EP2135092A1 - Fluoreszenz-basiertes assay zum erkennen von verbindungen zum modulieren des natrium-calcium-austauschers (ncx) im "vorwärtsmodus" - Google Patents

Fluoreszenz-basiertes assay zum erkennen von verbindungen zum modulieren des natrium-calcium-austauschers (ncx) im "vorwärtsmodus"

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Publication number
EP2135092A1
EP2135092A1 EP08716226A EP08716226A EP2135092A1 EP 2135092 A1 EP2135092 A1 EP 2135092A1 EP 08716226 A EP08716226 A EP 08716226A EP 08716226 A EP08716226 A EP 08716226A EP 2135092 A1 EP2135092 A1 EP 2135092A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
ncx
assay
cells
calcium
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP08716226A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Martin Hug
Thomas Licher
Sven Geibel
Henning Vollert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi SA
Original Assignee
Sanofi Aventis France
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Aventis France filed Critical Sanofi Aventis France
Publication of EP2135092A1 publication Critical patent/EP2135092A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Definitions

  • the present invention relates to sodium-calcium exchangers (NCX) and methods for determining their activity. More particularly, the invention relates to a fluorescence-based assay for detecting compounds for modulating the NCX in "forward mode.” It further relates to a kit of parts that includes cells that express NCX and the use of the kit of parts.
  • NCX sodium-calcium exchangers
  • a prerequisite for life is compartmentalization - whereby biological membranes are the tool of nature to implement this principle.
  • a lipid bilayer - the structure underlying the cell membrane - is impermeable to most ions and compounds whose transport is essential for maintaining vital functions in cells and organisms.
  • the answer to this paradox lies in the semipermeable nature of the cell membrane - solutes that must cross the membrane are transported by specific membrane proteins.
  • These carriers are responsible for the generation and maintenance of ion gradients, the absorption of nutrients, the transport of metabolites, the recovery of signaling molecules and the disposal of toxic and waste compounds. Therefore, carriers are potential drug targets that directly influence disease-related abnormalities in this context.
  • the sodium / calcium exchanger is an important mechanism for the removal of Ca 2+ from diverse cells.
  • Ca 2+ which has entered through Ca 2+ channels to initiate contraction, while Na + enters the heart cell.
  • Its relevance in cardiovascular diseases is exemplified in Hobai, JA &O'Rourke, B (2004) Expert Opinion. Investig. Drugs, 13, 653-664. Therefore, the pharmaceutical industry has developed compounds that inhibit the NCX, as described, for example, in Iwamoto, T. et al. (2004) J. Biol. Chem., 279, 7544-7553.
  • the Na + / The Ca 2+ exchanger electrogenically carries three to four Na + for each Ca 2+ moving in the opposite direction, as shown, for example, by electrophysiological means in Hinata, M. et al. (2002) J. Physiol. 545, 453-461.
  • the NCX is able to maintain the cytoplasmic Ca 2+ concentration ([Ca 2+ ] one) three to four orders of magnitude below the extracellular Ca 2+ concentration ([Ca 2+ ] off). Nonetheless, the direction of net Ca 2+ transport is dependent on the electrochemical gradient of Na + . Simultaneous and consecutive transport models have been proposed for Na + and Ca 2+ translocations, and a lot of evidence supports the latter.
  • Transporters are an aspiring target family with tremendous potential that offers scientific and economic opportunities.
  • carriers are a difficult target class in drug discovery technologies.
  • radioactive flux assays have been used in which cells are provided with a radioactive tracer (eg 45 Ca) and the flow of radiolabelled Ca is monitored. Cells loaded with the tracer are exposed to compounds, and these compounds, which either enhance or decrease the effluent of the tracer, are identified as possible activators or inhibitors of ion channels in the cell membranes.
  • a radioactive tracer eg 45 Ca
  • a specific example is included in T. Kuramochi et al .; Bioorganic & Medical Chemistry; 12 (2004) 5039-5056; Title: Synthesis and structure-activity relationships of phenoxypyridine derivatives as novel inhibitors of the sodium-calcium exchanger.
  • EP 1 031 556 discloses a method in which the Na + / Ca 2+ -exchange activity is measured by means of sarcolemmal vesicles, the concentration of Ca 2+ uptake in the sarcolemmal vesicles being determined by measuring the 45 Ca radioactivity.
  • radioactive ion transporter assays have limited sensitivity and therefore poor data quality.
  • costs and safety issues associated with radioactive screening technology are hurdles preventing broader application.
  • radioactive flux assays to identify compounds that modulate the activity of ion channels and ion transporters is the closest prior art to the present invention, as this is a technique involving a test compound by monitoring the flow of Ca 2+ from the cells as a potential activator or inhibitor.
  • the main problem for the radioactive assays is based on the difficulty of detecting the limited turnover of ion transporters of about 1 to 1,000 molecules per second - about 10 4 times less than most ion channels.
  • An object of the present invention relates to an assay for determining the activity of NCX protein, wherein: a) cells expressing NCX are provided; b) providing a colored substance for determining intracellular calcium; c) cells are contacted with an NCX activity activator; and d) comparing the calcium-mediated change in the luminescent signal from the colored substance with a luminescence signal generated in a control experiment.
  • Another object of the present invention is an assay for determining the activity of NCX protein in response to the addition of a compound, wherein: a) cells expressing NCX are provided; b) providing a colored substance for determining intracellular calcium; c) cells are contacted with a compound, wherein the cells have been treated with the compound having an NCX activity activator prior to treatment; and d) comparing the calcium-mediated change in the luminescent signal from the colored substance with a luminescence signal generated in a control experiment.
  • the NCX protein used came from a mammal, and more particularly from a human.
  • the NCX protein is selected from NCX1, NCX2, NCX3, NCX4, NCX5, NCX6 and / or NCX7, in particular NCX1, NCX2 and / or NCX3.
  • the cells used in the assay of the present invention may be derived from any eukaryotic organism.
  • the cells are mammalian cells.
  • the cells are CHO (CCL-61), HEK (CCL-1573), COS7 (CRL-1651) and / or JURKAT (CRL-1990) cells.
  • the NCX activity activator used in the assay of the present invention is ionomycin.
  • the colored substance is added as a dye precursor to the cells, which is capable of entering the cells and being hydrolyzed to a dye, whereby the dye in the cells forms a complex with calcium and provides a luminescent signal.
  • the dye precursor may preferably be an acetoxymethyl ester derivative, and the dye may preferably be the calcium-sensitive fluorescent dye fluo-4.
  • the luminescent signal is fluorescence and the monitoring step c) uses a FLIPR device.
  • the invention further relates to the use of an assay as previously mentioned for testing a compound for activity as an agonist or antagonist of NCX.
  • the invention relates to the use of an assay as previously mentioned for the diagnosis of a disease associated with NCX-altered expression.
  • the invention further relates to a kit of parts comprising: a) lyophilized cells expressing NCX protein; b) a colored substance; c) a connection buffer; and d) a colored substance buffer.
  • the colored substance is the calcium-sensitive fluorescent dye fluo-4.
  • the NCX protein used was derived from a mammal, and more particularly from a human.
  • the NCX protein is selected from NCX1, NCX2, NCX3, NCX4, NCX5, NCX6 and / or NCX7, in particular NCX1, NCX2 and / or NCX3.
  • the invention further relates to the use of a kit of parts as previously mentioned for testing a compound for activity as an agonist or antagonist of NCX.
  • the invention relates to the use of a kit of parts as previously mentioned for the diagnosis of a disease associated with NCX-altered expression.
  • assay refers to a method of measuring a property of a system or object Assay is an abbreviation commonly used for biological assay and is a type of in vitro experiment Assays are usually used to measure the effects of a substance on a living organism Assays can be qualitative or quantitative and are essential in the development of new drugs.
  • the subject assay provides a broad dynamic range so that the activity of an NCX protein can be determined.
  • the present invention provides a rapid, effective assay for the screening and profiling of pharmaceutically active compounds that specifically interact with and modulate the activity of an NCX protein.
  • NCX protein or "NCX” is intended, in the context of the present invention, to stand for one of the list of the following Na + / Ca 2+ exchange proteins either alone or in combination: NCX1, NCX2, NCX3, NCX4, NCX5, NCX6, NCX7. Particularly preferred are NCX1, NCX2 and / or NCX3, whose amino acid sequences are each SEQ. ID. NO. 1, SEQ. ID. NO. 2 and SEQ. ID. NO. 3 correspond.
  • NCX protein could be derived from any vertebrate, and particularly mammalian species (e.g., dog, horse, bovine, mouse, rat, chicken, anthropoid, human or others).
  • the NCX could be isolated from tissue samples of such vertebrate organisms, or prepared using recombinant biological material capable of expressing the NCX protein.
  • NCX protein refers to polypeptides, polymorphic variants, mutants and interspecies homologs having an amino acid sequence having an amino acid sequence identity greater than about 80%, 85%, 90%, preferably an amino acid sequence identity of 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or higher, preferably over a region of at least about 25, 50, 100, 200 or 500 or more amino acids encoded by an amino acid sequence Nucleic acid sequence contained in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
  • biological material stands for any material that is genetic Contains information and is able to reproduce itself or be reproduced in a biological system.
  • Recombinant biological material is any biological material that has been produced, altered or modified by recombinant techniques known to those skilled in the art.
  • the following references are examples of cloning certain NCX proteins.
  • the dog Na + / Ca 2+ exchanger NCX1 was prepared by Nicoll, DA. et al. (Science, 250 (4980): 562-5, 1990; Title: Molecular cloning and functional expression of the cardiac sarcolemmal Na (+) - Ca 2+ exchanger).
  • the human Na + / Ca 2+ exchanger NCX1 was prepared by Komuro, I., et al. (Proc. Natl Acad., USA 89 (10), 4769-4773, 1992, Title: Molecular cloning and characterization of the human cardiac Na + / Ca 2+ exchanger cDNA) and by Kofuji, P. et al. (Am. J.
  • the human Na + / Ca 2+ exchanger NCX2 was prepared by Li, Z. et al. (J Biol Chem 269 (26): 17434- 9, 1994 Title:... Cloning of the NCX2 isoform of the plasma membrane (Na (+) - Ca2 + exchanger) cloned the rat Na7Ca 2+ exchanger NCX3 was by Nicoll, DA, et al., (J. Biol. Chem.
  • polypeptide peptide
  • protein protein
  • amino acid polymers in which one or more amino acid residues is an artificial chemical mimic of a corresponding naturally occurring amino acid, as well as naturally occurring amino acid polymers and non-naturally occurring amino acid polymers.
  • NCX protein activity refers to the mechanism of removing intracellular Ca 2+ from a cell, in the heart it extrudes Ca 2+ , which has entered through Ca 2+ channels to initiate contraction, while Na + into the Its relevance in cardiovascular diseases is exemplified in Hobai, JA &O'Rourke, B (2004) Expert Opinion Investig Drugs, 13, 653-664.Therefore, the pharmaceutical industry has developed compounds that inhibit the NCX, as described, for example, in Iwamoto, T. et al., (2004) J. Biol.
  • the Na7 Ca 2+ exchanger electrostatically transports three to four Na + for each Ca 2+ , which moves in the opposite direction, as shown, for example, by electrophysiological means in Hinata, M. et al. (2002) J. Physiol. 545, 453-461.
  • the NCX is able to maintain the cytoplasmic Ca 2+ concentration ([Ca 2+ ] one) three to four orders of magnitude below the extracellular Ca 2+ concentration ([Ca 2+ ] off). Nonetheless, the direction of net Ca 2+ transport is dependent on the electrochemical gradient of Na + .
  • NCX protein is determined by measuring the enhanced luminescence resulting from a suitable colored substance that complexes with calcium.
  • NCX refers to cells that endogenously express the exchanger of interest, or recombinant cells.
  • recombinant when used with reference, for example, to a cell or nucleic acid, protein or vector, indicates that the cell, nucleic acid, protein or vector is introduced by the introduction of a heterologous nucleic acid or protein or vector
  • recombinant cells express genes that are not found in the native (non-recombinant) form of the cell, or they express native genes which are otherwise abnormally expressed, under-expressed or not expressed at all In the present invention, this normally refers to cells transfected with nucleic acid sequences encoding NCX proteins
  • the assay is accomplished simply by growing the cells in a suitable container carried out with a suitable culture medium be as long as the cell is able to be maintained during the assay and to grow in a culture medium desirably.
  • Suitable cells for generating the subject assay include prokaryotes, yeast or higher eukaryotic cells, especially mammalian cells.
  • Prokaryotes include Gram-negative and Gram-positive organisms.
  • the cells are usually mammalian cells, such as human cells, mouse cells, rat cells, Chinese hamster cells, etc.
  • Cells which have been found to be useful include CHO, COS7, JURKAT, HeLa, HEKs, MDCK and HEK293 cells , Cells can be prepared by known methods (Current protocols in cell biology, John Wiley & Sons Inc., ISBN: 0471241059) or may be purchased (Invitrogen Corp., Sigma-Aldrich Corp., Stratagene).
  • the term "colored substance” refers to a calcium-sensitive fluorescent dye
  • the dye precursor is characterized by being non-luminescent under the conditions of the assay, but is an ester capable of entering the cells and which hydrolyzes intracellularly into the luminescent oxy-compound, providing luminescence enhanced upon complex formation with calcium
  • the esters are selected to be susceptible to hydrolysis by intracellular hydrolases
  • capable of entering the cells is meant in that the precursors are capable of traversing the cellular membrane and being hydrolyzed in the cells; the dye precursor enters the cell under specific conditions of pH, temperature, etc., enters the cell at different rates, or does not enter the cell under specific conditions.
  • the colored substance is added to the cells by known protocols (Current protocols in cell biology, John Wiley & Sons Inc., ISBN: 0471241059).
  • the use of a colored substance is conventional, and commercial reagents (Invitrogen Corp.) as well as laboratory synthesized reagents can be used.
  • Fluorescent dyes for monitoring Ca 2+ are known and described in detail in Section 20.1-20.4 of the Molecular Probes, 9th Edition catalog. They usually have two bis-carboxymethylamino groups attached to a fluorescent nucleus such as fluorescein, rhodamine, coumarin, aminophenylindole and others. For the most part, the compounds are 3,6-dioxy-substituted xanthenes, the oxy groups being substituted in the precursor and unsubstituted in the luminescent dye. Usually there are acetoxymethyl groups which protect the phenols and acids. See, for example, Fluo3 / 4, Fura2 / 3, Calcein Green, etc. Hydrolysis of the acetyl groups results in the luminescent product. The precursors are capable of traversing the cellular membrane and being hydrolyzed in the cell.
  • luminescence refers to a "cold light", light from other sources of energy, which can occur at normal and lower temperatures.
  • an energy source displaces an electron of an atom from its "ground” (low energy) status to an "excited” (higher energy) status; then The electron gives back the energy in the form of light so that it can return to its "ground” state
  • luminescence There are several varieties of luminescence, each named after what the energy source is or what triggers the luminescence.
  • fluorescence refers to a luminescence that is found primarily as an optical phenomenon in cold bodies where the molecular absorption of one photon causes the emission of another photon with a longer wavelength
  • the energy difference between the absorbed and emitted photons ends up as molecular vibrations
  • the absorbed photon is in the ultraviolet range and the emitted light is in the visible range, but this is dependent on the absorbance curve and Stokes shift of the particular fluorophore Fluorescence is named for the mineral fluorite, composed of calcium fluoride, which is common this phenomenon shows.
  • Fluorescence from the indicator dyes can be measured with a luminometer or a fluorescence imager.
  • a preferred recognition instrument is the Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR) (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.).
  • FLIPR Fluorometric Imaging Plate Reader
  • the FLIPR is well suited for high throughput screening using the methods of the present invention, as it provides integrated liquid handling capable of pipetting simultaneously into 96 or 384 wells of a microtiter plate, and rapid kinetic recognition using an argon Includes laser coupled to a charge coupled circuit imaging camera.
  • aequorin system uses the protein apoaequorin, which binds to the lipophilic chromophore coelenterazine, thereby forming a combination of apoaequorin and coelenterazine, known as aequorin.
  • Apoaequorin has three calcium binding sites, and in calcium binding the apoaequorin moiety of aequorin changes its conformation. This change in conformation causes the coelenterazine to oxidize to coelenteramide, CO2, and a photon of blue light (466 nm). This photon can be detected with proper instrumentation.
  • Polypeptide sequences are used to refer to the activating, inhibiting or modulating molecules that are identified by the cell-based assays of NCX polynucleotide and polypeptide sequences.
  • “Inhibitors” are compounds which, for example, bind to NCX proteins, e.g., antagonists, partially or completely block their activity, reduce their activation, prevent or retard, or deactivate, desensitize, or down regulate their activity or expression.
  • Activators are compounds that increase, open, activate, facilitate, or enhance the activation of NCX protein activity and sensitize, agonize, or upregulate NCX protein activity.
  • a preferred NCX activator is ionomycin, an ionophore derived from Streptomyces conglobatus comes.
  • Inhibitors, activators or modulators also include genetically modified
  • NCX proteins e.g. Versions with altered activity as well as naturally occurring and synthetic ligands, antagonists, agonists, peptides, cyclic
  • compound or “test compound” or “test candidate” or grammatical equivalents thereof describes any molecule, either naturally occurring or synthetic, eg, protein, oligopeptide, small organic molecule, polysaccharide, lipid, fatty acid, polynucleotide, oligonucleotide, etc.
  • test compound for testing the capacity to modulate NCX activity (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., ISBN: 0471250961)
  • the test compound may be in the form of a library of test compounds, such as a combinatorial or randomized library, which has a sufficient Diverse range (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., ISBN: 0471250937)
  • Test compounds are optionally linked to a fusion partner, eg, targeting compounds, rescue compounds, dimerization compounds, stabilizing compounds, addressable compounds, and other functional components new chemical moieties having useful properties are generated by identifying a test compound (called a "lead compound") having a desirable property or activity, eg, enhancing activity, generating variants of the lead compound, and evaluating the property and activity of these variant compounds.
  • Preferred high throughput (HTS) screening methods for such analyzes used.
  • the inhibitor, activator and test compound may be added to the cells by injection into the culture medium after the cells have grown or may be present in the culture medium prior to cell growth (Current Protocols in cell biology, John Wiley & Sons Inc., ISBN: 0471241059).
  • the cells may be grown on the inhibitor, activator and / or test compound to an appropriate number or may be applied thereto and used without further growth.
  • the cells may be attached to the inhibitor, activator and / or test compound, or, in embodiments where the cells are positioned or grown in wells, the cells may be suspension cells suspended in the fluid in the wells.
  • control experiment refers to different types of experiments that should be performed together and those skilled in the art will recognize that it is generally advantageous to perform controls in conjunction with the methods described herein.
  • control cells One possibility for such control cells would be the use of non-recombinant parental cells, with the cells of the actual experiment expressing the NCX protein of interest. Further controls for the assay for determining the activity of NCX protein in response to the addition of a compound would be to perform the assay without adding the test compound (low control) and performing the assay with a high concentration of the test compound (high control).
  • Other types of Controls include taking compounds identified by the assay of the present invention as agonists or antagonists of NCX proteins of interest, and assaying these compounds with the methods of the prior art to confirm that these compounds are also agonists or antagonists when tested with these prior art methods.
  • agonist and antagonist refer to receptor-effector molecules that modulate signal transduction via a receptor.
  • Receptor-effector molecules are capable of binding to the receptor, but not necessarily to the binding site of the natural ligand.
  • Receptor-effectors can modulate signal transduction when used alone, i. they may be replacement ligands, or they may alter signal transduction in the presence of the natural ligand, either to enhance or inhibit signaling by the natural ligand.
  • antagonists are molecules that block or reduce the signal transduction activity of the receptor, e.g., they can competitively, non-competitively, and / or allosterically inhibit signal transduction from the receptor, whereas "agonists” potentiate, induce, or otherwise enhance the signal transduction activity of a receptor.
  • NCX altered expression refers to dilated cardiomyopathy, coronary heart disease, arrhythmia, heart failure, etc.
  • the colored substance and other components of the assay may be provided in sets, which colored substance may be present as a reconstitutable powder or as a chilled solution on ice, in a buffer.
  • the kit may also contain the buffer, activator, inhibitor, test compound, cells expressing NCX protein, etc. Cells can be present as lyophilized cells.
  • the kit of parts may be used as a diagnostic kit for diagnosing dilated cardiomyopathy, coronary heart disease, arrhythmia, heart failure, etc.
  • the following figures and examples describe the invention in more detail by describing the typical results of the fluorescence-based cellular NCX assay without limiting the scope of protection.
  • the dye application buffer is removed by washing three times with 100 ⁇ l of assay buffer.
  • the buffer is disposed of.
  • connection plates 80 ⁇ l from the connection plates are added and the plates are kept at 16 ° C. for 30 min.
  • Plates are transferred to the FLIPR and assayed using the following protocol (including 40 ⁇ l addition from the ionophore plate):
  • the high control agent is derived from the average difference of eight paired samples of 10 or 30 ⁇ M A000135933 with ionomycin.
  • the lower control agent is derived from the ionomycin controls. Compounds that increase basal fluorescence more than 1.3 times are discarded.
  • the typical fluorescence response of the high and low controls upon addition of 2 ⁇ M ionomycin is shown in Figure 2 and is as follows:
  • the NCX1 is active (low control)
  • calcium entering the cell after ionomycin addition is removed from the cell transported. After a few seconds, the initial calcium loading of the cells is restored.
  • the inhibition of NCX1 leads to a fluorescence increase after ionomycin addition due to an increase in cytosolic calcium (high control, 30 ⁇ M A000135933).
  • the new NCX1 inhibitor A000135933 was found in the first HTS screen.
  • Figures 3, 4 and 5 show a typical dose-dependent response to different concentrations of A000135933.
  • A000135933 was a good NCX1 inhibitor with a mean IC 50 of 5.9 ⁇ M and since then has been used as a tool substance in the assays.
  • An IC 50 of this compound is added to each plate as a control.
  • the S / B ratio and the z ' value for this example were very good.
  • the IC 50 of A000135933 used these parameters to indicate good assay performance for each plate:
  • IC 5O of tool joint A000135933 must be around the mean of 5.9 ⁇ M.
  • the inhibition measured with SURFE 2 R was higher (mean 14%), except for one compound, than the inhibition derived from the indirect FLIPR assay.
  • FIG. 1 is a diagrammatic representation of FIG. 1:
  • Figure 1a shows the polynucleotide sequence of NCX1 represented by SEQ. ID. NO. 1.
  • Figure 1b shows the polynucleotide sequence of NCX2 represented by SEQ. ID. NO. 2.
  • Figure 1c shows the polynucleotide sequence of NCX3 represented by SEQ. ID. NO. Third
  • FIG. 2 is a diagrammatic representation of FIG. 1
  • FIG. 3 is a diagrammatic representation of FIG. 3
  • FIG. 4 is a diagrammatic representation of FIG. 4
  • Assay statistics for a 96-well plate with high and low controls and different concentrations of A000135933 The calculated signal-to-background ratio (S / B), z ' and the increase in fluorescence between 50 and 90 seconds of different concentrations of A000135933 are listed (see also Figure 2).
  • the calculated IC 50 of A000135933 was 7.16 ⁇ M (mean IC 50 : 5.9 ⁇ M).
  • FIG. 5 is a diagrammatic representation of FIG. 5
  • FIG. 6 is a diagrammatic representation of FIG. 6
  • FIG. 6 shows the raw data printout from the FLIPR.
  • FIG. 7 is a diagrammatic representation of FIG. 7
  • NCX1 fluorescence-based FLIPR assay Correlation between the NCX1 fluorescence-based FLIPR assay and the electrophysiology-based SURFE 2 R technology of a class of compounds.
  • the inhibition of NCX1 was measured in both cases at 10 ⁇ M.

Landscapes

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Abstract

Transporteure sind eine aufstrebende Zielfamilie mit enormem Potential, welche wissenschaftliche und wirtschaftliche Möglichkeiten bieten. Der Natrium/Calcium- Austauscher ist ein wichtiger Mechanismus für das Entfernen von Ca2+ aus diversen Zellen. Im Herz extrudiert er Ca2+, welches durch Ca2+-Kanäle zum Initiieren von Kontraktion eingetreten ist, während Na+ in die Herzzelle eintritt. Es ist von erheblichem Interesse, Verbindungen zu identifizieren, welche die Aktivität des Natrium-Calcium-Austauschers modulieren. Die vorliegende Erfindung ist ausgerichtet auf ein Fluoreszenz-basiertes Assay für das Erkennen von Verbindungen zum Modulieren des NCX im „Vorwärtsmodus'. Sie betrifft ferner einen Teilesatz umfassend Zellen, welche NCX exprimieren, und die Verwendung des Teilesatzes zum Testen einer Verbindung auf die Aktivität als ein Agonist oder Antagonist von NCX.

Description

BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG
Fluoreszenz-basiertes Assay zum Erkennen von Verbindungen zum Modulieren des Natrium-Calcium-Austauschers (NCX) im „Vorwärtsmodus"
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Natrium-Calcium-Austauscher (NCX) und Verfahren zum Bestimmen ihrer Aktivität. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Fluoreszenzbasiertes Assay zum Erkennen von Verbindungen zum Modulieren des NCX im „Vorwärtsmodus". Sie betrifft ferner einen Teilesatz, welcher Zellen umfasst, die NCX exprimieren, und die Verwendung des Teilesatzes.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Eine Grundvoraussetzung für das Leben ist die Kompartimentierung - wobei biologische Membranen das Werkzeug der Natur sind, um dieses Prinzip umzusetzen. Jedoch ist eine Lipiddoppelschicht - die Struktur, welche der Zellmembran unterliegt - für die meisten Ionen und Verbindungen undurchlässig, deren Transport essentiell für das Beibehalten der Vitalfunktionen in Zellen und Organismen ist. Die Antwort auf dieses Paradoxon liegt in der semipermeablen Natur der Zellmembran - gelöste Stoffe, welche die Membran durchqueren müssen, werden durch spezifische Membranproteine transportiert. Diese Transporteure sind verantwortlich für die Erzeugung und Aufrechterhaltung von lonengradienten, die Aufnahme von Nährstoffen, den Transport von Metaboliten, die Wiederaufnahme von Signalgebungsmolekülen und die Entsorgung von Gift- und Abfallverbindungen. Daher sind Transporteure potentielle Arzneimittelziele, welche direkten Einfluss auf erkrankungsbezogene Anomalitäten in diesem Kontext zulassen.
Der Natrium/Calcium-Austauscher ist ein wichtiger Mechanismus für das Entfernen von Ca2+ aus diversen Zellen. Im Herz extrudiert er Ca2+, welches durch Ca2+-Kanäle zum Initiieren von Kontraktion eingetreten ist, während Na+ in die Herzzelle eintritt. Seine Relevanz bei kardiovaskulären Erkrankungen ist z.B. veranschaulicht in Hobai, JA & O'Rourke, B (2004) Expert Opin. Investig. Drugs, 13, 653-664. Daher hat die pharmazeutische Industrie Verbindungen entwickelt, welche den NCX hemmen, wie z.B. beschrieben in Iwamoto, T. et al. (2004) J. Biol. Chem., 279, 7544-7553. Der Na+/ Ca2+-Austauscher transportiert elektrogenisch drei bis vier Na+ für jedes Ca2+, welches sich in die entgegengesetzte Richtung bewegt, wie z.B. gezeigt durch elektrophysiologische Mittel in Hinata, M. et al. (2002) J. Physiol. 545, 453-461. Der NCX ist in der Lage, die Zytoplasma-Ca2+-Konzentration ([Ca2+] ein) drei bis vier Größenordnungen unter der extrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+] aus) aufrechtzuerhalten. Nichtsdestotrotz ist die Richtung des Netto-Ca2+-Transports abhängig vom elektrochemischen Gradienten des Na+. Simultane und konsekutive Transportmodelle wurden für Na+- und Ca2+-Translokationen vorgeschlagen, und eine Menge an Belegen spricht für Letztgenannte.
Transporteure sind eine aufstrebende Zielfamilie mit enormem Potential, die wissenschaftliche und wirtschaftliche Möglichkeiten bieten. Andererseits sind Transporteure eine schwierige Zielklasse im Hinblick auf Arzneimittel- Entdeckungstechnologien.
Es ist von erheblichem Interesse, Verbindungen zu identifizieren, welche Kanalaktivität modulieren, zum Beispiel durch das Blockieren des Calciumflusses und/oder das Hemmen der Aktivierung von Calciumkanälen. Ein Standardverfahren, dies zu erreichen, ist die Verwendung von Patch-Clamp-Experimenten. Bei diesen Experimenten müssen Zellen einzeln und in Sequenz durch hochgeschulte Bediener bewertet werden, durch Messung des Calciumstromes durch die Zellmembran hindurch als Reaktion auf Veränderungen des Membranpotentials und/oder die Anwendung von Testverbindungen. Die Wirkung von SeaO4OO, einem neuen spezifischen Inhibitor von NCX, auf das Wirkpotential im Hunde- Ventrikelpapillarmuskel wurde untersucht und offenbart durch K. Acsai während des „ESC Congress 2004" in München auf Poster Nr. 2886 (Titel: Effect of a specific sodium-calcium exchanger blocker SeaO4OO on the ventricular action potential and triggered activity in dog ventricular muscle and Purkinje fiber) und durch C. Lee et al. (The Journal of pharmacology and experimental therapeutics; Vol. 311 : 748-757, 2004; Titel: Inhibitory profile of SEA0400 [2-[4-[(2,5-Difluorophenyl)methoxy]phenoxy]-5- ethoxyaniline] assessed on the cardiac Na+/Ca2+ exchanger, NCX1.1 ). Unter Verwendung einer lonenselektiv-Elektrodentechnik zum Quantifizieren von lonenflüssen in Riesenpatches wurde gezeigt, dass der kardiale Na+/Ca2+-Austauscher mehrere Transportmodi aufweist (Tong Mook Kang & Donald W. Hilgemann; Nature; Vol. 427, 5. Februar 2004; Titel: Multiple transport modes of the cardiac NaVCa2+ exchanger). Diese Experimente sind, während sie gültig und informativ sind, sehr zeitaufwändig und nicht für Assays mit hohem Durchsatz für Verbindungen anpassbar, welche die Calciumionenkanal-Aktivität modulieren.
Es wurden verschiedene Techniken als Alternativen zu Standardverfahren der Elektrophysiologe entwickelt. Zum Beispiel wurden radioaktive Fluss-Assays verwendet, bei denen Zellen mit einem radioaktiven Tracer (z.B. 45Ca) versehen werden, und der Fluss des radioaktiv markierten Ca wird überwacht. Zellen beladen mit dem Tracer werden Verbindungen ausgesetzt, und diese Verbindungen, welche den Ausfluss des Tracers entweder verstärken oder verringern, werden als mögliche Aktivatoren oder Hemmer von lonenkanälen in den Zellmembranen identifiziert. Ein spezifisches Beispiel ist eingeschlossen in T. Kuramochi et al.; Bioorganic & Medical Chemistry; 12 (2004) 5039-5056; Titel: Synthesis and structure-activity relationships of phenoxypyridine derivates as novel inhibitors of the sodium-calcium exchanger. EP 1 031 556 offenbart ein Verfahren, bei dem die Na+/Ca2+-Austauscheraktivität mit Hilfe von Sarkolemmvesikeln gemessen wird, wobei die Konzentration der Ca2+-Aufnahme in den Sarkolemmvesikeln durch Messung der 45Ca-Radioaktivität bestimmt wird.
Viele radioaktive lonentransporteur-Assays weisen eingeschränkte Empfindlichkeit und daher unzureichende Datenqualität auf. Außerdem sind die Kosten und Sicherheitsfragen in Zusammenhang mit der radioaktiven Screening-Technologie Hürden, welche eine breitere Anwendung verhindern.
Unter den obengenannten Arzneimittel-Entdeckungstechnologien ist die Verwendung von radioaktiven Fluss-Assays zum Identifizieren von Verbindungen, welche die Aktivität von lonenkanälen und lonentransporteuren modulieren, der nächste Stand der Technik zur vorliegenden Erfindung, da es sich hierbei um eine Technik handelt, bei der eine Testverbindung durch Überwachung des Flusses von Ca2+ aus den Zellen als möglicher Aktivator oder Hemmer identifiziert werden kann. Das Hauptproblem für die radioaktiven Assays basiert auf der Schwierigkeit der Erkennung des eingeschränkten Umsatzes von lonentransporteuren von etwa 1 bis 1.000 Molekülen pro Sekunde - etwa 104 Mal weniger als die meisten lonenkanäle.
Das Problem, welches sich aus dem Stand der Technik ergibt, ist daher das Identifizieren eines robusten Assays mit einer sehr guten Empfindlichkeit und Brauchbarkeit für das Screening mit hohem Durchsatz und das Profiling von NCX- Modulatoren. Die Lösung dieses Problems wird durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt. KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Assay für das Bestimmen der Aktivität von NCX-Protein, wobei: a) Zellen, welche NCX exprimieren, bereitgestellt werden; b) eine farbige Substanz zum Bestimmen des intrazellulären Calciums bereitgestellt wird; c) Zellen mit einem NCX-Aktivitätsaktivator in Kontakt gebracht werden; und d) die durch Calcium vermittelte Veränderung in dem Lumineszenzsignal von der farbigen Substanz verglichen wird mit einem Lumineszenzsignal erzeugt bei einem Kontrollexperiment.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Assay für das Bestimmen der Aktivität von NCX-Protein als Reaktion auf die Zugabe einer Verbindung, wobei: a) Zellen, welche NCX exprimieren, bereitgestellt werden; b) eine farbige Substanz zum Bestimmen des intrazellulären Calciums bereitgestellt wird; c) Zellen mit einer Verbindung in Kontakt gebracht werden, wobei die Zellen vor der Behandlung mit der Verbindung mit einem NCX-Aktivitätsaktivator behandelt wurden; und d) die durch Calcium vermittelte Veränderung in dem Lumineszenzsignal von der farbigen Substanz verglichen wird mit einem Lumineszenzsignal erzeugt bei einem Kontrollexperiment.
Im Allgemeinen stammte das verwendete NCX-Protein von einem Säugetier, und insbesondere von einem Menschen. Das NCX-Protein ist ausgewählt aus NCX1 , NCX2, NCX3, NCX4, NCX5, NCX6 und/oder NCX7, insbesondere NCX1 , NCX2 und/oder NCX3.
Im Allgemeinen können die bei dem Assay der vorliegenden Erfindung verwendeten Zellen von jedem eukaryotischen Organismus abgeleitet sein.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Zellen Säugetierzellen. Bei einer bevorzugteren Ausführungsform sind die Zellen CHO (CCL-61 ), HEK (CCL-1573), COS7 (CRL-1651 ) und/oder JURKAT (CRL-1990) -Zellen. Insbesondere ist der beim Assay der vorliegenden Erfindung verwendete NCX- Aktivitätsaktivator lonomycin.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die farbige Substanz als ein Farbstoffvorläufer zu den Zellen zugegeben, welcher in der Lage ist, in die Zellen einzutreten und zu einem Farbstoff hydrolysiert zu werden, wodurch der Farbstoff in den Zellen einen Komplex mit Calcium bildet und ein Lumineszenzsignal bereitstellt. Ferner kann der Farbstoffvorläufer bevorzugt ein Acetoxymethylester-Derivat sein und der Farbstoff kann bevorzugt der Calcium-empfindliche Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 sein. Bei einer bevorzugteren Ausführungsform ist das Lumineszenzsignal Fluoreszenz und der Überwachungsschritt c) verwendet ein FLIPR-Gerät.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Assays wie zuvor erwähnt zum Testen einer Verbindung auf die Aktivität als ein Agonist oder Antagonist von NCX. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines Assays wie zuvor erwähnt für die Diagnose einer Erkrankung in Zusammenhang mit einer NCX-veränderten Expression.
Die Erfindung betrifft ferner einen Teilesatz, welcher Folgendes umfasst: a) lyophilisierte Zellen, welche NCX-Protein exprimieren; b) eine farbige Substanz; c) einen Verbindungspuffer; und d) einen farbigen Substanzpuffer.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Teilesatzes der vorliegenden Erfindung ist die farbige Substanz der Calcium-empfindliche Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammte das verwendete NCX-Protein von einem Säugetier, und insbesondere von einem Menschen. Das NCX-Protein ist ausgewählt aus NCX1 , NCX2, NCX3, NCX4, NCX5, NCX6 und/oder NCX7, insbesondere NCX1 , NCX2 und/oder NCX3.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Teilesatzes wie zuvor erwähnt zum Testen einer Verbindung auf die Aktivität als ein Agonist oder Antagonist von NCX. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung eines Teilesatzes wie zuvor erwähnt für die Diagnose einer Erkrankung in Zusammenhang mit einer NCX-veränderten Expression. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Begriff „Assay" betrifft ein Verfahren, bei dem eine Eigenschaft eines Systems oder Objektes gemessen wird. Assay ist eine Abkürzung üblicherweise verwendet für biologisches Assay und ist eine Art in vitro Experiment. Assays werden normalerweise zum Messen der Auswirkungen einer Substanz auf einen lebenden Organismus durchgeführt. Assays können qualitativ oder quantitativ sein und sie sind essentiell bei der Entwicklung neuer Arzneimittel.
Das gegenständliche Assay stellt einen breiten dynamischen Bereich bereit, so dass die Aktivität eines NCX-Proteins bestimmt werden kann. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein schnelles, effektives Assay für das Screening und Profiling pharmazeutisch wirksamer Verbindungen bereit, welche spezifisch mit der Aktivität eines NCX-Proteins interagieren und diese modulieren.
Der Begriff „NCX-Protein" oder „NCX" soll im Kontext der vorliegenden Erfindung für eines aus der Liste der folgenden Na+/Ca2+-Austauscherproteine entweder allein oder in Kombination miteinander stehen: NCX1 , NCX2, NCX3, NCX4, NCX5, NCX6, NCX7. Besonders bevorzugt sind NCX1 , NCX2 und/oder NCX3, deren Aminosäuresequenzen jeweils SEQ. ID. NR. 1 , SEQ. ID. NR. 2 und SEQ. ID. NR. 3 entsprechen.
Ein solches NCX-Protein könnte abgeleitet sein von irgendeinem Wirbeltier und insbesondere Säugetierspezies (z.B. Hund, Pferd, Rind, Maus, Ratte, Huhn, Anthropoid, Mensch oder andere). Der NCX könnte aus Gewebeproben solcher Wirbeltierorganismen isoliert sein oder mit Hilfe von rekombinantem biologischem Material hergestellt werden, welches in der Lage ist, das NCX-Protein zu exprimieren.
Der Begriff „NCX-Protein" betrifft Polypeptide, polymorphe Varianten, Mutanten und Interspezies-Homologa, welche eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche eine Aminosäuresequenzidentität, die größer ist als etwa 80 %, 85 %, 90 %, bevorzugt eine Aminosäuresequenzidentität von 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % oder höher, bevorzugt über eine Region von mindestens etwa 25, 50, 100, 200 oder 500 oder mehr Aminosäuren zu einer Aminosäuresequenz codiert durch die Nukleinsäuresequenz enthalten in SEQ. ID. NR. 1 , SEQ, ID. NR. 2 und SEQ. ID. NR. 3 aufweist.
Der Begriff „biologisches Material" steht für jedes Material, welches genetische Informationen enthält und in der Lage ist, sich selbst zu reproduzieren oder in einem biologischen System reproduziert zu werden. Rekombinantes biologisches Material ist jedes biologische Material, das mit Hilfe rekombinanter Techniken, die einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, hergestellt, verändert oder modifiziert wurde.
Die folgenden Referenzen sind Beispiele des Klonens bestimmter NCX-Proteine. Der Hunde-Na+/Ca2+-Austauscher NCX1 wurde durch Nicoll, DA. et al. (Science, 250 (4980): 562-5, 1990; Titel: Molecular cloning and functional expression of the cardiac sarcolemmal Na(+)-Ca2+ exchanger) geklont. Der menschliche Na+/Ca2+-Austauscher NCX1 wurde durch Komuro, I., et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (10), 4769-4773, 1992; Titel: Molecular cloning and characterization of the human cardiac Na+/Ca2+ exchanger cDNA) und durch Kofuji, P. et al. (Am. J. Physiol. 263 (Cell Physiol. 32): C1241-C1249, 1992; Titel: Expression of the Na-Ca exchanger in diverse tissues: a study using the cloned human cardiac Na-Ca exchanger) geklont. Der menschliche Na+/Ca2+-Austauscher NCX2 wurde durch Li, Z. et al. (J. Biol. Chem. 269(26): 17434- 9, 1994; Titel: Cloning of the NCX2 isoform of the plasma membrane (Na(+)-Ca2+ exchanger) geklont. Der Ratten-Na7Ca2+-Austauscher NCX3 wurde durch Nicoll, DA. et al. (J. Biol. Chem. 271 (40): 24914-21 , 1996; Titel: Cloning of a third mammalian Na7Ca2+ exchanger, NCX3) geklont. Der menschliche Na+/Ca2+-Austauscher NCX3 wurde durch Gabellini, N. et al. (Gene, 298: 1-7, 2002; Titel: The human SLC8A3 gene and the tissue-speeifie Na+/Ca2+ exchanger 3 isoforms) geklont.
Die Begriffe „Polypeptid", „Peptid" und „Protein" werden hierin austauschbar verwendet zur Bezugnahme auf ein Polymer von Aminosäureresten.
Die Begriffe gelten für Aminosäurepolymere, in denen ein oder mehr Aminosäurereste ein künstlicher chemischer Nachahmer einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure ist, sowie für natürlich vorkommende Aminosäurepolymere und nicht natürlich vorkommende Aminosäurepolymere.
Der Begriff „Aktivität von NCX-Protein" betrifft den Mechanismus des Entfernens von intrazellulärem Ca2+ aus einer Zelle. Im Herz extrudiert er Ca2+, welches durch Ca2+- Kanäle zum Initiieren von Kontraktion eingetreten ist, während Na+ in die Herzzelle eintritt. Seine Relevanz bei kardiovaskulären Erkrankungen ist z.B. veranschaulicht in Hobai, JA & O'Rourke, B (2004) Expert Opin. Investig. Drugs, 13, 653-664. Daher hat die pharmazeutische Industrie Verbindungen entwickelt, welche den NCX hemmen, wie z.B. beschrieben in Iwamoto, T. et al. (2004) J. Biol. Chem., 279, 7544-7553. Der Na7 Ca2+-Austauscher transportiert elektrogenisch drei bis vier Na+ für jedes Ca2+, welches sich in die entgegengesetzte Richtung bewegt, wie z.B. gezeigt durch elektrophysiologische Mittel in Hinata, M. et al. (2002) J. Physiol. 545, 453-461. Der NCX ist in der Lage, die Zytoplasma-Ca2+-Konzentration ([Ca2+] ein) drei bis vier Größenordnungen unter der extrazellulären Ca2+-Konzentration ([Ca2+] aus) aufrechtzuerhalten. Nichtsdestotrotz ist die Richtung des Netto-Ca2+-Transports abhängig vom elektrochemischen Gradienten des Na+. Simultane und konsekutive Transportmodelle wurden für Na+- und Ca2+-Translokationen vorgeschlagen, und eine Menge an Belegen spricht für Letztgenannte. Die Aktivität von NCX-Protein wird bestimmt durch die Messung der verstärkten Lumineszenz, welche aus einer geeigneten farbigen Substanz, die mit Calcium einen Komplex bildet, resultiert.
Der Begriff „Zellen, welche NCX exprimieren" betrifft Zellen, welche den Austauscher von Interesse endogen exprimieren oder rekombinante Zellen.
Der Begriff „rekombinant", wenn er unter Bezugnahme z.B. auf eine Zelle oder Nukleinsäure, ein Protein oder einen Vektor verwendet wird, gibt an, dass die Zelle, Nukleinsäure, das Protein oder der Vektor durch das Einführen einer/s heterologen Nukleinsäure oder Proteins oder die Veränderung einer/s nativen Nukleinsäure oder Proteins modifiziert wurde, oder dass die Zelle abgeleitet ist von einer so modifizierten Zelle. So exprimieren rekombinante Zellen zum Beispiel Gene, welche sich nicht in der nativen (nicht-rekombinanten) Form der Zelle finden, oder sie exprimieren native Gene, welche sonst anomal exprimiert, unterexprimiert oder überhaupt nicht exprimiert werden. In der vorliegenden Erfindung betrifft dies normalerweise Zellen, welche mit Nukleinsäuresequenzen transfiziert wurden, die NCX-Proteine codieren. Das Assay wird einfach durch das Züchten der Zellen in einem geeigneten Behälter mit einem geeigneten Kulturmedium durchgeführt. Die Zelle kann eine natürlich vorkommende Zelle, eine native Zelle, eine etablierte Zelllinie, eine handelsübliche Zelle, eine genetisch modifizierte Zelle usw. sein, solange die Zelle in der Lage ist, während des Assays aufrechterhalten zu werden und in einem Kulturmedium wünschenswert zu wachsen.
Zu geeigneten Zellen für das Erzeugen des gegenständlichen Assays zählen Prokaryoten, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen, besonders Säugetierzellen. Zu Prokaryoten zählen Gram-negative und Gram-positive Organismen. Die Zellen sind normalerweise Säugetierzellen, wie menschliche Zellen, Mauszellen, Rattenzellen, chinesische Hamsterzellen usw. Zu Zellen, welche sich als geeignet erwiesen haben, zählen CHO-, COS7-, JURKAT-, HeLa-, HEKs-, MDCK- und HEK293-Zellen. Zellen lassen sich mit den bekannten Verfahren herstellen (Current protocols in cell biology, John Wiley & Sons Inc., ISBN: 0471241059) oder können erworben werden (Invitrogen Corp., Sigma-Aldrich Corp., Stratagene).
Der Begriff „farbige Substanz" betrifft insbesondere einen Calcium-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff. Der Farbstoffvorläufer ist dadurch gekennzeichnet, dass er unter den Bedingungen des Assays nicht lumineszent ist; jedoch handelt es sich um einen Ester, der in der Lage ist, in die Zellen einzutreten und der intrazellulär zu der lumineszenten Oxyverbindung hydrolysiert, wodurch bei der Komplexbildung mit Calcium verstärkte Lumineszenz bereitgestellt wird. Die Ester werden so ausgewählt, dass sie empfänglich für die Hydrolyse durch intrazelluläre Hydrolasen sind. Der Begriff „in der Lage, in die Zellen einzutreten" steht dafür, dass die Vorläufer in der Lage sind, die zelluläre Membran zu durchqueren und in den Zellen hydrolysiert zu werden; der Farbstoffvorläufer tritt unter spezifischen Bedingungen des pH, der Temperatur usw. in die Zelle ein, tritt mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in die Zelle ein oder tritt unter spezifischen Bedingungen nicht in die Zelle ein. Die farbige Substanz wird mittels der bekannten Protokolle (Current protocols in cell biology, John Wiley & Sons Inc., ISBN: 0471241059) zu den Zellen zugegeben. Die Verwendung einer farbigen Substanz ist konventionell, und es können handelsübliche Reagenzien (Invitrogen Corp.) sowie im Labor synthetisierte Reagenzien verwendet werden.
Eine Reihe handelsüblicher Farbstoffe, welche die obigen Anforderungen erfüllen, sind bekannt. Fluoreszenzfarbstoffe für die Überwachung des Ca2+ sind bekannt und in Abschnitt 20.1-20.4 des Katalogs Molecular Probes, 9. Edition detailliert beschrieben. Sie weisen üblicherweise zwei Bis-carboxymethylaminogruppen angehaftet an einem fluoreszenten Nukleus wie Fluorescin, Rhodamin, Coumarin, Aminophenylindol und andere auf. Größtenteils sind die Verbindungen 3,6-Dioxy-substituierte Xanthene, wobei im Vorläufer die Oxygruppen substituiert sind und im lumineszenten Farbstoff sind sie unsubstituiert. Üblicherweise sind Acetoxymethylgruppen vorhanden, welche die Phenole und Säuren schützen. Siehe zum Beispiel Fluo3/4, Fura2/3, Calceingrün usw. Die Hydrolyse der Acetylgruppen resultiert in dem lumineszenten Produkt. Die Vorläufer sind in der Lage, die zelluläre Membran zu durchqueren und in der Zelle hydrolysiert zu werden.
Der Begriff „Lumineszenz" betrifft ein „kaltes Licht", Licht aus anderen Energiequellen, was bei normalen und niedrigeren Temperaturen stattfinden kann. Bei der Lumineszenz verdrängt eine Energiequelle ein Elektron eines Atoms von seinem „Grund" (Niedrigstenergie) -Status in einen „angeregten" (Höherenergie) Status; dann gibt das Elektron die Energie in Form von Licht zurück, so dass in seinen „Grund"- Zustand zurückkehren kann. Es gibt mehrere Varietäten von Lumineszenz, jede jeweils danach benannt, was die Energiequelle ist oder was der Auslöser für die Lumineszenz ist.
Der Begriff „Fluoreszenz" betrifft eine Lumineszenz, welche sich hauptsächlich als ein optisches Phänomen bei kalten Körpern findet, bei denen die molekulare Absorption eines Photons die Emission eines anderen Photons mit einer längeren Wellenlänge auslöst. Der Energieunterschied zwischen dem absorbierten und emittierten Photon endet als Molekülschwingungen oder Wärme. Üblicherweise liegt das absorbierte Photon im ultravioletten Bereich und das emittierte Licht liegt im sichtbaren Bereich, dies ist jedoch abhängig von der Absorbanzkurve und der Stokes-Verschiebung des bestimmten Fluorophors. Fluoreszenz ist benannt nach dem Mineral Fluorit, zusammengesetzt aus Calciumfluorid, welches häufig dieses Phänomen zeigt.
Fluoreszenz von den Indikatorfarbstoffen kann mit einem Luminometer oder einem Fluoreszenz-Imager gemessen werden. Ein bevorzugtes Erkennungsinstrument ist der Fluorometric Imaging Plate Reader (FLIPR) (Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.). Der FLIPR ist gut geeignet für das Screening mit hohem Durchsatz unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, da er integriertes Flüssigkeitshandling, welches in der Lage ist, gleichzeitig in 96 oder 384 Wells einer Mikrotiterplatte zu pipettieren, und die schnelle kinetische Erkennung unter Verwendung eines Argon- Lasers gekoppelt an eine ladungsgekoppelte Schaltungs-Imagingkamera einschließt.
Eine Alternative zur Verwendung von Calciumindikatorfarbstoffen ist die Verwendung des Aequorinsystems. Das Aequorinsystem verwendet das Protein Apoaequorin, welches an den lipophilen Chromophor Coelenterazin bindet, wodurch eine Kombination aus Apoaequorin und Coelenterazin gebildet wird, die als Aequorin bekannt ist. Apoaequorin weist drei Calciumbindungsstellen auf, und bei der Calciumbindung ändert der Apoaequorinanteil des Aequorins seine Konformation. Diese Veränderung in der Konformation veranlasst, dass das Coelenterazin zu Coelenteramid, CO2 und einem Photon von blauem Licht (466 nm) oxidiert. Dieses Photon kann mit geeigneter Instrumentierung erkannt werden.
Für eine Revision der Verwendung von Aequorin, siehe Creton et al., 1999, Microscopy Research and Technique 46:390-397; Brini et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:9896-9903; Knight & Knight, 1995, Meth. Cell. Biol. 49:201-216. Außerdem von Interesse kann US-Patentschrift Nr. 5,714,666 sein, welches Verfahren der Messung intrazellulären Calciums in Säugetierzellen durch die Zugabe von Coelenterazin-Co- Faktoren zu Säugetierzellen, die Apoaequorin exprimieren, beschreibt.
„Hemmer", „Aktivatoren" und „Modulatoren" von NCX-Polynukleotid- und -
Polypeptidsequenzen werden verwendet, um auf die aktivierenden, hemmenden oder modulierenden Moleküle Bezug zu nehmen, welche mit Hilfe der zeilbasierten Assays von NCX-Polynukleotid- und -Polypeptidsequenzen identifiziert werden.
„Hemmer" sind Verbindungen, welche z.B. an NCX-Proteine, z.B. Antagonisten, binden, deren Aktivität teilweise oder komplett blockieren, ihre Aktivierung verringern, verhindern oder verzögern oder deren Aktivität oder Expression deaktivieren, desensibilisieren oder nach unten regulieren.
„Aktivatoren" sind Verbindungen, welche die Aktivierung der NCX-Proteinaktivität erhöhen, öffnen, aktivieren, vereinfachen oder verstärken und die NCX-Proteinaktivität sensibilisieren, agonisieren oder nach oben regulieren. Ein bevorzugter NCX-Aktivator ist lonomycin, ein lonophor, der von Streptomyces conglobatus stammt.
Zu Hemmern, Aktivatoren oder Modulatoren zählen auch genetisch modifizierte
Versionen von NCX-Proteinen, z.B. Versionen mit veränderter Aktivität sowie natürlich vorkommende und synthetische Liganden, Antagonisten, Agonisten, Peptide, cyclische
Peptide, Nukleinsäuren, Antikörper, Antisense-Moleküle, Ribozyme, kleine organische
Moleküle und ähnliche.
Der Begriff „Verbindung" oder „Testverbindung" oder „Testkandidat" oder grammatische Äquivalente davon beschreibt jedes Molekül, entweder natürlich vorkommend oder synthetisch, z.B. Protein, Oligopeptid, kleines organisches Molekül, Polysaccharid, Lipid, Fettsäure, Polynukleotid, Oligonukleotid usw. zum Testen auf die Kapazität zum Modulieren der NCX-Aktivität (Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Inc., ISBN: 0471250961 ). Die Testverbindung kann in Form einer Bibliothek von Testverbindungen vorliegen, wie eine kombinatorische oder randomi- sierte Bibliothek, welche einen ausreichenden Diversitätsbereich bereitstellt (Current protocols in molecular biology, John Wiley & Sons Inc., ISBN: 0471250937). Testverbindungen sind wahlweise verbunden mit einem Fusionspartner, z.B. Targeting-Verbindungen, Rettungsverbindungen, Dimerisationsverbindungen, Stabilisierungsverbindungen, adressierbare Verbindungen und weitere funktionale Komponenten. Herkömmlich werden neue chemische Einheiten mit nützlichen Eigenschaften durch Identifikation einer Testverbindung (eine „Führungsverbindung" genannt) mit einer wünschenswerten Eigenschaft oder Aktivität erzeugt, z.B. Verstärkung der Aktivität, Erzeugung von Varianten der Führungsverbindung und Auswertung der Eigenschaft und Aktivität dieser Variantenverbindungen. Bevorzugt werden Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz (HTS) für solche Analysen eingesetzt.
Die Hemmer-, Aktivator- und Testverbindung kann durch Injektion in das Kulturmedium zu den Zellen zugegeben werden, nachdem die Zellen gewachsen sind, oder sie können vor dem Zellwachstum in dem Kulturmedium vorliegen (Current protocols in cell biology, John Wiley & Sons Inc., ISBN: 0471241059).
Die Zellen können auf der Hemmer-, Aktivator und/oder Testverbindung auf eine geeignete Zahl gezüchtet werden, oder sie können darauf aufgebracht und ohne weiteres Wachstum verwendet werden. Die Zellen können an die Hemmer-, Aktivator- und/oder Testverbindung angehaftet werden, oder, bei den Ausführungsformen, bei denen die Zellen in Wells positioniert oder gezüchtet werden, können die Zellen Suspensionszellen sein, welche in dem Fluid in den Wells suspendiert sind.
Der Begriff „Kontrollexperiment" betrifft unterschiedliche Arten von Experimenten, die zusammen durchgeführt werden sollten. Der Fachmann wird erkennen, dass es im Allgemeinen von Vorteil ist, Kontrollen zusammen mit den hierin beschriebenen Verfahren durchzuführen.
Zum Beispiel ist es üblicherweise hilfreich, eine Kontrolle für das Assay für die Bestimmung der Aktivität von NCX-Protein zu haben, bei der die Zellen bevorzugt im Wesentlichen identisch mit den Zellen sind, die in dem Assay verwendet werden, außer dass diese Zellen das NCX-Protein von Interesse nicht exprimieren würden. Außerdem ist es üblicherweise hilfreich, eine Kontrolle für das Assay für die Bestimmung der Aktivität von NCX-Protein als Reaktion auf die Zugabe einer Verbindung zu haben, bei der die Verbindungen in dem Assay der Erfindung gegen Zellen getestet werden, die bevorzugt im Wesentlichen identisch mit den Zellen sind, die in dem Assay verwendet werden, außer dass diese Zellen das NCX-Protein von Interesse nicht exprimieren würden. Auf diese Art und Weise kann bestimmt werden, dass Verbindungen, welche durch das Assay identifiziert werden, ihre Wirkungen wirklich durch das NCX-Protein von Interesse ausüben, anstatt durch einen unerwarteten nichtspezifischen Mechanismus. Eine Möglichkeit für solche Kontrollzellen wäre die Verwendung nicht-rekombinanter Elternzellen, wobei die Zellen des tatsächlichen Experimentes das NCX-Protein von Interesse exprimieren. Weitere Kontrollen für das Assay zum Bestimmen der Aktivität von NCX-Protein als Reaktion auf die Zugabe einer Verbindung wären das Durchführen des Assays ohne die Zugabe der Testverbindung (niedrige Kontrolle) und das Durchführen des Assays mit einer hohen Konzentration der Testverbindung (hohe Kontrolle). Weitere Arten von Kontrollen beinhalten das Hernehmen von Verbindungen, welche durch das Assay der vorliegenden Erfindung als Agonisten oder Antagonisten von NCX-Proteinen von Interesse identifiziert werden und das Testen dieser Verbindungen mit den Verfahren des Standes der Technik zur Bestätigung dessen, dass diese Verbindungen auch Agonisten oder Antagonisten sind, wenn sie mit diesen Verfahren des Standes der Technik getestet werden.
Außerdem dürfte ein Fachmann auf dem Gebiet wissen, dass es auch wünschenswert wäre, statistische Analysen durchzuführen, indem Assay-Werte mit Standardwerten verglichen werden.
Die Begriffe „Agonist" und „Antagonist" betreffen Rezeptor-Effektor-Moleküle, welche die Signaltransduktion über einen Rezeptor modulieren. Rezeptor-Effektor-Moleküle sind in der Lage an den Rezeptor zu binden, jedoch nicht notwendigerweise an der Bindungsstelle des natürlichen Liganden. Rezeptor-Effektoren können die Signaltransduktion modulieren, wenn sie allein verwendet werden, d.h. sie können Ersatzliganden sein, oder sie können die Signaltransduktion in Gegenwart des natürlichen Liganden verändern, entweder zum Verstärkern oder Hemmen der Signal- gebung durch den natürlichen Liganden. Zum Beispiel sind „Antagonisten" Moleküle, welche die Signaltransduktionsaktivität des Rezeptors blockieren oder verringern, z.B. können sie konkurrierend, nichtkonkurrierend und/oder allosterisch die Signaltransduktion von dem Rezeptor hemmen, wohingegen „Agonisten" die Signaltransduktionsaktivität eines Rezeptors potenzieren, induzieren oder anderweitig verstärken.
Der Begriff „Erkrankung in Zusammenhang mit einer NCX-veränderten Expression" betrifft dilatierte Kardiomyopathie, Koronarherzerkrankung, Arrhythmie, Herzversagen usw.
Der Verbraucherfreundlichkeit halber können die farbige Substanz und andere Komponenten des Assays in Sätzen bereitgestellt sein, wobei die farbige Substanz als ein rekonstituierbares Pulver oder als eine gekühlte Lösung auf Eis, in einem Puffer vorliegen kann. Der Satz kann auch den Puffer, Aktivator, Hemmer, die Testverbindung, Zellen, welche NCX-Protein exprimieren, usw. enthalten. Zellen können als lyophilisierte Zellen vorliegen. Der Teilesatz kann als ein diagnostischer Satz für das Diagnostizieren von dilatierter Kardiomyopathie, Koronarherzerkrankung, Arrhythmie, Herzversagen usw. verwendet werden. Die folgenden Figuren und Beispiele beschreiben die Erfindung detaillierter durch die Beschreibung der typischen Resultate des Fluoreszenz-basierten zellulären NCX- Assays, ohne dabei den Schutzumfang einzuschränken.
BEISPIELE
1. Assay-Verfahren
1.1 Assay-Reagenzien
Die folgenden chemischen Zusammensetzungen werden als Reagenzien für das Assay verwendet:
1.2 Assay-Verfahren 1] 20 bis 24 Stunden vor dem Experiment werden Zellen in Wachstumsmedium suspendiert (Nutrient Mixture F12 (HAM) Invitrogen, Karlsruhe, 5 % FCS, Biochrom, Berlin), ohne Antibiotika, und in schwarzen 96-Well-Klarbodenplatten (25.000 Zellen/Well in 100 μl) kultiviert.
2] Das Medium wird entsorgt und anschließend werden 100 μl Farbstoffauftragspuffer zugegeben, und die Platten werden im Dunkeln für 75 Min. bei RT inkubiert.
3] Der Farbstoffauftragspuffer wird durch dreimaliges Waschen mit 100 μl Assay- Puffer entfernt. Der Puffer wird entsorgt.
4] 80 μl aus den Verbindungsplatten werden zugegeben und die Platten für 30 Min. bei 16 0C aufbewahrt.
5] Die Platten werden in den FLIPR übertragen und unter Verwendung des folgenden Protokolls (einschließlich 40 μl Zugabe aus der lonophor-Platte) untersucht:
1.3 Datenanalyse Inhibitorische Aktivität der Testverbindungen in NCX-Zellen:
Berechnung der Hemmung:
Die Berechnungen basieren auf dem Statistikexport. Rohdaten werden für die Hemmung gemäß folgender Gleichung umgewandelt:
Probe - Mittel untere Kontrolle
% - HEMMUNG = 100 x ( )
Mittel hohe Kontrolle - Mittel untere Kontrolle
Das Mittel der hohen Kontrolle ist abgeleitet aus der durchschnittlichen Differenz von acht gepaarten Proben von 10 oder 30 μM A000135933 mit lonomycin. Das Mittel der unteren Kontrolle ist abgeleitet aus den lonomycin-Kontrollen. Verbindungen, welche die basale Fluoreszenz mehr als 1 ,3fach erhöhen, werden entsorgt.
2. Assay-Beispiele
2.1 Reaktion der hohen und niedrigen Kontrollen
Die typische Fluoreszenzreaktion der hohen und niedrigen Kontrollen nach Zugabe von 2 μM lonomycin ist in Figur 2 gezeigt und ist Folgende: Wenn der NCX1 aktiv ist (niedrige Kontrolle), wird Calcium, welches nach der lonomycin-Zugabe in die Zelle eintritt, aus der Zelle heraustransportiert. Nach ein paar Sekunden ist die Anfangscalciumbeladung der Zellen wiederhergestellt. Die Hemmung von NCX1 führt zu einer Fluoreszenzerhöhung nach der lonomycin-Zugabe aufgrund einer Erhöhung des cytosolischen Calciums (hohe Kontrolle, 30 μM A000135933).
2.2 Werkzeugsubstanz: A000135933
Der neue NCX1 -Hemmer A000135933 fand sich im ersten HTS-Screen. Figur 3, 4 und 5 zeigen eine typische dosisabhängige Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen von A000135933. A000135933 war ein guter NCX1 -Hemmer mit einem mittleren IC50 von 5,9 μM und seit dieser Zeit wird er als eine Werkzeugsubstanz bei den Assays verwendet. Ein IC50 dieser Verbindung wird auf jeder Platte als Kontrolle zugegeben. Das S/B-Verhältnis und der z'-Wert für dieses Beispiel waren sehr gut. Zusammen mit dem IC50 von A000135933 wurden diese Parameter verwendet, um eine gute Assay- Leistung für jede Platte anzuzeigen:
1. S/B größer als zwei.
2. z'-Wert zwischen 0,5 und 0,7.
3. IC5O der Werkzeugverbindung A000135933 muss um das Mittel von 5,9 μM liegen.
2.3 Werkzeugsubstanz: Assay-Beispiel
Ein Assay wurde mit vier Verbindungen in doppelter Ausführung durchgeführt (Figur 6). Die vier Verbindungen sind aus der gleichen Verbindungsklasse. Eine Verbindung war ein guter NCX1 -Hemmer (A000135933), zwei Verbindungen zeigen moderate Hemmung (A000136648, A000104243) und eine war nicht aktiv im Konzentrationsbereich (A000103746). Dieses Beispiel zeigt, dass das Assay geeignet ist, NCX1 -Hemmer zu screenen und Strukturaktivitätsbeziehungen zu etablieren.
2.4 Korrelation mit Eiektrophysiologie
Der Vergleich der Daten abgeleitet aus dem Fluoreszenz-basierten Assay mit einem direkten Elektrophysiologieverfahren (longate's SURFE2R-Technologie) ist die beste Möglichkeit zum Einschätzen der Leistung dieses Assays. Die Korrelation dieser beiden sehr unterschiedlichen Techniken ist recht gut (Figur 7).
Die mit SURFE2R gemessene Hemmung war höher (im Mittel 14 %), außer bei einer Verbindung, als die Hemmung abgeleitet aus dem indirekten FLIPR-Assay.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Figur 1 :
Figur 1a zeigt die Polynukleotidsequenz von NCX1 dargestellt durch SEQ. ID. NR. 1. Figur 1b zeigt die Polynukleotidsequenz von NCX2 dargestellt durch SEQ. ID. NR. 2. Figur 1c zeigt die Polynukleotidsequenz von NCX3 dargestellt durch SEQ. ID. NR. 3.
Figur 2:
Fluoreszenzsignal der CHO-NCX1 -Zellen nach lonomycin-Zugabe. Hemmung von NCX1 (hohe Kontrolle, 30 μM A000135933, rot) führt zu einer Fluoreszenzerhöhung aufgrund einer Erhöhung des cytosolischen Calciums. Aktives NCX1 stellt die Anfangscalciumbeladung nach wenigen Sekunden wieder her (niedrige Kontrolle, schwarz).
Figur 3:
Rohdaten: Die Kinetik der Fluoreszenz ändert sich nach lonomycin-Zugabe für unterschiedliche Konzentrationen von A000135933. Die Summe der Fluoreszenzwerte von 50 bis 90 Sek. wurde verwendet, um die prozentualen Fluoreszenzänderungen im Vergleich zu den Kontrollen zu berechnen. Die Ergebnisse sind in Figur 4 gezeigt.
Figur 4:
Assay-Statistik für eine 96-Well-Platte mit hohen und niedrigen Kontrollen und unterschiedlichen Konzentrationen von A000135933. Das berechnete Signal-zuHintergrund-Verhältnis (S/B), z' und die Erhöhung der Fluoreszenz zwischen 50 und 90 Sekunden verschiedener Konzentrationen von A000135933 sind aufgelistet (siehe auch Figur 2). Bei diesem Beispiel betrug der berechnete IC50 von A000135933 7,16 μM (mittlerer IC50: 5,9 μM).
Figur 5:
Veranschaulichung der prozentualen Fluoreszenzerhöhung im Vergleich zur Verbindungskonzentration von A000135933 und die entsprechende Passkurve. Bei diesem Beispiel betrug der berechnete IC5O von A000135933 7,16 μM (mittlerer IC5o: 5,9 μM).
Figur 6:
Figur 6 zeigt den Rohdatenausdruck aus dem FLIPR.
Figur 7:
Korrelation zwischen dem NCX1-Fluoreszenz-basierten FLIPR-Assay mit der Elektrophysiologie-basierten SURFE2R-Technologie einer Verbindungsklasse. Die Hemmung von NCX1 wurde in beiden Fällen mit 10 μM gemessen.

Claims

ANSPRÜCHE
1. Assay zum Bestimmen der Aktivität von NCX-Protein, welches Folgendes umfasst:
e) das Bereitstellen von Zellen, welche NCX exprimieren; f) das Bereitstellen einer farbigen Substanz zum Bestimmen des intrazellulären Calciums; g) das in Kontakt bringen von Zellen mit einem NCX-Aktivitätsaktivator; und h) das Vergleichen der durch Calcium vermittelten Veränderung in dem Lumineszenzsignal von der farbigen Substanz mit einem Lumineszenzsignal erzeugt bei einem Kontrollexperiment.
2. Assay nach Anspruch 1 , wobei das NCX-Protein ein NCX-Protein aus folgender Liste ist: NCX1 , NCX2, NCX3.
3. Assay nach Anspruch 1 , wobei das NCX-Protein von einem Säugetier stammt, bevorzugt von Ratte, Maus, Hund, Rind, Schwein, Affe oder Mensch.
4. Assay nach Anspruch 1 , wobei die Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: CHO-, HEK-, COS7- und JURKAT-Zellen.
5. Assay nach Anspruch 1 , wobei die farbige Substanz als ein Farbstoffvorläufer zu den Zellen zugegeben wird, der in der Lage ist, in die Zellen einzutreten und zu einem Farbstoff hydrolysiert zu werden, wodurch der Farbstoff in den Zellen einen Komplex mit Calcium bildet und ein Lumineszenzsignal bereitstellt.
6. Assay nach Anspruch 1 und 5, wobei das Lumineszenzsignal Fluoreszenz ist und der Überwachungsschritt c) ein FLIPR-Gerät verwendet.
7. Assay nach Anspruch 5, wobei der Farbstoffvorläufer ein Acetoxymethylester- Derivat ist.
8. Assay nach Anspruch 5, wobei der Farbstoff der Calcium-empfindliche Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 ist.
9. Assay nach Anspruch 1 bis 8, wobei der NCX-Aktivitätsaktivator lonomycin ist.
10. Verwendung des Assays nach Anspruch 1 bis 9 zum Testen einer Verbindung auf die Aktivität als ein Agonist oder Antagonist des NCX.
11. Verwendung des Assays nach Anspruch 1 bis 9 für die Diagnose einer Erkrankung in Zusammenhang mit einer NCX-veränderten Expression.
12. Assay zum Bestimmen der Aktivität von NCX-Protein als Reaktion auf die Zugabe einer Verbindung, welches Folgendes umfasst:
a) das Bereitstellen von Zellen, welche NCX exprimieren; b) das Bereitstellen einer farbigen Substanz zum Bestimmen des intrazellulären Calciums; c) das in Kontakt bringen von Zellen mit einer Verbindung, wobei die Zellen vor der Behandlung mit der Verbindung mit einem NCX-Aktivitätsaktivator behandelt wurden; und d) das Vergleichen der durch Calcium vermittelten Veränderung in dem Lumineszenzsignal von der farbigen Substanz mit einem Lumineszenzsignal erzeugt bei einem Kontrollexperiment.
13. Assay nach Anspruch 12, wobei das NCX-Protein ein NCX-Protein aus folgender Liste ist: NCX1 , NCX2, NCX3.
14. Assay nach Anspruch 12, wobei das NCX-Protein von einem Säugetier stammt, bevorzugt von Ratte, Maus, Hund, Rind, Schwein, Affe oder Mensch.
15. Assay nach Anspruch 12, wobei die Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: CHO-, HEK-, COS7- und JURKAT-Zellen.
16. Assay nach Anspruch 12, wobei die farbige Substanz als ein Farbstoffvorläufer zu den Zellen zugegeben wird, der in der Lage ist, in die Zellen einzutreten und zu einem Farbstoff hydrolysiert zu werden, wodurch der Farbstoff in den Zellen einen Komplex mit Calcium bildet und ein Lumineszenzsignal bereitstellt.
17. Assay nach Anspruch 12 und 16, wobei das Lumineszenzsignal Fluoreszenz ist und der Überwachungsschritt c) ein FLIPR-Gerät verwendet.
18. Assay nach Anspruch 16, wobei der Farbstoffvorläufer ein Acetoxymethylester- Derivat ist.
19. Assay nach Anspruch 16, wobei der Farbstoff der Calcium-empfindliche Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 ist.
20. Assay nach Anspruch 12 bis 19, wobei die Verbindung ein NCX-Antagonist ist.
21. Assay nach Anspruch 12 bis 19, wobei der NCX-Aktivator lonomycin ist.
22. Teilesatz, welcher Folgendes umfasst:
a) lyophilisierte Zellen, welche NCX-Protein exprimieren; b) eine farbige Substanz; c) einen Verbindungspuffer; und d) einen farbigen Substanzpuffer.
23. Teilesatz nach Anspruch 22, wobei die farbige Substanz der Calcium- empfindliche Fluoreszenzfarbstoff Fluo-4 ist.
24. Teilesatz nach Anspruch 22 und 23, wobei das NCX-Protein ein NCX-Protein aus folgender Liste ist: NCX1 , NCX2, NCX3.
25. Teilesatz nach Anspruch 22 und 23, wobei das NCX-Protein von einem Säugetier stammt, bevorzugt von Ratte, Maus, Hund, Rind, Schwein, Affe oder Mensch.
26. Verwendung eines Teilesatzes nach Anspruch 22 bis 25 zum Testen einer Verbindung auf die Aktivität als ein Agonist oder Antagonist von NCX.
27. Verwendung eines Teilesatzes nach Anspruch 22 bis 25 für die Diagnose einer Erkrankung in Zusammenhang mit einer NCX-veränderten Expression.
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