケチド経路(Malpartidaら，1984，Nature 309:462-464)およびwhiE ポリケチド経路(Davisら，1989，Mo lecular Microbiology 4:1679-1691)に特異的なＤＮＡプローブを、非放射性DIG 標識キットを用いて標識し、60℃にて５×SSC／0.1％SDS溶液中で一晩フィルターディスクへハイブリダイズさせた。インキュベーションの後、ディスクを60℃ にて１×SSC／0.1％SDS中で１〜４回洗浄し、プローブとハイブリダイズしたコロニーを検出した。約60〜70個の陽性クローンを元のプレートから単離し、プールした。コスミドＤＮＡをプールしたクローンから単離し、DraIで消化してコスミドベクターＤＮＡをactinomyceteＤＮＡから分離した。代謝経路の遺伝子をランダムに混合するために、actinomyceteＤＮＡをSau3AIで部分的に消化して約4〜10kbの断片を生成させ、断片をライゲートさせて50kbよりも大きなコンカテマーを形成した。ライゲートさせたＤＮＡをSau3AIで部分的に再度消化し、おおよそのサイズが15〜 30kbの断片を生成させ、ベクターpIJ702(Hopwoodら，1985 Genetic Manipulatio n of Streptomyces，A laboratoy Manual，The John Innes Foundation)のBglII 部位へライゲートさせた。次いで勾配をつけたコンビナトリアル発現ライブラリーを発現宿主であるS．lividans TK64へ導入した。2,200個のクローンを拾って別々に培養し、Micrococcus lutens(MLUT)、Staphylococcus aureus(SA1)、Baci llus subtilis(BS8)、大腸菌(E.coli)、Saccharomycescerevisiae(SC7)、Candid aalbicans(CA917)、およびPenlcillium chrysogenum(PC)の増殖を抑制する能力について分析した。クローンはSOS試験によってＤＮＡ反応性についても試験した(SOS)。７．２．結果コンビナトリアル天然経路発現ライブラリーの場合、8,200個のクローンを抗微生物活性についてスクリーニングし、205個の目的のクローン(2.5％)を同定した。表VIに、コンビナトリアル天然経路発現ライブラリー由来の20個のクローンの抗微生物アッセイの結果を示す。勾配をつけたコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの場合、2,200個のクローンを抗微生物活性についてスクリーニングし、71個の目的のクローン(3.2％ )を同定した。表VIIに、コンビナトリアル天然経路発現ライブラリー由来の９個のクローンの抗微生物アッセイの結果を示す。これらは化学構造分析にかける予定である。データより、コンビナトリアル天然経路発現ライブラリーと勾配をつけたコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの双方とも、代謝経路（おそらく、新規なポリケチド経路またはハイブリッドポリケチド経路）をコードする遺伝物質を保有するクローンを含有し、抗微生物活性を有する化合物を産生することは明らかである。上記に開示した本発明の実施態様は代表例にすぎず、様々な変更、応用、ならびに改良が本発明の範囲内で行えることは当業者には自明のことである。従って、本発明は本明細書に記述した特定の実施態様に限定されるものでなく、以下の請求項にのみ限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ブライアン，ポールアメリカ合衆国 92103 カリフォルニア州，サンディエゴ，ナンバー 305 サードアベニュー 4179

Claims

【特許請求の範囲】１．発現構築物のプールを含んでなる移動可能なコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーであって、各発現構築物が異なる宿主細胞種または株内で複製する能力のあるシャトルベクターを含み、該シャトルベクターば複数のドナー生物種に由来するｃＤＮＡ断片またはゲノムＤＮＡ断片を含有し、このｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片が、適当な宿主生物内での該ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片によりコードされる遺伝子の発現を駆動する１以上の調節領域と機能的に結合されていることを特徴とする、前記移動可能なコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリー。２．発現構築物に含まれるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片がランダムに連結されており(concatenated)、１種以上のドナー生物種に由来するものである、請求項１に記載の遺伝子発現ライブラリー。３．発現構築物に含まれるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片のいくつかは、特定の性質について予め選択される、請求項１に記載の遺伝子発現ライブラリー。４．発現構築物がプラスミドベクター、ファージ、ウイルスベクター、コスミドベクターまたは人工染色体を含む、請求項１、２または３に記載の遺伝子発現ライブラリー。５．シャトルベクターが導入起点(origin of transfer)をさらに含む、請求項１、２または３に記載の遺伝子発現ライブラリー。６．ドナー生物が微生物の混合物を含む、請求項１、２または３に記載の遺伝子発現ライブラリー。７．各発現構築物が宿主細胞内に保持されている、請求項１、２または３に記載の遺伝子発現ライブラリー。８．宿主細胞が、関心のある既知の代謝経路またはその一部の導入、誘導または過剰生産により改変されている、請求項７に記載の遺伝子発現ライブラリー。９．宿主細胞が、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、ストレプトミセス・ケリコロール(Streptomyces coelicolor)、緑膿菌(Pseudomonas aerugino sa)、ミクソコッカス・キサンタス(Myxococcus xanthus)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ( Schizosaccharomyces pombe)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera f rugiperda)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)、ニコチアナ・タバクム(N icotiana tabacum)、COS細胞、293細胞、VERO細胞、NIH/3T3細胞、またはCHO細胞である、請求項７に記載の遺伝子発現ライブラリー。 10．宿主細胞が、望ましい代謝経路または化合物を発現している前記ライブラリー中のクローンを同定するように適応されたリポーターレジメ(reporter regimen)をさらに含む、請求項７に記載の遺伝子発現ライブラリー。 11．リポーターレジメが、宿主細胞により発現された望ましい代謝経路または化合物により誘導可能であるかまたはモジュレートされる調節領域と機能的に結合されたリポーター遺伝子をコードするＤＮＡを含む、請求項７に記載の遺伝子発現ライブラリー。 12．宿主細胞が、望ましい代謝経路または化合物を発現している前記ライブラリー中のクローンを同定するように適応されたリポーターレジメを含有するマトリックス中に存在する、請求項７に記載の遺伝子発現ライブラリー。 13．移動可能なコンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの作製方法であって、異なる宿主細胞種または株内で複製する能力のあるシャトルベクターをｃＤＮＡ断片またはゲノムＤＮＡ断片にライゲートして発現構築物を作製することを含んでなり、該ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片は複数のドナー生物種から得られたものであり、該ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片中に含まれる遺伝子が、適当な宿主細胞において該遺伝子の発現を駆動するその固有の調節領域または外因性の調節領域と機能的に結合されていることを特徴とする前記方法。 14．発現構築物に含まれるｃＤＮＡまたはゲノム断片がランダムに連結されており、１種以上のドナー生物種に由来するものである、請求項13に記載の方法。 15．発現構築物に含まれるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片のいくつかは、特定の性質について予め選択される、請求項13に記載の方法。 16．ＤＮＡベクターがプラスミドベクター、ファージ、ウイルスベクター、コスミドベクターまたは人工染色体である、請求項13、14または15に記載の方法。 17．シャトルベクターが導入起点をさらに含む、請求項13、14または15に記載の方法。 18．コンビナトリアル遺伝子発現ライブラリーの作製方法であって、宿主生物種の発現構築物のプールを別の宿主生物種または株へ導入することを含んでなり、該発現構築物は異なる宿主細胞種または株内で複製する能力のあるシャトルベクターを含み、該シャトルベクターは複数のドナー生物種から得られたｃＤＮＡ断片またはゲノムＤＮＡ断片を含有し、該ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片中に含まれる遺伝子が、適当な宿主細胞において該遺伝子の発現を駆動するその固有の調節領域または外因性の調節領域と機能的に結合されていることを特徴とする前記方法。 19．発現構築物のプールを接合によって導入する、請求項18に記載の方法。 20．発現構築物のプールを、該発現構築物を第１の宿主生物種から単離し、該発現構築物を第２の宿主生物種または株へ導入することによって導入する、請求項18に記載の方法。 21．発現構築物を、形質転換、トランスフェクション、感染またはエレクトロポレーションによって第２の生物種または株へ導入する、請求項20に記載の方法。 22．シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)の自律複製配列を含んでなるコスミドベクター。 23．pPCos+uraである、請求項22に記載のコスミドベクター。 24．pPCos1である、請求項22に記載のコスミドベクター。 25．ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片が、代謝経路のタンパク質をコードする核酸配列に対する相同性について予め選択される、請求項３に記載の遺伝子発現ライブラリー。 26．ｃＤＮＡよたはゲノムＤＮＡ断片が、代謝経路のタンパク質をコードする核酸配列に対する相同性について予め選択される、請求項15に記載の方法。